CN113292659B - 重组蛋白和猪流行性腹泻疫苗组合物 - Google Patents

重组蛋白和猪流行性腹泻疫苗组合物 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种重组蛋白和猪流行性腹泻疫苗组合物。重组蛋白是由来自猪流行性腹泻病毒S蛋白(Spike，纤突蛋白)的截短片段与猪IgG的Fc片段串联而成的融合蛋白，S蛋白的截短片段优选选自S蛋白的S1亚基中具有唾液酸结合活性的N端结构域(NTD)、中和表位域(COE)以及S2亚基中的多个B细胞识别表位。疫苗组合物包含了重组蛋白以及佐剂。本发明的重组蛋白免疫小鼠后能够产生较高水平的IgG抗体和中和抗体滴度，CD3+CD4+、CD3+CD8+淋巴细胞比例和淋巴细胞中IFN‑γ、IL‑4浓度均表现出显著升高。

Description

重组蛋白和猪流行性腹泻疫苗组合物
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组蛋白和猪流行性腹泻疫苗组合物。
背景技术
猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)属于Ⅰ类冠状病毒，引起猪流行性腹泻病，这是一种具有高度传染性的肠道疾病，其特征是严重的水样腹泻、呕吐和脱水，以及一些全身症状，如呕吐、发烧、厌食和嗜睡。对乳猪来说，其对脱水的敏感性较强，表现为更严重的临床症状，在全球范围内给养猪业造成了巨大的经济损失。
目前市面上售卖的猪流行性腹泻疫苗主要都是传统的PEDV灭活疫苗和弱毒疫苗。但是灭活疫苗需要接种很大的剂量，单次的接种不能产生足够的免疫力，不适用紧急预防接种。弱毒疫苗存在扩散病毒和返强的风险。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的一方面在于提供一种重组蛋白，所述重组蛋白是由来自猪流行性腹泻病毒S蛋白(Spike，纤突蛋白)的截短片段与猪IgG的Fc片段串联而成的融合蛋白。
术语“猪流行性腹泻病毒S蛋白”是猪流行性腹泻病毒的主要结构蛋白之一，由1383个氨基酸组成。S蛋白是负责病毒附着、受体结合和进入的主要包膜糖蛋白，依据与其他冠状病毒S蛋白的同源性，也可以把猪流行性腹泻病毒S蛋白分为负责介导病毒和细胞表面受体附着的S1亚基(1～725aa)以及参与病毒和宿主细胞膜融合的S2亚基(726～1383aa)。
术语“猪IgG的Fc片段”是指猪免疫球蛋白G重链恒定区的CH2和CH3，其包括天然氨基酸序列及其序列衍生物(即，突变体)。
本发明的重组蛋白中S蛋白的截短片段优选选自S蛋白的S1亚基中具有唾液酸结合活性的N端结构域(NTD)、中和表位域(COE)以及S2亚基中的多个B细胞识别表位。
进一步优选地，所述S蛋白的截短片段包括：具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列或者SEQ ID NO.1所示氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列的片段，具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列或者SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列的片段，以及具有SEQ ID NO.3所示氨基酸序列或者SEQ ID NO.3所示氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列的片段。
所述猪IgG的Fc片段优选具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。
优选地，所述重组蛋白具有或包括SEQ ID NO.5所示的氨基酸序列或者SEQ IDNO.5所示氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。
优选地，所述重组蛋白是利用真核表达系统外源表达具有SEQ ID NO.6所示DNA序列的重组基因得到的重组蛋白。
优选地，所述重组蛋白是利用哺乳动物细胞表达系统外源表达具有SEQ ID NO.6所示DNA序列的重组基因得到的重组蛋白。
本发明还提供所述重组蛋白的应用，所述重组蛋白用于制备猪流行性腹泻病毒疫苗和/或用于检测猪流行性腹泻病毒抗体。
本发明另一方面还提供一种猪流行性腹泻疫苗组合物，所述疫苗组合物包含本发明的重组蛋白以及药学上可接受的佐剂。
优选地，所述佐剂是弗氏佐剂或层状双金属氢氧化物(LDH)佐剂。
当使用弗氏佐剂作为佐剂时，所述疫苗组合物由所述重组蛋白与所述佐剂按1:1的体积比混合并乳化制备而成。当使用层状双金属氢氧化物(LDH)作为佐剂时，所述疫苗组合物由所述重组蛋白与所述佐剂按1:4的质量比混合并乳化制备而成。
优选地，所述层状双金属氢氧化物佐剂通过以下方法制备：步骤1，制备第一混合溶液，所述第一混合溶液中包含0.54mol/L的Mg(NO3)2和0.27mol/L Al(NO3)3的混合盐溶液；步骤2，制备第二混合溶液，所述第二混合溶液由NaOH和乳酸混合后剧烈搅拌制备而成；步骤3，将所述第一混合溶液和所述第二混合溶液混合反应，反应之后将沉淀物在冰浴中超声处理10分钟，5000rpm下离心10min获得纯的LDH浆液，并用水洗涤两次，然后分散于20mL水中，而得到呈纳米颗粒状的层状双金属氢氧化物佐剂。
本发明的疫苗组合物可以有效地预防或治疗猪流行性腹泻。
本发明通过将表达PEDV S蛋白的多个截短片段的功能表位(NTD、COE和B细胞表位)的基因串联，并进一步串联了表达猪IgG Fc段的基因，构建真核表达质粒通过真核表达系统高效表达重组蛋白，利用该真核表达系统表达的重组蛋白纯化工艺简便，产量高，便于大规模生产。
本发明进一步利用外源表达得到的重组蛋白制备了亚单位疫苗，该疫苗具有安全性高、免疫原性好、批次间稳定、生产成本低，能够诱导猪只产生良好的免疫反应等优点。
附图说明
图1是示出pcDNA3.1-S1-Fc质粒图谱的图。
图2是示出通过间接免疫荧光检测重组真核表达质粒pcDNA3.1-S1-Fc在293T细胞中表达情况的结果图。
图3是对真核表达的重组蛋白进行Western blot检测的结果的图，其中M是蛋白质分子质量标准，泳道1和2是pcDNA3.1-PEDV真核蛋白。
图4是示出使用Nicomp 380Z3000纳米粒度仪检测制备的LDH佐剂的粒径大小的结果图。
图5是示出用本发明实施例的重组蛋白制备疫苗免疫后小鼠血清中IgG抗体检测结果的图。
图6是示出疫苗免疫后小鼠血清中和抗体效价检测结果的图。
图7和图8是示出通过流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD3+CD4+亚型比例结果的图，其中图7中的A是空白组，B是疫苗组合物1，C是疫苗组合物2，D是PBS对照。
图9和图10是示出通过流式细胞术检测小鼠脾淋巴细胞CD3+CD8+亚型比例结果的图，其中图9中的A是空白组，B是疫苗组合物1，C是疫苗组合物2，D是PBS对照。
图11是示出通过MTT法检测小鼠脾淋巴细胞相对增值率的结果的图。
图12和图13是示出小鼠细胞因子IFN-γ、IL-4检测结果的图。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步描述本发明的技术方案，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应当理解，实施例仅是示例性的，不对本发明的范围构成限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下文的描述中，所涉及的方法如无特别说明，则均为本领域的常规方法。所涉及的原料如无特别说明，则均是能从公开商业途径获得的原料。
实施例1：构建用于真核表达重组蛋白的重组质粒
本实施例以PEDV AH2012/12株S基因序列(GenBank：KU646831.1)为基础，通过南京金斯瑞生物科技有限公司合成具有SEQ ID NO.6所示DNA序列的融合基因，记为S1-Fc。该融合基因S1-Fc中包含S蛋白基因的三个截短片段，分别是S1亚基中具有唾液酸结合活性的N末端结构域(NTD，aa19～233)、中和抗原核心区域(COE，aa499～638)以及S2亚基中的B细胞识别表位(aa744～774)，这三个截短片段通过接头多肽(linker)依次串联，之后再融合猪IgG抗体的Fc片段。
将合成的融合基因通过常规的分子生物学手段克隆到质粒载体pcDNA3.1中，构建得到用于表达重组蛋白的重组质粒pcDNA3.1-S1-Fc，图1示出了重组质粒pcDNA3.1-S1-Fc的图谱。
将重组质粒pcDNA3.1-S1-Fc转化大肠杆菌DH5a感受态细胞构建得到用于扩增重组质粒pcDNA3.1-S1-Fc的重组大肠杆菌。将重组大肠杆菌接种到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，于37℃、200rpm的条件下在恒温振荡培养箱培养8h，用Axygen公司小提质粒试剂盒从培养物中提取并纯化重组质粒pcDNA3.1-S1-Fc。
转染试剂Lipofectamine3000(购自Invitrogen公司)将纯化得到的重组质粒pcDNA3.1-S1-Fc转染293T细胞，同时转染质粒载体pcDNA3.1作为阴性对照，通过间接免疫荧光方法检测融合基因S1-Fc的表达。
进行293T细胞的传代铺板时在培养孔中放入细胞爬片，然后用重组质粒pcDNA3.1-S1-Fc转染293T细胞并培养48h。然后使用PBS洗涤三次，按500μL/孔的量加入无水乙醇于4℃下固定15min。固定结束后用PBST洗涤三次，然后加入小鼠抗HIS标签单克隆抗体作为一抗(购自美国Genscript公司，稀释1000倍)，37℃恒温培养箱孵育30min，用PBST洗涤二次后加入FITC羊抗鼠IgG抗体作为二抗(购自博士德生物公司，稀释500倍)，PBST洗涤二次后加入DAPI染液(稀释1500倍)作用5min，将细胞爬片取出固定在载玻片上，使用倒置荧光显微镜观察荧光情况。
结果如图2所示，转染重组质粒pcDNA3.1-S1-Fc的培养孔表现出明显的特异性荧光反应，而转染质粒载体pcDNA3.1的对照孔没有表现出荧光反应，表明上述构建重组质粒pcDNA3.1-S1-Fc能够成功地在293T细胞中驱动目的基因的表达。
实施例2：制备真核表达的重组蛋白
本实施例通过Expi293TM表达系统来制备大批量的重组蛋白。本实施例所用的ExpiFectamineTM293转染试剂盒购自Gibco公司。
具体操作如下：
(1)在30mL Expi293TM表达培养基中接种6×107个Expi293FTM活细胞；
(2)于37℃、8％CO2、125rpm的条件下在轨道振动器中孵育细胞；
(3)使用自动细胞计数器来确定细胞数量和活力，细胞密度应为3×106～5×106个/mL，细胞活力应＞95％；
(4)在125mL的烧瓶中用25.5mL Expi293TM表达培养基将7.5×107个细胞稀释至2.9×106个/mL；
(5)在A管中用Opti-MEM稀释30μg pcDNA3.1-S1-Fc真核表达质粒至总体积1.5mL，在B管中用Opti-MEM稀释81μL ExpiFectamineTM293试剂至总体积为1.5mL，轻轻混合后分别在室温下孵育5min，然后将B管中的混合物加入到A管，得到总体积为3mL的复合物，轻轻混合，在室温下孵育20min；
(6)向烧瓶中加入3mL上述复合物，此时烧瓶中混合物的体积为28.5mL；
(7)于37℃、8％CO2、125rpm的条件下在轨道振动器中孵育细胞20h；
(8)向烧瓶中加入150μL的ExminFectaminTM293转染增强剂1和1.5mL的ExpiFectamineTM293转染增强剂2，最终，烧瓶中混合物的体积应约为30mL；
(9)于37℃、8％CO2、125rpm的条件下在轨道振动器中继续孵育细胞3天；
(10)收取蛋白。
通过Western blot检测重组蛋白的表达情况。
从上述收取的蛋白中取出20μL蛋白样品，加入5μL的5×SDS-PAGE上样缓冲液，煮沸10min后，进行SDS-PAGE凝胶电泳。
SDS-PAGE电泳后，将凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜，然后将硝酸纤维素膜浸入含5％脱脂乳的PBST中封闭2h。封闭结束后用PBST洗涤三次，加入小鼠抗HIS标签单克隆抗体作为一抗(购自美国Genscript公司，稀释2000倍)，缓慢震荡反应90min，PBST洗涤三次后加入HRP酶标羊抗鼠IgG抗体作为二抗(购自博士德生物公司，稀释10000倍)，缓慢震荡反应60min，PBST洗涤三次。用regentⅠ、regentⅡ等量混合后，均匀浸湿硝酸纤维素膜，通过化学发光仪来观察结果。
结果如图3所示，表明使用ExpiFectamineTM293真核表达系统能够成功表达出大量的重组蛋白。
接下来，采用Protein G小柱对上述得到的蛋白质进行进一步纯化，具体操作如下：
(1)向预装柱中加入5mL ddH2O，冲洗层析柱中的储存液；
(2)向预装柱中加入5mL结合缓冲液，平衡层析柱；
(3)将样品蛋白加到平衡好的层析柱中，流速1mL/min，收集流出液；
(4)向预装柱中加入10mL洗杂缓冲液进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液；
(5)向预装柱中加入10mL洗脱缓冲液，将与层析柱结合的目的蛋白洗下来，收集洗脱液，得到纯化后的重组蛋白。
用RC DC Protein Assay试剂盒测得纯化后重组蛋白的浓度为0.68mg/mL。
实施例3：制备疫苗组合物
分别使用市售的弗氏佐剂和发明人自行制备的层状双金属氢氧化物(LDH)佐剂与实施例2制备纯化的重组蛋白混合来制备疫苗组合物。
层状双金属氢氧化物(LDH)佐剂制备如下：首先，准备15mL的混合盐溶液，混合盐溶液中含有8.0mmol的Mg(NO3)2和4.0mmol的Al(NO3)3；接下来，准备20mL的4.0mol/L NaOH溶液，加入20mmol的乳酸(88％)，剧烈搅拌2h，得到NaOH混合物；然后，将15mL的混合盐溶液添加到11mL NaOH混合物中进行反应，将反应后产生的沉淀物在冰浴中超声处理10分钟，5000rpm下离心10min，获得纯的LDH浆液，并用水将LDH浆液洗涤两次，然后手动分散在20mL水中，得到制备好的LDH佐剂。使用Nicomp 380Z3000纳米粒度仪测定LDH佐剂的粒径大小，结果如图4所示，横坐标为粒子直径，纵坐标为粒子相对百分比，LDH佐剂的最佳尺寸为115nm左右时促进作用较强，结果表明发明人所制得的LDH佐剂大小适宜。
将实施例2中纯化的重组蛋白与LDH佐剂按质量比1:4混合并乳化制得疫苗组合物1，于4℃保存备用。将实施例2中纯化的重组蛋白与弗氏佐剂按体积比1:1混合并乳化制得疫苗组合物2，于4℃保存备用
实施例4：疫苗组合物的免疫效力评价
取20只6-8周龄BALB/c雌性小鼠(购自扬州大学实验动物中心)，随机分为4组，其中包括两组疫苗组、对照组和空白组，每组5只小鼠，免疫计划如表2所示。
表2动物实验免疫计划
Figure BDA0003073727430000071
总共进行三次免疫，间隔2周。分别于免疫前和免疫后14d、28d、42d进行眼眶静脉丛采血，分离血清并保存于-20℃，用于测定不同免疫时期的血清抗体水平。
第42天测定抗体效价，适时进行全部小鼠眼球采血，分离血清，进行抗体IgG以及中和效价的测定；分离脾脏淋巴细胞，进行MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖以及CD3+CD4+和CD3+CD8+T细胞测定；并收集脾脏淋巴细胞培养上清进行IL-4和IFN-γ细胞因子测定。
1.免疫小鼠血清IgG测定
通过间接ELISA检测免疫小鼠的血清IgG水平。
以具有SEQ ID NO.7所示氨基酸序列的原核重组COE蛋白作为抗原，与PEDV阴性血清和阳性血清组成方阵滴定，确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度。重组COE蛋白是通过将具有SEQ ID NO.8所示序列的COE基因片段克隆到pGEX-4T-1载体，然后在大肠杆菌BL21(DE3)中外源表达获得的。
用包被液将纯化的原核重组COE蛋白依次做1:100、1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200稀释，按100μL/孔滴加到聚苯乙烯微量滴定板中，4℃过夜。第二天弃去液体，PBST200μL/孔洗三次，每次五分钟。(按200μL/孔加入PBST稀释的5％脱脂乳，37℃封闭2h，弃去封闭液后PBST200μL/孔洗三次，每次五分钟。用2％脱脂乳将PEDV阴性血清和阳性血清分别做1:50、1:100、1:200、1:400稀释，组成棋盘方阵，100μL/孔，37℃1h，弃去液体后按200μL/孔用PBST洗三次，每次五分钟。按100μL/孔加入用2％脱脂乳1:10000稀释的羊抗猪IgG-HRP，37℃1h，弃去液体后按200μL/孔用PBST洗三次，每次五分钟。加入TMB显色液，100μL/孔，室温避光作用15min。加入终止液，100μL/孔，终止反应，用酶标仪读取OD450nm值。选取阳性血清OD450nm值为1.0左右，阴性OD450nm值为0.2左右，且阳性与阴性OD450nm比值(P/N)最大时的抗原包被浓度为抗原最佳包被浓度，对应的阴阳性血清稀释度为血清最佳稀释度。最终确定原核重组COE蛋白的最佳包被浓度为6.7μg/mL，血清最佳稀释度为1:50。
使用以上确定的最佳抗原包被浓度包被聚苯乙烯微量滴定板，应用上述ELISA方法检测免疫后14d、28d、42d采集血清的IgG。结果如图5所示，结果表明疫苗组合物1和疫苗组合物2组小鼠血清中的IgG抗体水平均明显高于PBS组及空白组。
2.免疫小鼠血清中和实验
(1)将所有采集得到的血清分装放入水浴锅中于56℃灭活处理30min。
(2)在96孔微量细胞培养板上，将已灭活处理的血清使用纯DMEM做倍比稀释，分别为原血清的1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256，每孔终含量50μL，每个稀释度重复2孔。
(3)取-80℃冰箱内保存的PEDV病毒液，使用含有5μg/mL胰酶的纯DMEM，按测定的TCID50做200倍稀释(与等量血清混合，其毒价为100TCID50)。
(4)每孔加入50μL步骤(3)中的病毒液，封盖，于37℃、5％CO2温箱中中和作用1h。
(5)待96孔板上长满单层VERO细胞，弃去上清液，使用纯DMEM清洗一遍，每孔加入100μL血清和病毒的混合液，37℃、5％CO2温箱中培养1.5h。使用纯DMEM轻轻洗两遍，更换含有2μg/mL胰酶的纯DMEM维持液，放入温箱中培养，24h后开始逐日观察记录。
以完全抑制细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)的血清的最大稀释度为该血清的中和效价。为保证实验结果的可靠性，设置孔内只加入病毒液不加入血清的阴性对照，阴性对照孔必定出现CPE。
结果如图6所示，疫苗组合物1和疫苗组合物2组的中和抗体效价分别为1:30和1:64，显著高于PBS组和空白组，尤其疫苗组合物2组中和抗体滴度最高且平行重复结果最稳定。
3.流式细胞术检测脾淋巴细胞亚型比例
3.1脾淋巴细胞的制备
取出免疫小鼠的脾脏，放入有不含牛血清的RPMI-1640培养液(不完全1640)的平皿中，转移至300目纱布中，加入10mL的不完全1640培养液，用无菌注射器的活塞顶部轻轻研磨，然后补加不完全1640培养液，将纱布上的剩余组织冲洗至平皿中。竖直静放2min，待组织下沉后吸取上清至15mL无菌离心管内，1000rpm离心10min，弃去上清液，加入5mL无菌NH4Cl(8.3g/L)，混匀后，37℃静置5min，1000rpm离心5min，用不完全1640培养液将沉淀重悬、洗涤并离心，最后用完全1640培养液重悬细胞，得到制备好的脾淋巴细胞。
3.2检测脾淋巴细胞亚型比例
取1×106个上述制备好的小鼠脾脏淋巴细胞加入1.5mL无菌离心管中，1500rpm下离心5min，弃去上清液，用1mL的PBS缓冲液洗涤，1500rpm下离心5min，弃去上清液，用溶有APC anti-mouse CD3、FITC rat anti-mouse CD4(L3T4)和PE Rat anti-mouse CD8a荧光抗体的300μL PBS重悬细胞，完全混匀后4℃避光孵育30min，用1mL PBS洗涤2次，1500rpm离心5min，弃去上清液，用500μL流式细胞染色缓冲液将管底的细胞重悬，利用BD AccuriTMC6Plus流式细胞仪检测10000个细胞中CD3+CD4+和CD3+CD8+阳性细胞的比例。
图7和图8示出了CD3+CD4+T淋巴细胞的变化，首免后42天，与PBS组(比例为7.64％)和空白组(比例为6.88％)相比，疫苗组合物1和疫苗组合物2实验组的CD3+CD4+T淋巴细胞比例均表现出一定程度的上升，与PBS组相比，疫苗组合物1和疫苗组合物2组分别升高11.43％和8.26％。
图9和图10示出了CD3+CD8+T淋巴细胞的变化，首免后42天，与PBS组(比例为4.52％)和空白组(比例为3.66％)相比，疫苗组合物1和疫苗组合物2实验组的CD3+CD8+T淋巴细胞比例均表现出一定程度的上升，与PBS组相比，疫苗组合物1和疫苗组合物2实验组分别升高了3.48％和2.61％。
3.3MTT法检测小鼠脾淋巴细胞增殖
以每孔103～104个细胞的量将脾淋巴单细胞悬液接种到96孔板，每孔体积为200uL，细胞贴壁后每孔加终浓度为10μg/mL的ConA，对照孔只加等体积RPMI-1640培养液，设三个重复孔。将细胞板放入37℃、5％CO2温箱中培养。培养3～5天后，每孔加20μL MTT溶液(5mg/mL，用PBS配制)，继续孵育4h后终止培养，小心吸取孔内培养上清液保存(每个样品的3孔合至1孔，总计300μL，用于后续检测细胞因子)。然后每孔加入150μL DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔的光吸收值，结果以三个重复孔的平均值表示，最后计算细胞相对增值率(P％)：P％＝(加药实验组平均OD值/正常对照组平均OD值)×100％。
结果如图11所示，首免后42天，相对于PBS组(增值率为82.51％)和Blank组(增值率为92.78％)，疫苗组合物1和疫苗组合物2实验组的细胞相对增值率均显著增大，与PBS组相比，疫苗组合物1和疫苗组合物2组分别增大67.24％和64.38％。
3.4小鼠细胞因子的检测
使用3.3中收集的上清液对淋巴细胞IFN-γ和淋巴细胞IL-4等细胞因子进行检测。
使用小鼠γ干扰素(IFN-γ)酶联免疫分析试剂盒并参考试剂盒内说明书对脾脏淋巴细胞上清IFN-γ浓度进行检测。
使用小鼠白介素-4(IL-4)酶联免疫分析试剂盒并参考试剂盒内说明书对脾脏淋巴细胞上清IL-4浓度进行检测。
图12示出了IFN-γ的检测结果，首免42天后，疫苗组合物1和疫苗组合物2免疫组的IFN-γ水平均值分别是645.27ng/L和572.84ng/L，与PBS组(342.59ng/L)相比都有明显升高，其中疫苗组合物1免疫组差异最明显，高于PBS组302.68ng/L。
图13示出了IL-4的检测结果，首免42天后，疫苗组合物1和疫苗组合物2免疫组的IL-4水平均值分别是203.3pg/mL和207.42pg/mL，与PBS组(101.82pg/mL)相比都有明显升高，其中疫苗组合物1和疫苗组合物2免疫组差异比较明显分别高于PBS组101.49pg/mL和105.61pg/mL。
本发明通过构建真核表达质粒，能够在包括293细胞系在内的哺乳动物细胞系中高效表达重组蛋白，利用该重组蛋白制备的疫苗组合物免疫小鼠后能够产生较高水平的抗体。血清中和实验结果表明本发明的疫苗组合物能够有效地刺激产生中和抗体，可以起到较好的保护作用。脾脏淋巴细胞亚型比例及细胞因子的检测结果表明，本发明的疫苗组合物可以提高外周血T淋巴细胞免疫功能和细胞因子表达水平能力。
淋巴细胞增殖试验结果表明，本发明的疫苗组合物可以刺激T细胞转化为免疫记忆细胞，当再次遇到同样的抗原时，可以发生更加迅速且有效的免疫应答反应。
申请人结合说明书附图对本发明的实施例做了详细的说明与描述，但是本领域技术人员应该理解，以上实施例仅为本发明的优选实施方案，详尽的说明只是为了帮助读者更好地理解本发明精神，而并非对本发明保护范围的限制，相反，任何基于本发明的发明精神所作的任何改进或修饰都应当落在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 重组蛋白和猪流行性腹泻病毒的疫苗组合物
<130> JAAS2021-02
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 215
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒
<400> 1
Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Thr Ala Asn Thr Asn Phe Arg Arg
1 5 10 15
Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val Val Val Leu Gly
20 25 30
Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn Ser Thr Trp Tyr
35 40 45
Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His Gly Ile Phe Leu
50 55 60
Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly Ile Ser Gln Glu
65 70 75 80
Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His Lys Ala Thr Asn
85 90 95
Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys Gln Phe Pro Ser
100 105 110
Ile Lys Thr Leu Gly Pro Ala Ala Asn Asn Asp Val Thr Thr Gly Arg
115 120 125
Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met Ser Glu His Ser
130 135 140
Val Val Gly Ile Thr Trp Asp Asn Asp Arg Val Thr Val Phe Ser Asp
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Lys Cys Tyr Asn Ser Gly Gly Cys Ala Met Gln Tyr Val Tyr Glu Pro
180 185 190
Thr Tyr Tyr Ile Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu Asp Gly Ile Ser
195 200 205
Tyr Gln Pro Cys Thr Ala Asn
210 215
<210> 2
<211> 140
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒
<400> 2
Thr Ser Phe Val Thr Leu Pro Ser Phe Asn Asp His Ser Phe Val Asn
1 5 10 15
Ile Thr Val Ser Ala Ala Phe Gly Gly His Ser Gly Ala Asn Leu Ile
20 25 30
Ala Ser Asp Thr Thr Ile Asn Gly Phe Ser Ser Phe Cys Val Asp Thr
35 40 45
Arg Gln Phe Thr Ile Ser Leu Phe Tyr Asn Val Thr Asn Ser Tyr Gly
50 55 60
Tyr Val Ser Lys Ser Gln Asp Ser Asn Cys Pro Phe Thr Leu Gln Ser
65 70 75 80
Val Asn Asp Tyr Leu Ser Phe Ser Lys Phe Cys Val Ser Thr Ser Leu
85 90 95
Leu Ala Ser Ala Cys Thr Ile Asp Leu Phe Gly Tyr Pro Glu Phe Gly
100 105 110
Ser Gly Val Lys Phe Thr Ser Leu Tyr Phe Gln Phe Thr Lys Gly Glu
115 120 125
Leu Ile Thr Gly Thr Pro Lys Pro Leu Glu Gly Val
130 135 140
<210> 3
<211> 31
<212> PRT
<213> 猪流行性腹泻病毒
<400> 3
Cys Thr Glu Pro Val Leu Val Tyr Ser Asn Ile Gly Val Cys Lys Ser
1 5 10 15
Gly Ser Ile Gly Tyr Val Arg Ser Gln Ser Gly Gln Val Lys Ile
20 25 30
<210> 4
<211> 224
<212> PRT
<213> 猪
<400> 4
Pro Cys Pro Ile Cys Pro Gly Cys Glu Val Ala Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Gln Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Lys Glu His Ala Glu Val
35 40 45
Gln Phe Ser Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Thr Ala Glu Thr
50 55 60
Arg Pro Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Leu Lys Gly Lys Glu Phe Lys Cys
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115 120 125
Pro Ala Glu Glu Leu Ser Arg Ser Lys Val Thr Val Thr Cys Leu Val
130 135 140
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Val Asp Gly Thr Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ala Val Asp Lys Ala
180 185 190
Arg Trp Asp His Gly Glu Thr Phe Glu Cys Ala Val Met His Glu Ala
195 200 205
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Lys Thr Gln Gly Lys
210 215 220
<210> 5
<211> 676
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ile Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Leu Pro Gln Asp Val Thr Arg Cys Thr Ala Asn Thr
20 25 30
Asn Phe Arg Arg Phe Phe Ser Lys Phe Asn Val Gln Ala Pro Ala Val
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Val Val Leu Gly Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Glu Asn Gln Gly Val Asn
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Ser Thr Trp Tyr Cys Ala Gly Gln His Pro Thr Ala Ser Gly Val His
65 70 75 80
Gly Ile Phe Leu Ser His Ile Arg Gly Gly His Gly Phe Glu Ile Gly
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Ile Ser Gln Glu Pro Phe Asp Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Tyr Leu His
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Lys Ala Thr Asn Gly Asn Thr Asn Ala Thr Ala Arg Leu Arg Ile Cys
115 120 125
Gln Phe Pro Ser Ile Lys Thr Leu Gly Pro Ala Ala Asn Asn Asp Val
130 135 140
Thr Thr Gly Arg Asn Cys Leu Phe Asn Lys Ala Ile Pro Ala His Met
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Val Phe Ser Asp Lys Ile Tyr Tyr Phe Tyr Phe Lys Asn Asp Trp Ser
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195 200 205
Val Tyr Glu Pro Thr Tyr Tyr Ile Leu Asn Val Thr Ser Ala Gly Glu
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr
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660 665 670
His His His His
675
<210> 6
<211> 2031
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgtacagga tgcagctgct gtcctgtatc gccctgatcc tggccctggt gaccaattct 60
ctgccacagg acgtgaccag gtgcacagca aacaccaatt tccggagatt cttttctaag 120
tttaacgtgc aggcaccagc agtggtggtg ctgggaggat acctgccaat cggcgagaat 180
cagggcgtga actccacatg gtattgtgca ggacagcacc ctaccgcaag cggagtgcac 240
ggcatcttcc tgtcccacat caggggcggc cacggcttcg agatcggcat ctctcaggag 300
ccatttgacc ccagcggcta ccagctgtat ctgcacaagg ccacaaacgg caatacaaac 360
gccaccgcca ggctgcgcat ctgtcagttc cctagcatca agaccctggg cccagccgcc 420
aacaatgatg tgaccacagg ccgcaattgc ctgtttaaca aggccatccc agcccacatg 480
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gtgagcaagt ctcaggactc caattgccct ttcaccctgc agtctgtgaa cgattatctg 1020
agcttctcca agttttgcgt gagcaccagc ctgctggcaa gcgcctgcac catcgacctg 1080
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caggacgtgg atggcacatt ctttctgtat tccaagctgg ccgtggacaa ggccagatgg 1920
gatcacggcg agaccttcga gtgcgccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacaca 1980
cagaagtcca tctctaagac ccagggcaag caccaccacc accaccactg a 2031

Claims (8)

1.一种重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
2.根据权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白是利用真核表达系统外源表达具有SEQ ID NO.6所示DNA序列的重组基因得到的重组蛋白。
3.根据权利要求1所示的重组蛋白，其特征在于：所述重组蛋白是利用哺乳动物细胞表达系统外源表达具有SEQ ID NO.6所示DNA序列的重组基因得到的重组蛋白。
4.权利要求1～3中任一项所述的重组蛋白的应用，其特征在于：所述重组蛋白用于制备猪流行性腹泻病毒疫苗。
5.一种猪流行性腹泻疫苗组合物，其特征在于：所述疫苗组合物包含权利要求1～3中任一项所述的重组蛋白以及药学上可接受的佐剂。
6.根据权利要求5所述的猪流行性腹泻疫苗组合物，其特征在于：所述佐剂是弗氏佐剂或层状双金属氢氧化物佐剂。
7.根据权利要求6所述的猪流行性腹泻疫苗组合物，其特征在于：所述疫苗组合物由所述重组蛋白与所述层状双金属氢氧化物佐剂按1:4的质量比混合并乳化制备而成。
8.根据权利要求6所述的猪流行性腹泻疫苗组合物，其特征在于：所述疫苗组合物由所述重组蛋白与所述弗氏佐剂按1:1的体积比混合并乳化制备而成。
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