JP6932393B2 - ブタのfc断片を含む組み換えベクターおよび該ベクターを用いた組み換え蛋白質の製造方法 - Google Patents
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Description
目的タンパク質の発現量を増加させると同時に、溶解性を改善して、分離精製効率を高めた組み換えタンパク質を製造するための組み換えベクターを製造するために、ブタの免疫グロブリンFc断片(pFc)のpFc1(配列番号1)、pFc2(配列番号3)、またはpFc3(配列番号5)を用いて組み換えベクターを製作した。より詳しくは、図1および図2に示されたように、pCAMBIA1300ベクターのCaMV35Sプロモーター遺伝子とNOSターミネータとの間にM17の5′UTR部位遺伝子(配列番号7)、BiP(chaperone binding protein)タンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号8)、口蹄疫ウイルス(Foot−and−mouth disease virus;FMDV)のVP1遺伝子(配列番号9);pFc断片をコードするポリヌクレオチド;およびHDEL(His−Asp−Glu−Leu)タンパク質をコードするポリヌクレオチドを順にクローニングして組み換えベクターを製作した。pFc断片は、それぞれ、pFc1、pFc2、またはpFc3を挿入して、互いに異なる組み換えベクターを製造した。
(2.1:pFc融合VP1組み換えタンパク質の発現量の確認実験)
実施例1と同じ方法で製造されたpFc融合VP1組み換えタンパク質発現ベクターのタンパク質の発現量を確認するために、前記ベクターをシロイヌナズナの葉から分離した原形質体(プロトプラスト)にPEG−媒介形質転換法で導入して形質転換体を製造した後に、培養された原形質体を収集および溶解して、これから発現する組み換えタンパク質であるBiP:FMDV−VP1:pFc発現様相を、pFcを認識するanti−pig secondary antibody(1:5,000,Abcam)を用いてウェスタンブロッティングで確認した。より詳しくは、細胞溶解液30μLをSDS試料バッファーと混合した後に加熱した。そして、10%SDS−PAGEゲルに電気泳動して、サイズ別にタンパク質を分離し、分離したタンパク質をPVDF膜に移動させた後に、5%スキムミルクを用いてブロッキング段階を経た後に、抗体とタンパク質を結合させ、ECL溶液を製造社で提供する方法によって処理して、pFc融合組み換えタンパク質を確認した。その結果は、図3に示した。
実施例1と同じ方法で製造されたpFc融合組み換えタンパク質発現ベクターのタンパク質安定性を確認するために、組み換えタンパク質を抽出した当時試料(0)と4℃で1時間の間保管した後の試料(1)をそれぞれ実施例2.1と同じ方法でウェスタンブロッティングを実施して確認した。その結果は、図4に示した。
実施例1と同じ方法で製造されたpFc2融合組み換えタンパク質発現ベクターのタンパク質溶解性を確認するために、前記ベクターで形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)をタバコ植物(Nicotiana benthamiana)の葉に接種する一過性発現(transient expression)方式でpFc2融合組み換えタンパク質(BiP:FMDV−VP1:pFc2)を発現させた後に、植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後に、溶液に含まれている可溶性(soluble)形態(S)のタンパク質とペレット(pellet;P)部分にあるタンパク質を用いて実施例2.1と同じ方法でウェスタンブロッティングを実施した。対照群としては、既存に知られているセルロース結合モジュール(cellulose binding module;CBM3)をコードするポリヌクレオチド(配列番号13)をpFc断片の代わりに融合させた組み換えタンパク質を用いた。その結果は、図5に示した。
pFc2断片を豚繁殖・呼吸障害症候群(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome;PRRS)のGP5抗原タンパク質と融合させるために、ブタGP5抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号11)を実施例1の組み換えベクター内に含まれている口蹄疫ウイルスのVP1遺伝子の代わりに挿入して、GP5:pFc2組み換え抗原を発現する組み換えベクターを製造した。そして、前記ベクターで形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスをタバコ植物(Nicotiana benthamiana)の葉に接種する一過性発現方式でpFc2融合GP5組み換え抗原(GP5:pFc2)を発現させた後に、植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後に、溶液に含まれている可溶性形態(S)のタンパク質とペレット(P)部分にあるタンパク質を用いて、実施例2.1と同じ方法でウェスタンブロッティングを実施した。対照群としては、pFc断片の代わりにCBM3(配列番号14)が融合したGP5組み換え抗原を用い、CBM3融合GP5組み換え抗原の場合には、ウェスタンブロッティングのためにHA抗体を用いて実験を進めた。その結果は、図6に示した。
pFc2断片をブタサーコウイルス2型(Porcine circovirus Type 2;PCV2)タンパク質と融合させるために、ブタサーコウイルス2型タンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号15)を実施例1の組み換えベクター内に含まれている口蹄疫ウイルスのVP1遺伝子の代わりに挿入して、PCV2:pFc2組み換えタンパク質を発現する組み換えベクターを製造した。そして、前記ベクターで形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスをタバコ植物(Nicotiana benthamiana)の葉に接種する一過性発現方式でpFc2融合PCV2組み換えタンパク質を発現させた後に、植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後に、溶液に含まれている可溶性形態(S)のタンパク質とペレット(P)部分にあるタンパク質を用いて実施例2.1と同じ方法でウェスタンブロッティングを実施した。対照群としては、pFc断片の代わりにHisタグが融合したPCV2組み換えタンパク質を用い、Hisタグ融合PCV2組み換えタンパク質の場合には、ウェスタンブロッティングのために抗His抗体を用いて実験を進めた。その結果は、図7に示した。
pFc2断片を抗原タンパク質に融合して使用可能であるかを確認するために、ブタコレラ抗原であるE2タンパク質をコードするポリヌクレオチド(配列番号17)を実施例1の組み換えベクター内に含まれている口蹄疫ウイルスのVP1遺伝子の代わりに挿入して、BiP:E2:pFc2組み換えタンパク質を発現する組み換えベクターを製造した。そして、製造された組み換えベクターをアグロバクテリウム−媒介形質転換方法でシロイヌナズナに形質転換させ、カナマイシンに対する耐性を有するシロイヌナズナを選別し、世代促進を通じてpFc2が融合したE2組み換えタンパク質の発現が安定したホモ種子を最終確保して、形質転換植物体を製造した。そして、タンパク質の抽出に普遍的に使用されるタンパク質抽出バッファーを用いて最終確保された形質転換植物体8gからタンパク質を分離し、protein A−sepharose columnを装着したAKTA prime(GE Healthcare)を用いてpFc融合E2組み換えタンパク質を分離した。そして、対照群としては、pFc断片の代わりに、セルロース結合ドメイン(配列番号19)を融合させたBiP:E2:CBD組み換えタンパク質を使用した。CBDが融合したE2組み換えタンパク質は、アモルファスセルロース(amorphous cellulose;AMC)を使用して形質転換植物体5gから分離した。そして、分離した組み換えタンパク質は、リン酸緩衝溶液(phosphate buffered saline;PBS)を用いて透析後に遠心フィルターチューブを使用して濃縮した。そして、分離した組み換えタンパク質の量を定量するために、SDS−PAGEを実施した後に、クマシブルーで染色した。この際、ウシ血清アルブミンを用いた標準曲線を用いて組み換えタンパク質を定量した。その結果は、図8に示した。
Claims (10)
- 配列番号4からなるブタのFc断片をコードするポリヌクレオチドおよび目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記目的タンパク質が、前記Fc断片と融合した融合タンパク質として発現される、植物体での発現用組み換えベクター。
- 前記組み換えベクターが、プロモーター遺伝子、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびFc断片をコードするポリヌクレオチドが順次に連結されていることを特徴とする、請求項1に記載の組み換えベクター。
- 前記プロモーターが、カリフラワーモザイクウイルス(cauliflower mosaic virus)由来35Sプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス(cauliflower mosaic virus)由来19S RNAプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、CMV(Cytomegalovirus)プロモーター、SV40(Simian virus 40)プロモーター、RSV(Respiratory syncytial virus)プロモーター、pEMUプロモーター、MASプロモーター、ヒストンプロモーター、ClpプロモーターおよびEF−1α(Elongation factor−1 alpha)プロモーターよりなる群から選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項2に記載の組み換えベクター。
- 前記組み換えベクターが、BiP(Chaperone binding protein)をコードするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組み換えベクター。
- 前記組み換えベクターが、HDEL(His−Asp−Glu−Leu)ペプチドをコードする遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組み換えベクター。
- 前記組み換えベクターが、M17の5′UTR(untranslational region)部位遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組み換えベクター。
- 前記組み換えベクターが、Fc断片が融合した目的タンパク質の発現量を増加させ、溶解性を増加させることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組み換えベクター。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の組み換えベクターで形質転換された、形質転換植物体。
- (a)請求項8に記載の形質転換植物体を培養する段階と、
(b)前記形質転換植物体または培養液からFc断片が融合した目的タンパク質を分離および精製する段階とを含む、組み換えタンパク質の生産方法。 - 配列番号4からなるブタのFc断片の植物体での発現のための組み換えタンパク質タグのための使用。
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