TW202028242A - 抗ｂ７ｈ３抗體－依喜替康類似物偶聯物及其醫藥用途 - Google Patents

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Abstract

本公開涉及抗B7H3抗體-依喜替康類似物偶聯物及其醫藥用途。具體而言，本公開涉及通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物，其中Pc為抗B7H3抗體或其抗原結合片段，L、Y和n如說明書中所定義。本公開還涉及該配體-藥物偶聯物的製備方法，含有其的藥物組合物，以及其在用於製備治療B7H3介導的疾病或病症的藥物中的用途；尤其在用於製備抗癌藥物中的用途。

Description

抗B7H3抗體-依喜替康類似物偶聯物及其醫藥用途
本公開涉及抗B7H3抗體-依喜替康類似物偶聯物，其製備方法，包含其的醫藥組成物，以及其用於製備治療B7H3介導的疾病或病症的藥物中的用途；尤其在用於製備抗癌藥物中的用途。
T細胞介導的免疫反應在機體抗腫瘤過程中發揮著極其重要的作用，而T細胞的活化和增殖不僅需要TCR識別抗原信號，還需要共刺激分子提供的第二信號。B7家族分子屬共刺激分子免疫球蛋白超家族，越來越多的研究表明，該家族分子在機體正常免疫功能和病理狀態下均發揮了重要的調節作用。
B7H3是B7家族的成員之一，屬I型跨膜蛋白，包含胺基端的一個信號肽，一個細胞外的免疫球蛋白樣可變區(IgV)和恆定區(IgC)，一個跨膜區和一個含有45個胺基酸的胞質尾區(Tissue Antigens.2007 Aug；70(2)：96-104)。目前，B7H3主要存在2種剪切體，B7H3a和B7H3b。B7H3a胞外段由IgV-IgC 2個免疫球蛋白結構域組成，又稱為2IgB7H3， 而B7H3b胞外段由IgV-IgC-IgV-IgC 4個免疫球蛋白結構域組成，又稱為4IgB7H3。
B7H3蛋白在正常組織、細胞中不表達或極低表達，卻高表達於多種腫瘤組織，並與腫瘤的進展、患者的生存及預後密切相關。臨床上已經報道，B7H3在許多癌症中，特別是在非小細胞肺癌、腎癌、泌尿道上皮癌、結直腸癌、前列腺癌、多形性膠質母細胞瘤、卵巢癌和胰腺癌中過表達(Lung Cancer.2009 Nov；66(2)：245-249；Clin Cancer Res.2008 Aug 15；14(16)：5150-5157)。此外，也有文獻報道，在前列腺癌中，B7H3的表達強度與臨床病理學惡性(諸如腫瘤體積、前列腺外侵襲或Gleason評分)正相關，且也與癌症進展相關(Cancer Res.2007 Aug 15；67(16)：7893-7900)。類似地，在多形性膠質母細胞瘤中，B7H3的表達與無事件存活負相關，且在胰腺癌中，B7H3的表達與淋巴結轉移和病理學進展相關。因此，B7H3被認為是一種新的腫瘤標誌物和潛在的治療靶點。
目前，已有針對B7H3靶點的治療策略用於臨床前研究，如靶向小鼠B7H3的抗體會增強瘤內的浸潤性的CD8-陽性的T細胞和抑制腫瘤生長(Mod Pathol.2010 Aug；23(8)：1104-1112)。此外，WO 2008/066691顯示，識別B7H3變體B7H3a的抗體會對腺癌表現出體內抗腫瘤作用。在臨床研究中，一種鼠源的B7H3抗體與放射性I131的偶聯藥物可顯著抑制患者成神經母細胞瘤的生長[J Neufooocol 97(3)：409-1 8(2010)]。但目前在研的項目都是鼠源抗體經人源化改造的人源化抗體，而人源化抗體在免疫時存在免疫原性相對較高的問題，在人體應用時是一個不利的因素。
噬菌體展示技術(phage display technology)是將外源蛋白質或多肽與噬菌體外殼蛋白融合表達，從而將外源蛋白表達在噬菌體的表面。噬菌體抗體庫是將噬菌體展示技術、PCR擴增技術、蛋白表達技術相結合的一項運用綜合技術手段所建立起來的抗體庫。
噬菌體抗體庫最大的優點是不經體內免疫，模擬體內抗體生成的三個過程而製備出全人源的抗體。除此之外，噬菌體抗體庫還具有以下優勢：①實現了基因型與表型的統一；此外，實驗方法簡單、快速，傳統的藉由融合瘤技術抗體產生方法需歷經數月，而抗體庫技術只需短短幾週的時間；②表達的是完全人抗體，且分子量小，主要以活性片段Fab、scFv的形式表達，與完整抗體相比在組織穿透力方面都有明顯優勢；③篩選容量大，融合瘤技術是在上千個純株內篩選，抗體庫技術可以在百萬甚至億萬個分子中進行選擇，篩選到的抗體種類多；④用途廣泛，採用了原核表達系統，當大規模生產時優勢更加明顯(Curr Opin Biotechnol.2002 Dec；13(6)：598-602；Immunotechnology,2013,48(13)48(13)：63-73)。
抗體-藥物偶聯物(antibody drug conjugate,ADC)將單株抗體或者抗體片段藉由穩定的化學接頭化合物與具有生物活性的細胞毒素相連，充分利用了抗體對正常細胞和腫瘤細胞表面抗原結合的特異性和細胞毒性物質的高效性，同時又避免了前者療效偏低和後者毒副作用過大等缺陷。這也就意味著，與以往傳統的化療藥物相比，抗體-藥物偶聯物能更精准地結合腫瘤細胞並降低將對正常細胞的影響。
目前已有多種ADC藥物被用於臨床或臨床研究，如Kadcyla，是靶向Her2的曲妥珠單抗與DM1形成的ADC藥物。同時，也 有靶向B7H3的抗體及ADC藥物的專利報導，如WO2008100934、WO2012147713、WO2014061277、WO2015184203、WO2016044383。
用於抗體藥物偶聯物的具有細胞毒性的小分子有幾類；其中有一類是喜樹鹼衍生物，它們藉由抑制拓樸異構酶I而具有抗腫瘤作用的。報導喜樹鹼衍生物依沙替康(化學名：(1S，9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3’,4’：6,7]咪唑並[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮)應用於抗體偶聯藥物(ADC)的文獻有WO2014057687；Clinical Cancer Research(2016)22(20)：5097-5108；Cancer Sci(2016)107：1039-1046。但仍需進一步開發療效更好的ADC藥物。
本公開涉及抗B7H3抗體的ADC及其用途，其中提供與B7H3的胞外區的胺基酸序列或三維結構結合的單株抗體或抗原結合片段與細胞毒性物質依喜替康類似物偶聯的ADC藥物。
因此，本公開的目的為提供一種通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：
Figure 108135628-A0101-12-0004-4
其中：Y選自-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-、-O-CR1R2-(CRaRb)m-、-O-CR1R2-、-NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-或-S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基、烷氧基、羥基、胺基、氰基、硝基、羥烷基、環烷基或雜環基；或者，Ra和Rb與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；R1選自鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；或者，Ra和R2與其相連的碳原子一起形成環烷基或雜環基；m為0至4的整數；n為1至10，視需要自约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10；可以為整數，也可以為小數；L為接頭單元；Pc為抗B7H3抗體或其抗原結合片段。
本公開的一些實施方案中，提供的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含： 分別如SEQ ID NO：8、9和10胺基酸序列所示的重鏈HCDR1、HCDR2、HCDR3，或與SEQ ID NO：8、9和10所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的HCDR變體；和分別如SEQ ID NO：11、12和13胺基酸序列所示的輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3，或與SEQ ID NO：11、12和13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的LCDR變體。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該抗B7H3抗體或其抗體結合片段的輕鏈可變區上的輕鏈FR區來源於人種系輕鏈序列或其突變序列，和/或重鏈可變區上的重鏈FR區來源於人種系重鏈序列或其突變序列。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含選自如下所示的重鏈可變區和/或輕鏈可變區：其中該重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示或與其具有至少95%序列同一性，該輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示或與其具有至少95%序列同一性。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含抗體恆定區；該抗體恆定區的重鏈恆定區來源於人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或與其具有至少95%序列同一性，該抗體恆定區的輕鏈恆定區來源於人抗體κ、λ鏈或與其具有至少95%序列同一性；較佳地，該重鏈恆定區的胺基酸序列源於人IgG1或與其具有至少95%序列同一性。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該Pc為全長抗體；其中該全長抗體選自：由SEQ ID NO：14所示的重鏈序列和SEQ ID NO：15所示的輕鏈序列組成的h1702抗體，和由SEQ ID NO：14所示的重鏈序列和SEQ ID NO：16所示的輕鏈序列組成的h1702DS抗體。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該抗原結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和包含CDR的肽的抗原結合片段。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中，R1為鹵烷基或C3-6環烷基。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中，R2為氫原子。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中，R1為C3-6環烷基；R2為氫原子。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中： Y為-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素或烷基；R1為鹵烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；m為0或1。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中：Y為-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素或烷基；R1為C3-6環烷基；R2選自氫原子；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；m為0。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中Y選自：
Figure 108135628-A0101-12-0009-5
 較佳
Figure 108135628-A0101-12-0009-6
和
Figure 108135628-A0101-12-0009-7
；最佳
Figure 108135628-A0101-12-0009-8
。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中Y的O端與接頭單元L相連。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中n為2至8，較佳為5至9，最佳為7.5；非限制性實施例包括3、4、5、6、7.2、7.5、8、8.5、9。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中接頭單元-L-為-L1-L2-L3-L4-，L1為
Figure 108135628-A0101-12-0009-9
，s1為2至8的整數；L2為化學鍵；L3為四肽殘基；L4為-NR5(CR6R7)t-，R5、R6或R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基，t為1或2。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中所述的接頭單元-L-，其L1端與配體相連，L4端與Y相連。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該L3的四肽殘基為由兩個或多個選自苯丙胺酸(E)、甘胺酸(G)、纈胺酸(V)、賴胺酸(K)、胍胺酸、絲胺酸(S)、谷胺酸(E)、天冬胺酸(N)中的胺基酸形成的胺基酸殘基；較佳為GGFG(甘胺酸-甘胺酸-苯丙胺酸-甘胺酸)的四肽殘基。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該-L-Y-為以下結構：
Figure 108135628-A0101-12-0010-10
L2為化學鍵；L3為GGFG的四肽殘基；R1為鹵烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；R5、R6或R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基；s1為2至8的整數；m為0至4的整數。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中-L-Y-選自：
Figure 108135628-A0101-12-0011-11
Figure 108135628-A0101-12-0011-12
Figure 108135628-A0101-12-0011-13
Figure 108135628-A0101-12-0011-14
Figure 108135628-A0101-12-0011-15
Figure 108135628-A0101-12-0011-16
Figure 108135628-A0101-12-0011-17
Figure 108135628-A0101-12-0011-18
Figure 108135628-A0101-12-0011-19
Figure 108135628-A0101-12-0012-20
Figure 108135628-A0101-12-0012-21
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其為通式(Pc-La-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：
Figure 108135628-A0101-12-0012-22
其中：W選自C1-8烷基、C1-8烷基-環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，所述雜烷基包含1至3個選自N、O或S的雜原子，其中所述的C1-8烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地視需要進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-或化學鍵，p1為1至20的整數，較佳1-6；L3為由2至7個胺基酸構成的肽殘基，胺基酸可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，所述取代 基為一個或多個獨立地選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基；R1選自鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基；R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；R4和R5相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；R6和R7相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；m為0至4的整數；n為1至10，可以為整數，也可以為小數；Pc為抗B7H3抗體或其抗原結合片段。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其為通式(Pc-Lb-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：
Figure 108135628-A0101-12-0013-23
其中：s1為2至8的整數；較佳5； R1、R2、R5~R7、m和n如通式(Pc-La-Y-Dr)中所定義。
本公開的一些實施方案中，通式(Pc-L-Y-Dr)所示的的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，該配體-藥物偶聯物選自：
Figure 108135628-A0101-12-0014-25
Figure 108135628-A0101-12-0014-26
Figure 108135628-A0101-12-0014-27
Figure 108135628-A0101-12-0014-28
Figure 108135628-A0101-12-0015-29
Figure 108135628-A0101-12-0015-30
Figure 108135628-A0101-12-0015-31
Figure 108135628-A0101-12-0015-32
Figure 108135628-A0101-12-0015-33
Figure 108135628-A0101-12-0016-34
Figure 108135628-A0101-12-0016-35
 其中Pc和n如通式(Pc-L-Y-Dr)中所定義。
本公開典型的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物包括，但不限於：
Figure 108135628-A0101-12-0016-37
Figure 108135628-A0101-12-0017-38
或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物； 其中n可以為0至10的非零整數或小數，較佳為1-10之間的整數或小數；更佳為2至8，可以為整數，也可以為小數；最佳為3至8，可以為整數，也可以為小數。
本公開進一步提供一種製備如通式(Pc-La-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的方法，其包括以下步驟：
Figure 108135628-A0101-12-0018-39
Pc還原後，與通式(La-Y-Dr)偶聯反應，得到通式(Pc-La-Y-Dr)所示的化合物；該還原劑較佳TCEP；其中：Pc為抗B7H3抗體或其抗原結合片段；W、L2、L3、R1、R2、R5~R7、m和n如通式(Pc-La-Y-Dr)中所定義。
在另一個實施方式中，提供另一種方法，其中該通式La-Y-Dr為通式Lb-Y-Dr所示的化合物：
Figure 108135628-A0101-12-0019-40
或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其中R1、R2、R5~R7、s1和m如通式Pc-Lb-Y-Dr中所定義。
在本公開的一個較佳的實施方案中，根據本公開所述的通式(Pc-La-Y-Dr)或通式(Pc-Lb-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的方法，其中通式(La-Y-Dr)所示的化合物或通式(Lb-Y-Dr)所示的化合物選自：
Figure 108135628-A0101-12-0019-179
Figure 108135628-A0101-12-0020-44
Figure 108135628-A0101-12-0020-45
Figure 108135628-A0101-12-0020-46
Figure 108135628-A0101-12-0020-50
另一方面，本公開提供一種組醫藥組成物，其包含根據本公開所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，以及一種或多種可藥用的赋形劑、稀釋劑或載體。
另一方面，本公開提供根據本公開所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或包含其的醫藥組成物在製備用於治療B7H3介導的疾病或病症的藥物中的用途。其中所述B7H3介導的疾病或病症為B7H3高表達癌症。
另一方面，本公開提供根據本公開所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或包含其的醫藥組成物在製備用於治療或預防腫瘤的藥物中的用途；其中所述癌症較佳選自乳腺癌、卵巢癌、宮 頸癌、肺癌、子宮癌、前列腺癌、腎癌、尿道癌、膀胱癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、肉瘤、咽頭癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、白血病、骨癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胰腺癌或淋巴瘤。
另一方面，本公開進一步涉及一種用於治療和/或預防腫瘤的方法，該方法包括向需要其的患者施用治療有效劑量的根據本公開所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或包含其的醫藥組成物；較佳其中所述的腫瘤為與B7H3高表達相關的癌症。
另一方面，本公開進一步涉及一種用於治療或預防癌症的方法，該方法包括向需要其的患者施用治療有效劑量的根據本公開所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或包含其的醫藥組成物；其中所述癌症較佳選自乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、子宮癌、前列腺癌、腎癌、尿道癌、膀胱癌、卵巢癌、肝癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、神經膠質瘤、神經母細胞瘤、肉瘤、咽頭癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、白血病、骨癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胰腺癌或淋巴瘤。
可將活性化合物製成適合於藉由任何適當途徑給藥的形式，活性化合物較佳是以單位劑量的方式，或者是以患者可以以單劑自我給藥的方式。本公開化合物或組合物的單位劑量的表達方式可以是片劑、膠囊、扁囊劑、瓶裝藥水、藥粉、顆粒劑、錠劑、栓劑、再生藥粉或液體製劑。
本公開治療方法中所用化合物或組合物的劑量通常將隨疾病的嚴重性、患者的體重和化合物的相對功效而改變。不過，作為一般性指導，合適的單位劑量可以是0.1~1000mg。
本公開的醫藥組成物除活性化合物外，可含有一種或多種輔料，該輔料選自以下成分：填充劑(稀釋劑)、黏合劑、潤濕劑、崩解劑或賦形劑等。根據給藥方法的不同，組合物可含有0.1至99重量%的活性化合物。
第1圖為B7H3抗體在U87MG細胞上的內吞效果。
第2圖為本公開ADC對不同腫瘤細胞的增殖抑制結果。第2A圖為不同ADC在A498細胞上的增殖抑制實驗結果；第2B圖為不同ADC在Calu-6細胞上的增殖抑制實驗結果；第2C圖為不同ADC在U87細胞上的增殖抑制實驗結果；第2D圖為不同ADC在A375細胞上的增殖抑制實驗結果；第2E圖為不同ADC在Detroit562細胞上的增殖抑制實驗結果，第2F圖為不同ADC在CHOK1細胞上的增殖抑制實驗結果。
第3圖為測試例7中腹腔注射本公開ADC-8(1mpk，3mpk)和ADC-5(1mpk，3mpk)對U87MG裸小鼠移植瘤的抑制作用。
第4圖為測試例8中腹腔注射本公開ADC-2(1mpk，3mpk)和ADC-1(1mpk，3mpk)對Detroit 562裸小鼠移植瘤的抑制作用。
第5A圖為測試例9中本公開ADC-4、ADC-6和ADC-7在Detroit562細胞上的增殖抑制率。
第5B圖為測試例9中本公開ADC-4、ADC-6和ADC-7在Calu-6細胞上的增殖抑制率。
第5C圖為測試例9中本公開ADC-4、ADC-6和ADC-7在CHOK12細胞上的增殖抑制率。
第6圖為測試例10中本公開ADC-4的血漿穩定性結果。
發明詳述
一.術語
除非另有限定，本文所用的所有技術和科學術語均與本公開所屬領域普通技術人員的通常理解一致。雖然也可採用與本文所述相似或等同的任何方法和材料實施或測試本公開，但本文描述了較佳的方法和材料。描述和要求保護本公開時，依據以下定義使用下列術語。
當本公開中使用商品名時，申請人旨在包括該商品名產品的製劑、該商品名產品的非專利藥和活性藥物部分。
除非有相反陳述，在說明書和申請專利範圍中使用的術語具有下述含義。
術語“藥物”是指細胞毒性藥物，藥物表示為Dr，能在腫瘤細胞內具有較強破壞其正常生長的化學分子。細胞毒性藥物原則上在足夠高的濃度下都可以殺死腫瘤細胞，但是由於缺乏特異性，在殺傷腫瘤細胞的同時，也會導致正常細胞的凋亡，導致嚴重的副作用。該術語包括毒素，如細菌、真菌、植物或動物來源的小分子毒素或酶活性毒素，放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32和Lu的放射性同位素)，毒性藥物，化療藥物，抗生素和核溶酶，較佳為毒性藥物。
術語“接頭單元(或連接片段)”是指一端與配體連接而另一端與藥物相連的化學結構片段或鍵，也可以連接其他接頭後再與藥物相連。 本公開的較佳方案表示為L和L1至L4，其中L1端與配體相連，L4端與結構單元Y相連後與藥物(Dr)相連。
接頭，包括延伸物、間隔物和胺基酸單元，可以藉由本領域已知方法合成，諸如US2005-0238649A1中所記載的。接頭可以是便於在細胞中釋放藥物的“可切割接頭”。例如，可使用酸不穩定接頭(例如腙)、蛋白酶敏感(例如肽酶敏感)接頭、光不穩定接頭、二甲基接頭、或含二硫化物接頭(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992)；美國專利No.5,208,020)。
術語“配體-藥物偶聯物”指配體藉由穩定的連接單元與具有生物活性的藥物相連。在本公開中“配體-藥物偶聯物”較佳為抗體-藥物偶聯物(antibody drug conjugate，ADC)，指將單株抗體或者抗體片段藉由穩定的連接單元與具有生物活性的毒性藥物相連。
本公開所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
術語“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈結構。免疫球蛋白重鏈恆定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恆定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恆定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本公開所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的編號規則(HCDR1)。
術語“完全人源抗體”或“全人抗體”，也稱“全人源單株抗體”，其抗體的可變區和恆定區都是人源的，去除免疫原性和毒副作用。單株抗體的發展經歷了四個階段，分別為：鼠源性單株抗體、嵌合性單株抗體、人源化單株抗體和全人源單株抗體。全人源抗體製備的相關技術主要有：人融合瘤技術、EBV轉化B淋巴細胞技術、噬菌體顯示技術(phage display)、轉基因小鼠抗體製備技術(transgenic mouse)和單個B細胞抗體製備技術等。本公開中的“完全人抗體”採用噬菌體展示技術獲得。噬菌體展示技術，從人PBMC、脾臟、淋巴結組織分離B細胞，構建天然單鏈噬菌體人抗體庫，或者藉由免疫可表達人抗體輕重鏈的轉基因小鼠，篩選獲得的抗體。
術語“抗原結合片段”是指抗體的保持特異性結合抗原的能力的一個或多個片段。已顯示可利用全長抗體的片段來進行抗體的抗原結合功能。“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)單結構域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH結構域組成；和(vi)分離的互補決定區(CDR)或(vii)可視需要地藉由合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能够產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領域技術人員已知的常規技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗體。
Fab是藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H鏈的224位的胺基酸殘基)處理IgG抗體分子所獲得的片段中的具有約50,000的分子量並具有抗原結合活性的抗體片段，其中H鏈N端側的約一半和整個L鏈藉由二硫鍵結合在一起。
F(ab')2是藉由用酶胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下方部分而獲得的分子量為約100,000並具有抗原結合活性並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區的抗體片段。
Fab'是藉由切割上述F(ab')2的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50,000並具有抗原結合活性的抗體片段。
此外，可以藉由將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產所述Fab'。
術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體鏈重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體鏈輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的現有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本公開的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
術語“CDR”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。該6個CDR的最常用的定義之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定義只應用於鏈輕鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及鏈重鏈可變結構域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。
術語“抗體框架”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上讲，其是不具有CDR的可變結構域。
術語“表位”或“抗原決定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗體特異性結合的部位。表位通常以獨特的空间構象包括至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個連續或非連续的胺基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大约小於10-7M，例如大约小於10-8M、10-9M或10-10M或更小的親和力(KD)結合。
術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果動啟動子或增强子影響編碼序列的轉錄，那麼動啟動子或增强子有效地連接至所述編碼序列。
術語“表達載體”是指能够運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能够在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細 胞的基因組，從而随宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。
現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明所述的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因數據庫和MOE軟體，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NS0細胞。
本公開工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大 培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用PH梯度法洗脫結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
術語“肽”是指介於胺基酸和蛋白質之間的化合物片段，由2個或2個以上胺基酸分子藉由肽鍵相互連接而成，是蛋白質的結構與功能片段，如激素、酶類等本質上都是肽。
術語“糖”是指由C、H、O三種員素組成的生物大分子，可分為單糖、二糖和多糖等。
術語“螢光探針”是指在紫外-可見-近紅外區有特徵螢光，並且其螢光性質(激發和發射波長、強度、壽命和偏振等)可隨所處環境的性質，如極性、折射率、黏度等改變而靈敏地改變的一類螢光性分子，其與核酸(DNA或RNA)、蛋白質或其他大分子結構非共價相互作用而使一種或幾種螢光性質發生改變，可用於研究大分子物質的性質和行為。
術語“毒性藥物”是指抑制或防止細胞的功能和/或引起細胞死亡或破壞的物質。包括毒素和其他能用於腫瘤治療的化合物。
術語“烷基”指飽和脂肪族烴基團，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，較佳含有1至12個碳原子的烷基，更佳含有1至10個碳原子的烷基，最佳含有1至6個碳原子(包含1個、2個、3個、4個、5個或6個碳原子)的烷基。非限制性實例包括甲基、乙基、正丙基、 異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基、正庚基、2-甲基己基、3-甲基己基、4-甲基己基、5-甲基己基、2,3-二甲基戊基、2,4-二甲基戊基、2,2-二甲基戊基、3,3-二甲基戊基、2-乙基戊基、3-乙基戊基、正辛基、2,3-二甲基己基、2,4-二甲基己基、2,5-二甲基己基、2,2-二甲基己基、3,3-二甲基己基、4,4-二甲基己基、2-乙基己基、3-乙基己基、4-乙基己基、2-甲基-2-乙基戊基、2-甲基-3-乙基戊基、正壬基、2-甲基-2-乙基己基、2-甲基-3-乙基己基、2,2-二乙基戊基、正癸基、3,3-二乙基己基、2,2-二乙基己基，及其各種支鏈異構體等。更佳的是含有1至6個碳原子的低級烷基，非限制性實施例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第三丁基、第二丁基、正戊基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、正己基、1-乙基-2-甲基丙基、1,1,2-三甲基丙基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2-乙基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、2,3-二甲基丁基等。烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，所述取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、側氧基。
術語“雜烷基”指含有一個或多個選自N、O或S的雜原子的烷基，其中烷基如上所定義。
術語“亞烷基”指飽和的直鏈或支鏈脂肪族烴基，其具有2個從母體烷的相同碳原子或兩個不同的碳原子上除去兩個氫原子所衍生的殘基，其為包含1至20個碳原子的直鏈或支鏈基團，較佳含有1至12個碳原子，更佳含有1至6個碳原子(包含1個、2個、3個、4個、5個或6個碳原子)的亞烷基。亞烷基的非限制性實例包括但不限於亞甲基(-CH2-)、1,1-亞乙基(-CH(CH3)-)、1,2-亞乙基(-CH2CH2)-、1,1-亞丙基(-CH(CH2CH3)-)、1,2-亞丙基(-CH2CH(CH3)-)、1,3-亞丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-亞丁基(-CH2CH2CH2CH2-)和1,5-亞丁基(-CH2CH2CH2CH2CH2-)等。亞烷基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，所述取代基較佳獨立地視需要選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基和側氧基中的一個或多個取代基所取代。
術語“烷氧基”指-O-(烷基)和-O-(非取代的環烷基)，其中烷基或環烷基的定義如上所述。烷氧基的非限制性實例包括：甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、環丙氧基、環丁氧基、環戊氧基、環己氧基。烷氧基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。
術語“環烷基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，環烷基環包含3至20個碳原子，較佳包含3至12個碳原子，更佳包含3至10個碳原子，最佳包含3至8個碳原子(包含3個、4個、5個、6個、7個或8個碳原子)。單環環烷基的非限制性實例包括環丙基、環丁基、環戊基、環戊烯基、環己基、環己烯基、環己二烯基、環庚基、環庚三烯基、環辛基等；多環環烷基包括螺環、稠環和橋環的環烷基。
術語“雜環基”指飽和或部分不飽和單環或多環環狀烴取代基，其包含3至20個環原子，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0、1或2)的雜原子，但不包括-O-O-、-O-S-或-S-S-的環部分，其餘環原子為碳。較佳包含3至12個環原子，其中1~4個是雜原子(1個、2個、3個或4個雜原子)；更佳環烷基環包含3至10個環原子(包含3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個環原子)。單環雜環基的非限制性實例包括吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、嗎啉基、硫代嗎啉基、高哌嗪基等。多環雜環基包括螺環、稠環和橋環的雜環基。
術語“螺雜環基”指5至20員的單環之間共用一個原子(稱螺原子)的多環雜環基團，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0至2)的雜原子，其餘環原子為碳。其可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統。較佳為6至14員，更較佳為7至10員。根據環與環之間共用螺原子的數目將螺雜環基分為單螺雜環基、雙螺雜環基或多螺雜環基，較佳為單螺雜環基和雙螺雜環基。更較佳為4員/4員、4員/5員、4員/6員、5員/5員或5員/6員單螺雜環基。螺雜環基的非限制性實例包括：
Figure 108135628-A0101-12-0034-51
術語“稠雜環基”指5至20員，系統中的每個環與體系中的其他環共享毗鄰的一對原子的多環雜環基團，一個或多個環可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0、1或2)的雜原子，其餘環原子為碳。較佳為6至14員，更佳為7至10員(7員、8員、9員或10員環)。根據組成環的數目可以分為雙環、三環、四環或多環稠雜環基，較佳為雙環或三環，更佳為5員/5員或5員/6員雙環稠雜環基。稠雜環基的非限制性實例包括：
Figure 108135628-A0101-12-0034-52
術語“橋雜環基”指5至14員，任意兩個環共用兩個不直接連接的原子的多環雜環基團，其可以含有一個或多個雙鍵，但沒有一個環具有完全共軛的π電子系統，其中一個或多個環原子為選自氮、氧或S(O)m(其中m是整數0、1或2)的雜原子，其餘環原子為碳。較佳為6至14員，更佳為7至10員(7員、8員、9員或10員環)。根據組成環的數 目可以分為雙環、三環、四環或多環橋雜環基，較佳為雙環、三環或四環，更佳為雙環或三環。橋雜環基的非限制性實例包括：
Figure 108135628-A0101-12-0035-53
該雜環基環可以稠合於芳基、雜芳基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜環基，其非限制性實例包括：
Figure 108135628-A0101-12-0035-54
和
Figure 108135628-A0101-12-0035-55
等。
雜環基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基、側氧基基。
術語“芳基”指具有共軛的π電子體系的6至14員全碳單環或稠合多環(也就是共享毗鄰碳原子對的環)基團，較佳為6至10員(6員、7員、8員、9員或10員)，例如苯基和萘基，較佳苯基。所述芳基環可以稠合於雜芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為芳基環，其非限制性實例包括：
Figure 108135628-A0101-12-0036-56
芳基可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。
術語“雜芳基”指包含1至4個雜原子(1個、2個、3個或4個雜原子)、5至14個環原子的雜芳族體系，其中雜原子選自氧、硫和氮。雜芳基較佳為5至10員(5員、6員、7員、8員、9員或10員雜芳基)，更佳為5員或6員，例如呋喃基、噻吩基、吡啶基、吡咯基、N-烷基吡咯基、嘧啶基、吡嗪基、咪唑基、四唑基等。該雜芳基環可以稠合於芳基、雜環基或環烷基環上，其中與母體結構連接在一起的環為雜芳基環，其非限制性實例包括：
Figure 108135628-A0101-12-0036-57
雜芳基可以是視需要取代的或非取代的，當被取代時，取代基較佳為一個或多個以下基團，其獨立地選自烷基、烯基、炔基、烷氧基、 烷硫基、烷基胺基、鹵素、巰基、羥基、硝基、氰基、環烷基、雜環烷基、芳基、雜芳基、環烷氧基、雜環烷氧基、環烷硫基、雜環烷硫基。
術語“胺基保護基”是為了使分子其它部位進行反應時胺基保持不變，用易於脫去的基團對胺基進行保護。非限制性實施例包含9-芴甲氧羰基、第三丁氧羰基、乙醯基、苄基、烯丙基和對甲氧苄基等。這些基團可視需要地被選自鹵素、烷氧基或硝基中的1-3個取代基(1個、2個或3個取代基)所取代。所述胺基保護基較佳為9-芴甲氧羰基。
術語“鹵烷基”指烷基被一個或多個鹵素取代，其中烷基如上所定義。
術語“氘代烷基”指烷基被一個或多個氘原子取代，其中烷基如上所定義。
術語“羥烷基”指烷基被一個或多個羥基取代，其中烷基如上所定義。
術語“羥基”指-OH基團。
術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。
術語“胺基”指-NH2。
術語“硝基”指-NO2。
術語“氰基”指-CN。
術語“醯胺基”指-C(O)N(烷基)或(環烷基)，其中烷基、環烷基如上所定義。
術語“羧酸酯基”指-C(O)O(烷基)或(環烷基)，其中烷基、環烷基如上所定義。
本公開還包括各種氘化形式的式(I)化合物。與碳原子連接的各個可用的氫原子可獨立地被氘原子替換。本領域技術人員能夠參考相關文獻合成氘化形式的式(I)化合物。在製備氘代形式的式(I)化合物時可使用市售的氘代起始物質，或它們可使用常規技術採用氘代試劑合成，氘代試劑包括但不限於氘代硼烷、三氘代硼烷四氫呋喃溶液、氘代氫化鋰鋁、氘代碘乙烷和氘代碘甲烷等。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述的事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生地場合。例如，“視需要被烷基取代的雜環基團”意味著烷基可以但不必須存在，該說明包括雜環基團被烷基取代的情形和雜環基團不被烷基取代的情形。
“取代的”指基團中的一個或多個氫原子，較佳為最多5個，更佳為1個、2個或3個氫原子彼此獨立地被相應數目的取代基取代。不言而喻，取代基僅處在它們的可能的化學位置，本領域技術人員能夠在不付出過多努力的情況下確定(藉由實驗或理論)可能或不可能的取代。例如，具有遊離氫的胺基或羥基與具有不飽和(如烯屬)鍵的碳原子結合時可能是不穩定的。
術語“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，以及其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
術語“藥學上可接受的鹽”或“可藥用鹽”是指本公開配體-藥物偶聯物的鹽，或本公開中所述的化合物的鹽，這類鹽用於哺乳動物體內 時具有安全性和有效性，且具有應有的生物活性，本公開配體藥物偶聯物至少含有一個胺基，因此可以與酸形成鹽，可藥用鹽的非限制性實例包括：鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、檸檬酸鹽、乙酸鹽、琥珀酸鹽、抗壞血酸鹽、草酸鹽、硝酸鹽、梨酸鹽、磷酸氫鹽、磷酸二氫鹽、水楊酸鹽、檸檬酸氫鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、甲酸鹽、苯甲酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、苯磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽。
術語“溶劑合物”指本公開的配體-藥物偶聯物與一種或多種溶劑分子形成可藥用的溶劑化物，溶劑分子的非限制性實例包括水、乙醇、乙腈、異丙醇、DMSO、乙酸乙酯。
術語“載藥量”是指式(I)分子中每個配體上加載的細胞毒性藥物平均數量，也可以表示為藥物量和抗體量的比值，藥物載量的範圍可以是每個配體(Pc)連接0-12個，較佳1-10個細胞毒性藥物(D)。在本公開的實施方案中，載藥量表示為n，也可稱為DAR值，示例性的為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10的均值。可用常規方法如UV/可見光光譜法、質譜、ELISA試驗和HPLC特徵鑒定偶聯反應後每個ADC分子的藥物品均數量。
本公開的一個實施方式中，細胞毒性藥物藉由連接單員偶聯在配體的N端胺基和/或賴胺酸殘基的ε-胺基上，一般地，偶聯反應中能與抗體偶聯的藥物分子數將小於理論上的最大值。
可以用以下非限制性方法控制配體細胞毒性藥物偶聯物的載量，包括：(1)控制連接試劑和單抗的莫耳比， (2)控制反應時間和溫度，(3)選擇不同的反應試劑。
常規的醫藥組成物的製備見中國藥典。
術語“載體”用於本公開的藥物，是指能改變藥物進入人體的方式和在體內的分佈、控制藥物的釋放速度並將藥物輸送到靶向器官的體系。藥物載體釋放和靶向系統能夠減少藥物降解及損失，降低副作用，提高生物利用度。如可作為載體的高分子表面活性劑由於其獨特的兩親性結構，可以進行自組裝，形成各種形式的聚集體，較佳的實例如膠束、微乳液、凝膠、液晶、囊泡等。這些聚集體具有包載藥物分子的能力，同時又對膜有良好的滲透性，可以作為優良的藥物載體。
術語“賦形劑”是在藥物製劑中除主藥以外的附加物，也可稱為輔料。如片劑中的黏合劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑；半固體製劑軟膏劑、霜劑中的基質部分；液體製劑中的防腐劑、抗氧劑、矯味劑、芳香劑、助溶劑、乳化劑、增溶劑、滲透壓調節劑、著色劑等均可稱為賦形劑。
術語“稀釋劑”又稱填充劑，其主要用途是增加片劑的重量和體積。稀釋劑的加入不僅保證一定的體積大小，而且減少主要成分的劑量偏差，改善藥物的壓縮成型性等。當片劑的藥物含有油性組分時，需加入吸收劑吸收油性物，使保持“乾燥”狀態，以利於製成片劑。如澱粉、乳糖、鈣的無機鹽、微晶纖維素等。
醫藥組成物可以是無菌注射水溶液形式。可在使用的可接受的溶媒和溶劑中有水、林格氏液和等滲氯化鈉溶液。無菌注射製劑可以是其中活性成分溶於油相的無菌注射水包油微乳。例如將活性成分溶於大豆油和卵磷脂的混合物中。然後將油溶液加入水和甘油的混合物中處理形成 微乳。可藉由局部大量注射，將注射液或微乳注入患者的血流中。或者，最好按可保持本公開化合物恆定循環濃度的方式給予溶液和微乳。為保持這種恆定濃度，可使用連續靜脈內遞藥裝置。這種裝置的實例是Deltec CADD-PLUS.TM.5400型靜脈注射泵。
醫藥組成物可以是用於肌內和皮下給藥的無菌注射水或油混懸液的形式。可按已知技術，用上述那些適宜的分散劑或濕潤劑和懸浮劑配製該混懸液。無菌注射製劑也可以是在無毒腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑中製備的無菌注射溶液或混懸液，例如1,3-丁二醇中製備的溶液。此外，可方便地用無菌固定油作為溶劑或懸浮介質。為此目的，可使用包括合成甘油單或二酯在內的任何調和固定油。此外，脂肪酸例如油酸也可以製備注射劑。
本公開涉及一類可裂解的特定結構的連接臂和特定結構的活性物，及由連接臂、活性物與抗體組成的抗體藥物偶聯物(ADC)。此類ADC是經由間隔物將一種毒性物質連於抗體而形成的複合物。該抗體偶聯藥物(ADC)在體內經降解而釋放出活性分子，從而起到抗腫瘤的作用。
二、合成方法
為了完成合成目的，採用如下的合成技術方案：通式(Pc-La-Y-Dr)所示的化合物的製備方法，其包括如下步骤：
Figure 108135628-A0101-12-0042-58
Pc還原後，與通式(La-Y-Dr)偶聯反應，得到通式(Pc-La-Y-Dr)所示的化合物；還原劑較佳TCEP，特別地，較佳還原抗體上的二硫鍵；其中：Pc、W、L2、L3、R1、R2、R5~R7、m和n如通式(Pc-La-Y-Dr)中所定義。
在以上說明書中提出了本公開一種或多種實施方案的細節。雖然可使用與本文所述類似或相同的任何方法和材料來實施或測試本公開，但是以下描述較佳的方法和材料。藉由說明書和申請專利範圍，本公開的其他特點、目的和優點將是顯而易見的。在說明書和申請專利範圍中，除非上下文中有清楚的另外指明，單數形式包括複數指代物的情況。除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語都具有本公開所屬領域普通技術人員所理解的一般含義。說明書中引用的所有專利和出版物都藉由引用納入。提出以下實施例是為了更全面地說明本公開的較佳實施方案。這些實施例不應以任何方式理解為限制本公開的範圍，本公開的範圍由申請專利範圍限定。
本公開實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未註明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
化合物的結構是藉由核磁共振(NMR)或質譜(MS)來確定的。NMR的測定是用Bruker AVANCE-400核磁儀，測定溶劑為氘代二甲基亞碸(DMSO-d6)、氘代氯仿(CDCl3)、氘代甲醇(CD3OD)，內標為四甲基矽烷(TMS)，化學位移是以10-6(ppm)作為單位給出。
MS的測定用FINNIGAN LCQAd(ESI)質譜儀(生產商：Thermo，型號：Finnigan LCQ advantage MAX)。
UPLC的測定用Waters Acquity UPLC SQD液質聯用儀。
HPLC的測定使用安捷倫1200DAD高壓液相色譜儀(Sunfire C18 150×4.6mm色譜柱)和Waters 2695-2996高壓液相色譜儀(Gimini C18 150×4.6mm色譜柱)。
UV-HPLC的測定使用Thermo nanodrop2000紫外分光光度計。
增殖抑制率及IC50值的測定用PHERA starFS酶標儀(德國BMG公司)。
薄層層析矽膠板使用煙臺黃海HSGF254或青島GF254矽膠板，薄層色譜法(TLC)使用的矽膠板採用的規格是0.15mm~0.2mm，薄層層析分離純化產品採用的規格是0.4mm~0.5mm矽膠板。
柱層析一般使用煙臺黃海200~300目矽膠為載體。
本公開的已知的起始原料可以採用或按照本領域已知的方法來合成，或可購買自ABCR GmbH & Co.KG，Acros Organnics，Aldrich Chemical Company，韶遠化學科技(Accela ChemBio Inc)、達瑞化學品等公司。
實施例中如無特殊說明，反應均在氬氣氛或氮氣氛下進行。
氬氣氛或氮氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氬氣或氮氣氣球。
氫氣氛是指反應瓶連接一個約1L容積的氫氣氣球。
加壓氫化反應使用Parr 3916EKX型氫化儀和清藍QL-500型氫氣發生器或HC2-SS型氫化儀。
氫化反應通常抽真空，充入氫氣，重複操作3次。
微波反應使用CEM Discover-S 908860型微波反應器。
實施例中如無特殊說明，反應中的溶液是指水溶液。
實施例中如無特殊說明，反應的溫度為室溫。
室溫為最適宜的反應溫度，溫度範圍是20℃~30℃。
實施例中pH=6.5的PBS緩衝液的配製：取KH2PO4 8.5g，K2HPO4.3H2O 8.56g，NaCl 5.85g，EDTA 1.5g置於瓶中，定容至2L，超聲波使其全部溶解，搖勻即得。
純化化合物採用的柱層析的洗脫劑的體系和薄層色譜法的展開劑的體系包括：A：二氯甲烷和異丙醇體系，B：二氯甲烷和甲醇體系，C：石油醚和乙酸乙酯體系，溶劑的體積比根據化合物的極性不同而進行調節，也可以加入少量的三乙胺和酸性或鹼性試劑等進行調節。
本公開部分化合物是藉由Q-TOF LC/MS來表徵的。Q-TOF LC/MS使用安捷倫6530精確質量數四級杆-飛行時間質譜儀和安捷倫1290-Infinity超高效液相色譜儀(安捷倫Poroshell 300SB-C8 5μm,2.1×75mm色譜柱)。
實施例1 N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-1-羥基環丙烷-1-甲醯胺1
Figure 108135628-A0101-12-0045-59
向依喜替康甲磺酸鹽1b(2.0mg，3.76μmol，採用專利申請“EP0737686A1”公開的方法製備而得)中添加1mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加一滴三乙胺，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入1-羥基環丙基甲酸1a(1.4mg，3.7μmol，採用公知的方法“Tetrahedron Letters,25(12),1269-72；1984”製備而得)和4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(3.8mg，13.7μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應2小時。向反應液中加入5mL水淬滅反應，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取反應液，合併有機相，用飽和氯化鈉溶液(5mL×2)洗滌，有機相用無水硫酸鈉乾燥，過濾，將濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物1(1.6mg，產率：82.1%)。
MS m/z(ESI)：520.2[M+1]。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.90-7.84(m,1H),7.80-7.68(m,1H),5.80-5.70(m,1H),5.62-5.54(m,2H),5.44-5.32(m,2H),5.28-5.10(m,2H),3.40-3.15(m,3H),2.44(s,3H),2.23(t,1H),2.06-1.75(m,2H),1.68-1.56(m,1H),1.22-1.18(m,2H),1.04-0.98(m,2H),0.89(t,3H)。
實施例2 (S)-2-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-1,2,3,9,10,12,13,15-八氫苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺2-A (R)-2-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-1,2,3,9,10,12,13,15-八氫苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-2-羥基乙醯胺2-B
Figure 108135628-A0101-12-0046-176
向1b(4mg，7.53μmol)中加入2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基嗎啉，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入2-環丙基-2-羥基乙酸2a(2.3mg，19.8μmol，採用專利申請“WO2013106717”公開的方法製備而得)、1-羥基苯並三唑(3mg，22.4μmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳 二亞胺鹽酸鹽(4.3mg，22.4μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應1小時。撤去冰水浴，加熱至30℃攪拌2小時。反應液減壓濃縮，所得到的粗品化合物2用高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)，B-乙腈，梯度洗脫，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(1.5mg，1.5mg)。
MS m/z(ESI)：534.0[M+1]。
單一構型化合物2-B(較短保留時間)
UPLC分析：保留時間1.06分鐘，純度：88%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.37(d,1H),7.76(d,1H),7.30(s,1H),6.51(s,1H),5.58-5.56(m,1H),5.48(d,1H),5.41(s,2H),5.32-5.29(m,1H),3.60(t,1H),3.19-3.13(m,2H),2.38(s,3H),2.20-2.14(m,1H),1.98(q,2H),1.87-1.83(m,1H),1.50-1.40(m,1H),1.34-1.28(m,1H),0.86(t,3H),0.50-0.39(m,4H)。
單一構型化合物2-A(較長保留時間)
UPLC分析：保留時間1.10分鐘，純度：86%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.35(d,1H),7.78(d,1H),7.31(s,1H),6.52(s,1H),5.58-5.53(m,1H),5.42(s,2H),5.37(d,1H),5.32(t,1H),3.62(t,1H),3.20-3.15(m,2H),2.40(s,3H),2.25-2.16(m,1H),1.98 (q,2H),1.87-1.82(m,1H),1.50-1.40(m,1H),1.21-1.14(m,1H),0.87(t,3H),0.47-0.35(m,4H)。
實施例3 (S)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-1,2,3,9,10,12,13,15-八氫苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-3,3,3-三氟-2-羥基丙醯胺3-A (R)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-1,2,3,9,10,12,13,15-八氫苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-3,3,3-三氟-2-羥基丙醯胺3-B
Figure 108135628-A0101-12-0048-63
向1b(5.0mg，9.41μmol)中添加2mL乙醇和0.4mL N,N-二甲基甲醯胺，冰水浴冷卻至0-5℃，滴加0.3mL N-甲基嗎啡啉，攪拌至反應液變澄清。向反應液中依次加入3,3,3-三氟-2-羥基丙酸3a(4.1mg，28.4μmol，供應商Alfa)、1-羥基苯並三唑(3.8mg，28.1μmol)和1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(5.4mg，28.2μmol)，加畢，在0-5℃攪拌反應10分鐘。撤去冰水浴，加熱至30℃攪拌8小時。反應液減壓濃縮，所得到的粗品化合物3用高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度洗脫，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(1.5mg，1.5mg)。
MS m/z(ESI)：561.9[M+1]。
單一構型化合物(較短保留時間)
UPLC分析：保留時間1.11分鐘，純度：88%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.94(d,1H),7.80(d,1H),7.32(s,1H),7.20(d,1H),6.53(s,1H),5.61-5.55(m,1H),5.45-5.23(m,3H),5.15-5.06(m,1H),4.66-4.57(m,1H),3.18-3.12(m,1H),2.40(s,3H),2.26-2.20(m,1H),2.16-2.08(m,1H),2.02-1.94(m,1H),1.89-1.82(m,1H),1.50-1.40(m,1H),0.87(t,3H)。
單一構型化合物(較長保留時間)
UPLC分析：保留時間1.19分鐘，純度：90%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.97(d,1H),7.80(d,1H),7.31(s,1H),7.16(d,1H),6.53(s,1H),5.63-5.55(m,1H),5.45-5.20(m,3H),5.16-5.07(m,1H),4.66-4.57(m,1H),3.18-3.12(m,1H),2.40(s,3H),2.22-2.14(m,1H),2.04-1.95(m,2H),1.89-1.82(m,1H),1.50-1.40(m,1H),0.87(t,3H)。
實施例4 1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五側氧基-2,5,8,11,14-五氮雜二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺4
Figure 108135628-A0101-12-0050-64
第一步 1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲氧基)環丙烷-1-羧酸苄酯4c
將1-羥基環丙烷-1-羧酸苄酯4a(104mg，0.54mmol；採用專利申請“US2005/20645”公開的方法製備而得)和2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲基乙酸酯4b(100mg，0.27mmol；採用專利申請“CN105829346A”公開的方法製備而得)加入反應瓶，加入5mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(61mg，0.54mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌10分鐘，加入20mL冰水，用乙 酸乙酯(5mL×2)和氯仿(5mL×5)萃取，合併有機相並濃縮。所得殘餘物溶於3mL 1,4-二氧六環中，加入0.6mL水，加入碳酸氫鈉(27mg，0.32mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(70mg，0.27mmol)，室溫攪拌1小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(8mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物4c(100mg，產率：73.6%)。
MS m/z(ESI)：501.0[M+1]。
第二步 1-((2-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)胺基)乙醯胺基)甲氧基)環丙烷-1-羧酸4d
將4c(50mg，0.10mmol)溶於3mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(25mg，含量10%)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應1小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用四氫呋喃淋洗，濾液濃縮，得到標題產物4d(41mg，產率：100%)。
MS m/z(ESI)：411.0[M+1]。
第三步 (9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)環丙氧基)甲基)胺基)-2-側氧基乙基)胺基甲酸酯4e
將1b(7mg，0.013mmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入4d(7mg，0.017mmol)的0.5mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(7mg，0.026mmol)，冰浴 攪拌反應35分鐘。加入10mL水，用乙酸乙酯(5mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物4e(8.5mg，產率78.0%)。
MS m/z(ESI)：828.0[M+1]。
第四步 1-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺4f
將4e(4mg，4.84μmol)溶於0.2mL二氯甲烷中，加入0.1mL二乙胺，室溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯減壓濃縮，重複兩次，加入3mL正己烷打漿，傾倒出上層正己烷，重複三次，減壓濃縮得到粗品標題產物4f(2.9mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：606.0[M+1]。
第五步 1-(((S)-7-苄基-20-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)-3,6,9,12,15-五側氧基-2,5,8,11,14-五氮雜二十烷基)氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)環丙烷-1-甲醯胺4
將粗品4f(2.9mg，4.84μmol)溶於0.5mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入(S)-2(-2-(-2-(6-(2,5-二側氧基-1H-吡咯-1-基)已醯胺基)乙醯胺基)乙醯胺基)-3-苯基丙酸4g(2.7mg，5.80μmol，採用專利申請“EP2907824”公開的方法製備而得)的0.3mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲 基氯化嗎啉鹽(2.7mg，9.67μmol)，冰浴攪拌反應30分鐘，撤去冰浴，升至室溫攪拌15分鐘。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度洗脫，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮得到標題產物4(2mg，產率：39.0%)。
MS m/z(ESI)：1060.0[M+1]。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 9.01(d,1H),8.77(t,1H),8.21(t,1H),8.08-7.92(m,2H),7.73(d,1H),7.28(s,1H),7.24-7.07(m,4H),6.98(s,1H),6.50(s,1H),5.61(q,1H),5.40(s,2H),5.32(t,1H),5.12(q,2H),4.62(t,1H),4.52(t,1H),4.40-4.32(m,1H),3.73-3.47(m,8H),3.16-3.04(m,2H),2.89(dd,1H),2.69-2.55(m,2H),2.37-2.23(m,4H),2.12-1.93(m,4H),1.90-1.74(m,2H),1.52-1.38(m,4H),1.33-1.11(m,5H),0.91-0.81(m,4H)。
實施例5 N-((2R,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺5-A N-((2S,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺5-B
Figure 108135628-A0101-12-0054-65
第一步 2-環丙基-2-羥基乙酸苄酯5a
將2a(1.3g，11.2mmol；採用專利申請“WO2013/106717”公開的方法製備而得)溶於50mL乙腈中，依次加入碳酸鉀(6.18g，44.8mmol)、溴化苄(1.33mL，11.2mmol)和四丁基碘化銨(413mg，1.1mmol)。將反應液室溫攪拌48小時，藉由矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯(10ml)淋洗，合併濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物5a(2g，產率：86.9%)。
第二步 10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧基-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸苄酯5b
將5a(120.9mg,0.586mmol)和4b(180mg，0.489mmol)加入反應瓶，加入4mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(109mg，0.98mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌40分鐘，加入10mL冰水，用乙酸乙酯(20mL×2)和氯仿(10mL×5)萃取，合併有機相並濃縮。所得殘餘物溶於4mL二氧六環中，加入2mL水，加入碳酸氫鈉(49.2mg，0.586mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(126mg，0.49mmol)，室溫攪拌2小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物5b(48mg，產率：19%)。
MS m/z(ESI)：515.0[M+1]。
第三步 10-環丙基-1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧基-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸5c
將5b(20mg，0.038mmol)溶於4.5mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(12mg，含量10%，乾型)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應1小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用乙酸乙酯淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題產物5c(13mg)，產品不經純化直接進行下一步反應。
MS m/z(ESI)：424.9[M+1]。
第四步 (9H-芴-9-基)甲基(2-(((1-環丙基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲 哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-2-側氧基乙氧基)甲基)胺基)-2-側氧基乙基)胺基甲酸酯5d
將1b(10mg，18.8μmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入粗品5c(13mg，30.6μmol)，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(16.9mg，61.2μmol)，冰浴攪拌反應40分鐘。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合併有機相。有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮。用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物5d(19mg，產率：73.6%)。
MS m/z(ESI)：842.1[M+1]。
第五步 2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-2-環丙基-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)乙醯胺5e
將5d(19mg，22.6μmol)溶於2mL二氯甲烷中，加入1mL二乙胺，室溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，加入1mL甲苯並減壓濃縮，重複兩次。向殘餘物中加入3mL正己烷打漿，靜置後傾倒出上層清液，保留固體。將固體殘餘物減壓濃縮，油泵拉乾得到粗品標題產物5e(17mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：638.0[M+18]。
第六步 N-((2R,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲 哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺5-A N-((2S,10S)-10-苄基-2-環丙基-1-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,6,9,12,15-五側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺5-B
將粗品5e(13.9mg，22.4μmol)溶於0.6mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入4g(21.2mg，44.8μmol)的0.3mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(18.5mg，67.3μmol)，冰浴攪拌反應10分鐘，撤去冰浴，升至室溫攪拌1小時，反應生成化合物5。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)：B-乙腈，梯度洗脫，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(2.4mg，1.7mg)。
MS m/z(ESI)：1074.4[M+1]。
單一構型化合物5-A(較短保留時間)：UPLC分析：保留時間1.14分鐘，純度：85%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.60(t,1H),8.51-8.49(d,1H),8.32-8.24(m,1H),8.13-8.02(m,2H),8.02-7.96(m,1H),7.82-7.75(m,1H),7.31(s,1H),7.26-7.15(m,4H),6.99(s,1H),6.55-6.48(m,1H),5.65-5.54(m,1H),5.41(s,2H),5.35-5.15(m,3H),4.74-4.62(m,2H),4.54-4.40(m,2H),3.76-3.64(m，4H),3.62-3.48(m,2H),3.20-3.07(m, 2H),3.04-2.94(m,2H),2.80-2.62(m,2H),2.45-2.30(m,3H),2.25-2.15(m,2H),2.15-2.04(m,2H),1.93-1.78(m,2H),1.52-1.39(m,3H),1.34-1.12(m,5H),0.87(t,3H),0.64-0.38(m,4H)。
單一構型化合物5-B(較長保留時間)：UPLC分析：保留時間1.16分鐘，純度：89%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.68-8.60(m,1H),8.58-8.50(m,1H),8.32-8.24(m,1H),8.13-8.02(m,2H),8.02-7.94(m,1H),7.82-7.75(m,1H),7.31(s,1H),7.26-7.13(m,4H),6.99(s,1H),6.55-6.48(m,1H),5.60-5.50(m,1H),5.41(s,2H),5.35-5.15(m,3H),4.78-4.68(m,1H),4.60-4.40(m,2H),3.76-3.58(m,4H),3.58-3.48(m,1H),3.20-3.10(m,2H),3.08-2.97(m,2H),2.80-2.72(m,2H),2.45-2.30(m,3H),2.25-2.13(m,2H),2.13-2.04(m,2H),2.03-1.94(m,2H),1.91-1.78(m,2H),1.52-1.39(m,3H),1.34-1.12(m,5H),0.91-0.79(m,3H),0.53-0.34(m,4H)。
實施例6 N-((2S,10S)-10-苄基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)-1,1,1-三氟-6,9,12,15-四側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺6-A N-((2R,10S)-10-苄基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)-1,1,1-三氟-6,9,12,15-四側氧基-3-氧雜- 5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺6-B
Figure 108135628-A0101-12-0059-66
第一步 3,3,3-三氟-2-羥基丙酸苄酯6a
將3a(1.80g，12.5mmol)溶於100mL乙腈中，依次加入碳酸鉀(5.17g，37.5mmol)、溴化苄(4.48mL，37.5mmol)和四丁基碘化銨(231mg，0.63mmol)。將反應液加熱至60℃攪拌5小時。將反應液冷卻至室溫，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物6a(980mg，產率：33.5%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.43-7.36(m,5H),5.34(s,2H),4.53(s,1H),3.44(s,1H)。
第二步 1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧基-10-(三氟甲基)-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸苄酯6b
將4b(63mg,0.17mmol)和6a(80mg，0.34mmol)加入反應瓶，加入3mL四氫呋喃，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入第三丁醇鉀(38mg，0.34mmol)，撤去冰浴，升至室溫攪拌20分鐘，加入10mL冰水，用乙酸乙酯(20mL×2)和氯仿(10mL×5)萃取，合併有機相並濃縮，所得殘餘物溶於2mL二氧六環中，加入0.4mL水，加入碳酸氫鈉(19mg，0.23mmol)和氯甲酸-9-芴甲酯(49mg，0.19mmol)，室溫攪拌1小時。加入20mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，有機相用飽和氯化鈉溶液(20mL)洗滌，無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用矽膠柱色譜法以展開劑體系C純化所得殘餘物，得到標題產物6b(51mg，產率：55.3%)。
MS m/z(ESI)：559.9[M+18]。
第三步 1-(9H-芴-9-基)-3,6-二側氧基-10-(三氟甲基)-2,9-二氧雜-4,7-二氮雜十一-11-酸6c
將6b(15mg，0.28mmol)溶於3mL四氫呋喃和乙酸乙酯(V：V=2：1)混合溶劑中，加入鈀碳(15mg，含量10%)，氫氣置換三次，室溫攪拌反應1小時。反應液用矽藻土過濾，濾餅用四氫呋喃淋洗，濾液濃縮，得到粗品標題產物6c(13mg)。
MS m/z(ESI)：452.9[M+1]。
第四步 (9H-芴-9-基)甲基(2-((((3-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基)-1,1,1-三氟-3-側氧基丙-2-基)氧基)甲基)胺基)-2-側氧基乙基)胺基甲酸酯6d
將1b(10mg，18.8μmol)加入反應瓶，加入1mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，滴加一滴三乙胺，加入6c(13mg，28.7μmol)的0.5mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(11mg，39.7μmol)，冰浴攪拌反應30分鐘。加入10mL水，用乙酸乙酯(10mL×3)萃取，合併有機相，有機相用飽和氯化鈉溶液(10mL×2)洗滌，用無水硫酸鈉乾燥，過濾，濾液減壓濃縮，用薄層層析以展開劑體系B純化所得殘餘物，得到標題產物6d(16mg，產率97.8%)。
MS m/z(ESI)：870.0[M+1]。
第五步 2-((2-胺基乙醯胺基)甲氧基)-N-((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)-3,3,3-三氟丙醯胺6e
將6d(16mg，18.4μmol)溶於0.6mL二氯甲烷中，加入0.3mL二乙胺，室溫攪拌2小時。反應液減壓濃縮，加入2mL甲苯並減壓濃縮，重複兩次。向殘餘物中加入3mL正己烷打漿，靜置後傾倒出上層 清液，保留固體；重複三次。將固體殘餘物減壓濃縮，油泵拉乾得到粗品標題產物6e(12mg)，產品不經純化直接用於下一步反應。
MS m/z(ESI)：647.9[M+1]。
第六步 N-((2S,10S)-10-苄基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)-1,1,1-三氟-6,9,12,15-四側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺6-A N-((2R,10S)-10-苄基-2-(((1S,9S)-9-乙基-5-氟-9-羥基-4-甲基-10,13-二側氧基-2,3,9,10,13,15-六氫-1H,12H-苯並[de]吡喃並[3',4'：6,7]吲哚嗪並[1,2-b]喹啉-1-基)胺基羰基)-1,1,1-三氟-6,9,12,15-四側氧基-3-氧雜-5,8,11,14-四氮雜十六-16-基)-6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺6-B
將粗品6e(12mg，18.5μmol)溶於1.0mL N,N-二甲基甲醯胺，氬氣置換三次，冰水浴降溫至0-5℃，加入4g(14mg，29.6μmol)的0.3mL N,N-二甲基甲醯胺溶液，加入4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基氯化嗎啉鹽(15mg，54.2μmol)，冰浴攪拌反應30分鐘，撤去冰浴，升至室溫攪拌1小時，反應生成化合物6。反應液進行高效液相色譜法純化(分離條件：色譜柱：XBridge Prep C18 OBD 5um 19*250mm；流動相：A-水(10mmol NH4OAc)B-乙腈，梯度洗脫，流速：18mL/min)，收集其相應組分，減壓濃縮，得到標題產物(2.7mg，2.6mg)。
MS m/z(ESI)：1102.0[M+1]。
單一構型化合物(較短保留時間)：UPLC分析：保留時間1.18分鐘，純度：91%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 8.97(d,1H),8.85-8.76(m,1H),8.37-8.27(m,1H),8.12-8.02(m,1H),8.02-7.95(m,1H),7.80(d,1H),7.31(s,1H),7.26-7.10(m,4H),6.99(s,1H),6.66(s,1H),6.52(s,1H),5.65-5.54(m,1H),5.41(s,1H),5.37-5.25(m,3H),5.23-5.13(m,1H),4.81-4.68(m,2H),4.51-4.41(m,1H),3.78-3.45(m,6H),3.21-3.13(m,1H),3.02-2.93(m,1H),2.77-2.63(m,2H),2.45-2.29(m,3H),2.24-2.05(m,3H),2.04-1.93(m,5H),1.90-1.75(m,2H),1.52-1.38(m,4H),0.90-0.78(m,5H)。
單一構型化合物(較長保留時間)：UPLC分析：保留時間1.23分鐘，純度：90%(色譜柱：ACQUITY UPLC BEHC18 1.7um 2.1*50mm，流動相：A-水(5mmol NH4OAc)，B-乙腈)。
1H NMR(400MHz,DMSO-d 6)：δ 9.05(d,1H),8.97-8.88(m,1H),8.35-8.27(m,1H),8.11-8.03(m,1H),8.02-7.95(m,1H),7.80(d,1H),7.34(s,1H),7.29-7.13(m,4H),6.99(s,1H),6.66(s,1H),6.54(s,1H),5.64-5.55(m,1H),5.43(s,1H),5.36-5.20(m,3H),4.92-4.85(m,1H),4.82-4.72(m,2H),4.52-4.42(m,1H),3.77-3.48(m,6H),3.21-3.14(m,1H),3.03-2.95(m,1H),2.79-2.65(m,2H),2.47-2.28(m,3H),2.25-2.05(m,3H),2.05-1.94(m,5H),1.91-1.76(m,2H),1.52-1.37(m,4H),0.92-0.77(m,5H)。
實施例7相關抗體及其檢測蛋白的製備 實施例7-1. B7H3抗原及檢測用蛋白
以SEQ ID NO：1所示人B7H3作為本公開B7H3的模板，設計本公開涉及的抗原及檢測用蛋白的胺基酸序列。以下B7H3抗原未特殊說明的均指人B7H3。
1.1 人B7H3全長胺基酸序列：B7H3(SEQ ID NO：1)：
Figure 108135628-A0101-12-0064-67
註釋：雙橫線部分為信號肽(Signal peptide：1-28)；劃橫線部分為B7H3胞外區(Extracellular domain：29-466)，其中29-139為Ig-樣V-型1結構域，145-238為Ig-樣C2-型1結構域；243-357為Ig-樣V-型2結構域，363-456為Ig-樣C2-型2結構域；點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：467-487)；斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：488-534)。
1.2 鼠B7H3全長胺基酸序列(SEQ ID NO：2)
Figure 108135628-A0101-12-0065-68
註釋：雙橫線部分為信號肽(Signal peptide：1-28)；劃橫線部分為B7H3胞外區(Extracellular domain：29-248)，其中29-139為Ig-樣V-型結構域，145-238為Ig-樣C2-型結構域；點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：249-269)；斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：270-316)。
1.3 篩選及檢測用人B7H3抗原(SEQ ID NO：3)
為商業化產品(R&D cat# 1949-B3-050/CF，簡稱2Ig-B7H3)，序列如下：
Figure 108135628-A0101-12-0065-69
註釋：劃橫線部分為B7H3胞外區； 斜體部分為His-tag標記。
1.4 檢測用人B7H3抗原(SEQ ID NO：4)
為商業化產品(SinoBiological cat# 11188-H08H，簡稱4Ig-B7H3)，序列如下：
Figure 108135628-A0101-12-0066-72
註釋：劃橫線部分為B7H3胞外區；斜體部分為His-tag標記。
1.5 篩選及檢測用鼠B7H3抗原(SEQ ID NO：5)
為商業化產品(R&D cat#1397-B3-050/CF)，序列如下：
Figure 108135628-A0101-12-0066-73
註釋：劃橫線部分為B7H3胞外區；斜體部分為His-tag標記。
實施例7-2. 完全人源抗體的製備
2.1 陽性序列的篩選
利用人PBMC、脾臟、淋巴結組織分離B細胞，並提取RNA，構建天然單鏈噬菌體抗體庫(庫容3.2×1010)。將構建的天然單鏈噬菌體文庫經過包裝形成噬菌體顆粒後，採用液相法進行淘篩，噬菌體與生物素化的B7H3液相結合，再採用鏈黴親和素磁珠分離。為了獲得可分別與人B7H3(R&D cat# 1949-B3-050/CF)和鼠B7H3(R&D cat#1397-B3-050/CF)交叉結合的陽性序列，分別採用生物素化的人B7H3和生物素化的鼠B7H3進行交替淘篩，首輪採用2μg/ml生物素化的人B7H3進行淘篩，第二輪採用2μg/ml生物素化的鼠B7H3進行淘篩，第三輪採用0.5μg/ml生物素化的人B7H3進行淘篩，經三輪淘篩後，挑取500個單純株包裝成噬菌體，用於噬菌體ELISA測試。分別測試單純株噬菌體與人B7H3(R&D cat# 1949-B3-050/CF)和鼠B7H3(R&D cat#1397-B3-050/CF)的結合活性：ELISA板上分別包被1μg/ml人B7H3或鼠B7H3以及1%BSA，加入1：1封閉緩衝液稀釋的噬菌體上清，最後用anti-M13 HRP檢測。將ELISA測試到的OD450值大於0.5，以及結合人和鼠B7H3的ELISA OD450值除以結合1%BSA的ELISA OD450值的兩個比值均大於2.0的純株進行測序，得到特異性序列1702(在本公開中也稱h1702，本公開所稱抗體h1702和h1702DS與申請PCT/CN2018/081249的h1702和h1702-1相同，將申請PCT/CN2018/081249中的所有內容引入本公開)。
2.2 完整單株抗體的構建
噬菌體庫篩選得到特異性序列1702，構建其完整單株抗體的過程如下：根據測序得到的單鏈抗體序列，設計引物PCR搭建各單鏈抗體序列的VH/VK/VL基因片段。獲得1702的重輕鏈可變區。
>1702重鏈可變區序列
Figure 108135628-A0101-12-0068-74
SEQ ID NO：6
>1702輕鏈可變區序列
Figure 108135628-A0101-12-0068-75
SEQ ID NO：7
註：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，下劃線為CDR序列。
其中各抗體輕重鏈中CDR序列如表1所示。
Figure 108135628-A0101-12-0069-76
抗體可變區再與恆定區基因(CH1-FC/CL)片段進行同源重組，構建完整抗體VH-CH1-FC/VK-CL/VL-CL。
構建的完整全長抗體1702序列如下：1702重鏈(IgG1)胺基酸序列：(SEQ ID NO：14)
Figure 108135628-A0101-12-0069-77
1702輕鏈胺基酸序列：Lamada(SEQ ID NO：15)
Figure 108135628-A0101-12-0070-78
為進一步提高抗體的穩定性，對1702的輕鏈序列進行胺基酸突變，具體突變為輕鏈(SEQ ID NO：15)N端第一個胺基酸殘基Q替代為D，缺失突變C端第一個胺基酸殘基S，以獲得更加穩定和均一的單株抗體1702DS(在本公開中也稱h1702DS)。
突變修飾後的1702DS的重鏈序列為SEQ ID NO：14，輕鏈胺基酸序列如下：(SEQ ID NO：16)。
Figure 108135628-A0101-12-0070-79
2.3 全人抗體的表達與純化
分別表達抗體輕重鏈的質粒以1.5：1的比例轉染HEK293E細胞，6天後收集表達上清，高速離心去除雜質，用Protein A柱進行純化。用PBS沖洗柱子，至A280讀數降至基線。用pH3.0-pH3.5的酸性洗脫液洗脫目的蛋白，用1M Tris-HCl,pH8.0-9.0中和。洗脫樣品適當濃縮後，利用PBS 平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，以去除聚體，收集單體峰，分裝備用。
B7H3抗體-藥物偶聯物製備實施例
實施例8 ADC-1
Figure 108135628-A0101-12-0071-80
在37℃條件下，向抗體1702DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；7.3ml，13.8mg/ml，0.681μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.347mL，3.47μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至14.0ml，並取出3.3ml溶液往下反應。
將化合物4(3.0mg，2.75μmol)溶解於0.15mL DMSO中，加入到上述3.3ml溶液中，置於水浴振盪器，於25℃下振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-1通式的示例性產物ADC-1的PBS緩衝液(1.35mg/mL，13mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=7.50。
實施例9 ADC-2
Figure 108135628-A0101-12-0072-81
在37℃條件下，向抗體1702DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；1.0ml，13.8mg/ml，0.093μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.050mL，0.50μmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至2.0ml，並取出1.15ml溶液往下反應。
將化合物5-較短保留時間化合物5-A(1.29mg，1.02μmol)溶解於0.10mL DMSO中，加入到上述1.15ml溶液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-2通式的示例性產物ADC-2的PBS緩衝液(2.63mg/mL，2.4mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=7.24。
實施例10 ADC-3
Figure 108135628-A0101-12-0072-82
在37℃條件下，向抗體1702DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；7.3ml，13.8mg/ml，0.681μmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦的水溶液(10mM，0.347mL，3.47μmol)， 置於水浴振盪器，於37℃下振盪反應3小時，停止反應；將反應液用水浴降溫至25℃，稀釋至14.0ml，並取出3.3ml溶液往下反應。
將化合物6-較長保留時間化合物(3.0mg，2.75μmol)溶解於0.15mL DMSO中，加入到上述3.3ml溶液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-3通式的示例性產物ADC-3的PBS緩衝液(1.28mg/mL，13mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-HPLC計算平均值：n=7.58。
實施例11 ADC-4
Figure 108135628-A0101-12-0073-83
在37℃條件下，向抗體1702DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，2.14mL，144.60nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，73.7uL，740nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物5-較短保留時間化合物5-A(3.0mg，2793nmol)溶解於150ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)， 得到FADC-2通式的示例性產物ADC-4的PBS緩衝液(1.28mg/mL，13.0mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.87。
實施例12 ADC-5
Figure 108135628-A0101-12-0074-84
在37℃條件下，向抗體1702DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，0.89mL，60.14nmol)加入配置好的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，30.1uL，300nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物5-較短保留時間化合物5-A(1.02mg，950nmol)溶解於100ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-2通式的示例性產物ADC-5的PBS緩衝液(1.94mg/mL，3.5mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.11。
參考以上反應步驟，按本領域的常規技術手段調整反應條件，得到n值分別為2.97、4.8的FADC-2通式的示例性產物：ADC-6(n=2.97)；ADC-7(n=4.8)。
實施例13 ADC-8
Figure 108135628-A0101-12-0075-85
在37℃條件下，向抗體1702DS的PBS緩衝水溶液(pH=6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液；10.0mg/ml，0.89mL，60.14nmol)加入配置好的的三(2-羧乙基)膦(TCEP)的水溶液(10mM，30.1uL，300nmol)，置於水浴振盪器，於37℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用水浴降溫至25℃。
將化合物4(1.0mg，943nmol)溶解於100ul DMSO中，加入到上述反應液中，置於水浴振盪器，於25℃振盪反應3小時，停止反應。將反應液用Sephadex G25凝膠柱脫鹽純化(洗脫相：pH為6.5的0.05M的PBS緩衝水溶液，含0.001M的EDTA)，得到FADC-1通式的示例性產物ADC-8的PBS緩衝液(1.47mg/mL，4.5mL)，於4℃冷凍儲存。
UV-Vis計算平均值：n=6.33。
生物學評價
測試例1. Biacore抗體親和力實驗
用Biacore，GE儀器測定抗B7H3抗體，及B7H3-ADC和人2Ig-B7H3抗原，人4Ig-B7H3抗原之間的反應親和力。
用生物傳感芯片Protein A(Cat.# 29127556，GE)親和捕獲一定量的待測抗體/待測ADC，然後於芯片表面流經一系列濃度梯度下的人2Ig-B7H3抗原(Cat.# 1949-B3-050/CF，R&D)、人4Ig-B7H3抗 原(Cat.# 11188-H08H，Sino Biological)，利用Biacore儀器(Biacore T200，GE)實時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線。在每個循環解離完成後，用甘胺酸-鹽酸再生溶液(pH 1.5)(Cat.# BR-1003-54，GE)將生物芯片洗淨再生。實驗中用到的緩衝液為HBS-EP緩衝溶液(pH 7.4)(Cat.# BR-1001-88，GE)。
實驗得到的數據用BIAevaluation version 4.1，GE軟件以(1：1)Langmuir模型進行擬合，從而得出親和力數值。實驗結果見表2。
Figure 108135628-A0101-12-0076-86
結論：h1702抗體與抗原具有很強的親和力。同時，針對與人2Ig-B7H3、人4Ig-B7H3在Biacore實驗上的親和力測試表明，ADC與裸抗的親和力相似。
測試例2. 體外細胞內吞實驗
本實驗藉由檢測細胞內抗體的螢光信號，根據螢光信號強弱來評價抗體的內吞效果。將B7-H3抗體和APC anti-human IgG Fc(Biolegend，409306)以1：2的摩爾比例混合在冰上孵育15分鐘。將抗體混合物與2×105個U87MG細胞(人腦星形膠質母細胞瘤，中科院細胞庫，Catalog # TCHu138)在冰上孵育30分鐘後洗掉多餘的抗體，然後將細胞轉入預溫37℃的培養基中，在37℃分別孵育0、15、30、60和120分鐘。離心細胞並將細胞重懸在抗體洗脫液(0.05M甘胺酸，0.1M NaCl， PH2.45)中室溫孵育7分鐘，洗掉抗體洗脫液，使用BD Verse讀取細胞內螢光信號(結果見第1圖)。結果表明h1702與U87MG細胞系結合後，均能有效地被內吞入細胞。
測試例3. SD大鼠T1/2評價
SD大鼠(購自傑思捷實驗動物有限公司)4隻，雌雄各半，12/12小時光/暗調節，溫度24±3℃恆溫，濕度50-60%，自由進食飲水。實驗當天對SD大鼠分別尾靜脈注射受試藥物B7H3抗體/ADC，給藥劑量為3mg/kg，注射體積5ml/kg。
取血時間點為：第1天給藥後5分鐘、8時、24時(第2天)、第3天、第5天、第8天、第11天、第15天，於大鼠眼底靜脈取血，每次200μL(相當於取血清100μL)；收集的血樣在室溫放置半小時至凝集，然後於4℃10000×g離心10分鐘。收集上清，立即放置-80℃貯存。
用ELISA檢測血清中的B7H3抗體濃度，進行PK分析，結果見表3。
Figure 108135628-A0101-12-0077-87
結果表明，本公開h1702在大鼠體內的半衰期約為185h(7.7天)。
測試例4. B7H3抗體的化學穩定性
抗體製備後化學修飾是導致產品穩定性的常見問題之一，尤其是CDR區域的部分胺基酸高度脫醯胺、氧化或者異構化修飾，一般選擇儘量避免或者突變降低。取500μg待測抗體溶於500μl pH 7.4的PBS中，40℃水浴；分別於0、10、20天取樣，用於酶解實驗。將100μg不同時間點取樣的樣品溶於100μl 0.2M His-HCl(組胺酸鹽酸緩衝液)和8M Gua-HCl(胍胺酸鹽酸緩衝液)，pH 6.0溶液中，加3μl 0.1g/mL DTT(二硫蘇糖醇)，50℃水浴1小時後用0.02M His-HCl，pH 6.0的溶液超濾兩次，加入3μL 0.25mg/mL的胰蛋白酶(invitrogen，CAT#25200-072)，37℃水浴酶解過夜。Agilent 6530 Q-TOF進行LC-MS檢測分析，對潛在的修飾位點進行質譜分析(結果見表4)。結果顯示本公開中涉及的B7H3抗體h1702均無明顯的脫醯胺、氧化或者異構化加劇趨勢，提示良好的理化穩定性。
Figure 108135628-A0101-12-0078-88
測試例5. h1702DS抗體的穩定性
藉由SEC、非還原CE-SDS分析檢測方法(pH 9.0)和IEX分析檢測方法，對h1702和h1702DS進行穩定性檢測。
SEC檢測：使用Waters e2695色譜儀，Xbridge BEH 200A SEC色譜柱，上樣50μg抗體，PBS流動相等度洗脫。
CE-SDS NR方法：使用Beckman SDS-MW Analysis Kit試劑盒處理樣品。100μg蛋白中加入緩衝液，加熱變性。使用PA800毛細管電泳儀採集數據。
IEX方法：使用Waters Acquity H-Class色譜儀，Thermo MAbPac SCX-10色譜柱，CX-1 pH Gradient Buffer Kit作為流動相，上樣50μg抗體，線性梯度，採集280nm波長的紫外信號。
Figure 108135628-A0101-12-0079-178
測試例6：體外細胞增殖實驗
本實驗藉由檢測細胞內ATP含量，根據IC50大小評價B7H3-ADC對細胞增殖的抑制效果。
U87MG細胞(人腦星形膠質母細胞瘤，中科院細胞庫，Catalog # TCHu138)、Calu-6細胞(肺癌細胞，ATCC，Catalog # ATCC® HTB-56TM)、Detroit562細胞(人咽頭癌細胞ATCC，Catalog #ATCC® CCL-138TM)、A498細胞(腎癌細胞，ATCC，Catalog #ATCC® HTB-44TM) 培養在含10%FBS的EMEM培養基中，一週傳代2-3次，傳代比例1：3或1：6。EMEM培養基配置：MEM培養基(GE，CAT# SH30024.01)，NEAA(sigma，CAT# M7145-100ML)，丙酮酸鈉溶液(Sodium pyruvate solution，sigma，CAT# S8636-100ML)。
A-375(黑色素瘤細胞，ATCC，Catalog # ATCC® CRL-1619TM)培養在含10%FBS的DMEM(GE，SH30243.01)培養基中，一週傳代2-3次，傳代比例1：3或1：6。
CHO-K1(不表達人B7H3，ATCC，Catalog #ATCC® CCL-61TM)培養在含10%FBS的F12(Gibco，11765-054)培養基中，一週傳代2-3次，傳代比例1：4或1：6。
傳代時，吸掉培養基，用5ml 0.25%的胰酶沖洗細胞層，然後吸掉胰酶，將細胞放在培養箱中消化3~5分鐘，加入新鮮培養基重懸細胞，計數，將細胞懸液配製為相應密度(U87MG細胞500個細胞/孔；A-498細胞500個細胞/孔；A-375細胞300個細胞/孔；Calu-6細胞800個細胞/孔；detroit562細胞2000個細胞/孔；CHO-K1細胞500個細胞/孔)。
在96孔細胞培養板中加入180μL的細胞懸液，96孔板外圍只加入200ul培養基。將培養板在培養箱中培養24小時(37℃，5% CO2)。
將待測樣品用PBS或DMSO以3倍的倍比依次稀釋成9個濃度(各ADC起始濃度500nM)。將樣品加入培養板中，將培養板在培養箱孵育6天(37℃，5% CO2)。在96孔細胞培養板中，每孔加入90μl CellTiter-Glo試劑，室溫避光放置10分鐘，在Victor3中讀取化學發光信號值，數據使用GraphPad軟件處理。測得的IC50值見表6及第2A圖至第2F圖。
表6. 本公開ADC對細胞增殖的抑制效果
Figure 108135628-A0101-12-0081-90
測試例7：本公開ADC對人腦星形膠質母細胞瘤U87MG裸小鼠移植瘤的療效評價
一、試驗目的
本實驗以BALB/cA-nude裸小鼠為受試動物，評價本公開ADC化合物對人腦星形膠質母細胞瘤U87MG裸小鼠移植瘤的的療效。
二、受試藥物及材料
1、受試藥物
ADC-5(1mpk，3mpk)
ADC-8(1mpk，3mpk)
空白組(blank)：PH7.4的PBS緩衝液
2、配製方法：PH7.4的PBS緩衝液。
3、試驗動物
BALB/cA-nude裸小鼠：SPF，雌性，購自上海傑思捷實驗動物有限責任公司。
三、試驗方法
實驗用BALB/cA-nude裸小鼠，雌性，6-7週，皮下接種人腦星形膠質母細胞瘤U87MG細胞(同上)。接種細胞後第十天，將動物 隨機分組(D0)，每組8隻，開始腹腔注射給藥1次/週，共給藥3次，每週測2-3次瘤體積和體重，記錄數據。腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×a×b2
其中：a、b分別表示長、寬。
相對體積(RTV)=VT/V0
抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)
其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。CRTV、TRTV分別為實驗結束時的對照組(空白組)及實驗組的相對腫瘤體積。
四、試驗結果
腹腔注射(i.p.)給藥每週1次，共給藥3次，觀察至第18天時，ADC-8 1mpk的抑瘤率達到39.22%(P<0.01)；ADC-8 3mpk的抑瘤率達到80.24%(P<0.0001)；ADC-5 1mpk的抑瘤率達到27.53%(P<0.05)；ADC-5 3mpk的抑瘤率達到55.88%(P<0.0001)。觀察至22天(D22)時，各給藥組的抑瘤率均進一步提高，ADC-8 1mpk的抑瘤率達到47.7%(P<0.0001)；ADC-8 3mpk的抑瘤率達到89.8%(P<0.0001)；ADC-5 1mpk的抑瘤率達到40.6%(P<0.0001)；ADC-5 3mpk的抑瘤率達到63.3%(P<0.0001)。
給藥過程中各組動物體重正常，提示ADC無明顯毒副作用。檢測結果如表7和第3圖所示。所檢測抗體能夠有效抑制荷瘤裸鼠中U87MG移植瘤的生長，並且呈現出劑量依賴性。
表7. 本公開ADC對荷瘤裸鼠U87MG移植瘤的療效(D22)
Figure 108135628-A0101-12-0083-91
測試例8：本公開ADC對人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit 562裸小鼠移植瘤的療效評價
一、試驗目的
本實驗以BALB/cA-nude裸小鼠為受試動物，評價本公開ADC化合物對人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit 562裸小鼠移植瘤的療效。
二、受試藥物及材料
1、受試藥物
ADC-1(1mpk，3mpk)
ADC-2(1mpk，3mpk)
陰性對照ADC(3mpk)：非B7H3靶點與參比化合物(專利“CN104755494A”中實施例58)偶聯形成的配體毒素偶聯物
2、配製方法：均用PBS稀釋配製。
3、試驗動物
BALB/cA-nude裸小鼠：購自常州卡文斯實驗動物有限責任公司。
三、試驗方法
實驗用BALB/cA-nude裸小鼠，雌性，6-7週，皮下接種人咽頭癌胸水轉移細胞Detroit 562細胞。接種細胞後第十天，將動物隨機分組(D0)，每組8隻，開始腹腔注射給藥1次/週，共給藥3次，每週測2-3次瘤體積和體重，記錄數據。腫瘤體積(V)計算公式為：V=1/2×a×b2
其中：a、b分別表示長、寬。
相對體積(RTV)=VT/V0
抑瘤率(%)=(CRTV-TRTV)/CRTV(%)
其中V0、VT分別為實驗開始時及實驗結束時的腫瘤體積。CRTV、TRTV分別為實驗結束時的對照組(陰性對照)及實驗組的相對腫瘤體積。
四、試驗結果
腹腔注射給藥每週1次，共給藥3次，觀察至D28時，受試ADC抑瘤率分別是：ADC-1 1mg/kg(1mpk)的抑瘤率達到40.85%；ADC-1 3mg/kg(3mpk)的抑瘤率達到62.55%(P<0.05)；ADC-2 1mg/kg (1mpk)的抑瘤率達到44.26%；ADC-2 3mg/kg(3mpk)的抑瘤率達到72.27%(P<0.01)。
給藥過程中各組動物體重正常，提示ADC無明顯毒副作用。檢測結果如表8和第4圖所示。所檢測抗體能夠有效抑制荷瘤裸鼠中Detroit 562移植瘤的生長，並且呈現出劑量依賴性。
Figure 108135628-A0101-12-0085-92
測試例9：不同載藥量的ADC的體外細胞增殖
對具有FADC-2結構式的ADC化合物ADC-4(N=6.87)、ADC-6(n=2.97)、ADC-7(n=4.8)，檢測其在體外細胞增殖實驗的療效，實驗操作流程與測試例6相同。
測得的IC50值和最大抑制率見表9及第5A圖、第5B圖和第5C圖。結果顯示，不同DAR值的FADC-2均顯示出抑制細胞增殖的療效，且抑制效果與DAR值正相關，而裸抗無細胞增殖抑制的效果。
Figure 108135628-A0101-12-0086-93
測試例10：血漿穩定性
將ADC-4樣品，以100μg/ml的終濃度，分別與人血漿、猴血漿(上海美迪西生物醫藥股份有限公司)、和1%BSA(Sigma)PBS(上海生工)溶液混合均勻後，過濾除菌後置於37℃水浴鍋內孵育，將孵育當天記為第0天，隨後分別在第7天、14天和21天取出樣品，進行遊離毒素的檢測。
不同時間點的樣品取出後放至室溫，渦旋混勻；取25時間樣品至96孔板中；加入50中；內標工作液(100ng/mL喜樹鹼乙腈溶液) 及150μl乙腈；渦旋混合5分鐘，離心10分鐘(4000rpm)，取上清液5取上清進行LC/MS/MS分析(美國應用生物系統公司)。
結果如第6圖所示，ADC-4在人和猴血漿，以及1%BSA PBS溶液中均相當穩定，遊離毒素的釋放率最高不超過2%，且在第14天趨於穩定。
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 上海恆瑞醫藥有限公司
<120> 抗B7H3抗體-依喜替康類似物偶聯物及其醫藥用途
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 534
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 肽
<223> 人B7H3全長胺基酸序列
<400> 1
Figure 108135628-A0101-12-0088-94
Figure 108135628-A0101-12-0089-95
Figure 108135628-A0101-12-0090-96
<210> 2
<211> 316
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 肽
<223> 鼠B7H3全長胺基酸序列
<400> 2
Figure 108135628-A0101-12-0090-97
Figure 108135628-A0101-12-0091-98
<210> 3
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 肽
<223> 2Ig-B7H3
<400> 3
Figure 108135628-A0101-12-0091-99
Figure 108135628-A0101-12-0092-100
<210> 4
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 肽
<223> 4Ig-B7H3
<400> 4
Figure 108135628-A0101-12-0092-101
Figure 108135628-A0101-12-0093-102
<210> 5
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 肽
<223> 篩選及檢測用鼠B7H3抗原
<400> 5
Figure 108135628-A0101-12-0094-103
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 結構域
<223> 1702重鏈可變區序列
<400> 6
Figure 108135628-A0101-12-0095-104
<210> 7
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 結構域
<223> 1702輕鏈可變區序列
<400> 7
Figure 108135628-A0101-12-0095-105
Figure 108135628-A0101-12-0096-106
<210> 8
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 結構域
<223> 1702 HCDR1
<400> 8
Figure 108135628-A0101-12-0096-107
<210> 9
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 結構域
<223> 1702 HCDR2
<400> 9
Figure 108135628-A0101-12-0096-108
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 結構域
<223> 1702 HCDR3
<400> 10
Figure 108135628-A0101-12-0096-109
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 結構域
<223> 1702 LCDR1
<400> 11
Figure 108135628-A0101-12-0097-110
<210> 12
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 結構域
<223> 1702 LCDR2
<400> 12
Figure 108135628-A0101-12-0097-111
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 結構域
<223> 1702 LCDR3
<400> 13
Figure 108135628-A0101-12-0097-112
<210> 14
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 鏈
<223> 1702重鏈(IgG1)胺基酸序列
<400> 14
Figure 108135628-A0101-12-0098-113
Figure 108135628-A0101-12-0099-114
<210> 15
<211> 216
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 鏈
<223> 1702輕鏈胺基酸序列
<400> 15
Figure 108135628-A0101-12-0099-115
Figure 108135628-A0101-12-0100-116
<210> 16
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<221> 鏈
<223> 突變修飾後的1702DS輕鏈胺基酸序列
<400> 16
Figure 108135628-A0101-12-0100-117
Figure 108135628-A0101-12-0101-118
Figure 108135628-A0101-11-0002-3

Claims (28)

  1. 一種通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：
    Figure 108135628-A0101-13-0001-119
     其中：Y選自-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-、-O-CR1R2-(CRaRb)m-、-O-CR1R2-、-NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-或-S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基、烷氧基、羥基、胺基、氰基、硝基、羥烷基、環烷基或雜環基；或者，Ra和Rb與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；R1選自鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、環烷基烷基、烷氧基烷基、雜環基、芳基或雜芳基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；或者，Ra和R2與其相連的碳原子一起形成環烷基或雜環基；m為0至4的整數；n為1至10，n是小數或整數； L為接頭單元；Pc為抗B7H3抗體或其抗原結合片段。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含：分別如SEQ ID NO：8、9和10胺基酸序列所示的重鏈HCDR1、HCDR2、HCDR3，或與SEQ ID NO：8、9和10所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的HCDR變體；和分別如SEQ ID NO：11、12和13胺基酸序列所示的輕鏈LCDR1、LCDR2和LCDR3，或與SEQ ID NO：11、12和13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3分別具有3、2或1個胺基酸差異的LCDR變體。
  3. 如申請專利範圍第1或2項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該抗B7H3抗體或其抗原結合片段的輕鏈可變區上的輕鏈FR區來源於人種系輕鏈序列或其突變序列，和/或重鏈可變區上的重鏈FR區來源於人種系重鏈序列或其突變序列。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含選自如下所示的重鏈可變區和/或輕鏈可變區：其中所該重鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：6所示或與其具有至少95%序列同一性，該輕鏈可變區胺基酸序列如SEQ ID NO：7所示或與其具有至少95%序列同一性。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該抗B7H3抗體或其抗原結合片段包含抗體恆定區；該抗體恆定區的重鏈恆定區來源於人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或與其具有至少95%序列同一性，該抗體恆定區的輕鏈恆定區來源於人抗體κ、λ鏈或與其具有至少95%序列同一性；較佳地，該重鏈恆定區的胺基酸序列源於人IgG1或與其具有至少95%序列同一性。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該Pc為全長抗體，其中該全長抗體選自：由SEQ ID NO：14所示的重鏈序列和SEQ ID NO：15所示的輕鏈序列組成的h1702抗體，和由SEQ ID NO：14所示的重鏈序列和SEQ ID NO：16所示的輕鏈序列組成的h1702DS抗體。
  7. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中所述抗原結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和包含CDR的肽的抗原結合片段。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中n為2至8，較佳為5至9，n是小數或整數。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中：Y為-O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-；Ra和Rb相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、氘原子、鹵素或烷基；R1為鹵烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；m為0或1。
  10. 如申請專利範圍第1至9項中任一項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中Y選自：
    Figure 108135628-A0101-13-0004-120
  11. 如申請專利範圍第1至10項中任一項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中Y的O端與接頭單元L相連。
  12. 如申請專利範圍第1至11項中任一項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中接頭單員-L-為-L1-L2-L3-L4-，L1為
    Figure 108135628-A0101-13-0005-121
    ，s1為2至8的整數；L2為化學鍵；L3為四肽殘基；L4為-NR5(CR6R7)t-，R5、R6或R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基，t為1或2。
  13. 如申請專利範圍第1至12項中任一項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該接頭單元-L-，其L1端與Pc相連，L4端與Y相連。
  14. 如申請專利範圍第1至13項中任一項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該L3的四肽殘基為由兩個或多個選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、賴胺酸、胍胺酸、絲胺酸、谷胺酸、天冬胺酸中的胺基酸形成的胺基酸殘基；較佳為GGFG的四肽殘基。
  15. 如申請專利範圍第1至14項中任一項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中該-L-Y-為以下結構：
    Figure 108135628-A0101-13-0006-122
     L2為化學鍵；L3為GGFG的四肽殘基；R1為鹵烷基或C3-6環烷基；R2選自氫原子、鹵烷基或C3-6環烷基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成C3-6環烷基；R5、R6或R7相同或不同，且各自獨立地為氫原子或烷基；s1為2至8的整數；m為0至4的整數。
  16. 如申請專利範圍第1至15項中任一項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其中-L-Y-選自：
    Figure 108135628-A0101-13-0006-123
    Figure 108135628-A0101-13-0006-124
    Figure 108135628-A0101-13-0006-125
    Figure 108135628-A0101-13-0006-126
    Figure 108135628-A0101-13-0007-127
    Figure 108135628-A0101-13-0007-128
    Figure 108135628-A0101-13-0007-129
    Figure 108135628-A0101-13-0007-130
    Figure 108135628-A0101-13-0007-131
    Figure 108135628-A0101-13-0007-132
    Figure 108135628-A0101-13-0007-133
  17. 如申請專利範圍第1至11項中任一項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其為通式(Pc-La-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：
    Figure 108135628-A0101-13-0008-134
     其中：W選自C1-8烷基、C1-8烷基-環烷基或1至8個原子的直鏈雜烷基，該雜烷基包含1至3個選自N、O或S的雜原子，其中該C1-8烷基、環烷基和直鏈雜烷基各自獨立地視需要進一步被選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基的一個或多個取代基所取代；L2選自-NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-、-NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-、-S(CH2)p1C(O)-或化學鍵，p1為1至20的整數；L3為由2至7個胺基酸構成的肽殘基，胺基酸可以是取代的或非取代的，當被取代時，取代基可以在任何可使用的連接點上被取代，該取代基為一個或多個獨立地選自鹵素、羥基、氰基、胺基、烷基、氯代烷基、氘代烷基、烷氧基和環烷基；R1選自鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基；R2選自氫原子、鹵素、鹵烷基、氘代烷基、環烷基、雜環基、芳基或雜芳基；或者，R1和R2與其相連接的碳原子一起形成環烷基或雜環基；R4和R5相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基； R6和R7相同或不同，且各自獨立地選自氫原子、鹵素、烷基、鹵烷基、氘代烷基和羥烷基；m為0至4的整數；n為1至10，n是小數或整數；Pc為抗B7H3抗體或其抗原結合片段。
  18. 如申請專利範圍第17項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，其為通式(Pc-Lb-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物：
    Figure 108135628-A0101-13-0009-135
     其中：s1為2至8的整數；R1、R2、R5~R7、m和n如申請專利範圍第17項中所定義。
  19. 如申請專利範圍第1至18項中任一項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，該配體-藥物偶聯物選自：
    Figure 108135628-A0101-13-0009-136
    Figure 108135628-A0101-13-0010-137
    Figure 108135628-A0101-13-0010-138
    Figure 108135628-A0101-13-0010-139
    Figure 108135628-A0101-13-0010-140
    Figure 108135628-A0101-13-0010-141
    Figure 108135628-A0101-13-0011-142
    Figure 108135628-A0101-13-0011-143
    Figure 108135628-A0101-13-0011-144
    Figure 108135628-A0101-13-0011-145
    Figure 108135628-A0101-13-0011-146
     其中Pc和n如申請專利範圍第1項中所定義。
  20. 如申請專利範圍第1至19項中任一項所述的通式(Pc-L-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，該配體-藥物偶聯物選自：
    Figure 108135628-A0101-13-0012-148
    Figure 108135628-A0101-13-0012-149
    Figure 108135628-A0101-13-0012-150
    Figure 108135628-A0101-13-0012-151
    Figure 108135628-A0101-13-0013-152
    Figure 108135628-A0101-13-0013-153
    Figure 108135628-A0101-13-0013-154
     其中，n如申請專利範圍第1項所定義。
  21. 一種製備如通式(Pc-La-Y-Dr)所示的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物的方法，其包括以下步骤：
    Figure 108135628-A0101-13-0014-155
     Pc還原後，與通式(La-Y-Dr)偶聯反應，得到通式(Pc-La-Y-Dr)所示的化合物；其中：Pc為抗B7H3抗體或其抗原結合片段；W、L2、L3、R1、R2、R5~R7、m和n如申請專利範圍第17項中所定義。
  22. 如申請專利範圍第21項所述的方法，其中該通式La-Y-Dr為通式Lb-Y-Dr所示的化合物：
    Figure 108135628-A0101-13-0014-156
     或其互變異構體、內消旋體、外消旋體、對映異構體、非對映異構體、或其混合物形式，或其可藥用的鹽，其中 R1、R2、R5~R7、s1和m如申請專利範圍第18項中所定義。
  23. 如申請專利範圍第21或22項所述的方法，其中式(La-Y-Dr)所示的化合物或式(Lb-Y-Dr)所示的化合物選自：
    Figure 108135628-A0101-13-0015-157
    Figure 108135628-A0101-13-0016-158
    Figure 108135628-A0101-13-0016-159
  24. 一種組醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1至20藥物組合物中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物，以及一種或多種藥學上可接受的赋形劑、稀釋劑或載體。
  25. 一種申請專利範圍第1至20項中任一項所述的抗體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或如申請專利範圍第24項所述的醫藥組成物的用途，其用在製備用於治療B7H3介導的疾病或病症的藥物。
  26. 如申請專利範圍第25項所述的用途，其中該B7H3介導的疾病或病症為B7H3高表達癌症。
  27. 一種申請專利範圍第1至20項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或如申請專利範圍第24項所述的醫藥組成物的用途，其用在製備用於治療或預防腫瘤的藥物。
  28. 一種申請專利範圍第1至20項中任一項所述的配體-藥物偶聯物或其藥學上可接受的鹽或溶劑化物或如申請專利範圍第24項所述的組醫藥組成物的用途，其用在製備治療和/或預防癌症的藥物，其中該癌症較佳選自乳腺癌、卵巢癌、宮頸癌、肺癌、子宮癌、前列腺癌、腎癌、尿道癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、食道癌、黑色素瘤、 神經膠質瘤、神經母細胞瘤、肉瘤、咽頭癌、肺癌、結腸癌、直腸癌、結直腸癌、白血病、骨癌、皮膚癌、甲狀腺癌、胰腺癌和淋巴瘤。
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