ES2267203T3

ES2267203T3 - Expresion proteinica en sistemas de expresion de vector de baculovirus.

Info

Publication number: ES2267203T3
Application number: ES98962690T
Authority: ES
Inventors: Dietmar Kretzdorn; Dirk Franciscus Marinus Van De Wiel; Abraham Johannes De Smit; Robertus Jacobus Maria Moormann; Erik Kees Hamann
Original assignee: Pfizer Animal Health SA; Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek DLO
Current assignee: Zoetis Belgium SA; Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek DLO
Priority date: 1997-12-18
Filing date: 1998-12-17
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2018-12-17
Also published as: CN101130073A; WO1999031257A2; HUP0101136A2; CN1283801C; IL181468A0; KR100682171B1; CA2315248C; KR20010033304A; ZA9811434B; DE69834346T2; KR20050115340A; CA2315248A1; AU1786599A; DK1049788T3; ATE324456T1; DE69834346D1; EP0924298A1; BR9813692A; EP1049788A2; UY25315A1

Abstract

Método para aumentar el rendimiento de una proteína E2 o Erns de pestivirus recombinante o fragmentos inmunogénicos de los mismos o de un FSH producido en cultivo celular de insecto, que comprende: - la selección de un baculovirus recombinante que codifica dicha proteína - y el cultivo de células de insecto a una densidad celular de 1 x 105 a 5 x 106 células/ml, todavía mejor de 5 x 105 a 1, 5 x 106 células/ml en un medio de cultivo en un recipiente de cultivo con volumen suficiente para contener por lo menos dos litros de medio de crecimiento, y - la infección de las células con un inóculo de por lo menos un baculovirus con una multiplicidad de infección comprendida entre 0, 005 y 0, 00025, calculada a partir de una gama de dilución de una estirpe (stock) de virus.

Description

Expresión proteínica en sistemas de expresión de vector de baculovirus.

La invención se refiere a métodos para aumentar la expresión proteínica o polipeptídica en sistemas de expresión de vector de baculovirus. Cuando se desarrollaron las técnicas de ADN recombinante, las expectativas eran muy grandes con respecto a la producción de proteínas a gran escala utilizando bacterias genéticamente modificadas. La mayoría de las proteínas comercialmente atractivas experimentan sin embargo necesariamente modificaciones post-transduccionales antes de que se puedan convertir en proteínas biológicamente activas. Por consiguiente, se utilizan ahora con mayor frecuencia células animales para producir proteínas recombinantes.

Entre las células animales, son las células de insectos las que presentan una importancia mayor para la producción de proteínas recombinantes. Se ha desarrollado un sistema de vector de baculovirus conveniente y versátil utilizando células de insectos. La información sobre la Fisiología de las células de insectos es más bien escasa; no obstante gozan por lo general de buena aceptación las vacunas producidas con técnicas recombinantes de baculovirus. Un ejemplo de ello es la utilización de una proteína de envoltura expresada por baculovirus gp 160 de virus de inmunoteficiencia humana tipo I como posible vacuna para el SIDA en pruebas clínicas.

Hasta la fecha, la producción a gran escala de proteínas expresadas por baculovirus en células de insectos se limita a bioreactores de hasta aproximadamente 10 litros. Para un aumento proporcional, los cultivos de suspensión ofrecen las mejores posibilidades. En la producción a gran escala (véase Tramper et al., Rec. Adv. Biotech., 1992, 263-284; Power and Nielsen, Cytotechnology 20: 209-219, 1996) es preciso hacer hincapié en factores que influyen en el crecimiento celular y la producción de virus. Las variaciones de dichos factores influyen en gran medida en el nivel final de producción de proteína recombinante.

Los baculovirus se caracterizan por partículas de virus en forma de bastoncitos, generalmente ocluidos en unos cuerpos de oclusión (también llamados poliedros). La familia de Baculoviridae se puede dividir en dos subfamilias: los Eubaculoviridae que comprenden dos géneros de virus ocluidos: el virus de polihedrosis nuclear (NPV) y el virus de granulosis (GV), y la subfamilia de nudobaculovirinae que comprende los virus no ocluidos. Se ha estudiado más en detalle la biología celular y molecular de la Autographa californica (Ac) NPV.

Muchas proteínas se han expresado en células de insectos infectadas con un baculovirus recombinante que codifica dicha proteína. Codificar significa que a dichos virus se les proporciona una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína heteróloga y muchas veces se le suministran además secuencias de ácido nucleico regulador como promotor. Se utiliza por lo general el promotor polihedrina para expresar un gen extraño pero el promotor p10 resulta igualmente adecuado y también se utiliza.

Se dispone de varias líneas celulares para infectar con baculovirus recombinante. La línea celular SF-21 se derivó de tejido de ovario de oruga negra (Spodoptera frugiperda). El aislado clonal, SF-9, que se puede obtener en la American Type Culture Collection (CRL 1711) es una línea celular más o menos standard para la producción in vitro de virus recombinante y al parecer es la mejor para producir virus recombinante. Otras líneas celulares son por ejemplo la línea celular Hi-Cinco y la Tn-368 y las líneas celulares Tn-368A que se obtienen de la oruga de la col (Trichoplusia ni). El medio que más se utiliza y en el que se cultivan células de insectos puede ser por ejemplo: TNM-FH, BML-TC/10, E IPL-41. Estos medios se suelen complementar con componentes más o menos definidos, como suero de mamífero, en particular suero de ternera fetal. También se han aplicado reposiciones de suero a cultivos de célula de insecto y se encuentran en el comercio medios libres de suero como Ex-cell 400^{TM} y Sf900.

Las células de insecto crecen por lo general sobre soportes sólidos así como en suspensión, pero al parecer ofrecen mayores rendimientos de virus cuando se cultivan sobre soportes sólidos. La infección presenta una eficacia máxima cuando las células se infectan en la fase de crecimiento exponencial pero la cantidad de poliedros y de virus producido por célula no varía sin embargo de forma notable entre células infectadas durante diferentes etapas del ciclo celular. La densidad celular ejerce una gran influencia en la producción de virus. Las células de insectos pueden mostrar una forma de inhibición de contacto que tiene como resultado una producción reducida de virus con densidades celulares mayores.

La multiplicidad inicial de infección (m.o.i.) que es el número de virus infecciosos por célula, influye por lo general tanto en la fracción de células infectadas como en el número de poliedros por célula al final de la infección. La m.o.i. óptima para la producción de virus se sitúa por lo general en torno a 20-30. En un estudio (Licari and Bailey, Biotech. Bioeng., 37: 238-246, 1991), con un baculovirus recombinante que expresa (\beta-galactosidasa, se infectaron células Sf-9 con valores de m.o.i. comprendidos entre 0 y 100. El rendimiento de (\beta-galactosidasa aumentó y la densidad celular disminuyó al aumentar la m.o.i. Se considera en general que el aumento o la disminución de la m.o.i. solo ejerce un efecto limitado en el rendimiento máximo que se puede obtener de una proteína recombinante por célula infectada. No obstante, eligiendo una m.o.i. baja, se puede reducir la estirpe vírica necesaria para la infección y minimizar el riesgo de generación de partículas de baculovirus defectuosas que intervienen. Si se infecta un cultivo en lotes de células de insecto con una m.o.i. elevada (>5), el proceso de infección resultante será prácticamente sincrónico, es decir que todas las células pasarán simultáneamente por el ciclo de infección. Si se infectan células con una m.o.i. igual a 1-5 en un cultivo por lotes, el cultivo ya no será sincrónico. El cultivo estará compuesto inicialmente por células no infectadas y células a diferentes puntos de su ciclo individual de infección, hasta que todas las células estén infectadas y finalice la producción de proteínas deseadas. Por lo general, en estos cultivos, los niveles de producción son mucho más bajos. El comportamiento del cultivo es el comportamiento combinado de las células individuales que se encuentran cada una de ellas en una fase diferente de producción, lo que explica los niveles de producción inferiores al nivel óptimo. En un cultivo continuo se añaden de forma continua células no infectadas y el cultivo quedará obviamente infectado de forma asincrónica.

Diseñando modelos matemáticos, se piensa poder predecir comportamientos complejos tales como los observados en la infección de células con una m.o.i. baja o cuando se propagan virus en un sistema de cultivo continuo. Un análisis puramente empírico del mismo fenómeno se considera muy difícil si no imposible. En la actualidad, se conocen tres modelos, el modelo de Licari & Bailey, el de Gooijer y el de Power & Nielsen. Pese a su complejidad y al esfuerzo que ha supuesto desarrollarlos todos ellos son modelos de primera generación que postulan en torno al comportamiento de baculovirus que expresan una proteína recombinante modelo (\beta-galactosidasa) expresada bajo el control del promotor de polihedrina. Constituyen, en gran medida, la compresión cuantitativa actual que tenemos de la interacción entre el baculovirus y las células de insecto cuando se considera como un sistema de caja negra, sin atender al ciclo de infección y acumulación de ARN y ADN. Los procesos de fijación y de infección inicial se entienden todavía muy poco desde el punto de vista cuantitativo y se necesita realizar más trabajos en este campo.

El sistema de expresión de baculovirus ofrece una potente herramienta para la producción de proteína recombinante. Se pueden utilizar diversas configuraciones de cultivo celular para la producción a gran escala. Estos sistemas sin embargo necesitan una mayor optimización para aprovechar plenamente su potencial. La producción a gran escala y a bajo coste es fundamental para las aplicaciones comerciales. Los sistemas de producción de poliedros referidos en cultivos celulares a gran escala deberán mejorarse considerablemente para satisfacer las demandas comerciales de un producto competitivo en cuanto al precio.

La invención proporciona un método para la producción recombinante a gran escala de proteína E2 o E^{rns} pestivirus o fragmentos inmunogénicos de la misma o de FSH utilizando el sistema de expresión de baculovirus que permite rendimientos mayores o mejorados de la proteína deseada. La invención proporciona un método para producir y mejorar el rendimiento de una proteína recombinante en un cultivo de célula de insecto que comprende la selección de un baculovirus recombinante que codifica dicha proteína, el cultivo de células de insecto en medio de cultivo en un recipiente de cultivo, y la infección de las células con una multiplicidad de infección comprendida entre 0,005 y 0,00025.

La invención proporciona un método para aumentar el rendimiento de una proteína recombinante E2 o E^{rns} pestivirus producida en un cultivo celular de insecto, que comprende la selección de un baculovirus recombinante que codifica dicha proteína, el cultivo de células de insecto en medio de cultivo en un recipiente de cultivo, y la infección de las células con un inóculo de por lo menos un baculovirus con una multiplicidad de infección de <0,01. El objetivo de varios grupos de investigación ha sido incrementar el rendimiento. Por ejemplo, Chen et al, (Drug metabolism and Disposition: 24 p399-405, 1997) estudió la posibilidad de optimizar la MOI para un método de co-infección, donde se produjeron dos proteínas diferentes expresadas por baculovirus en cultivo celular de insecto. Contrariamente a los resultados descritos aquí, encontraron para sus dos proteínas una MOI mejor de aproximadamente 0,015 a 0,03. El hecho de reducir la MOI a <0,01 se redujo el rendimiento del sistema de co-infección de Chen et al. Radford et al (Cytotechnology 24, 73-81, 1997) al no existir ningún impedimento al estudiar un sistema de co-infección, indica claramente que se tiene que utilizar siempre una MOI >1 para maximizar los rendimientos del proceso final, lo cual supone nuevamente algo contrario a los resultados de la presente invención. Afirman que es imposible producir cantidades mayores de proteína y virus por célula utilizando una MOI baja, y sugieren por el contrario que se ajuste el tiempo de infección (TOI).

Otros, como Nguyen (J. Biotech. 31, 205-217, 1993) no consideran que sea una solución cambiar la MOI y su objetivo es aumentar los rendimientos aplicando cultivos en lotes alimentados (fed-batch), o cambiar la temperatura bajo la cual se cultiva el virus (Wu et al, Cytotechnology, 9, 141-147, 1992; King et al Biotechnol Bioeng, 38, 1091-1099, 1991) y evitar cultivar el virus por debajo de MOI <0,01.

Estos resultados iniciales difieren claramente de los facilitados en esta descripción (véase por ejemplo la Figura 1), donde los cultivos infectados con una MOI <0,01 (como 0,003, 0,001 o incluso 0,0001) obtuvieron vendimientos superiores a los obtenidos con cultivos infectados con una MOI de 0,01 o 0,1.

Una realización preferida de la invención proporciona un método para producir y mejorar los rendimientos de una proteína recombinante en cultivos celulares de insecto no cultivados en cultivos monocapa. Los métodos de laboratorio convencionales para producir proteínas en el sistema de vector de expresión de baculovirus en pequeñas cantidades utilizan cultivos monocapa de células de insecto en matraces de cultivo. Estos cultivos estáticos son infectados normalmente con una MOI elevada, para garantizar una infección sincrónica. Es fundamental que todas las células sean infectadas antes de que la monocapa se haya vuelto confluente ya que la inhibición de contacto conducirá a cambios metabólicos en las células, que pueden afectar el rendimiento del producto final.

Como es difícil establecer de forma precisa la densidad celular en cultivos monocapa, es imposible realizar experimentos de MOI. Resulta incluso menos útil utilizar una MOI baja (<0,01) para infectar los cultivos. La sobre- y la infra-estimación de la densidad celular en el momento de la infección conducirá a un rendimiento proteínico notablemente inferior al óptimo. Se utiliza rutinariamente una MOI elevada, que garantiza una infección sincrónica de toda la población celular. Esto supone que se necesitan grandes estirpes (stocks) de virus para infectar el cultivo monocapa y lograr rendimientos óptimos.

El hecho de aumentar proporcionalmente la producción de proteína utilizando cultivos monocapa significa simplemente utilizar más matraces de cultivo de tejido. La producción de grandes cantidades de proteína utilizando cultivos monocapa requiere mucho trabajo. Además, no es posible regular y/o controlar y seguir parámetros importantes del cultivo, como la concentración de oxigeno disuelto y el pH. La invención ofrece ahora un método adecuado para todos los cultivos de células de insectos; la invención permite comprender mejor que una MOI baja resulta beneficiosa para optimizar el rendimiento en cultivos de insectos que no sean cultivos monocapa.

Se pueden utilizar diferentes tipos de recipientes de cultivo para cultivar células de insectos que no sea en cultivo monocapa. El objetivo de cada diseño de fermentador es lograr una aireación suficiente y una elevada densidad celular, manteniendo las fuerzas de cizallamiento lo más bajas posible (Tramper et al. In: Recent advantages in biotechnology (eds. Vardar-Sukan and Sukan) 1992). En la mayoría de los casos descritos en la literatura, se utiliza un bioreactor de depósito agitado, equipado con un tubo burbujeador de gas. En este tipo de recipiente, se logra la homogeneidad utilizando un impulsor. Este tipo de fermentador se puede utilizar en varios métodos diferentes. En primer lugar, el método de lotes. Este es el método más sencillo y claro. Se cultivan las células, se añade virus y el producto se cosecha al final de la infección. Un método más complicado es el cultivo por lote alimentado (fed-batch). Se añade una mezcla concentrada de nutrientes al recipiente de cultivo para lograr mayores densidades celulares y mayores rendimientos volumétricos del producto (Nguyen et al. 1993 Journal of Biotechnology vol. 31, p.205-217). Resulta más complicado ya que no está siempre claro qué es el untriente limitador. El hecho de anular una limitación de untriente añadiendo este sustrato puede conducir directamente a otra limitación de sustrato y por lo tanto no necesariamente a mayores rendimientos de producto.

En bioreactores de elevadores neumáticos se utiliza un método diferente de mezcla (Wu et al. 1992 Cytotechnology vol. 9 p. 141-147). Este tipo de recipiente consta de dos cilindros. El cilindro con el diámetro más pequeño (tubo de tiro) se coloca en el interior del cilindro de diámetro mayor (tubo vertical de bajada). En el cilindro central se introduce aire u otro gas que crea una corriente hacia arriba. En la parte superior del fermentador, el gas sale del fluido y el fluido baja saliendo del cilindro central. De este modo, se consiguen tanto la ventilación como la homogeneidad utilizando la pulverización de gas solamente, debido a la diferencia de densidad en el tubo de tiro y el tubo vertical descendente. Este método puede reducir los esfuerzos de cizallamiento. No obstante, se necesita una ventilación continua para lograr una mezcla adecuada.

Otro método para aumentar la densidad de células vivas en un fermentador consiste en incluir un filtro giratorio (spin filter) u otro dispositivo de retención celular. Esto recibe el nombre de perfusión. Esto permite eliminar del fermentador el medio de desecho y añadir medio reciente, manteniendo las células en el fermentador. Este método supone la necesidad de muchos equipos suplementarios y mayor dificultad en el manejo del fermentador (Caron et al. 1994 Biotechnology and Bioengineering vol. 43, p. 881-891). Además, se mencionan métodos como el de
lecho - macroporoso e inmovilización en una matriz de gel. Este tipo de métodos se basa en la inmovilización de las células sobre o en el interior de una matriz, lo cual permite eliminar el medio de desecho y añadir medio fresco sin diluir el cultivo celular. Si se pudieran controlar las densidades celulares, la inhibición de contacto y otros problemas afines de los cultivos monocapa, un método como el de la invención, no solamente se podría aplicar en los diversos sistemas de cultivo anteriores sino también en un cultivo monocapa.

Por ejemplo, una realización preferida de la invención proporciona un modelo para producir y mejorar el vendimiento de una proteína recombinante en cultivos de células de insecto que comprende la selección de un baculovirus recombinante que codifica dicha proteína, el cultivo de células de insecto en un medio de cultivo, en un recipiente de cultivo con un volumen suficiente para contener al menos dos litros y la infección de las células de insecto con un inóculo de al menos un baculovirus con una m.o.i. de <0,01 PFU de dicho baculovirus/célula. La invención proporciona un método en el que se utilizan multiplicidades de infección, considerablemente inferiores por ejemplo a la m.o.i. de 1-5 que conduce a un cultivo infectado asincrónicamente. Al infectar cultivos de insectos con un baculovirus utilizando una m.o.i. como la que ofrece la invención, se logra un equilibrio optimo entre la velocidad de replicación de las células en relación con la velocidad de replicación del virus, permitiendo de este modo una expresión óptima de la proteína deseada. Un método facilitado por la invención puede ajustarse fácilmente a densidades celulares superiores o inferiores, ajustando también la m.o.i., en cuyo caso la proporción relativa de partículas de virus disponibles para infectar las células en las diversas fases de replicación permanece dentro de las multiplicidades y densidades proporcionadas por la invención. Una realización preferida del método según la invención comprende el cultivo de las células en un recipiente de cultivo con un volumen suficiente para contener por lo menos 10, de preferencia por lo menos 20 y todavía mejor por lo menos 50 o 250 litros de medio de cultivo, lo cual permite aumentar proporcionalmente los cultivos de baculovirus que expresan proteínas heterólogas. Se puede utilizar por ejemplo un recipiente de cultivo con un volumen superior al que se necesita para el volumen de medio de cultivo existente, por ejemplo se pueden utilizar recipientes de cultivo de 100 litros para cultivar 20-70 litros de cultivo celular. Una realización preferida del método según la invención comprende la infección de las células a una densidad celular de 1 x 10^{5} a 5 x 10^{6} células/ml, de preferencia 5 x 10^{5} a 1,5 x 10^{6} células/ml, manteniendo el volumen real del inóculo de virus dentro de límites fácilmente manejables. Otra realización más del método según la invención comprende la infección de células con una m.o.i. \leq 0,005 m, como p. ej. 0,003, 0,001, 0,0005 o 0,00025, manteniéndose el inóculo más reducido posible. Una realización preferida del método según la invención comprende la selección de un baculovirus recombinante que expresa la proteína deseada bajo el control del promotor p10. El promotor p10 desempeña un papel en la lisis celular, la ausencia de la proteína p10 hace que las células infectadas permanezcan intactas y evita la liberación de poliedros de las células infectadas, reduciendo de este modo las tasas de reinfección aunque no la infectividad per se. Se puede comprobar ahora visualmente todo el proceso de infección por virus debido al hecho de que el gen de polihedrina y por lo tanto los poliedros están todavía presentes. La infección por virus se puede observar como partículas proteínicas densas que se acumulan en el núcleo celular. Otra realización del método según la invención, comprende el cultivo de las células infectadas en un sistema de cultivo por lotes, minimizando de este modo la acumulación de partículas de baculovirus defectuosas que pueden interferir y comprometer la infección y la replicación de células no infectadas todavía. Otra realización del método proporcionado por la invención comprende el cultivo de las células de insecto en suspensión, de preferencia en un recipiente de cultivo como un fermentador que se puede agitar (moderadamente). La utilización de cultivos en suspensión (agitados), especialmente si se combinan con la utilización de un baculovirus recombinante en el que la proteína deseada se encuentra bajo el control del promotor p10 para comprobar visualmente el crecimiento de virus (aunque también existen otros métodos de comprobación, por ejemplo en el caso de utilizar en promotor de polihedrina, como por ejemplo la observación de CPE) permite un mejor control
del cultivo.

La agitación moderada de la suspensión garantiza un cultivo homogéneo en el que no se forma ningún gradiente de sustrato y en el que las células no están sometidas a fuerzas de cizallamiento demasiado elevadas. Además, el hecho de agitar tiene como resultado una transferencia eficaz de virus desde células infectadas a células no infectadas, ofreciendo una mayor eficacia de la infección del virus por las células. Como inicialmente solo están infectadas aproximadamente 0,1-0,3% de las células, el 99,7-99,9% restante de las células puede crecer y multiplicarse.

La invención proporciona un método para expresar y producir proteína recombinante de orígenes varios. Uno de los ejemplos que ofrece la invención es la producción de proteína activada por pestivirus hasta una concentración de dicha proteína en el medio de cultivo en el momento de la recolección de por lo menos 100, 120 o 150 \mug/ml, todavía mejor por lo menos 200 e incluso 300 \mug/ml. La proteína deseada también se puede utilizar para preparar sustancias antigénicas para uso veterinario o médico, por ejemplo incorporada en una vacuna o en una prueba diagnostica. La proteína deseada producida por un método según la invención puede utilizarse por ejemplo para preparar una
vacuna.

Una de las proteínas proporcionadas por la invención es la proteína E2 de pestivirus o fragmentos de la misma que se puede utilizar por ejemplo para preparar una vacuna contra infecciones por pestivirus, como la clásica fiebre de los cerdos. En una realización preferida, la invención presenta una vacuna que comprende proteína E2 o E^{rns} de pestivirus recombinante o fragmentos de la misma, caracterizada porque no se purifica por inmunoafinidad y confiere de preferencia protección contra una infección por pestivirus al nivel PD95 tras una sola vacunación con una dosis. Esto resulta particularmente relevante para vacunación CSFV. Cuando se aplica, la vacunación CSFV se realiza por lo general durante una campana a gran escala en una zona en la que ha producido un brote de CSFV. Esto requiere una vacunación rápida de grandes números de animales en un período de tiempo relativamente corto. En este tipo de campana a gran escala es muy importante lograr rápidamente un nivel de protección adecuado (el número de cerdos protegidos contra la infección por virus natural. El hecho de esperar varias semanas tras una primera vacunación para realizar una segunda vacunación con el objetivo de lograr una protección dificulta gravemente y retrasa el control de la enfermedad. Existen diferencias entre los diversos métodos para producir la proteína E2 expresada recombinantemente incluso comparando E2 (fragmentos) expresados en baculovirus. En cultivos para producción de proteína E2 descritos anteriormente, el rendimiento de proteína E2 (fragmento) oscilaba entre 20-90 \mug/ml (Hulst et al., J. Virol. 5435-5442, 1993; Hulst and Moormann, Cytotechnology 20:271-279, 1996), y requería purificación por inmunoafinidad con anticuerpos monoclonales para obtener la masa antigénica E2 relevante para una sola dosis de vacunación. Otro de los métodos (que utiliza un fragmento de E2 descrito en el documento EP 0389034), que utiliza E2 cosechado del sobrenadante de células de insecto sin ulterior purificación por inmunoafinidad, da como resultado una vacuna a base de E2 que se inyecta dos veces antes de obtenerse una respuesta inmune (protectora) satisfactoria. Si bien se encuentra actualmente registrada una vacuna (Porcilis®Pesti) que comprende antígeno E2, esta vacuna necesita aplicarse dos veces, dificultando de este modo gravemente la utilidad de la vacunación contra las infecciones por fiebre de cerdo clásicas con esta vacuna ya que requiere por lo menos dos vacunaciones, con un intervalo de 4 semanas, para proporcionar la respuesta inmune deseada. Estos problemas (que se resuelven con la presente solución), entre otros, son debidos a una baja concentración de la sustancia antigénica relevante, en este caso la proteína E2 (fragmento) en el material inicial, por ejemplo el sobrenadante de cultivo celular, a partir del cual se prepara la vacuna. En teoría, se puede seguir acumulando masa antigénica con métodos de purificación y condensación conocidos en el estado de la técnica pero esto no conduce a producción de vacuna comercialmente atractiva sino que supone unos costes elevados por dosis. Otro ejemplo es la proteína E^{rns} pestivirus que también se puede utilizar en una vacuna y en pruebas diagnosticas o en otras sustancias
(terapéuticas).

Por ejemplo, Ruggli et al (Virus Genes 10:115-126, 1995) cultivan un baculovirus que expresa E2 en cultivo de célula de insecto monocapa con un máximo rendimiento de no más de 5-10 \mug/10^{6} células. Por otra parte Moser et al (Vet. Microbiol. 51:41-53) cultivan el E2 de Ruggli et al en cultivo de célula de insecto monocapa utilizando una MOI de 5 y no puede producir suficiente antígeno de forma no concentrada para fines de ELISA. En su experiencia, constituye un requisito previo la purificación ulterior por cromatografía por afinidad níquel-quelato de la proteína para simplificar la manipulación y mejorar la calidad de ELISA. No se contemplaba ninguna preparación de vacuna con la proteína E2 preparada a tal efecto.

\newpage

Cuando el objeto de la investigación era la vacunación, se vio que la vacunación necesitaba realizarse dos veces, utilizando una proteína E2 inmunopurificada para lograr cierta medida de protección. Por ejemplo, en Hulst et al (J. Virol. 67:5435-5442, 1993), documento WO 95/35380 y van Rijn et al (J. Gen. Virol. 77:2737-2745, 1996), se produjo E2 en monocapas y se purificó por inmunoafinidad para lograr una vacuna de protección.

Uno de los ejemplos que ofrece la invención es una vacuna que comprende proteína (fragmentos) E2 CSFV recombinante que, ahora que se pueden producir grandes cantidades suficientes, ya no necesita la purificación por inmunoafinidad antes de incorporarse a una vacuna que confiere protección (a un nivel de dosis de protección de 95% (PD95)) contra una infección clásica por virus de fiebre porcina dentro de las dos o tres semanas de haber recibido los animales una sola vacunación con una dosis. Un método presentado por la invención ofrece una vacuna que comprende proteína E2 o E^{rns} de pestivirus recombinante o fragmentos de la misma que confiere protección contra una infección por pestivirus tras una sola vacunación con una dosis. Aunque la proteína (fragmento) no ha sido purificada por inmunoafinidad. La invención también ofrece una vacuna que comprende una proteína presentada por la invención que comprende adicionalmente un adyuvante. El experto en la materia conoce los adyuvantes adecuados, como por ejemplo adyuvante de Freund o hidróxido de aluminio o emulsión como por ejemplo emulsiones de agua en aceite o doble emulsión de agua en aceite o de aceite en agua. La proteína deseada también se puede utilizar para preparar otras sustancias, por ejemplo para uso veterinario o médico. Otro ejemplo más proporcionado por la invención es una sustancia similar a una hormona como la hormona estimuladora de folículo (FSH, unidades \alpha y/o unidades \beta y complejos y fragmentos de las mismas), que se pueden producir por ejemplo infectando un cultivo celular de insecto con un baculovirus que expresa la unidad \alpha y/o con otro baculovirus que expresa la unidad \beta en el cultivo. Se puede utilizar también un método según la invención para la producción a gran escala y con bajo coste de baculovirus (recombinantes) como bioinsecticidas. Una realización preferida es la utilización de virus recombinantes que utiliza el promotor p10 para expresión de genes extraños en la producción de bioinsecticidas ya que los insectos resultan por lo general menos infectados por baculovirus al carecer del gen poliédrico. El especialista en la materia conoce el cultivo de otros baculovirus recombinantes que expresan otras proteínas recombinantes con un método según la invención y la producción y/o utilización de dichas proteínas de virus para su incorporación en sustancias o productos insecticidas, médicos, terapéuticos y/o antigénicos. La invención se sigue ilustrando en la parte experimental aunque no se limita a la misma.

Parte experimental

El género pestivirus de la familia Flaviviridae consiste convencionalmente en virus clásicos de la fiebre porcina (CSFV), virus de la enfermedad "border" (BDV) y virus de la diarrea viral bovina (BVDV). Han sido secuenciados los genomas de diversas cepas de BVDV y CSFV (Renard et al., 1987 EP application 0208672; Collett et al., 1988, Virology 165, 191-199; Deng and Brock, 1992, Virology 1991, 865-679; Meyers et al., 18989, Virology 171, 555-567; Moormann et al., 1990. Virology 177, 184-188). Para el BDV, solo se dispone ahora de secuencias de nucleótidos genómicos incompletas. El genoma de pestivirus es una molécula de ARN de cadena positiva de aproximadamente 12,5 kilobases que contiene un marco de lectura abierto grande. El marco de lectura abierto se traduce en una poliproteína hipotética de aproximadamente 4000 aminoácidos, que se procesa mediante proteasas de virus y célula codificados. El marco de lectura abierto está flanqueado por dos regiones pequeñas, dos traducidas, altamente conservadas que intervienen probablemente en la replicación del genoma. La región no codificadora 5' juega también un papel en la iniciación de la traducción.

La poliproteína procesada co- y post- transduccionalmente mediante procesos celulares y virales contiene todas las proteínas virales estructurales y no estructurales (para una panorámica, véase C.M. Rice: In Fields Virology, Third Edition, 1996 Flaviviridae: The Virases and their Replication: Chapter 30: pp. 931-959). Las proteínas estructurales virales, entre las cuales se encuentran las proteínas de envoltura E^{rns}, El y E2, están situadas en la parte terminal N de la poliproteína. Las proteínas no estructurales entre las cuales se encuentran el complejo de replicasa ARN y NS3 de proteasa de serina, NS5A y NS5B están situadas en la parte terminal C de la poliproteína.

Los animales infectados con un pestivirus desarrollan anticuerpos contra E^{rns}, E2 y NS3. No obstante, los anticuerpos dirigidos contra E2 neutralizan fuertemente los virus mientras que los dirigidos contra E^{rns} y NS3 tienen únicamente una capacidad de neutralización de virus baja o ninguna en absoluto. Este hecho nos indujo a iniciar la evaluación de la idoneidad de E2 como vacuna de marcador de subunidad CSF. En esta configuración, E^{rns} y/o NS3 se podrían utilizar para desarrollar el test de diagnóstico que acompaña la vacuna de marcador E2.

Hasta la fecha se han aislado BDV y BVDV de especies diferentes, ya que al parecer CSFV se limita a los cerdos. Los pestivirus son estrechamente afines desde el punto de vista estructural y antigénico. La glicoproteína de envoltura E2 es la proteína más inmunogénica y más variable de los pestivirus. Clonamos genes de E2 de muchas cepas diferentes de pestivirus, inclusive las procedentes de un ciervo y de una jirafa. Se expresaron transitoriamente los genes de E2, se caracterizaron con anticuerpos monoclonales, se secuenciaron y se compararon, P.A. van Rijn et al., 1997, Virology, 237: 337-348. Tomando como base estos datos, podemos señalar seis grupos importantes dentro del género de pestivirus. Cuatro grupos corresponden a genotepos definidos, y los otros dos grupos son genotipos nuevos dentro del género de pestivirus. Un grupo comprende cepas de CSFV aisladas de cerdo. Un segundo grupo consiste en cepas BVD Moredun, L83 y X818, que han sido aisladas de ovejas y la cepa F de cerdo. Un tercer grupo contiene la cepa BD78 de ovejas, cepa 5250 de cerdos y cepa 178003 de ganado. Tomando como base el E2, estos virus son muy similares a las cepas de BVDV asociadas con brotes graves y agudos de diarrea viral bovina, que reciben el nombre de BVDV de tipo 2. El cuarto grupo consiste en cepas de BVDV procedentes predominantemente de ganado. Este grupo BVDV se puede dividir en dos subtipos o subgrupos BVDV-1a y 1b: BVDV contiene virus de los Estados Unidos como NADL y Oregon, y algunos otros, como 150022 y 1138 de Europa. El subgrupo BVDV-1b contiene la cepa Osloss y varios aislados holandeses. El quinto y sexto "grupo" se podrían proponer como dos nuevos genotipos y contienen cepas de ciervo y de jirafa, respectivamente.

El desarrollo de vacunas de marcador para uso Viterinario ha conducido a nuevos conceptos para el control y la erradicación de enfermedades virales económicamente importante de ganado. La utilización de una vacuna de marcador permite la discriminación serológica entre animales vacunados y animales infectados por virus en campo (field-virus), y por lo tanto la eliminación controlada del virus. Por ejemplo, en la mayoría de los Estados Miembros de la UE se permite la vacunación contra la enfermedad de Aujeszky (AD) con vacunas gE-negativas solamente. Los animales infectados con un virus de campo AD, si que desarrollan anticuerpos contra gE. Se utiliza un test ELISA que detecta estos anticuerpos, para la detección de animales infectados, que se pueden eliminar ulteriormente del rebaño y para controlar el estado de las infecciones por virus de campo en un rebaño durante campañas de vacunación (prolongadas). Finalmente, el objetivo es lograr que un rebaño esté libre de virus de campo. La vacunación se puede interrumpir entonces y debería introducirse un programa de vigilancia serológica para mantener esta situación. Por consiguiente, la vacunación con una vacuna de marcador reducirá los costes de las campañas de erradicación que se basan en descartar los rebaños infectados en lugar de descartar únicamente los animales individuales infectados, y se realiza a gran escala y durante un período de tiempo suficientemente largo, puede constituir incluso un método más rápido para conseguir una población de cerdos libre de virus de campo en lugar de descartarlos.

Ahora y en el futuro, cuando se haya erradicado las enfermedades endémicas actuales como AD, se podrán seguir utilizando vacunas de marcador, por ejemplo para controlar los brotes de enfermedades que han sido erradicadas de la población, y contra las cuales ya no existe ninguna vacunación de rutina. En tales casos, cuando una población de animales es serológicamente "naive" (carece de tratamiento previo) solo pueden extenderse de forma explosiva las enfermedades altamente contagiosas y causar entonces perdidas económicas enormes.

Muchos ejemplos han mostrado que el sistema de baculovirus soporta la expresión a alto nivel de proteínas heterólogas. La expresión a alto nivel resulta altamente ventajosa ya que las vacunas de subunidad muertas solo son, por lo general, capaces de provocar una respuesta inmune protectora si se aplica una gran cantidad de antígeno. En nuestro primer enfoque, se construyeron dos baculovirus recombinantes, uno que expresa E2 con un TMR (BacE2[+]) y el otro que expresa E2 sin un TMR (BacE2[-]), (Hulst et al, 1993, J. Virol. 67:5435-5442). Hay que señalar que en esta publicación y en otras publicaciones comparables, E2 sigue teniendo su antiguo nombre El. Se secretó E2 sin un TMR en el medio de cultivo celular y mientras que no ocurrió lo mismo con el E2 con un TMR.

Además, ambos E2s reaccionaron de forma idéntica con anticuerpos monoclonales que representaban cada uno de los cuatro dominios antigénicos en E2. Esto sugería que las propiedades antigénicas de E2 secretado y asociado a la célula eran idénticas, y como el E2 secretado se produjo en niveles mucho mayores que el E2 asociado a la célula (diez veces más), se decidió probar E2 purificada por inmunoafinidad, secretada en una prueba de vacunación en cerdos. Se prepararon dos formulaciones de vacunas que contenían 20 \mug/E2/ml y 100 \mug E2/ml en un adyuvante doble de agua-aceite. De los cuatro grupos de dos cerdos SPF, dos fueron vacunados IM con 20 \mug de ED y dos con 100 \mug de E2. Después de 28 días, se revacunaron con la misma dosis de E2 un grupo vacunado con 20 \mug de E2 y un grupo vacunado con 100 \mug de E2. El día 42 todos los animales se expusieron por vía intranasal a Brescia de cepa CSFV virulenta. Independientemente de la dosis de vacuna aplicada todos los cerdos vacunados tenían anticuerpos neutralizantes montados el día 28, aunque a niveles diferentes. Hasta el día 42, el día de la exposición, los volúmenes de anticuerpo siguieron aumentando hasta niveles elevados en todos los animales independientemente de que hubieran sido revacunados o no. Por consiguiente no resultó sorprendente que incluso los animales vacunados una sola vez con una dosis de 20 \mug E2 purificada por inmunoafinidad, estuvieran ya completamente protegidos contra CSF (Hulst et al., 1993 J. Virol. 67: 5435-5442).

Debido a que los animales infectados con pestivirus desarrollan invariablemente anticuerpos contra E^{rns} (Kwang et al., 1992, Vet. Microbiol. 32: 281-292), una segunda glicoproteína de envoltura viral, es una de las proteínas virales más adecuadas para el desarrollo de la prueba diagnóstica en conjunción con E2. No obstante, existe también un informe que sugiere que E^{rns} podría ser un antígeno importante para la protección de cerdos contra CSF (Köning et al., 1995, J. Virol. 69:6479-6486). En estos estudios E^{rns} se expresó con un vector de virus vaccinia en vivo. Los animales vacunados simultáneamente por tres vías diferentes (intradermal, intravenosa e intraperitoneal) con 5 x 10^{7} PFU de virus recombinante vaccinia- E^{rns} por lugar de infección, sobrevivieron a una exposición IN a una dosis letal de Alfort cepa CSFV a las 5 semanas de la vacunación, sin mostrar ningún signo de CSF.

Para evaluar la idoneidad de E^{rns} como vacuna de subunidad muerta, se probó en cerdos E^{rns} expresado por baculovirus de cepa Brescia (según Hulst et al., 1994, Virology, 200:558-565). Se vacunaron una vez IM, grupos de seis cerdos SPF con 5,0 y 20 \mug E^{rns}, respectivamente (Moormann et al., 1996, Proc. 14^{th} Intern. Pig. Vet. Society Congress, pp. 25-29, Bolonia, Italia). Un tercer grupo de cuatro cerdos SPF no vacunados sirvió de control. Tres semanas después de la vacunación se expusieron todos los animales IM a 10^{5} TCID_{50} de cepa Behring. Dentro de los 5 días siguientes a la exposición, todos los animales vacunados con la dosis más baja de E^{rns} desarrollaron síntomas graves de CSF. Dentro de los 14 días siguientes a la exposición, murieron dos animales, tres se mataron al estar moribundos y uno al parecer se recuperó. Cinco de estos animales, inclusive el que se recuperó tenían IFT positivo. Tras la exposición, todos los animales vacunados con la dosis más elevada de E^{rns} mostraron signos más o menos graves de CSF y fiebre alta durante varios días, pero dentro de los 14 días, 4 de cada 6 animales se recuperaron, un animal murió y otro se mató al estar moribundo. De los cuatro animales supervivientes únicamente 1 mostró IFT positivo. Por el contrario, todos los animales de control mostraron síntomas graves de CSF dentro de los cinco días siguientes a la exposición, murieron dentro de los 14 días siguientes de la exposición y tuvieron un IFT positivo (Moormann et at., 1996, Proc. 14^{th} Intern. Pig. Vet. Society Congress, pp. 25-29, Bolonia, Italia).

Sacamos como conclusión que el E^{rns} expresado por baculovirus puede proteger a los cerdos contra una exposición de CSFV heteróloga, aunque con una eficacia muy inferior a la de E2 expresado por baculovirus.

La hormona de estimulación del folículo (FSH) pertenece a la familia de hormonas glicoproteínicas producida en la pituitaria (hormona luteizante, LH; hormona estimulante de la tiroides, TSH) o en la placenta (gonadotropina coriónica humana, hCG; gonadotropina de suero de yegua preñada PMSG). Dentro de una especie, cada una de estas hormonas comprende una subunidad alfa común, unida no por covalencia a una subunidad beta específica de la hormona. La FSH purificada administrada sola o en combinación con LH, es ampliamente utilizada para inducir una respuesta superovulatoria en muchas especies, inclusive en el ganado.

Un problema en la vaca es que la FSH bovina resulta difícil de purificar en cantidades sustanciales a partir de pituitarias bovinas. Por esta razón, se suele utilizar FSH de origen ovino (oFSH), porcina (pFSH) o equino (eFSH, PMSG) para el tratamiento de superovulación de las vacas. No obstante, no carece de riesgo la aplicación de material derivado de tejido cerebral debido a la posible presencia de proteínas afines a priones que pueden causar la encefalopatía espongiforme bovina (BSE) en las vacas, y posiblemente una variante de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (CJD) en los humanos. Además, la utilización de material derivado de placenta presenta la desventaja de una semivida biológica muy larga que requiere su neutralización mediante la inyección de anticuerpos específicos. Finalmente, todas las preparaciones de FSH que se utilizan en la actualidad, contienen alguna actividad LH que se considera responsable, por lo menos en parte, de la gran variación observada en los resultados de superovulación.

Por estas razones, parece probable que el tratamiento de la superovulación de vacas se pueda beneficiar de la aplicación de FSH bovino recombinante (rbFSH) producido en células no de mamíferos, como células de insectos (sistema de expresión de baculovirus).

Materiales y métodos 1. Ejemplo de la preparación de un cultivo celular de producción (PCS) de células SF21

Se descongeló hasta una temperatura de 20-30º un criofrasquito con 1,5 ml de siembra de célula de explotación (working) SF21 (WCS) (número total de células = 4-10 x 10^{6} células/ml). Después de la descongelación, el contenido del frasquito se llevó a un tubo Falcon de 15 ml, que contenía 8,5 ml de medio libre de suero SF900II, y se suspendió. Tras la suspensión, el contenido del tubo Falcon se centrifugó a 100-200xg durante 10 minutos para precipitar las células. El medio se desechó y se suspendió el residuo en 4-6 ml de SF900II. Las células suspendidas se transfirieron a un matraz de agitación de 100 ml que contenía 10 ml de SF900II. Las células se cultivaron durante 3-7 días a 26-30ºC colocando el matraz sobre una plataforma agitadora orbital a 40-80 rpm. El crecimiento y la viabilidad celular se controlan tomando muestras durante el proceso. Cuando la densidad celular es de 1,0-6,5 x 10^{6} células/ml, las células se pasan a dos matraces de agitación de 500 ml, que contienen 100 ml de SF900II cada uno. Esto corresponde a una dilución 10 veces superior de las células. Nuevamente, se cultivan las células durante 3-7 días a 26-30ºC colocando el matraz sobre una plataforma agitadora orbital que se mueve a 40-80 rpm. El crecimiento y la viabilidad celular se controlan constantemente durante el proceso. Cuando la densidad celular es de 1,0-6,5 x 10^{6} células/ml, las células se hacen pasar por segunda vez, en este caso a 6-11 matraces de agitación de 500 ml que contienen 100 ml de SF900II cada uno. Se desecha el material celular en exceso. También en este caso, se logra una dilución de 10 veces. Las células se cultivan durante 3-7 días a 26-30ºC colocando el matraz sobre una plataforma agitadora orbital que se mueve a 40-80 rpm. El crecimiento y la viabilidad celular se controlan constantemente durante el proceso. Cuandola densidad celular es de 1,0-6,5 x 10^{6} células/ml, se hace pasar 500 ml ó 1000 ml de la suspensión que contiene la célula a un fermentador de 5 litros o de 10 litros, que contiene aproximadamente 4,5 litros ó 9 litros de SF900II respectivamente. Esto corresponde a una dilución de las células de 10 veces. Las células se cultivan durante 3-7 días a 26-30ºC. La suspensión se agita constantemente (50-100 rpm). El crecimiento y la viabilidad celular se controlan constantemente durante el proceso. Cuando la densidad celular es de 1,0-6,5 x 10^{6} células/ml, el contenido del fermentador de 5 litros se pasa a un fermentador de 50 litros que contiene aproximadamente 40 litros de SF900II. Las células se cultivan a 26-30ºC hasta alcanzar una densidad de \pm 5-15 x 10^{5} células/ml. La suspensión se agita constantemente (50-100 rpm). Se toman muestras para el control durante el proceso.

2. Ejemplo de producción de antígeno E2

Se añade a la suspensión celular antes citada, 1-2 ml de virus de siembra de explotación (WVS) (BacE2[-]), que contiene \pm 10^{7} TCID_{50}/ml. La suspensión se incuba a 28ºC durante 3-8 días hasta que el 70-100% de las células muestran un efecto citopático. Durante la incubación, se toman muestras para realizar el control durante el proceso. Seguidamente, la suspensión se aclara quitando las células por microfiltración. El filtrado obtenido (es decir la solución de antígeno) se recoge y almacena a \leq-20ºC hasta que se inicia la etapa de inactivación (3,3). Se toman muestras para el control durante el proceso. Para determinar el contenido de antígeno, se someten a pruebas las muestras por ejemplo en un inmuno ensayo ligado a una enzima para determinar la masa antigénica, o en un ensayo proteínico para determinar el peso real por volumen de la proteína de agua o combinando estos métodos.

3. Ejemplo de inactivación de virus

El virus se inactiva añadiendo 2-bromoetil-amonio bromuro (BEA) a una concentración de 10 mmol/l. Ajustando el pH a 8,2-8,7 y la temperatura a 34-37ºC, se convierte el BEA en 2-bromoetil-inminabromuro (BEI), que es el componente activo para inactivar el virus. Se comprueba la inactivación del virus tomando muestras durante el control para el proceso. La inactivación dura 24 -72 horas. Después de la inactivación, pueden estar presentes <1 partícula infecciosa por 10000 litros. Después de la inactivación del virus, se neutraliza el BEI añadiendo tiosulfato sódico en una concentración de 5-25 mol/l y ajustando el pH a 5,7-6,3. Se toman muestras para el control del proceso. La solución de antígeno neutralizada e inactivada se transfiere a unas bolsas de 1 y/o 5 litros y se almacena
a \leq-20ºC.

4. Ejemplo de formulación

La solución de antígeno congelada se descongela a 22-28ºC y se diluye con SF900II o PBS hasta una solución antigénica de 50 \mug/ml. Se añade tiomersal como agente antimicrobiológico hasta 100 \mug/ml. Se toman muestras para el control en el proceso. Esta solución (es decir la primera fase acuosa) se almacena a 2-8ºC durante <3 días. Entre tanto, la fase olea se ha preparado mezclando Marcol 52 con Montanide 80 (9:1). Se almacena también esta solución a 2-8ºC durante no más de 3 días. La fase olea se filtra estéril a través de un filtro estéril de 0,22 \mum. Se toman muestras para el control en el proceso. Finalmente, la segunda fase acuosa se prepara mezclando salino con tampón de fosfato (PBS) o medio SF900II con Montanox 80 (98:2), y se añade tiomersal hasta lograr una concentración final de 100 \mug/ml. Esta solución se almacena a 2-8ºC hasta su utilización (<3 días). Antes de la utilización, se procede a un filtrado estéril la primera fase acuosa. Se toman muestras para el control en el proceso. La primera emulsión se prepara mezclando la primera fase acuosa con la fase olea (1:1,1). Esta emulsión se puede almacenar a 2-8ºC no más de tres días. Se toman muestras para el control en el proceso. La doble emulsión de agua en aceite se prepara emulsionando la primera emulsión con la segunda fase acuosa (2.1:1). La doble emulsión se almacena a 2-8ºC en una sala de almacenamiento de cuarentena hasta rellenarla en frasquitos. Se toman muestras para el control en el
proceso.

5. Ejemplo de llenado y taponado

La doble solución de emulsión se rellena asépticamente en una zona de cale A en la sala limpia. El volumen de relleno es de 51, 102 ó 255 ml en frasquitos de 50, 100 ó 250 ml, respectivamente. El volumen de relleno se controla constantemente, comprobando el peso del volumen rellenado. Inmediatamente después de rellenar, se taponan los frasquitos. Finalmente, los frasquitos se almacenan en una sala de almacenamiento de cuarenta a 2-8ºC, tras lo cual se inicia el control de calidad.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

Ejemplo de esquema para vacuna de subunidad E2 escala fermentador de 50 litros

1

2

3

4

5

6. Ejemplo de experimento de estabilidad de E2 Objeto

Investigar la estabilidad de la proteína E2 en un cultive celular infectado (MOI*0,0001) tras cultivo prolongado en condiciones por otra parte normales. Debido a la naturaleza lítica del proceso infeccioso del baculovirus en el cultivo celular, pueden liberarse proteasas en el medio, ya avanzado el ciclo de infección. Lo que se quiere averiguar con este experimento es si esto produce o no la degradación de la proteína E2 y por consiguiente una disminución de la proteína de los niveles volumétricos de proteína E2.

Materiales y métodos

Cuando se habla de medio o de SF900II, se hace referencia a medio SF900II con 0,2% de Pluronic F68.

Se descongela un frasquito con células de SF21 y se cultiva en 10 ml de SF900II en un matraz de agitación de 100 ml en un incubador sobre una plataforma de agitación orbital. Una vez que el cultivo celular alcanza la densidad celular requerida, se diluyen las células 10 veces hasta 100 ml en un frasco de agitación de 500 ml. Una vez que este cultivo celular alcanza la densidad celular requerida, se volvió a pasar a 100 ml mediante una dilución de 10 veces. El material celular en exceso se desechó. Una vez que este cultivo celular alcanzó la densidad celular requerida se diluyó 10 veces pasando a 3 matraces de agitación de 500 ml con 100 ml de volumen por matraz. Se desechó el material en exceso. Los matraces de agitación se colocaron sobre una plataforma de agitación orbital IKS que agitaba a una velocidad de 70 rpm en un incubador a 28ºC.

A una densidad celular de 0,612*10^{5} células por ml, se añadieron 63 \mul de una suspensión de virus diluida 100 veces a los matraces 2 y 3. El matraz de agitación nº 1 se mantiene como blanco no infectado. La MOI con la que infectan los cultivos es la siguiente

(0,063*0,10*0,8*10^{7}) / 100*0,612*10^{5}) = 0,00008

\newpage

La suspensión de virus diluida 100 veces se preparó en la forma indicada más adelante. Se descongeló el frasquito 253 de MSV mediante QC y se diluyó 100 veces en medio TC100, suplementado con 10% FBS (lote nº 97QC0139) y se almacenó a -70ºC. en porciones de 0,5 ml.

Se toman regularmente muestras de los cultivos del matraz agitador infectado y los del matraz agitador no infectado para determinar el estado del cultivo celular. El muestreo se realizó en la forma indicada a continuación.

Se introducen por centrifugación aproximadamente 1,1 ml de material celular en tubos Falcon de 15 ml en centrifugadora GPBR e IEC Centra durante 6 minutos a 1000 rpm. Seguidamente se filtra (0,45 \mum) el sobrenadante a través de un filtro de jeringa Gelman Acrodisc para desechar las células que todavía pueden estar presentes. Se almacena 0,4 ml de muestras en frasquitos criogénicos Nalgane a -70ºC para su análisis ulterior.

Resultados y conclusiones

Como se puede apreciar por los datos de la figura 1 y los gráficos de la figura 2, las curvas de crecimiento celular en el matraz 2 y 3 tienen un desarrollo más o menos similar. Después de 191 hpi, no se realizó ningún recuento celular más, ya que prácticamente todas las células estaban muertas e infectadas. La muestra de 130 hpi del matraz 2 no se presenta en el gráfico. Los recuentos celulares de esta muestra fueron muy superiores a los de la muestra anterior y siguiente. Esto indica que probablemente se ha producido alguna precipitación antes o después del muestreo, con el resultado de una muestra imprecisa que se mezcló con la solución de azul tripan. Esta hipótesis es confirmada por el hecho de que tanto la viabilidad como el porcentaje de infección están en consonancia con los resultados esperados. Esto significa que no se ha producido nada inusual en el cultivo infectado mismo. Este muestreo impreciso no tendrá muy probablemente ningún efecto en la concentración de E2 en la muestra, ya que el E2 se encuentra presente en el medio y no intracelularmente.

La concentración de E2 en el matraz 2 aumenta muy rápidamente hasta un máximo de >190 \mug/ml en torno a 139 hpi y luego disminuye lentamente hasta 170 \mug/ml a 215 hpi. Entonces el contenido de E2 desciende más rápidamente hasta un nivel final de >100 g/ml a 306,5 hpi.

El perfil en el matraz 3 es más o menos el mismo. El contenido máximo de proteína E2 se alcanza también en torno a 139 hpi, pero es ligeramente más elevado en el matraz 2. La concentración de E2 disminuye lentamente de 233 \mug/ml a 139 hpi hasta 212 \mug/ml a 191 hpi antes de que la concentración caiga más rápidamente hasta 141 \mug/ml a 215 hpi. Los matraces 2 y 3 muestran una buena correlación.

En momento t = 44,25 hpi se recontó también el matraz de agitación nº 1, el blanco. La densidad de células vivas era de 2,435*10^{6} células/ml, la densidad de células muertas 0,190*10^{6} y la densidad de células totales 2,625* células/ml, lo cual da una viabilidad de 92,8%. La densidad de células vivas es notablemente superior a la que se da en los matraces 2 y 3, lo cual indica que la infección ya está reduciendo el crecimiento celular. Este cultivo en blanco se intubó ulteriormente.

El cuadro siguiente muestra los resultados del ensayo de inmunotransferencia realizado en una selección de las muestras del matraz 2.

Muestra (hpi)	V3	V3 degradado	V8	V8 degradado
0	-	-	-	-
44	-	-	-	-
115	+	-	-	-
139	+	-	+	-
164,5	+	-	+	-
191	+	+	+	-
288	+	+	+	+
306.5	+	+	+	-

"-" Indica no detectable, "+" indica detectable

\vskip1.000000\baselineskip

Como se puede apreciar en este cuadro, los epítopos V3 y V8 no son todavía detectables en las muestras 0 y 44 hpi. Esto se corresponde bien con los resultados del ELISA E2. En las muestras de 115 hpi en adelante, se detecta E2 intacto ya que se detecta tanto V3 como V8 en la banda de E2.

De 191 hpi en adelante, se puede aplicar en el gel una segunda banda, de una proteína más pequeña. La inmunotransferencia con V3 y V8 en dos transferencias separadas muestra que el producto de degradación contiene efectivamente el epítopo V3 aunque no el epítopo V8. No se detecta ningún V8 en ningún otro lugar de la transferencia salvo en la banda de E2 intacto. Este ensayo muestra claramente que la degradación de la proteína E2 se produce efectiva-
mente debido a la presencia de proteasas. De hecho, estas pueden ser responsables de la disminución en el contenido.

El contenido de proteína E2 que se observa durante la etapa de microfiltración de la solución de antígeno E2 bulk. En esta etapa de proceso de corriente abajo las células son eliminadas antes de que se inicie la inactivación del
virus.

Por consiguiente, es más que probable que la presencia de una proteasa cause la degradación de la proteína E2.

7. Ejemplo de experimento de MOI Objeto

Seguir investigando la relación entre MOI (multiplicidad de infección, número de virus por célula), la densidad celular máxima y el contenido volumétrico de E2. Por una parte, la infección de toda la población celular debe haberse completado antes de que se agote el medio, pero por otra parte, la infección de la población total con una concentración celular baja tiene como resultado unos rendimientos de proteína sub-óptimos.

Materiales y métodos

Cuando se habla de medio, se hace referencia al medio SF900II.

Se diluyó 76 ml de suspensión celular en 444 ml de SF900II en una botella de 1000 ml y se mezcló ligeramente. La densidad de células vivas justo antes de la dilución del cultivo era de 3,41*10^{6} células/ml, la densidad de células muertas 0,190*10^{6}, lo cual da una viabilidad de 94,8%. Esta dilución debería dar una densidad celular de \pm5*10^{5} células/ml. Se añadió además gentamicina hasta una concentración final de 10 \mug/ml. La suspensión celular se dividió en 9 porciones de 50 ml en matraces de agitación de 250 ml y se desechó el material celular en exceso. Los primeros 50 ml se transfirieron a un matraz de agitación 1, los 50 ml finales al matraz de agitación 5.

Los números 1 y 6 se utilizan para MOI = 0 (blanco)

Los números 2 y 7 para MOI = 0,000001

Los números 3 y 8 para MOI = 0,00001

Los números 4 y 9 para MOI = 0,0001

El número 5 para MOI = 0,001

La preparación de la estirpe de virus (stock) es la siguiente. Una gama (range) de dilución consta de un frasquito con suspensión de virus diluida 100x (el frasquito contiene 0,8*10^{5} unidades formadoras de placa (pfu) por ml). Esta solución de estirpe de virus diluida 100x se preparó del siguiente modo.

Se descongeló el virus de siembra master y se diluyó 100x en medio TC100, suplementado con 10% FBS y se almacenó a -70ºC. en porciones de 0,5 ml.

Se diluyó 0,4 ml de esta solución de virus diluida 100x con 3,6 ml de medio SF900II, lo cual dio como resultado un factor de dilución de 10^{-1}. Se añadido 1 ml de esta solución a 9 ml de medio, lo cual dio como resultado un factor de dilución de 10^{-2}. Se añadió 1 ml de esta solución a 9 ml de medio para obtener un factor de dilución de 10^{-3} y se diluyó 1 ml de esta solución 10 veces para obtener un factor de dilución de 10^{-4}. Se añadió 3,1 ml de medio a los matraces de agitación 1 y 6 (matraces en blanco) que contenían el cultivo celular. Se añadieron 3,1 ml de diluciones de virus 10^{-2}, 10^{-3} y 10^{-4} a los matraces de agitación 4 y 9, 3 y 8 y 2 y 7 respectivamente. Estos matraces de agitación contienen ya el cultivo celular.

En 3,1 ml de dilución de virus 10-2, se encuentran presente 3,1*10^{-2} *0,8*10^{5} = 2,5*10^{3} pfu. En un matraz de agitación con 50 ml de suspensión celular se encuentran presentes 0,5*10^{6}*50 = 2,5*10^{7} células. Así, la adición de 3,1 ml de dilución de virus 10^{-2} a 50 ml de la suspensión celular da como resultado una MOI de 2,5*10^{3}/2,5*10^{7} = 0,0001. Realizando cálculos comparables para las otras soluciones virales, se obtienen recuentos de 0,00001 y 0,000001 para diluciones de virus 10^{-3} y 10^{-4} añadidas a 50 ml de cultivo celular. Finalmente, se añade 2,85 ml de dilución 10^{-1} al matraz de agitación nº 5, lo cual da como resultado una MOI de 0,00092 en lugar de 0,001.

Se toma una muestra de 3,1 ml de cada matraz de agitación inmediatamente después de añadir el virus. Las células en las muestras se centrifugan en una centrifugadora IEC Centra GP8R en tubos Falcon de 15 ml (10 minutos 1000 rpm). El muestreo se realiza partiendo de una MOI baja hasta una MOI elevada para evitar la transmisión viral de una suspensión celular infectada con MOI elevada a una suspensión celular infecta con una MOI baja. Tras la centrifugación, se filtran 0,45 \mum (para eliminar la células que puedan estar todavía presentes en el sobrenadante) y se dividen entre 3 criofrasquitos Nalgene y se almacenan a -70ºC para su comprobación ulterior.

La densidad celular de los matraces de agitación 1 y 5 se determino inmediatamente después de añadir el virus. Se inocularon con células el primero y el último matraz como las densidades celulares eran casi idénticas, se supuso que todos los matraces tenían una densidad igual al valor medio de los dos recuentos celulares. La densidad de células vivas inicial era de 0,423*10^{6} células/ml, de las que 0,012*10^{6} células estaban muertas, lo cual suponía una viabilidad de 97,3%.

Todos los matraces se colocaron sobre la plataforma agitadora orbital Labotech 300 que agita a una velocidad aproximada de 75 rpm en la sala a 28ºC.

A 23, 95, 125, 144, 173 y 194 hpi (horas post infección) se muestrearon todos los matraces de las muestras cuya densidad celular se determinó tenían un volumen de 3,3 ml, del que se utilizó 0,2 ml para determinar la densidad celular. Los 3,1 ml restantes se trataron en la forma mencionada anteriormente para la muestra t = 0. Las muestras de cultivo que no se recontaron tenían un volumen de 3,1 ml. Se determinó la densidad celular a 194 hpi y se terminó el experimento. La suspensión celular restante (aprox. 30 ml) se almacenó en 3 porciones de 1 ml en criofrasquitos Nalgene y 4 porciones de aprox. 6 ml en tubos Falcon de 15 ml. Resultados y conclusiones.

Los resultados muestran que existe una buena correlación entre MOI y la densidad celular óptima y, todavía más importante, entre MOI y el rendimiento de proteína E2. Esto se puede ver en el gráfico donde el rendimiento volumétrico máximo de proteína E2 de los cultivos infectados con MOI 0,001 se sitúa en 100%. Muestra que el rendimiento volumétrico de proteína E2 aumenta al disminuir MOI. Hasta un MOI de 0,00001, la densidad celular es infectada antes de alcanzar la densidad celular máxima alcanzable. Utilizando una MOI de 0,00001 o menos se tiene como resultado una infección en la que el medio es agotado antes de que se complete la infección del cultivo, con el resultado de rendimientos proteínicos inferiores a lo óptimo.

La conclusión que se puede extraer es que cuanto menor es la MOI utilizada mayor es el rendimiento de proteína E2, siempre que el medio no se agote antes de que se complete el proceso de infección y de producción de E2.

Baculovirus recombinantes que expresan bFSHa y/o FSM\beta

Se construyeron transfervectores pDW-Alfa-9,1 y pDW-Beta-3,1. Se co-transfectaron células Sf21 con pDW-Alfa-9,1 o pDW-Beta-3,1 y se aisló ADN natural (wt) AcNPV/MO21 de partículas de virus extracelular (Solicitud PCT: WO 96/ 25696). Se aislaron placas polihedrin-positivas que expresan \beta-galactosidasa y se analizó la expresión de bFSHa o bFSH\beta por ELISA de medio de cultivo. Se utilizó un virus bFSH\beta purificado por palca (AcNPVa3.4) y un virus bFSH\beta purificado por placa AcNPV\beta1.4) para preparar stocks de virus con un TCID50 de aprox. 10^{7} y 10^{8}, respectivamente. La producción de FSH se realizó según los métodos descritos anteriormente dando como resultado unos niveles de producción que oscilan entere 17 a 33 \mug/ml.

Prueba PD_{95}

Evaluación de la dosis (\mug) de E2 necesaria tras una vacunación para proteger el 95% (PD_{95}) de los cerdos vacunados contra una exposición a un 100 LD_{50} de Brescia de cepa CSFV virulento.

Animales

Se dividieron aleatoriamente 26 cerdos de 6-7 semanas de edad libres de patógeno específico (SPF), a su llegada, en tres grupos de ocho (A-C) y un grupo de dos (D). Los animales se alojaron en establos B18, B19, B20 y B21 dentro de las instalaciones de elevado confinamiento ID-DLO. Se dejó que los animales se aclimataran durante tres días. Los animales se alimentaron una vez al día en un comedero, con alimento completo (Hope Farms) y podían beber agua de un bebedero ad limitum.

Vacunación y exposición

Se prepararon tres formulaciones de vacuna con adyuvante de doble agua-en-aceite en la forma descrita anteriormente, cada una de ellas con una concentración diferente de antígeno E2; 32,0, 8,0 y 2,0 \mug/dosis. Los cerdos se inocularon una vez por vía intramuscular, y cada cerdo recibió una dosis, 2 cm detrás de la oreja izquierda (A: 2 \mug E2, B: 8 \mug E2, C: 32 \mug E2, D: 0 \mug E2). El grupo de control D fue inoculado con adyuvante DEO solamente y los cerdos centinela no fueron inoculados en absoluto. Tres semanas después de la vacunación se expuso cada animal, con excepción de los centinelas por vía intranasal a 100 dosis 50% letales (= 100 Va LD_{50}) de Brescia cepa CSFV 456610. Justo antes de la exposición, se separaron los centinelas de su grupo y se les hizo volver 24 horas después. Se determinó por valoración el contenido viral de inóculo de una muestra tomada después de volver del establo.

Observación clínica

Los cerdos fueron examinados directamente por los técnicos en animales, registrándose los resultados anormales y, en caso necesario, se llamó al veterinario supervisor. Cada grupo fue observado por lo menos durante 15 minutos al día antes y durante el tiempo de alimentación y de limpieza del establo.

Se anotó la reducción en la absorción alimentaria del grupo o de un animal individual.

Se registraron las temperaturas corporales (rectales) durante nueve días después de la vacunación y durante 20 después de la exposición.

Análisis de sangre después de la exposición

Se recogieron muestras de sangre EDTA el día 0, 2, 4,7, 10 y 14 después de la exposición para controlar y seguir los cambios en el número de leucocitos y trombocitos. Una reducción del número de leucocitos (leucopenia) y de trombocitos (trombocitopenia) en la sangre es una de las señales típicas de CSF. Los recuentos celulares normales para células de glóbulos blancos y los trombocitos en los cerdos convencionales oscilan respectivamente entre 11-22 10^{9}/l y 320-720 10^{9}/l. Para cerdos SPF estos valores eran un poco más reducidos; 6-12 10^{9}/l y 300-700 10^{9}/l. Los dos intervalos mencionados varían en cada cerdo. Los análisis de glóbulos se realizaron con un contador coulter Medonic® Ca 570. La leucopenia y la trombocitopenia se definieron como recuentos de células/plaquetas considerablemente inferiores al número mínimo mencionado anteriormente, de preferencia durante más de un día.

Propagación/excreción de virus y detección viral

La temperatura, los recuentos de leucocitos y trombocitos y la seroconversión de los centinelas fueron los parámetros utilizados para detectar la transmisión de virus de los animales inoculados a estos animales. En el tejido post-mortem se recogieron muestras de los siguientes órganos: amígdala, bazo, riñón e íleo y se comprobó mediante una técnica inmunofluorescente directa la presencia de antígeno vital. Se fijaron e incubaron con suero conjugado FITC anti-pestivirus porcino policlonal cortex de criostato (4 \mum de grosor, dos por órgano) de estas muestras de tejidos. Después del lavado se leyeron los cortes con un microscopio de fluorescencia. Los resultados se expresaron como positivo (= fluorescencia) o negativo (= no fluorescencia).

Respuesta serológica

Se recogió suero de todos los cerdos a las 0, 2 y 3 semanas después de la vacunación y en el momento de la muerte.

Las muestras se almacenaron a -20ºC. y se sometieron a un test de neutralización de virus (VNT) y al Ceditest®, un ELISA para detectar anticuerpo específico CSF. Se determinaron los valores de anticuerpo neutralizadores de CSFV en el suero en un sistema de microvaloración. Se mezclaron diluciones dos veces de suero en serie con un volumen igual de una suspensión CSFV (Brescia cepa) que contenía 30-330 TCID_{50}. Tras la incubación durante una hora a 37ºC en un incubador de CO_{2} se añadieron aproximadamente 25000 células PK 15 por pocillo, después de 4 días se trataron las placas de microvaloración en la forma mencionada anteriormente y se leyeron microscópicamente. El valor
de neutralización de CSFV se expresó como el recíproco de la dilución más elevada que neutralizaba todo el virus.

Evaluación estadística

La determinación de la dosis protectora al 95% se basó en el supuesto de que un valor Ab de neutralización CSFV de \geq 50 correspondía a la protección completa.

Resultados

Para el número de animales en toda esta sección, véase los cuadros 1 y 2.

Observación clínica tras la vacunación

La vacunación no tuvo ningún efecto negativo en los cerdos, y la absorción de comida y la temperatura corporal siguieron siendo normales. En los grupos A y C se pudo observar ligera diarrea, anorexia y depresión el día 3 después de la vacunación. Un cerdo del grupo A (nº 448) vomitó regularmente durante todo el período y su crecimiento fue inferior al de los demás. El cerdo nº 438 del grupo B vomitó una vez. La temperatura del cerdo nº 434 (grupo C, centinela) fue ligeramente elevada, este animal padecía cojera en la pata posterior derecha. La absorción de alimentos aumentó durante el período entre la vacunación y la exposición de 3 a 6 Kg por grupo/día.

Observación clínica tras la exposición

Los animales de control no vacunados presentaron signos de CSF a los tres (nº 59) y seis (nº 60) días de la exposición: fiebre, escalofríos, pérdida de apetito y depresión, todos estos síntomas se observaron hasta la muerte, 10 días después de la exposición. Además, los animales presentaron cianosis, paresis posterior, diarrea y vómitos severos. Los dos animales se mataron cuando se encontraban moribundos.

Todos los cerdos vacunados con 2 \mug de E2 (grupo A) presentaron signos de enfermedad 2-3 días después de la exposición, que consistían principalmente en fiebre, depresión y anorexia. La fiebre duró de 2 a 7 días y la temperatura máxima (T_{max}) osciló entre 40,7-42,2ºC. A partir del séptimo día, desapareció la fiebre en los cerdos 443-446 y aumentó la absorción de pienso hasta alcanzar la cantidad de antes de la exposición. El cerdo 448 fue hallado muerto en el noveno día y el cerdo 447 presentó CSF aguda (convulsiones, paresis posterior) y se mató cuando se encontraba moribundo el mismo día. Ambos centinelas permanecieron normales hasta 7-9 días después de la exposición tras haber desarrollado CSF aguda y se mataron cuando se encontraban moribundos el día 20.

En los animales de los grupos B y C, los signos clínicos y la duración de la enfermedad fueron suavizándose al aumentar la carga útil de antígeno E2.

En el grupo B, la fiebre (435-439) duró hasta el día 27 y T_{max} osciló entre 40,2 y 41,7ºC. El cerdo nº 436 resistió a la exposición con signos clínicos muy suaves. Un cerdo (nº 440) murió de CSF aguda a los 18 días y se mató estando moribundo. Los cinco animales restantes del grupo B se recuperaron. Ambos centinelas siguieron estando normales hasta 11-12 días después de la exposición tras haber desarrollado CSF aguda y se mataron el día 20.

En el grupo C se observó fiebre suave en dos (430-431) de un grupo de seis animales. Del día 4 al 6 y T_{max} osciló entre 40,5 y 41,2ºC. No se observó ningún signo clínico salvo una ligera depresión seis días después la exposición. El cerdo nº 40 vomitó al igual que antes de la exposición. Ambos centinelas siguieron estando normales hasta el final del experimento.

Análisis de sangre después de la exposición

En el grupo A únicamente un cerdo (450), el centinela, desarrolló una leucopenia y trombocitopenia clara. Los cerdos números 445 y 446 desarrollaron trombocitopenia el día 7 y 10 después de la exposición, el cerdo 449 el día 10 y el 14. Un cerdo (440) del grupo B presentó leucopenia y trombocitopenia, los demás siguieron siendo normales. Ambos centinelas mostraron signos de desarrollo de trombocitotenia el día 14. No detectó leucopenia ni trombocitopenia en el grupo C, inclusive los centinelas.

Ambos animales de control (nº 59 y 60) se volvieron trombocitopénicos a partir del día 7.

Propagación del virus y detección del antígeno viral después de la exposición.

La revaloración del inóculo dio un valor de virus de 2,55 TCID50/ml después de volver del establo. Se detectó antígeno viral CSFV (Cuadro 1) en todas las muestras de tejido seleccionadas de los controles y centinelas de los grupos A y B. Uno de cada seis animales inoculados era positivo en los grupos A y B. Y no había ninguno, en el grupo C, inclusive las centinelas.

Respuesta serológica

La seroconversión para CSFV se definió como un valor \geq 25 en el VNT. El resultado de la revaloración, para determinar la cantidad de virus Brescia utilizada en el VNT fue de 41 TCID50/pocillo.

Ninguno de los controles (D) o animales centinelas seroconvertidos durante el experimento (Cuadro 2). Dos de cada seis animales del grupo A se habían seroconvertido después de tres semanas. Pero 4 de 6 animales se reforzaron después de la exposición (Cuadro 2). Los grupos B y C se habían seroconvertido a los 21 días de la vacunación y todos los animales se habían reforzado después de la exposición. Esto último solo indica una replicación con éxito del virus de exposición en el animal.

Conclusión

La dosis PD_{95} por animal se determinó como 32 \mug de E2 en 2 ml de adyuvante DOE dado una sola vez. Con esta dosis los signos clínicos de enfermedad después de una exposición con una cepa CSFV altamente virulenta siguieron siendo mínimos y no se produjo ninguna diseminación de virus a animales de contacto. En resumen, se vacunaron 4 grupos (A-D) de seis cerdos por vía intramuscular con respectivamente 32 (A), 8 (B), 2 (C) y 0 \mug Ed (D) por 2 ml de adyuvante (DOE). Se mantuvieron dentro de cada grupo (A-C) dos cerdos no vacunados para decretar excreción de virus causante de infecciones por contacto (centinelas). Después de tres semanas, los animales se expusieron por vía intranasal a 100 LD_{50} de Brescia cepa CSFV altamente virulenta. Se midieron los parámetros clínicos, virológicos y serológicos para evaluar la eficacia de esta vacuna sub-unidad E2. Según lo esperado, los animales en el grupo C resistieron la exposición mejor que los animales de los demás grupos. No se detecto ningún antígeno viral en muestras de tejido de los animales inoculados con la dosis más elevada de E2 (32 \mug) y en este grupo no apareció la enfermedad. La dosis PD95 de calculó con el supuesto de un valor NPLA de \geq 50 (a los 21 días de la vacunación) confiere plena protección (ninguna diseminación del virus). Esto dio como resultado una dosis PD95 de 32 \mug/animal.

Para seguir evaluando el nivel de protección contra una exposición con CSFV virulento 100 LD_{50} a las 2 y 3 semanas de la vacunación, se vacunaron dos grupos (A-B) de seis cerdos por vía intramuscular con 32 \mug de E2. Se mantuvieron dentro de cada grupo (A-B) dos cerdos no vacunados para detectar excreción de virus de los cerdos vacunados causante de infecciones por contacto. A las dos (A) y tres (B) semanas los animales vacunados y animales de control se expusieron por vía intranasal a 100 LD_{50} de Brescia cepa CSFV altamente virulenta. Se midieron los parámetros clínicos, virológicos y serológicos con el objeto de evaluar la eficacia de la vacuna de sub-unidad E2 dos y tres semanas después de la vacunación. Según lo esperado, el grupo B resistió la exposición con menos síntomas clínicos que el grupo A. La transmisión del virus a los centinelas se produjo solamente en el grupo A y en las leucofracciones de todos los animales de ambos grupos se detectó virus. Únicamente un animal del grupo B se había seroconvertido a los 14 días de la vacunación (nº 414). Del mismo grupo, un animal no se había seroconvertido a los 21 días pero estaba protegido, tenía fiebre durante solamente dos días y se seroconvirtió a los 11 días de la exposición. Únicamente los controles y uno de los centinelas (grupo A) desarrolló leucopenia y trombocitopenia. No se detectó ningún antígeno viral en ninguna de las muestras de tejidos de los animales de grupos A y B. En conclusión, todos los animales quedaron protegidos contra la exposición 2 a 3 semanas después de la vacunación con una sola dosis.

Para seguir evaluando el nivel de protección contra una exposición con 100 LD_{50} de CSFV virulento a los 3 y 6 meses después de la vacunación, se vacunaron dos grupos (A-B) de seis cerdos por vía intramuscular con 32 \mug de E2. Se mantuvieron dentro de cada grupo (A-B) dos cerdos no vacunados para detectar excreción de virus de los cerdos vacunados causante de infecciones de contacto. Después de tres (A) y seis (B) meses los animales vacunados y animales de control se expusieron por vía intranasal a 100 LD_{50} de Brescia cepa CSFV altamente virulenta. Se midieron los parámetros clínicos, virológicos y serológicos con el objeto de evaluar la eficacia de la vacuna sub-unidad E después de este período. Todos los animales del grupo A y B resistieron la exposición con síntomas clínicos de poca importancia. Y solamente los controles desarrollaron leucopenia y trombocitopenia. No se produjo transmisión de virus a los centinelas. Y no se detecto virus en ninguna de las leucofracciones seleccionadas de ambos grupos. Únicamente un animal del grupo B se había seroconvertido a los 28 días de la vacunación (nº 1983). No se detectó ningún antígeno viral en ninguna de las muestras de tejidos de los animales de los grupos A, B y los centinelas. En conclusión, todos los animales quedaron protegidos contra la exposición a los tres y seis meses de la vacunación con una sola dosis y no se produjo transmisión de virus.

Se utilizaron cepas BVDV 4800, 150022 y 178003 para generar vacunas de sub-unidad E2 experimentales. Los genes E2 de estas cepas se expresaron en el sistema de expresión de baculovirus (Hulst et al., 1993, J. Virol. 67: 5435-5442) (P.A. van Rijn et al., 1996 I). Gen. Virol., 77:2737-2745). Se utilizó la línea celular Spodoptera frugiperda, SF21 para la propagación de los baculovirus recombinantes y la producción de proteínas E2. Se cultivaron células de SF21 a 28ºC en medio SF900 libre de suero (GIBCO BRL). Se infectaron monocapas confluentes de células SF21 con baculovirus recombinante a una multiplicidad de infección de 5 TCIDSO (50% dosis infectiva) de cultivo histológico por célula. A los 4-5 días, los cultivos mostraron un efecto citopático de 80-90%. Las células se centrifugaron durante 10 minutos a 1500*g y el sobrenadante que contenía baculovirus y E2, se recogió y almacenó a -20ºC. Para inactivar baculovirus se realizó un tratamiento de 2-bromoetil-inminobromuro (BEI) según los procedimientos standard en suma, se mezclaron 600 \mul BEI y 600 \mul de NaOH 1 M. Después de 30 minutos a 20ºC, se añadido 150 ml de sobrenadante y se agitó durante 24 horas a 20ºC. Después se añadieron 20 ml de tiosulfato al 25%. La inactivación del baculovirus se confirmó por valoración del sobrenadante sobre células SF21.

Las vacunas experimentales BVDV consistían en los sobrenadantes, que contenían E2, en una doble emulsión agua aceite. El aceite contenía 90% Marcol 52 (Esso) y 10% Montanide 80 (Seppic). La fracción acuosa (PBS+) contenía 98% de salino con tampón de fosfato, 2% Montanox 80 (Seppic) y 100 ppm de tiomersal. Se utilizaron sobrenadante, aceite y PBS+ en la proporción de 10:11:10. Primero se emulsionó sobrenadante y aceite y luego se añadió PBS+ y se emulsionó. Se preparó de forma similar una vacuna de control del sobrenadante de células SF21 infectadas con baculovirus natural. Después de la preparación, las vacunas resultaron ser estériles.

Nuestro supuesto preliminar de que la cantidad de antígeno en las tres vacunas sería similar debido a la comparabilidad de las proteínas expresadas, era incorrecto. La diferencia en la cantidad de antígeno es debida probablemente a diferencias en la expresión en las células de insecto. La vacuna 150022 contenía 55 \mug de E2 por dosis y resultaba protectora para el feto después de dos vacunaciones (día 0 y día 21). (Brusche et al., 1997, Vaccine in press). La vacuna 4800 y la vacuna 178003 contenía 12 \mug y 17 \mug de E2 por dosis, respectivamente, y no protegían el feto. Este resultado sugiere una correlación entre la cantidad de proteína E2 y la protección fetal. No obstante, una diferencia en la inmunogenicidad de glicoproteínas E2 y la inaptitud de las cepas de exposición de atravesar la placenta puede también explicar los resultados diferentes de la exposición. Ninguna de las vacunas protegió contra exposición BVDV heteróloga.

Los resultados de este estudio son prometedores para ulteriores desarrollos de vacuna de subunidad BVDV ya que hemos mostrado que la protección fetal se puede lograr mediante vacunación con glicoproteína de envoltura E2. Además, es una vacuna marcadora que permite discriminar entre animales vacunados y animales infectados con una cepa de virus de campo. Esto resulta ventajoso con vistas a futuros programas de erradicación de BVDV.

Discusión

El proceso de producción desarrollado tiende a obtener una producción de proteína heteróloga óptima codificada por genes insertados en baculovirus en células de insectos. El sistema de vector de expresión de baculovirus (BEVS) resulta muy adecuado para la producción de proteínas recombinantes diferentes, ya que la correcta multiplicación (folding) de la proteína y el procesamiento post-transduccional preciso da como resultado proteínas biológicamente activas para aplicaciones en animales y seres humanos. El baculovirus contiene dos genes no esenciales, que se transcriben desde promotores muy potentes, el p10 y los promotores de polihedrina. La mutagénesis de deleción del gen p10 (van Oers et al., J. Gen Virol. 74: 563-574; 1993) mostró que no resulta esencial para la replicación de virus en cultivos celulares; no obstante, p10 juega un papel en la lisis celular y la ausencia de proteína p10 hace que las células infectadas permanezcan intactas y evita la liberación de poliedros desde células infectadas, reduciendo de este modo las tasas de reinfección aunque no la infectividad per se. Los productos de los genes (P10 (o fibrilina) y poliedrina) se expresan tardíamente durante la fase de infección. El hecho de sustituir estos genes por el gen de la proteína requerida puede tener como resultado (en el caso del promotor de polihedrina) teóricamente, rendimientos de hasta 50% de la producción de proteína total del cultivo celular de insecto, lo cual se refleja en niveles de expresión de más de 1 gramo de proteína polihedrina por litro en cultivo (Maioarella et al., (1988) cultivo celular de insecto a gran escala para producción de proteína recombinante. Bio/technology, 6, 1406-1410). La multiplicidad de infección (MOI, relación entre la densidad de virus por ml y la densidad celular por ml) es un parámetro claro para la optimización de la producción de proteína. Una de las razones obvias de la infección con una multiplicidad de infección muy baja, es mantener el inóculo del virus lo más pequeño posible. Si la infección se produce a una densidad de 2 millones de células por ml con una MOI de 0,1 en un fermentador de 50 litros, entonces se necesita 10*10^{10} virus. Esto requeriría un inóculo de aproximadamente 1 litro. Además, se necesita una etapa de producción adicional para realizar este tipo de inóculo. Dos de las desventajas de los cultivos adjuntos son el uso de medio ineficiente y la limitación de oxigeno. Debido a que la solubilidad de oxigeno en fluidos acuosos es relativamente reducida, el oxígeno será el sustrato limitador para las células en los cultivos monocapa. El factor determinante para una densidad celular máxima en cultivos estáticos es la superficie disponible. Una vez recubierta la superficie con una monocapa de células, se detendrá el crecimiento celular. Esto tiene como resultado una densidad celular de aproximadamente 1*10^{6} células/ml de medio. En cultivos en suspensión no existe limitación de oxígeno y la disponibilidad de otros sustratos es el factor limitador de la densidad celular. Esta limitación se produce a una densidad celular superior a la de la limitación de oxígeno y por lo tanto la densidad celular es más elevada que en los cultivos estáticos. La limitación de oxígeno se evita utilizando un electrodo de oxígeno para controlar y seguir la concentración de oxígeno disuelto. Una vez que ha caído por debajo de cierto valor, se añade automáticamente oxígeno a la suspensión, ya sea rociando o por adición a través del espacio de la cabeza del fermentador. Una agitación moderada de la suspensión garantiza un cultivo homogéneo en el que no se forma ningún gradiente de sustrato y en el que las células no están sometidas a fuerzas de cizalladura demasiado elevadas. Además, el resultado del agitar es una transferencia eficaz de virus de las células infectadas a las células no infectadas, obteniéndose de este modo una mayor eficacia de infección por virus de las células. Como inicialmente solo están infectadas aprox. 0,1-0,3% de las células, el 99,7-99,9% restante de las células pueden crecer y multiplicarse. Las partículas de virus que se producen en las células infectadas se liberan 12-20 horas después de la infección (Dee, K.U. and Shuler, M.L. 1997. Biotechnology Progress, 13, 14-24). El número de partículas virales liberadas por célula es de 100-200, que pueden infectar por lo tanto células no infectadas en un nuevo ciclo. Pasarán nuevos ciclos hasta que se produzca un número suficiente de partículas virales para infectar todas las células presentes en el cultivo. El objetivo es completar la producción de proteína del paso de infección final antes de agotar el medio y de que se detengan todos los procesos metabólicos. Tampoco es deseable lograr una infección completa a una densidad celular inferior a la óptima ya que entonces el medio no se utilizará eficazmente, lo cual tendrá como resultado un rendimiento volumétrico inferior de las proteínas heterólogas. Todo el proceso de infección por virus se puede comprobar visualmente, debido a que el gen poliédrico sigue estando presente. La infección por virus se puede observar como partículas proteínicas densas que se acumulan en el núcleo celular. Para evitar daños de cizalladura en las células se añade Pluronic F-68 al medio hasta una concentración final de 0,2%. Además, si es necesario, se añade antiespuma A para evitar un espumado excesivo que tendría como resultado la muerte celular. La cantidad total de antiespuma A añadida a un cultivo 50 L es por término medio de 20 ml. Se puede calcular la densidad viral óptima para infectar las células. Esta densidad depende de la tasa de crecimiento de las células, el tiempo tras la infección en que se liberan las nuevas partículas virales y el número de nuevas partículas virales producidas por célula infectada. Una ilustración del método presentado por la infección es la producción de la proteína E2 de pestivirus. Aunque esta proteína era conocida como antígeno potente no siempre ha tenido éxito la producción de (fragmento) de E2 para una vacuna o una prueba diagnostica. Pese a un PD50 tan bajo como 2 \mug (si se utiliza un fragmento de E2 particularmente inmunogénico), uno de los problemas es cómo acumular cantidades suficientes de dosis de vacuna con masa antigénica suficiente de forma comercialmente atractiva para permitir la vacunación protectora de grandes grupos de animales con una sola vacunación por animal. Esto resulta particularmente relevante para la vacunación CSFV. Cuando se utiliza, la vacunación CSFV se suele realizar durante una campaña masiva en una zona en la que se ha producido un brote de CSFV. Esto requiere una vacunación rápida de grandes números de animales en un período de tiempo relativamente corto. En este tipo de campañas masivas resulta particularmente importante conseguir rápidamente un nivel de protección adecuado (el número de cerdos protegidos contra la infección por virus natural). Si se espera varias semanas después de la primera vacunación para realizar una segunda vacunación con el objeto de lograr una protección se dificulta y aplaza en gran medida el control de la enfermedad. Existen diferencias entre los diversos métodos para producir la proteína E2 expresada recombinantemente incluso si se comparan (fragmentos de) E2 expresados en baculovirus. En cultivos de producción de proteína E2 descritos anteriormente, el rendimiento de (fragmento de) proteína oscila entre 20 y 90 \mug/ml (Hulst et al., J. Vir. 5435-5442, 1993; Hulst and Moormann Cytotechnology 20:271-279, 1996), necesitando además purificación por inmunoafinidad con anticuerpos monoclonales para obtener la masa antigénica de E2 necesaria y relevante para una sola vacunación. Otro método (que utiliza un fragmento de E2 descrito en el documento EP 0389034), que utiliza E2 cosechado del sobrenadante de células de insecto sin ulterior purificación por inmunoafinidad da como resultado una vacuna a base de E2 que se inyecta dos veces antes de obtener una respuesta inmune satisfactoria (protectora). Estos problemas, entre otros, son debidos a una baja concentración de la sustancia antigénica relevante, en este caso (los fragmentos de) proteína E2, en el material de partida, por ejemplo el sobrenadante de cultivo celular, a partir del cual se prepara la vacuna. En teoría, se puede seguir acumulando masa antigénica por métodos de purificación y condensación conocidos en el estado de la técnica; sin embargo, esto no conduce a una producción de vacuna comercialmente atractiva sino que supone unos costes elevados por dosis. La producción, utilizando un método facilitado por la invención, en nuestro fermentador de 50 L suele dar un rendimiento de aproximadamente 200-300 \mug/ml de fragmentos de proteína E2 CSFV, suficiente para vacunar en teoría 100.000 animales por cultivo. Las células son infectadas a una densidad de 0,5 a 1,5*10^{6} células/ml con 1 a 10 ml de inóculo viral que contiene aproximadamente 10^{7} TCID_{50}/ml. El cultivo se cosecha de preferencia cuando > 50-80% de las células muestran CPE. Esto se produce aproximadamente 100-150 horas después de la infección. En cultivos de producción de proteína E2 anteriores, las células se infectaban (sincrónicamente) con una MOI>1, lo cual daba como resultado un rendimiento de proteína inferior al proporcionado por la presente invención. En un método presentado por la invención se inocula un fermentador de 50 litros con 5 litros de suspensión celular cultivada en un fermentador de 5 L o 10 L de toda la suspensión cultivada en un fermentador de 10 L. La densidad celular inicial es de aproximadamente 3*10^{5} células/ml. Las células se hacen crecer hasta la densidad celular calculada antes de añadir el virus a la suspensión. El procesamiento aguas abajo comienza con la eliminación de las células y los poliedros por microfiltración. Se conecta un dispositivo de microfiltración por fibra hueco al fermentador y se bombea el material a través del módulo de filtración con un tamaño de poro de 0,22 \mum. El flujo se recircula por el fermentador y se recoge el flujo permeato en un recipiente de 100 L. Una vez finalizada la filtración, libre ahora de células aunque sigue conteniendo baculovirus infecciosos, se inactiva en el recipiente de 100 L. Por lo general, se añade 2-bromoetil-a-moniobrumuro (BEA) a la suspensión hasta una concentración final de 8-12 mM. El pH se eleva de aproximadamente 5,8 a 8.2-8,7 añadiendo NaOH 2M. Estos cambios en el pH convierten el BEA en BEI (2-bromoetil-inminobromuro). Este es el agente inactivador de ADN. El pH se controla y se sigue cuidadosamente regulándose a 6-10 y la temperatura se mantiene a 34-39. Después de 6 horas de inactivación, la solución de antígeno se transfiere a un segundo recipiente de inactivación. Este garantiza que todo el material contenido dentro del recipiente ha estado en contacto con BEI y por lo tanto quedará inactivado. En el primer recipiente podría haber gotas de fluido, que contienen virus, pero no contienen BEI, pero esto no ocurre en el segundo. Los baculovirus presentes en una concentración de 10^{4}-10^{7} pfu/ml se degradan hasta un valor <10^{-7} pfu/ml (<1 partícula de virus por 10 m^{3}). Esta es la misma norma que la que se utiliza para vacunaciones virales basadas en virus que pueden infectar el animal anfitrión (como FMD). Los cerdos no son anfitriones de baculovirus. La masa antígena inactivada se almacena a \leq -20ºC hasta que se fórmula en una emulsión de agua-aceite-agua. Una sola dosis que contiene 32 \mug E2 (volumen de la dosis 2 ml) resulta suficiente para dar protección (>PD95) contra la fiebre porcina clásica, desde las dos semanas hasta por lo menos seis meses después de la vacunación. El proceso de producción se diseña de forma que el aumento gradual del proceso es sencillo y resulta posible la utilización de fermentadores de 250 litros e incluso mayores. El aumento gradual de la producción de cultivo estático también es sencillo y solo utiliza más matraces de cultivo de tejido. No obstante la producción de proteína total realizada rutinariamente en el fermentador de 50 litros requeriría aproximadamente 7.000 matraces de cultivo de tejido T175. El crecimiento celular y la infección se pueden controlar, seguir y regular mejor en un fermentador ya que se encuentran presentes el oxígeno y un electrodo de pH. En los matraces de cultivo de tejido las variaciones de un matraz a otro existirán probablemente aunque no es posible cuantificarlas. La inactivación se controla, sigue y regula de forma más precisa en los matraces que como se hizo en la producción de cultivo estático. Los niveles de producción volumétrica de otras proteínas expresadas en el BEVS (en nuestro instituto) también mejoran considerablemente si se cultivan células con un método de los ofrecidos por la invención. Por ejemplo, el rendimiento de FHS bovino aumento un factor de 3-4, utilizando un fermentador de 10 L. Se coinfectaron células a una MOI de 0,003 de cada uno de los dos baculovirus recombinantes a una densidad celular de 1,1*10^{6} células/ml. Los rendimientos de proteínas E2 diferentes de BVDV y de proteínas E^{rns} o BVDV y/o CSFV en cultivos de suspensión en matraces de agitación se incrementó 3 veces. El método también se puede aplicar a otras proteínas recombinantes.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

\newpage

CUADRO 1

Detección de antígeno viral por medio de la técnica de inmunofluorescencia en cortes de criostato de tejidos diferentes

6

\newpage

CUADRO 2

Resultados de la prueba de neutralización de virus

7

Claims

1. Método para aumentar el rendimiento de una proteína E2 o E^{rns} de pestivirus recombinante o fragmentos inmunogénicos de los mismos o de un FSH producido en cultivo celular de insecto, que comprende:

- la selección de un baculovirus recombinante que codifica dicha proteína

- y el cultivo de células de insecto a una densidad celular de 1 x 10^{5} a 5 x 10^{6} células/ml, todavía mejor de 5 x 10^{5} a 1,5 x 10^{6} células/ml en un medio de cultivo en un recipiente de cultivo con volumen suficiente para contener por lo menos dos litros de medio de crecimiento, y

- la infección de las células con un inóculo de por lo menos un baculovirus con una multiplicidad de infección comprendida entre 0,005 y 0,00025, calculada a partir de una gama de dilución de una estirpe (stock) de virus.

2. Método según la reivindicación 1, que comprende la selección de un baculovirus recombinante que expresa la proteína deseada bajo control del promotor p10.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, que comprende el cultivo de las células de insecto en suspensión, de preferencia en un recipiente de cultivo como un fermentador, que se puede agitar de forma moderada.

4. Utilización de un método según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para producir una sustancia antigénica.

5. Utilización según la reivindicación 4, en la que la sustancia antigénica es una proteína de pestivirus o un fragmento inmunogénico de la misma, de preferencia una proteína de virus de fiebre porcina clásica o un fragmento inmunogénico de la misma.

6. Una vacuna que comprende una proteína de pestivirus recombinante y baculovirus inactivado, producido según el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde dicha proteína muestra la glicosilación del sistema de producción de baculovirus, y donde dicha vacuna confiere protección contra el virus de la fiebre del cerdo clásica después de una sola vacunación sin purificación por inmunoafinidad.

7. Vacuna según la reivindicación 6, que comprende además un adyuvante, adyuvante que comprende de preferencia una doble emulsión de agua en aceite.

8. Utilización de un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para producir un FHS recombinante.

9. Utilización según la reivindicación 8 para producir un FSH recombinante para su incorporación en una composición farmacéutica para tratar trastornos reproductivos.