JP6932393B2

JP6932393B2 - ブタのｆｃ断片を含む組み換えベクターおよび該ベクターを用いた組み換え蛋白質の製造方法

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Publication number: JP6932393B2
Application number: JP2019521760A
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Inventors: イ、ヨンチク
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Filing date: 2018-12-06
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Description

本発明は、ブタのＦＣ断片を含む組み換えベクターおよび該ベクターを用いた組み換え蛋白質の製造方法等に関する。

バイオ医薬品（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）とは、生体内に存在する物質を医薬品として使用することを示し、より広い意味としては、先端バイオ技術である遺伝子組み換え、細胞融合、細胞培養など生物工学技術を基盤として生産された医薬品と定義することができる。このようなバイオ医薬品は、タンパク質医薬品、治療用抗体、ワクチン、遺伝子治療剤、細胞治療剤等に分類される。このうち、タンパク質医薬品、治療用抗体等は、一般的に酵母、バクテリア、動物細胞、昆虫細胞等の宿主を用いて生産されており、最近には、このような医薬品の利用度が増加している傾向にある。したがって、効率的な生産のためには、組み換えタンパク質の生産量を増加させると同時に、分離が容易であり、組み換えタンパク質の安定性を増加させることができる方法の開発が持続的に要求されているのが現況である。

一方、分子生物学と遺伝工学技術の目覚ましい発達は、植物分野にも適用されて、植物体から有用生理活性物質を生産しようとする努力が絶え間なく継続されている。植物から有用物質を生産することは、生産コストを顕著に減少させることができ、従来、一般的方法（動物細胞または微生物でタンパク質を合成して分離精製する方法）で発生しうる様々な汚染源（ウイルス、癌遺伝子、腸毒素等）を根本的に排除することができると共に、商品化の段階でも動物細胞や微生物とは異なって種子としてシードストック（ｓｅｅｄｓｔｏｃｋ）管理が可能であるという点から有利な点を有している（韓国特許登録１０−１７３２６２４号公報）。

したがって、植物体でも使用可能であり、組み換えタンパク質の生産量を顕著に増加させることができると共に、組み換えタンパク質の溶解性および安定性を増加させて、分離および保管が容易な組み換えタンパク質の生産システムがあれば、多様な分野において必要とする組み換えタンパク質の高効率生産が可能なものと期待される。

本発明は、前記のような従来技術上の問題点を解決するためになされたものであって、その目的は、ブタのＦｃ断片を含む組み換えベクターおよび該ベクターを用いた組み換えタンパク質の製造方法等を提供することにある。

しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に明確に理解され得る。

本発明は、配列番号４で表されるブタのＦｃ断片をコードするポリヌクレオチドおよび目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターを提供する。

本発明の一具体例において、前記組み換えベクターは、プロモーター遺伝子、Ｆｃ断片をコードするポリヌクレオチド、および目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの順に、またはプロモーター遺伝子、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＦｃ断片をコードするポリヌクレオチドの順に順次に連結され得る。

本発明の他の具体例において、前記プロモーターは、カリフラワーモザイクウイルス由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス由来１９ＳＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎｖｉｒｕｓ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＥＦ−１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ−１ａｌｐｈａ）プロモーター、ｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストンプロモーター、Ｃｌｐプロモーター等であるが、既存に知られているプロモーターの種類であれば、これらに制限されない。

本発明のさらに他の具体例において、前記目的タンパク質は、抗原、抗体、抗体の断片、構造タンパク質、調節タンパク質、転写因子、毒素タンパク質、ホルモン、ホルモン類似体、サイトカイン、酵素、酵素の断片、酵素阻害剤、輸送タンパク質、受容体、受容体の断片、生体防御誘導物質、貯蔵タンパク質、移動タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）、エックスプロイティブタンパク質（ｅｘｐｌｏｉｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎ）、レポータータンパク質等であってもよいが、本発明の組み換えベクターにより製造され得るタンパク質であれば、これらに制限されない。

本発明のさらに他の具体例において、前記組み換えベクターは、ＢｉＰ（シャペロン結合タンパク質）をコードするポリヌクレオチド、ＨＤＥＬ（Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）ペプチドをコードする遺伝子、Ｍ１７の５′ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｒｅｇｉｏｎ、非翻訳領域）部位遺伝子等をさらに含むことができる。

本発明のさらに他の具体例において、前記組み換えベクターは、タグであるＦｃ断片が融合した目的タンパク質の発現量を増加させ、溶解性を増加させることを特徴とする。前記融合は、Ｆｃ断片のＮ末端および／またはＣ末端に目的タンパク質がペプチド結合で連結された形態であってもよいが、Ｆｃ断片と目的タンパク質が結合している形態であれば、これに制限されない。

また、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された形質転換体を提供する。

本発明の一具体例において、前記形質転換体は、大腸菌、バシルス、サルモネラ、酵母等のような微生物、昆虫細胞、ヒトを含む動物細胞、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ウマ、ウシ等のような動物、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、植物等であってもよく、前記植物は、イネ、コムギ、ムギ、トウモロコシ、マメ、ジャガイモ、アズキ、エンバク、およびモロコシを含む食糧作物類；シロイヌナズナ、ハクサイ、ダイコン、トウガラシ、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、マクワウリ、カボチャ、ネギ、タマネギ、およびニンジンを含む野菜作物類；高麗人参、タバコ、ワタ、ゴマ、サトウキビ、テンサイ、エゴマ、ピーナッツ、およびアブラナを含む特用作物類；およびリンゴの木、ナシの木、ナツメの木、モモ、ブドウ、ミカン、カキ、スモモ、アンズ、およびバナナを含む果樹類；およびバラ、カーネーション、キク、ユリ、およびチューリップを含む草花類等であってもよいが、本発明の組み換えベクターで形質転換され得る生命体であれば、これに制限されない。

また、本発明は、（ａ）前記形質転換体を培養する段階と、（ｂ）前記形質転換体または培養液からＦｃ断片が融合した目的タンパク質を分離および精製する段階とを含む組み換えタンパク質の生産方法を提供する。前記形質転換体は、好ましくは細胞自体、または細胞を含む培養物であってもよく、前記培養液は、好ましくは細胞を培養した後、細胞を除去した培養液であってもよいが、本発明の組み換えタンパク質を含んでいる場合、これに制限されない。

また、本発明は、配列番号４で表されるブタのＦｃ断片を有効成分として含む目的タンパク質のタグ用組成物を提供する。

また、本発明は、配列番号４で表されるブタのＦｃ断片の組み換えタンパク質タグ用途を提供する。

また、本発明は、配列番号４で表されるブタのＦｃ断片を組み換えタンパク質に結合させる段階を含むブタのＦｃ断片を組み換えタンパク質に結合させる方法を提供する。

本発明の一具体例において、前記方法は、組み換えタンパク質の安定性を増加させることを特徴とする。

本発明によるブタのＦｃ断片を含む組み換えベクターは、多様な目的タンパク質にｐＦｃ断片を融合させることによって、目的タンパク質の生産量を増加させると同時に、溶解性および安定性を増加させて、組み換えタンパク質の分離および保管を容易にするので、多様な活性を有する目的タンパク質に幅広く適用して、多様な分野の組み換えタンパク質の高効率生産を可能にするものと期待される。

本発明の一実施例によるｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターマップを示す図である。本発明の一実施例によるｐＦｃ融合ＶＰ１組み換えタンパク質発現のための遺伝子の配列を示す図である。本発明の一実施例によるｐＦｃ融合ＶＰ１組み換えタンパク質の発現量をウェスタンブロッティングで確認した結果を示す図である。本発明の一実施例によるｐＦｃ融合ＶＰ１組み換えタンパク質の安定性をウェスタンブロッティングで確認した結果を示す図である。本発明の一実施例によるｐＦｃ融合ＶＰ１組み換えタンパク質の溶解性をウェスタンブロッティングで確認した結果を示す図である。本発明の一実施例によるｐＦｃ融合ＧＰ５組み換え抗原の溶解性をウェスタンブロッティングで確認した結果を示す図である。本発明の一実施例によるｐＦｃ融合ＰＣＶ２組み換えタンパク質の溶解性および生産性をウェスタンブロッティングで確認した結果を示す図である。本発明の一実施例によるｐＦｃ融合Ｅ２組み換え抗原の生産量を確認した結果を示す図である。

本発明では、多様な生理活性タンパク質、抗原、ペプチド等にブタの免疫グロブリンＦｃ断片を結合させる場合、前記断片によりタンパク質の発現量および生産性が増加すると共に、溶解性および安定性が増加することを確認し、前記ブタのＦｃ断片をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターおよび前記組み換えベクターを用いた組み換えタンパク質の生産方法を提供することを目的とする。

本明細書において、「Ｆｃ断片」とは、免疫グロブリンがパパインにより消化されたとき、重鎖（ｈｅａｖｙｃｈａｉｎ；Ｈｃｈａｉｎ）部分だけがＳ−Ｓ結合で連結され、抗原結合部位を有しない部分をＦｃ断片と言い、本発明のＦｃ断片は、好ましくはブタのＦｃ断片であり、より好ましくは配列番号４で表されるブタのＦｃ断片であるが、目的タンパク質と融合したとき、目的タンパク質の発現量および溶解性を増加させるＦｃ断片であれば、これに制限されない。また、本発明のＦｃ断片は、配列番号４の変異体が本発明の範囲に含まれる。具体的に、前記遺伝子は、配列番号３の塩基配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性のパーセンテージ」は、最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域でポリヌクレオチド配列の一部は、さらに、配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に対して追加または削除（すなわち、ギャップ）を含むことができる。

本明細書において、「目的タンパク質」とは、本発明による遺伝工学的方法で生産しようとするタンパク質を言うものであり、好ましくは商業的用途に用いられている大量で生産される必要があるタンパク質であり、より好ましくは抗原、抗体、抗体の断片、構造タンパク質、調節タンパク質、転写因子、毒素タンパク質、ホルモン、ホルモン類似体、サイトカイン、酵素、酵素の断片、酵素阻害剤、輸送タンパク質、受容体、受容体の断片、生体防御誘導物質、貯蔵タンパク質、移動タンパク質（ｍｏｖｅｍｅｎｔｐｒｏｔｅｉｎ）、エックスプロイティブタンパク質（ｅｘｐｌｏｉｔｉｖｅｐｒｏｔｅｉｎ）、レポータータンパク質等であるが、本発明の組み換えベクターで製造され得るタンパク質であれば、これに制限されない。

本明細書において、「組み換えベクター」とは、ベクター内に挿入された異種の核酸によりコードされるペプチドまたはタンパク質を発現できるベクターを示すものであり、好ましくはブタのＦｃ断片が融合した目的タンパク質を発現できるように製造されたベクターを意味する。前記「ベクター」は、試験管内、生体外または生体内で宿主細胞に塩基の導入および／または転移のための任意の媒介物を言い、他のＤＮＡ断片が結合して結合された断片の複製をもたらすことができる複製単位（レプリコン）であってもよく、「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自家ユニットとして機能する、すなわち、自らの調節により複製可能な、任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス等）を言う。本発明の組み換えベクターは、好ましくはＲＮＡ重合酵素が結合する転写開始因子であるプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列と転写および解読の終結を調節する配列、ターミネータ等を含むことができ、より好ましくはタンパク質の合成量を増加させるためのＭ１７の５′ＵＴＲ部位遺伝子、目的タンパク質を小胞体に移動させるためのＢｉＰ遺伝子、タンパク質が小胞体内で安定的に維持され得るようにタンパク質の分解を最小化するためのＨＤＥＬ遺伝子等をさらに含むことができ、より好ましくはタグであるＦｃ断片以外に組み換えタンパク質を容易に分離するための追加タグ用遺伝子、形質転換体を選別するための抗生剤耐性遺伝子等の選別用マーカー遺伝子等をさらに含むことができる。

前記タグ用遺伝子は、本発明のタグタンパク質であるＦｃ断片以外にさらに容易な分離のために含まれるものであって、代表的にＡｖｉタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、Ｅタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、ＩｇＧ−Ｆｃタグ、ＣＴＢタグ、Ｓｏｆｔａｇ１タグ、Ｓｏｆｔａｇ３タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ等が含まれ得、前記選別用マーカー遺伝子には、代表的にグリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）またはホスフィノスリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）のような除草剤抵抗性遺伝子、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコールのような抗生剤耐性遺伝子、ａａｄＡ遺伝子等が含まれ得、前記プロモーターには、代表的にｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストンプロモーター、Ｃｌｐプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス由来１９ＳＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎｖｉｒｕｓ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＥＦ−１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ−１ａｌｐｈａ）プロモーター等が含まれ得、前記ターミネータは、代表的にノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、イネアミラーゼＲＡｍｙ１Ａターミネータ、パセオリンターミネータ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトパイン（Ｏｃｔｏｐｉｎｅ）遺伝子のターミネータ、大腸菌のｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネータ等であるが、前記例は、例示に過ぎず、既存に知られている組み換えベクターに使用されている遺伝子であれば、制限がない。

本明細書において、「融合タンパク質」とは、ブタのＦｃ断片と目的タンパク質が融合した組み換えタンパク質を意味するものであり、好ましくは前記Ｆｃ断片と融合することによって溶解性が増加した組み換えタンパク質を意味するが、本発明のブタのＦｃ断片と結合した組み換えタンパク質であれば、これに制限されない。

本明細書において、「形質転換」とは、注入されたＤＮＡにより生物の遺伝的な性質が変わることを総称し、「形質転換体」とは、分子遺伝学的方法で外部の遺伝子を注入して製造された生命体であって、好ましくは本発明の組み換えベクターにより形質転換された生命体であり、前記生命体は、微生物、真核細胞、昆虫、動物、植物等生命がある生物であれば、制限がなく、好ましくは大腸菌、サルモネラ、バシルス、酵母、動物細胞、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ウマ、ウシ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、植物等であるが、これらに制限されない。前記形質転換体は、形質転換、トランスフェクション、アグロバクテリウム−媒介形質転換方法、パーティクルガン衝撃法（ｐａｒｔｉｃｌｅｇｕｎｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、超音波処理法（ソニケーション）、電気穿孔法（エレクトロポレーション）およびＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｇｌｙｃｏｌ）−媒介形質転換方法等の方法で製造され得るが、本発明のベクターを注入できる方法であれば、制限がない。

本明細書において、「溶解性」とは、目的タンパク質またはペプチドが人体に投与するのに適した溶媒に溶解することができる程度を意味する。具体的には、特定の温度で所定の溶媒に対して溶質が飽和した程度を示すものであってもよい。溶解性は、溶質の飽和濃度を決定することによって測定することができ、例えば溶媒に溶質を過量に添加し、これを撹拌し、濾過した後、濃度をＵＶ分光器またはＨＰＬＣ等を使用して測定することができるが、これに制限されるものではなく、高い溶解性は、組み換えタンパク質の分離精製に有利であり、組み換えタンパク質の凝集が抑制されて、組み換えタンパク質の生理活性または薬理的な活性を維持するのに長所を有する。

以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるわけではない。

（実施例１：ｐＦｃ融合ＶＰ１組み換えタンパク質発現ベクターの製造）
目的タンパク質の発現量を増加させると同時に、溶解性を改善して、分離精製効率を高めた組み換えタンパク質を製造するための組み換えベクターを製造するために、ブタの免疫グロブリンＦｃ断片（ｐＦｃ）のｐＦｃ１（配列番号１）、ｐＦｃ２（配列番号３）、またはｐＦｃ３（配列番号５）を用いて組み換えベクターを製作した。より詳しくは、図１および図２に示されたように、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターのＣａＭＶ３５Ｓプロモーター遺伝子とＮＯＳターミネータとの間にＭ１７の５′ＵＴＲ部位遺伝子（配列番号７）、ＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号８）、口蹄疫ウイルス（Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ；ＦＭＤＶ）のＶＰ１遺伝子（配列番号９）；ｐＦｃ断片をコードするポリヌクレオチド；およびＨＤＥＬ（Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを順にクローニングして組み換えベクターを製作した。ｐＦｃ断片は、それぞれ、ｐＦｃ１、ｐＦｃ２、またはｐＦｃ３を挿入して、互いに異なる組み換えベクターを製造した。

［実施例２：ｐＦｃ融合ＶＰ１組み換えタンパク質発現実験］
（２．１：ｐＦｃ融合ＶＰ１組み換えタンパク質の発現量の確認実験）
実施例１と同じ方法で製造されたｐＦｃ融合ＶＰ１組み換えタンパク質発現ベクターのタンパク質の発現量を確認するために、前記ベクターをシロイヌナズナの葉から分離した原形質体（プロトプラスト）にＰＥＧ−媒介形質転換法で導入して形質転換体を製造した後に、培養された原形質体を収集および溶解して、これから発現する組み換えタンパク質であるＢｉＰ：ＦＭＤＶ−ＶＰ１：ｐＦｃ発現様相を、ｐＦｃを認識するａｎｔｉ−ｐｉｇｓｅｃｏｎｄａｒｙａｎｔｉｂｏｄｙ（１：５，０００，Ａｂｃａｍ）を用いてウェスタンブロッティングで確認した。より詳しくは、細胞溶解液３０μＬをＳＤＳ試料バッファーと混合した後に加熱した。そして、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動して、サイズ別にタンパク質を分離し、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に移動させた後に、５％スキムミルクを用いてブロッキング段階を経た後に、抗体とタンパク質を結合させ、ＥＣＬ溶液を製造社で提供する方法によって処理して、ｐＦｃ融合組み換えタンパク質を確認した。その結果は、図３に示した。

図３に示されたように、多様なｐＦｃ断片のうちｐＦｃ２断片を結合させた組み換えタンパク質の発現量が最も高いことを確認した。前記結果を通じて、同じ免疫グロブリン断片であるとしても、同じ効果を示さないことを確認することができた。

（２．２：ｐＦｃ融合ＶＰ１組み換えタンパク質の安定性の確認実験）
実施例１と同じ方法で製造されたｐＦｃ融合組み換えタンパク質発現ベクターのタンパク質安定性を確認するために、組み換えタンパク質を抽出した当時試料（０）と４℃で１時間の間保管した後の試料（１）をそれぞれ実施例２．１と同じ方法でウェスタンブロッティングを実施して確認した。その結果は、図４に示した。

図４に示されたように、ｐＦｃ２断片が結合した組み換えタンパク質の発現量が最も高く、安定性も高いことを確認した。

（２．３：ｐＦｃ２融合ＶＰ１組み換えタンパク質の溶解性の確認実験）
実施例１と同じ方法で製造されたｐＦｃ２融合組み換えタンパク質発現ベクターのタンパク質溶解性を確認するために、前記ベクターで形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）をタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に接種する一過性発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）方式でｐＦｃ２融合組み換えタンパク質（ＢｉＰ：ＦＭＤＶ−ＶＰ１：ｐＦｃ２）を発現させた後に、植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後に、溶液に含まれている可溶性（ｓｏｌｕｂｌｅ）形態（Ｓ）のタンパク質とペレット（ｐｅｌｌｅｔ；Ｐ）部分にあるタンパク質を用いて実施例２．１と同じ方法でウェスタンブロッティングを実施した。対照群としては、既存に知られているセルロース結合モジュール（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅｂｉｎｄｉｎｇｍｏｄｕｌｅ；ＣＢＭ３）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１３）をｐＦｃ断片の代わりに融合させた組み換えタンパク質を用いた。その結果は、図５に示した。

図５に示されたように、ｐＦｃ２融合組み換えタンパク質は、ペレット部分では観察されないのに対し、溶液内に含まれていることを確認した。しかしながら、セルロース結合モジュールを融合させた組み換えタンパク質の場合には、ペレット部分で組み換えタンパク質が相当数観察された。前記結果を通じて、ｐＦｃ２融合組み換えタンパク質は、目的タンパク質とｐＦｃ２断片の結合による構造的変形を通じて溶解性が増加したことを確認することができた。これにより、ｐＦｃ２融合組み換えタンパク質は、分離精製に有利であり、組み換えタンパク質の凝集が抑制されて、組み換えタンパク質の生理活性または薬理的な活性を維持するのに効果的であることを確認することができた。

［実施例３：ｐＦｃ２融合ＧＰ５組み換え抗原溶解性の確認実験］
ｐＦｃ２断片を豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰｏｒｃｉｎｅＲｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅａｎｄＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＳｙｎｄｒｏｍｅ；ＰＲＲＳ）のＧＰ５抗原タンパク質と融合させるために、ブタＧＰ５抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１１）を実施例１の組み換えベクター内に含まれている口蹄疫ウイルスのＶＰ１遺伝子の代わりに挿入して、ＧＰ５：ｐＦｃ２組み換え抗原を発現する組み換えベクターを製造した。そして、前記ベクターで形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスをタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に接種する一過性発現方式でｐＦｃ２融合ＧＰ５組み換え抗原（ＧＰ５：ｐＦｃ２）を発現させた後に、植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後に、溶液に含まれている可溶性形態（Ｓ）のタンパク質とペレット（Ｐ）部分にあるタンパク質を用いて、実施例２．１と同じ方法でウェスタンブロッティングを実施した。対照群としては、ｐＦｃ断片の代わりにＣＢＭ３（配列番号１４）が融合したＧＰ５組み換え抗原を用い、ＣＢＭ３融合ＧＰ５組み換え抗原の場合には、ウェスタンブロッティングのためにＨＡ抗体を用いて実験を進めた。その結果は、図６に示した。

図６に示されたように、ｐＦｃ２融合ＧＰ５組み換え抗原は、ペレット部分では若干のタンパク質が観察されるのに対し、ほとんどが溶液内に含まれていることを確認した。しかしながら、ＣＢＭ３を融合させたＧＰ５組み換え抗原の場合には、ペレット部分で組み換えタンパク質が相当数観察された。前記結果を通じて、ｐＦｃ２融合組み換えタンパク質は、タンパク質の種類に関係なく、溶解性が増加することを確認することができた。

前記結果を通じて、ブタの免疫グロブリンＦｃ断片、特に、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むｐＦｃ２断片を目的タンパク質に融合させることによって、目的タンパク質の発現量を増加させると同時に、溶解性を増加させて、目的タンパク質を安定的に容易に分離および保管できることを確認することができた。

［実施例４：ｐＦｃ２融合ＰＣＶ２組み換えタンパク質の生産性および溶解性の確認実験］
ｐＦｃ２断片をブタサーコウイルス２型（ＰｏｒｃｉｎｅｃｉｒｃｏｖｉｒｕｓＴｙｐｅ２；ＰＣＶ２）タンパク質と融合させるために、ブタサーコウイルス２型タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１５）を実施例１の組み換えベクター内に含まれている口蹄疫ウイルスのＶＰ１遺伝子の代わりに挿入して、ＰＣＶ２：ｐＦｃ２組み換えタンパク質を発現する組み換えベクターを製造した。そして、前記ベクターで形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスをタバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）の葉に接種する一過性発現方式でｐＦｃ２融合ＰＣＶ２組み換えタンパク質を発現させた後に、植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後に、溶液に含まれている可溶性形態（Ｓ）のタンパク質とペレット（Ｐ）部分にあるタンパク質を用いて実施例２．１と同じ方法でウェスタンブロッティングを実施した。対照群としては、ｐＦｃ断片の代わりにＨｉｓタグが融合したＰＣＶ２組み換えタンパク質を用い、Ｈｉｓタグ融合ＰＣＶ２組み換えタンパク質の場合には、ウェスタンブロッティングのために抗Ｈｉｓ抗体を用いて実験を進めた。その結果は、図７に示した。

図７に示されたように、ｐＦｃ２融合ＰＣＶ２組み換えタンパク質の場合には、ほとんどが溶液内に含まれていると共に、Ｈｉｓタグが融合したＰＣＶ２組み換えタンパク質と比較して生産量が顕著に増加したことを確認した。

［実施例５：ｐＦｃ２融合Ｅ２組み換えタンパク質発現実験］
ｐＦｃ２断片を抗原タンパク質に融合して使用可能であるかを確認するために、ブタコレラ抗原であるＥ２タンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１７）を実施例１の組み換えベクター内に含まれている口蹄疫ウイルスのＶＰ１遺伝子の代わりに挿入して、ＢｉＰ：Ｅ２：ｐＦｃ２組み換えタンパク質を発現する組み換えベクターを製造した。そして、製造された組み換えベクターをアグロバクテリウム−媒介形質転換方法でシロイヌナズナに形質転換させ、カナマイシンに対する耐性を有するシロイヌナズナを選別し、世代促進を通じてｐＦｃ２が融合したＥ２組み換えタンパク質の発現が安定したホモ種子を最終確保して、形質転換植物体を製造した。そして、タンパク質の抽出に普遍的に使用されるタンパク質抽出バッファーを用いて最終確保された形質転換植物体８ｇからタンパク質を分離し、ｐｒｏｔｅｉｎＡ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅｃｏｌｕｍｎを装着したＡＫＴＡｐｒｉｍｅ（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてｐＦｃ融合Ｅ２組み換えタンパク質を分離した。そして、対照群としては、ｐＦｃ断片の代わりに、セルロース結合ドメイン（配列番号１９）を融合させたＢｉＰ：Ｅ２：ＣＢＤ組み換えタンパク質を使用した。ＣＢＤが融合したＥ２組み換えタンパク質は、アモルファスセルロース（ａｍｏｒｐｈｏｕｓｃｅｌｌｕｌｏｓｅ；ＡＭＣ）を使用して形質転換植物体５ｇから分離した。そして、分離した組み換えタンパク質は、リン酸緩衝溶液（ｐｈｏｓｐｈａｔｅｂｕｆｆｅｒｅｄｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）を用いて透析後に遠心フィルターチューブを使用して濃縮した。そして、分離した組み換えタンパク質の量を定量するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施した後に、クマシブルーで染色した。この際、ウシ血清アルブミンを用いた標準曲線を用いて組み換えタンパク質を定量した。その結果は、図８に示した。

図８に示されたように、セルロース結合ドメインが融合したＥ２組み換え抗原の場合には、植物体１ｇ当たり約３０μｇが生産されるのに対し、ｐＦｃ２断片が融合したＥ２組み換え抗原の場合には、植物体１ｇ当たり３０２μｇが生産されることを確認した。前記結果を通じて、ｐＦｃ２断片を用いて目的抗原の発現量を１０倍以上増加させることができることを確認した。

前記結果を通じて、本発明のｐＦｃ２断片をタグとして使用して多様な目的タンパク質と融合させることによって、目的タンパク質の生産量を顕著に増加させることができると共に、溶解性および安定性を増加させて、目的タンパク質の凝集が抑制されて、組み換えタンパク質の効率的生産に大きく役に立つことを確認することができた。

前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解すべきである。

本発明は、ブタのＦｃ断片を含む組み換えベクターに関し、本発明の組み換えベクターを用いてブタのＦｃ断片を多様な目的タンパク質と融合させることによって、植物体を含む多様な宿主を用いて多様なタンパク質を発現させることができると共に、本発明のＦｃ断片がタグで結合することによって目的タンパク質の生産量および安定性が顕著に増加するので、商業化した多様な目的タンパク質の製造に幅広く用いられるものと期待される。

Claims

配列番号４からなるブタのＦｃ断片をコードするポリヌクレオチドおよび目的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記目的タンパク質が、前記Ｆｃ断片と融合した融合タンパク質として発現される、植物体での発現用組み換えベクター。
前記組み換えベクターが、プロモーター遺伝子、目的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびＦｃ断片をコードするポリヌクレオチドが順次に連結されていることを特徴とする、請求項１に記載の組み換えベクター。
前記プロモーターが、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒｍｏｓａｉｃｖｉｒｕｓ）由来１９ＳＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎｖｉｒｕｓ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ）プロモーター、ｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストンプロモーター、ＣｌｐプロモーターおよびＥＦ−１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ−１ａｌｐｈａ）プロモーターよりなる群から選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項２に記載の組み換えベクター。
前記組み換えベクターが、ＢｉＰ（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組み換えベクター。
前記組み換えベクターが、ＨＤＥＬ（Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）ペプチドをコードする遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組み換えベクター。
前記組み換えベクターが、Ｍ１７の５′ＵＴＲ（ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｒｅｇｉｏｎ）部位遺伝子をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組み換えベクター。
前記組み換えベクターが、Ｆｃ断片が融合した目的タンパク質の発現量を増加させ、溶解性を増加させることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組み換えベクター。
請求項１〜７のいずれか一項に記載の組み換えベクターで形質転換された、形質転換植物体。
（ａ）請求項８に記載の形質転換植物体を培養する段階と、
（ｂ）前記形質転換植物体または培養液からＦｃ断片が融合した目的タンパク質を分離および精製する段階とを含む、組み換えタンパク質の生産方法。
配列番号４からなるブタのＦｃ断片の植物体での発現のための組み換えタンパク質タグのための使用。