CN103319600B - 一种人源抗TLR4抗体Fab及其制备方法与应用 - Google Patents
一种人源抗TLR4抗体Fab及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种人源抗TLR4抗体Fab及其制备方法及其应用，属于生物制药领域，涉及一种人源抗TLR4抗体Fab及其制备方法以及其在抑制TLR4介导的炎症反应中的用途。本发明从50例重症肝炎患者的全血中分离B淋巴细胞，扩增所有的抗体重、轻链可变区基因，采取基因工程方法，构建全人源Fab抗体库，用重组TLR4蛋白对噬菌体抗体库进行富集筛选分离抗TLR4的特异性人源Fab抗体，表达产物经ProteinL柱亲和纯化后，用于抗体的功能分析。体外试验结果表明，抗TLR4基因工程抗体Fab能够明显地阻断LPS诱导的人PBMC细胞对TNF-α的表达，抑制率达76.25%。
Description
技术领域
本发明属生物制药领域，涉及人源噬菌体抗体库及1株抗TLR4基因工程抗体Fab及其重链可变区基因、轻链可变区基因与其所编码的蛋白，以及所述蛋白及其衍生物在炎症反应中的作用。
背景技术
感染性休克也称败血症性休克或中毒性休克。是由病原微生物及其毒素在人体引起的一种微循环障碍状态，导致组织缺氧、代谢紊乱、细胞损害甚至多器官功能衰竭。其特点是病情重、进展快、死亡率高。感染性休克最重要的发病机制主要与感染的细菌及其内毒素引起的一系列炎症因子有关。脂多糖是细菌内毒素（endotoxin）的主要成分，是革兰氏阴性细菌胞壁的成分。内毒素有多种生物活性，进入人体血液可造成内毒素血症(ETM)，可引起多种病理生理过程变化如发热、休克、弥漫性血管内凝血和粒细胞减少等，甚至造成严重后果如呼吸窘迫综合症(ARDS)，急性肾衰竭(ARF)，甚至多器官功能衰竭(MOF)等多种疾病，最终可因内毒素休克死亡。重型肝病时，由于肝脏的解毒功能严重受损，存在严重的感染、内毒素血症，从而加重肝病的进程。
TLR4 是Toll 样受体家族的成员之一，也是一种模式识别受体（patternrecognition receptors, PRRs），能够识别微生物进化过程中的一些保守结构PAMP (pathogen-associatedmolecular pattern, PAMP)，如LPS，被认为是内毒素激活炎症反应的关键。TLR4 在体内和体外对LPS 效应起着主要感受器的作用，并调节细胞的促炎症因子表达和组织对损伤的炎症反应。近年来，对LPS 的信号转导与TLR4 的关系的研究取得了重大进展。TLR4属于Ⅰ型跨膜受体蛋白；胞外区由富含亮氨酸的重复序列LRR(leucine-rich repeats)组成，胞内区与IL-1 受体胞内区相似，称为TIR(Toll/IL-1 receptor)区。TLR4 广泛表达在各种淋巴细胞表面，其中既包括非特异免疫细胞如巨噬细胞、中型粒细胞和肥大细胞，又包括介导特异免疫反应的T 淋巴细胞和B 淋巴细胞，活化TLR4 将诱导产生一系列的炎症介质，从而产生强有力的炎症反应。LPS 在细胞外被识别后导致TLR4 受体寡聚化激活, 将LPS 刺激信号向细胞内转导, 通过MyD88 依赖和非MyD88 依赖的2 条途径触发一系列的信号激联反应, 诱导NF-κB、AP-1 和IRF-3等转录因子磷酸化和核转位，上调TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8 和IFN-γ 等细胞因子的表达, 最后启动炎症反应。TLR4 信号转导通路在这一过程中起着极其重要的作用，可能会成为治疗内毒素血症的重要靶点。
TLR4 是内毒素发挥生物学效应的瓶颈和内毒素瀑布效应的限速步骤。阻断TLR4 对内毒素信号的传导，是控制内毒素生物效应的最为有效的手段。目前虽然有对TLR4进行的相关研究，但是尚无开发出针对人源TLR4的抗体，从而不能有效控制内毒素的生物效应，因此对于TLR4介导的各种炎症反应，没有得到十分有效的抑制。
发明内容
解决的技术问题：本发明目的在于针对现有技术的不足提供一种抗TLR4的基因工程抗体Fab，及其轻链、Fd链CDR序列，轻链、Fd链可变区氨基酸序列，轻链、Fd链氨基酸序列，轻链、Fd链可变区核酸序列以及轻链、Fd链核酸序列，以及制备人源抗TLR4抗体Fab的方法，及其在抑制TLR4介导的炎症反应中的用途。
技术方案：
一种人源抗TLR4抗体Fab，轻链的互补决定区CDR具有以下的CDR氨基酸序列：
SEQ ID NO.1 所示的CDR1;
SEQ ID NO.2 所示的CDR2；
SEQ ID NO.3 所示的CDR3;
并且所述抗体的Fd链的互补决定区CDR具有以下的CDR氨基酸序列：
SEQ ID NO.4 所示的CDR4;
SEQ ID NO.5 所示的CDR5；
SEQ ID NO.6 所示的CDR6。
一种人源抗TLR4抗体Fab，其中抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7 所示，抗体Fd链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
所述的人源抗TLR4抗体Fab，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示，Fd链氨基酸序列为SEQ ID NO.10所示。
一种编码人源抗TLR4抗体Fab的DNA分子，其中轻链可变区核酸序列为SEQ ID NO.11所示，Fd链可变区核酸序列为SEQ ID NO.12所示。
所述的编码人源抗TLR4抗体Fab的DNA分子，轻链核酸序列为SEQ ID NO.13所示，Fd链核酸序列为SEQ ID NO.14所示。
一种人源抗TLR4抗体Fab的制备方法，包括以下步骤：
（1） 全人源Fab噬菌体抗体库的构建
本发明从50例重症肝炎患者的全血中分离的B淋巴细胞中，扩增所有抗体重链、轻链可变区基因，采取基因工程方法，构建了库容量为5.76×109的全人源Fab抗体库；
（2） 抗TLR4抗体Fab的筛选、表达及纯化
用重组的TLR4蛋白对噬菌体抗体库进行富集筛选，分离并筛选1株抗TLR4的特异性人源Fab抗体；
（3） 抗TLR4全人源Fab抗体的制备
将Fab的表达载体转化大肠杆菌E.coli.TOP10，挑选阳性工程菌，经IPTG诱导表达，细菌表达的Fab经Protein L柱亲和纯化后，用于抗体的功能分析；
（4） 抗TLR4全人源Fab抗体特性分析
Western blot结果显示，纯化蛋白的目的条带与预期大小一致，分别为Fab的Fd链和L链；ELISA分析结果显示，抗TLR4的Fab能够与TLR4蛋白结合，但不结合阴性对照蛋白BSA；
（5） 抗TLR4抗体Fab对LPS诱导TNF-α表达的影响。
上述所述的人源抗TLR4抗体Fab，其在抑制TLR4介导的炎症反应中的用途。
上述所述的人源抗TLR4抗体Fab在制备抑制TLR4介导的炎症反应药物中的应用。
一种抑制TLR4介导的炎症反应的药物，其有效成分为人源抗TLR4抗体Fab。
有益效果：
病原微生物及其内毒素的感染会使人产生很多的病灶，而TLR4是内毒素传导生物学效应的关键步骤，阻断TLR4 对内毒素信号的传导，是控制内毒素生物学效应的最为有效的手段。本发明通过基因工程的方法制备了一种人源抗TLR4抗体Fab，通过试验表明它能够有效的阻断LPS 诱导的人PBMC 细胞对TNF-α的表达，抑制率达76.25%，因而为治疗TLR4介导的内毒素炎症反应提供了可能，同时为其他相关疾病的基因工程研究提供了技术储备。
附图说明
图1是纯化的抗TLR4抗体Fab的SDS-PAGE（A）和Western blot（B）检测。
图2是抗TLR4抗体Fab效价的检测。
图3是抗TLR4 抗体对PBMC细胞表达TNF-α的影响。
具体实施方式
实施例1
全人源Fab噬菌体抗体库的构建：
（1）采集重症肝炎患者全血50份，分离其淋巴细胞，采用Invitrogen公司的Trizol抽提总RNA，采用oligo(dT)20作为引物，逆转录生成cDNA。
（2）利用人抗体可变区扩增引物进行PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。经Overlap PCR合成Fab基因，与经SfiI内切酶酶切的表达载体pComb3XSS连接，构建Fab的原核重组表达载体。
（3）电转化感受态大肠杆菌XL1-Blue，最终构建了容量为5.76×109的全人源Fab抗体库。
所述构建的Fab基因与pComb3xSS载体连接是指：将纯化定量后的Fab基因分别以SfiI内切酶进行双酶切消化；纯化、定量后与同样双酶切pComb3xSS 载体连接。
所述的转化是指：
1）0.2cm电转杯，25 μF，2.5 kV ，200Ω的电转条件转化感受态大肠杆菌XL1-Blue。
2）转化产物加入LB培养基后37℃振荡培养2 h，10倍梯度稀释将菌液涂布于SOBAG琼脂板上，30℃过夜培养。
3）次日计算平板上的克隆数，估算库容为5.76×109。
4）将电转化后的菌液加入辅助噬菌体 VCSM13超感染，离心沉淀菌体，用LB培养基重悬，37℃振荡过夜，离心沉淀菌体，吸取上清即为Fab噬菌体抗体库。
抗TLR4特异性抗体的筛选、表达及纯化：
1）用纯化的重组人TLR4蛋白包被固相筛选ELISA板，每孔2μg，洗涤，加封闭液，洗涤，加入噬菌体抗体库抗体，洗涤去除未结合的噬菌体抗体。
2）加入胰蛋白酶，洗脱特异性结合的噬菌体抗体，感染增值，辅助噬菌体VCSM13超感染。
3）重复以上筛选步骤，共进行五轮“吸附-洗脱-扩增”富集筛选。
4）将最后一轮筛选且增值得到的噬菌体稀释后铺于加入100μg/mL的氨苄青霉素培养板上培养过夜，挑取80个单菌落于细胞培养板中，振摇培养过夜。
5）过夜后从第一块板各孔中分别转移5μL菌液至第二块板，振摇培养。
6）加辅助噬菌体VCSM13超感染，振摇培养；离心，培养基重悬沉淀，振摇培养过夜。7）离心取上清进行ELISA检测，测定每孔450nm和650nm吸光值，按A450nm～A650nm
计算每孔吸光值。当P/N值(Positive/Negative)大于4时，该菌株为阳性单克隆噬菌体菌株。
8）将阳性克隆进行核酸序列分析，得到1种基因序列正确的Fab。
筛选得到的Fab的DNA序列如下：
其中轻链核酸序列为SEQ ID NO.13所示，轻链可变区核酸序列为SEQ ID NO.11所示；对应的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7 所示，轻链的互补决定区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.1 、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示。
Fd链核酸序列为SEQ ID NO.14所示，Fd链可变区核酸序列为SEQ ID NO.12所示；对应的Fd链氨基酸序列为SEQ ID NO.10所示，Fd链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，Fd链的互补决定区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6 所示。
人源抗TLR4抗体Fab的制备与特性分析：
将阳性克隆噬菌体感染E.coli.Top10F’，含有重组质粒pComb3x-Fab的菌株接种到1000mL的LB液体培养基中（其中含有100μg/mL的氨苄青霉素），37℃摇床培养至OD600nm至0.9，加入终浓度为1mmol-1的IPTG，37℃诱导4小时。培养上清以及细菌的超声上清经检测后进行纯化，具体步骤如下：
1）将Protein-L亲和层析柱安装至蛋白质纯化仪上，用10个柱床体积的结合缓冲液冲洗柱床。
2）用结合缓冲液平衡柱床后，上样品，流速为1mL/分钟。用结合缓冲液洗涤柱床至A280nm吸光度到基线，用5-10个柱床体积的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，用SDS-PAGE和Western-blot鉴定。
结果显示，在预期大小处出现目的条带，分别为Fab的Fd链和轻链（图1）。
具有抗原识别特异性的全人源抗TLR4抗体Fab的鉴定：
用重组人TLR4蛋白0.2μg/ mL 包被酶联板，4 ℃过夜，次日封闭液37 ℃封闭2 h 后洗板,加入梯度稀释的Fab抗体，37 ℃孵育1 h后洗板，加入1∶1000（体积比） 稀释HRP 标记的羊抗人Fab，37 ℃孵育1 h 后洗板，显色，酶标仪测A450吸光度值。ELISA检测分析表明，当Fab稀释滴度从100增加到6400倍时，A450 Corr值从1.498降低到0.338，（图2）。
抗TLR4抗体Fab对LPS诱导TNF-α表达的影响：
1）取正常人肝素抗凝血10 mL，与Hank's 液1∶1（体积比）混合后，加于等量淋巴细胞分离液液面上，1 500 r/min 离心15 min，收集环状乳白色淋巴细胞层，加Hank's 液5 mL，2 000 r/min、离心10 min 洗2 次，收集细胞沉淀，悬浮于2mL RPMI-1640中，细胞计数，调整细胞数至1×106 mL-1，于96 孔板接种，每孔100μL。
2）接种后于37℃，5%CO2条件下的培养箱中培养过夜。第二天更换培养液5 h后，加入含有不同抗体浓度的培养液进行处理，4 h 后LPS 500 μg/mL 刺激，10 min 后收取细胞培养上清，-20 ℃保存备用。
3）采用ELISA法测定细胞培养上清中细胞因子TNF-α的浓度。
检测结果显示，抗TLR4基因工程抗体Fab能够明显地阻断LPS 诱导的人PBMC 细胞对TNF-α的表达，计算抑制率=对照组-实验组/对照组，抗体的抑制率达76.25%（图3）。
序列表
<110> 南京军区军事医学研究所
<120> 一种人源抗TLR4抗体Fab及其制备方法和应用
<130> 2013
<160> 14
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 2
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gly Ala Ser
1
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Leu Thr
1 5
<210> 4
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Ala Ala Tyr Ser Ser Ser Ser Trp Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 7
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Glu Leu Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Tyr Ser Ser Ser Ser Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Pro
115
<210> 9
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Glu Leu Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala
100 105 110
Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser
115 120 125
Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu
130 135 140
Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser
145 150 155 160
Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu
165 170 175
Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val
180 185 190
Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Leu Pro Val Thr Lys
195 200 205
Gly Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 10
<211> 225
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Tyr Ser Ser Ser Ser Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Pro Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro
115 120 125
Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly
130 135 140
Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn
145 150 155 160
Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln
165 170 175
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser
180 185 190
Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser
195 200 205
Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr
210 215 220
Ser
225
<210> 11
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gagctcacac tcacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctct cactttcggc 300
ggagggacca aggtggagat caaa 324
<210> 12
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccgagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc ggcttatagc 300
agctcgtcct ggttcgaccc ctggggccag ggcaccctgg tcaccgtctc ccct 354
<210> 13
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gagctcacac tcacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60
ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcagctact tagcctggta ccagcagaaa 120
cctggccagg ctcccaggct cctcatctat ggtgcatcca gcagggccac tggcatccca 180
gacaggttca gtggcagtgg gtctgggaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag 240
cctgaagatt ttgcagtgta ttactgtcag cagtatggta gctcacctct cactttcggc 300
ggagggacca aggtggagat caaacgaact gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360
ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420
tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480
caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540
acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600
ggcctgagct tgcccgtcac aaagggcttc aacaggggag agtgt 645
<210> 14
<211> 675
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtcaagc ctgggaggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt agctatgcta tgcactgggt ccgccaggct 120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatcatatg atggaagtaa taaatactac 180
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccgagaa cacgctgtat 240
ctgcaaatga acagcctgag agctgaggac acggctgtgt attactgtgc ggcttatagc 300
agctcgtcct ggttcgaccc ctggggccag ggcaccctgg tcaccgtctc ccctgcctcc 360
accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 420
gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 480
tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 540
tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 600
tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 660
tgtgacaaaa ctagt 675
Claims (7)
1.一种人源抗TLR4抗体Fab，其特征在于，轻链的互补决定区CDR为以下的CDR氨基酸序列：
SEQ ID NO.1 所示的CDR1;
SEQ ID NO.2 所示的CDR2；
SEQ ID NO.3 所示的CDR3;
并且所述抗体的Fd链的互补决定区CDR为以下的CDR氨基酸序列：
SEQ ID NO.4 所示的CDR4;
SEQ ID NO.5 所示的CDR5；
SEQ ID NO.6 所示的CDR6。
2.一种人源抗TLR4抗体Fab，其特征在于，所述抗体轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.7 所示，抗体Fd链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
3.根据权利要求2所述的人源抗TLR4抗体Fab，其特征在于，轻链氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示，Fd链氨基酸序列为SEQ ID NO.10所示。
4.一种编码人源抗TLR4抗体Fab的DNA分子，其特征在于，轻链可变区核酸序列为SEQ ID NO.11所示，Fd链可变区核酸序列为SEQ ID NO.12所示。
5.根据权利要求4所述的编码人源抗TLR4抗体Fab的DNA分子，其特征在于，轻链核酸序列为SEQ ID NO.13所示，Fd链核酸序列为SEQ ID NO.14所示。
6.权利要求1-3中任意一条所述的人源抗TLR4抗体Fab在制备抑制LPS 诱导的人PBMC 细胞对TNF-α表达的药物中的应用。
7.一种抑制LPS 诱导的人PBMC 细胞对TNF-α表达的药物，其特征在于，有效成分为权利要求1-3任一项所述的人源抗TLR4抗体Fab。
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