TW202340252A - 糖皮質激素的藥物偶聯物 - Google Patents

Abstract

本揭露關於糖皮質激素的藥物偶聯物。具體而言，本揭露關於式(I)所示的抗體-藥物偶聯物，其中，Ab為抗體或其抗原結合片段，L為將Ab共價連接於D的連接子，且k為1至20，D為糖皮質激素或其殘基，該糖皮質激素選自布地奈德或環索奈德。

Ab-(L-D)_k　　　(I)

Description

糖皮質激素的藥物偶聯物

本揭露屬於醫藥領域，具體關於一種糖皮質激素的藥物偶聯物。

白介素4(Interleukin-4，IL-4)由153個胺基酸組成，分子量約為17kDa。最初，因為IL-4能夠刺激B細胞增殖而被發現，並被命名為B細胞刺激因子-1(BSF-1)。IL-4與IL-13一樣屬I型細胞因子家族，具有4α螺旋的疏水束核心所構成的四級結構。IL-4由TH2細胞分泌，參與TH2介導的免疫應答，具有廣泛的生物學活性，包括刺激T細胞、肥大細胞、粒細胞、巨核細胞和紅細胞增殖。此外，IL-4還可以刺激B細胞表達主要組織相容性複合物2類分子。IL-13與IL-4具有大約30%的胺基酸序列同源性和多種相似的功能。IL-4和IL-13都能促進B細胞增殖，並聯合CD40/CD40L共刺激誘導IgM類型轉變成IgE。IL-4促進肥大細胞聚集，上調肥大細胞高親和力IgE受體和B細胞上IgE低親和力受體CD23(FcεRII)的表達，上調血管內皮細胞黏附分子(VCAM-1)表達，促進嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞、單核細胞和嗜鹼性粒細胞的轉移。與IL-13不同的是，IL-4可以促進幼稚T細胞分化成TH2。

IL-4需要與膜受體結合而發揮生物學功能。人白介素受體(IL-4R)是由兩條多肽鏈形成的異二聚體，其中一條α鏈對IL-4有很高的親和力，由於在IL-4R複合物中IL-4Rα鏈對IL-4的結合起主導作用，因此很多科學研究和報導中常用IL-4Rα替代IL-4R。IL-4R在人B細胞、肥大細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、巨噬細胞/單核細胞、DC細胞、纖維細胞、氣道上皮和平滑肌等多種細胞上都有表達。IL-4Rα可以與其他亞基形成兩類受體複合物，在造血幹細胞中主要表達由IL-4Rα和γc組成的I型受體。在非造血幹細胞中IL-4主要藉由IL-4Rα和IL-13Rα1組成的II型受體發揮作用。II型受體是IL-4和IL-13的共同受體，IL-13與IL-13Rα1結合發揮功能。I型受體和II型受體都藉由Jak/STAT通路轉導信號，IL-4Rα、γc和IL-13Rα1分別與Jak1、Jak3和Tyk2結合激活下游通路，IL-4和IL-13還可以藉由胰島素受體受質家族(IRS)轉導信號，最終激活核內的PI3-K、NF-κB。阻斷IL-4R既可以抑制IL-4也可以抑制IL-13的生物學功能。

多項研究表明IL-4和IL-13與TH2免疫應答相關的疾病有關。特應性皮炎(AD)，又稱異位性皮炎或遺傳過敏性皮炎，是皮膚科常見疾病，多見於兒童和青少年，常與某些遺傳過敏性疾病如過敏性鼻炎、哮喘等併發。研究發現AD患者的TH2因子IL-4、IL-5、IL-10和IL-13水平上升，IgE水平升高，此外還發現，TH2因子與AD疾病進程相關，過表達IL-4、IL-13等TH2因子的小鼠表現出皮膚保護缺陷和類似AD病症^[14][15]。AD患者IL-4和IL-13水平升高阻礙了表皮分化和抗菌肽的產生。IL-4缺陷小鼠降低皮膚過敏性炎症的發生。這些研究表明阻斷IL-4R可能 對治療AD有效。國外已經有抗IL-4R的單抗上市，對AD表現出良好的治療效果。

IL-13和IL-4在哮喘中也發揮重要作用。哮喘是一種常見的肺部炎症疾病，以氣道高反應性(AHR)、黏液分泌過多、纖維化和IgE水平升高為特徵。非特異性刺激如冷空氣等常常導致氣道高反應性加劇，AHR和黏液分泌過多導致氣道阻礙這是哮喘致死的主要原因。TH2因子在哮喘疾病進程中發揮重要作用，哮喘患者支氣管和肺泡灌洗液過表達IL-4和IL-13。儘管IL-13和IL-4具有某些功能相似性，但是一些研究表明IL-13在哮喘的疾病進展中發揮了比其他Th2細胞因子更為重要的作用。IL-13可以促進杯狀細胞的分化和纖維化。給未經過過敏原刺激的小鼠氣道注射重組IL-13會導致氣道炎症，黏液分泌過多和氣道高反應性，注射可溶性的IL13Rα2可以阻止小鼠AHR、黏液分泌過多和肺部炎症的發生。在哮喘模型中注射IL-4Rα抗體可以降低AHR和肺泡灌洗液中的嗜酸性粒細胞。研究表明阻斷IL-4Rα可能對治療哮喘有效。

目前各國已有多家製藥公司正在研發針對IL-4R的單株抗體，相關專利申請如WO2010053751、WO2001092340、WO2008054606、WO2014031610、WO2020038454等。

糖皮質激素也是治療過敏性疾病、炎症等較為有效的藥物。作為代表性的糖皮質激素，已知皮質醇、皮質酮等在生物體內製成的糖皮質激素以及地塞米松、潑尼松、潑尼松龍、布地奈德等合成糖皮質激素。這些糖皮質激素由於具有類固醇結構，因此總稱為類固醇類，應用在各種疾病的治療中。但是，這些類固醇類由於其使用，有時會表現出類固醇消 化性潰瘍、類固醇紫斑、類固醇胰炎、類固醇糖尿病、類固醇白內障、類固醇青光眼等副作用。

抗體藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)，是指單株抗體或者抗體片段藉由穩定的化學接頭化合物與具有生物活性的藥物相連。臨床前和臨床開發中的大多數ADC都用於腫瘤適應症，其中細胞毒性有效載荷靶向表達抗原的癌細胞。但是，藉由ADC介導的生物活性小分子的傳遞來調節病原性細胞活性對於非腫瘤學適應症也是有吸引力的，從而導致了該技術的廣泛應用。

現有技術已經公開了一些糖皮質激素的藥物偶聯物，例如WO2017210471，WO2019106609、WO2019136487等。

本揭露一方面提供了一種式(I)所示的抗體-藥物偶聯物(ADC)，

Ab-(L-D)_k(I)

其中，Ab為抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段，

L為將Ab共價連接於D的連接子，且k為1至20(包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或任意兩數值之間任意數值)，

D為糖皮質激素或其殘基，所述糖皮質激素選自地塞米松、潑尼松、潑尼松龍、布地奈德、莫米松、丙酸倍氯米松、氟替卡松、曲安奈德和環索奈德，例如可以是布地奈德或環索奈德。

在一些實施方案中，D如下式所示：

在一些實施方案中，抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段可以是已知的，如在例如WO2010053751、WO2001092340、WO2008054606、WO2014031610、WO2020038454(其各自藉由引用併入本文)中所描述的抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段。

在一些實施方案中，抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段包括但不限於Dupixent、PRS-060、AK-120、63 IgG1、CBP201、AMG-317或其抗原結合片段。

在一些實施方案中，抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段是抗人IL-4R的抗體或其抗原結合片段。

在一些實施方案中，抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中重鏈可變區包含：

(I)分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；或

(II)分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；

和/或抗體輕鏈可變區包含：

(I)分別如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(II)分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(III)分別如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：40所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或

(IV)分別如SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

表1示出了抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段的CDR序列。

在一些實施方案中，抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段包含選自以下(I)至(IV)中的任一項：

(I)重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和

輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(II)重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和

輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(III)重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和

輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：40所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(IV)重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和

輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

在一些實施方案中，該抗IL-4R的抗體或抗原結合片段是鼠源抗體、嵌合抗體、全人抗體、人源化抗體或其片段。在一些具體的實施方案中，該抗IL-4R的抗體或抗原結合片段是人源化的。

在一些實施方案中，該抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段，包含來源於人種系輕鏈IGKV3-11*01(SEQ ID NO：22，用於抗體25G7)的FR序列或與其至少有95%同一性的帶有回復突變的序列。在一些具體 實施方案中，該回復突變選自L46P，L47W，F71Y中的一個或多個。在一些實施方案中，該抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段，包含來源於人種系重鏈IGHV3-48*01(SEQ ID NO：21，用於抗體25G7)的FR區序列或與其至少有95%同一性的帶有回復突變的序列。在一些具體實施方案中，該回復突變選自S94A，F67S，A93T中的一個或多個。在一些實施方案中，該抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段，包含來源於人種系輕鏈IGKV2D-29*01(SEQ ID NO：24，用於抗體7B10)的FR區序列或與其至少有95%同一性的回復突變序列。在一些具體實施方案中，該回復突變選自M4L和/或V58I。在一些實施方案中，該抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段，包含來源於人種系重鏈IGHV1-2*02(SEQ ID NO：23，用於抗體7B10)的FR區序列或與其至少有95%同一性的回復突變序列。在一些具體實施方案中，該回復突變選自M69L，R71I，T73K，R94K中的一個或多個。

人種系重鏈IGHV3-48*01：

SEQ ID NO：21

人種系輕鏈IGKV3-11*01：

SEQ ID NO：22

人種系重鏈IGHV1-2*02：

SEQ ID NO：23

人種系輕鏈IGKV2D-29*01：

SEQ ID NO：24

在一些實施方案中，抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，

重鏈可變區包含：

(I)如SEQ ID NO：1所示或與SEQ ID NO：1具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或

(II)如SEQ ID NO：9所示或與SEQ ID NO：9具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或

(III)如SEQ ID NO：43所示或與SEQ ID NO：43具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或

和/或輕鏈可變區包含：

(I)如SEQ ID NO：2所示或與SEQ ID NO：2具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或

(II)如SEQ ID NO：10所示或與SEQ ID NO：10具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或

(III)如SEQ ID NO：37所示或與SEQ ID NO：37具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列；或

(IV)如SEQ ID NO：41所示或與SEQ ID NO：41具有至少70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列。

25G7 HCVR(25G7重鏈可變區)

SEQ ID NO：1

25G7 LCVR(25G7輕鏈可變區)

SEQ ID NO：2

7B10 HCVR(7B10重鏈可變區)

SEQ ID NO：9

7B10 LCVR(7B10輕鏈可變區)

SEQ ID NO：10

hu25G7-A LCVR(hu25G7-A輕鏈可變區)

SEQ ID NO：37

hu25G7-B LCVR(hu25G7-B輕鏈可變區)

SEQ ID NO：41

hu25G7-VH(hu25G7重鏈可變區)

SEQ ID NO：43

在至少一個實施方案中，該抗IL-4R的抗體或抗原結合片段的重鏈可變區如序列SEQ ID NO：1所示，輕鏈可變區如序列SEQ ID NO：2所示；或

重鏈可變區如序列SEQ ID NO：9所示，輕鏈可變區如序列SEQ ID NO：10所示；或

重鏈可變區如序列SEQ ID NO：43所示，輕鏈可變區如序列SEQ ID NO：37所示；或

重鏈可變區如序列SEQ ID NO：43所示，輕鏈可變區如序列SEQ ID NO：41所示。

在一些實施方案中，抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其中，

重鏈可變區包含：

(I)如SEQ ID NO：25-27之一所示或與SEQ ID NO：25-27之一具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；或

(II)如SEQ ID NO：31-33之一所示或與SEQ ID NO：31-33之一具有至少70%、80%、90%、95%、98%、或99%同一性的序列；

和/或輕鏈可變區包含：

(I)如SEQ ID NO：28-30之一所示或與SEQ ID NO：28-30之一具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；或

(II)如SEQ ID NO：34-36之一所示或與SEQ ID NO：34-36之一具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列。

hu25G7-VH-a：

SEQ ID NO：25

hu25G7-VH-b：

SEQ ID NO：26

hu25G7-VH-c：

SEQ ID NO：27

hu25G7-VL-a：

SEQ ID NO：28

hu25G7-VL-b：

SEQ ID NO：29

hu25G7-VL-c：

SEQ ID NO：30

hu7B10-VH-a：

SEQ ID NO：31

hu7B10-VH-b：

SEQ ID NO：32

hu7B10-VH-c：

SEQ ID NO：33

hu7B10-VL-a：

SEQ ID NO：34

hu7B10-VL-b：

SEQ ID NO：35

hu7B10-VL-c：

SEQ ID NO：36

在一些具體的實施方案中，重鏈可變區如序列SEQ ID NO：25-27之一所示，和輕鏈可變區如序列SEQ ID NO：28-30之一所示；

重鏈可變區如序列SEQ ID NO：31-33之一所示，和輕鏈可變區如序列SEQ ID NO：34-36之一所示。

在一些實施方案中，該抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段包含選自人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區或其變體。一些具體的方案中，包含人源IgG1的重鏈恆定區或其變體。在一些實施方案中，該抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段包含人源κ、λ鏈或其變體的恆定區。

在一些實施方案中，該抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人源化抗體，重鏈序列如SEQ ID NO：17所示或與其具有至少85%序列同一性；輕鏈序列如SEQ ID NO：18所示或與其具有至少85%序列同一性。

在一些實施方案中，該抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人源化抗體，重鏈序列如SEQ ID NO：19所示或與其具有至少85%序列同一性；輕鏈序列如SEQ ID NO：20所示或與其具有至少85%序列同一性。

在一些實施方案中，該抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人源化抗體，重鏈序列如SEQ ID NO：44所示或與其具有至少85%序列同一性；輕鏈序列如SEQ ID NO：45所示或與其具有至少85%序列同一性。

在一些實施方案中，該抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段，其中該抗體為人源化抗體，重鏈序列如SEQ ID NO：44所示或與其具有 至少85%序列同一性；輕鏈序列如SEQ ID NO：46所示或與其具有至少85%序列同一性。

在一些實施方案中，提供一種分離的抗IL-4R抗體或其抗原結合片段，其特徵在於與如上所述的任一抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段競爭結合人IL-4R或其表位。

在一些實施方案中，提供一種雙特異性抗體或多特異性抗體，其含有如上所述任一抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段輕鏈可變區和/或重鏈可變區。在另一些實施方案中，提供一種單鏈抗體，其含有如上所述任一抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區和/或重鏈可變區。

在一些實施方案中，人源化抗IL-4R抗體或其抗原結合片段，還包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區或其變體。在至少一個實施方案中，包含的是人源IgG2或IgG4重鏈恆定區。因為IgG2或IgG4沒有ADCC毒性。在另一個實施方案中，使用胺基酸突變後無ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒作用)毒性的IgG1。在至少一個實施方案中，變體包含ADCC效應功能降低或缺失的重鏈恆定區突變，例如但不限於IgG1的N297A、L234A、L235A。在一些實施方案中，IgG1包含突變E239D和M241L。

除非另有說明，本揭露的抗IL-4R抗體或其抗原結合蛋白根據Kabat編碼。

在一些實施方案中，抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段的包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包含：

(I)如SEQ ID NO：17所示或與SEQ ID NO：17具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；或

(II)如SEQ ID NO：19所示或與SEQ ID NO：19具有至少70%、80%、90%、95%、98%、或99%同一性的序列；或

(III)如SEQ ID NO：44所示或與SEQ ID NO：44具有至少70%、80%、90%、95%、98%、或99%同一性的序列；

(IV如SEQ ID NO：47所示或與SEQ ID NO：47具有至少70%、80%、90%、95%、98%、或99%同一性的序列；

和/或輕鏈包含：

(I)如SEQ ID NO：18所示或與SEQ ID NO：18具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；或

(II)如SEQ ID NO：20所示或與SEQ ID NO：20具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；或

(III)如SEQ ID NO：45所示或與SEQ ID NO：45具有至少90%、95%、98%或99%同一性的序列；或

(IV)如SEQ ID NO：46所示或與SEQ ID NO：46具有至少90%、95%、98%或99%同一性的序列。

hu25G7 HC

SEQ ID NO：17

hu25G7 LC

SEQ ID NO：18

hu7B10 HC

SEQ ID NO：19

hu7B10 LC

SEQ ID NO：20

hu25G7-IgG4 HC

SEQ ID NO：44

hu25G7-A LC

SEQ ID NO：45

hu25G7-B LC

SEQ ID NO：46

hu25G7-24-IgG1(E239D，M241L)HC

SEQ ID NO：47

在一些實施方案中，重鏈序列如SEQ ID NO：17所示，和輕鏈序列如SEQ ID NO：18所示；或

重鏈序列如SEQ ID NO：19所示，和輕鏈序列如SEQ ID NO：20所示；或

重鏈序列如SEQ ID NO：44所示，和輕鏈序列如SEQ ID NO：45所示；或

重鏈序列如SEQ ID NO：44所示，和輕鏈序列如SEQ ID NO：46所示；或

重鏈序列如SEQ ID NO：47所示，和輕鏈序列如SEQ ID NO：45所示。

在一些實施方案中，抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段的包含重鏈和輕鏈，其中重鏈包含：

(I)如SEQ ID NO：48所示或與SEQ ID NO：48具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；或

(II)如SEQ ID NO：49所示或與SEQ ID NO：49具有至少70%、80%、90%、95%、98%、或99%同一性的序列；或

(III)如SEQ ID NO：50所示或與SEQ ID NO：50具有至少70%、80%、90%、95%、98%、或99%同一性的序列；

(IV如SEQ ID NO：51所示或與SEQ ID NO：51具有至少70%、80%、90%、95%、98%、或99%同一性的序列；

和/或輕鏈包含：

(I)如SEQ ID NO：18所示或與SEQ ID NO：18具有至少70%、80%、90%、95%、98%或99%同一性的序列；或

(II)如SEQ ID NO：45所示或與SEQ ID NO：45具有至少90%、95%、98%或99%同一性的序列；或

(III)如SEQ ID NO：46所示或與SEQ ID NO：46具有至少90%、95%、98%或99%同一性的序列。

hu25G7-IgG4 VH-CH1

SEQ ID NO：48

hu25G7-IgG1 VH-CH1

SEQ ID NO：49

hu25G7-24-IgG4 VH-CH1

SEQ ID NO：50

hu25G7-24-IgG1 VH-CH1

SEQ ID NO：51

在一些實施方案中，重鏈序列如SEQ ID NO：48所示，和輕鏈序列如SEQ ID NO：18所示；或

重鏈序列如SEQ ID NO：49所示，和輕鏈序列如SEQ ID NO：18所示；或

重鏈序列如SEQ ID NO：50所示，和輕鏈序列如SEQ ID NO：45所示；或

重鏈序列如SEQ ID NO：50所示，和輕鏈序列如SEQ ID NO：46所示；或

重鏈序列如SEQ ID NO：51所示，和輕鏈序列如SEQ ID NO：45所示；或

重鏈序列如SEQ ID NO：51所示，和輕鏈序列如SEQ ID NO：46所示。

在一些實施方案中，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段可以為抗體變體，該變體在輕鏈有1至10個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸變化，和/或重鏈有1至10個(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個)胺基酸變化。

在一些實施方案中，上述變體具有與親本抗IL-4R的抗體或其片段相同或相似的生物學功能或效果。

在一些實施方案中，抗原結合片段包括但不限於Fab、Fab’、Fv、F(ab’)2、線性抗體、scFv(單鏈Fv抗體)、串聯二-scFv、串聯三-scFv、雙鏈抗體(diabody)、三鏈抗體(triabody)、四鏈抗體(tetrabody)、 sdAb(單域抗體或奈米抗體)、sdFv、肽抗體(peptibody)、結構域抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體、三特異性抗體或四特異性抗體)、dsFv(二硫鍵穩定化的Fv)、ScdsFv(二硫鍵穩定化的單鏈Fv抗體)。

在一些實施方案中，本揭露的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物中的抗IL-4R的抗體的抗原結合片段是與上述的抗IL-4R的抗體的抗原結合片段結合相同的IL-4R或其表位。

在一些實施方案中，提供編碼如上所述的抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段的多核苷酸，例如DNA或RNA。

在一些實施方案中，提供包含上述多核苷酸的表達載體，例如真核表達載體、原核表達載體、病毒載體。

在一些實施方案中，提供上述表達載體轉化的宿主細胞，例如真核細胞、原核細胞。一些具體實施方案中，宿主細胞為細菌(例如大腸桿菌)、酵母菌(例如畢赤酵母)、哺乳動物細胞(例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或人胚腎(HEK)293細胞)。

在一些實施方案中，提供製備上述抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段的方法包括步驟：在如前所述的宿主細胞中表達該抗體或其抗原結合片段，並自該宿主細胞中分離該抗體或其抗原結合片段。

本揭露中抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段中的胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.Biol.Chem，243，p3558(1968)中所述。

在某些實施方案中，k為1-10之間的任意數值，較佳2-5之間的任意數值。k可以為整數，也可以為小數。

在某些實施方案中，連接子在細胞外是穩定的，使得ADC在存在於細胞外環境中時保持完整，但在細胞中內化時能夠裂解。在一些實施方案中，當ADC進入表達對ADC的抗體部分具有特異性的抗原的細胞 時，糖皮質激素藥物部分從抗體部分裂解，且裂解釋放糖皮質激素的未修飾形式。

在某些實施方案中，連接子中的可裂解部分為可裂解肽部分。在一些實施方案中，相對於包含其他可裂解部分的ADC，包含可裂解肽部分的ADC顯示較低的聚集水平，改善的抗體與藥物比率。在某些實施方案中，相對於不可裂解的連接子，添加可裂解部分增加細胞毒性和/或效力。在一些實施方案中，可裂解肽部分能夠由酶裂解，且連接子為酶能夠裂解的連接子。在一些實施方案中，酶為組織蛋白酶，且連接子為組織蛋白酶能夠裂解的連接子。在某些實施方案中，與其它分裂機制相比，酶能夠裂解的連接子(例如組織蛋白酶能夠裂解的連接子)顯示上述改善特性中的一種或多種。

在一些實施方案中，連接子包含拉伸單元，其一端藉由碳原子與抗體共價連接而另一端與胺基酸單元、二硫化物部分、磺醯胺部分或非肽化學部分相連的化學結構片段。示例性拉伸單元包括但不限於

在一些實施方案中，連接子包含胺基酸單元，該胺基酸單元較佳包含由2至7個選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、賴胺酸、瓜胺酸、 絲胺酸、谷胺酸、天冬胺酸、高賴胺酸、n-甲基-纈胺酸、

(q為1-6的整數)的胺基酸構成的肽殘基，示例性胺基酸單元包括但不限於纈胺酸-瓜胺酸(Val-Cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(Ala-Phe)；苯丙胺酸-賴胺酸(Phe-Lys)、苯丙胺酸-高賴胺酸(Phe-Homolys)、n-甲基-纈胺酸-瓜胺酸(Me-Val-Cit)、丙胺酸-丙胺酸(Ala-Ala)、甘胺酸-谷胺酸(Gly-Glu)、谷胺酸-丙胺酸-丙胺酸(Glu-Ala-Ala)和甘胺酸-賴胺酸(Gly-Lys)、甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(Glv-Val-Cit)和甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(Gly-Gly-Gly)、

在一些實施方案中，連接子可以包含至少一種聚乙二醇 (PEG)部分。PEG部分可以例如包含-(PEG)_p1-，

，其中p1為整數 1至20，例如

，(PEG)₂；

，(PEG)₄；

，(PEG)₅。

在一些實施方案中，該連接子包含連接於D的間隔單元。在一些實施方案中，該間隔單元包含對胺基苯甲氧基羰基(PAB)，

在一些實施方案中，該間隔單元包含對胺基苯甲醯基，

在一些實施方案中，該間隔單元包含：

-NH(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-，其中n1選自0-6之間整數；L^a表示-C(=O)-NH-、-NR⁷-(CH₂)_n2-、-O-或單鍵，R⁷選自氫、C_1-6烷基、-(CH₂)_n3-COOH、-(CH₂)_n4-OH，n3選自1-4之間整數，n4選自1-6之間整數；L^b表示- CR⁸(R⁹)-、-O-、-NR¹⁰-或單鍵，R⁸和R⁹獨立選自氫、C_1-6烷基、C_3-6環烷基、-(CH₂)_n5-NH₂、-(CH₂)_n6-COOH、-(CH₂)_n7-OH，R¹⁰選自氫或C_1-6烷基，n5選自0-6之間整數，n6選自1-4之間整數，n7選自1-4之間整數，且n5為0時，R⁸與R⁹不相同，或者R⁸和R⁹與其相連接的碳原子一起形成C_3-6環烷基；L^c表示-CH₂-或-C(=O)-。

在一些實施方案中，-NH(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-中L^c表示-NHCH₂-。

在一些實施方案中，-NH(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-中R⁸和R⁹獨立選自氫、C_1-6烷基、C_3-6環烷基，例如氫、甲基、乙基或環丙基。

在一些實施方案中，-NH(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-中L^a表示-O-或單鍵，L^b表示-CR⁸(R⁹)-或單鍵，L^c表示-C(=O)-，R⁸和R⁹與其相連接的碳原子一起形成C_3-6環烷基。

在一些實施方案中，-NH(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-中L^a表示-O-或單鍵，L^b表示-CR⁸(R⁹)-或單鍵，L^c表示-C(=O)-，R⁸和R⁹獨立選自氫、C_1-6烷基、C_3-6環烷基、-(CH₂)_n5-NH₂、-(CH₂)_n6-COOH、-(CH₂)_n7-OH，R¹⁰選自氫或C_1-6烷基，n5選自0-6之間整數，n6選自1-4之間整數，n7選自1-4之間整數，且n5為0時，R⁸與R⁹不相同。

在一些實施方案中，-NH(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-中L^a表示-O-或單鍵，L^b表示-CR⁸(R⁹)-或單鍵，L^c表示-CH₂-。

在一些實施方案中，-NH(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-中L^a表示-O-或單鍵，L^b表示-CR⁸(R⁹)-或單鍵，L^c表示-CH₂-，R⁸和R⁹獨立選自氫、C_1-6烷基、C_3-6環烷基，較佳氫、甲基、乙基或環丙基。

在一些實施方案中，抗體-藥物偶聯物中-NH(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-為：-NHCH₂-、-NHCH₂CH₂-、-NHCH₂CH₂CH₂-、-NHCH₂-O-CH₂-、 -NHCH₂CH₂-O-CH₂-、-NH(CH₂)₃-C(O)-、-NHCH₂-O-CH₂-C(O)-、- NH(CH₂)₂-O-CH₂-C(O)-、

、

、

、

、

和

。

在一些實施方案中，-NH-(CH₂)_n1-L^a-L^b-L^c-為-NHCH₂-或-NHCH₂CH₂CH₂-。

在一些實施方案中，連接子中的間隔子單元包含(PEG)₂。在一些實施方案中，儘管連接子長度較短，但相對於包含較長間隔子單元(例如(PEG)₈)的ADC，包含較短間隔子單元(例如(PEG)₂)的ADC顯示較低的聚集水平和/或較高的藥物負載。

另一方面，本揭露抗體偶聯物(ADC)中L-D是由下式表示的化學部分：

-Str-Pep-Sp-D

Str是與Ab共價連接的伸展基單元，

Sp為間隔單元，

Pep選自胺基酸單元、二硫化物部分、磺醯胺部分或以下非肽化學部分：

，

或

，其中，W是-NH-亞(伸)雜環烷基-或雜環烷基；Y是亞(伸)雜芳基、亞(伸)芳基、-C(O)C_1-6亞(伸)烷基、C_2-6亞(伸)烯基、C_1-6亞(伸)烷基或-C_1-6亞(伸)烷基-NH-；每個R¹⁶獨立選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、-(C_1-6亞(伸)烷基)NHC(NH)NH₂或-(C_1-6亞(伸)烷基)NHC(O)NH₂；R¹⁷和R¹⁸各自獨立選自氫、C_1-6烷基、C_2-6烯基、 芳基、雜芳基，或R¹⁷和R¹⁸一起可形成C_3-6環烷基；R¹⁹和R²⁰各自獨立選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、芳基、雜芳基、(C_1-6烷基)OCH₂-，或R¹⁹和R²⁰一起可形成C_3-6環烷基環。

在一些實施方案中，該抗體-藥物偶聯物(ADC)中Str選自下式表示的化學部分：

或

，其中R²¹選自-W₁-C(O)-、-C(O)-W₁-C(O)-、-(CH₂CH₂O)_p1C(O)-、-(CH₂CH₂O)_p1CH₂C(O)-、-(CH₂CH₂O)_p1CH₂CH₂C(O)-，其中W1選自C_1-6亞烷基、C_1-6亞烷基-環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，該雜烷基包含1至3個選自N、O或S的雜原子，其中該烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地視需要被一個或多個選自鹵素、氘、羥基、氰基、胺基、C_1-6烷基、鹵C_1-6烷基、氘代C_1-6烷基、C_1-6烷氧基和C_3-6環烷基所取代，p1各自獨立地為1至20的整數；

L¹選自-NR²²-(CH₂CH₂O)_p2CH₂CH₂C(O)-、-NR²²-(CH₂CH₂O)_p2CH₂C(O)-、-S(CH₂)_p2C(O)-、-(CH₂)_p2C(O)-或單鍵，較佳單鍵；p2為1至20的整數，R²²選自氫原子、C_1-6烷基、鹵C_1-6烷基或氘代C_1-6烷基。

在一些實施方案中，該抗體-藥物偶聯物Str中R²¹選自C_1-6亞(伸)烷基C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₂C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₂CH₂C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₂CH₂CH₂C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₃C(O)-和-(CH₂-CH₂O)₄C(O)-。

在一些實施方案中，該Pep選自纈胺酸-瓜胺酸(Val-Cit)、丙胺酸-丙胺酸-天冬醯胺(Ala-Ala-Asn)、甘胺酸-甘胺酸-賴胺酸(Gly-Gly-lys)、纈胺酸-賴胺酸(Val-lys)、纈胺酸-丙胺酸(Val-Ala)、纈胺酸-苯丙胺酸(Val-Phe)或甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸(Gly-Gly-Phe-Gly)。

在一些實施方案中，該Sp選自-NHCH₂-、-NHCH₂CH₂-、-NHCH₂CH₂CH₂-、-NHCH₂-O-CH₂-、-NHCH₂CH₂-O-CH₂-、-NH(CH₂)₃- C(O)-、-NHCH₂-O-CH₂-C(O)-、-NH(CH₂)₂-O-CH₂-C(O)-、

、

在一些實施方案中，該抗體-藥物偶聯物中連接子L包含：順丁烯二醯亞胺-(PEG)₄-CH₂CH₂C(O)-Gly-Gly-Phe-Gly、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₂-Val-Cit、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₆-Val-Cit、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₈-Val-Cit、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₄-CH₂CH₂C(O)-Val-lys、順丁烯二醯亞胺-(CH₂)₅-Val-Cit、順丁烯二醯亞胺-(CH₂)₅-Val-lys、順丁烯二醯亞胺-(CH₂)₅-Gly-Gly-Phe-Gly、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₄-CH₂CH₂C(O)-Gly-Gly-Phe-Gly、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₂-Ala-Ala-Asn、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₆-Ala-Ala-Asn、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₈-Ala-Ala-Asn、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₄-三唑-(PEG)₃-磺醯胺、順丁烯二醯亞胺-(PEG)_2-CH₂CH₂C(O)-Val-lys、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₄-三唑-(PEG)₃-磺醯胺或Mal-(PEG)₄-三唑-(PEG)₃-二硫化物。

在另一些實施方案中，本揭露抗體-藥物偶聯物(ADC)，其由下式表示：

，其中k選自1至10，可以為整數，也可以為小數，p1選自2、4、6或8，p3、p4各自獨立地選自0、1或2；

，其中k選自1至10，可以為整數，也可以為小數，p1選自2、4、6或8，p3、p4各自獨立地選自0、1或2；

在另一些實施方式中，本揭露抗體-藥物偶聯物(ADC)，選自：

其中k選自1至10，可以為整數，也可以為小數。

本揭露還提供了一種式II-A所示化合物或其可藥用鹽，

其中p1選自2、4、6或8，p3、p4各自獨立地選自0、1或2。

本揭露還提供了一種式II-B所示化合物或其可藥用鹽，

其中X為鹵素，p1選自2、4、6或8，p3、p4各自獨立地選自0、1或2。

本揭露所述的結構中，

表示單鍵或雙鍵。

本揭露還提供了一種醫藥組成物，包括至少一種前述抗體-藥物偶聯物，以及藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

在一些實施方案中，該醫藥組成物的單位劑量為0.001mg-1000mg。

在一些實施方案中，基於組成物的總重量，該醫藥組成物含有0.01%-99.99%的前述化合物。在一些實施方案中，該醫藥組成物含有0.1%-99.9%的前述化合物。在一些實施方案中，該醫藥組成物含有0.5%-99.5%的前述化合物。在一些實施方案中，該醫藥組成物含有1%-99%的前述化合物。在一些實施方案中，該醫藥組成物含有2%-98%的前述化合物。

在一些實施方案中，基於組成物的總重量，該醫藥組成物含有0.01%-99.99%的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在一些實施方案中，該醫藥組成物含有0.1%-99.9%的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在一些實施方案中，該醫藥組成物含有0.5%-99.5%的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在一些實施方案中，該醫藥組成物含有1%-99%的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在一些實施方案中，該醫藥組成物含有2%-98%的藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。

本揭露的抗體-藥物偶聯物可以用適合適應症的方式對患者施用，例如，腸胃外、局部或藉由吸入施用。如果注射的話，拮抗劑可以藉由例如，關節內、靜脈內、肌內、損傷內、腹膜內或皮下路徑，藉由快速濃注或連續輸注進行施用。在疾病或損傷處的局部給藥被認為是經皮遞送和從植入物中持續釋放。藉由吸入遞送包括，例如，鼻或口腔吸入、使用噴霧器、吸入氣霧劑形式的拮抗劑等。其它的選擇包括眼藥水；口服製劑，包括丸劑、糖漿劑、錠劑或口香糖；和局部製劑如洗劑、凝膠劑、噴霧劑和軟膏劑。

本揭露還提供了一種可吸入的醫藥組成物，包括式(I)所示的抗體-藥物偶聯物以及藥學上可接受的載體，

Ab-(L-D)_k(I)

其中，Ab為抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段，

L為將Ab共價連接於D的連接子，且k為1至20(包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或任意兩數值之間任意數值)，

D為糖皮質激素或其殘基。

可選的Ab、L、D如前文所述。

在一些實施方案中，Ab為抗IL-4R的Fab片段。

本揭露還提供了該抗體-藥物偶聯物和/或包含抗體-藥物偶聯物的醫藥組成物在製備用於治療或預防IL-4R介導的疾病或病症的藥物中的用途。

本揭露還提供了該抗體-藥物偶聯物和/或包含抗體-藥物偶聯物的醫藥組成物在製備用於治療或預防免疫性疾病或病症的藥物中的用途。該疾病或病症選自：哮喘、鼻息肉、慢性鼻竇炎、過敏性皮膚病、嗜酸細胞性食管炎、慢性阻塞性肺病、過敏性鼻炎、關節炎、炎症性疾病、變應性反應、自體免疫淋巴組織增生性綜合症、自體免疫性溶血性貧血、巴雷特食管、自體免疫葡萄膜炎、結核病和腎病。較佳哮喘或過敏性皮膚病。

本揭露還提供了一種向表達IL-4R的細胞遞送糖皮質激素的方法，包括使表達IL-4R的細胞與本揭露所述的抗體-藥物偶聯物接觸的步驟。

本揭露進一步提供了一種試劑盒，其包含本揭露所述的抗體-藥物偶聯物，或醫藥組成物。

發明的詳細說明

除非另有限定，本揭露所用的所有技術和科學術語均與本揭露所屬技術領域具有通常知識者的通常理解一致。雖然也可採用與本揭露所述相似或等同的任何方法和材料實施或測試本揭露，但本揭露描述了較佳的方法和材料。描述和要求保護本揭露時，依據以下定義使用下列術語。

當本揭露中使用商品名時，申請人旨在包括該商品名產品的製劑、該商品名產品的非專利藥和活性藥物部分。

除非有相反陳述，在說明書和申請專利範圍中使用的術語具有下述含義。

術語“連接子”、“連接單元”、“接頭單元”、“接頭”或“連接片段”是指一端與配體連接而另一端與藥物相連的化學結構片段或鍵，也可以連接其他接頭後再與藥物相連。

接頭可以包含一種或多種接頭構件。例示性的接頭構件包括6-馬來醯亞胺基己醯基(MC)、馬來醯亞胺基丙醯基(MP)、纈胺酸-瓜胺酸(Val-Cit或vc)、丙胺酸-苯丙胺酸(ala-phe)、對胺基苄氧羰基(PAB)，及那些源自與接頭試劑的偶聯的：N-琥珀醯亞胺基4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)、N-琥珀醯亞胺基4-(N-馬來醯亞胺基甲基)環己烷-1羧酸酯(SMCC，在本文中也稱作MCC)和N-琥珀醯亞胺基(4-碘-乙醯基)胺基苯甲酸酯(SIAB)。接頭可以包括拉伸單元、間隔單元、胺基酸單元和延伸單元。可以藉由本領域已知方法合成，諸如US2005-0238649A1中所記載的。接頭 可以是便於在細胞中釋放藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩定接頭(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接頭、光不穩定接頭、二甲基接頭、或含二硫化物接頭(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美國專利No.5,208,020)。

術語“拉伸單元”指一端藉由碳原子與抗體共價連接而另一端與胺基酸單元、二硫化物部分、磺醯胺部分或非肽化學部分相連的化學結構片段。

術語“間隔單元”是一種雙功能化合結構片段，可用於偶聯胺基酸單元和糖皮質激素最終形成抗體-藥物偶聯物，這種偶聯方式可以將糖皮質激素選擇性的連接到胺基酸單元上。

術語“胺基酸”是指分子結構中含有胺基和羧基，並且胺基和羧基都直接連接在-CH-結構上的有機化合物。通式是H2NCHRCOOH，R為H、取代或未取代烷基等。根據胺基連結在羧酸中碳原子的位置，可分為α、β、γ、δ、ε……-胺基酸。在生物界中，構成天然蛋白質的胺基酸具有其特定的結構特點，即其胺基直接連接在α-碳原子上，即α-胺基酸，包括甘胺酸(Glycine)、丙胺酸(Alanine)、纈胺酸(Valine)、亮胺酸(Leucine)、異亮胺酸(Isoleucine)、苯丙胺酸(Phenylalanine)、色胺酸(Tryptophan)、酪胺酸(Tyrosine)、天冬胺酸(Aspartic acid)、組胺酸(Histidine)、天冬醯胺(Asparagine)、谷胺酸(Glutamic acid)、賴胺酸(Lysine)、穀胺醯胺(Glutamine)、甲硫胺酸(Methionine)、精胺酸(Arginine)、絲胺酸(Serine)、蘇胺酸(Threonine)、半胱胺酸(Cysteine)、脯胺酸(Proline)等。非天然胺基酸如瓜胺酸。如所屬技術領域具有通常知識者所 公知的，非天然胺基酸並不構成天然蛋白質，因此也不參與本揭露中抗體的合成。本揭露所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。

術語“抗體-藥物偶聯物”，指配體藉由穩定的連接單元與具有生物活性的藥物相連。在本揭露中“抗體-藥物偶聯物”(antibody drug conjugate，ADC)，指把單株抗體或者抗體片段藉由穩定的連接單元與具有生物活性的糖皮質激素相連。其中抗體或抗體片段可藉由其中的特定基團(例如鏈間二硫鍵)與包含接頭的糖皮質激素分子相結合。

術語“載藥量”是指抗體-藥物偶聯物群體中，每個抗體-藥物偶聯物分子載有的藥物平均數量，也可以表示為藥物量和抗體量的比值。載藥量的範圍可以是每個抗體(Ab)連接1-20個，較佳1-10個糖皮質激素(D)。在本揭露的實施方式中，載藥量表示為k，示例性的可以為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或任意兩數值之間數值的均值。較佳1-10，更佳1-8，或2-8，或2-7，或3-8，或3-7，或3-6，或4-7，或4-6，或4-5的均值。可用常規方法如UV/可見光光譜法、質譜、ELISA試驗、單抗分子大小變異體測定法(CE-SDS)和HPLC特徵鑑定偶聯反應後每個ADC分子的藥物平均數量。

本揭露單抗分子大小變異體測定法(CE-SDS)可採用十二烷基硫酸鈉毛細管電泳(CE-SDS)紫外檢測方法，在還原和非還原條件下，依據分子量大小，按毛電泳法(2015年版《中國藥典》0542)，定量測定重組單株抗體產品的純度。

本揭露的一個實施方式中，糖皮質激素藉由連接單元偶聯在配體的N端胺基和/或賴胺酸殘基的ε-胺基上，一般地，偶聯反應中能與抗體偶聯的藥物分子數將小於理論上的最大值。

可以用以下非限制性方法控制抗體-藥物偶聯物的載量，包括：

(1)控制連接試劑和單抗的莫耳比，

(2)控制反應時間和溫度，

(3)選擇不同的反應試劑。

術語“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。

抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。 可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。

本揭露的抗體包括鼠源抗體、嵌合抗體、人源化抗體和全人源抗體，較佳人源化抗體和全人源抗體。

術語“鼠源抗體”在本揭露中為根據本領域知識和技能用鼠製備抗體。製備時用特定抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。

術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恆定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恆定區基因，將鼠可變區基因與人恆定區基因連接成嵌合基因後插入表達載體中，最後在真核系統或原核系統中表達嵌合抗體分子。

術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體框架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量鼠蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲 得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。為避免免疫原性下降的同時，引起的活性下降，可對該人抗體可變區框架序列進行最少反向突變或回復突變，以保持活性。本揭露的人源化抗體也包括進一步由噬菌體展示對CDR進行親和力成熟後的人源化抗體。進一步描述參與人源化可使用小鼠抗體的方法的文獻包括，例如Queen等，Proc.，Natl.Acad.Sci.USA，88，2869，1991和Winter及其同事的方法[Jones等，Nature，321，522(1986)，Riechmann，等，Nature，332，323-327(1988)，Verhoeyen，等，Science，239，1534(1988)]。

術語“全人源抗體”、“全人抗體”或“完全人源抗體”，也稱“全人源單株抗體”，其抗體的可變區和恆定區都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。單株抗體的發展經歷了四個階段，分別為：鼠源性單株抗體、嵌合性單株抗體、人源化單株抗體和全人源單株抗體。本揭露為全人源單株抗體。全人抗體製備的相關技術主要有：人融合瘤技術、EBV轉化B淋巴細胞技術、噬菌體顯示技術(phage display)、轉基因小鼠抗體製備技術(transgenic mouse)和單個B細胞抗體製備技術等。

術語“抗原結合片段”是指抗體的保持特異性結合抗原的能力的一個或多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來進行抗體的抗原結合功能。“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')₂片段，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1結構 域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)單結構域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH結構域組成；和(vi)分離的互補決定區(CDR)或(vii)可視需要地藉由合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能夠產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用所屬技術領域具有通常知識者已知的常規技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亞型)、IgA1、IgA2、IgD、IgE或IgM抗體。

Fab是藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H鏈的224位的胺基酸殘基)處理IgG抗體分子所獲得的片段中的具有約50,000的分子量並具有抗原結合活性的抗體片段，其中H鏈N端側的約一半和整個L鏈藉由二硫鍵結合在一起。

F(ab')2是藉由用酶胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下方部分而獲得的分子量為約100,000並具有抗原結合活性並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區的抗體片段。

Fab'是藉由切割上述F(ab')2的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50,000並具有抗原結合活性的抗體片段。

此外，可以藉由將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產該Fab'。

術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH₂-VL-接頭-VH-COOH或NH₂-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本揭露的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

術語“CDR”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。該6個CDR的最常用的定義之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定義只應用於輕鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及重鏈可變結構域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。通常，每個重鏈可變區中存在三個CDR(HCDR1、HCDR2、 HCDR3)，每個輕鏈可變區中存在三個CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。可以使用各種公知方案中的任何一種來確定CDR的胺基酸序列邊界，包括“Kabat”編號規則(參見Kabat等(1991)，“Sequences of Proteins of Immunological Interest”，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD)、“Chothia”編號規則(參見Al-Lazikani等人，(1997)JMB 273：927-948)和ImMunoGenTics(IMGT)編號規則(參見Lefranc M.P.，Immunologist，7，132-136(1999)；Lefranc，M.P.等，Dev.Comp.Immunol.，27，55-77(2003))等。例如，對於經典格式，遵循Kabat規則，該重鏈可變域(VH)中的CDR胺基酸殘基編號為31-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)；輕鏈可變域(VL)中的CDR胺基酸殘基編號為24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)。遵循Chothia規則，VH中的CDR胺基酸編號為26-32(HCDR1)、52-56(HCDR2)和95-102(HCDR3)；並且VL中的胺基酸殘基編號為26-32(LCDR1)、50-52(LCDR2)和91-96(LCDR3)。藉由組合Kabat和Chothia兩者的CDR定義，CDR由人VH中的胺基酸殘基26-35(HCDR1)、50-65(HCDR2)和95-102(HCDR3)和人VL中的胺基酸殘基24-34(LCDR1)、50-56(LCDR2)和89-97(LCDR3)構成。遵循IMGT規則，VH中的CDR胺基酸殘基編號大致為26-35(CDR1)、51-57(CDR2)和93-102(CDR3)，VL中的CDR胺基酸殘基編號大致為27-32(CDR1)、50-52(CDR2)和89-97(CDR3)。遵循IMGT規則，抗體的CDR區可以使用程序IMGT/DomainGap Align確定。

術語“抗體框架”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。

“與IL-4R結合”，指能與人IL-4R(或其表位、片段)相互作用。本文的術語“抗原結合位點”指由本文抗體或抗原結合片段識別的三維空間位點。

術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位。表位通常以獨特的空間構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或非連續的胺基酸(參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996))。

術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大約小於10^-7M，例如：大約小於10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的親和力(KD)結合。

術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增強子有效地連接至該編碼序列。

術語“載體”是指能夠運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中 可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能夠在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。

現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟體，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。

術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NS0細胞。

本揭露工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推 薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。陽性的株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法沖提結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。

胺基酸序列“同一性”指在比對胺基酸序列及必要時引入間隙，以達成最大序列同一性百分比，且不將任何保守性取代視為序列同一性的一部分，第一序列中與第二序列中的胺基酸殘基同一的胺基酸殘基的百分比。為測定胺基酸序列同一性百分比的目的，比對可以藉由屬本領域技術的範圍內的多種方式來實現，例如使用公開可得到的計算機軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟體。所屬技術領域具有通常知識者可確定適用於測量比對的參數，包括在所比較的序列全長上達成最大比對所需的任何算法。

術語“抗IL-4R抗體”或“與IL-4R結合的抗體”是指能夠例如以足夠的親和力結合IL-4R的抗體，使得該抗體可用作靶向IL-4R的治療劑。抗IL-4R抗體與不相關的非IL-4R蛋白的結合程度可以小於如，例如，藉由放射免疫測定(RIA)所測量的抗體與IL-4R的結合的約10%。在一些實施方案中，與IL-4R結合的抗體具有

1μM、

100nM、

10nM、

1nM或

0.1nM的解離常數(Kd)。

術語“肽”是指介於胺基酸和蛋白質之間的化合物片段，由2個或2個以上胺基酸分子藉由肽鍵相互連接而成，是蛋白質的結構與功能片段，如激素、酶類等本質上都是肽。

術語“糖”是指由C、H、O三種元素組成的生物大分子，可分為單糖、二糖和多糖等。

術語“螢光探針”是指在紫外-可見-近紅外區有特徵螢光，並且其螢光性質(激發和發射波長、強度、壽命和偏振等)可隨所處環境的性質，如極性、折射率、黏度等改變而靈敏地改變的一類螢光性分子，其與核酸(DNA或RNA)、蛋白質或其他大分子結構非共價相互作用而使一種或幾種螢光性質發生改變，可用於研究大分子物質的性質和行為。

術語“烷基”指飽和脂肪族烴基團，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，較佳含有1至12個碳原子的烷基。非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己 基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各種支鏈異構體等。更佳的是含有1至6個碳原子的烷基，非限制性實施例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、側氧基、羧基或羧酸酯基。

術語“雜烷基”指含有一個或多個選自N、O或S的雜原子的烷基，其中烷基如上所定義。

術語“環烷基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，環烷基環包含3至20個碳原子，較佳包含3至12個碳原子，更佳包含3至6個碳原子。單環環烷基的非限制性實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基、環庚基、環庚三烯基、環辛基等；多環環烷基包括螺環、稠環和橋環的環烷基。“碳環”指的是環烷基中的環系。

術語“螺環烷基”指5至20員的單環之間共用一個碳原子(稱螺原子)的多環基團，其可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全 共軛的π電子系統。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據環與環之間共用螺原子的數目將螺環烷基分為單螺環烷基、雙螺環烷基或多螺環烷基，較佳為單螺環烷基和雙螺環烷基。更佳為4員/4員、4員/5員、4員/6員、5員/5員或5員/6員單螺環烷基。“螺碳環”指的是螺環烷基中的環系。螺環烷基的非限制性實例包括：

術語“稠環烷基”指5至20員，系統中的每個環與體系中的其他環共享毗鄰的一對碳原子的全碳多環基團，其中一個或多個環可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環稠環烷基，較佳為雙環或三環，更佳為5員/5員或5員/6員雙環烷基。“稠碳環”指的是稠環烷基中的環系。稠環烷基的非限制性實例包括：

術語“橋環烷基”指5至20員，任意兩個環共用兩個不直接連接的碳原子的全碳多環基團，其可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環橋環烷基，較佳為雙環、三環或四環，更佳為雙環或三環。橋環烷基的非限制性實例包括：

該環烷基環可以稠合於芳基、雜芳基或雜環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為環烷基，非限制性實例包括茚滿基、四氫萘基、苯并環庚烷基等。環烷基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、側氧基、羧基或羧酸酯基。

術語“雜環基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，其包含3至20個環原子，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)_m(其中m是整數0至2)的雜原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的環部分，其餘環原子為碳。較佳包含3至12個環原子，其中1~4個是雜原子；更佳包含3至6個環原子。單環雜環基的非限制性實例包括吡咯烷基、咪唑烷基、四氫呋喃基、四氫噻吩基、二氫咪唑基、二氫呋喃基、二氫吡唑基、二氫吡咯基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、硫嗎啉基、高哌嗪基等，較佳哌啶基、吡咯烷基。多環雜環基包括螺環、稠環和橋環的雜環基。“雜環”指的是雜環基中的環系。

術語“螺雜環基”指5至20員的單環之間共用一個原子(稱螺原子)的多環雜環基團，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)_m(其中 m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。其可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據環與環之間共用螺原子的數目將螺雜環基分為單螺雜環基、雙螺雜環基或多螺雜環基，較佳為單螺雜環基和雙螺雜環基。更佳為4員/4員、4員/5員、4員/6員、5員/5員或5員/6員單螺雜環基。“螺雜環”指的是螺雜環基中的環系。螺雜環基的非限制性實例包括：

術語“稠雜環基”指5至20員，系統中的每個環與體系中的其他環共享毗鄰的一對原子的多環雜環基團，一個或多個環可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)_m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環稠雜環基，較佳為雙環或三環，更佳為5員/5員或5員/6員雙環稠雜環基。“稠雜環”指的是稠雜環基中的環系。稠雜環基的非限制性實例包括：

術語“橋雜環基”指5至14員，任意兩個環共用兩個不直接連接的原子的多環雜環基團，其可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)_m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。較佳為6至14員，更佳為7至10員。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環橋雜環基，較佳為雙環、三環或四環，更佳為雙環或三環。橋雜環基的非限制性實例包括：

該雜環基環可以稠合於芳基、雜芳基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜環基，其非限制性實例包括：

和

等。

雜環基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、側氧基、羧基或羧酸酯基。

術語“芳基”指具有共軛的π電子體系的6至14員全碳單環或稠合多環(也就是共享毗鄰碳原子對的環)基團，較佳為6至10員，例如苯 基和萘基。該芳基環可以稠合於雜芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為芳基環。“芳環”指的是芳基中的環系。芳基非限制性實例包括：

芳基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、羧基或羧酸酯基，較佳苯基。

術語“稠環芳基”可以是含有8-14個環原子由兩個或兩個以上環狀結構彼此共用兩個相鄰的原子連接起來形成的不飽和的具有芳香性的稠環結構，環原子較佳8-12個。例如包括全部不飽和稠環芳基，例如萘、菲等，還包括部分飽和稠環芳基，例如苯并3-8員飽和單環環烷基、苯并3-8員部分飽和單環環烷基。“稠芳環”指的是稠環芳基中的環系。稠環芳基具體實例如2,3-二氫-1H-茚基、IH-茚基、1,2,3,4-四氫萘基、1,4-二氫萘基等。

術語“雜芳基”指包含1至4個雜原子、5至14個環原子的雜芳族體系，其中雜原子選自氧、硫和氮。雜芳基較佳為5至12員，例如咪唑基、呋喃基、噻吩基、噻唑基、吡唑基、噁唑基、吡咯基、四唑基、吡啶 基、嘧啶基、噻二唑、吡嗪基等，較佳為咪唑基、吡唑基、嘧啶基或噻唑基；更佳為吡唑基或噻唑基。該雜芳基環可以稠合於芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜芳基環。“雜芳環”指的是雜芳基中的環系。雜芳基非限制性實例包括：

雜芳基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、羧基或羧酸酯基。

術語“稠雜芳基”可以是含有5-14個環原子(其中至少含有一個雜原子)由兩個或兩個以上環狀結構彼此共用兩個相鄰的原子連接起來形成的不飽和的具有芳香性的稠環結構，同時包括碳原子、氮原子和硫原子可以被氧化，較佳"5-12員稠雜芳基"、"7-12員稠雜芳基"、"9-12員稠雜芳基"等，例如苯并呋喃基、苯并異呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、異吲哚、苯并噁唑基、苯并咪唑基、吲唑基、苯并三唑基、喹啉基、2-喹啉酮、4-喹啉酮、1-異喹啉酮、異喹啉基、吖啶基、菲啶基、苯并噠嗪基、酞嗪基、 喹唑啉基、喹喔啉基、酚嗪基、喋啶基、嘌呤基、萘啶基、吩嗪、吩噻嗪等。“稠雜芳環”指的是稠雜芳基中的環系。

稠雜芳基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、羧基或羧酸酯基。

術語“亞(伸)烷基(-CH₂-)”則表示烷烴分子中去除2個氫原子後餘下的部分，包括1至20個碳原子的直鏈和支鏈亞(伸)基團。含有1至6個碳原子的亞(伸)烷基，非限制性實施例包括亞甲基(-CH₂-)、亞(伸)乙基(如-CH₂CH₂-或-CH(CH₃)-)、亞(伸)丙基(如-CH₂CH₂CH₂-或-CH(CH₂CH₃)-)、伸丁基(如-CH₂CH₂CH₂CH₂-)。亞(伸)烷基可以是取代的或未取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，較佳一個或多個以下基團，獨立地選自鹵素、氘、羥基、硝基、氰基或胺基。同理，“亞(伸)烯基”、“亞(伸)雜芳基”、“亞(伸)芳基”、“亞(伸)雜環烷基”等如前所定義。

術語“亞(伸)鏈烯基”指包含具有2至8個碳原子，較佳地具有2至6個碳原子，更佳地具有2至4個碳原子並在任何位置具有至少一個雙鍵的線性鏈烯基，包括例如亞(伸)乙烯基、亞(伸)烯丙基(allylene)、亞(伸)丙烯基、亞(伸)丁烯基、亞(伸)異戊二烯基(prenylene)、亞(伸)丁二烯基(butadienylene)、亞(伸)戊烯基、亞(伸)戊二烯基、亞(伸)己烯基、亞(伸)己二烯基等。

術語“亞(伸)鏈炔基”包括具有2至8個碳原子，較佳地具有2至6個碳原子，更佳地具有2至4個碳原子且在任何位置具有至少一個三鍵的線性亞鏈炔基，包括例如亞乙炔基、亞丙炔基、亞丁炔基、亞戊炔基、亞己炔基等。

術語“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的環烷基)，其中烷基的定義如上所述。烷氧基的非限制性實例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基。烷氧基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、羧基或羧酸酯基。

術語“烷硫基”指-S-(烷基)和-S-(非取代的環烷基)，其中烷基的定義如上所述。烷硫基的非限制性實例包括：甲硫基、乙硫基、丙硫基、丁硫基、環丙硫基、環丁硫基、環戊硫基、環己硫基。烷硫基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基中的一個或多個取代基所取代。

術語“羥烷基”指被羥基取代的烷基，其中烷基如上所定義。

術語“鹵烷基”指被鹵素取代的烷基，其中烷基如上所定義。

術語“氘代烷基”指被氘原子取代的烷基，其中烷基如上所定義。

術語“羥基”指-OH基團。

術語“側氧”指=O基團。例如，碳原子與氧原子藉由雙鍵連接，其中形成酮或醛基。

術語“硫基”指=S基團。例如，碳原子與硫原子藉由雙鍵連接，形成硫羰基-C(S)-。

術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。

術語“胺基”指-NH₂。

術語“氰基”指-CN。

術語“硝基”指-NO₂。

術語“羧基”指-C(O)OH。

術語“醛基”指-CHO。

術語“羧酸酯基”指-C(O)O(烷基)或-C(O)O(環烷基)，其中烷基、環烷基如上所定義。

術語“醯鹵”指含有-C(O)-鹵素的基團的化合物。

術語“磺醯基”指-S(O)(O)-。

術語“亞磺醯基”指-S(O)-。

“胺基保護基”是本領域已知的適當的用於胺基保護的基團，參見文獻(“Protective Groups in Organic Synthesis”，5^Th.Ed.T.W.Greene & P.G.M.Wuts)中的胺基保護基團，較佳地，該胺基保護基可以是(C_1-10烷基或芳香基)醯基，例如：甲醯基，乙醯基，苯甲醯基等；可以是(C_1-6烷基或C_6-10芳基)磺醯基；也可以是(C_1-6烷氧基或C6_-10芳基氧基)羰基， 例如：Boc或Cbz；還可以是取代或非取代的烷基，例如：三苯甲基(Tr)、2,4-二甲氧基苄基(DMB)、對甲氧基苄基(PMB)或苄基(Bn)。

“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“視需要被烷基取代的雜環烷基團”意味著烷基可以但不必須存在，該說明包括雜環烷基團被烷基取代的情形和雜環烷基團不被烷基取代的情形。

術語“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。

術語“藥物載體”用於本揭露的藥物，是指能改變藥物進入人體的方式和在體內的分佈、控制藥物的釋放速度並將藥物輸送到靶向器官的體系。藥物載體釋放和靶向系統能夠減少藥物降解及損失，降低副作用，提高生物利用度。如可作為載體的高分子表面活性劑由於其獨特的兩親性結構，可以進行自組裝，形成各種形式的聚集體，較佳的實例如膠束、微乳液、凝膠、液晶、囊泡等。這些聚集體具有包載藥物分子的能力，同時又對膜有良好的滲透性，可以作為優良的藥物載體。

術語“賦形劑”是在藥物製劑中除主藥以外的附加物，也可稱為輔料。如片劑中的黏合劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑；半固體製劑軟膏劑、霜劑中的基質部分；液體製劑中的防腐劑、抗氧劑、矯味劑、芳香劑、助溶劑、乳化劑、增溶劑、滲透壓調節劑、著色劑等均可稱為賦形劑。

術語“稀釋劑”又稱填充劑，其主要用途是增加片劑的重量和體積。稀釋劑的加入不僅保證一定的體積大小，而且減少主要成分的劑量偏差，改善藥物的壓縮成型性等。當片劑的藥物含有油性組分時，需加入吸收劑吸收油性物，使保持“乾燥”狀態，以利於製成片劑。

本揭露中化合物可以含有一個或多個不對稱中心，因此可以產生對映異構體、非對映異構體，並且其可以根據絕對立體化學定義為(R)-或(S)-或用於胺基酸的(D)-或(L)-的其它立體異構形式。本揭露包括所有可能異構體以及其外消旋和光學純的形式。光學活性的(+)和(-)、(R)-和(S)-或(D)-和(L)-異構體可以使用手性合成子或手性試劑製備，或者可以使用常規方法例如色譜法和分級結晶製備。用於製備/分離各個對映體的常規方法包括從合適的光學純前體手性合成或使用例如手性高效液相色譜法(HPLC)的外消旋物(或鹽或衍生物的外消旋物)拆分。當本文描述的化合物含有烯雙鍵或其它幾何不對稱性中心，除非另有說明，否則其意味著該化合物包括E和Z幾何異構體。而且，所有的互變異構形式也意味著包括在內。

本揭露所述化合物的化學結構中，鍵“

”表示未指定構型，即如果化學結構中存在手性異構體，鍵“

”可以為“

”或“

”，或者同時包含“

”和“

”兩種構型。本揭露所述化合物的化學結構中，鍵“

”並未指定構型，即可以為Z構型或E構型，或者同時包含兩種構型。

“立體異構體”指藉由相同的鍵鍵合但具有不同的三維結構的相同原子組成的化合物，其不可互換。本揭露中預期各種立體異構體及其 混合物，並且包括“對映異構體”，其指其分子彼此為不能重疊的鏡像的兩種立體異構體。

“互變異構體”指質子從分子的一個原子轉移到同一分子的另一個原子。本揭露中包括任何該化合物的互變異構體。

本揭露所述化合物或其可藥用鹽、或其異構體的任何同位素標記的衍生物都被本揭露所覆蓋。能夠被同位素標記的原子包括但不限於氫、碳、氮、氧、磷、氟、氯、碘等。它們可分別被同位素同位素²H(D)、³H、¹¹C、¹³C、¹⁴C、¹⁵N、¹⁸F、³¹P、³²P、³⁵S、³⁶Cl和¹²⁵I等代替。除另有說明，當一個位置被特別地指定為氘(D)時，該位置應理解為具有大於氘的天然豐度(其為0.015%)至少3000倍的豐度的氘(即，至少45%的氘摻入)。

圖1顯示受試蛋白與人源IL-4Rα表達細胞的全細胞結合活性劑量-響應曲線

圖2顯示受試蛋白對IL-4/IL-13信號通路阻斷作用的劑量-響應曲線

圖3顯示受試蛋白在TF-1細胞中的內吞率-時間曲線

圖4顯示氣管內給藥後ADC-2和游離Budesonide在各組織的時間-濃度曲線

圖顯示測試例6肺泡灌洗液內白細胞與分型細胞計數

圖6：顯示測試例7肺泡灌洗液內白細胞與分型細胞計數

以下結合實施例進一步描述本揭露所述的化合物、可藥用鹽的製備，但這些實施例並非限制本揭露中的範圍。

本揭露中實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。

NMR位移(δ)以10^-6(ppm)的單位給出。NMR的測定是用Bruker AVANCE-400核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞碸(DMSO-d ⁶)，氘代氯仿(CDCl₃)，氘代甲醇(CD₃OD)，內標為四甲基矽烷(TMS)。

MS的測定用Shimadzu 2010 Mass Spectrometer或Agilent 6110A MSD質譜儀。

HPLC的測定使用Shimadzu LC-20A systems、Shimadzu LC-2010HT series或安捷倫Agilent 1200 LC高壓液相色譜儀(Ultimate XB-C18 3.0*150mm色譜管柱或Xtimate C18 2.1*30mm色譜管柱)。

手性HPLC分析測定使用Chiralpak IC-3 100×4.6mm I.D.,3um、Chiralpak AD-3 150×4.6mm I.D.,3um、Chiralpak AD-3 50×4.6mm I.D.,3um、Chiralpak AS-3 150×4.6mm I.D.,3um、Chiralpak AS-3 100×4.6mm I.D.,3μm、ChiralCel OD-3 150×4.6mm I.D.,3um、Chiralcel OD-3 100×4.6mm I.D.,3μm、ChiralCel OJ-H 150×4.6mm I.D.,5um、Chiralcel OJ-3 150×4.6mm I.D.,3um色譜管柱；薄層層析矽膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254矽膠板，薄層色譜法(TLC)使用的矽膠 板採用的規格是0.15mm~0.2mm，薄層層析分離純化產品採用的規格是0.4mm~0.5mm。

管柱層析一般使用煙臺黃海矽膠100~200目、200~300目或300~400目矽膠為載體。

手性製備管柱使用DAICEL CHIRALPAK IC(250mm*30mm,10um)或Phenomenex-Amylose-1(250mm*30mm,5um)。

CombiFlash快速製備儀使用Combiflash Rf150(TELEDYNE ISCO)。

激酶平均抑制率及IC₅₀值的測定用NovoStar酶標儀(德國BMG公司)。

本揭露的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買自ABCR GmbH & Co.KG，Acros Organics，Aldrich Chemical Company，韶遠化學科技(Accela ChemBio Inc)、達瑞化學品等公司。

實施例中無特殊說明，反應能夠均在氬氣氛或氮氣氛下進行。

氬氣氛或氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氬氣或氮氣氣球。

氫氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。

加壓氫化反應使用Parr 3916EKX型氫化儀和清藍QL-500型氫氣發生器或HC2-SS型氫化儀。

氫化反應通常抽真空，充入氫氣，重複操作3次。

微波反應使用CEM Discover-S 908860型微波反應器。

實施例中無特殊說明，溶液是指水溶液。

實施例中無特殊說明，反應的溫度為室溫，為20℃~30℃。

實施例中的反應進程的監測採用薄層色譜法(TLC)，反應所使用的展開劑，純化化合物採用的管柱層析的沖提劑的體系和薄層色譜法的展開劑體系包括：A：二氯甲烷/甲醇體系，B：正己烷/乙酸乙酯體系，C：石油醚/乙酸乙酯體系，D：石油醚/乙酸乙酯/甲醇，溶劑的體積比根據化合物的極性不同而進行調節，也可以加入少量的三乙胺和醋酸等鹼性或酸性試劑進行調節。

1.0M Tris buffer pH=8.30±0.1的配製：

50mL容量瓶中稱取tris 6.0g，加入40mL純化水，振盪溶解，滴加入濃鹽酸1.2mL，調pH至8.30，再用純化水定容。

Buffer A的配製：

在2.0L的容器中，加入KH₂PO4(8.50g)、K₂HPO4(8.56g)、NaCl(5.86g)和EDTA(1.50g)，加入1.6L注射用水，攪拌半小時，完全溶解後再用注射用水定容至2.0L，測定pH為6.30±0.1。

下述實驗中所用縮寫代表的含義如下：

DAST：二乙胺基三氟化硫；THF：四氫呋喃；NMP：N-甲基吡咯烷酮；DCM：二氯甲烷；m-CPBA：間氯過氧苯甲酸；DIEA：N,N-二異丙基乙胺；TEA：三乙胺；Boc：第三丁氧羰基，MeOH：甲醇；Et₂O：乙醚。

本申請中25G7、7B10抗體的製備、純化方法已在申請號為WO2020038454A1專利文件中記載，前述申請文件的全部內容均引入本揭露。

實施例1：N-((10S)-10-苄基-1-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘并[2',1'：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-1,6,9,12,15-五氧-3-側氧-5,8,11,14-四聚乙二醇-16-基)-1-(2-溴乙醯胺基)-3,6,9,12-四側氧十五烷-15-醯胺(化合物1)的製備

步驟1)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘胺醯甘胺醯-L-苯丙胺酸第三丁基酯(化合物1b)的製備

將化合物1a(5.14g，20.0mmol，1.0eq)和L-苯丙胺酸第三丁酯鹽酸鹽(7.08g，20.0mmol，1.0eq)置入250mL三口燒瓶中，加入無水DMF(60mL)溶清。冰浴冷卻，再加入HATU(9.12g,24.0mmol,1.2eq)和DIEA(7.74g，60.0mmol，3.0eq)，保持冰浴反應2 小時。向反應液中加入水，乙酸乙酯萃取，有機相用飽和食鹽水洗滌，乾燥，減壓濃縮得化合物1b(11.5g,100% yield)，粗品可直接投入下一步。

MS(ESI)：m/z 580.3[M+Na]⁺。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.21-8.16(m,1H),8.12-8.05(m,1H),7.91-7.87(m,2H),7.72-7.68(m,2H),7.64-7.59(m,1H),7.44-7.38(m,2H),7.36-7.25(m,4H),7.23-7.18(m,3H),4.41-4.18(m,4H),3.76-3.72(m,2H),3.68-3.61(m,2H),2.98-2.89(m,2H),2.69(s,2H),1.30(s,9H).

步驟2)甘胺醯甘胺醯-L-苯丙胺酸第三丁酯(化合物1c)的製備

將化合物1b(5.57g，10.0mmol，1.0eq)置入250mL三口燒瓶中，加入無水DCM(60mL)溶清，冰浴冷卻。緩慢加入哌啶(8.5g，100.0mmol，10.0eq)，加畢之後維持室溫攪拌反應約2小時。直接將反應液濃縮至乾，粗品經管柱層析純化得化合物1c(2.70g，81% yield)

MS(ESI)：m/z 358.3[M+H]⁺。

步驟3)(1-(9H-芴-9-基)-3-側氧-2,7,10,13,16-五氧-4-四聚乙二醇-19-氧基)甘胺醯甘胺醯-L-苯丙胺酸第三丁酯(化合物1d)的製備

100mL三口燒瓶中加入原料1-(9H-芴-9-基)-3-側氧-2,7,10,13,16-五氧-4-四聚乙二醇-19-油酸(1.0g，2.05mmol，1.0eq；來源於通萊生化)和1c(0.69g，2.05mmol，1.0eq)，加入無水DMF(25mL)溶清，冰浴冷卻。加入HATU(1.01g,2.67mmol,1.3eq)和DIEA(529mg，4.10mmol，2.0eq)，維持冰浴反應1小時。向反應液中加 入水，乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌，乾燥且減壓濃縮得化合物1d(1.60g,97% yield)。

MS(ESI)：m/z 805.3[M+H]⁺。

步驟4)(1-(9H-芴-9-基)-3-側氧-2,7,10,13,16-五氧-4-四聚乙二醇-19-氧基)甘胺醯甘胺醯-L-苯丙胺酸(化合物1e)的製備

100mL單口瓶中加入化合物1d(1.60g，1.99mmol，1.0eq)，加入無水二氯甲烷(16mL)溶解。室溫下加入三氟乙酸(8mL)，維持攪拌反應2小時。將反應液直接濃縮至乾，加入乙酸乙酯溶解，飽和食鹽水洗滌，乾燥，減壓濃縮得化合物1e(1.23g，83% yield)；

MS(ESI)：m/z 749.3[M+H]⁺。

步驟5)(9H-芴-9-基)甲基(2-(((2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘并[2',1'：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-2-側氧乙氧基)甲基)胺基)-2-側氧乙基)胺基甲酸酯(化合物1f)的製備

100mL三口瓶中加入原料布地奈德(1.29g，3.0mmol，1.0eq)和(2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)乙酸甲酯(1.16g，3.15mmol，1.0eq；參考文獻“Tetrahedron,2018,74(15),1951-1956”的方法製備)及對甲苯磺酸吡啶鹽(75mg，0.30mmol，0.1eq)。室溫下加入加入無水四氫呋喃(20mL)，回流加熱反應4小時。直接將反應液濃縮至乾，粗品管柱層析純化得1f(0.54g，24% yield)。

MS(ESI)：m/z 739.4[M+H]⁺。

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.76-8.69(m,1H),7.91-7.84(m,2H),7.73-7.67(m,2H),7.63-7.57(m,1H),7.43-7.58(m,2H),7.35-7.23(m,3H),6.13(d,J=7.5Hz,1H),5.91(s,2H),5.15-4.97(m,1H),4.73-4.45(m,5H),4.30-4.09(m,5H),3.65-3.59(m,2H),2.29-2.21(m,1H),2.11-1.87(m,2H),1.74-1.21(m,11H),1.09-0.77(m,8H).

步驟6)2-胺基-N-((2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘并[2',1'：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-2-側氧乙氧基)甲基)乙醯胺(化合物1g)的製備

25mL單口瓶中置入化合物1f(540mg，0.73mmol，1.0eq)，加入無水二氯甲烷(10mL)溶解。冰浴冷卻，加入DBU(167mg，1.10mmol，1.5eq)，維持攪拌反應30分鐘。加入水分液，水相用二氯甲烷萃取兩次，飽和食鹽水洗滌，減壓濃縮得化合物1g(450mg，100% yield)，粗品可以直接用於下一步反應。

MS(ESI)：m/z 517.4[M+H]⁺。

步驟7)(9H-芴-9-基)甲基((10S)-10-苄基-1-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘并[2',1'：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-1,6,9,12,15,18-六側氧-3,21,24,27,30-五側氧-5,8,11,14,17-五胺雜三十烷-32-基)胺基甲酸酯(化合物1h)的製備

100mL三口燒瓶中置入化合物1g(0.45g粗品，折算為0.73mmol，1.0eq)和1e(0.55g，0.73mmol，1.0eq)，加入無水DMF(9 mL)溶清。冰浴冷卻，再依次加入HATU(361mg,0.95mmol,1.3eq)和DIEA(189mg，1.46mmol，2.0eq)，維持攪拌反應1小時。向反應液中加入水，二氯甲烷萃取兩次，合併有機相，飽和食鹽水洗滌一次，乾燥且減壓濃縮得粗品。將粗品在混合溶劑石油醚和乙酸乙酯中打漿純化，得化合物1h(710mg，78% yield)。

MS(ESI)：m/z 1269.7[M+Na]⁺。

步驟8)1-胺基-N-((10S)-10-苄基-1-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘并[2',1'：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-側氧-5,8,11,14-聚四乙二醇-16-基-3,6,9,12-四側氧十五烷-15-醯胺(化合物1i)的製備

25mL單口瓶中置入化合物1h(350mg，0.28mmol，1.0eq)，加入無水二氯甲烷(10mL)溶清。冰浴冷卻，加入DBU(64mg，0.42mmol，1.5eq)，維持攪拌反應1小時。直接將反應液濃縮至乾，得粗品，再經管柱層析純化得化合物1i(289mg，89% yield)。

MS(ESI)：m/z 1025.6[M+H]⁺。

步驟9)N-((10S)-10-苄基-1-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘并[2',1'：4,5]茚並[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-1,6,9,12,15-五氧-3-側氧-5,8,11,14-四聚乙二醇-16-基)-1-(2-溴乙醯胺基)-3,6,9,12-四側氧十五烷-15-醯胺(化合物1)的製備

25ml Schlenk-Tube中置入溴乙酸固體(35.2mg，0.127mmol，1.0eq)和EEDQ(63mg，0.25mmol，2.0eq)，加入無水DMF(5mL)溶清。維持室溫攪拌反應1小時。化合物1i(130mg，0.127mmol，1.0eq)溶解在DMF(2mL)中，將此溶液逐滴加入到上述製備的活性酯溶液中，加畢再維持室溫反應2小時。向反應體系中加入水，乙酸乙酯萃取兩次，合併有機相，飽和食鹽水洗滌，乾燥且減壓濃縮得粗品，再經管柱層析純化得化合物1(39mg,27% yield)。

MS(ESI)：m/z 1145.5/1147.6[M+1]⁺。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ 8.62-8.57(m,1H),8.34-8.28(m,2H),8.19-8.11(m,2H),8.03-7.99(m,1H),7.30-7.17(m,6H),6.15(d,J=9.6Hz,1H),5.92(s,2H),5.18-5.03(m,1H),4.72-4.47(m,5H),4.29-4.15(m,2H),3.78-3.42(m,27H),3.27-3.21(m,2H),3.06-2.84(m,2H),2.41-2.28(m,3H),2.06-1.73(m,2H),1.60-1.24(m,10H),1.01-0.82(m,8H).

實施例2：

N-((10S)-10-苄基-1-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧-10-丙基l-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘并[2',1'：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-1,6,9,12,15-五氧-3-側氧-5,8,11,14-四聚乙二醇-16-基)-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四側氧十五烷-15-醯胺

步驟1)(((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)甘胺醯甘胺醯-L-苯丙胺酸(化合物2a)的製備

100mL單口瓶中置入化合物1b(1.50g，2.69mmol，1.0eq)，加入4M HCl的1,4-二氧六環溶液(20mL)溶解。室溫下維持攪拌4小時至原料1b反應完全。將反應液直接濃縮至乾，得化合物1a(1.34g，100% yield)。

MS(ESI)：m/z 502.3[M+1]⁺

步驟2)(9H-芴-9-基)甲基-((10S)-10-苄基-1-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7, 8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘并[2',1'：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-1,6,9,12,15-五側氧-3-氧-5,8,11,14-四聚乙二醇-16-基)胺基甲酸酯(化合物2b)的製備

將化合物2a(0.97g，1.63mmol，1.0eq)和1g(1.0g，1.95mmol，1.2eq)置於100mL三口燒瓶中。加入DMF(20mL)，冰浴冷卻。依次加入HATU(927mg，2.44mmol，1.5eq)和DIEA(420mg，3.26mmol，2.0eq)，加完後，維持冰浴反應1-2小時。將反應液濃縮，經管柱層析純化得化合物2b(860mg，53% yield)。

MS(ESI)：m/z 1000.5[M+1]⁺

步驟3(2S)-2-(2-(2-胺乙醯胺基)乙醯胺基-N-(2-(((2-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧-10-丙基-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘并[2',1'：4,5]茚並[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b-基)-2-側氧乙氧基)甲基)胺基)-2-側氧乙基)-3-苯丙醯胺(化合物2c)的製備

25mL單口瓶中置入化合物2b(860mg，0.86mmol，1.0eq)，加入無水DMF烷(10mL)溶清。冰浴冷卻，加入DBU(196mg，1.29mmol，1.5eq)，維持攪拌反應30分鐘。直接將反應液濃縮，經管柱層析純化得化合物2c(485mg，72% yield)。

MS(ESI)：m/z 778.4[M+1]⁺

步驟4)N-((10S)-10-苄基-1-((6aR,6bS,7S,8aS,8bS,11aR,12aS,12bS)-7-羥基-6a,8a-二甲基-4-側氧-10-丙基l-1,2,4,6a,6b,7,8,8a,11a,12,12a,12b-十二氫-8bH-萘并[2',1'：4,5]茚并[1,2-d][1,3]二氧雜環戊-8b- 基)-1,6,9,12,15-五氧-3-側氧-5,8,11,14-四聚乙二醇-16-基)-1-(2,5-二側氧-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四側氧十五烷-15-醯胺(化合物2d)的製備

100mL三口燒瓶中置入化合物2c(480mg，0.62mmol，1.0eq)和1-(2,5-二氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12-四氧戊二酸-15-油酸(213mg，0.62mmol，1.0eq；來源於通萊生化)，加入無水DMF(10mL)溶清。冰浴冷卻，再依次加入HATU(352mg,0.93mmol,1.5eq)和DIEA(159mg，1.23mmol，2.0eq)，維持攪拌反應1小時。直接將反應液濃縮，經管柱層析純化得化合物2d(360mg，53% yield)。

MS(ESI)：m/z 1105.6[M+1]⁺

¹H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ 8.61-8.56(m,1H),8.32-8.26(m,1H),8.22-8.13(m,2H),8.03-7.96(m,1H),7.39-7.20(m,6H),7.02(s,2H),6.17-6.13(m,1H),5.92(s,2H),5.16-4.99(m,1H),4.76-4.40(m,6H),4.29-4.16(m,2H),3.64-3.19(m,26H),3.09-3.02(m,1H),2.86-2.79(m,1H),2.41-2.26(m,3H),2.12-1.90(m,2H),1.78-1.25(m,10H),1.03-0.83(m,8H).

實施例3：25G7-Fab蛋白製備流程

合成抗體的基因序列，亞選殖至pcDNA3.4載體。連接產物轉化Top10感受態細胞，挑取陽性株擴大培養。株接種於培養基中擴大培養，大量抽提含25G7-Fab抗體的脫氧核糖核酸序列的質粒。採用脂質體轉染，將表達質粒與轉染試劑混合後，加入Expi 293細胞中，恆溫培養箱培養5天後收穫細胞培養物。將細胞培養物離心後取上清，過濾除去細胞碎片，收集澄清液。使用kappa select層析管柱捕獲目的蛋白。目的蛋白 經過濾，用Nanodrop測定A280吸光度值並除以消光係數的方法得到蛋白濃度，乘以體積以確定最終產量，凝膠電泳、體積排阻色譜法對蛋白進行SDS-PAGE、SEC-HPLC及內毒素檢測，得到最終產物是25G7-Fab。

實施例4：AZD1402-TAG蛋白製備流程

AZD1402-TAG(蛋白序列來自於專利WO2020200960A1中SEQ ID NO1，為了便於蛋白製備純化，該序列C端融合了His tag，最終命名為AZD1402-TAG)。

AZD1402-TAG

SEQ ID NO：52

合成上述蛋白的編碼基因序列，亞選殖至pcDNA3.4。將表達質粒與轉染試劑混合後37℃孵育15分鐘，將混合液逐滴加入HEK293細胞液中，細胞液37℃搖床培養一週後，將細胞培養物離心後取上清。使用不含咪唑的緩衝液平衡鎳親和層析管柱，然後將蛋白樣品流經鎳親和層析管柱進行上樣，再次使用不含咪唑的緩衝液平衡後，用含有高濃度咪唑的緩衝液沖提管柱結合蛋白。並將沖提蛋白轉移至透析袋於1×PBS中透析，置換為PBS存儲緩衝液。經檢測，獲得目的蛋白。

實施例5：抗體藥物偶聯物ADC-1的製備

Buffer A的配製：在2.0L的容器中，加入KH₂PO₄(8.50g)、K₂HPO₄(8.56g)、NaCl(5.86g)和EDTA(1.50g)，加入1.6L注射用水，攪拌半小時，完全溶解後再用注射用水定容至2.0L，測定pH為6.30±0.1。

於37℃，向抗體25G7-Fab(重鏈序列如SEQ ID NO：50所示，輕鏈序列如SEQ ID NO：45所示)的buffer A緩衝水溶液(pH=6.3的0.05M緩衝水溶液；10.0mg/ml，0.5mL，0.125mmol)加入配製好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(2.5mM，100.0uL，0.250mmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。

將1.0M Tris buffer(50uL)加入至上述反應液中，再將化合物1(1.43mg，1.250mmol)溶解於25ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：buffer A)，並用超濾管濃縮得到標題產物ADC-1的buffer A緩衝液(6.06mg/mL，0.60mL)，於4℃冷凍儲存。

實施例6：抗體藥物偶聯物ADC-2的製備

於37℃，向抗體25G7-Fab的buffer A緩衝水溶液(pH=6.3的0.05M緩衝水溶液；10.0mg/ml，6.0mL，1.50mmol)加入配製好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10.0mM，1.50mL，15.0mmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。

將化合物2(12.2mg，12.0mmol)溶解於300ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠管柱脫鹽純化(沖提相：buffer A)，並用超濾管濃縮得到標題產物ADC-2的buffer A緩衝液(3.65mg/mL，12.8mL)，於4℃冷凍儲存。

生物學評價

以下結合測試例進一步描述解釋本揭露中，但這些實施例並非意味著限制本揭露中的範圍。

測試例1：抗體藥物偶聯物ADC-2與人源IL-4Rα蛋白的親和力檢測

1、受試蛋白

抗體藥物偶聯物ADC-2，25G7-Fab，AZD1402-TAG

2、實驗方法

採用表面電漿共振技術(surface plasmon resonance,SPR)檢測抗體藥物偶聯物ADC-2、25G7-Fab及AZD1402-TAG與人源IL-4Rα抗原蛋白的親和力。Biacore 8K(Cytiva)中放入SA傳感器芯片(Cytiva)，Biotin標記的人源IL-4Rα蛋白(SinoBiological，CAT# 10402-H08H-B)捕獲於SA傳感器芯片上，流動相採用HBS-EP+緩衝溶液(10mM HEPES,150mM NaCl,3mM EDTA,0.05% surfactant P20)。各受試蛋白用HBS-EP+緩衝溶液進行2倍梯度稀釋後作為分析物進樣，設置流速為30μL/min，ADC-2、25G7-Fab和AZD1402-TAG的檢測時間為結合100秒，解離600秒。採用Biacore 8K evaluation software軟體(Cytiva)進行分析，獲得各受試蛋白的親和力數據。

3、實驗結果

結果如表1所示，ADC-2結合人源IL-4Rα抗原蛋白的KD值為11.0pM，略優於AZD1402-TAG和25G7-Fab。

測試例2：抗體藥物偶聯物ADC-2與人源IL-4Rα表達細胞的全細胞結合活性

1、受試蛋白

抗體藥物偶聯物ADC-2，25G7-Fab，hu25G7(重鏈序列如SEQ ID NO：44所示，輕鏈序列如SEQ ID NO：45所示)，AZD1402-TAG。

2、實驗方法

TF-1及Karpas 299細胞株經鑑定可表達IL-4Rα。將處於對數生長期的TF-1和Karpas299細胞收集後，計數並調整細胞密度，以1×10⁵細胞/孔接入圓底96孔板。將細胞與不同濃度的抗IL-4R抗體(25G7、裸抗25G7-Fab)、抗體藥物偶聯物ADC-2及AZD1402-TAG在4℃條件下孵育45分鐘，用FACS Buffer(含2% FBS的PBS)洗去抗體後，加入螢光標記二抗進行染色，25G7-Fab、hu25G7及ADC-2採用FITC偶聯的抗人IgG(Fab特異性)二抗(Sigma，CAT#F5512-1ML)，AZD1402-TAG採用FITC偶聯的抗His抗體(GenScript，CAT#A01620)。將細胞與二抗在4℃條件下孵育30分鐘，隨後用FACS Buffer洗滌兩次，流式細胞儀進行檢測(BD，FACS Celesta)，檢測結果採用FlowJo(FlowJo,LLC)軟體進行分析。

3、實驗結果

結果如圖1及表2所示，ADC-2結合TF-1細胞的EC₅₀值為0.107nM，與裸抗25G7-Fab和hu25G7相當。AZD1402-TAG與TF-1細胞的結合作用強，但因檢測抗體不同，數據與ADC-2、25G7-Fab等不具有可比性。

測試例3：抗體藥物偶聯物ADC-2對IL-4/IL-13信號通路的阻斷作用

1、受試蛋白

抗體藥物偶聯物ADC-2，25G7-Fab。

2、實驗方法

STAT6的活化是IL-4/IL-13信號通路激活的關鍵步驟。本實施例中，ADC-2對IL-4/IL-13信號通路的阻斷作用藉由HEK-Blue^TM IL-4/IL-13報告基因細胞株進行評估。該細胞購自Invivogen(Cat#hkb-i1413)，其中過表達了人源STAT6基因及由磷酸化STAT6誘導表達的分泌型鹼性磷酸酶報告基因(Secreted alkaline phos-phatase，SEAP)，可藉由SEAP受質QUANTI-Blue檢測細胞培養上清中分泌的SEAP的含量以評估IL-4/IL-13信號通路的活化水平。

將處於對數生長期的HEK-Blue^TM IL-4/IL-13細胞收集後調整密度為5×10⁵細胞/ml，每孔100μL加入96孔平底培養板中，於37℃，5% CO₂條件下培養24小時，而後每孔加入20μL梯度稀釋的受試蛋白和20μL重組人IL-4或IL-13，將細胞培養板放在37℃，5% CO₂培養箱中繼續孵育20~24小時。培養結束後，取出細胞培養板，每孔吸取20μL細 胞培養上清轉移至另一塊96孔板，加入37℃預熱的QUANTI-Blue顯色液180μL/孔，在37℃孵育1小時後，檢測620nm波長下的光吸收值。

3、實驗結果

結果如圖2及表3所示，各受試蛋白對重組人IL-4和IL-13誘導的STAT6的活化均有阻斷作用，ADC-2阻斷IL-4信號通路的IC₅₀值為0.68nM，與25G7-Fab的IC₅₀值0.61nM接近；ADC-2阻斷IL-13信號通路的IC₅₀值為10.60nM，與25G7-Fab的IC₅₀值14.59nM相當。

測試例4：抗體藥物偶聯物ADC-2在TF-1細胞中的內吞活性

1、受試蛋白

抗體藥物偶聯物ADC-2，25G7-Fab，hu25G7，AZD1402-TAG。

2、實驗方法

將生長狀態良好的TF-1細胞收集後調整密度為1×10⁶細胞/mL，100μL/孔加入96孔細胞培養板中並置於4℃，加入終濃度為2nM的各受試蛋白，於4℃孵育1小時後放入細胞培養箱於4℃分鐘，5% CO₂條件下繼續培養，每個時間點單點設置一塊培養板，期間按不同孵育時間取出培養板，FACS buffer清洗並離心，隨後加入螢光標記二抗進行孵育。 25G7-Fab、hu25G7及ADC-2採用FITC偶聯的抗人IgG(Fab特異性)二抗進行標記，AZD1402-TAG採用FITC偶聯的抗His抗體進行標記。將細胞與二抗在4℃條件下孵育30分鐘，隨後用FACS Buffer洗滌兩次，流式細胞儀進行檢測(BD，FACS Celesta)，檢測結果採用FlowJo(FlowJo,LLC)軟體進行分析。特定時間點的內吞率計算公式為：

(gMFI_{Test Ab at time X}-gMFI_{ISO Ab at time X})/(gMFI_{Test Ab at time zero}-gMFI_{ISO Ab at time zero})*100%

3、實驗結果

實驗結果如圖3所示，各受試蛋白均可檢測到其在TF-1細胞中的內吞信號。ADC-2和hu25G7的內吞作用活性相當，3小時內吞率在70%左右；25G7-Fab的內吞作用更快，內吞率也更高。相比於AZD1402-TAG，ADC-2、25G7-Fab和hu25G7的內吞速率和內吞率均顯著優於AZD1402-TAG約在2小時左右達到平臺，ADC-2的內吞活性比25G7-Fab稍弱。

測試例5：抗體藥物偶聯物ADC-2在小鼠模型上的藥物代謝動力學測試

1、受試蛋白

抗體藥物偶聯物ADC-2

2、實驗方法

2.1 實驗動物

C57BL6/J小鼠，8週齡，雄性，賽業(蘇州)生物科技有限公司

2.2 小鼠給藥操作

小鼠接受氣管內霧化給藥(intratracheal，i.t.)，於給藥後的不同時間點進行下頜採血300-400μL，靜置2小時後，7500rpm，4℃離心10min，採集血清。採血後將小鼠進行麻醉並固定，將小鼠頸部肌肉進行鈍性分離，暴露出氣管，將氣管橫向開口，緩慢插入灌洗針，將預先抽裝好的4℃預冷生理鹽水緩慢推入肺組織進行灌洗，並收集肺泡灌洗液(BALF)。一共灌洗3次，前兩次分別用300μL生理鹽水灌洗，第3次用400μL灌洗。收集好的肺泡灌洗液1000rpm，4℃離心10min，採集上清液。安樂死小鼠後，剖開小鼠胸腔，分離並收集完整小鼠肺組織，用PBS沖洗掉肺組織表面的血漬，紙巾蘸乾表面PBS後，對肺組織稱重。將肺組織置於2mL離心管中，加入1mL細胞裂解液(CST，#9803)，勻漿器(Shanghai Jing Xin，Tissuelyser-48)60Hz研磨2min後，10,000×g，4℃離心10min，上清液即為肺組織勻漿液，檢測勻漿液蛋白濃度(Pierce,23227)。血清、BALF和肺組織勻漿液置於-80℃保存。給藥方案見表4，採樣方案見表5。

2.3 ADC-2含量檢測

(1)包被：用碳酸鹽緩衝液稀釋抗原hIL-4Rα至1μg/mL,(Acro，ILR-H5221)，向ELISA板中每孔加入100μL，4℃過夜孵育(16-18h)。

(2)洗板：ELISA板恢復至室溫，每孔加入300μL 0.05% PBST(PBS+0.05% Tween20)緩衝液洗板，共洗板3次。

(3)封閉：每孔加入300μL含3% BSA的PBS，400rpm室溫搖板孵育2h。

(4)洗板：每孔加入300μL 0.05% PBST，洗板3次。

(5)樣品孵育：將100μL稀釋後的血清、BALF或肺組織勻漿液加入ELISA板中，400rpm室溫搖板孵育1.5h。

(6)洗板：每孔加入300μL 0.05% PBST，洗板3次。

(7)檢測：用Assay buffer(含0.5% BSA的0.05% PBST)將檢測抗體(Invitrogen，A18811)稀釋10000倍後加入ELISA板中，每孔100μL，400rpm室溫搖板孵育1h。

(8)洗板：每孔加入300μL 0.05% PBST，洗板3次。

(9)顯色：每孔加入100μL TMB受質(Sera care，5120-0080)，室溫孵育15min。

(10)終止：每孔加入100μL受質反應終止液(Solarbio，C1058)，檢測620nm波長下的光吸收值。

2.4 游離Budesonide含量檢測

取30μL血清、BALF或肺組織勻漿液，加入30.0μL內標工作溶液(5.00ng/mL布地奈德-D8)和120μL乙腈，渦流1min，13,000rpm，4℃離心5min，取上清100μL至96孔板中，加入100μL 0.3% FA稀釋液，1,000rpm室溫搖板孵育15min，取20μL進行LC-MS/MS分析(日本島津，島津液相色譜系統；AB Sciex，Triple Quad 6500⁺型三重四極杆串聯質譜儀)。

3、實驗結果

抗體藥物偶聯物ADC-2和游離Budesonide的藥物代謝動力學參數如表6所示，藥時曲線如圖4所示。

實驗結果表明，抗體藥物偶聯物ADC-2氣管內給藥後，藥物主要分佈於血清和BALF，血清暴露量低。各組織中Budesonide的暴露量均很低。

測試例6：ADC-2在OVA誘導的小鼠哮喘模型上的體內藥效

1、受試物

抗體藥物偶聯物ADC-2，25G7-Fab，AZD1402-TAG，Budesonide。

2、實驗方法

2.1 實驗動物

IL-4 hu/hu-IL-4Rα hu/hu雙基因轉殖C57BL6/J小鼠，8週齡，雌性，賽業(蘇州)生物科技有限公司

2.2 小鼠給藥操作

將動物隨機分為正常對照動物和造模動物。於Day 0，7和14分別腹腔注射100μL含200μg OVA(Sigma，A5503)的PBS溶液，並使用等體積的氫氧化鋁作為佐劑對小鼠進行致敏。於Day 21-27，小鼠每天吸入一次3% OVA的霧化溶液，每次持續35min。於Day 21開始，吸入OVA霧化溶液前半小時，小鼠接受氣管內霧化給藥。具體給藥方案見表7。

在Day 28，小鼠安樂死後，將小鼠頸部肌肉進行鈍性分離，暴露出氣管，將氣管橫向開口，緩慢插入灌洗針，將預先抽裝好的4℃預冷生理鹽水緩慢推入肺組織進行灌洗，並收集肺泡灌洗液。一共灌洗3次，前兩次分別用300μL生理鹽水灌洗，第3次用400μL灌洗。1,000rpm，4℃離心10min，細胞沉澱用350μL預冷生理鹽水重新懸浮後，用全自動血液分析儀進行白細胞與分型細胞計數。

2.3 實驗指標

BALF內白細胞與分型細胞的數量。

2.4 統計學分析

除非特別說明，兩組別細胞計數之間的比較採用one-way ANOVA檢驗，p<0.05定義為有統計學顯著性差異。

3、實驗結果

實驗結果如圖5所示。相比於造模組，在等莫耳劑量下，抗體藥物偶聯物ADC-2顯著降低了BALF內白細胞、嗜酸性粒細胞和嗜中性粒細胞的數量，對單核細胞的數量也有一定的抑制，藥效優於AZD1402-TAG，並明顯優於25G7-Fab和Budesonide。ADC-2在藥效上體現出了25G7-Fab和Budesonide的協同效應。

測試例7：ADC-2在OVA誘導的小鼠哮喘模型上體內藥效的劑量探索

1、受試物

抗體藥物偶聯物ADC-2，AZD1402-TAG，Budesonide。

2、實驗方法

2.1 實驗動物

IL-4 hu/hu-IL-4Rα hu/hu雙基因轉殖C57BL6/J小鼠，8週齡，雌性，賽業(蘇州)生物科技有限公司

2.2 小鼠給藥操作

給藥和BALF採樣操作同測試例6。具體給藥方案見表8。

2.3 實驗指標

BALF內白細胞與分型細胞的數量。

2.4 統計學分析

除非特別說明，兩組別細胞計數之間的比較採用one-way ANOVA檢驗，p<0.05定義為有統計學顯著性差異。

3、實驗結果

實驗結果如圖6所示。相比於造模組，10μg ADC-2就能將肺泡灌洗液內嗜酸性粒細胞的數量顯著降低，與AZD1402-TAG相當，並略優於遠高於臨床等效使用劑量的布地奈德。此外，10μg ADC-2對白細胞數量的抑制能力也非常顯著，對單核細胞和中性粒細胞的數量也有一定程度的抑制。這些結果表明，1/10莫耳劑量的ADC-2就能實現與AZD1402-TAG相當的藥效。

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Claims (21)

1. 一種式(I)所示的抗體-藥物偶聯物，

   Ab-(L-D)_k(I)

   其中，Ab為抗IL-4R抗體或其抗原結合片段，

   L為將Ab共價連接於D的連接子，且k為1至20，

   D為糖皮質激素或其殘基，該糖皮質激素選自布地奈德或環索奈德。
2. 如請求項1所述的抗體-藥物偶聯物，其中D為：

   
3. 如請求項1或2所述的抗體-藥物偶聯物，其中該抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段包含選自以下(I)至(IV)中的任一項：

   (I)重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和

   輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：38、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：40所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

   (II)重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和

   輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

   (III)重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和

   輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

   (IV)重鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和

   輕鏈可變區，其包含分別如SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：39和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
4. 如請求項1至3中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其中該抗IL-4R的抗體選自以下中的任一項：鼠源抗體、嵌合抗體、全人抗體和人源化抗體；

   較佳地，該抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段包含來源於人種系輕鏈IGKV3-11*01的FR或與其至少有95%同一性的FR；該FR較佳包含回復突變，該回復突變選自46P、47W和71Y中的一個或多個；和/或

   包含來源於人種系重鏈IGHV3-48*01的FR或與其至少有95%同一性的FR；該FR較佳包含回復突變，該回復突變選自49A、67S和93T中的一個或多個；

   或者較佳地，該抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段包含來源於人種系輕鏈IGKV2D-29*01的FR或與其至少有95%同一性的FR；該FR較佳包含回復突變，該回復突變選自4L和/或58I；和/或

   包含來源於人種系重鏈IGHV1-2*02的FR或與其至少有95%同一性的FR；該FR較佳包含回復突變，該回復突變選自69L、71I、73K和94K中的一個或多個。
5. 如請求項1至4中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其中該抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段包含選自以下(i)至(vi)中的任一項：

   (i)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：43具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；和

   輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：37所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：37具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；

   (ii)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：9所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：9具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；和

   輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：10所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：10具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；

   (iii)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：1所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：1具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；和

   輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：2具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；

   (iv)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：43所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：43具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；和

   輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：41所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：41具有至少90%、95%、98%、99%同一性的胺基酸序列；

   (v)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：25-27之一所示的序列或與SEQ ID NO：25-27之一具有至少90%、95%、98%或99%同一性的序列；和

   輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：28-30之一所示的序列或與SEQ ID NO：28-30之一具有至少90%、95%、98%或99%同一性的序列；

   (vi)重鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：31-33之一所示的序列或與SEQ ID NO：31-33之一具有至少90%、95%、98%、或99%同一性的序列；和

   輕鏈可變區，其包含如SEQ ID NO：34-36之一所示的序列或與SEQ ID NO：34-36之一具有至少90%、95%、98%或99%同一性的序列；

   較佳地，該抗IL-4R的抗體或抗原結合片段包含選自以下(vii)至(xii)中的任一項：

   (vii)序列如SEQ ID NO：43所示的重鏈可變區，序列如SEQ ID NO：37所示的輕鏈可變區；

   (viii)序列如SEQ ID NO：9所示的重鏈可變區，序列如SEQ ID NO：10所示的輕鏈可變區；

   (ix)序列如SEQ ID NO：1所示的重鏈可變區，序列如SEQ ID NO：2所示的輕鏈可變區；

   (x)序列如SEQ ID NO：43所示的重鏈可變區，序列如SEQ ID NO：41所示的輕鏈可變區；

   (xi)序列如SEQ ID NO：25-27之一所示的重鏈可變區，序列如SEQ ID NO：28-30之一所示的輕鏈可變區；

   (xii)序列如SEQ ID NO：31-33之一所示的重鏈可變區，序列如SEQ ID NO：34-36之一所示的輕鏈可變區。
6. 如請求項1至5中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其中該抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段包含重鏈恆定區，該重鏈恆定區為人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重鏈恆定區或其變體；和/或

   胎抗原結合片段為Fab、Fv、scFv、Fab’或F(ab’)2。
7. 如請求項1至6中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其中該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包含選自(a)-(d)中的任一項：

   (a)重鏈，其包含如SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：44具有至少90%、95%、98%、或99%同一性的胺基酸序列；和

   輕鏈，其包含如SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：45具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；

   (b)重鏈，其包含如SEQ ID NO：19所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：19具有至少90%、95%、98%、或99%同一性的胺基酸序列；和

   輕鏈，其包含如SEQ ID NO：20所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：20具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；

   (c)重鏈，其包含如SEQ ID NO：17所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：17具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；和

   輕鏈，其包含如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：18具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；

   (d)重鏈，其包含如SEQ ID NO：44所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：44具有至少90%、95%、98%、或99%同一性的胺基酸序列；和

   輕鏈，其包含如SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：46具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；

   更佳地，該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包含選自(e)-(i)中的任一項：

   (e)序列如SEQ ID NO：44所示的重鏈，序列如SEQ ID NO：45所示的輕鏈；

   (f)序列如SEQ ID NO：47所示的重鏈，序列如SEQ ID NO：45所示的輕鏈；

   (g)序列如SEQ ID NO：17所示的重鏈，序列如SEQ ID NO：18所示的輕鏈；

   (h)序列如SEQ ID NO：19所示的重鏈，序列如SEQ ID NO：20所示的輕鏈；

   (i)序列如SEQ ID NO：44所示的重鏈，序列如SEQ ID NO：46所示的輕鏈。
8. 如請求項1至6中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其中該抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包含選自(a)-(f)中的任一項：

   (a)重鏈，其包含如SEQ ID NO：48所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：48具有至少90%、95%、98%、或99%同一性的胺基酸序列；和

   輕鏈，其包含如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：18具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；

   (b)重鏈，其包含如SEQ ID NO：49所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：49具有至少90%、95%、98%、或99%同一性的胺基酸序列；和

   輕鏈，其包含如SEQ ID NO：18所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：18具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；

   (c)重鏈，其包含如SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：50具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；和

   輕鏈，其包含如SEQ ID NO：45示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：45具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；

   (d)重鏈，其包含如SEQ ID NO：50所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：50具有至少90%、95%、98%、或99%同一性的胺基酸序列；和

   輕鏈，其包含如SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：46具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；

   (e)重鏈，其包含如SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：51具有至少90%、95%、98%、或99%同一性的胺基酸序列；和

   輕鏈，其包含如SEQ ID NO：45所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：45具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；

   (f)重鏈，其包含如SEQ ID NO：51所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：51具有至少90%、95%、98%、或99%同一性的胺基酸序列；和

   輕鏈，其包含如SEQ ID NO：46所示的胺基酸序列或與SEQ ID NO：46具有至少90%、95%、98%或99%同一性的胺基酸序列；

   更佳地，所述抗IL-4R抗體或其抗原結合片段包含選自(h)-(m)中的任一項：

   (h)序列如SEQ ID NO：48所示的重鏈，序列如SEQ ID NO：18所示的輕鏈；

   (i)序列如SEQ ID NO：49所示的重鏈，序列如SEQ ID NO：18所示的輕鏈；

   (j)序列如SEQ ID NO：50所示的重鏈，序列如SEQ ID NO：45所示的輕鏈；

   (k)序列如SEQ ID NO：50所示的重鏈，序列如SEQ ID NO：46所示的輕鏈；

   (l)序列如SEQ ID NO：51所示的重鏈，序列如SEQ ID NO：45所示的輕鏈；

   (m)序列如SEQ ID NO：51所示的重鏈，序列如SEQ ID NO：46所示的輕鏈。
9. 如請求項1至8中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其中L-D是由下式表示的化學部分：

   -Str-Pep-Sp-D，

   其中，Str是與Ab共價連接的伸展基單元，

   Sp為間隔單元，

   Pep選自胺基酸單元、二硫化物部分、磺醯胺部分或以下非肽化學部分：

   

   ，

   

   或

   

   ，其中，W是-NH-亞(伸)雜環烷基-或雜環烷基；Y是亞(伸)雜芳基、亞(伸)芳基、-C(O)C_1-6亞(伸)烷基、C_2-6亞(伸)烯基、C_1-6亞(伸)烷基或-C_1-6亞(伸)烷基-NH-；每個R¹⁶獨立選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、-(C_1-6亞(伸)烷基)NHC(NH)NH₂或-(C_1-6亞(伸)烷基)NHC(O)NH₂；R¹⁷和R¹⁸各自獨立選自氫、C_1-6烷基、C_2-6烯基、芳基、雜芳基，或R¹⁷和R¹⁸一起可形成C_3-6環烷基；R¹⁹和R²⁰各自獨立選自C_1-6烷基、C_2-6烯基、芳基、雜芳基、(C_1-6烷基)OCH₂-，或R¹⁹和R²⁰一起可形成C_3-6環烷基環。
10. 如請求項9所述的抗體-藥物偶聯物，其中Str選自下式表示的化學部分：

    

    或

    

    ，其中R²¹選自-W₁-C(O)-、-C(O)-W₁-C(O)-、-(CH₂CH₂O)_p1C(O)-、-(CH₂CH₂O)_p1CH₂C(O)-、-(CH₂CH₂O)_p1CH₂CH₂C(O)-，其中W₁選自C_1-6亞(伸)烷基、C_1-6亞(伸)烷基-環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，該雜烷基包含1至3個選自N、O或S的雜原子，其中該烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地視需要被一個或多個選 自鹵素、氘、羥基、氰基、胺基、C_1-6烷基、鹵C_1-6烷基、氘代C_1-6烷基、C_1-6烷氧基和C_3-6環烷基所取代，p1各自獨立地為1至20的整數；

    L¹選自-NR²²-(CH₂CH₂O)_p2CH₂CH₂C(O)-、-NR²²-(CH₂CH₂O)_p2CH₂C(O)-、-S-(CH₂)_p2C(O)-、-(CH₂)_p2C(O)-或單鍵，較佳單鍵；p2各自獨立地為1至20的整數，R²²選自氫原子、C_1-6烷基、鹵C_1-6烷基或氘代C_1-6烷基。
11. 如請求項10所述的抗體-藥物偶聯物，其中R²¹選自-C_1-6亞(伸)烷基C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₂C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₂CH₂C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₂CH₂CH₂C(O)-、-(CH₂-CH₂O)₃C(O)-和-(CH₂-CH₂O)₄C(O)-。
12. 如請求項10或11所述的抗體-藥物偶聯物，其中該Pep選自纈胺酸-瓜胺酸、丙胺酸-丙胺酸-天冬醯胺、甘胺酸-甘胺酸-賴胺酸、纈胺酸-賴胺酸(Val-lys)、纈胺酸-丙胺酸、纈胺酸-苯丙胺酸或甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸。
13. 如請求項10至12中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其中Sp選自-NHCH₂-、-NHCH₂CH₂-、-NHCH₂CH₂CH₂-、-NHCH₂-O-CH₂-、-NHCH₂CH₂-O-CH₂-、-NH(CH₂)₃-C(O)-、-NHCH₂-O-CH₂-C(O)-、- NH(CH₂)₂-O-CH₂-C(O)-、

    

    、

    

    、

    

    
14. 如請求項1至13中任一項所述的抗體-藥物偶聯物，其中該抗體-藥物偶聯物中連接子L包含：順丁烯二醯亞胺-(PEG)₄-CH₂CH₂C(O)-Gly-Gly-Phe-Gly、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₂-Val-Cit、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₆-Val-Cit、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₈-Val-Cit、順丁烯二 醯亞胺-(PEG)₄-CH₂CH₂C(O)-Val-lys、順丁烯二醯亞胺-(CH₂)₅-Val-Cit、順丁烯二醯亞胺-(CH₂)₅-Val-lys、順丁烯二醯亞胺-(CH₂)₅-Gly-Gly-Phe-Gly、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₄-CH₂CH₂C(O)-Gly-Gly-Phe-Gly、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₂-Ala-Ala-Asn、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₆-Ala-Ala-Asn、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₈-Ala-Ala-Asn、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₄-三唑-(PEG)₃-磺醯胺、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₂-CH₂CH₂C(O)-Val-lys、順丁烯二醯亞胺-(PEG)₄-三唑-(PEG)₃-磺醯胺或Mal-(PEG)₄-三唑-(PEG)₃-二硫化物。
15. 如請求項1所述的抗體-藥物偶聯物，其由下式表示：

    

    ，其中k選自1至10，p1選自2、4、6或8，p3、p4各自獨立地選自0、1或2；或

    

    ，其中k選自1至10，p1選自2、4、6或8，p3、p4各自獨立地選自0、1或2。
16. 如請求項15所述的抗體-藥物偶聯物，其選自：

    

    

    

    或

    

    其中k選自1至10。
17. 一種式II-A所示化合物或其可藥用鹽，

    

    其中，p1選自2、4、6或8，p3、p4各自獨立地選自0、1或2，D為布地奈德或環索奈德。
18. 一種式II-B所示化合物或其可藥用鹽，

    

    其中X為鹵素，較佳溴，p1選自2、4、6或8，p3、p4各自獨立地選自0、1或2，D為布地奈德或環索奈德。
19. 一種醫藥組成物，包含如請求項1至16中任一項所述的抗體-藥物偶聯物以及藥學上可接受的賦形劑。
20. 一種可吸入的醫藥組成物，包括式(I)所示的抗體-藥物偶聯物以及藥學上可接受的載體，

    Ab-(L-D)_k(I)

    其中，Ab為抗IL-4R的抗體或其抗原結合片段，較佳抗IL-4R的Fab片段，

    L為將Ab共價連接於D的連接子，且k為1至20，

    D為糖皮質激素或其殘基。
21. 一種如請求項1至16中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或如請求項19或20所述的醫藥組成物在製備用於治療或預防免疫性疾病或病症的藥物中的用途，該疾病或病症較佳：哮喘、鼻息肉、慢性鼻竇炎、過敏性皮膚病、嗜酸細胞性食管炎、慢性阻塞性肺病、過敏性鼻炎、關節炎、炎症性疾病、變應性反應、自體免疫淋巴組織增生性綜合症、自體免疫性溶血性貧血、巴雷特食管、自體免疫葡萄膜炎、結核病和腎病，更佳哮喘或過敏性皮膚病。

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