KR20200033036A

KR20200033036A - 돼지의 Fc 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 이용한 재조합 단백질의 제조 방법

Info

Publication number: KR20200033036A
Application number: KR1020180112442A
Authority: KR
Inventors: 이용직
Original assignee: 주식회사 바이오앱
Priority date: 2018-09-19
Filing date: 2018-09-19
Publication date: 2020-03-27
Also published as: JP6932393B2; JP2021502051A; CN111556898B; CN111556898A; WO2020059960A1; KR102148405B1

Abstract

본 발명은 돼지의 Fc 단편을 포함하는 재조합 벡터에 관한 것으로, 본 발명의 재조합 벡터를 이용하여 돼지의 Fc 단편을 다양한 목적 단백질과 융합시킴으로써, 식물체를 포함하는 다양한 숙주를 이용하여 목적 단백질을 발현시킬 수 있을 뿐만 아니라, 목적 단백질의 생산량 및 안정성을 증가시킬 수 있다.

Description

돼지의 Fc 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 이용한 재조합 단백질의 제조 방법{Recombinant vector comprising porcine Fc fragment and preparation method of recombinant proteins using thereof}

본 발명은 돼지의 Fc 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 이용한 재조합 단백질의 제조 방법 등에 관한 것이다.

바이오의약품(biopharmaceutical)이란 생체 내에 존재하는 물질을 의약품으로 사용하는 것을 지칭하며, 보다 넓은 의미로는 첨단 바이오 기술인 유전자 재조합, 세포 융합, 세포 배양 등 생물공학기술을 기반으로 하여 생산된 의약품으로 정의할 수 있다. 이러한 바이오의약품은 단백질 의약품, 치료용 항체, 백신, 유전자 치료제, 세포 치료제 등으로 분류된다. 이 중 단백질 의약품, 치료용 항체 등은 일반적으로 효모, 박테리아, 동물 세포, 곤충 세포 등의 숙주를 이용하여 생산되고 있으며, 최근에는 이러한 의약품들의 이용도가 증가되고 있는 추세이다. 따라서, 효율적인 생산을 위해서는 재조합 단백질의 생산량을 증가시키는 동시에 분리가 용이하며, 재조합 단백질의 안정성은 증가시킬 수 있는 방법의 개발이 지속적으로 요구되고 있는 실정이다.

한편, 분자생물학과 유전공학 기술의 눈부신 발달은 식물 분야에도 적용되어 식물체로부터 유용 생리활성 물질을 생산하려는 노력들이 꾸준히 이어지고 있다. 식물에서 유용 물질을 생산하는 것은 생산 단가를 현저히 감소시킬 수 있으며, 종래 대중적 방법(동물세포 또는 미생물에서 단백질을 합성하여 분리 정제하는 방법)에서 발생할 수 있는 여러 가지 오염원(바이러스, 암유전자, 장독소 등)을 원천 배제할 수 있을 뿐만 아니라, 상품화 단계에서도 동물 세포나 미생물과는 달리 종자로 종묘(seed stock) 관리가 가능하다는 점에서 유리한 이점을 가지고 있다.

따라서, 식물체에서도 사용 가능하며, 재조합 단백질의 생산량을 현저히 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라, 재조합 단백질의 용해성 및 안정성을 증가시켜 분리 및 보관이 용이한 재조합 단백질의 생산 시스템이 있다면, 다양한 분야에서 필요로 하는 재조합 단백질의 고효율 생산이 가능할 것으로 기대된다.

국내등록특허 10-1732624

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 돼지의 Fc 단편을 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터를 이용한 재조합 단백질의 제조 방법 등을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 서열번호 4로 표시되는 돼지의 Fc 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 프로모터 유전자, Fc 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 순서로, 또는 프로모터 유전자, 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 Fc 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 순서로 순차적으로 연결될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에 있어서, 상기 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터 등이나, 기존에 알려져 있는 프로모터의 종류라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 목적 단백질은 항원, 항체, 항체의 단편, 구조 단백질, 조절 단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 효소, 효소의 단편, 효소 저해제, 수송 단백질, 수용체(receptor), 수용체의 단편, 생체방어 유도물질, 저장 단백질, 이동 단백질(movement protein), 익스플로이티브 단백질(exploitive protein), 리포터 단백질 등일 수 있으나, 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 제조될 수 있는 단백질이라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 BiP(Chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 유전자, M17의 5' UTR(untranslational region) 부위 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체예에서, 상기 재조합 발현 벡터는 태그(tag)인 Fc 단편이 융합된 목적 단백질의 발현량을 증가시키며 용해성을 증가시키는 것을 특징으로 한다. 상기 융합은 Fc 단편의 N 말단 및/또는 C 말단에 목적 단백질이 펩타이드 결합으로 연결된 형태일 수 있으나, Fc 단편과 목적 단백질이 결합되어 있는 형태라면 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균, 바실러스, 살모넬라, 효모 등과 같은 미생물, 곤충 세포, 인간을 포함한 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소 등과 같은 동물, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등일 수 있으며, 상기 식물은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리, 및 수수를 포함하는 식량작물류; 애기장대, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파, 및 당근을 포함하는 채소작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무, 들깨, 땅콩, 및 유채를 포함하는 특용작물류; 및 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구, 및 바나나를 포함하는 과수류; 및 장미, 카네이션, 국화, 백합, 및 튤립을 포함하는 화훼류 등일 수 있으나, 본 발명의 재조합 발현 벡터로 형질전환될 수 있는 생명체라면 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 (a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 형질전환체 또는 배양액으로부터 Fc 단편이 융합된 목적 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는 재조합 단백질의 생산 방법을 제공한다. 상기 형질전환체는 바람직하게는 세포 자체, 또는 세포를 포함하는 배양물일 수 있으며, 상기 배양액은 바람직하게는 세포를 배양한 후, 세포를 제거한 배양액일 수 있으나, 본 발명의 재조합 단백질을 포함하고 있다면 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 4로 표시되는 돼지의 Fc 단편을 유효성분으로 포함하는 목적 단백질의 태그용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 돼지의 Fc 단편을 포함하는 재조합 벡터는 다양한 목적 단백질에 pFc 단편을 융합시킴으로써, 목적 단백질의 생산량을 증가시키는 동시에 용해성 및 안정성을 증가시켜 재조합 단백질의 분리 및 보관을 용이하게 하기 때문에 다양한 활성을 가지는 목적 단백질에 폭넓게 적용하여 다양한 분야의 재조합 단백질의 고효율 생산을 가능하게 할 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 pCAMBIA1300 벡터맵을 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 pFc 융합 VP1 재조합 단백질 발현을 위한 유전자의 배열을 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 pFc 융합 VP1 재조합 단백질의 발현량을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 pFc 융합 VP1 재조합 단백질의 안정성을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 pFc 융합 VP1 재조합 단백질의 용해성을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 pFc 융합 GP5 재조합 항원의 용해성을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 pFc 융합 PCV2 재조합 단백질의 용해성 및 생산성을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 pFc 융합 E2 재조합 항원의 생산량을 확인한 결과를 나타낸 도면이다.

본 발명에서는 다양한 생리활성 단백질, 항원, 펩타이드 등에 돼지의 면역글로불린 Fc 단편을 결합시키는 경우, 상기 단편에 의하여 단백질의 발현량 및 생산성이 증가될 뿐만 아니라, 용해성 및 안정성이 증가된다는 것을 확인하고, 상기 돼지의 Fc 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 재조합 벡터를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 명세서에 있어서, "Fc 단편(Fc fragment)"이란 면역글로불린이 파파인(papain)에 의해 소화되었을 때, 중쇄(heavy chain; H chain) 부분만이 S-S 결합으로 연결되고, 항원 결합부위를 가지지 않는 부분을 Fc 단편이라고 하며, 본 발명의 Fc 단편은 바람직하게는 돼지의 Fc 단편이며, 더욱 바람직하게는 서열번호 4로 표시되는 돼지의 Fc 단편이나, 목적 단백질과 융합되었을 때, 목적 단백질의 발현량 및 용해성을 증가시키는 Fc 단편이라면 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 Fc 단편은 서열번호 4의 변이체가 본 발명의 범위에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 4의 염기서열과 90 % 이상, 더욱 바람직하게는 95 % 이상, 가장 바람직하게는 98 % 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 “서열 상동성의 %”는 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 더 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 명세서에 있어서, “목적 단백질(target protein)”이란 본 발명에 따른 유전공학적 방법으로 생산하고자 하는 단백질을 말하는 것으로, 바람직하게는 상업적 용도로 이용되고 있는 대량으로 생산될 필요가 있는 단백질들이며, 더욱 바람직하게는 항원, 항체, 항체의 단편, 구조 단백질, 조절 단백질, 전사인자, 독소 단백질, 호르몬, 호르몬 유사체, 사이토카인, 효소, 효소의 단편, 효소 저해제, 수송 단백질, 수용체(receptor), 수용체의 단편, 생체방어 유도물질, 저장 단백질, 이동 단백질(movement protein), 익스플로이티브 단백질(exploitive protein), 리포터 단백질 등이나, 본 발명의 재조합 발현 벡터로 제조될 수 있는 단백질이라면 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “재조합 벡터(recombinant vector)”란 벡터 내에 삽입된 이종의 핵산에 의해 코딩되는 펩타이드 또는 단백질을 발현할 수 있는 벡터를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 돼지의 Fc 단편이 융합된 목적 단백질을 발현할 수 있도록 제조된 벡터를 의미한다. 상기 "벡터"는 시험관 내, 생체 왜 또는 생체 내에서 숙주 세포로 염기의 도입 및/또는 전이를 위한 임의의 매개물을 말하며, 다른 DNA 단편이 결합하여 결합된 단편의 복제를 가져올 수 있는 복제단위(replicon)일 수 있으며, "복제 단위"란 생체 내에서 DNA 복제의 자가 유닛으로서 기능하는, 즉, 스스로의 조절에 의해 복제가능한, 임의의 유전적 단위(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스 등)를 말한다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 바람직하게는 RNA 중합효소가 결합하는 전사 개시 인자인 프로모터(promoter), 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열과 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열, 터미네이터 등을 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 단백질의 합성량을 증가시키기 위한 M17의 5' UTR 부위 유전자, 목적 단백질을 소포체로 이동시키기 위한 BiP 유전자, 단백질이 소포체 내에서 안정적으로 유지될 수 있도록 단백질의 분해를 최소화하기 위한 HDEL 유전자 등을 추가로 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 태그인 Fc 단편 이외에 재조합 단백질을 용이하게 분리하기 위한 추가 태그용 유전자, 형질전환체를 선별하기 위한 항생제 내성 유전자 등의 선별용 마커 유전자 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 태그용 유전자는 본 발명의 태그 단백질인 Fc 단편 이외에 추가로 용이한 분리를 위해 포함되는 것으로서, 대표적으로 Avi 태그, Calmodulin 태그, polyglutamate 태그, E 태그, FLAG 태그, HA 태그, His 태그, Myc 태그, S 태그, SBP 태그, IgG-Fc 태그, CTB 태그, Softag 1 태그, Softag 3 태그, Strep 태그, TC 태그, V5 태그, VSV 태그, Xpress 태그 등이 포함될 수 있으며, 상기 선별용 마커 유전자에는 대표적으로 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페닐콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 포함될 수 있으며, 상기 프로모터에는 대표적으로 pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래한 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터 등이 포함될 수 있으며, 상기 터미네이터는 대표적으로 노팔린 신타아제(NOS), 벼 아밀 라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린 터미네이터, 아그로박테리움 투마파시엔스의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터, 대장균의 rrnB1/B2 터미네이터 등이나, 상기 예는 예시일 뿐 기존에 알려져 있는 재조합 벡터에 사용되고 있는 유전자라면 제한이 없다.

본 명세서에 있어서, “융합 단백질(fusion protein)”이란 돼지의 Fc 단편과 목적 단백질이 융합된 재조합 단백질을 의미하는 것으로, 바람직하게는 상기 Fc 단편과 융합됨으로써 용해성이 증가된 재조합 단백질을 의미하나, 본 발명의 돼지의 Fc 단편과 결합된 재조합 단백질이라면 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에 있어서, “형질전환(transformation)”이란 주입된 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 총칭하며, “형질전환체(transgenic organism)”란 분자유전학적 방법으로 외부의 유전자를 주입하여 제조된 생명체로서, 바람직하게는 본 발명의 재조합 발현 벡터에 의하여 형질전환된 생명체이며, 상기 생명체는 미생물, 진핵세포, 곤충, 동물, 식물 등 생명이 있는 생물이라면 제한이 없으며, 바람직하게는 대장균, 살모넬라, 바실러스, 효모, 동물 세포, 마우스, 래트, 개, 원숭이, 돼지, 말, 소, 아그로박테리움 튜머패시언스, 식물 등이나 이에 제한되지 않는다. 상기 형질전환체는 형질전환(transformation), 형질감염(transfection), 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개 형질전환 방법, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 초음파 처리법(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylen glycol)-매개 형질전환 방법 등의 방법으로 제조될 수 있으나, 본 발명의 벡터를 주입할 수 있는 방법이라면 제한이 없다.

본 명세서에 있어서, “용해성(solubility)"이란 목적 단백질 또는 펩타이드가 인체에 투여하기 적합한 용매에 용해될 수 있는 정도를 의미한다. 구체적으로는 특정 온도에서 주어진 용매에 대하여 용질이 포화된 정도를 나타내는 것일 수 있다. 용해성은 용질의 포화 농도를 결정함으로써 측정할 수 있으며, 예컨대 용매에 용질을 과량으로 첨가하고 이를 교반하고 여과한 다음, 농도를 UV 분광기 또는 HPLC 등을 사용하여 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 높은 용해성은 재조합 단백질의 분리정제에 유리하며, 재조합 단백질의 응집이 억제되어 재조합 단백질의 생리활성 또는 약리적인 활성을 유지하는데 장점을 가진다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1: pFc 융합 VP1 재조합 단백질 발현 벡터 제조

목적 단백질의 발현량을 증가시키는 동시에 용해성을 개선하여 분리 정제 효율을 높인 재조합 단백질을 제조하기 위한 발현 벡터를 제조하기 위하여, 돼지의 면역글로불린 Fc 단편(porcine Fc fragment; pFc)의 pFc1(서열번호 1), pFc2(서열번호 3), 또는 pFc3(서열번호 5)을 이용하여 발현 벡터를 제작하였다. 보다 자세하게는, 도 1 및 2에 나타난 바와 같이, pCAMBIA1300 벡터의 CaMV 35S 프로모터 유전자와 NOS 종결자(terminator) 사이에 M17의 5' UTR(untranslational region) 부위 유전자(서열번호 7), BiP(chaperone binding protein) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 8), 구제역 바이러스(Food-and-mouth disease virus; FMDV)의 VP1 유전자(서열번호 9); pFc 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 순서대로 클로닝하여 발현 벡터를 제작하였다. pFc 단편은 각각 pFc1, pFc2, 또는 pFc3을 삽입하여 서로 다른 발현 벡터를 제조하였다.

실시예 2: pFc 융합 VP1 재조합 단백질 발현 실험

2.1. pFc 융합 VP1 재조합 단백질의 발현량 확인 실험

실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 pFc 융합 VP1 재조합 단백질 발현 벡터의 단백질 발현량을 확인하기 위하여, 상기 벡터를 애기장대 잎에서 분리한 원형질체(protoplast)에 PEG-매개 형질전환(PEG-mediated transformation) 방법으로 도입하여 형질전환체를 제조한 후에, 배양된 원형질체를 수집 및 용해하여 이로부터 발현되는 재조합 단백질인 BiP:FMDV-VP1:pFc 발현 양상을 pFc를 인식하는 anti-pig secondary antibody(1:5,000, Abcam)를 이용하여 웨스턴 블롯팅으로 확인하였다. 보다 자세하게는, 세포 용해액 30 μL를 SDS 시료 버퍼와 혼합한 후에 가열하였다. 그리고 10 % SDS-PAGE 겔에 전기영동하여 크기별로 단백질을 분리하고, 분리된 단백질을 PVDF 막으로 이동시킨 후에, 5 % 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 블록킹 단계를 거친 후에, 항체와 단백질을 결합시키고, ECL 용액을 제조사에서 제공하는 방법대로 처리하여 pFc 융합 재조합 단백질을 확인하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타난 바와 같이, 다양한 pFc 단편들 중 pFc2 단편을 결합시킨 재조합 단백질의 발현량이 가장 높은 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 동일한 면역글로불린 단편이라고 하여, 동일한 효과를 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다.

2.2. pFc 융합 VP1 재조합 단백질의 안정성 확인 실험

실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 pFc 융합 재조합 단백질 발현 벡터의 단백질 안정성을 확인하기 위하여, 재조합 단백질을 추출한 당시 시료(0)와 4 ℃에서 한시간 동안 보관한 후의 시료(1)를 각각 실시예 2.1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 실시하여 확인하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, pFc2 단편이 결합된 재조합 단백질의 발현량이 가장 높으며, 안정성 또한 높은 것을 확인하였다.

2.3. pFc2 융합 VP1 재조합 단백질의 용해성 확인 실험

실시예 1과 동일한 방법으로 제조된 pFc2 융합 재조합 단백질 발현 벡터의 단백질 용해성(solubility)을 확인하기 위하여, 상기 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머패시언스(Agrobacterium tumefaciens)를 담배 식물(Nicotiana benthamiana)의 잎에 접종하는 일과성 발현(transient expression) 방식으로 pFc2 융합 재조합 단백질(BiP:FMDV-VP1:pFc2)을 발현시킨 후에 식물 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심 분리한 후에, 용액에 포함되어 있는 soluble 형태(S)의 단백질과 펠릿(pellet; P) 부분에 있는 단백질을 이용하여 실시예 2.1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 대조군으로는 기존에 알려져 있는 셀룰로오스 결합 모듈(cbellulose binding module; CBM3)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 13)를 pFc 단편 대신 융합시킨 재조합 단백질을 이용하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, pFc2 융합 재조합 단백질은 펠릿 부분에서는 관찰되지 않는 반면, 용액 내에 포함되어 있는 것을 확인하였다. 그러나 셀룰로오스 결합 모듈을 융합시킨 재조합 단백질의 경우에는 펠릿 부분에서 재조합 단백질이 상당수 관찰되었다. 상기 결과를 통하여, pFc2 융합 재조합 단백질은 목적 단백질과 pFc2 단편의 결합으로 인한 구조적 변형을 통해 용해성이 증가된 것을 확인할 수 있었으며, 이를 통하여, pFc2 융합 재조합 단백질은 분리정제에 유리하며, 재조합 단백질의 응집이 억제되어 재조합 단백질의 생리활성 또는 약리적인 활성을 유지하는데 효과적인 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: pFc2 융합 GP5 재조합 항원 용해성 확인 실험

pFc2 단편을 돼지 생식기호흡증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome; PRRS)의 GP5 항원 단백질과 융합시키기 위하여, 돼지 GP5 항원 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 11)를 실시예 1의 재조합 벡터 내에 포함되어 있는 구제역 바이러스의 VP1 유전자 대신에 삽입하여 GP5:pFc2 재조합 항원을 발현하는 재조합 벡터를 제조하였다. 그리고 상기 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머패시언스(Agrobacterium tumefaciens)를 담배 식물(Nicotiana benthamiana)의 잎에 접종하는 일과성 발현(transient expression) 방식으로 pFc2 융합 GP5 재조합 항원(GP5:pFc2)을 발현시킨 후에 식물 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심 분리한 후에, 용액에 포함되어 있는 soluble 형태(S)의 단백질과 펠릿(pellet; P) 부분에 있는 단백질을 이용하여 실시예 2.1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 대조군으로는 pFc 단편 대신 CBM3(서열번호 14)가 융합된 GP5 재조합 항원을 이용하였고, CBM3 융합 GP5 재조합 항원의 경우에는 웨스턴 블롯팅을 위하여 HA antibody를 이용하여 실험을 진행하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, pFc2 융합 GP5 재조합 항원은 펠릿 부분에서는 약간의 단백질이 관찰되는 반면, 대부분 용액 내에 포함되어 있는 것을 확인하였다. 그러나 CBM3를 융합시킨 GP5 재조합 항원의 경우에는 펠릿 부분에서 재조합 단백질이 상당수 관찰되었다. 상기 결과를 통하여, pFc2 융합 재조합 단백질은 단백질의 종류에 관계없이 용해성이 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 통하여, 돼지의 면역글로불린 Fc 단편, 특별히, 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 pFc2 단편을 목적 단백질에 융합시킴으로써, 목적 단백질의 발현량을 증가시키는 동시에, 용해성을 증가시켜, 목적 단백질을 안정적으로 용이하게 분리 및 보관할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 4: pFc2 융합 PCV2 재조합 단백질의 생산성 및 용해성 확인 실험

pFc2 단편을 돼지 서코바이러스 2형(Porcine circovirus Type 2; PCV2) 단백질과 융합시키기 위하여, 돼지 서코바이러스 2형 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 15)를 실시예 1의 재조합 벡터 내에 포함되어 있는 구제역 바이러스의 VP1 유전자 대신에 삽입하여 PCV2:pFc2 재조합 단백질을 발현하는 재조합 벡터를 제조하였다. 그리고 상기 벡터로 형질전환된 아그로박테리움 튜머패시언스(Agrobacterium tumefaciens)를 담배 식물(Nicotiana benthamiana)의 잎에 접종하는 일과성 발현(transient expression) 방식으로 pFc2 융합 PCV2 재조합 단백질을 발현시킨 후에 식물 잎으로부터 단백질을 추출하여 원심 분리한 후에, 용액에 포함되어 있는 soluble 형태(S)의 단백질과 펠릿(pellet; P) 부분에 있는 단백질을 이용하여 실시예 2.1과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯팅을 실시하였다. 대조군으로는 pFc 단편 대신 His-tag가 융합된 PCV2 재조합 단백질을 이용하였고, His-tag 융합 PCV2 재조합 단백질의 경우에는 웨스턴 블롯팅을 위하여 anti-His antibody를 이용하여 실험을 진행하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, pFc2 융합 PCV2 재조합 단백질의 경우에는 대부분 용액 내에 포함되어 있을 뿐만 아니라, His-tag가 융합된 PCV2 재조합 단백질과 비교하여 생산량이 현저히 증가된 것을 확인하였다.

실시예 5: pFc2 융합 E2 재조합 단백질 발현 실험

pFc2 단편을 항원 단백질에 융합하여 사용가능한지 확인하기 위하여, 돼지 열병 항원인 E2 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드(서열번호 17)를 실시예 1의 재조합 벡터 내에 포함되어 있는 구제역 바이러스의 VP1 유전자 대신에 삽입하여, BiP:E2:pFc2 재조합 단백질을 발현하는 재조합 벡터를 제조하였다. 그리고 제조된 재조합 벡터를 아그로박테리움-매개 형질전환 방법(Agrobacterium-mediated transformation)으로 애기장대에 형질전환시키고, 카나마이신(Kanamycin)에 대한 내성을 가지는 애기장대를 선별하고, 세대진전을 통해 pFc2가 융합된 E2 재조합 단백질의 발현이 안정된 호모 종자를 최종 확보하여, 형질전환 식물체를 제조하였다. 그리고 단백질 추출에 보편적으로 사용되는 단백질 추출 버퍼를 이용하여 최종 확보된 형질전환 식물체 8 g으로부터 단백질을 분리하고, protein A-sepharose column을 장착한 AKTA prime(GE Healthcare)을 이용하여 pFc 융합 E2 재조합 단백질을 분리하였다. 그리고 대조군으로는 pFc 단편 대신 셀룰로오스 결합 도메인(서열번호 19)을 융합시킨 BiP:E2:CBD 재조합 단백질을 사용하였다. CBD가 융합된 E2 재조합 단백질은 비결정 셀룰로오스(amorphous cellulose; AMC)를 사용하여 형질전환 식물체 5 g으로부터 분리하였다. 그리고 분리된 재조합 단백질은 인산화완충용액(phosphate buffered saline; PBS)를 이용하여 투석 후에 원심 필터 튜브(Centrifugal filter tube)를 사용하여 농축하였다. 그리고 분리된 재조합 단백질의 양을 정량하기 위하여, SDS-PAGE를 실시한 후에 쿠마씨 블루(coomassie blue)로 염색하였다. 이때, BSA(bovine serum albumin)를 이용한 표준곡선(standard curve)을 이용하여 재조합 단백질을 정량하였다. 그 결과는 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타난 바와 같이, 셀룰로오스 결합 도메인이 융합된 E2 재조합 항원의 경우에는 식물체 1 g 당 약 30 μg이 생산되는 반면, pFc2 단편이 융합된 E2 재조합 항원의 경우에는 식물체 1 g 당 302 μg이 생산되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, pFc2 단편을 이용하여 목적 항원의 발현량을 10 배 이상 증가시킬 수 있다는 것을 확인하였다.

상기 결과들을 통하여, 본 발명의 pFc2 단편을 태그(tag)로 사용하여 다양한 목적 단백질과 융합시킴으로써, 목적 단백질의 생산량을 현저히 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라 용해성 및 안정성을 증가시켜 목적 단백질의 응집이 억제되어 재조합 단백질의 효율적 생산에 크게 도움이 되는 것을 확인할 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> BioApplications Inc. <120> Recombinant vector comprising porcine Fc fragment and preparation method of recombinant proteins using thereof <130> MP18-195 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 690 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of pFc1 <400> 1 ggaactaaga ctaagccacc ttgtcctatt tgtccagggt gcgaggtagc cggtcccagc 60 gtgtttattt ttccaccaaa accaaaggat actttgatga tatctcaaac accggaagtt 120 acttgcgttg tggtcgacgt ttcaaaagag catgccgaag ttcagttctc ttggtatgtg 180 gatggtgtgg aagtgcacac cgctgagaca cgtcctaaag aggaacagtt taactctact 240 tacagagtcg tgtccgtatt gcccattcag catcaagact ggcttaaggg aaaagaattt 300 aaatgtaagg taaataatgt tgatctgcca gcacctataa ctagaaccat ctcgaaagct 360 attggacaat ctagagaacc tcaagtttat acattgcctc ctccagctga ggaactttct 420 agaagtaaag tcactgttac atgcttagtt attggattct atccaccaga tatccatgtt 480 gaatggaaat caaatggtca gcccgaacct gagggcaact acagaacaac accaccacag 540 caagatgtag atggtacttt tttcctctac tcaaaactag ctgttgataa ggctaggtgg 600 gatcatggcg 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Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu 1 5 10 15 Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Val Gln Arg Arg His His Thr Asp Val 20 25 30 Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Ser Ile 35 40 45 Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Thr Pro Pro His Thr Leu Val Gly Ala 50 55 60 Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val 65 70 75 80 Lys His Glu Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala 85 90 95 Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu 100 105 110 Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr 115 120 125 Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Ala Gly Gly Ser Leu Pro Asn Val 130 135 140 Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Gln Lys Ala Ala Trp Pro Leu Pro 145 150 155 160 Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu 165 170 175 Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu 180 185 190 Ala Val His Pro Ser Ala Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro 195 200 205 Val Lys Gln Ser Leu 210 <210> 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Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp 115 120 125 Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp 130 135 140 Leu Arg Leu Gln Thr Ser Arg Asn Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr 145 150 155 160 Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Val Thr 165 170 175 Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn 180 185 190 Pro <210> 17 <211> 1026 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of E2 <400> 17 aacggctagc ctgcaaggaa gattacaggt acgcaatatc atcaaccaat gagatagggc 60 tactcggggc cggaggtctc accaccacct ggaaagaata caaccacgat ttgcaactga 120 atgacgggac cgttaaggcc atttgcgtgg caggttcctt taaagtcaca gcacttaatg 180 tggtcagtag gaggtatttg gcatcattgc ataaggaggc tttacccact tccgtgacat 240 tcgagctcct gttcgacggg accaacccat caactgagga aatgggagat gacttcgggt 300 tcgggctgtg cccgtttgat acgagtcctg ttgtcaaagg aaagtacaat acaaccttgt 360 tgaacggtag tgctttctat cttgtctgtc caatagggtg gacgggtgtt atagagtgca 420 cagcagtgag cccaacaact ctgagaacag aagtggtaaa gaccttcagg agggacaagc 480 cctttccgca cagaatggat tgtgtgacca caacagtgga aaatgaagat ttattctact 540 gtaagttggg gggcaactgg acatgtgtga aaggtgaacc agtggtctac acgggggggc 600 tagtaaaaca atgcagatgg tgtggctttg acttcaatga gcctgacgga ctcccacact 660 accccatagg taagtgcatt ttggcaaatg agacaggtta cagaatagtg gattcaacag 720 actgtaacag agatggtgtt gtaatcagca cagaggggag tcatgagtgc ttgatcggta 780 acacgactgt caaggtgcat gcatcagatg aaagactggg ccccatgcca tgcagaccta 840 aagagatcgt ctctagtgca ggacctgtaa ggaaaacttc ctgtacattc aactacgcaa 900 aaactttgaa gaacaagtac tatgagccca gggacagcta cttccagcaa tatatgctta 960 agggcgagta tcagtactgg tttgacctgg acgtgactga ccgccactca gattacttcg 1020 cagaag 1026 <210> 18 <211> 341 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Amino acid sequence of E2 <400> 18 Arg Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn 1 5 10 15 Glu Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu 20 25 30 Tyr Asn His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr Val Lys Ala Ile Cys 35 40 45 Val Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg 50 55 60 Tyr Leu Ala Ser Leu His Lys Glu Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe 65 70 75 80 Glu Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr Glu Glu Met Gly Asp 85 90 95 Asp Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Ser Pro Val Val Lys 100 105 110 Gly Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val 115 120 125 Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro 130 135 140 Thr Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Arg Arg Asp Lys Pro 145 150 155 160 Phe Pro His Arg Met Asp Cys Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Glu Asp 165 170 175 Leu Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Glu 180 185 190 Pro Val Val Tyr Thr Gly Gly Leu Val Lys Gln Cys Arg Trp Cys Gly 195 200 205 Phe Asp Phe Asn Glu Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys 210 215 220 Cys Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Ile Val Asp Ser Thr Asp 225 230 235 240 Cys Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu Gly Ser His Glu Cys 245 250 255 Leu Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Ser Asp Glu Arg Leu 260 265 270 Gly Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro 275 280 285 Val Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Ala Lys Thr Leu Lys Asn 290 295 300 Lys Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys 305 310 315 320 Gly Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Val Thr Asp Arg His Ser 325 330 335 Asp Tyr Phe Ala Glu 340 <210> 19 <211> 429 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA sequence of cellulose binding domain <400> 19 tttcgaagtt caccagtgcc tgcacctggt gataacacaa gagacgcata ttctatcatt 60 caggccgagg attatgacag cagttatggt cccaaccttc aaatctttag cttaccaggt 120 ggtggcagcg ccattggcta tattgaaaat ggttattcca ctacctataa aaatattgat 180 tttggtgacg gcgcaacgtc cgtaacagca agagtagcta cccagaatgc tactaccatt 240 caggtaagat tgggaagtcc atcgggtaca ttacttggaa caatttacgt ggggtccaca 300 ggaagctttg atacttatag ggatgtatcc gctaccatta gtaatactgc gggtgtaaaa 360 gatattgttc ttgtattctc aggtcctgtt aatgttgact ggtttgtatt ctcaaaatca 420 ggaacttct 429

Claims

서열번호 4로 표시되는 돼지의 Fc 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 재조합 벡터.
제 1 항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 프로모터 유전자, Fc 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 순차적으로 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제 2 항에 있어서,
상기 프로모터는 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 35S 프로모터, 꽃양배추 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 유래 19S RNA 프로모터, 식물의 액틴 단백질 프로모터, 유비퀴틴 단백질 프로모터, CMV(Cytomegalovirus) 프로모터, SV40(Simian virus 40) 프로모터, RSV(Respiratory syncytial virus) 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터, 히스톤 프로모터, Clp 프로모터 및 EF-1α(Elongation factor-1 alpha) 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제 1 항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 BiP(Chaperone binding protein)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제 1 항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 HDEL(His-Asp-Glu-Leu) 펩타이드를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제 1 항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 M17의 5' UTR(untranslational region) 부위 유전자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제 1 항에 있어서,
상기 재조합 벡터는 Fc 단편이 융합된 목적 단백질의 발현량을 증가시키며 용해성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 형질전환된, 형질전환체.
(a) 제 8 항의 형질전환체를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 형질전환체 또는 배양액으로부터 Fc 단편이 융합된 목적 단백질을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 재조합 단백질의 생산 방법.
서열번호 4로 표시되는 돼지의 Fc 단편을 유효성분으로 포함하는, 목적 단백질 태그용 조성물.