CN107602699A - 一种高纯度雷珠单抗包涵体的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，公开了一种雷珠单抗的制备工艺。采用PET25b表达载体，利用T7启动子，将雷珠单抗轻重链分别表达成包涵体，再一起复性成Fab。本发明涉及一种高纯度雷珠单抗包涵体的制备方法，包括以下步骤：制备含有雷珠单抗基因的重组大肠杆菌；重组大肠杆菌进行发酵培养；发酵培养后得到的菌体进行超声破碎和离心得到包涵体；对包涵体进行洗涤；对洗涤后的包涵体进行变性与复性；对复性后蛋白再次纯化得到雷珠单抗蛋白。与现有技术相比，本发明通过对大肠杆菌生产雷珠单抗的培养条件进行优化，获得较疏松的雷珠单抗包涵体结构，提高了蛋白在高浓度下的复性效率，操作简单，节约了生产成本。这种通过优化培养条件、提高复性效率、简化纯化过程的方法，可适用于其它有类似包涵体结构特点蛋白的制备。

Description

一种高纯度雷珠单抗包涵体的制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及生物工程下游蛋白质的纯化过程，尤其是涉及一种高纯度雷珠单抗包涵体的制备方法。

背景技术

雷珠单抗（ranibizumab，亦译为兰尼单抗），又称 rhu-FabV2，商品名为诺适得（Lucentis），是第二代人源化抗血管内皮生长因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）蛋白，由可降低免疫原性的非结合性人源化片段以及鼠高亲和力抗原决定簇两部分组成。雷珠单抗于2006年6月被美国 FDA 批准用于治疗湿性老年性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）的治疗，2011年12月在中国获得上市许可。研究表明，VEGF-A通过激活血管生成和增加血管通透性引起新生血管（neovascularization，NV）生成，同时，VEGF-A还与年龄相关性黄斑变性患者脉络膜新生血管（choroidalneovascularization， CNV）)发展和糖尿病视网膜病变患者黄斑囊样水肿（cystoidmacular edema， CME）发生有关。雷珠单抗能与所有活性形式的 VEGF-A 结合，防止它们与VEGFＲ1及VEGFＲ2结合，从而减少血管内皮细胞增殖和降低血管通透性，抑制新生血管生成。因此，雷珠单抗临床上已经被用于治疗 AMD、息肉样脉络膜血管病变、脉络膜新生血管，以及各种原因引起的黄斑水肿。

雷珠单抗在玻璃体内的半衰期和最大血药浓度分别为2.8 d和162 ng/mL， 生物有效治疗浓度可以维持近1个月，并且血清浓度比眼内的浓度要低1000～2000倍。雷珠单抗上市至今，临床应用日益扩展，其疗效得到越来越多的临床实践证实和肯定。为了提高雷珠单抗在大肠杆菌中的表达，我们优化了一种雷珠单抗的制备工艺，获得较疏松的雷珠单抗包涵体结构，提高了蛋白在高浓度下的复性效率，操作简单，节约了生产成本。

发明内容

本发明的目的就是为了克服雷珠单抗包涵体复性过程收率低、纯化困难的缺点而提供一种高纯度雷珠单抗包涵体的制备方法。本发明分析了雷珠单抗包涵体的结构特点，本发明优化了包涵体的复性条件，复性方法能有效复性雷珠蛋白，得到高纯度的雷珠单抗蛋白，且步骤得到了简化，节约了生产成本，操作简单。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种高纯度雷珠单抗包涵体的制备方法，该方法包括以下步骤：为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：

雷珠单抗蛋白诱导表达方法，具体步骤如下：

（1）制备含有雷珠单抗基因的重组大肠杆菌；

（2）重组大肠杆菌进行发酵培养；

（3）发酵培养后得到的菌体进行超声破碎、离心得到包涵体；

（4）对包涵体进行洗涤；对洗涤后的包涵体进行变性与复性，得到雷珠单抗蛋白；

（5）复性后的包涵体进一步纯化，得到雷珠单抗蛋白。

进一步的，作为优选：

步骤 （1）所述的制备含有雷珠单抗基因的重组大肠杆菌时，表达质粒为 pET25b，表达宿主为 BL21（DE3），雷珠单抗的基因序列如SEQ NO.1所示；

步骤 （2）所述的重组大肠杆菌进行发酵培养的步骤如下 ：

将测序正确的pET25b-Rani BL21（DE3）菌种，用接种环LB平板划线（含100ug/ml的氨苄青霉素）；

正置放置两分钟之后倒置，37℃恒温培养过夜；

挑选线上的圆形单菌落，用移液枪挑取pET25b-Rani BL21菌落后，吹打入足量的LB液体培养基（含100ug/ml 氨苄青霉素），过夜培养；

向过夜培养的pET25b-Rani BL21菌液中加入ITPG诱导剂，使终浓度达到0.2-1mM，12h，29℃，180rpm诱导表达；

将诱导后的表达菌8000rpm离心10min，弃上清，-20℃保存备用；

步骤 （3）所述的超声破碎方法为：发酵培养后得到的菌体进行超声破碎得到包涵体：将菌体重悬于复性缓冲液（6M尿素，20mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 8.0），置于冰水中降温，进行超声破碎，超声功率设为350W，超声时间为30min（超声5s，暂停10s），将破碎溶液离心（10，000×g，30min，4℃）收获蛋白溶液；

步骤（4）所述的复性方法为 ：

① 透析袋预处理：剪大小合适的透析袋，置于400mL 0.05M NaHCO3和400mL 0.05MEDTA 的混合液（pH8.0）中煮沸20min，取出，浸入超纯水中置于磁力搅拌器上搅拌10min，最后置于20%乙醇中，4℃保存；

②透析复性过程：将包涵体收集到一起，装入透析袋中，放入不同浓度的透析复性Buffer中，透析复性，复性梯度为从6M尿素到0M尿素，每个浓度梯度4℃透析6小时或透析过夜；

步骤（4）所述的洗复性缓冲液浓度为 ：

① 6M尿素透析复性Buffer：6M尿素，20mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 8.0；

② 4M尿素透析复性Buffer：4M尿素，20 mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 8.0；

③ 2M尿素透析复性Buffer：2M尿素，20 mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 8.0

④ 1M尿素透析复性Buffer：1M尿素，20 mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 8.0；

⑤ 0.5M尿素透析复性Buffer：0.5M尿素，20mM Tris-HCl，0.1M NaCl，1mM GSH，0.2 mMGSSG，pH 8.0；

⑥ 0M尿素透析复性Buffer：20mM Tris-HCl，0.1M NaCl，1mM GSH，0.2mM GSSG，pH8.0。

附图说明

图1为本申请中雷珠单抗可溶性检测，SDS-PAGE检测。

图1中，泳道1为蛋白marker，泳道2为雷珠单抗复性后溶液样品，泳道3为雷珠单抗纯化洗脱杂质，泳道4为雷珠单抗纯化洗脱峰样品，泳道5为雷珠单抗纯化洗脱杂质。

图2为本申请中雷珠单抗western blot检测，使用山羊抗人Fab HRP二抗。

图2中，泳道1为蛋白marker，泳道2为雷珠单抗纯化洗脱峰样品。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1-2对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。实施例中未注明具体条件的，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商的，均为可以通过市售获得的常规产品。

1.1主要材料与试剂

大肠杆菌感受态细胞BL21购自天根生化科技有限公司；Protein Marker购自近岸蛋白质科技有限公司；其他化学试剂购自北京索莱宝公司；DNA片段合成和载体质粒构建委托生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2方法

1.2.1重组雷珠单抗的诱导表达

接种阳性单克隆菌落于LB培养基 （100μg/mL 氨苄青霉素），置于37℃摇床 200rmp 培养。当 OD600至0.6-0.8时，加入0.5mM诱导剂IPTG，29℃诱导12h。收获发酵液，经离心（8000rpm，10min）收集诱导表达的重组菌菌体，并用不含尿素的复性缓冲液（20mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 8.0）洗涤一次菌体；

1.2.2 重组雷珠单抗包涵体的获得、变性与复性

将菌体重悬于不含尿素的复性缓冲液 （20mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 8.0），置于冰中冷却，进行超声破碎，超声功率设为350W，超声时间为30min （超声 5 s，暂停10 s）。将破碎溶液离心（10，000×g，30min，4℃）收获包涵体。对收获后的包涵体用不含尿素的复性缓冲液及去离子水分别洗涤包涵体，每次搅拌洗涤2小时，10，000×g离心30min，收集沉淀。该方法能有效逐步去除杂蛋白，得到纯度较高的雷珠单抗包涵体，减少了纯化步骤，节约了生产成本，操作简单。洗涤后的包涵体溶解于复性缓冲液中（6M尿素，20mM Tris-HCl，0.1MNaCl，pH 8.0），搅拌过夜，10，000×g离心30min，取上清。采用透析复性方法，尿素浓度递减（6M-4M-2M-1M-0.5M-0M），pH稳定不变，在最后两个梯度的复性缓冲液中添加还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽质量比10∶1，最终得复性成功的雷珠单抗蛋白；

1.2.3复性雷珠蛋白精细纯化

将Capto L 5ml纯化柱安装至AKTA pure纯化系统上，先使用不含尿素的复性缓冲液（20 mM Tris-HCl，0.1M NaCl，pH 8.0）平衡柱子，流速2ml/min，平衡5CV；将复性后的雷珠单抗蛋白上样至纯化柱，流速2ml/min，待蛋白上样完成再次使用不含尿素的复性缓冲液平衡柱子，流速2ml/min，平衡5CV；使用0.1M甘氨酸溶液对柱子进行洗脱，流速2ml/min；收集各洗脱峰，使用1M NaOH溶液将各洗脱峰样品pH调整至中性，得到纯化后的雷珠单抗蛋白。

2结果与分析

按材料与方法所述进行重组蛋白诱导表达复性及纯化过程，SDS-PAGE及Western Blot检测结果表明，雷珠单抗复性及纯化效果良好，且具有生物活性，如（图1、2）。

以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明，不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明创造所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明创造的保护范围。

序列表

<110> 山东华铂凯盛生物科技有限公司

<120> 一种高纯度雷珠单抗包涵体的制备方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1560

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgaaaaaga atatcgcatt tcttcttgca tctatgttcg ttttttctat tgctacaaac 60

gcgtacgctg atatccagct gacccaaagc ccgtcttccc tgtcggcgag tgtgggcgat 120

cgtgttacga ttacctgcag cgcctctcag gatatttcca actatctgaa ttggtaccaa 180

cagaaaccgg gcaaggcgcc taaagtgctt atttatttta ccagctctct gcattccggc 240

gtgccctcgc gcttcagcgg cagtggttca gggaccgatt tcacgttaac tattagctct 300

ctgcagccgg aagattttgc gacctattac tgccagcaat acagcacggt cccgtggaca 360

tttggccagg gtactaaagt ggaaattaag cgaactgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc 420

ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct ggaactgctt ctgttgtgtg cctgctgaat 480

aacttctatc ccagagaggc caaagtacag tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt 540

aactcccagg agagtgtcac agagcaggac agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc 600

accctgacgc tgagcaaagc agactacgag aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc 660

catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag agcttcaaca ggggagagtg ttaagctgat 720

cctctacgcc ggacgcatcg tggccctagt acgcaactag tcgtaaaaag ggtatctaga 780

ggttgaggtg attttatgaa aaagaatatc gcatttcttc ttgcatctat gttcgttttt 840

tctattgcta caaacgcgta cgctgaagtg cagctggttg agagcggcgg tgggctcgtg 900

caaccgggcg gttcgctgcg tttaagttgc gcggcaagcg gctatgactt tacgcactac 960

ggtatgaatt gggtgcgcca ggccccgggc aaaggtctgg aatgggtggg ttggattaac 1020

acctatacgg gcgagccgac ttacgcggct gattttaaac gccgttttac cttcagcctg 1080

gatacatcga aaagtacggc gtatctgcag atgaattctc tgcgcgccga agacaccgca 1140

gtgtattact gcgcgaaata tccgtattac tatggcacct cccattggta cttcgatgtc 1200

tggggtcagg gcaccctggt gacggttagc tcggcctcca ccaagggccc atcggtcttc 1260

cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 1320

aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 1380

gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 1440

accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 1500

agcaacacca aggtcgacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacctctaa 1560

Claims (7)

1.一种高纯度雷珠单抗包涵体的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

(1) 制备含有雷珠单抗基因的重组大肠杆菌；

(2) 重组大肠杆菌进行发酵培养；

(3) 发酵培养后得到的菌体进行超声破碎、离心得到包涵体；

(4) 对包涵体进行洗涤，对洗涤后的包涵体进行变性与复性；

(5) 对复性后的包涵体进一步纯化，得到雷珠单抗蛋白。

2.根据权利要求 1 所述的高纯度雷珠单抗包涵体的制备方法，其特征在于，步骤 (1)所述的制备含有雷珠单抗基因的重组大肠杆菌时，表达质粒为 pET25b，表达宿主为 BL21(DE3)，雷珠单抗的基因序列如SEQ NO.1所示。

3.根据权利要求 1 所述的高纯度雷珠单抗包涵体的制备方法，其特征在于，步骤 (1)所述的制备含有雷珠单抗基因的重组大肠杆菌的步骤如下 ：编码雷珠单抗的cDNA的序列如SEQ NO.1所示，进行合成并拼接到pET25b质粒的Hind III和EcoR I克隆位点上，制备重组质粒pET25b-Rani。

4.根据权利要求 1 所述的高纯度雷珠单抗包涵体的制备方法，其特征在于，步骤 (2)所述的重组大肠杆菌进行发酵培养的步骤如下：

① 将测序正确的pET25b-Rani BL21（DE3）菌种，用接种环LB平板划线（含100ug/ml 氨苄青霉素）；

② 正置放置两分钟之后倒置37℃恒温过夜培养；

③ 挑选线上的圆形单菌落，用移液枪挑取pET25b-Rani BL21菌落后，吹打入足量的LB液体培养基（含100ug/ml 氨苄青霉素），过夜培养；

④ 向过夜培养的pET25b-Rani BL21菌液中加入ITPG诱导剂，使终浓度达到0.2-1 mM，12h，29℃，180rpm诱导表达；

⑤ 将诱导后的表达菌8000rpm离心10min，弃上清，-20℃保存备用。

5.根据权利要求 1 所述的高纯度雷珠单抗包涵体的制备方法，其特征在于，步骤 (3)所述的超声破碎方法为：将菌体重悬于透析复性缓冲液，置于冰上进行超声破碎，将破碎溶液离心收获包涵体。

6.根据权利要求 1 所述的高纯度雷珠单抗包涵体的制备方法，其特征在于，步骤 (4)所述的复性方法为：

① 透析袋预处理：剪大小合适的透析袋，置于400mL 0.05M NaHCO₃和400 mL 0.05MEDTA的混合液（pH8.0）中煮沸20min，取出，浸入超纯水中置于磁力搅拌器上搅拌10min，最后置于20%乙醇中，4℃保存；

② 透析复性过程：将包涵体收集到一起，装入透析袋中，放入不同浓度的透析复性Buffer中，透析复性，复性梯度为从6M尿素到0M尿素；每个浓度梯度4℃透析6小时或透析过夜。

7.根据权利要求 1 所述的高纯度雷珠单抗包涵体的制备方法，其特征在于，步骤 (5)所述的纯化方法为：

① 复性蛋白纯化：使用不含尿素的蛋白复性buffer平衡5ml Capto L纯化柱，待紫外吸收线稳定后使复性后的雷珠单抗蛋白溶液经过纯化柱纯化，流速2ml/min，当雷珠单抗蛋白纯化完成后再次使用不含尿素的蛋白复性buffer平衡纯化柱；

② 复性蛋白的洗脱：使用0.1M 甘氨酸溶液对吸附了雷珠单抗的纯化柱进行洗脱，收集各洗脱峰，加入1M NaOH溶液调节pH至中性，得到纯化后的雷珠单抗蛋白。