CN115364207A - 用于防治牛病毒性腹泻病的疫苗组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于防治牛病毒性腹泻的疫苗组合物，该疫苗组合物包括牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白和药学上可接受的佐剂。重组的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白优选是通过HEK‑293细胞外源表达E2蛋白编码基因得到的蛋白，或者是通过HEK‑293细胞外源表达具有牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码序列的融合基因得到的蛋白，融合基因包括所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码序列以及位于牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码序列下游的编码牛源IgG Fc的DNA序列。本发明制备的亚单位疫苗适合用于经鼻腔喷雾方式施用，能够有效诱导犊牛产生免疫应答，不仅可以产生局部黏膜免疫，还可以产生系统免疫，具有良好的免疫原性和免疫保护效果。

Description

用于防治牛病毒性腹泻病的疫苗组合物及其制备方法
技术领域
本发明属于兽用生物制品的技术领域，具体涉及用于防治牛病毒性腹泻病的疫苗组合物及其制备方法。
背景技术
牛病毒性腹泻,又称牛病毒性腹泻-粘膜病(Bovine viral diarrhea-mucosaldisease，BVD-MD)，是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV) 引起的一种急性、接触性传染病。感染牛、羊、猪、鹿、骆驼及其他野生动物，甚至还有感染人的报道，宿主相当广泛。
世界动物卫生组织(OIE)将其认定为B类传染病。《牛病毒性腹泻病毒中国流行病学调研》结果显示，超过46.7％的牛场BVDV抗原检测为阳性，牛群中BVDV持续性感染率为2.2％，感染严重程度远远高于亚洲多数国家，同时也比欧美国家的普遍感染率要高；并且其基因型也日趋多样与复杂，给我国养牛业的持续发展构成巨大威胁，应采取相应的措施对该病进行防控。
发明内容
本发明的目的一方面在于提供一种用于防治牛病毒性腹泻的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括牛病毒性腹泻病毒的E2蛋白和药学上可接受的佐剂。
优选地，所述重组的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白是通过HEK-293、HEK-293T、 HEK-293E、HEK-293F、HEK-293H、HEK-293S、CHO、BHK、COS、SP2/0中任一种或多种细胞系外源表达的重组E2蛋白。
进一步优选地，所述重组的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白是通过HEK-293细胞外源表达E2蛋白编码基因得到的蛋白，所述E2蛋白编码基因包括SEQ ID No.1 所示的DNA序列。
进一步优选地，所述重组的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白是通过HEK-293细胞外源表达具有牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码序列的融合基因得到的蛋白，所述融合基因包括所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码序列以及位于所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码序列下游的编码牛源IgG Fc的DNA序列。
进一步优选地，所述牛源IgG Fc是牛源IgG1 Fc和/或牛源IgG3 Fc。
进一步优选地，所述融合基因具有SEQ ID No.2所示的DNA序列。
进一步优选地，所述疫苗组合物中的E2蛋白浓度为50μg/ml～500μg/ml。
进一步优选地，所述疫苗组合物是经鼻腔施用的疫苗或者经肌肉注射施用的疫苗。
本发明还提供一种用于防治牛病毒性腹泻的疫苗组合物的制备方法，所述方法包括：步骤S1，利用重组质粒载体在细胞中进行外源性表达获得重组的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白；以及，步骤S2，将所述重组的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白与药学上可接受的佐剂混合乳化制备得到所述疫苗组合物。
进一步优选地，在步骤S1，利用携带具有SEQ ID No.1所示DNA序列的重组基因的重组质粒载体pcDNA3.1-BVDV-tE2在HEK-293细胞中表达获得所述重组的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白，或者利用携带具有SEQ ID No.2所示DNA序列的融合基因的重组质粒载体pcDNA3.1-BVDV-tE2Fc在HEK-293细胞中表达获得所述重组的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白。
本发明制备的亚单位疫苗适合用于经鼻腔喷雾方式施用，能够有效诱导犊牛产生免疫应答，不仅可以产生局部黏膜免疫，还可以产生系统免疫，具有良好的免疫原性和免疫保护效果，尤其是由包括BVDV E2蛋白片段与牛源IgG Fc片段的融合蛋白制备的亚单位疫苗的免疫效果更为显著。
附图说明
图1是实施例1构建的重组质粒载体pcDNA3.1-BVDV-tE2的图谱。
图2示意性示出了重组质粒载体pcDNA3.1-BVDV-tE2中所携带的重组基因的表达产物的结构组成。
图3是实施例3构建的重组质粒载体pcDNA3.1-BVDV-tE2Fc的图谱。
图4示意性示出了重组质粒载体pcDNA3.1-BVDV-tE2Fc中所携带的重组基因的表达产物的结构组成。
图5A示出了通过SDS-PAGE法对纯化的重组质粒载体 pcDNA3.1-BVDV-tE2Fc表达产物进行鉴定的结果；图5B示出了通过SDS-PAGE 法对纯化的重组质粒载体pcDNA3.1-BVDV-tE2表达产物进行鉴定的结果。
图6A示出了通过蛋白免疫印迹法(Western blotting)利用抗BVDV E2抗体对纯化的重组质粒载体pcDNA3.1-BVDV-tE2Fc表达产物进行鉴定的结果；图6B 示出了通过蛋白免疫印迹法(Western blotting)利用抗BVDV E2抗体对纯化的重组质粒载体pcDNA3.1-BVDV-tE2表达产物进行鉴定的结果。
图7A示出了通过间接免疫荧光法(IFA)鉴定重组质粒载体pcDNA3.1-BVDV-tE2中所携带的重组基因在HEK293细胞中的表达情况的结果；图7B示出了通过间接免疫荧光法(IFA)鉴定重组质粒载体 pcDNA3.1-BVDV-tE2Fc中所携带的融合基因在HEK293细胞中的表达情况的结果。
图8示出了实施例5中各组犊牛血清中BVDV特异性中和抗体滴度的检测结果。
图9示出了实施例5中通过ELISA检测各组犊牛血清中BVDV特异性抗体水平的结果。
图10A示出了实施例5中通过ELISA检测血清中IgA水平的结果；图10B 示出了实施例5中通过ELISA检测犊牛鼻拭子与粪便的混合样品中的sIgA水平的结果。
图11A示出了实施例5中使用流式细胞仪测定分泌IFN-γ的CD4+T细胞占比值的结果；图11B示出了实施例5中使用流式细胞仪测定分泌IFN-γ的CD8+T 细胞占比值的结果。
图12示出了实施例5中对各组犊牛淋巴细胞增殖情况进行检测的结果。
图13A示出了实施例5中通过双抗体夹心ELISA法检测细胞因子IFN-γ的结果，图13B示出了实施例5中通过双抗体夹心ELISA法检测细胞因子IL-2的结果，图13C示出了实施例5中通过双抗体夹心ELISA法检测细胞因子IL-4的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1：构建用于表达重组E2蛋白的重组质粒载体
本实施例构建一种能表达截短的重组BVDV E2蛋白的重组质粒载体。
以发明人所在实验室分离并保存的BVDV XZ02株为模板获取cDNA，然后利用专门设计的引物以该cDNA作为模板进行PCR获取能编码重组E2蛋白的基因片段。所用的引物序列为F：5’-GGATCCGCCACCATGTACCGGATGCA-3’和R：5’-CTCGAGCTAGTGATGGTGATGGTGATGAGAGCCCGATCC-3’，扩增获得的基因片段5’端具有IL-2信号肽序列，以便有利于表达产物分泌到细胞上清液中。
PCR反应体系如下表1所示。
表1
Figure RE-GDA0003882993480000041
反应程序为：98℃，2min；循环反应30次，循环条件为98℃15s，60℃15s， 72℃1kb/min；72℃，5min；4℃，保存。
将PCR扩增产物进行回收，用限制性内切酶BamHI/XhoI进行消化，同时将pCDNA3.1质粒载体也用限制性内切酶BamHI/XhoI进行消化。用DNA快速回收试剂盒回收酶切产物DNA，回收的具体步骤和注意事项参考产品北京天根生物有限公司说明书。
接下来，通过T4连接酶将以上经限制性内切酶消化后得到的基因片段和pCDNA3.1质粒载体片段进行连接反应，反应体系如表2所示。
表2
Figure RE-GDA0003882993480000042
接下来将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，过挑菌、质粒提取、酶切与测序鉴定证实重组质粒载体构建成功，得到用于制备重组E2蛋白的重组质粒载体，命名为pcDNA3.1-BVDV-tE2，其图谱如图1所示。图2示意性地示出了重组质粒载体pcDNA3.1-BVDV-tE2中所携带的重组基因的表达产物的结构，其从N端到C端依次包括IL-2信号肽序列、截短的E2蛋白序列和6×His标签序列，该重组蛋白的编码序列是SEQ ID No.1所示的DNA序列。
实施例2：重组E2蛋白的制备
将实施例1构建的重组质粒载体pcDNA3.1-BVDV-tE2转染HEK293细胞(来源于珠海恺瑞生物科技有限公司)，过程如下。
1)、转染前细胞培养
将置于三角瓶中的悬浮HEK-293细胞放入5％CO2恒温摇床中，于37℃、120rpm下恒温震荡培养。当密度达到3～6×106个/ml的高活率时进行稀释传代培养，使其密度为0.3×106个/ml。每培养3天传代一次。
2)、转染细胞的准备
当细胞传代3天后、密度为2～4×106个/ml时(此时细胞生长处于指数期) 加入新鲜的KOP293培养液(来源于珠海恺瑞生物科技有限公司，货号为 M21201121A)，调整细胞密度为2×106个/ml，摇瓶置于5％CO2恒温摇床中，于37℃、120rpm下恒温震荡培养10min后进行转染。
3)、瞬时转染
a.准备两支15ml无菌离心管，一支加入5ml的KPM(珠海恺瑞生物科技有限公司，货号为R21208104A)和100μg无菌质粒DNA并轻柔混匀，另一支加入5ml的KPM和500μl的TA-293转染试剂(来源于珠海恺瑞生物科技有限公司，货号为R21203109A)并轻柔混匀；
b.将上述另一支离心管中含有转染试剂的液体混合物全部转移至含质粒的离心管中，轻柔混匀，室温下静置10分钟形成质粒-载体复合物；
c.从恒温摇床中取出100ml/瓶的细胞悬液(细胞密度为2×106个/ml)，边摇边加入制备好的质粒-载体复合物，放回CO2恒温摇床中震荡培养，为防止细菌污染，3小时后加入1％抗生素到细胞瓶内；
d.为了提高蛋白表达量，转染24小时后同时加入600μl的KE-293(来源于珠海恺瑞生物科技有限公司，货号为R21204109A)和2ml的KT-Feed(50×) (来源于珠海恺瑞生物科技有限公司，货号为M21210105A)，转染后第6天收获细胞并测定蛋白表达情况。
通过间接免疫荧光法(IFA)鉴定HEK293细胞中重组E2蛋白的表达情况。将转染后24小时的细胞铺到6孔板内，继续培养3天。用4％的多聚甲醛按400μL/ 孔的量将6孔板内的细胞在室温下固定20min。固定结束后，用PBS洗涤细胞3 次，每次5min。接下来，进行封闭，封闭液为含2％BSA的PBST，将封闭液加入到6孔板内，37℃下作用1h。
之后进行一抗孵育，所用的一抗为His单抗(来源于Abbkine公司，货号为ATUOC0902)，用含2％BSA的PBST按1:500的比例稀释His单抗，加入到6 孔板内后于37℃下作用1h，然后用PBS洗涤3次,每次5min。
接下来，进行二抗孵育，所用的二抗是FITC山羊抗鼠IgG(来源于ABclonal 公司，货号为9300001001)，将二抗用1％BSA的PBST按1:3000的比例稀释后加入到6孔板内并于37℃下作用1h，然后用PBST洗涤4次，每次5min。
接下来，用DAPI染料进行细胞核染色，加入DAPI染料后室温下作用10min，然后用PBST洗涤4次,每次洗5min。荧光显微镜下观察拍照，结果如图7A所示，结果显示，重组质粒载体pcDNA3.1-BVDV-tE2中所携带的重组基因在293 细胞中成功表达。
接下来，利用6×His标签序列对表达产物进行纯化，过程如下。
将生长表达6天的HEK293悬浮细胞于4℃、7000rpm下离心30min，收集上清，10000rpm、4℃离心30min。将离心后的上清用0.22μm的滤器过滤。用40ml PBS平衡镍柱，用上样泵使目的蛋白结合到镍柱，流速为1ml/min，整个过程在 4℃恒温下进行。
上样结束后在纯化仪上洗脱蛋白，洗脱程序为：先用100％Buffer A以1 mL/min的流速洗脱20mL，再用4～30％Buffer B1以0.8mL/min的流速洗脱200 mL，接着用100％Buffer B1以0.8mL/min的流速洗脱20mL。
将洗脱后含咪唑的蛋白装入处理过的透析袋内密封，透析袋放入2L的PBS 中透析过夜。用0.22μm低蛋白结合滤器对透析后的蛋白进行过滤除菌。采用BCA 法测得蛋白浓度为1mg/ml，采用HPLC方法测得蛋白纯度为95％以上。
通过SDS-PAGE法以及以His单抗为一抗、HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗的蛋白质免疫印迹实验对纯化后蛋白的蛋白进行鉴定检验。SDS-PAGE电泳结果如图5B所示，蛋白质免疫印迹实验的结果如图6B所示，结果显示，293细胞中所表达并纯化得到的重组E2蛋白的条带大小与预期分子量大小一致，约为 45KDa。
将上述制备的重组蛋白分装并存放于-80℃。
实施例3：构建用于表达融合蛋白E2Fc的重组质粒载体
本实施例构建一种携带融合基因的重组质粒载体，用于表达包括BVDV E2 蛋白和牛IgG1 Fc片段的融合蛋白。通过人工合成(委托北京擎科生物科技有限公司合成)的方式制备融合基因，其中，BVDV E2蛋白编码序列与牛IgG1 Fc 片段编码序列通过柔性肽(linker)和铰链区(Hinge)连接。此外，为了有利于表达产物分泌到细胞上清液中，融合基因的5’端添加有IL-2信号肽序列；为了便于表达产物的回收和纯化，融合基因的3’端添加6×His标签序列。该融合基因具有SEQ ID No.2所示的DNA序列。
图4示意性地示出了该融合基因所编码的融合蛋白的结构组成，具体地，从 N端到C端依次包含IL-2信号肽序列、BVDV E2蛋白、柔性肽、铰链区、牛IgG1 Fc片段中的CH2和CH3以及6×His标签序列。
将人工合成得到的融合基因用限制性内切酶BamHI/XhoI进行消化，同时将pCDNA3.1质粒载体也用限制性内切酶BamHI/XhoI进行消化。用DNA快速回收试剂盒回收酶切产物DNA，回收的具体步骤和注意事项参考产品北京天根生物有限公司说明书。
接下来，通过T4连接酶将以上经限制性内切酶消化后得到的基因片段和pCDNA3.1质粒载体片段进行连接反应，反应体系如表3所示。
表3
Figure RE-GDA0003882993480000071
接下来将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，过挑菌、质粒提取、酶切与测序鉴定证实重组质粒载体构建正确，得到用于制备重组E2蛋白的重组质粒载体，命名为pcDNA3.1-BVDV-tE2Fc，其图谱如图3所示。
实施例4：融合蛋白E2Fc的制备
将实施例3构建的重组质粒载体pcDNA3.1-BVDV-tE2Fc转染HEK293细胞 (来源于珠海恺瑞生物科技有限公司)，过程如下。
1)、转染前细胞培养
将置于三角瓶中的悬浮HEK-293细胞放入5％CO2恒温摇床中，于37℃、 120rpm下恒温震荡培养。当密度达到3～6×106个/ml的高活率时进行稀释传代培养，使其密度为0.3×106个/ml。每培养3天传代一次。
2)、转染细胞的准备
当细胞传代3天后、密度为2～4×106个/ml时(此时细胞生长处于指数期) 加入新鲜的KOP293培养液，调整细胞密度为2×106个/ml，摇瓶置于5％CO2恒温摇床中，37℃、120rpm下恒温震荡培养10min后进行转染。
3)、瞬时转染
a.准备两支15ml无菌离心管，一支加入5ml的KPM和100μg无菌质粒DNA 并轻柔混匀，另一支加入5ml的KPM和500μl的TA-293转染试剂并轻柔混匀；
b.将上述另一支离心管中含有转染试剂的液体混合物全部转移至含质粒的离心管中，轻柔混匀，室温下静置10分钟形成质粒-载体复合物；
c.从恒温摇床中取出100ml/瓶的细胞悬液(细胞密度为2×106个/ml)，边摇边加入制备好的质粒-载体复合物，放回CO2恒温摇床中震荡培养，为防止细菌污染，3小时后加入1％抗生素到细胞瓶内；
d.为了提高蛋白表达量，转染24小时后同时加入600μl的KE-293和2ml 的KT-Feed(50×)，转染后第6天收获细胞并测定蛋白表达情况。
通过间接免疫荧光法(IFA)鉴定融合蛋白E2Fc在HEK293细胞中的表达情况。将转染后24小时的细胞铺到6孔板内，继续培养3天。用4％的多聚甲醛按400μL/孔的量将6孔板内的细胞在室温下固定20min。固定结束后，用PBS 洗涤细胞3次，每次5min。接下来，进行封闭，封闭液为含2％BSA的PBST，将封闭液加入到6孔板内，37℃下作用1h。
之后进行一抗孵育，所用的一抗为His单抗(来源于Abbkine公司，货号为ATUOC0902)，用含2％BSA的PBST按1:500的比例稀释His单抗，加入到6 孔板内后于37℃下作用1h，然后用PBS洗涤3次,每次5min。
接下来，进行二抗孵育，所用的二抗是FITC山羊抗鼠IgG(来源于ABclonal，货号为9300001001)，将二抗用1％BSA的PBST按1:300的比例稀释后加入到 6孔板内并于37℃下作用1h，然后用PBST洗涤4次，每次5min。
接下来，用DAPI染料进行细胞核染色，加入DAPI染料后室温下作用10min，然后用PBST洗涤4次,每次洗5min。荧光显微镜下观察拍照，结果如图7B所示，结果显示，重组质粒载体pcDNA3.1-BVDV-tE2Fc中所携带的重组基因在293 细胞中成功表达。
接下来，利用6×His标签序列对表达产物进行纯化，过程如下。
将生长表达6天的HEK293悬浮细胞于4℃、7000rpm下离心30min，收集上清，10000rpm、4℃离心30min。将离心后的上清用0.22μm的滤器过滤。用 40ml PBS平衡镍柱，用上样泵使目的蛋白结合到镍柱，流速为1ml/min，整个过程在4℃恒温下进行。
上样结束后在纯化仪上洗脱蛋白，洗脱程序为：先用100％Buffer A以1 mL/min的流速洗脱20mL，再用4～30％Buffer B1以0.8mL/min的流速洗脱200 mL，接着用100％Buffer B1以0.8mL/min的流速洗脱20mL。
将洗脱后含咪唑的蛋白装入处理过的透析袋内密封，透析袋放入2L的PBS 中透析过夜。用0.22μm低蛋白结合滤器对透析后的蛋白进行过滤除菌。采用BCA 法测得蛋白浓度为3mg/mL(用PBS稀释为1mg/ml备用)，采用HPLC方法测得蛋白纯度为95％以上。
通过SDS-PAGE法以及以His单抗为一抗、HRP标记的羊抗鼠IgG为二抗的蛋白质免疫印迹实验对纯化后蛋白的蛋白进行鉴定检验。SDS-PAGE电泳结果如图5A所示，蛋白质免疫印迹实验的结果如图6A所示，结果显示，在293细胞中所表达并纯化得到的融合蛋白E2Fc的条带与预期分子量大小一致，约为 80KDa。
将上述制备的融合蛋白用PBS稀释为1mg/ml，分装并储存于-80℃。
实施例5：亚单位疫苗的制备和免疫试验
1、疫苗制备
用实施例2制备的重组E2蛋白和实施例4制备的融合蛋白E2Fc以及IMS 1313VG佐剂(Seppic，法国)分别制备两种亚单位疫苗。
具体方法如下：取200ul上述实施例1所制备的蛋白溶液(蛋白浓度为 1mg/ml)与300ul的PBS混合，再与500ul的IMS 1313VG佐剂混合并乳化制备成亚单位疫苗。质检合格后置于4℃保存。最终制得的两种亚单位疫苗中的蛋白终浓度分别为200μg/ml。
筛选4月龄犊牛共计25头，使用市售的bvdv-E0及bvdv-E2抗体检测试剂盒(来源于江苏菲亚生物科技有限公司)检测确认所有犊牛的血清中抗体为阴性。将犊牛分为5组，每组5头，各组中的每头犊牛分别进行两次免疫，具体免疫方案如下表4所示，PBS溶液作为免疫试验的阴性对照。
表4
Figure RE-GDA0003882993480000091
Figure RE-GDA0003882993480000101
注：E2--重组E2蛋白制成的亚单位疫苗；E2Fc--融合蛋白E2Fc制成的亚单位疫苗；
N--鼻腔喷雾；IM--肌肉注射
在初次免疫前(第1天)、第二次免疫前(第21天)、第二次免疫后1周 (第28天)、第二次免疫后2周(第35天)、第二次免疫后3周(第42天) 和第二次免疫后4周(第49天)分别采集血样，并检测血样中的抗体水平。
2、抗体检测
首先，对血清中的中和抗体滴度进行了检测。
从第二次免疫后1周(第28天)和第二次免疫后3周(第42天)采集的血样中分离血清，将分离得到的血清于56℃水浴灭活30min后进行中和试验。
先将灭活完全的血清进行2-1至2-12倍比稀释，再将每个稀释度的每组血清按50μl/孔的量分别加入96孔板中，每个平行组设3个重复，然后将BVDV XZ02 株病毒按50μl/孔的量加入含100个TCID50病毒的溶液，轻轻振荡混匀，放置于 37℃反应1h。接下来将MDBK细胞的悬液(细胞密度为5×105个/ml)按照100μl/ 孔的量加入96孔板中，振荡混匀后放入37℃、5％CO2培养箱孵育72h，之后吸出培养基，用丙酮固定20分钟，然后用PBS漂洗3次，吸干，一抗孵育，用含 2％BSA的PBST按1:300的比例稀释E2抗体，37℃作用1h(来源于USBiological，货号为L19071007)。二抗孵育用1％BSA的PBST按1:3000的比例稀释FITC山羊抗鼠IgG(来源于Abclonal，货号为9300001001)37℃作用1h进行染色检测。结果如图8所示，结果显示，经鼻腔喷雾施用(即，粘膜免疫)的融合蛋白E2Fc 亚单位疫苗的中和抗体效价为1:64，效果要优于经肌肉注射施用的亚单位疫苗组。
为了研究上述两种亚单位疫苗引起的体液免疫应答，通过ELISA法对上述采集的血样中的BVDV特异性抗体进行检测。采用商品化试剂盒来进行检测，从室温平衡20min后的铝箔袋中取出包被有牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的微孔板，依次加入标准品和待测样本各50μL，然后每孔加入辣根过氧化物酶(HRP) 标记的检测抗体100μL，用封板膜密封后于37℃恒温箱温育60min。洗涤5次后每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。每孔加入终止液50μL，在 450nm波长处测定各孔的OD值。
结果如图9所示，结果显示，初次免疫前6组犊牛的血清中抗BVDV抗体均为阴性。在初次免疫后的第21天，重组E2蛋白组和融合蛋白E2Fc组的抗体水平显著高于阴性对照组，尤其以经鼻腔喷雾方式施用的融合蛋白E2Fc组(即，第4组)的抗体水平最高。在第二次免疫后2周(即，第35天)和第二次免疫后4周(即，第49天)，施用亚单位疫苗的各组犊牛的血清中抗体水平均显著高于阴性对照组，经鼻腔喷雾方式施用的两组尤其更高，且鼻腔喷雾方式施用的融合蛋白E2Fc组的抗体水平最高。以上结果表明，由重组E2蛋白和融合蛋白 E2Fc制备得到的两种亚单位疫苗均能很好地诱导体液免疫应答，且两种亚单位疫苗均适合用于经鼻腔喷雾方式施用，都具有优异的免疫原性，由融合蛋白E2Fc 制备的亚单位疫苗免疫原性尤其更优。
为了评估犊牛血清中IgA的分泌水平以及粘膜免疫应答效果，在第二次免疫后第14天采集各组犊牛的鼻拭子、粪便及血清样品，用牛免疫球蛋白AELISA 试剂盒检测这些样品中IgA的表达，用牛分泌型免疫球蛋白AELISA试剂盒检测样品中的sIgA。结果如图10A和图10B所示，结果显示，重组E2蛋白组和融合蛋白E2FC组的鼻拭子与粪便的混合样品以及血清中的IgA、sIgA水平明显高于阴性对照组，融合蛋白E2Fc组尤其更高。该结果表明，不管是肌肉注射还是经鼻腔喷雾方式施用，本发明所制备的亚单位疫苗都能够诱导犊牛的粘膜免疫应答，由融合蛋白E2Fc制备的亚单位疫苗的效果尤其更优。
IFN-γ由T细胞和NK细胞分泌，是Th1型细胞因子，其介导细胞免疫，对于清除病毒至关重要。采集各组犊牛的外周血单个核细胞(PBMC)并从中分离淋巴细胞，随后用灭活的BVDV对淋巴细胞进行刺激。使用流式细胞仪测定分泌IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞的占比值。结果如图10A和图10B所示，结果显示，与阴性对照组相比，病毒刺激后融合蛋白E2Fc组和重组E2蛋白组分泌IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞均表现出增加，且经鼻腔喷雾方式施用的融合蛋白E2Fc 组的CD4+CD8+T细胞比值显著高于经鼻腔喷雾方式施用的重组E2蛋白组。这一结果表明，融合蛋白E2FC和重组E2蛋白均能够产生针对BVDV的特异性T 细胞免疫应答(Th1型)，且经鼻腔喷雾方式施用的融合蛋白E2Fc亚单位疫苗的所产生的特异性T细胞免疫应答效果更优。
为了进一步研究本发明的亚单位疫苗对细胞免疫应答的影响，还对淋巴细胞的增殖情况进行了检测。免疫后第42天从各组犊牛采集抗凝血，将细胞计数后用含10％FBS的1640培养液稀释成细胞浓度为1×106个/mL的细胞悬液，按每孔100μL的量加入96孔板中。每个样品分别用紫外线照射灭活的BVDV作刺激原、刀豆素(阳性对照)和培养液(阴性对照)进行刺激，且每种刺激物设置 3个重复实验孔。将细胞板放入5％CO2温箱中培养72h。按照细胞增殖检测试剂盒(来自上海尚宝生物科技有限公司)的说明书，向每孔加入10μLMTS，混匀后继续培养1h。用自动酶标检测仪测定OD490值，取各平行孔的OD490值的平均值来计算用于判断淋巴细胞增殖滴度的刺激指数(Stimulation Index，SI)。 SI值的计算：刺激指数(SI)＝(样品的OD490-空白对照的OD490)/(阴性样品的 OD490-空白对照的OD490)。
结果如图12所示，结果显示，与阴性对照组相比，所有亚单位疫苗组的刺激指数(SI)都显著升高，经鼻腔喷雾方式免疫的融合蛋白E2Fc组具有比经鼻腔喷雾方式免疫的重组E2蛋白组更高的刺激指数。这一结果表明，上述两种亚单位细胞均能很好地刺激犊牛的细胞免疫应答，尤其经鼻腔喷雾方式免疫的融合蛋白E2Fc亚单位疫苗效果更优。
基于IFN-γ和IL-2由Th1细胞反应所诱导，而IL-4由Th2细胞反应所诱导，为了进一步研究犊牛经本发明的亚单位疫苗免疫后细胞免疫应答的情况，使用商品化的牛IFN-γ、IL-2、IL-4双抗体夹心ELISA试剂盒来测定抗原刺激后脾淋巴细胞上清中Th1和Th2型细胞因子的含量。结果如图13A～图13C所示，结果显示，在免疫后第42天，经本发明的亚单位疫苗免疫的各组犊牛的IFN-γ、IL-2 分泌量均显著高于阴性对照组，但IL-4分泌量与阴性对照组相比差异不显著。这一结果表明本发明的亚单位疫苗主要诱导Th1型免疫应答。
以上通过实施例对本发明的具体实施方式进行了详细的说明，但本发明的保护范围并不受限于此。在实现本发明目的的前提下，本领域技术人员能对本发明的技术方案做出各种改变和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 华中农业大学
<120> 用于防治牛病毒性腹泻病的疫苗组合物及其制备方法
<130> HZAU2022-01
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1146
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ggatccgcca ccatgtaccg gatgcagctg ctgagctgta tcgccctgag cctggccctg 60
gtgaccaaca gcatgctgcc cgcctgcaag cccgacttca gctacgccat cgccaagaac 120
aacgagatcg gccccctcgg cgccaccgga ctgactacac agtggtacga atatagcgac 180
ggcatgagac tgcaagacac cgaggtggtc gtgtggtgca aggatggcga gataaagtac 240
ctgatcacat gcgaaagaga agccagatat ctggcaatac tgcacacccg ggcactgccc 300
acctccgtcg tgtttgagaa aattataaag ggcaaggagc aggaggacgt cgtggagatg 360
gacgacgact tcgagtttgg actgtgcccc tgcgacgcca agccactcgt tagaggcaag 420
tttaacacca ccctgctgaa cggccccgct ttccagatgg tgtgccccat tggatggacc 480
ggcaccgtga gctgcgcact cgccaacaag gacaccctcg ccctgaccgt ggtgagaacc 540
tacaccagac acaaaccatt tccctaccgc caaggctgta tcacccagaa gactatcgga 600
gaagatctgt acaactgcga cctcggcgga aactggacct gcatccccgg cgaccaactc 660
agatacgtcg acggccccgt cgaaagctgc aagtggtgcg gctataactt ctacaagagc 720
gagggcctgc cccacttccc tattggaaag tgcaaactga agaacgagtc tggctacaga 780
caggtggacg agaccagttg caacagagac ggcgttgcta tcgtgctgca cggcagggtg 840
aaatgcaaga tcggcgacac cgtggtgcag gtgatagcaa tggacgacag actcggaccc 900
atgccctgta taccccacga gatcattcct tccgagggcc ccgttgagaa aacagcctgc 960
accttcaact ataccaaaac cctgaagaat aagtactacg agcccagaga caactacttc 1020
caacagtaca tgctcaaggg cgagtaccag tactggttcg acctggaagt gaccgaccac 1080
cacaaggact acttcgccga aagcctgggc agcggcagtc accaccacca ccatcactga 1140
ctcgag 1146
<210> 2
<211> 1869
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctcgaggcca ccatgtaccg gatgcagctg ctgagctgta tcgccctgag cctggccctg 60
gtgaccaaca gcatgctgcc cgcctgcaag cccgacttca gctacgccat cgccaagaac 120
aacgagatcg gccccctcgg cgccaccgga ctgactacac agtggtacga atatagcgac 180
ggcatgagac tgcaagacac cgaggtggtc gtgtggtgca aggatggcga gataaagtac 240
ctgatcacat gcgaaagaga agccagatat ctggcaatac tgcacacccg ggcactgccc 300
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cagaaaagca cctccaagtc cgccggcaag ggcagcggca gtcaccacca ccaccatcac 1860
tgactcgag 1869

Claims (10)

1.一种用于防治牛病毒性腹泻的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物包括重组的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白和药学上可接受的佐剂。
2.根据权利要求1所述的用于防治牛病毒性腹泻的疫苗组合物，其特征在于，所述重组的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白是通过HEK-293、HEK-293T、HEK-293E、HEK-293F、HEK-293H、HEK-293S、CHO、BHK、COS、SP2/0中任一种或多种细胞系外源表达的重组E2蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的用于防治牛病毒性腹泻的疫苗组合物，其特征在于，所述重组的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白是通过HEK-293细胞外源表达E2蛋白编码基因得到的蛋白，所述E2蛋白编码基因包括SEQ ID No.1所示的DNA序列。
4.根据权利要求1或2所述的用于防治牛病毒性腹泻的疫苗组合物，其特征在于，所述重组的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白是通过HEK-293细胞外源表达具有牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码序列的融合基因得到的蛋白，所述融合基因包括所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码序列以及位于所述牛病毒性腹泻病毒E2蛋白编码序列下游的编码牛源IgG Fc的DNA序列。
5.根据权利要求4所述的用于防治牛病毒性腹泻的疫苗组合物，其特征在于，所述牛源IgG Fc是牛源IgG1 Fc和/或牛源IgG3 Fc。
6.根据权利要求4所述的用于防治牛病毒性腹泻的疫苗组合物，其特征在于，所述融合基因具有SEQ ID No.2所示的DNA序列。
7.根据权利要求1所述的用于防治牛病毒性腹泻的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物中的E2蛋白浓度为50μg/ml～500μg/ml。
8.根据权利要求1所述的用于防治牛病毒性腹泻的疫苗组合物，其特征在于，所述疫苗组合物是经鼻腔施用的疫苗组合物或者经肌肉注射施用的疫苗组合物。
9.一种用于防治牛病毒性腹泻的疫苗组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
步骤S1，利用重组质粒载体在细胞中进行外源性表达获得重组的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白；以及，
步骤S2，将所述重组的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白与药学上可接受的佐剂混合乳化制备得到所述疫苗组合物。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，在步骤S1，利用携带具有SEQ IDNo.1所示DNA序列的重组基因的重组质粒载体pcDNA3.1-BVDV-tE2在HEK-293细胞中表达获得所述重组的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白，或者利用携带具有SEQ ID No.2所示DNA序列的融合基因的重组质粒载体pcDNA3.1-BVDV-tE2Fc在HEK-293细胞中表达获得所述重组的牛病毒性腹泻病毒E2蛋白。
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