JP5190383B2 - ブタコレラウイルス（ｃｌａｓｓｉｃ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ）に対するキメラワクチン抗原 - Google Patents

Description

本発明は動物の健康に関し、特に、細胞性及び体液性免疫系を刺激することができるタンパク質に結合したブタコレラウイルス（Ｃｌａｓｓｉｃ Ｓｗｉｎｅ Ｆｅｖｅｒ Ｖｉｒｎｓ（ＣＳＦＶ））のウイルスのサブユニットを含みブタにおける該ウイルスに対する強力にして早期の免疫反応を生じる新しいキメラ抗原に関する。

Ｃｌａｓｓｉｃ Ｓｗｉｎｅ Ｆｅｖｅｒ（ＣＳＦ）は、その高い感染性及びその世界的分布のためにブタコレラ（Ｓｗｉｎｅ ｃｈｏｌｅｒａ）としても知られるが、ブタにおける最も重要な病気と考えられ、国際獣疫事務局（ｔｈｅ Ｗｏｒｌｄ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ Ａｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）の通知された疾患リストに含まれている。この疾患の病原体であるＣＳＦＶはＦｌａｖｉｖｕｒｉｄａｅ科のＰｅｓｔｖｉｒｉｓ属のウイルスである。脂質エンベロープを持ち、直径４０から６０ｎｍで正６角形対照性を持ち、遺伝子材料として単純なリボ核酸（ＲＮＡ）鎖を持つことが知られている（Ｋｕｍｍｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｐｅｓｔｖｉｒｕｓｅｓ．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７７：１１７−１２８；Ｍｏｅｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）。Ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｉｇｎｓ ａｎｄ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｓｗｉｎｅ Ｆｅｖｅｒ；ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｎｅｗ Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ．Ｖｅｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ １６５：１１−２０）。

ＣＳＦは非常に伝染し易い疾患であり、急性型では発熱、毛細血管の変性、内臓の壊死を示し、そして死亡する。最初の臨床徴候は２から６日の潜伏期の後に現れ、発熱、運動の減少、食欲不振を生じ、続く数日で悪化し、体温は４２℃に達する。また、白血球減少症を生じ、白血球数の値は８０００／ｍｍ^３血液より少なくなる。またブタは、末期には、結膜炎、便秘、その後の下痢、嘔吐、運動の協調欠如、痙攣及び筋肉の麻痺を生じる。腹部全体、鼻、耳、足の内側に広がった赤い皮膚の色が顕著である。致死例の大部分において、脳の病理組織は、高度の血管新生を伴う非化膿性脳炎を示す（Ｍｏｅｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｇｎｓ ａｎｄ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｓｗｉｎｅ Ｆｅｖｅｒ．Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｎｅｗ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ．Ｖｅｔ．Ｊｏｕｎａｌ １６１：１−１０）。

ＣＳＦＶは、感染の間は免疫抑制物質に似た働きをし（Ｓｕｓａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｓｗｉｎｅ Ｆｅｖｅｒ：Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｈｏｇ Ｃｈｏｌｅｒａ ｖｉｒｕｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１１７１−１１７５）、感染後２から３週間で中和抗体の検出が始まる（Ｌａｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ａ ｃａｌｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｗｅａｎｅｒ ｐｉｇｓ．ＩＩ．Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄａｔａ ｔｏ ｅｓｔｉｍａｔｅ ｔｈｅ ｄａｙ ｏｆ ｖｉｒｕｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｎａｔｕｒａｌ ｏｕｔｂｒｅａｋｓ．Ｖｅｔ．Ｑ．２０：４６−４９）。感染の末期は、循環系並びにリンパ系組織のＢリンパ球の著しい減少を伴う（Ｓｕｓａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）．Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ ｏｆ Ｃｌａｃｃｉｃａｌ Ｓｗｉｎｅ Ｆｅｖｅｒ；Ｂ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｃａｕｓｅｄ ｈｏｇ ｃｈｏｌｅｒｅ ｖｉｒｕｓ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：１１７１−１１７５）。疾患に罹ったブタの大部分は、感染後１０から２０日の間に死亡し、死亡率は９５％に達する。ＣＳＦに特徴的な死後の病変は臓器系の大部分における点状出血を伴う出血性素因に属するものである。それらは、腎臓、膀胱及びリンパ節には規則的に生じるが、脾臓、喉頭、粘膜及び漿液にも現れることがある（Ｍｏｕｗｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８３）．Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｂｕｎｇｅ，Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。

経胎盤感染はＣＳＦの他の臨床形態である；この場合に、ウイルスは妊娠雌ブタの胎盤を通過することができ、胎児に感染する。この感染の結果によって、流産、死産、ミイラ化、奇形、弱いブタの出産及び器官分化の問題などがあり得る。感染が生じた妊娠の時期によっては、雌ブタを介する感染の結果、ＣＳＦＶ免疫耐性の子が生まれることがあり得る（垂直感染）。仔豚は感染を維持し、死ぬまでウイルス血症であり、群れに対する安定したＣＳＦＶ播種病巣となる（Ｍｏｅｎｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｓｉｇｎｓ ａｎｄ Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃａｓｓｉｃａｌ Ｓｗｉｎｅ Ｆｅｖｅｒ；ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｎｅｗ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ：Ｖｅｔ．Ｊｏｕｒｎａｌ １６５：１１−２０）。ＣＳＦに関係する死亡は、被害を受けた国の経済問題であり、開発途上国の経済及び社会状況に損害を及ぼす。このような理由から、ブタの密度が高く、ウイルスの保有率が高い国において、ワクチンに基づく管理プログラムを適用することが必要になっている。ヨーロッパ、米国及びカナダのように、ブタの生産が主として政府により助成させている高度開発諸国では、根絶による撲滅方法が取られている。しかし、コストは非常に高く、そしてこれらの国々では未だ動物間流行病の恐れがある。

欧州連合は、ブタの飼育密度が高く、非ワクチン方針であり、そしてＣＳＦＶが風土病となっている東ヨーロッパの諸国に地理的に隣接しているために、新しいＣＳＦＶ動物流行病の再発の高リスク地域と考えられている。この地域における新しい動物間流行病の出現に関係する一つの問題は、ＣＳＦの地域的感染を有する野生イノシシの存在である（Ｌａｄｄｏｍａｄａ（２０００）Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ＣＳＦ ｉｎ ｗｉｌｄ ｂｏａｒｓ ｉｎ Ｅｕｒｏｐｅ．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂ，７３：１２１−３０）。欧州連合の中で実施されている接触集団全ての公衆衛生的殺処理及び感染地域から疾患の無い地域へのブタ輸送の制限を含む管理の完全なプログラムがあるにも係らず、これらの新しい動物間流行病が出現している（ｖａｎ Ｏｉｒｓｃｈｏｔ（２００３）Ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｓｗｉｎｅ Ｆｅｖｅｒ：ｆｒｏｍ ｌａｂ ｔｏ ｆｉｅｌｄ．Ｖｅｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，９６：３６７−３８４）。したがって、早期にそして安全に免疫応答を誘発し、感染とウイルス伝達の予防を保証するワクチンを開発する必要性は緊急なものである。

完全なウイルスに基づくＣＳＦＶに対するワクチンは開発されている：クリスタルバイオレット又はホルマリン不活化ウイルスを含むワクチン（Ｂｉｒｏｎｔ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｒｅｌａｔｅｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｌｉｅｓｓ Ｂ．Ｍ．Ｅｄ．Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｂｏｓｔｏｎ：１８１−２００）、Ｓｉｎｌａｋ株（Ｂａｉｂｉｋｏｖ ｅｔ ａｌ．ＲＵ２１８２４９５）及びＬａｐｉｎｉｚｉｅｄ Ｃｈｉｎｅｓｅ株（Ｄａｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｓａｆｅｔｙ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ ｏｆ ａ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｓｔｒａｉｎ Ｃ ｖａｃｃｉｎｅ ｏｆ ｈｏｇ ｃｈｏｌｅｒａ／ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｕｉｒｕｓ．Ｂｅｒｌ−Ｍｕｎｃｈ．Ｔｉｅｒａｒｚｔｌ．Ｗｓｃｈ．１０８：２０−２５）のように、ウサギにおいて継代することにより弱毒化したウイルスを含むワクチン、又はウサギ、モルモット及びブタ由来の組織培養により弱毒化されたウイルスを含むワクチン（Ｋａｃｈｉｋｕ ｅｔ ａｌ．ＪＰ７３００１４８４；Ｔｅｒｐｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ａ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ｆｏｒ ｈｏｇ ｃｈｏｌｅｒａ ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｓｔｒａｉｎ．Ｄｉｔｓｈ．Ｔｉｅｒａｒｚｔｌ．Ｗｓｃｈ．９７：７７−７９）。これらタイプのワクチンは、感受性の高い動物に接種されて、新たなＣＳＦ発生を生じる活性ウイルスのフラクションを含む可能性のために、リスクを含んでいる。その上、ある場合には、不活化がウイルスの免疫原性に影響を及ぼすので、予防的免疫応答を得るために反復接種が必要になる。

弱毒化生ワクチンという特別な場合には、それらは部分弱毒化又は毒性の復活を生じる潜在的リスクを持っている。いずれの場合にも、それらは病原性のあるウイルス粒子を生産し、感受性動物に接種されると、感染し、臨床的疾患を生じ、群れにＣＳＦを拡大することができる。このような問題は、このウイルスが非常に感受性の高い胎児に感染することができ、感染した子が疾患を拡大するので、妊娠雌ブタにはより大きなリスクをもたらす。

Ｃ Ｃｈｉｎｅｓｅ株、ＰＡＶ ２５０株、Ｔｈｉｅｒｖａｌ株及びＩＦＦＡ／Ａ−４９株（Ｂｊｏｒｌｕｎｄ，Ｊ ＪＶ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ３’ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ ｖａｃｃｉｎｅ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｖｉｒｕｓ Ｇｅｎｅｓ １６：３０７−３１２．Ｌａｕｎａｉｓ ｅｔ ａｌ．（１９７８）Ｈｏｇ Ｃｈｏｌｅｒａ Ｖｉｒｕｓ；Ａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｉｇｌｅｔｓ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｔｈｉｖｅｒｖａｌ ｓｔｒａｉｎ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ａｎｄ ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｃａｌｏｓｔｒａｌ ｐａｓｓｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｖｅｔ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ３：３１−４３）のような弱毒化が立証されているＣＳＦＶ株に基づくワクチンがある。これらの株は、ワクチンを受けた動物と天然のウイルスに感染した動物の区別を不可能にすると言う不便さがあるために、疾患が風土病である国においてのみ使用される。これらの株によるワクチンを受けた動物は、血清検査において、感染動物と同じ反応を生じる。弱毒化ウイルスに基づくワクチンにより生じる抗ＣＳＦＶ特異的抗体は、ＣＳＦによる感染の診断を妨害する。この診断は、扁桃内の感染ウイルスの免疫検出及び扁桃内に存在するワクチンウイルス株の増幅によって行われる。このため、弱毒株は撲滅プログラムに使用するには不適当である。ＬＫ−ＶＮＩＩＶＶＭ株によるワクチン接種及びＦｒｅｕｎｄのアジュバントを加えて製剤化した精製株Ｓｈｉ−Ｍｙｎｇによる追加超免疫は、他の例である。しかし、４０〜４５箇所の免疫接種は、１日に数百頭の動物にワクチン接種しなければならないワクチン運動では実施不可能である（Ｂａｌａｓｈｏｖａ ｅｔ ａｌ．ＲＵ２１８３９７２）。

ウイルス全体を含むこれらのワクチンによる免疫は、ＣＳＦＶにより生じる感染と、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶと略称）及びボーダー病ウイルス（ＢＤＶと略称）のようなブタに感染しうるＰｅｓｔｖｉｒｕｓ属の他のメンバーによる感染との診断上の区別も妨害する（Ｄａｈｌｅ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｏｓｔ Ｍｏｒｔｅｍ ａｎｄ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ａｆｔｅｒ Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｉｇｓ ｗｉｔｈ Ｈｏｇ Ｃｈｏｌｅｒａ ａｎｄ ＢＶＤ Ｖｉｒｕｓ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｅｔ．３８：７６４−７７２）。

ウイルス全体に基づくワクチンの不便さを避けるためには、サブユニットに基づく変異体又は組換え技術により得られたウイルスタンパク質による、完全に無毒なワクチンを使用するのが適当である。これらのワクチンは、ウイルス株の再導入から群れを保護し、また簡単な血清学的方法によりワクチン接種動物と感染動物の区別を可能にする。この点から、ウイルスサブユニットに基づくワクチンは開発された。それを使用することにより毒性の復活のリスクはなく、診断を妨害しないために、ウイルスエンベロープのＥ２グリコプロテインのようなウイルスタンパク質を含むワクチンは安全である（Ｂｏｕｒｎａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｄｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｏｎｓｅｔ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅｒｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｅ２ ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ ａｇａｉｎｓｔ ｃｌａｓｓｉｃａｌ Ｓｗｉｎｅ Ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ １６：１３７４−１３８１）。作成された抗体はウイルスのセグメントに対してのみ反応するので、これらのワクチンは、感染動物とワクチン接種動物の区別を可能にする。従ってこのワクチンは、ＣＳＦ撲滅プログラムに便利である。

原核生物にＥ２タンパク質を発現するいくつかの組換えワクチン及び該タンパク質の合成ペプチドに基づくワクチンが開発された（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．ＷＯ２００２３２４５３）。これらの場合、タンパク質はグリコシル化されていないので、その免疫原性及び保護能力は十分ではなかった。他のワクチン候補は真核細胞に異種Ｅ２遺伝子を発現させるために、ブタ仮性狂犬病ウイルス（Ｐｅｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ ｓａｆｅ，ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ ｖａｃｃｉｎｅ ｐｒｏｔｅｃｔｓ ｐｉｇｓ ａｇａｉｎｓｔ ｂｏｔｈ Ａｕｊｅｓｚｋｙ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７８：３３１１−３３１５）、天然痘ブタウイルス（Ｇｉｂｂｓ ｅｔ ａｌ．ＵＳ６２１１７８８２）及びブタアデノウイルス（Ｎａｇｙ ｅｔ ａｌ．ＷＯ２００１８３７３７）のようなウイルスベクターを使用する。この場合、野生型ウイルスによるウイルス感染は、同じ血清型のウイルスベクターに対する中和抗体を生産する。したがって、ＣＳＦＶに対する免疫応答の誘発は影響を受ける。また、ブタ仮性狂犬病ウイルス及びブタ天然痘ウイルスに基づくウイルスベクターは、これらのウイルスの根絶が宣言されている国では、規制上の問題により適用できない。また、ワクシニアウイルスはベクターとして使用されたが、世界保健機構の規制はその使用を妨げている（Ｍｅｙｅｅｒｓ ｅｔ ａｌ．ＥＰ１０８７０１４）。

心筋細胞及び骨細胞においてＥ２タンパク質を発現させるための裸のデオキリボ核酸（ＤＮＡ）に基づくワクチンは、裸のＤＮＡによる遺伝子導入の効率が非常に悪いので、反応を誘発するために高濃度のＤＮＡを必要とする不便がある。このワクチンは強い規制管理を受け、その応用は妨げられている（Ａｕｄｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．ＷＯ２０１５２８８８）。

バキュロウイルスにより仲介される昆虫細胞発現系における抗原としてのＥ２−ＣＳＦＶの生産は実現可能な代替方法である（Ｖａｎ−Ｒｊｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｒｋｅｒ ｖａｃｃｉｎｅ ａｎｄ ａｃｃｏｍｐａｎｙｉｎｇ ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔ ｂｏｔｈ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅ２ ｏｆ ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，１７：４３３−４４０；Ｋｒｅｔｚｄｏｒｎ ｅｔ ａｌ．ＵＳ２００４００２８７０１）。このシステムにおいて、組換えＥ２はグリコプロテインとして作成され、グリコシル化されていないアイソフォームに比較して免疫原性を増加させている。バキュロウイルスはさらに不活化され、ブタに対する病原作用は無い。しかし、感染に対する有効な防御は、ワクチン接種３週間後に誘発され、そして子宮内感染に対する防御は完全ではない。したがって、ＣＳＦ予防における重要な問題は、ワクチン接種動物と感染動物の鑑別診断を可能にし、そしてワクチン接種後に早期防御を確立し、妊娠雌ブタから子への経胎盤伝達をなくすることができるサブユニット組換えワクチンがないことである。

発明の説明
本発明は、前記の問題を解決する。この新しいワクチンは、ＣＳＦＶ感染からブタを保護する早期免疫応答を発生させることができる免疫系−刺激分子に結合したウイルスのサブユニットを含むキメラ抗原を含有する。提案された解決策のほかの利点は、キメラ抗原においてウイルスタンパク質と結合した刺激分子の免疫増強作用により、感染妊娠雌ブタからその子へのウイルス伝達を無くすることである。

具体的には、本発明は、主成分としてＣＳＦＶエンベロープのＥ２グリコプロテインを有するＣＳＦに対するキメラ抗原に関する。Ｅ２グリコプロテインの細胞外セグメントが、免疫系刺激タンパク質（本発明の説明において「分子アジュバント」と称する）と結合した免疫原として使用され、早期細胞性免疫応答の刺激及び高いＣＳＦＶ中和抗体力価の誘導の両者を増強する。

本発明の特別な態様において、免疫系刺激タンパク質はアルファインターフェロン又はＣＤ１５４分子の細胞外セグメントである。好ましい態様において、アルファインターフェロン又はＣＤ１５４分子の細胞外セグメントはいずれの哺乳動物に由来しても良い。

キメラタンパク質に基づく本発明のワクチン抗原は、１０^５ＤＬ_５０（ＣＳＦＶ感染動物の５０％が死亡するウイルスの投与量）を投与した場合に、免疫後第１週からワクチン接種したブタの保護を保証する。このような保護はＣＳＦＶに対する強力な細胞免疫応答により仲介され、それはキメラ抗原において結合した要素の組合せに直接関係している。中和抗体誘導の時間減少も観察されており、それはワクチン接種後第２週に現れる。これは、ワクチン接種されたブタにおけるＣＳＦＶに対する保護を増強するのに寄与する。免疫された動物は臨床的疾患の徴候を示さず、該ウイルスのチャレンジ後のいずれの日においてもＣＳＦＶは体液から単離することができなかった。

Ｅ２−分子アジュバントキメラ抗原は、雌ブタからその胎児へのＣＳＦＶの垂直伝達を予防する。これらのタンパク質は妊娠雌ブタにおいて早期に保護が誘発され、１０^５ＤＬ_５０のＣＳＦＶを投与した後に、母親だけでなく、胎児においてもそれが臨床的疾患の発生を遅らせ、ウイルスを増殖させない。

好ましい態様において、キメラワクチン抗原は、ＣＳＦＶのＥ２グリコプロテインの細胞外セグメント（又はドメイン）の配列番号１の配列表に表されるアミノ酸配列及び配列番号２のブタのＣＤ１５４分子の細胞外セグメントを本質的に含有することを特徴とする。キメラワクチン抗原は本質的にこのようなアミノ酸配列を含むが、ＣＳＦＶのどの単離体からのＥ２細胞外配列をも含有することができる。

本発明の別の態様では、キメラワクチン抗原は、組換え、合成方法又は化学的結合により得ることができる。本発明の特別な態様において、Ｅ２ｈｉｓ（６ヒスチジンのテールに融合したＥ２の細胞外セグメント）及び分子アジュバントを含むキメラタンパク質に基づく変異体は融合タンパク質として作成された。この目的で、Ｇｌｙ_４Ｓｅｒの４反復ユニットからなるスペーサーペプチド（４Ｇ_４Ｓ）及び免疫系の刺激分子がＥ２ｈｉｓのＣ−末端に加えられた。４Ｇ_４Ｓペプチドの組み込みは、ポリペプチド鎖にある程度の緩みを可能とする。このことにより、タンパク質構造の正しい３次構造フォールディングを保証し、天然の構造に類似の３次構造を持つ融合タンパク質を得る。この発明の目的であるワクチン抗原の一つは、分子アジュバントとして、そのＣ−末端に融合したブタＣＤ１５４分子の細胞外ドメインを持っている（Ｅ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４）。

今までのところ、バイオリアクターとしての動物における発現系により仲介されたＣＳＦＶに対する組換えワクチン候補の生産は、探索されていない。しかし、その３次構造の正しいフォールディングを持つグリコシル化組み換えタンパク質を発現する乳腺の能力は、高い免疫原性と保護能力を持つＥ２グリコプロテインを生産するための適当な発現系となる。アデノウイルスベクターにより仲介される反芻動物の乳腺中の一過性発現システムは、速やかで簡単な方法で高発現レベルの組換えタンパク質を得るための手段を構成する（Ｔｏｌｅｄｏ ｅｔ ａｌ．ＷＯ２００４／０３４７８０）。この方法は、ＣＳＦの撲滅を指向するワクチン接種プログラムに適用する目的を持つＥ２組変え体の生産にとって非常に有用となる。

本発明の具体化において、本発明の目的であるワクチン抗原は、授乳過程の間に遺伝子修飾された哺乳動物の乳腺上皮細胞中に発現され、母乳の中に分泌される。組換えキメラ分子は遺伝子導入哺乳動物の母乳の中に生産されるか、又は遺伝子導入されていない哺乳動物の乳腺上皮のアデノウイルスベクターを使用することによる直接形質転換により生産される。本発明の他の具体化において、キメラワクチン抗原は遺伝子修飾されたイースト中で生産される。該抗原は、キメラ遺伝子及び発現と組換えタンパク質の培養液への分泌をさせる調節配列で形質転換したイーストの培養液中に得られる。

天然のＣＳＦＶのＥ２タンパク質はウイルスのエンベロープ上にホモダイマーとして露出しており、鎖間ジスルフィド架橋により安定化している。これは、中和及び保護抗体が、ホモダイマー上に存在する立体的抗原決定基に対して作成されることを決定する。本発明で開発されたワクチン抗原は、これらの組換えタンパク質の正しいフォールディングを可能にする発現システムで生産される。遺伝子構造の設計は、融合タンパク質の３次構造の変化が無いことを保証する。組換えワクチン抗原は、金属イオンに対する親和性の簡単なクロマトグラフィー段階により容易に精製される。

遺伝子構造の設計、発現システムの使用及び精製過程の相対的単純性は、本発明に関し説明したＣＳＦＶに対するワクチン抗原が、ウイルスのＥ２タンパク質に類似する抗原性及び免疫原性を維持することを保証する。Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ又はヤギの乳腺のような発現システムにおいて作られたキメラ分子による免疫は、強力にして早期の免疫応答を導く。Ｅ２の細胞外ドメインは、中和及び保護抗体の形成のための立体的抗原決定基を提供するホモダイマーを生成する。ＣＤ１５４のセグメントは分子アジュバントとして働き、それはワクチン接種ブタの免疫系を刺激し、ワクチン接種の第１週からＣＳＦＶから動物を保護する細胞免疫応答を生じさせる。スペーサーペプチドを含むキメラタンパク質の中の両分子の組合せは、それぞれの分子の正しいフォールディングを保証する。使用された発現システムは、組換えタンパク質がグリコシル化されたアイソフォームで発現されることを可能にし、また適切な３次構造を持つ分子を得る助けとなる。

本発明の他の態様は、ＣＳＦＶに対する保護免疫応答を発生させる能力を持つワクチン製剤であり、それはＥ２グリコプロテインの細胞外ドメイン及び分子アジュバントを含む前記キメラ抗原を含むことを特徴とする。このようなワクチン製剤は、ＣＳＦを予防する目的で全身又は粘膜の経路により動物に投与することができ、ブタの群れでのＣＳＦＶ感染により起こる資源や経済的損失を避けることができる。

実施例１：ＣＳＦＶ Ｅ２及びブタＣＤ１５４の細胞外ドメインをコードする遺伝子セグメントの増幅及びｐＭＯＳ−Ｅ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４プラスミドのクローニング。
３６３アミノ酸のＥ２細胞外ドメインをコードする遺伝子セグメントは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のデータベース上の受入番号ＡＪ７０４８１７のＣＳＦＶキューバ単離株「Ｍａｒｇａｒｉｔａ」のウイルスゲノムから逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により増幅された。抗原の精製を容易にするために、３’オリゴには６ヒスチジンテールのコード配列を含めた。

２１０アミノ酸のブタＣＤ１５４の細胞外ドメインのコード配列は、化学的合成により得られ、ブタのＣＤ１５４遺伝子はイノシシのＣＤ１５４（ＮＢＣＩ受入番号ＡＢ０４０４４３）に類似する配列パターンを取った。この分子のコード配列の５’末端に、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒの４回反復単位のペプチド（４Ｇ_４Ｓ）をコードする領域を含めた。ｐＭＯＳ−ＢＬＵＥプラスミド中へのサブクローニングを介して（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＳＡ）、構成配列（４Ｇ_４Ｓ−ＣＤ１５４）を、Ｅ２ｈｉｓのコード配列中の６ヒスチジンテールの直後に挿入した。ｐＭＯＳ−Ｅ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４プラスミドが得られた。

実施例２：哺乳動物細胞に対する分泌シグナルを持つＥ２ｈｉｓ及びＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４分子の遺伝子構築
ＲＴ−ＰＣＲにより得たＥ２ｈｉｓに対応する配列を、プラスミドｐＡＥＣ−ＳＰＴのＢｇＩ ＩＩ−ＥｃｏＲＶ部位に挿入した（Ｈｅｒｒｅｒａ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｙｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２７９：５４８−５５１）。こうして、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｈｔＰＡ）の分泌シグナルが先行し、そしてヒトサイトメガロウイルスの早期直接プロモーター（ＣＭＶＰ）の転写調節を受けるＥ２ｈｉｓのコード配列を含むベクターｐＥ２ｈｉｓ−ｓｅｃが得られた。

ｐＭＯＳ−ＢＬＵＥベクター中にサブクローニングされたＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４に対応する配列は、プラスミドｐＡＥＣ−ＳＴＰ中のエンドヌクレアーゼＢｇＩ ＩＩ−ＳＡＩ Ｉの制限部位に挿入された。こうして、ｈｔＰＡの分泌シグナルが先行しそしてＰＭＣＶの転写調節を受けるＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４のコード配列を含むベクターｐＥ２ｈｉｓＣＤ１５４−ｓｅｃが得られた。

実施例３：哺乳動物細胞に対する分泌シグナルを持つＥ２ｈｉｓ及びＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４のコード配列を含む組換えアデノウイルスベクターの作成。
複製欠陥のアデノウイルスベクター（Ａｄ−ΔＥ１，ΔＥ３）は、ＡｄＥａｓｙシステムガイド（ＡｄＥａｓｙ^ｔｍ−Ｖｅｃｔｏｒ ｓｙｓｔｅｍ，Ｑｕａｎｔｕｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＥＥ．ＵＵ）の記述に従って作成された。プラスミドｐＡｄ Ｔｒａｃｋ−ＣＭＶは、転移ベクターとして使用された。ｈｔＰＡの分泌シグナルを持つＥ２ｈｉｓのコード配列（Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃ）は、ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＶ制限エンドヌクレアーゼによる酵素消化によりプラスミドｐＥ２ｈｉｓ−ｓｅｃから抽出され、そしてそれはｐＡｄＴｒａｃｋベクターのＥｃｏＲ Ｖ制限部位に挿入された。ＰＣＭＶの転写調節の下にＥ２ｈｉｓ分泌可能な変異体を持つ組換えｐＡｄＴ−Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃが得られた。

分泌可能なＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４のコード配列は、Ｎｃｏ Ｉ及びＳａｌ Ｉ制限エンドヌクレアーゼによる酵素消化によりプラスミドｐＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４−ｓｅｃから抽出され、そしてそれはｐＡｄＴｒａｃｋベクターのＫｐｎ Ｉ−Ｘｈｏ Ｉ制限部位に挿入された。ＰＣＭＶの転写調節の下にＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４ｓｅｃを持つ組換えｐＡＤＴ−Ｅ２ｈｉｓＣＤ１５４−ｓｅｃが得られた。

組換えアデノウイルスゲノムを作成するために、転移アデノウイルスベクター、ｐＡｄＴ−Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃ及びｐＡｄＴ−Ｅ２ｈｉｓＣｄ１５４−ｓｅｃはＰｍｅＩ制限エンドヌクレアーゼによる酵素消化により直線化された。直線ベクターのそれぞれは別々に、ｐＡｄＥＡＳＹ−１ベクターと共にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＪ５１８３株の中に電気穿孔により導入された。ｐＡｄ−Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃ及びｐＡｄ−Ｅ２ｈｉｓＣＤ１５４−ｓｅｃベクターの両者の組換えゲノムは、相同組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）により得られた。それらの一つは、Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃのコード配列を含み、そして他の一つはＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４−ｓｅｃの分子のコード配列を含んでいる。両者の場合に、ＰＣＭＶの転写調節が維持されている。

組換えアデノウイルスゲノムはさらにＰａｃＩエンドヌクレアーゼで消化され、ＨＥＫ−２９３Ａ相補細胞系に別々に導入され、そして感染性ビリオンを得た。二つのアデノウイルスベクターが作成された：Ａｄ−Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃ及びＡｄ−Ｅ２ｈｉｓＣＤ１５４−ｓｅｃ。これらのベクターは別々にＨＥＫ−２９３Ａ細胞系において１×１０^１２コロニー形成単位／ｍＬ（ＣＦＵ／ｍＬ）の力価が得られるまで増幅され、そしてそれはＣｓＣｌグラジエント中で２回遠心分離して精製された。このベクターはさらに保存緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０，２ｍＭ ＭｇＣｌ_２，４％サッカロース）に対して透析され、そして−７０℃で保存された。Ａｄ−Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃ及びＡｄ−Ｅ２ｈｉｓＣＤ１５４−ｓｅｃアデノウイルスベクターの哺乳動物細胞を形質転換する能力、並びにＥ２ｈｉｓ、及びＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４の分子を培地に発現し分泌する能力は、ＰＫ１５ブタ細胞系における感染アッセイにより確証された。感染細胞の培地中に存在するタンパク質検体は、非還元条件においてドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離され、そしてＣＳＦＶのＥ２に対するモノクロナール抗体（αＥ２−１Ｇ６）によるウエスタンブロッティングアッセイにより分析された（図１及び２）。

Ｅ２ｈｉｓ及びＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４グリコプロテインの分子量分析により、これらは２量体及び３量体アイソフォームに相当することが立証された。図２のレーン１に、Ｅ２−ＣＤ１５４の２量体（１８０ｋＤａ）及び３量体（２７０ｋＤａ）に対応する二つのバンドが観察された。

実施例４：ミルク中にＥ２ｈｉｓ及びＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４を生産するためのヤギ乳腺上皮のＩｎ ｓｉｔｕ遺伝子導入。
発現カセットＥ２ｈｉｓ及びＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４による乳腺上皮の形質転換のために、Ａｄ−Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃ及びＡｄ−Ｅ２ｈｉｓＣＤ１５４−ｓｅｃ組換えアデノウイルスベクターを使用した。両者の場合において、このベクターを、乳頭チャネルを介して直接乳房に注入することにより授乳ヤギの乳腺に接種した。アデノウイルスベクターは、乳腺上皮を構成する分泌上皮細胞に感染し、組換えタンパク質の発現を可能とした。

自然授乳２ヶ月目の、１日平均１リットルを生産するヤギを使用した。アデノウイルスベクターを導入するために、最初ミルクが乳房から除去されるまで搾乳し、次いで乳頭チャネルを介して等浸透圧食塩液を槽内に直接注入し、乳房を緩和にマッサージし、乳腺の完全な洗浄を確実に行った。乳房から食塩液を徹底的に除去し、この操作を２回行った。次いで、３６ｍＭのＥＧＴＡを含む食塩液中の１０^９ＣＦＵ／ｍＬ力価のアデノウイルス接種液を注入した。各乳房に対する注入容量を変動させ、乳房の容量に応じて確実に槽を完全に充満させた。注入後、乳腺の胞の分泌上皮細胞まで達するようにアデノウイルス接種液の均一分布を促進するために乳房マッサージを行った。アデノウイルス接種液は、２４時間後に搾乳により除去した。槽内または乳腺内の残留アデノウイルスベクターを除去する目的で、食塩液の注入により乳腺を再度洗浄した。

２４時間後、遺伝子導入動物から手動によるミルクの収集が開始された。１２時間間隔で２日間の搾乳が行われた。収集されたミルクは−７０℃で保存された。ミルク中へのＥ２ｈｉｓ及びＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４組換えタンパク質の発現動態は各搾乳検体について分析された（図３及び４）。組換えタンパク質の分子量は２量体及び３量体アイソフォームに対応することが立証された。接種後２日目〜８日目で、Ｅ２ｈｉｓが、平均発現１．０３ｇ／Ｌ、各動物の平均収量５．２２ｇで得られた。組換え分子Ｅ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４は、平均発現０．７３ｇ／Ｌ，動物当たりの平均収量３．０４ｇで得られた。

実施例５：ヤギミルクから得られたＥ２ｈｉｓ及びＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４抗原の精製。
Ｅ２ｈｉｓ及びＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４組換えワクチン抗原を含むそれぞれの搾乳日の検体をそれぞれ混合し、１５，０００ｇ，３０分間、４℃で遠心分離した。可溶相（乳清）を分離し、脂肪相を廃棄した。収集した乳清をミルク分離緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１０ｍＭ ＣａＣｌ_２，ｐＨ；８．０）で比率１：４に希釈した。混合物を氷上で３０分間冷却し、１５，０００ｇ，３０分間、４℃で遠心分離した。上清及び沈殿をＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングアッセイにより分析した。組換えタンパク質の大部分は可溶相に存在したが、沈殿はカゼインを含むことが確認された。

目的の組換え抗原（Ｅ２ｈｉｓ及びＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４）を含む乳清フラクションを、０．８μＭ及び０．４μＭの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で連続濾過して澄明にし、さらにＮｉ−ＮＴＡ−Ａｇａｒｏｓｅマトリックス（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）を充填したＸＫ１６精製カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＳＡ）に適用した。１００ｍＭリン酸緩衝液、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２（最初の洗浄）及び１００ｍＭリン酸塩、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２（二回目の洗浄）による２回の洗浄ステップが実施された。洗浄後、目的のタンパク質は、１００ｍＭリン酸緩衝液、２００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２で溶出した。純粋なフラクションに相当するピークを１０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．２に対して透析した（図５）。

ヤギミルクからのＥ２ｈｉｓ及びＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４の精製操作は、両ワクチン抗原に対して同じであった。この２つのタンパク質は９０％に達する高い純度レベルで得られた。Ｅ２ｈｉｓは７０％の回収率で得られ、Ｅ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４の場合には、５８％の回収率で得られた。このタンパク質の凝集を測定するために、精製タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングアッセイにより分析された。ミルク中に生産されたＥ２ｈｉｓの２量体イソフォーム（ホモダイマー）がＣＳＦＶ感染ブタのポリクロナール血清により効率よく認識されることを確認することができ、この特異的立体構造が分子の抗原性を増加させていることを示した（図６）。

実施例６．Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓメチロトローフのイーストにおける発現ベクターの構築。
Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのインベルターゼスクロースの分泌シグナル（Ｓｕｃ２）の３’末端に目的のコード配列を組み入れるために、ｐＰＳ１０ Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ発現ベクターを、Ｎａｅ Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化した。ＰＣＲにより増幅されたＥ２コード配列は、ｐＰＳ１０プラスミドのＮａｅＩ制限部位に挿入された。Ｅ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４コード配列は、Ｓｍａ Ｉ−ＥｃｏＲＶ制限エンドヌクレアーゼによる酵素消化によりｐＭＯＳ−Ｅ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４プラスミドから取り出され、ｐＰＳ１０のＮａｅ Ｉ制限部位に挿入された。このようにして、ｐＰＳ−Ｅ２ｈｉｓ及びｐＰＳ−Ｅ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４プラスミドが得られた。両分子のコード配列は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＳｕｃ２の分泌シグナルに結合しており、そしてＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓイーストのアルコール酸化酵素（ＡＯＸ１）プロモーターの転写調節を受けていた。

組換えプラスミドは、Ｐｖｕ ＩＩ制限エンドヌクレアーゼにより直線化され、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＭＰ３６株の電気穿孔適合細胞に電気穿孔により導入された。このようにして、プラスミドｐＰＳ−Ｅ２ｈｉｓ及びｐＰＳ−Ｅ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４により安定的に形質転換されたＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＭＰ３６のいくつかのクローンが作成された。この株はヒスチジンの栄養要求性変異株であるので、組換えイーストはＨｉｓ^＋表現系を獲得し、栄養要求選別を可能にする。

最初にドットブロットアッセイにより確認された組換えイーストは、Ｍｕｔ^ｓ−Ｈｉｓ表現型（メタノールの低利用）を発生するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ ＡＯＸ１遺伝子の置換により生じうる統合パターンを決定するために、サザンブロットアッセイによっても分析された。ＡＯＸ１の遺伝子置換は、イーストゲノムに存在する５’ＡＯＸ１プロモーター領域及び３’ＡＯＸ１領域とプラスミドに存在する他の領域の間の組換えによって生じ、ＡＯＸ１遺伝子コード領域の除去を推進する。Ｍｕｔ^５表現型を持つ組換えイーストは、ＡＯＸ２遺伝子上のアルコール酸化酵素の生産を支持するが、メタノール中における増殖速度は低い。また、表現型Ｍｕｔ^＋−Ｈｉｓ統合パターンは置換により得ることができる。

Ｅ２ｈｉｓ及びＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４変異体のコード配列は、メタノールにより誘導しうるＡＯＸ１プロモーター調節の下にある。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは低レベルのタンパク質を分泌し、そしてその培地はタンパク質の追加を必要としない。したがって、分泌される異種タンパク質は培地中の総タンパク質の大部分（８０％を超えるまで）を構成すると予想されうる。組換えタンパク質生産は、５Ｌの発酵槽中で行われる。発現の誘導は５日間培養にメタノールを添加することにより行われ、そして組換えタンパク質は発酵培地中に得られる。Ｅ２ｈｉｓは、０．１４３ｍｇ／ｍＬのレベルで組換えイースト培地に分泌される。Ｅ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４の場合には、０．１２２ｍｇ／ｍＬの発現レベルで得られた。

実施例７：Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓの培地から得たＥ２ｈｉｓ及びＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４抗原の精製。
液相からバイオマスを分離するために、発酵生産物を１０，０００ｇ，３０分間、４℃で遠心分離した。この培養液を０．８μＭ及び０．２μＭの膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し、そしてそれをＮｉ−ＮＴＡ Ａｇａｒｏｓｅマトリックス（Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）を充填したＸＫ１６精製カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ，ＵＳＡ）に適用した。１００ｍＭリン酸緩衝液、３０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２による洗浄を行い、そして該タンパク質は１００ｍＭリン酸緩衝液、２００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．２で溶出した。純粋フラクションを１０ｍＭリン酸緩衝液に対して透析した。遺伝子導入Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓイーストの発酵上清のＥ２ｈｉｓ及びＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４の精製方法は、両ワクチン抗原について同じであった。この２つのタンパク質は、９５％の高い純度レベルで得られた。Ｅ２ｈｉｓは８３％の回収で得られ、Ｅ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４の場合には７８％の回収で得られた。

実施例８：分泌型Ｅ２ｈｉｓ変異体をワクチン接種されたブタにおける予防試験。
ＣＳＦＶに対する血清検査陰性であり、ワクチン接種をせずにＣＳＦのない群れに属する健康ブタ２４匹（体重約２０ｋｇ）をこのアッセイに使用した。ブタをそれぞれ８匹ずつの群に別け、３つの分離した実験室（Ａ，Ｂ及びＣ）に収容し、餌と水は自由摂取とした。

群Ａ及び群Ｂの動物は、動物当たり３０μｇ（群Ａ）及び５０μｇ（群Ｂ）の１回投与で、Ｅ２ｈｉｓ抗原を含むワクチン製剤で免疫され、そして群Ｃはプラセボで免疫された。抗原は水／油エマルジョンで製剤化され、そして首の筋肉内経路により２ｍＬの注射により接種された。プラセボは、１：１（Ｖ／Ｖ）の比率のアジュバント及びリン酸緩衝食塩溶液で構成され、同じ条件で接種された。免疫後第３週に、筋肉内注射により同種ＣＳＦＶ「Ｍａｒｇａｒｉｔａ」株を１０^５ＤＬ_５０で全動物をチャレンジした。

正常臨床パラメーターの変化は観察されなかったことから、Ｅ２ｈｉｓワクチン製剤による接種は有害反応を生じなかった。免疫後第２週の後にワクチン接種群において、１／５０（陽性と考えられる）の高さの中和抗体の力価が得られた。第３週後には、力価は１／１６００〜１／６４００まで増加した（図７）が、ワクチン接種群（Ａ及びＢ）の間に免疫応答の相違は観察されなかった。ワクチン接種ブタは発熱又は疾患の全臨床症状を発現せず、チャレンジ後にリンパ球からウイルスは分離されなかった。しかし、プラセボ群は、発熱、出血及び非化膿性脳炎を含む疾患の臨床症状を発現した。この群においては、チャレンジ後４日から屠殺日までウイルス分離が得られた。ここに、提案された接種方法で３０μｇの投与量で投与されたＥ２ｈｉｓ製剤でワクチン接種された離乳ブタは、臨床症状及びＣＳＦＶ感染から保護されていることが示された。

実施例９．分泌型Ｅ２ｈｉｓ抗原によりワクチン接種された妊娠雌ブタにおける垂直保護試験。
ＣＳＦ疾患の無い又はワクチン接種歴の無い群れ（３年以前）のＣＳＦＶ血清検査陰性の雌ブタ１０匹を使用した。離乳後、ホルモン処理により性周期が誘導され、３日後に全ての雌ブタに精子が注入された。精子注入は免疫と同時に行われた。雌ブタ５匹の群は、実施例７に記述したワクチン製剤の２ｍＬを首の筋肉内に注射された（群Ｂ）。残る５匹の雌ブタは陰性対照群とされ、アジュバントと食塩液の１：１（Ｖ／Ｖ）比混合物の２ｍＬにより構成されるプラセボを注射された。ワクチン投与群は２１日後にブースターを投与された。妊娠雌ブタは、臨床３徴候（体温、心拍数及び呼吸数）の測定による検査を受け、そして血液検査のための採血を毎週行い、そしてＣＳＦＶに対する中和抗体の検出が行われた。２ヵ月後、妊娠雌ブタは、筋肉内注射により１０^５ＤＬ_５０の同種ＣＳＦＶ「Ｍａｒｇａｒｉｔａ」株を投与された。ＣＳＦＶの存在を検出するために、チャレンジ後３日目及び５日目に末梢血リンパ球からウイルス分離が行われた。チャレンジ２週間後に雌ブタを屠殺し、形態及び解剖学的病理分析及びウイルス分離アッセイのために胎児を取り出した。実験中、雌ブタは水と餌を自由に摂取した。

ワクチンは全ての妊娠雌ブタにおいて無害であり、免疫後流産或いは臨床的変化は無かった。ワクチン接種動物は、１：５０から１：５１２００の間の力価のＣＳＦＶに対する特異的中和抗体を発現した。ワクチン接種群の雌ブタはチャレンジ後に完全に健康であり続けた。これらの動物はいずれも、発熱、白血球減少症、血小板増多症或いはその他のＣＳＦ臨床徴候を全く示さなかった。

形態学的及び解剖学的病理検査により、ワクチン投与雌ブタの胎児は正常の大きさであり、組織病理的病変を示さないことが確認できた。チャレンジ後に採血した母親の白血球からも血液からも、また屠殺した胎児の血液及び臓器からもＣＳＦＶは分離されなかった。

プラセボ群の雌ブタは、チャレンジの後発熱及び白血球減少症を示した。１匹の雌ブタはチャレンジ後８日目に流産を生じ、チャレンジ後９日目に屠殺した。チャレンジ後２週間で屠殺した雌ブタの胎児及び流産胎児に、小さなサイズ、ミイラ化、脾腫大、腎臓と膀胱の点状出血及び非化膿性脳炎のような病理的徴候が観察された。ＣＳＦＶは、この群の胎児の血液及び全臓器から分離された。Ｅ２ｈｉｓワクチン製剤によるブタのワクチン接種は、雌ブタから子へのＣＳＦＶ伝達を予防した。

実施例１０：Ｅ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４ワクチン製剤によるワクチン接種ブタにおける早期予防試験。
各群６匹のブタの４群を使用し（実施例８と同じ条件）、下記の抗原量でワクチン製剤を適用した：Ｅ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４ ５０μｇ（群Ｄ），Ｅ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４ ８０μｇ（群Ｅ），Ｅ２ｈｉｓ ５０μｇ（群Ｆ）。群Ｇはプラセボ群として使用した。抗原を「水／油」エマルジョン中に製剤化し、２ｍＬを筋肉内注射により接種した。プラセボ群には、タンパク質を含まないアジュバントを接種した。ワクチンは１回投与した。免疫後８日目に、１０^５ＤＬ_５０ ＣＳＦＶ「Ｍａｒｇａｒｉｔａ」株を筋肉内接種することにより、この動物にチャレンジした。試験期間中毎日臨床徴候を記録し、毎週血液学検査及び中和抗体分析のために採血を行った。また、リンパ球増殖及び「血清中の抗ウイルス活性」アッセイによる細胞性免疫応答を評価するために、ワクチン接種後１，３，５及び７日目に血液検体を採取した。

ワクチン接種後、正常な臨床徴候が観察され、接種部位には有害反応は認められなかった。リンパ球増殖アッセイでは、Ｅ２−ＣＤ１５４抗原をワクチン接種した動物（群Ｄ及びＥ）のリンパ球培養において、分裂促進因子フィトヘマグルチニンによるリンパ球数の増加が検出された。この応答は、ＣＤ４ドメインに対するＭａｂにより遮断されたことは、この免疫応答がヘルパーＴリンパ球により仲介されていることを示している。このアッセイにおいて、群Ｆ及びＧ（プラセボ）の動物のリンパ球検体は、分裂促進因子及びＣＳＦＶによるいずれの刺激にも応答しなかった（図８）。

群Ｄ及びＥに対するＥ２−ＣＤ１５４抗原によるワクチン接種後３，５及び７日の検体に高いインターフェロンアルファ力価が観察された。しかし、Ｅ２ｈｉｓ抗原（群Ｆ）及びプラセボ（群Ｇ）を接種された動物では、実験期間中インターフェロンは検出されなかった。伝達性胃腸炎ウイルスに対する「抗ウイルス活性アッセイ」をＰＫ−１５細胞において実施した。群Ｄ及びＥにおいて１：５１２の抗ウイルス活性力価が得られたが、Ｅ２ｈｉｓ免疫ブタ及びプラセボ群のいずれの検体からも抗ウイルス活性は検出されなかった（図９）。これらの実験により、ＣＤ１５４分子に結合したＥ２抗原は、ＣＤ１５４免疫刺激活性に関係するＣＳＦＶに対する細胞性免疫応答を増強することが確認された。

実施例１１：Ｅ２ｈｉｓ及びＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４を含むワクチン製剤の１回投与によりワクチン接種したブタにおける中和抗体動態の比較。
血清学的にＣＳＦＶ疾患及びワクチン接種歴の無い（以前３年間）群れの、体重約２０ｋｇ，ＣＳＦＶに対する血清検査陰性の６匹のブタの３群を使用した。動物は水と餌を毎日自由に与えられた。

それぞれの動物は、群Ｈでは５０μｇのＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４；群Ｉでは５０μｇのＥ２ｈｉｓをワクチン接種され、そして群Ｊはプラセボとして使用した。抗原は「水／油」エマルジョン中に製剤化し、２ｍＬの筋肉内注射により接種した。プラセボ群はタンパク質を含まないアジュバントを接種した。１回投与を行い、免疫後５週間、中和ペルオキシド結合アッセイ（ＮＰＬＡ）により、中和抗体のレベルを測定した。

Ｅ２−ＣＤ１５４及びＥ２ｈｉｓをワクチン接種された群（Ｈ及びＩ）において、１：５０（保護的と考えられる）を超える力価で免疫後２週間で中和抗体が検出された。試験中、プラセボ群の動物では抗体は全く検出されなかった。免疫後第２週において、群Ｈ（Ｅ２−ＣＤ１５４抗原）の動物の中和抗体力価は、Ｅ２ｈｉｓ抗原で免疫した群の力価より高かった。この結果は、群Ｈの動物における体液性応答のより高い刺激を示唆した（図１０）。

ワクチン接種されたブタにおいて、５０μｇの投与量レベルのＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４ワクチン製剤は、安全であり、免疫原性があり、そしてＥ２ｈｉｓワクチン製剤と比較した場合に、より早期の体液性応答を誘発すると、われわれは結論した。

実施例１２：Ｅ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４ワクチン製剤によりワクチン接種された妊娠雌ブタにおける垂直保護試験。
１０匹の雌ブタを、実施例８に使用したブタと同じ健康条件及び由来で選別した。離乳後、ホルモン処理により性周期を誘発し、３日後に全ての雌ブタに精子を注入した。同時に、５匹の雌ブタの群は、Ｅ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４ワクチン製剤（８０μｇ／動物；実施例１０の群Ｅに使用した組成）の２ｍＬを耳の後ろの首に筋肉注射して免疫した。残る５匹のブタの群はプラセボとしてアジュバントで免疫した。妊娠雌ブタは、臨床三徴候（体温、心拍数及び呼吸数）を調べられ、そして毎週、血液学及びＣＳＦＶに対する中和抗体の検出のための採血が行われた。妊娠２ヶ月において、１０^５ＤＬ_５０のＣＳＦＶ「Ｍａｒｇａｒｉｔａ」株でチャレンジした。チャレンジ後３日目と５日目に採血して、ウイルス血症を検査した。２週間後、雌ブタを屠殺し、その胎児を取り出し、ウイルス学的、形態学的及び病理学的分析を行った。実験中、雌ブタは毎日水と餌を自由に摂取した。

免疫後、流産例又はその他のＣＳＦ臨床徴候は観察されなかった。したがって、１回投与免疫によるＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４ワクチン製剤は、妊娠雌ブタにおいて安全であった。ワクチン接種動物は、１：５０から１：１６，０００のＣＳＦＶに対する特異的中和抗体を発生した。

チャレンジ後、ワクチン接種雌ブタ群において、発熱、白血球減少症又は血小板増多症は観察されなかった。この群において、胎児は正常の大きさであり、形態測定及び病理解剖分析により測定された組織病理学的病変は無かった。ワクチン接種された母親のチャレンジ後に採取された血液の白血球にも、その胎児の臓器や血液にも、ＣＳＦＶは発見されなかった。

プラセボ群の雌ブタは、チャレンジ後、発熱、白血球減少症及び食欲不振を示した。この群の胎児は、サイズの減少を示し、また脾腫大、腎臓及び膀胱の点状出血、腸の壊死、内臓の出血及び非化膿性脳炎などのＣＳＦに一致する組織病理的病変を示した。この群全ての胎児の臓器及び血液からＣＳＦＶが分離された。評価されたスケジュールで適用されたＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４ワクチン製剤による妊娠雌ブタのワクチン接種により、雌ブタから子へのＣＳＦＶ伝達は予防された。

Ａｄ−Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃアデノウイルスベクターにより形質導入されたＰＫ−１５細胞におけるＥ２ｈｉｓ発現のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元条件）による分析。（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，レーン１：形質導入細胞の培養液、レーン２：非処理細胞の培養液、ＭＷＭ：分子量マーカー。（Ｂ）ヒスチジンテールに対するモノクロナール抗体を使用するウエスタンブロッティングによるＥ２ｈｉｓの免疫同定。レーン１：形質導入細胞の培養液、レーン２：非処理細胞の培養液、レーン３：ヒスチジンテールの陽性対照。ＭＷＭ：分子量マーカー。（Ｃ）ＣＳＦＶ感染ブタのポリクロナール抗体を使用するウエスタンブロッティングによるＥ２ｈｉｓの免疫同定。レーン１：非処理細胞の培養液、レーン２：Ａｄ−Ｅ２ｈｉｓで形質導入細胞の培養液。ＭＷＭ：分子量マーカー。 Ａｄ−Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃ及びＡｄ−Ｅ２ｈｉｓＣＤ１５４−ｓｅｃアデノウイルスベクターで形質導入されたＰＫ−１５細胞におけるＥ２ｈｉｉｓ発現条件及びＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４の分析。培養液中のタンパク質は、非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離された。関心の分子の免疫同定はＣＳＦＶのＥ２タンパク質に対するモノクロナール抗体（Ｍａｂ−１Ｇ６）を使用するウエスタンブロッティングにより行われた。レーン１：Ａｄ−Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃベクターにより形質導入された細胞の培養液、レーン２：Ａｄ−Ｅ２ｈｉｓＣＤ１５４−ｓｅｃベクターにより形質導入された細胞の培養液。ＭＷＭ：分子量マーカー。 Ａｄ−Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃベクターにより形質導入されたヤギのミルクの中のＥ２ｈｉｓの発現の動態。それぞれの日の搾乳に対応する乳清のタンパク質を非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。Ｅ２ｈｉｓの免疫同定は、Ｍａｂ−１Ｇ６を使用するウエスタンブロッティングによりアッセイした。レーンＰＫ：Ａｄ−Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃベクターにより形質導入されたＰＫ−１５細胞の培養液中に発現されたＥ２ｈｉｓの陽性対照、レーンＣ：非処理ヤギの乳清検体、レーン１〜８：Ａｄ−Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃベクターにより形質導入されたヤギのアデノウイルス形質導入の後の８日の搾乳のそれぞれに対応する乳清検体。 Ａｄ−Ｅ２ｈｉｓＣｄ１５４−ｓｅｃで形質導入されたヤギのミルク中のＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４の発現の動態。搾乳のそれぞれの比に対応する乳清検体中に存在するタンパク質を、非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離した。Ｅ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４分子の免疫同定は、Ｍａｂ−１Ｇ６を使用するウエスタンブロッティングにより行われた。レーン１〜５：アデノウイルスによる形質導入の後の５搾乳日のそれぞれに対応するＡｄ−Ｅ２ｈｉｓＣＤ１５４−ｓｅｃベクターで形質導入されたヤギの乳清検体。レーンＣ：非処理ヤギの乳清検体。レーンＰＫ：Ａｄ−Ｅ２ｈｉｓＣＤ１５４−ｓｅｃベクターで形質導入されたＰＫ−１５細胞の培養液中に発現したＥ２ｈｉｓ−ＣＤ１５４の陽性対照。 非還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分離されたＥ２ｈｉｓの純度及び同定。このタンパク質は、ＡＤ−Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃベクターで形質導入されたヤギのミルク中に発現し、精製は金属アフィニティークロマトグラフィーにより行われた。（Ａ）異なる精製ステップのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。（Ｂ）Ｍａｂ−１Ｇ６を使用するウエスタンブロッティングによる免疫同定。レーン１：Ａｄ−Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃベクターにより形質導入されたＰＫ−１５細胞の培養液中に発現したＥ２ｈｉｓの陽性対照。レーン２：非処理ヤギの乳清検体。レーン３：クロマトグラフィーの最初の材料として採取されたＡｄ−Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃベクターにより形質導入されたヤギの乳清検体。レーン４：マトリックスに結合しない材料。レーン５：２０ｍＭイミダゾールによる洗浄液。レーン６：５０ｍＭイミダゾールによる洗浄液。レーン７：２００ｍＭイミダゾールの溶出液。 ＣＳＦＶの毒性株に感染したブタの血清中に存在する抗体による、Ｅ２ｈｉｓワクチン抗原の二つのイソフォームの抗原認識の比較。ＡＤ−Ｅ２ｈｉｓ−ｓｅｃアデノウイルスベクターで形質導入されたヤギのミルクから精製したＥ２ｈｉｓを電気泳動と還元条件（モノマー）及び非還元条件（ホモダイマー）においてウエスタンブロッティングアッセイにより分析した。（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ．（Ｂ）ＣＳＦ感染ブタのポリクロナール血清を使用するウエスタンブロッティング。レーン１：非還元条件で分離されたＥ２ｈｉｓ．レーン２：還元条件で分離されたＥ２−ｈｉｓ。 Ｅ２ｈｉｓワクチン抗原の１回投与によりワクチン接種された２群のブタにおいて得られた中和抗体の動態。抗体力価はパーオキシダーゼ結合中和アッセイにより測定した。群Ａは３０μｇ／動物の投与量、Ｂ群は５０μｇ／動物の投与量を接種された。両群は、ワクチン接種の３週間後、１０^５ＤＬ_５０のＣＳＦウイルス投与量をチャレンジされた。結果は、反復測定力価の幾何平均として示される。 Ｅ２−ＣＤ１５４抗原（群Ｄ及びＥ）とＥ２ｈｉｓ（群Ｆ）によるワクチン接種の５日後にブタから単離したリンパ球を使用するリンパ球増殖アッセイ。結果は、刺激された培養の１分間のカウント数（ｃｐｍ）と非処理対照のｃｐｍの比として定義される刺激指数（ＳＩ）として示す。ＳＩ≧２を誘発する増殖刺激を陽性とした。ＣＳＦＶで処理された培養中の増殖、並びにＣＳＦＶそしてブタＣＤ４ドメインに対するＭａｂで処理した培養中の増殖阻害を評価した。 Ｅ２−ＣＤ１５４抗原（群Ｄ及びＥ）及びＥ２ｈｉｓ抗原（群Ｆ）でワクチン接種された２群のブタの血清を使用したＰＫ−１５細胞における抗ウイルス活性アッセイ。結果は反復測定力価の幾何平均として示す。 ５０μｇ／動物の投与量を使用してＥ２−ＣＤ１５４抗原（群Ｈ）及びＥ２ｈｉｓ抗原（群Ｉ）でワクチン接種した２群のブタにおいて得られた中和抗体の動態。抗体力価は、ペルオキシダーゼ結合中和アッセイにより測定した。結果は反復測定力価の幾何平均として示す。

Claims (11)

1. 免疫系刺激タンパク質と結合した免疫原を含む、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）に対するキメラワクチン抗原であって、
   該免疫原がＣＳＦＶのウイルスエンベロープのＥ２グリコプロテインの細胞外セグメントであり；
   該免疫系刺激タンパク質がＣＤ１５４分子の細胞外セグメントである；
   キメラワクチン抗原。
2. 前記ＣＤ１５４分子の細胞外セグメントがいずれかの哺乳動物由来である、請求項１に記載のキメラワクチン抗原。
3. 前記ＣＳＦＶのウイルスエンベロープのＥ２グリコプロテインの細胞外セグメントのアミノ酸配列が配列番号１であり、
   前記ＣＤ１５４分子の細胞外セグメントのアミノ酸配列が配列番号２である、
   請求項１または２に記載のキメラワクチン抗原。
4. 組換え、合成又は化学的結合により得られる請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラワクチン抗原。
5. 乳腺上皮細胞中に請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原を発現する遺伝子修飾された非ヒト哺乳動物のミルクから得られる請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラワクチン抗原。
6. 乳腺の直接遺伝子変換により非遺伝子導入非ヒト哺乳動物のミルクから得られる、請求項５に記載のキメラワクチン抗原。
7. 前記乳腺の直接遺伝子変換がアデノウイルスベクターを使用して行われる、請求項６に記載のキメラワクチン抗原。
8. 乳腺上皮細胞中に請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原を発現する非ヒト遺伝子導入哺乳動物のミルクから得られる請求項５に記載のキメラワクチン抗原。
9. 請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原を発現する遺伝子修飾されたイーストから得られる請求項４に記載のキメラワクチン抗原。
10. 請求項１〜９のいずれか一項に記載されているキメラ抗原を含む、ＣＳＦＶに対する保護的免疫応答を生じさせるための、ワクチン製剤。
11. 全身又は粘膜経路により、ブタに投与するための、請求項１０に記載のワクチン製剤。