TWI225094B - Recombinant pestivirus E2 protein and a method to produce said E2 protein in insect cell culture - Google Patents
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Description
1225094 A7 B7 五、發明説明(I ) 本發明係關於在桿狀病毒載體表現系統中增加蛋白質 或多肽表現之方法,當發展重組D NA技術時,對於使用 遺傳修飾的細菌來大量生產蛋白質是有極高的期望,但是 ,大部分之具商業吸引性的蛋白質在成爲具生物活性的蛋 白質之前,必須經過轉錄後修飾(post-translational modification),因此,目前動物細胞更常被使用來製造重 組蛋白質。 在動物細胞中,昆蟲細胞在製造重組蛋白質上愈來愈 重要,已發展一種使用昆蟲細胞之方便且多方面的桿狀病 毒載體系統,對於昆蟲細胞的生理之資料相當少,然而, 藉由桿狀病毒重組技術製造的疫苗通常有良好的接受性, 實例之一爲使用人類免疫不全病毒第I型之桿狀病毒表現 的g P 1 6 0外膜蛋白質作爲A I D S疫苗於臨床試驗中 〇 直到目前爲止,在昆蟲細胞內大量生產桿狀病毒表現 的蛋白質僅限於達約1 0公升的生物反應器中,爲了增加 產量,懸浮液培養物提供最好的可能性,在大量生產上(參 見 Tramper et al·,Rec. Adv· Biotech·,1992,263-284; Power and Nielsen,Cytotechnology 20:209-219,1996),特別具有 重要性的是影響細胞生長及病毒製造之因子,在這些因子 中的變化極大地影響了重組蛋白質製造的最終含量。 桿狀病毒之特徵係爲桿狀病毒微粒,其通常包含於包 涵體(occlusion bodies)(亦稱爲多角體沖’桿狀病毒科可區 分爲兩個亞科:真桿狀病毒(Eubaculovirinae)亞科,其包含 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 丨.:I----»II (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225094 A7 B7 五、發明説明(> ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
兩個被包涵(occluded)病毒屬:核多角體病毒(nuclear polyhedrosis virus ; N P V)及顆粒體病病毒(granulosis virus ; G V ),以及裸桿狀病毒(Nudobaculovirinae)亞科 ,其包含非包涵性病毒 ’ ca/z/bm/ca (Ac) NPV 之細胞及分子生物學已更詳細被硏究。 許多蛋白質已被表現於感染一編碼該蛋白質之重組桿 狀病毒昆蟲細胞中,編碼係代表這類病毒具有一編碼異源 蛋白質的核酸序列,且通常另外有調控核酸序列,例如啓 動子,最常的是多角體啓動子係用於表現一外來基因,但 是p10啓動子相同地適合且使用。
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 一些細胞株可用於以桿狀病毒感染,細胞株S F - 2 1係衍生自秋蛆(Spodoptera frugiperda)之卵巢組織,一 分離株S F - 9係可得自美國典型菌種中心(C R L 1 7 11),其大槪爲用於試管內製造重組病毒之一標準的細 胞株且被認爲具有製造重組病毒之優越性,其他的細胞株 例如Hi-Five細胞株以及得自甘藍菜尺蠖(Trichoplusia ni )之Τη- 268及Τη — 368 A細胞株,最廣泛使用 於昆蟲細胞生長的培養基包括TNM—FH,BML — 丁 C/1 0,以及I P L - 4 1,這些培養基經常補充有一 些特定的成份,例如哺乳動物血淸,特別是胎牛血淸,血 淸替代物也被施用於昆蟲細胞培養物,且不含血淸的培養 基,例如 Ex— cell 400 TM& S f 9 0 0 爲市面 上可獲得的。 一般而言,昆蟲細胞生長在固體支持物上以及在懸浮 本紙張尺度適用巾關家縣(CNS ) A4規格(210X297^ ) ~ 1225094 A7 _____ B7 _______ 五、發明説明(今) !-II----m! 液中,但被報導爲當生長在固體支持物上時會得到較高的 產率,當細胞在指數生長期時受到感染時之感染是最有效 的,但是對於細胞周期間不同階段受到感染之細胞而言’ 每個細胞製造的多角體及病毒之量並不會有顯著的變化。 細胞密度對於病毒製造有極大之影響,昆蟲細胞可顯示一 接觸抑制之形式,使得在較高細胞密度時病毒產量下降°
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 感染之最初感染複製數(m . 〇 · i .),爲每個細胞的感 染病毒數目,一般影響在感染結束時每個細胞感染細胞的 部分以及多角體的數目,病毒製造之最佳的m· 〇 · i ·値 一般被認爲大約在2 0 - 3 0間,在表現β-半乳糖苷酶的 重組桿狀病毒之硏究中(Licari and Bailey,Biotech. Bioeng·,37:238-246,1991),S f — 9 細胞受到介於〇 至 1 0 0之m . ο · i ·値感染,隨著m . ο . i ·値之增加,(3 -半乳糖苷酶產率增加且細胞密度減少’一般認爲增加或 減少m· 〇 . i .値僅對於每個感染細胞中重組蛋白質之最 大可達成的產率具有限的影響,但是,選擇低m· 〇 . i . 値會使得需要感染的病毒體降低並將產生可偵測之桿狀病 毒干擾粒子之危害減至最小。若一批次的昆蟲細胞培養物 係在高m. 〇 . i .値(> 5 )被感染,則接著的感染程序 基本上將同時發生,即所有細胞將同時經過感染周期。當 細胞在m· 〇 · i ·値爲1 一 5時於一批次的培養物中被感 染,則該培養物將不再同時期,培養物最初會由非感染性 細胞以及在各別感染周期中不同點的細胞組成’直到所有 細胞已被感染且所欲的蛋白質製造完成爲止。一般而言’ ______β___ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X297公釐) 1225094 A7 五、發明説明(& ) 在這類培養物中,製造的含量較爲低,培養物的表現係爲 每一個在不同生產期的個別細胞之整體表現’其解釋了最 佳下的製造量。在一非連續的培養物中,未感染的細胞被 連續加入且該培養物將明顯非同時地被感染° 透過設計數學模式,可能預測複合物的表現’例如那 些當以低m. 〇 · i ·値感染之細胞或當使病毒繁殖於一連 續的培養系統中之時所觀察到者,若並非不可能時’相同 現象之純粹實驗分析被認爲非常困難。目前’已知三種模 式即 the Licari & Bailey,the de Gooijer 以及 the Power &
Nielsen模式,雖然其等具複雜性且已努力發展當中,該等 模式皆首先產生模式,假設表現一模型重組蛋白質(β-半 乳糖苷酶)之桿狀病毒的行爲係在多角體啓動子之控制下 。當其等模式被認爲一黑盒子系統時,且與D Ν Α和R Ν A的累積及感染周期無關,其等大程度地摘述對於桿狀病 毒與昆蟲細胞之間作用的目前定量理解,結合及最初感染 過程在定量上仍不完全被瞭解,且在此領域的進一步努力 是必要的。 桿狀病毒表現系統提供一種在重組蛋白質製造上之有 效工具,一些細胞培養株的組態可用於大量生產上,然而 ’這些系統需要使其進一步最適化以完全發揮其等潛力之 優點,在商業的應用上,重要的是大量及低成本的生產, 在大量細胞培養株中所報導之多角體製造系統應被極度地 改良以符合對價格競爭的產品之商業需求。 本發明係提供一種使用桿狀病毒表現系統來大量製造 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210χ297公慶) 丨:----------11衣_| (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225094 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 —_B7 五、發明説明(f ) 重組蛋白質之方法,其使得所欲得到的蛋白質產率增加或 改良。本發明提供一種製造及改良在昆蟲細胞培養株中重 組蛋白質產率之方法,其包含選擇一種編碼該蛋白質之重 組桿狀病毒,使昆蟲細胞在一培養管中的培養基內生長, 且以< 0 · 0 1感染複製率感染該等細胞。 在一較佳具體實施例中,本發明提供一種增加一重組 蛋白質製造於昆蟲細胞培養株中的產率之方法,其包含選 擇一種編碼該蛋白質之重組桿狀病毒,使昆蟲細胞在一培 養管中的培養基內生長,且以至少一種具感染複製率< 0 • 0 1的桿狀病毒之接種量感染該等細胞,增加產率已成 爲多個硏究團體的目標。舉例來說,Chen et al· (Drug metabolism and Disposition: 24 p399-405,1997)硏究對方令共 同感染方法上使MO I最佳化之可能性,藉此兩個不同的 桿狀病毒表現之蛋白質會於昆蟲細胞培養物中製造。與此 敘述的結果相反地,他們發現兩個蛋白質的最佳MO I値 約爲0 · 0 1 5至0 · 0 3,降低M〇I値至< 〇 · 0 1 會使得Chen et al.的共同感染系統之產率降低,Radford et al· (Cytotechnology 24, 73-81,1997)不受硏究共同感染系 統之阻礙,淸楚地指出MO I値> 1應一直用於使最終產 率最大化,再者,其教示的與本發明的發現相反,他們陳 述了使用低M〇I値在每個細胞中製造較大量的蛋白質及 病毒是不可能的,並且反而建議調整感染時間(T 0 I )。 另外,例如 Nguyen et al. (J. Biotech. 31,205-217, 1993)並沒有發現一種在於改變Μ〇I的溶液,而是著重於 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂
本紙張尺度適用中國國家檩準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 1225094 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明(h ) 藉由施用fed-batch培養物來增加產率,或改變病毒所生長 的溫度(Wu et al.,Cytotechnology,9,141-147,1992; King et al·,Biotechnol. Bioeng,38,1091_1099,1991),並且避免在 .Μ〇I値< 〇 · 〇 1下使病毒生長。 這些較早期的結果明顯地與在此敘述中所提供者(參見 圖1 ),其中培養物係以Μ〇I値< 〇 · 〇 1而感染(例如 〇 · 0 0 3,0 · 〇 〇 1,或甚至 0 · 0 〇 〇 1 )可達到 比那些以Μ〇I値爲0·01或0·1而感染者有更高的 產率。 本發明的一個較佳具體實施例係提供一種於昆蟲細胞 培養物,但非生長於單層培養物中,製造及增進重組蛋白 質的產率之方法。於桿狀病毒表現載體系統製造少量蛋白 質之習知實驗方法,係使用昆蟲細胞的單層培養物於培養 燒瓶中,這些穩定培養物一般以高MO I値感染,以確定 同時受到感染,重要的是所有的細胞係在單層成爲群集之 前被感染,因爲接觸之抑制將導致細胞中代謝的改變,其 可影響最終產物的產率。由於很難去精確地確定單層培養 物中的細胞密度,所以不可能進行MO I實驗。甚至,更 無效的是使用低Μ〇I値(< 0 · 0 1 )去感染培養物, 在感染之時細胞密度之過度及低估將導致明顯低於蛋白質 的最佳產率。一般而言,使用高Μ〇I値保證了同時感染 所有的細胞族群,此暗示必須使用大量病毒體來感染單層| 培養物以達到最佳產率。 | 使用單層培養物之大量化生產蛋白質,僅表示須使用| (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 1Τ.
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(2丨ΟΧ、297公釐) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225094 A7 B7 五、發明説明(1) 更多的組織培養燒瓶,使用單層培養物來大量製造蛋白質 是非常花費勞力的,此外,調整及/或監測重要的培養因 子例如溶氧濃度及p Η是不可能的。 目前,本發明提供一種適合用於所有昆蟲細胞培養物 的方法,本發明係提供一個低Μ〇I値有助於使除了單層 培養物以外的昆蟲細胞培養物中產率最佳化之見解。 不同類型的培養容器可用於培養除了在單層培養物中 以外的昆蟲細胞,每一個發酵槽設計之目的,係在於達到 足夠通氣以及高細胞密度,而同時儘可能保持低剪力(shear forces)(Tramper et al. In: Recent advantages in biotechnology (eds· Vardar_Sukan and Sukan) 1992),敘述 於此文獻中的大部分情形,係爲使用裝配有氣體噴灑器的 攪拌槽生物反應器。在這一類容器中,藉由使用驅輪 (impeller)來達到均質性,這類的發酵槽可以不同的方法操 作,第一爲批次(batch)方法,此爲最直接及簡單的方法, 培養細胞、加入病毒且在感染之最終收集產物。一種較複 雜的方法爲分批給料(fed-batch)培養,一濃縮的營養物混 合物被加入培養容器中,以達到較高的細胞密度及較高的 產物體積產率(Nguyen et al· 1993, Journal of Biotechnology vol. 31,p. 205-217),此方法更爲複雜,因爲其並非通常淸 楚營養物的限制爲何,藉著加入一種基質來除去此營養物 之限制,可能直接導致另一種基質的限制性,且因而不一 定會得到較高的產物產率。 混合之另一種方法係用於氣升式(airlift)生物反應器中 ^氏張尺度適用中國國家標準(CNS ) ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
!225〇94 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明() ! (Wu et al. 1992,Cytotechnology vol· 9 ρ· 141-147),此類型 I 的容器係由兩種圓柱體所組成,具有最小直徑之圓柱體(通 I 風管)是置於具有較大直徑之圓柱體之內(降流管),在中央 .的圓柱體中,空氣或其他氣體被噴灑,產生一向上之流, 在發酵槽的頂部,氣體離開流體且該流體於中央圓柱體之 外往下流,藉由此種方式,僅利用噴灑氣體均達到通氣及 均質性,此係由於通風管及降流管的密度不同之故,此方 法可降低剪應力〇hear stress),但是,連續通風速率須達到 適當的混合。 另一種提高發酵槽中細胞密度之方法是藉由加入一旋 轉過濾器或另外的細胞保留裝置,此稱爲灌注(Perfusion) ,這種方式使得可由發酵槽中除去廢棄培養基且加入新鮮 的培養基,而同時保留細胞於發酵槽中,這種方法造成許 多額外的設備及更複雜的發酵槽操作(Caron et al. 1994 Biotechnology and Bioengineering vol. 43,ρ· 881_891)。此 外,例如巨孔床及於一膠質-基質中的固定化之方法被報導 ,這類方法係藉由細胞在一基質之上或之內的固定化,使 其可能移除廢棄培養基並加入新鮮培養基,而不會稀釋細 胞培養物,若是細胞密度、接觸性抑制及其他相關的單層 培養物之問題可被控制,則根據本發明的方法不祇可被應 用在上述不同的培養系統中,也可應用於單層培養物中。 舉例來說,本發明之一個較佳具體實施例係提供一種 於昆蟲細胞培養物中製造且增進一重組蛋白質的產率之方 法,其包括選擇一種編碼該蛋白質的重組桿狀病毒,使昆 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣. 、1Τ
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X 297公釐) 1225094 A7 B7 五、發明説明(ί]) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
蟲細胞於一培養容器中的培養基內生長,該培養基具有一 j 足夠體積以包含至少2公升,且以至少一種具每細胞中桿 狀病毒m.o.i値<0·01 PF U的桿狀病毒之接種 量來感染昆蟲細胞。本發明提供一種其中使用的感染複製 數爲相當低例如m· 〇 . i値1 一 5,以得到一非同時感染 的培養物之方法,藉由以使用如本發明所提供的m. 〇 . i 値之桿狀病毒來感染昆蟲培養物,可達到細胞複製速率相 對於病毒複製速率之間的最佳平衡,藉此使所欲蛋白質的 表現最佳化。本發明所提供的方法可藉由調整m. 〇 . i値 而輕易地調整爲較高或較低的細胞密度,其中可用於感染 不同複製期的細胞之病毒微粒係保持根據本發明所提供的 複製數及密度之比率。根據本發明的方法之一個較佳具體 實施例,係包含使細胞生長於一足夠體積培養基之培養容 器中,其包括至少1 〇公升,較佳爲至少2 0公升,更佳 爲至少5 0或2 5 0公升的培養基,藉此使得表現異源蛋 白質的桿狀病毒培養物大量生產。舉例而言,可使用一個 具有大於存在的培養基所須體積之體積的培養容器,例如 使用1 0 0公升的培養容器,以培養2 0至7 0公升的細 胞培養物。根據本發明的方法之一個較佳具體實施例,係 包括感染細胞密度爲1 X 1 〇5至5 X 1 06細胞/公升, 更佳爲5 X 1 0 5至1 · 5 X 1 〇 6細胞/公升之細胞’藉| 此而保持病毒接種量的實際體積於可輕易控制的範圍內。I 根據本發明的方法之另一具體實施例包括以m . 〇 · i値=| 0 · 0 0 5,例如 0·003,0·001·0·000 | I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣·
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本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(2 ί Ο X 297公釐) 1225094 Α7 Β7 五、發明説明(θ ) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5或0 · 00025來感染細胞,使得接種量儘可能保持 最低。根據本發明的一個較佳具體實施例係包括選擇一種 在p10啓動子控制下表現所欲蛋白質之重組桿狀病毒, P 1 0啓動子在細胞溶解上扮演一個角色,缺乏P 1 0蛋 白質會導致感染的細胞保持完整且防止由感染的細胞中釋 出多角體,因而降低再感染率但非感染性本身。病毒感染 的整個過程目前可以目視觀察,此係由於多角體素基因 (polyhedrin gene)且因而多角體仍存在,病毒感染可以堆積 於細胞核中的稠密蛋白質微粒而被觀察到。根據本發明的 方法之另一具體實施例係包括使昆蟲細胞生長於一批次培 養系統中,藉此而減少具缺陷的干擾性桿狀病毒微粒至最 低,其可使未受感染的細胞之感染及複製達到折衷處理。 本發明所提供的方法之另一具體實施例係包括使昆蟲細胞 生長於懸浮液中,較佳爲一個可(溫和)攪拌的培養容器中 ,例如發酵槽。使用(攪拌)的懸浮液培養物,特別是當與 一重組桿狀病毒結合使用之時,其中所欲蛋白質係在P 1 0啓動子的控制下以目視檢測病毒的生長(但是其他檢測方 法,例如使用多角體素(polyhedrin)啓動子之情形下,如也 可觀察C P E ),使得培養物有更好的控制。 懸浮液的溫和攪拌確保了一均質的培養物,其中並沒 有建立一受質梯度,且其中的細胞並不受到太高的剪力。 除此之外,攪拌會使得病毒由感染細胞有效傳遞至非感染 細胞,得到病毒感染細胞之一較高效率,因爲最初祇有約I 〇 · 1 — 0 · 3%的細胞受到感染’剩下的9 9 · 7 — 9 j ί (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) il衣· 訂
本纸張尺度適用中國國家檩準(CNS ) A4規格(210><297公釐) 1225094 A7 B7 五、發明説明(丨丨) 9·9%的細胞則使之生長及複製。 本發明係提供一種表現及製造不同來源的重組蛋白質 之方法,本發明所提供的一實例爲製造源自鼠疫病毒 (pestivirus)的蛋白質於培養基中,至收集至少爲1 〇 0 ’ 1 2 0或1 5 0微克/毫升,更佳爲2 0 0或甚至3 0 0 微克/毫升之濃度,所欲得到的蛋白質也可用於製備抗原 性物質以供獸醫學或醫學使用,例如包含於一疫苗或一診 斷測試中,根據本發明所製造出來的所欲蛋白質可用於例 如製備一疫苗。 本發明所提供的一個實例係爲鼠疫病毒E 2蛋白質或 其片段,其可用於例如製備一種對抗鼠疫病毒感染之疫苗 ,如豬隻中的典型豬熱病(classical swine fever)。在一個較 佳具體實施例中,本發明係提供一種含有重組鼠疫病毒 (pestivirus)E 2 E ^〃蛋白質或其片段之疫苗,其特徵在於 其並未經免疫親合性純化,且較佳地在以單一劑量的單一 接種疫苗之後以P D 9 5含量會給予對抗鼠疫病毒感染的 保護性,此特別相關於C S F V之疫苗接種,當施用之時 ,C S F V的疫苗接種,通常在C S F V發生感染流行的 區域之大量競爭(mass campaign)期間進行’此需要於一相 當短的時間內快速接種大量數目的動物,在這種大量競爭 之中,足夠的保護含量(受到保護以免於野生型病毒感染之 豬隻數目)快速達到係具有迫切的重要性’在第一次接種之 後等待數週以進行第二次接種來達到保護會極度阻礙並延 遲疾病的控制。製造重組地表現的E 2蛋白質之不同方法| (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格U10X297公釐) 1225094 A7 B7 經濟部智慧射產局員工消費合作社印製 五、發明説明(丨> ) 間的相異處存在,即使當比較表現於桿狀病毒中的E2( 片段)時。在較早報導的E 2蛋白質生產培養物中,E 2 蛋白質(片段)產率之變化係在2 0 - 9 0微克/毫升間 (Hulst et al.5 J. Virol. 5435-5442, 1993; Hulst and Moormann,Cytotechnology 20: 271-279,1996 ),進一步需 要以單株抗體之免疫親合性純化以得到所須及相關的抗原 性質量以進行單一注射接種。另一種方法(使用敘述於E P 0 3 8 9 0 3.4中的E2之一片段),係利用由昆蟲細 胞的上淸液中收集E 2而不需進一步的免疫親合性純化, 其得到一種在獲得令人滿意的(保護性)免疫反應之前注射 兩次之以E 2爲主的疫苗。雖然一種含有E 2抗體的疫苗 (Porcilis®Pesti)目前已註冊,但這種疫苗須要施用兩次 ,因而會嚴重阻礙以此疫苗接種對抗典型豬熱病感染之有 效性,因爲其需要4週的間隔至少兩次的接種來得到所欲 的免疫反應。 在其他中的這些問題(已由本發明解決)係關於相關抗 原物質之低濃度,在此情形下用來製備疫苗的E 2蛋白質 (片段)於起始物質如細胞培養物上淸液中。理論上,可 藉由在此技術中已知的純化及濃縮方法來進一步累積抗原 性量,但是,此並無法得到一商業上具吸引力的疫苗生產 ,而是造成每劑量之闻成本。另~^個實例係爲鼠疫病毒E ns蛋白質,其也可用於一疫苗及診斷測試中’或是其他的 (治療性)物質中。 舉例來說,Ruggli et al (Virus Genes 10:115-126, 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2i〇X 297公釐)
(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 、11
1225094 A7 五、發明説明) 1995)使一種表現E 2之桿狀病毒於單層昆蟲細胞培養物中 丨生長以達到不超過5 - 1 0微克/1 06細胞的最大產率。 此外,Moser et al (Vet· Microbiol· 51:41_53)使 Ruggli et al_之E 2生長於以M〇I値爲5的單層昆蟲細胞培養物 中且無法製造足夠之以未濃縮形式存在的抗原以用來進行 E L I S A,在他們的經驗中,藉由蛋白質的鎳-箝合物之 親合性層析之進一步純化是對於簡化處理及增進EL I S A品質之先決條件,並沒有以因而製得之E 2蛋白質來構 思一疫苗製劑。 當接種疫苗是此硏究的目的時,已發現使用免疫純化 的E 2蛋白質來接種疫苗必須進行兩次,以達到保護的特 定量,例如,在 Hulst et al (J· Virol· 67:5435-5442,1993 ),W〇 95/35380,以及 van Rijn et al ( J. Gen. Viml. 77:2737-2745, 1996)中,E 2係以單層被製造且經 免疫親和性純化以獲得一種具保護性的疫苗。 本發明所提供的一個實例係爲一種含有重組C S F V E 2蛋白質(片段)之疫苗,現在可製造足夠大量之蛋白 質,不再需要在其被包含於一疫苗中之前經過免疫親合性 純化,在動物接受一劑量的單一接種二至三週之後該疫苗 會給予對抗一典型豬熱病病毒感染之保護(以一保護性劑 量含量9 5 % ( P D 9 5 ))。本發明的一種方法提供一 種含有重組鼠疫病毒E 2或E 1:118蛋白質或其片段之疫苗| ,其在以一劑量單獨一次接種之後會賦予對抗鼠疫病毒感 染之保護,同時該蛋白質(片段)不必經由免疫親合性而| (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧射產局員工消費合作社印製 本紙張又度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2丨0'〆29?公釐) 1225094 A7 -----------—______ 五、發明説明(\屮) I 被純化。本發明亦提供一種含有本發明的蛋白質之疫苗, ί 其額外包含一種佐劑,適合的佐劑爲一般熟於此技藝人士 所知悉,例如弗蘭德氏佐劑(Freund adjuvants)或氫氧化銘 ,或是乳劑,如水於油或雙層水於油之乳劑,所欲得到的 蛋白質也可用於製備其他的物質,舉例而言,獸醫學或醫 學上之使用。本發明所提供的另一實例係爲一種類似激素 的物質,例如濾泡刺激性激素(F S Η,α-單元及/或β -單元以及其複合物及片段),其可由例如以一種以表現 α-單元的桿狀病毒及/或另一種表現β 一單元的桿狀病毒 於培養物中感染一昆蟲細胞培養物而製造。根據本發明之 方法也可用於大量及低成本之作爲生物性殺昆蟲劑的(重組 )桿狀病毒之生產。較佳具體實施例係爲利用ρ 1 〇啓動子 的重組病毒之使用,以使外來基因表現於生物性殺昆蟲劑 之製造,因爲昆蟲通常較不易受到缺乏多角體基因的桿狀 病毒之感染,以根據本發明的方法來培養表現其他重組蛋 白質的其他重組桿狀病毒以及製造及/或使用這類病毒蛋 白質以包含於殺昆蟲的、醫學的、治療性的及/或抗原性 物質或產物中係在熟習於技藝人士之技術範圍內。本發明 在實驗部分中進一步說明但並非受限於其中。 實驗部分 黃病毒科(Flaviviridae)中的鼠疫病毒屬習 知係由典型豬熱病病毒(C S F V ),border disease virus j (B D V ),以及牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea j virus ; Β V D V )所組成,一些 Β V D V 及 C S F V株的 | j ! ------17___________j 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210、乂297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 1T-
經濟部智慧坷產局員工消費合作社印製 1225094 A7 B7 五、發明説明“<) 基因組(genome)已被定序列(Renard et al·,1987 EP application 0208672 ; Collett et al., 1988,Virology 165, 191-199 ; Deng and Brock,1992,Virology 1991,865-679 ; Meyers et al·,1989,Virology 171,555-567 ; Moormann et al·,1990,Virology 177,184-188 )。對於 B D V而言,目 前僅祇有不完整的基因組核苷酸序列可得到,鼠疫病毒基 因組係爲含有一個大的譯碼起始區域(open reading frame) 之約1 2 · 5 k ^的正股R N A分子,譯碼起始區域係轉 譯爲一個假設之約4,〇 0 0個氨基酸的多蛋白,其被病 毒及細胞所編碼的蛋白酶處理,此譯碼起始區域是由兩個 高度保守性(conserved)小的未轉譯區域覆蓋於其兩側’該 等兩個未轉譯區域可能與基因的複製有關,5’-未編碼區 域也在轉譯的起始上扮演一角色。 經細胞及病毒蛋白酶共轉譯及後轉譯處理的多蛋白係 包括所有的病毒結構性及非結構性蛋白質(參見評論匕乂· Rice: In Fields Virology, Third Edition, 1996, Flaviviridae: The Viruses and their Replication: Chapter 30: pp. 931-959) ,病毒的結構性蛋白質,其中有外膜蛋白質E 、E 1 及E 2,是位於多蛋白的N端部分,非結構性蛋白質’其 中有絲氨酸蛋白酶N S 3以及RNA複製酶複合物N S 5 A及N S 5 B,是位於多蛋白的C端部分。受到一鼠疫病 毒感染的動物會發展對抗E ^ n s、E 2及N S 3的抗體, 但是,祇有針對抗E 2的抗體會使病毒強烈地中和,然而 針對抗E ^ n s及N S 3的抗體則祇有低病毒中和能力或完 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 1T-
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 1225094 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明(4 ) 全無此能力,此認知促使我們開始評估E 2作爲C S F次 單元標記疫苗之適合性,在此計畫中,E ^ n 8及/或N S 3可被用於發展隨著E 2標記疫苗而來之診斷測試上。 直到現在爲止,B D V及B V D V已由不同的種類中 分離出來,而C S F V似乎限於豬隻,鼠疫病毒爲結構上 及抗原尙極爲相關連的,外膜醣蛋白E 2爲鼠疫病毒中最 具免疫性及最具變化的蛋白質,我們選殖了許多不同鼠疫 病毒株的E 2基因,包括那些由鹿及長頸鹿而來者,E 2 基因係暫時被表現,其特性係以單株抗體、定序列及比較 而定,見 P· A. van Rijn et al·,1997, Virology,237: 337-348 。基於這些數據,我們可將鼠疫病毒屬中的六個主族群線 性化,四個族群係相對於所定的基因型,而兩個其他的族 群爲鼠疫病毒內的新基因型,一個族群包括由豬隻中分離 出來的C S F V株,第二個族群係由B D V株即已由綿羊 中分離出來之Moredun、L83及X818以及由豬隻而 來之F株所組成,第三個族群係包括由綿羊而來之B D 7 8株由豬隻而來之5 2 5 0株以及由牛而來之1 7 8 0 0 3株。以E 2爲基礎而言,這些病毒係非常相似於與牛病 毒性腹瀉之急性嚴重流行有關的B V D V株,即稱爲第2 型B VDV。第四個族群係由大部分源自牛隻的B VDV 株所組成,此種BVDV族群可區分爲亞群BVDV— 1 a及l b之兩個亞型:B V D V - 1 a包括得自美國的病| 毒如N A D L及Oregon,以及一些其他如得自歐洲之1 5 | 0022 及 1138,亞群 B V D V — 1 b 包括 Osloss 株 | (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家檩準(CNS ) a4規格(2ί〇Χ297公釐) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225094 A7 B7 五、發明説明(α ) 以及一些荷蘭的分離株。第五及第六個“族群”可提出爲兩 個新的基因型並分別包括Deer及Giraffe株。 標記疫苗於獸醫學的使用上之發展已造成一個對於控 制及消滅生物物質之經濟上具重要性的病毒性疾病之觀念 ,使用一標記疫苗可允許在接種疫苗的動物及區域病毒 (field virus)感染的動物之間的血淸鑑別,藉此而可控制地 去除病毒。舉例來說,在大部分的歐洲會員國中,對抗歐 杰斯基氏疾病(A D )之接種祇有g E -負反應的疫苗被允 許,受到A D區域病毒(field virus)感染的動物會發展對抗 g E之抗體,偵測這些抗體之E L I S A測試係被用於偵 測受到感染的動物,其等可接著自一群中移開,以及用於 監測區域病毒在(延長的)接種疫苗競爭期間於一群中之感 染的狀態,最後,目的係在於達到一種一群中無區域病毒 的狀態,然後可停止接種並進行一種監視此狀態之血淸性 監測計畫,因此,以標記疫苗接種將降低消滅競爭之成本 ,其係重要性地依賴於將感染的動物群消滅,而非僅將感 染的個性動物消滅,並且,若是隨之以一足夠的大規模且 在足夠長的時間內進行,則甚至可爲一個比消滅更快速的 方法達到豬族群中不含區域病毒的狀態。 在目前以及未來,當現在的地方性疾病如A D已被滅 絕時,仍有標記疫苗的用途,例如控制已被自族群中消滅 之疾病的流行,以及對抗不再有常規的接種疫苗之狀況° 在這些情況下,當一動物族群爲血淸上未受到感染時’高 度傳染性的疾病可爆發性地散播,且可接著導致極大的經 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 1225094 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明(0) 濟損失。 許多的實例已顯示桿狀病毒系統可支持異源性蛋白質 的高含量表現,高含量表現係具有高度的優點,因爲死的 次單元疫苗一般祇當施用一大量的抗原時可以激發一保護 性的免疫反應。在本發明的第一個方法中,兩種重組的桿 狀病毒,一個表現具TMR的E 2 (BacE2[+])且另一個 表現不具TMR的E2 (BacE2[-]),係被構築(Hulstet al·,1993, J. Virol. 67:5435-5442),需注意在此出版物以 及其他可比較的出版物中,E 2仍被稱爲其舊的名稱E 1 。不具TMR的E 2係被分泌至細胞培養基中,而具TΜ R的Ε 2則否。此外,兩種Ε 2皆相同地與單株抗體反應 ,代表四個抗原區域的每一個在Ε 2上,此建議了與細胞 有關的抗原性質以及分泌的Ε 2係爲相同的’且因爲分泌 的Ε 2被製造爲遠高於與細胞有關的Ε 2之含量(高於十 倍),故測試分泌的免疫純化之Ε2於豬的接種試驗中是 明顯的。製備兩個含有於雙水-油佐劑中的2 0微克Ε 2/ 毫升及1 0 0微克Ε 2/毫升之免疫配方,在2 S P F的 豬隻中的四群,兩群係以2 0微克的Ε 2接種I Μ,且兩 群以1 0 0微克的Ε 2接種。經過2 8天之後,以2 0微 克的Ε 2接種的1群及以1 0 0微克的Ε 2接種的1群再 次以相同劑量的Ε 2接種。在第4 2天時’所有的動物以 經鼻內施用具毒性的C S F VBresda株攻擊之,不論被施| 用的疫苗劑量爲何,所有接種的豬隻已在第2 8天出現中| 和性的抗體,雖然爲不同的含量。直到第4 2天,以抗原|
_,_____J 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格U10X、297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1225094 A7 B7 i五、發明说明(d) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 攻擊之日時,不論動物被追加劑量(boost)與否’所有動物 中的抗體效價(titers)會保持上升至高含量。因此’不會令 人驚訝的是,即使僅以2 0微克的免疫親合性純化之E 2 接種一次的動物已可完全地得到免於c s F之保護(Hulst et al·,1993, J· Virol· 67:5435-5442) ° 由於受到鼠疫病毒感染的動物必然地發展出抗體對抗 E r ns之(Kwang et al·,1992,Vet. Microbiol· 32: 281-292 ),所以第二個病毒外膜醣蛋白,其爲最適合用於診斷測 試與E 2結合的發展之病毒蛋白質之一,然而,亦有一報 導指出E 1:11 s可能爲一個保護豬隻對抗C S F之重要抗原 (K0nig et al·,1995, J· Virol· 69:6479-6486)。在這些硏究 中,E 〃1系以一種活的病毒牛痘(vaccinia)載體來表現, 同時以3種不同途徑(表皮內,靜脈內及腹膜內)每個注 射部位接種5xl〇7 PFU的牛痘一 重組病毒, 在後接種5週時自一致命劑量的C S F V Alfort株的I N 攻擊下存活,而不顯示任何C S F之徵兆。 爲了評估E 1:11 8作爲一個死的次單元疫苗之適合性, Brescia株之桿狀病毒表現的E 1:11 s (如Hulst et al·,1994, Virology,200: 558-565 )在豬隻中測試。6個S P F豬群 係以5 · 0及2 0微克的E ^ n s I Μ接種一次(Moormann et al·,1996, Proc· 14th Intern· Pig· Vet· Society Congress,ρρ· | 25-29, Bologna,Italy ),第三群之4個未接種的S P F豬 I 隻係作爲控制組。在接種三週之後,所有的動物受到1 0 5 | T C I D 的Behring株以I Μ攻擊,在以抗原攻擊5天 | t (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -衣· 訂
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 1225094 Α7 Β7 五、發明説明(/) 之內’以最低劑量的E r n s攻擊的所有的動物會發展出c S F的嚴重徵兆,在攻擊1 4天之內,2隻動物死亡,3 隻動物在垂死下被殺死,且1隻明顯地復原,這些動物中 的五隻,包括復原的一隻,係在IFτ中表現正反應。在 以抗原攻擊之後,以最高劑量的E 接種的所有動物多 少會顯示C S F的嚴重徵兆以及高燒數天,但在1 4之內 ,6隻動物中的4隻復原,1隻死亡,以及另一隻在垂死 時被殺死,在4隻存活的動物中,祇有1隻在I f T中表 現正反應。相反地,所有的控制組動物在以抗原攻擊5天 之後顯示C S F的嚴重徵兆,在攻擊後的1 4天內死亡, 且在 I F T 中爲正反應(Moormann et al·,1996,Proc. 14th Intern· Pig· Vet. Society Congress,ρρ· 25-29, Bologna,Italy )° 我們下結論爲桿狀病毒表現的E ^ n 8可保護豬隻免於 異源性C S F V的攻擊,雖然其效力比桿狀病毒表現的E 2之效力較差。 濾泡刺激性激素(F S Η)是屬於醣蛋白激素之一族 ,其在腦下腺(黃體化內激素,L Η ;甲狀腺刺激激素, T S Η )或在胎盤(人類絨毛膜促性腺激素chorionic gonadotropin,h C G ;懷孕母馬血淸親生殖腺素,P M S G )中製造出來。在一物種中,這些激素的每一個是由一 相同的α次單元所組成,其係非共價地結合於一激素專一 性的β次單元,單獨或與L Η結合施用之純化的F S Η廣泛 地使用於誘導於許多物種包括牛中一種排卵過旺的反應。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X 297公釐) 1225094 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明(Η ) 存在於牛中的問題係爲牛F S Η很難由牛腦下腺中純 化出大量來,由於此原因,羊FSH(oFSH),豬F S H ( p F S Η)或馬 FSH(eFSH,PMSG)來 源通常用於治療牛的排卵過旺情形。但是,施用源自腦組 織的物質並非沒有危險性,因爲類似蛋白感染素(prion)之 蛋白質可能存在,其可在牛隻中造成牛海綿狀腦疾( bovine spongiforme encephalopathy ; B S E ),且可能在 人類中造成一變種的Creutzfeldt-Jacob疾病(C J D )。 除此之外,使用源自胎盤的物質具有非常長的生物半生期 之缺點,其必須藉由注射特定的抗體使其中和。最後,目 前所使用的F S Η製劑的確包含一些L Η活性,其被認爲 是排卵過旺結果所觀察到之大變化的肇因或至少部分所引 起的。 針對這些原因,似乎牛的排卵過旺之治療是由施用製 造於非哺乳動物細胞中,例如昆蟲細胞(桿狀病毒表現系統 )’的重組牛F S H ( r b F S Η)而獲得改善。 與方法 1 ·製備S F 2 1細胞的生產細胞培養物(P C S ) 之實例 含有1 · 5毫升的S F 2 1實驗細胞種子(W C S ) (總細胞數目爲4 一 1 0 x 1 0 6細胞/毫升)之冷凍管被| 融解至2 〇 一 3 〇 °C的溫度,在融解之後,小管中的內容I 物被轉移至15毫升之含有8·5毫升不含血淸的培養基| S F 9 〇 〇 I I的Falcon管中,並且被懸浮其中,在懸浮丨 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) .~φβ等 訂
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210Χ 297公釐) 1225094 Α7 Β7 五、發明説明(y>") 之後,該Falcon管中的內容物在100 — 200xg下離 心1 0分鐘以沉澱細胞,該培養基被倒掉且片狀物(Pellet) 被懸浮於4 一 6毫升的S F 9 0 0 I I中’懸浮的細胞接 著被轉移至一個1 0 0毫升之含有1 0毫升s F 9 0 〇 I I的振盪燒瓶中,細胞在2 6 - 3 0 cC下培養3 - 7天, 其培養是藉由將燒瓶置於一軌道振盪器平台上以4 0 - 8 0 r p m進行。細胞生長及存活性係藉由收取過程中樣本 來監測。當細胞密度爲1 · 0 - 6 · 5 X 1 〇 6細胞/毫升 時,細胞被移到兩個5 0 0毫升之每一個含有1 0 0毫升 S F 9 0 0 I I的振盪燒瓶中,此相當於1 0倍細胞稀釋 度,接著,藉著將燒瓶置於軌道振盪器平台上以4 0 - 8 0 r p m速度振盪使細胞在2 6 - 3 0。(:下培養3 - 7天 ,細胞生長及細胞存活性係持續以程序內控制來監測。當 細胞密度爲1 · 0 - 6 · 5 X 1 0 6細胞/毫升時,在此情 形下細胞第二次被移至六到十一個5 0 0毫升之每一個含 有1 0 0毫升S F 9 0 0 I I的振盪燒瓶中,多餘的細胞 物質被倒掉,在此情形下亦得到一個1 0倍稀釋液,藉著 將燒瓶置於軌道振豊器平台上以4 0 - 8 0 r p m速度振 盪使細胞在2 6 - 3 0 °C下培養3 - 7天,細胞生長及細 胞存活性係持續以程序內控制來監測。當細胞密度爲ΙΟ - 6 · 5 X 1 0 6細胞 / 毫升時, 5 0 0毫升或 1 0 0 0 毫升之含有該等細胞之懸浮液被移至5公升或10公升的 發酵槽中,該發酵槽中分別含有約4 · 5公升或9公升的 S F 9 0 0 I I,此相當於1 0倍細胞稀釋度,這些細胞 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本貢) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210Χ、297公釐) 1225094 A7 _____ B7 五、發明説明(>幻 在2 6 — 3 0°C下培養3 — 7天,該懸浮液被持續攪拌( 5 0 - 1 0 0 rpm),細胞生長及細胞存活性係持續以 程序內控制來監測。當細胞密度爲1·〇-6·5χ106 細胞/毫升時,5公升發酵槽的內容物被移至一個5 0公 升之含有約4 0公升S F 9 0 0 I I的發酵槽中,這些細 胞在2 6 — 3 0 °C下培養直到細胞密度達到:t5 — 1 5 X 1 0 5細胞/毫升,懸浮液被持續攪拌(5 0 - 1 0 0 r pm),樣本被取出爲程序內的控制之用。 2 ·製造E 2抗原之實例 在上述細胞懸浮液中,加入含有d=107 TCID5〇 /毫升之 1 一 2 毫升的 Working Seed Vims ( W V S )( B a c E 2〔—〕),懸浮液在2 8°C下培養3 — 8天, 直到7 0 - 1 0 0 %的細胞顯示一種細胞致病性作用,在 培養期間,樣本取出爲程序內控制之用,接著,藉由微過 濾移除細胞而使該懸浮液淸澈,所得到的過濾物(即抗原 溶液)被收集並保存於=一 2 0°C下,直到去活化步驟( 3 · 3 )開始時,樣本被取出以爲程序內控制之用。爲了 得到測定抗原內容物,樣本可測試於例如酵素結合免疫分 析中以測得出抗原的質量,或於蛋白質分析以測得每容積 的水蛋白質中實際的重量,或藉由這些方士的組合而測定 〇
3·病毒去活化之實例 藉著加入2-溴乙基-溴化銨(B E A )至濃度爲1 0毫 莫耳/公升以使病毒去活化,經由調整PΗ至8·2—8 J -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(:·Μ0 X 2〔)7公釐) A7 B7 i、發明説明(斗) • 7及溫度爲3 4 - 3 7°C,B E A會轉換爲2-溴乙基-溴化亞安(B E I ),其爲使病毒去活化之活性成份,病 霉之死亡是由取出樣本以於程序內控制而檢測,去活化作 用需要2 4 — 7 2小時,在去活化之後,可能出現每1 0 〇 0 0公升< 1的感染性微粒,在病毒區活化之後,B E I係藉由加入硫代硫酸鈉至5 - 2 5毫莫耳/公升的濃度 逝調整p Η爲5 · 7 — 6 · 3而被中和,樣本被取出爲程 序內控制之用,去活化以及中和的抗原溶液被轉移至1及 /或5公升袋中且儲存於=一 2 0°C下。 4·配方之實例 將冷凍的抗原溶液在2 2 - 2 8°C下融解,且以S F 9 〇 〇 I I或P B S稀釋成爲一種5 0微克/毫升之抗原 溶液,硫柳汞(Thiomersal)係作爲抗微生物劑而加入1 〇 〇 微克/毫升,樣本係取出爲程序內控制之用,此溶液(即 第一水相)儲存於2 — 8 °C下< 3天。同時,油相係藉由 混合 Marcol5 2 與 Montanide8 0 (9 : 1)而製備,此 外,此溶液儲存於2 - 8°C下少於3天,油相係通過0 · 2 2微米的無菌過濾器中而消毒過濾,樣本被取出爲程序 內控制之用。最後,第二水相係藉由混合磷酸緩衝鹽水( PBS)或 SF900I I 培養基與 Montanox 8 0 ( 9 8 : 2 )而製備,且硫柳汞被加入而得到最終濃度爲1 0 0微克/毫升,此溶液被儲存於2 - 8°C下直到使用時( <3天)。在使用之前,第一水相被消毒過濾,樣本被取 出爲程序內控制之用。第一乳化液係藉由混合第一水相與| (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、-口
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297^4 ) 1225094 A7 B7 --—-------- I五、發明説明(v〇 ! |
I 油相(1 : 1 · 1 )而製備,此乳化液可儲存於2 — 8 下不超過3天,樣本被取出爲程序內控制之用。雙層水於 ί 油乳化液係由以第二水相使第一水相(2 · 1 : 1 )乳化 | 而製備,雙層乳化液係儲存於2 - 8°C下於一檢疫儲藏室 | 中直到於小管中裝塡時。樣本被取出爲程序內控制之用。 5·裝塡與封蓋之實例 雙層乳化溶液係以無菌方式裝塡於無塵室的一A等級 區域中,裝塡的容積分別爲5 1,1 0 2,或2 5 5毫升 於50,1〇〇或25 0毫升的小管中,裝塡的容積藉由 檢查裝塡容積的重量而持續地被監測,在裝塡之後,立良口 將小管以塞住並封蓋,最後,在品質控制起始之後’小管 儲存於2 - 8 °C下檢疫儲藏室中。 對於5 0公升發酵槽規模E 2次單元疫苗之設計的胃 例 S F 21牛產細朐培養物(P C S)之製備 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T
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本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 1225094 A7 B7 五、發明説明(/k) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 22_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 1225094 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明(/()
(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
訂
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) L __ 1225094 Α7 Β7 五、發明説明(β) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210Χ297公釐) 1225094 Α7 Β7 五、發明説明(;>γ 藉由混合第一乳液及第 層乳液。 i二水相(2.1:1)來製備雙 儲存在2-8°C下。
(請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 6 · Ε 2穩定性實驗之實例 目的 爲檢測Ε 2蛋白質於一細胞培養物(Μ〇I *0 · 0 0 01)中在另外一般條件下經過一長時間培養後的穩定性 。由於桿狀病毒在細胞培養物中感染過程具溶解性質,可 能會在感染周期之晚期釋放出蛋白酶於培養基中,此實驗 的目的係爲此現象是否導致Ε 2蛋白質的分解及因而使得 Ε 2蛋白質含量體積降低。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210Χ297公釐) 1225094 A7 B7 I五、發明説明(γ) 材料及方法 當提及培養基或S F 9 0 0 I I時,是表示具有0 · 2 % PluronicF68 之 S F 9 0 0 I I。 含有S F 2 1細胞的小管被融解,並在圓軌振盪平台 上培養箱中培養於1 〇 〇毫升振盪燒瓶中1 〇毫升的S F 9 0 〇 I I內。當細胞達到所需要的細胞密度時,細胞被 稀釋十倍使其爲1 0 0毫升於5 0 0毫升的振盪燒瓶中。 當此細胞培養物達到所需要的細胞密度時,其再次被稀釋 十倍至1 0 0毫升,丟棄多餘的細胞物質。當此細胞培養 物到達所需細胞密度時,其被稀釋十倍成爲三個每一燒瓶 含有1 0 0毫升體積之5 0 0毫升振盪燒瓶中,丟棄多餘 的物質,振盪燒瓶被置於I K S圓軌振盪平台上,在一個 2 8 °C培養箱中以7 0 r pm速度攪拌。 在每一毫升中0 · 6 1 2*1 0 5細胞的細胞密度下, 6 3微升之稀釋1 〇 〇倍的病毒懸浮液被加入燒瓶第2及 3號中,振盪燒瓶第1號係保持作爲未受感染的空白組。 培養物受到感染之MO I値爲 (0 · 063*0 · 01*0 · 8*107)/(10 0*0·612*105)=0·00008 所使用之稀釋1 0 0倍的病毒懸浮液係以下列略述製 備,M S V小管2 5 3以Q c融解並在補充1 0 % F B S | (批號9 7 Q C 0 1 3 9 )之T C 1 0 0培養基中稀釋1 0 0倍,並以0 · 5毫升部分在一 7 0°c下保存。 一般來說,樣本係取自感染的振盪燒瓶培養物及未感| ____________________ . ^! 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格.;210Χ29Τ公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ- 經濟部智慧財產局員工消費合作杜印製 1225094 經濟部智慧射產局員工消費合作社印製 A7 B7 i五、發明説明(y) 染的振盪燒瓶兩者中,以測定細胞培養物的狀況,取樣是 以如下略述的方式進行。 大約1 · 1毫升的細胞物質係在1 5毫升的Falcon管 中於I E C CentraG P 8 R內以1 〇 〇 〇 r p m離心6分 —,接著上淸液通過0 · 4 5微米之Gelman Acrodisc注 射器瀘紙而過濾,以去除可能仍存在的細胞,〇 · 4毫升 的樣本係在- 7 0 ° C下儲存於Nalgene冷凍小管中以供後 續的分析。 結果及結論 如見於圖1中的資料及圖2中圖表,燒瓶2及3內細 胞生長曲線多少相似地發展。在1 9 1 h p i之後,不進 行細胞計數,因爲基本上所有的細胞會死亡並受到感染, 燒瓶2之1 3 9 h p i樣本不示於圖表中,此樣本的細胞 數目會遠高於先前及後來的樣本兩者,此代表可能有一些 沉澱發生在取樣之前或之後,造成不精確之與錐藍(trypan blue)溶液混合的樣本。此一假設係由存活性及感染百分率 兩者與所預期的結果一致而得到確認,此係表示在受感染 的培養物本身中沒有不尋常之事發生,此不精確的取樣將 極可能對於樣本中的E 2濃度不會有影響,因爲E 2是存 在於培養基中而不是存於細胞內。 燒瓶2中的E 2濃度在1 3 9 h p i左右時會極快 上升至>190微克/毫升之最高値,且接著在215 h P i時緩慢下降至1 7 0微克/毫升,然後,E 2含量會 更快速下降至在3 06 · 5hpi時<1〇 〇微克/毫升 i (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X 297公釐) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225094 A7 _____B7 五、發明説明(;P) 之最終含量。 燒瓶3之分佈曲線(profile)爲差不多相同,最高E 2 蛋白質含量也在1 3 9 h p i時達到但稍微高於燒瓶2中 者。在濃度更快速地下降至2 1 5 h p i下的1 4 1微克 /毫升之前,E 2濃度會由1 3 9 h p i下的2 3 3微克 /毫升緩慢下降至1 9 1 h p i下的2 1 2微克/毫升, 燒瓶2及3係顯示一種良好的相關聯性。 在t = 4 4 · 2 5 h p i時,燒瓶第1號,即爲空 白組,也計算其數目。活細胞密度係爲2 · 4 3 5 * 1 0 6 細胞/毫升,死細胞密度爲0 · 1 9 0 * 1 0 6細胞/毫升 ,且總細胞密度爲2 · 6 2 5 * 1 0 6細胞/毫升,得到一 存活率爲9 2 · 8 %。活細胞密度明顯地高於燒瓶2及3 兩者中之細胞密度,表示感染已使細胞生長變緩慢,此空 白組培養物被後續通過。 下表顯示在選擇燒瓶2的樣本上進行的免疫點墨分析 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
法(immunoblotting assay)之結果0
=S=BS=aSSSSBBS=SSS=SSBS=BBSBSSSB=B=BSSSS=SBS:8S=S=BSS=S=aBSS=SBS 樣本(hpi) V3 分解的V3 V8 分解的V8 0 - - - 垂 44 - - - 115 + - - - 139 + - + - 164.5 + - + - 191 + + + - 288 + + + + 306.5 + + + 代表未偵測到,‘ + ’代表可偵測到的 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格ί 2丨0X297公釐) 1225094 A7 B7 五、發明説明(;)乃 如此表中可見,抗原決定子(epitopes)V 3及V 8在0 及4 4 h p i取樣本時仍未偵測到,此係與E 2 - E L I S A的結果有良好的相關聯性。在1 1 5 h p i以上之樣 本中,由於V 3及V 8兩者在E 2帶(band)上偵測到,故 完整的E 2被偵測到。 在1 9 1 h p i以上,由較小蛋白質而來的第二帶 (band)可見於凝膠上,在兩個分開的點墨上以V 3及V 8 進行之免疫點墨分析顯示分解的產物的確含有V 3抗原決 定子,而非V 8抗原決定子,祇有在完整的E 2帶中偵測 到V 8,而無法在該點墨上的其他位置偵測到。此分析淸 楚地顯示E 2蛋白質的分解確實由於蛋白酶的存在而發生 ,事實上,此可對於在大量E 2抗原溶液中微過濾步驟期 間所觀察到的下跌E 2蛋白質含量負責,在此下游的處理 步驟中,細胞係在病毒去活化開始之前被移除。 因此,最可能的是蛋白酶的存在導致E 2蛋白質的分 解。 7 · MO I實驗之實例 目的 爲了進一步檢測MOI (感染複製率’每個細胞之病 毒數目)、細胞密度的最大値以及E2含量的體積之間的 關係。在一方面,全部細胞族群之感染必須在培養基耗盡 之前完成,但在另一方面’在低細胞濃度下的總族群之感 染會導致蛋白質產率在最佳値以下。 _ ^_______ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(:210 X297公釐) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225094 A7 五、發明説明 -〜——~~— 材料及方法 ® 到培養基時,所表示的是S F 9 0 Q I I培養基 7 6毫升的細胞懸浮液被稀釋於1 〇 〇 〇毫升瓶中4 4 4毫升的s F 9 〇 〇丨丨內並溫和地混合之,恰於培養 物稀釋之前的活細胞密度爲3 · 4 1 * 1 0 6細胞/毫升, 死細胞密度爲〇 · 1 9 0 * 1 0 6細胞/毫升,所得到的存 活率爲9 4 · 8%,此稀釋度應可得到±5*1 〇 5細胞/ 毫升之細胞密度。 除此之外,加入建大黴素(gentamycin)以得到最終濃度 1 0微克/毫升,細胞懸浮液被分別以九個5 〇毫升的部 分置於2 5毫升振盪燒瓶中,且多餘的細胞物質被倒掉, 第一個5 〇毫升被轉移至振盪燒瓶1中,最後的5 〇毫升 被移至振盪燒瓶5中。 第1及第6部分係用於M〇I =〇 (空白組), 第2及第7部分係用於M〇I = 〇 · 〇 〇 〇 〇 〇 1, 第3及第8部分係用於M〇I = 〇 · 〇 〇 〇 〇 1, 第4及第9部分係用於M〇I = 〇 · 〇 〇 〇 1, 第5部分係用於M〇I = 0 · 0 〇 1。 病毒儲存液stock的製備如下所示。稀釋的範圍是以 含有稀釋1 0 0倍的病毒懸浮液之小管所製備(該小管包 含每毫升0 · 8 * 1 0 5溶菌斑形成單位(p f u )),此 稀釋1 0 0倍的病毒儲存溶液stock係以下列方式製備。 母種子病毒(master seed virus)被融解且在補充有1〇 % FBS的TC100培養基中稀釋1〇〇倍,並以〇· _________________—S7---— 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X 297公釐) 一一一 — (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225094 A7 B7 五、發明説明(>7 <) 5毫升的小部分儲存於一 7 0°C。 0 · 4毫升的此稀釋1 0 0倍的病毒溶液係以3 · 6 毫升的S F 9 Ο Ο I I培養基來稀釋,得到一稀釋因子爲 1 Ο—1,1毫升的此溶液被加入9毫升的培養基中,得到 一稀釋因子爲1 0-2,1毫升的此溶液被加入9毫升的培 養基中,得到一稀釋因子爲1 0 ~3,且1毫升的此溶液被 稀釋1 0倍以得到一稀釋因子爲1 0_4。3 · 1毫升的培 養基加入含有細胞培養物之振盪燒瓶1及6(空白組燒瓶 )中,3 · 1毫升之1 (T2、1 0—3及1 0—4的病毒稀釋 液係分別加入振盪燒瓶4和9,3和8以及2和7中,這 些振盪燒瓶已含有細胞培養物。 在3 · 1毫升之1 0_2的病毒稀釋液中,係存在有3 •1*10-2*0·8*1〇5=2·5*103 pfu,在 一具有5 0毫升的細胞懸浮液中,存在有0 · 5*1 06* 5 0 = 2 · 5 * 1 0 7細胞。因此,3 · 1毫升之1 0 —2 的病毒稀釋液被加入5 0毫升的細胞懸浮液中,可得到Μ 〇1 値爲 2 · 5*103/2 · 5*107=0 · 0001。 對於其他病毒稀釋液進行相同的計算,加入5 0毫升的細 胞培養物中之1 Ο·3及1 0^的病毒稀釋液所得到的Μ〇 I 數目爲0 · 00001及0 · 000001。最後,2 • 8 5毫升之1 0-1稀釋液被加入振盪燒瓶nr. 5,得到之 M〇I値爲〇 · 〇 〇 〇 9 2而非0 · 0 0 1。
3 · 1毫升的樣本係在病毒加入後直接自每一振盪燒 瓶中取出,樣本中的細胞在1 5毫升的Falcon管中於I E --------3S______ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2丨0X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
1225094 A7 B7 五、發明説明(Μ) CCentraG Ρ 8 R離心機內被離心(1 〇分鐘1 0 0 〇 r p m),取樣係在低Μ〇I値至高Μ〇I値下進行,以避 免病毒病毒由具高MO I値之感染的細胞懸浮液傳送至以 低Μ〇I値感染的細胞懸浮液中。經過離心之後,樣本經 0 · 4 5微米膜過濾(以除去可能仍存在於上淸液中的細 胞),並分別置於3個Nalgene冷凍管中且保存於~ 7 〇。 C下以供後續測驗。 振盪燒瓶1及5之細胞密度係在病毒加入之後立即、測 定,這些爲被接種細胞之第一及最後之燒瓶,因爲細胞密 度幾乎爲相同,所以假設所有的燒瓶具有與兩者細胞數目 之平均値相等之細胞密度,最初的活細胞密度爲0 · 4 2 3 * 1 0 6細胞/毫升,而0 · 0 1 2 * 1 0 6細胞死亡,得 到之存活率爲9 7 · 3%。 所有的燒瓶置於Labotech 3 0 0圓軌振盪平台上, 在2 8 °C室中以約7 5 r p m攪拌。 在 23,95,125,144,173 及 194 h p i (感染後的小時)時,所有的燒瓶被取樣。細胞密 度被測定之樣本具有3·3毫升的體積,其中0·2毫升 係用於測定細胞密度,剩下的3 · 1毫升是對於t = 〇的 樣本以上述方式處理。未計數的培養物樣本具有3·1毫 升之體積。在1 9 4 h p i時,細胞密度被測定且實驗終| 止,剩餘的細胞懸浮液(約3 0毫升)係分成3個部分以 1毫升儲存於Nalgene冷凍管中’以及4個部分以約6毫 升儲存於1 5毫升的Falcon管中。 衣-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁} 、τ· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2X 297公釐) 1225094 Α7 Β7 五、發明説明(Μ) 結果及結論 結果顯示Μ〇I値及最佳細胞密度之間有良好的相關 聯性,且更重要的是,MO I値及Ε 2蛋白質產率之間的 相關聯性。此可於圖表中得知,受到Μ〇I値爲0 · 0 0 1感染之培養物的最大體積Ε2蛋白質產率是設定爲10 0%,其顯示體積Ε 2蛋白質產率隨著Μ〇I的降低而增 加。Μ〇I値達0 · 0 0 0 1時,細胞密度會在達到最大 可達成細胞密度之前而感染,使用ΜΟ I値爲0 · 0 0 0 0 1或較低會導致一感染,其中在培養物的感染完成之前 培養基被耗盡,使得蛋白質產率爲最佳値以下。 因此,結論可爲:所使用的ΜΟ I値愈低,Ε 2蛋白 質產率愈高,其條件爲在感染步驟及生產Ε 2完成之前培 養基未耗盡。 表現b F S H a及/或b H S Fp之重組桿狀病毒 構築轉移載體pDW — a— 9 · 1及pDW - β-3· 1。Sf 2 1細胞係與由細胞外病毒顆粒分離出來之pD W —α- 9 · 1或PDW - β- 3 · 1及野生型(w t ) A CNPV/M021 DNA共同轉染(PCT申請案:W 〇96/25696),表現β—半乳糖苷酶之多角體素 正反應之溶菌斑被分離出來,並以E L I S Α對生長的培 養基分析b FSHa或bFS Ηβ之表現,一個溶菌斑純化 | 的b F S H a病毒(AcNPVa3_4)以及一個溶菌 斑純化的b F S Ηβ病毒(A c Ν Ρ νβΐ · 4 )係用於製 備具有T C I D 5 0分別爲約1 0 7及1 0 8之病毒貯備物| (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣 _ 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(2丨0 X 297公釐) 1225094 A7 B7 五、發明説明(π) (virusstocks),F S Η的生產係根據上述方法所發生並得到 I 生產的含量爲1 7至3 3微克/毫升之間。 P D95試驗 在一次接種以保護9 5 % ( P D 9 5 )的接種豬隻對抗 以1 0 0 L Dso之致病C S F V的Brescia株之攻擊後, E 2劑量(微克)之分析是必要的。 動物 二十六隻不含對致病原專一性(S P F )、6 - 7週 大的豬隻被隨機分爲八隻之三組(A - C )以及二隻之一 組(D),動物在ID-DLO高容量設施中被飼養於B 18,B19,B20及B21畜舍,使動物適應三天, 這些動物每天於一食槽中以完整的食物粒(Hope Farms) 餵養一次,且可任意由一乳頭狀物來飮用水。 接種疫苗及以抗原攻擊 如上述方式製備三種雙層水於油爲佐的疫苗之製劑, 每一個具有不同的E 2抗原濃度;每劑量爲3 2 · 0,8 • 〇及2 · 〇微克。豬隻係以肌肉下接種一次,每一豬隻 接受一劑量,在左耳後2公分之處(A : 2微克的E 2, B : 8微克的E 2,C : 3 2微克的E 2,D ·· 0微克的 E 2),控制組D係僅以DOE佐劑接種,且154豬隻並 未接種。除了前哨動物以外,在每隻動物接種三週之後, 以1 〇 0 5 0 %致死劑量(=100 Va LD5〇)的 C S F V Brescia4 5 6 6 1 0株經由鼻內攻擊之,在攻 擊以前,將前哨動物與其族群分開並在2 4小時之後置回 衣— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 1225094 A7 五、發明説明(β) 。接種量之病毒含量係藉由在由畜舍中置回後滴定一樣本 而測定。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 臨床觀察 動物技術員每天檢測豬隻,記錄不正常的發現’且若 是必要時連絡管理的獸醫師。每天在餵食時間內及之前觀 察每一族群至少1 5分鐘且淸洗畜舍。 記錄族群或各別動物之食物攝取的降低。 在接種後九天及受到攻擊後的2 0天期間記錄動物的 體溫(直腸)。 經攻擊後的血液分析 在受到攻擊之後的第0,2,4,7,1 0及1 4天 時收集E D Τ Α -血液樣本,以監測白血球及血小板數目 的變化,血液中白血球數目的降低(白血球過少; leucopenia )以及血小板數目的降低(血小板過少; thrombocytopenia)係爲C S F典型症狀之一。在一般豬中 白血球細胞及血小板的正常細胞數目分別介於1 1 - 2 3 1 0 9/公升以及320 - 720 10 9/公升之間,就 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 S P F豬隻而言,這些値稍微低些;6 — 1 2 1 0 9/公 升及300-700 10 9/公升之間。上述値在每一隻 豬中均有所不同,血球細胞分析係以Medonic® CA 570 coulter計數器中進行,白血球過少及血小板過少係被界定 爲細胞/血小板數目相當低於上述的最低數目’較佳爲多 於一天。 ---^--42-------- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X Μ?公釐) 1225094 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明U〇) 病毒散播/排出及病毒之偵測 溫度、白血球和血小板數目以及前哨動物的血淸轉換 性係爲偵測病毒由被接種的動物轉移至這些動物中之參數 。在瀕死後之組織上,樣本係由下列器官中採集:扁桃腺 ,脾臟,腎臟及迴腸,且以免疫螢光技術來測試其病毒抗 原之存在。 由這些組織樣本而來的低溫恆溫切片(4微米厚,每 一器官兩個切片)被固定並以多株豬的抗鼠疫病毒FIT C -結合的血淸來培養,在淸洗之後,這些切片在一螢光 顯微鏡下讀取數値,結果係以正反應(=螢光)或副反應 (=無螢光)來表示。 · 血淸反應 所有豬隻的血淸在接種疫苗後之第0,2和3週以及 死亡時收集。樣本保存於- 2 0°C下,並被分析於病毒中 和試驗(V N T )及Ceditest®,一種偵測對C S F具專一 性的抗體之E L I S A中。血淸中中和C S F V的抗體效 價係於一微量效價(microtitre)系統中測定,連續兩倍稀釋 度的血淸係與等體積之含有30 — 300 TCIDso的 C S F V (Brescia株)懸浮液混合,在3 7QC下培養於 一 C 0 2培養箱中1小時之後,每一培養并中加入大約2 5 .0 0 0 P K 1 5細胞,在四天之後,微量效價培養皿 I 係以上述方式處理且在顯微鏡下讀値。C S F V中和效價| 是以中和所有病毒的最高稀釋度之倒數來表示。 |
I ί -—--------43- —___ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225094 A7 _B7 ____ 五、發明説明(斗丨) 統計評估 9 5 %保護劑量之測定係基於中和C S F ¥的抗體效 價>5 0是代表完全的保護之假設下° 結果 在此一章節中動物數目係比較表1或2 ° 在接種疫苗後的臨床觀察 接種疫苗對於豬隻而言沒有任何副面效果’食物攝取 及體溫仍保持正常。在族群A及C中,經過接種疫苗後的 第3天有出現輕微腹瀉、食慾喪失及沮喪之現象。一隻族 群A中的豬隻(第4 4 8號)在整個時期內常規性地嘔吐 ,並保持生長之後,族群B中的豬隻第4 3 8號嘔吐一次 ,豬隻第4 3 4號(族群C,前哨動物)之溫度稍微提高 ,此動物的右後腿有跛的樣子,在每天每一族群接種疫苗 及抗原攻擊3至6公斤之期間食物攝取量增加。 在抗原攻擊後之臨床觀察 未接種疫苗的控制組動物在抗原攻擊之後第三天(第 5 9號)及第六天(第6 0號)會發展出C S F的徵兆: 可見發燒,蜷縮,發抖,喪失食慾以及憂鬱直到死亡,在 抗原攻擊後的第1 0天。除此之外,這些動物發展出發甘 ,後面不全痲痺,腹瀉以及嚴重嘔吐,這兩種動物在瀕死 時被殺死。 接種2微克的E 2 (族群A)之所有豬隻在以抗原攻 擊後2 - 3天會發展出疾病之徵兆,主要包括發燒,蜷縮 ,憂鬱以及厭食,發燒持續2 - 1 0天且最高溫度(Tma --—______Μ._____________ 氏張尺度適用中國國家標準(〇奶)八4規格(2!0'乂297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225094 A7 B7
五、發明説明(LpO x)係爲4 0 · 7 — 4 2 · 2°c間,在第七天以後,豬隻 第4 43-446號不再發燒,且食物攝取量向抗原攻擊 之前的量增加,但是豬隻4 4 8在第九天被發現死亡’且 豬隻第4 4 7號發展出急性c s F (全身痙攣,後面不全 癞痺),並在同一天瀕死時被殺死’兩種前哨動物保持正 常直到以抗原攻擊後7 - 9天’在此之後會發展出急性C S F,並在第2 0天時瀕死時被殺死。 在族群B及C的動物中’當E 2抗體負載量增加時臨 床徵兆及疾病的持續時間較輕微。 在族群B (435 — 439)中,發燒會持續至第2 7天且Tmax介於4 0 · 2及4 1 · 7°C之間,豬隻第4 3 6號以非常輕微的臨床徵兆抵抗抗原的攻擊。一豬隻( 第4 4 0號)在第1 8天後因急性C S F瀕死而被殺死。 族群B中剩下的五隻動物復原,兩隻前哨動物保持正常直 到以抗原攻擊後的第1 1 - 1 2天,在此之後會發展出急 性C S F並在第2 0天殺死。 族群C中,可發現六隻動物中的兩隻(4 3 0,4 3 1 )由第4 一 6天有輕微發燒,且Tmax係介於4 0 · 5 一 4 1 · 2°C之間,除了在抗原攻擊後的第六天有輕微憂 鬱以外,沒有觀察到任何臨床徵兆。當以抗原攻擊之前, 豬隻第4 3 0號有喔吐現象。 兩隻前哨動物仍雄if正常直到實驗結束。 抗原攻擊後之血液分析 族群A中,祇有一豬隻(4 5 0 )、即前哨動物發展 ---------- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1225094 A7 B7 五、發明説明(H ) 出明顯的白血球減少及血小板減少,豬隻第4 4 5及4 4 6號在抗原攻擊後第7及1 0天有血小板減少之現象,豬 隻第4 4 9號則在第1 0及1 4天有血小板減少現象,族 群B中一豬隻(4 4 0 )發展出白血球減少及血小板減少 的現象,其他則保持正常。兩隻前哨動物在第1 4天顯示 發展出的血小板減少之現象,族群C包括前哨動物中未偵 測到白血球減少及血小板減少。 兩隻控制組動物(第5 9及6 0號)由第7天以後出 現血小板減少現象。 抗原攻擊後之病毒散播及病毒抗原偵測 在由畜舍中置回之後,接種量之回滴定(back titration) 係得到2 · 5 5 T C I D 5 0/毫升的病毒效價,C S F V病毒抗原(表1 )係在由族群A及B而來的控制組及前 哨動物之所有選擇的組織樣本中被偵測,六隻接種的動物 中有一隻在族群A及B中爲正反應,且沒有任何正反應在 族群C包括前哨動物中。 血淸反應 0 3?¥之血淸轉換係定義爲在¥:^丁中2 2 5之一 效價,爲了測定使用於V NT中的Brescia病毒之量,回 滴定之結果爲4 1 T C I D 5 0/井。 沒有控制組(D )或前哨動物在實驗期間有血淸轉換 (表2),族群A而來的六隻動物中有兩隻在三週之後有I 血淸轉換情況出現,但是,六隻動物中的四隻在以抗原攻| 擊之後加強劑量(表2),在接種疫苗之後的第2 1天族 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(21〇Χ297公釐) 1225094 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明u+) 群B及C有血淸轉換現象,且所有動物在以抗原攻擊後會 加強劑量,後者僅顯示動物中攻擊病毒的成功複製。 結論 每隻動物的P D 9 5劑量係以給予一次3 2微克的E 2 在2毫升的D〇E佐劑來測定的。以此劑量,在以高度致 病C S F V株攻擊之後臨床疾病徵兆仍爲最小,且病毒不 會散播至接觸動物。總而言之,六隻豬隻中的四個族群( A — D)係以肌肉內途徑來分別接種每2毫升佐劑(D〇 E)之 32(A)、8(B)、2(C)及 0 微克 E d ( D),兩隻未接種疫苗的豬隻維持於每一族群(A- C) 中以偵測病毒排出所造成的接觸感染(前哨動物)。在三 週之後,動作係以鼻內途徑以1 0 0 L D 之高度致病 的C S F VBrescia株來攻擊,臨床的、病毒的及血淸的參 數被測定以分析此E 2次單元疫苗之效用。如預期地,族 群C中的動物比其他族群中的動物更能抵抗抗原的攻擊, 由接種最高劑量的E 2 ( 3 2微克)之動物而來的組織樣 本中沒有偵測到病毒抗原,且在此族群中沒有存在疾病, PD95劑量係在NPLA效價>5 0 (在接種疫苗後第2 1天)之假設下計算以給予完全的保護(沒有病毒散播) ,此係得到每一動物3 2微克之P D 95劑量。 爲了進一步分析在接種疫苗後2及3週時對抗以10 〇 L D 5〇的致病性C S F V攻擊之保護程度,兩個族群 (A-B )之六豬隻係經由肌肉內途徑來接種3 2微克的 E 2,兩隻未接種疫苗的豬隻保持在每一族群(A - B ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) —4^衣· 訂
本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X 297公釐) 1225094 Α7 Β7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明(β) 偵測由接種疫苗的豬隻中排出的病毒所造成的接觸感 染。在兩週(A)及三週(Β )之後,接種疫苗的動物及 控制組動物係經由鼻內途徑被1 〇 〇 L D 5〇的高度致病 性C S F VBrescia株攻擊,臨床的、病毒的及血淸的參數 被測定以分析在接種疫苗之二及三週後E2次單元疫苗之 效用。如預期地,族群B中的動物比族群A中的動物以較 少的臨床症狀來抵抗抗原的攻擊,祇有在族群A中發現病 毒轉移至前哨動物中,且所有由兩個族群中而來的動物之 白血球部分中偵測到病毒。祇有在族群B中的一隻動物( 第4 1 4號)在接種疫苗後第1 4天有血淸轉換現象,由 此相同族群中,一隻動物在第2 1後並未有血淸轉換而是 受到保護,其僅發燒兩天且在以抗原攻擊後的十一天內有 血淸轉換現象出現。祇有控制組及前哨動物(族群A)的 一隻會發展出白血球減少及血小板減少,由族群A及B的 動物得來的組織樣本中並沒有任何病毒抗原被偵測到。下 結論爲,在接種單一劑量的疫苗後的二及三週,所有動物 會受到保護免於抗原之攻擊。 爲了進一步分析在接種疫苗後3及6個月時對抗以1 0 0 L D 5〇的致病性C S F V攻擊之保護程度,兩個族 群(A - B )之六豬隻係經由肌肉內途徑來接種3 2微克 的E 2,兩隻未接種疫苗的豬隻保持在每一族群(A 一 B )中以偵測由接種疫苗的豬隻中排出的病毒所造成的接觸 感染。在三個月(A)及六個月(B )之後,接種疫苗的 動物及控制組動物係經由鼻內途徑被1 〇 〇 L D 5〇的高 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(Ζ ί 0 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂
1225094 A7 B7 __ 五、發明説明(以) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 度致病性C S F VBrescia株攻擊’臨床的、病毒的及血淸 的參數被測定以分析在這段時間後E 2次單元疫苗之效用 。由族群A及B中而來的所有動物具輕微臨床症狀來抵抗 抗原的攻擊,且僅有控制組動物發展出白血球減少及血小 板減少。並未發生病毒轉移至前哨動物之情況,且病毒並 未在任何選自兩族群之白血球部分中偵測到。祇有在族群 B中的一隻動物(第1 9 8 3號)在接種疫苗後第2 8天 有血淸轉換現象,由族群A、B及前哨動物的動物得來的 組織樣本中並沒有任何病毒抗原被偵測到。總而言之’在 接種單一劑量的疫苗後的三及六個月,所有動物會受到保 護免於抗原之攻擊,且不會發生病毒轉移現象。
使用BVDV 4800、150022及1780 0 3株來生產實驗的E 2次單元疫苗,這些病毒株的E 2 基因被表現於桿狀病毒表現系統中(Hulst et al·,1993, J· Virol. 67: 5435-5442) ( Ρ· A. van Rijn et al·,1996, J. Gen. 經濟部智慧坷產局員工消費合作社印製
Virol·,77: 2737-2745 ) o Spodoptera frugiperda 細胞系,即 S F 2 1,係使用於繁殖重組的桿狀病毒及製造E 2蛋白 質,S F 2 1細胞生長在2 8°C下,於不含血淸的S F 9 00培養基中(GIBCO BRL)。群集單層的SF2 1細胞受到重組桿狀病毒以每細胞5 T C I D 5 〇 ( 5 0 %組織培養物之感染劑量)的感染複製率來感染,在4至 5天之後,培養物顯示出8 0 - 9 0 %細胞致病的效果。 該等細胞係在1 5 0 〇 * g下被離心1 0分鐘,且含有感狀 病毒及E 2之上淸液被收集並儲存於- 2 0°C。爲使感狀 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(=ί〇Χ 297公釐) 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225094 A7 B7 五、發明説明(1j/[) 病毒去活化,故根據標準程序來進行2 -溴乙基-亞安溴 化物(B E I )之處理,簡言之,混合6 0 0微升的B E I及6 0 0微升的1M Na〇H,在20°C下30分鐘 後,加入1 5 0毫升的上淸液並在2 0°C下攪拌2 4小時 ,然後加入2 0毫升的2 5 %的硫代硫酸鹽。感狀病毒之 去活化係由將上淸液滴定於S F 2 1細胞上來確認。 實驗的B V D V疫苗係由以一雙層水油乳液形成存在 之含有E 2的上淸液所組成,該油係包含9 0%的Marcol 52 (ESSO)及10% 的 Montanide 8 0 ( Seppic ) ’ 該水部分(P B S + )係包含9 8 %的磷酸緩衝鹽水、2 % 的 Montanox 8 0 ( Seppic)以及 1 〇 〇 p p m 的硫柳 汞。上淸液、油及P B S +係以1 0 : 1 1 : 1 0的比例 來使用,首先上淸液及油被乳化,接著加入P B S +且被 乳化。一控制組疫苗是以相似方式由受到野生型感狀病毒 感染的S F 2 1細胞之上淸液來製備,在製備完成後,發 現該等疫苗係爲無菌的。 吾人認爲由於表現的蛋白質之可相較性,故在三個疫 苗中的抗原量爲相似之初步的假設,係爲不正確的。抗原 量之不同可能是由於昆蟲細胞中表現之差異性所致,疫苗 1 5 0 0 2 2每一劑量包含5 5微克的E 2且在2 X接種 疫苗(第0天及第2 1天)後對於胎兒具有保護作用( Brusche et al·,1997,Vaccine in press)。疫苗 4 8 0 0 及 疫苗1 7 8 0 〇 3每一劑量分別包含1 2微克及1 7微克 的E 2,且不對於胎兒有保護作用。此結果係建議一介於 __________^0_ 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 '〆、297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
1225094 A7 ______ B7 五、發明説明(0) E 2蛋白質及胎兒保護之間的相關連性,但是,E 2醣蛋 白的免疫產生性及攻擊病毒株之無法通過胎盤的差異性也 解釋抗原攻擊後的不同結果,沒有疫苗可保護以免於異源 B V D V攻擊。 此硏究結果對於進一步發展B V D V次單元疫苗而言 是充滿希望的,因爲吾人已發現胎兒的保護性可藉由接種 外膜醣蛋白E 2來達到。除此之外,其係爲一種標記疫苗 ,可允許接種疫苗的動物及受到field病毒株感染的動物區 別,從未來消滅BVDV的計畫之觀點而言是有利的。 結論 所發展的生產方法係針對達到在昆蟲細胞中最高之由 嵌入桿狀病毒編碼的異源蛋白質產量。感狀病毒表現載體 系統(B E V S )非常適用於製造不同的重組蛋白質,因 爲正確的蛋白質摺疊及精確的轉譯後處理會得到對於動物 及人類應用上具有生物活性的蛋白質。桿狀病毒係包含2 個由非常強的啓動子,p 1 0及多角體素啓動子,而轉錄 來的非必須基因,使P 1 0缺失突變(^11〇6^6〖&1,1· Gen. Virol· 74: 563-574; 1993 )顯示 p 1 〇 在細胞培養物中 對於病毒複製上並不重要,而是在細胞溶解上扮演了一個 角色,P 1 0蛋白質的不存在造成受感染的細胞保持完整 且防止多角體素由受到感染的細胞中釋出,藉此而降低再 感染率但非感染率本身。該等基因的產物(p 1 〇 (就 fibrillin而言)及多角體素)係在感染期間的晚期表現,以 必要蛋白質的基因來取代這些基因(在多角體素啓動子之情 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
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經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格Ul〇X297公釐) 1225094 A7 B7 五、發明説明(y ) 況下)理論上可得到昆蟲細胞培養物之達5 0%的總蛋白質 產量,得到表現量爲培養物中每公升超過1公克的多角體 素(Maiorella et al·,( 1988 ),用於重組蛋白質生產的大 量昆蟲細胞培養物,Bio/technology,6, 14〇6-1410)。感染 的複製率(MO I,每毫升病毒密度及每毫升細胞密度之 比率)係爲使蛋白質產量最佳化的主要參數,一個以低感 染複製率感染之明顯的理由是在於使病毒接種量儘可能保 持最低,若是感染係每毫升2百萬個細胞以〇 · 1之Μ〇 I値發生於5 0公升的發酵槽中,則需要1*1 01°個病 毒,此必須有約1公升的接種量,除此之外,製備此一接 種量需要一額外的製造步驟。被感染的培養物之兩個主要 缺點是使用不足的培養基以及氧氣之限制’由於氧氣在水 性液體之溶解度相當低,對於單層細胞培養物中的細胞而 言氧氣將爲限制性基質。穩定的培養物中之最高細胞密度 之決定因子係爲可用的表面,一旦表面覆蓋一單層細胞時 ,細胞生長將會停止,此得到一細胞密度爲約1 * 1 〇 6細 胞/毫升培養基。在懸浮液培養物中’沒有氧氣限制性存 在,且其他基質的可用性對於細胞密度係爲限制因子,此 一限制性係發生比氧氣限制下更高的細胞密度,並因此細 胞密度會變得比穩定培養物更高。氧氣限制性係藉由使用 一溶氧電極以偵測溶氧濃度來預防,一旦溶氧濃度降低至 一特定値以下時,氧氣會自動地添加於懸浮液中,其可藉 著通氣攪拌或經由發酵槽的頂部空間加入,中度攪拌懸浮 液可確保一均質培養物,其中沒有形成基質梯度且其中細 ------—~—S2—-------- 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2丨〇'〆297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225094 A7 _______B7_ 五、發明説明(f ) 胞不會受到太高剪力。此外,攪拌可使得病毒由感染的細 胞充分地轉移至未感染的細胞,得到一較高之病毒感染細 胞的效率。因爲最初僅有約0 · 1 - 0 · 3 %的細胞受到 感染,故剩下9 9 · 7 - 9 9 · 9 %的細胞被允許生長及 複製,製造於感染細胞中的病毒顆粒係在感染之後的1 2 一 2 0 小時被釋放出來(Dee,K. U· and Shuler,M· L· 1997· Biotechnology Progress, 13, 14-24),每個細胞釋放的病毒 顆粒之數目爲1 0 〇 - 2 0 0,其至今可在一新的周期中 感染未感染的細胞’在製造足夠病毒顆粒來感染存在培養 物中的所有細胞之前將需要數個周期,此目的在於培養基 耗盡之前完成最終感染事件之蛋白質製造,且所有代謝程 序停止。所不欲的亦爲以一最佳以下的細胞密度來達到完 全感染,其將不會有效率地使用培養基,得到一較低體積 之異源蛋白質之產率。由於多角體素基因仍存在’病毒感 染的整個過程可以目視檢查,病毒感染可以堆積於細胞核 中之的稠密的蛋白質顆粒來觀察。爲了防止對於細胞的剪 力損害,加入Pluronic F-68於培養基中使最終濃度達到0 • 2%,另外,若有需要,加入消泡劑A以預防過度的起 泡,其也可造成細胞死亡。消泡劑A加入5 0公升的培養 物中之總量平均爲2 0毫升,感染細胞的最適病毒密度可 被計算出來,此密度係依細胞的生長速率、感染後釋放出 新病毒顆粒時的時間、以及每一個受到感染的細胞製造新 病毒顆粒之數目而定。本發明所提供的方法係以鼠疫病毒 E 2蛋白質之製造來說明,雖然此蛋白質已知爲一種有效 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 1225094 A7 ____ B7 五、發明説明(匕|) 的抗原,針對一疫苗或診斷試驗之E 2 (片段)製造並非 一直是成功的,儘管P D 5 〇爲2微克一般低(當使用一 特別的免疫產生性E 2片段時),如何以一商業上有吸引 性的方式來增加具足夠抗原性質量的疫苗劑量之足夠量,
使得多族群動物藉由每個動物單一疫苗接種而有保護性的 疫苗接種仍是一個問題。此特別與C S F V疫苗接種相關 ,當施用之時,C S F V疫苗接種通常是在C S F V已發 生流行的區域內於一大量競爭期間進行,此需要在一相當 短的時間內快速接種疫苗於大量的動物,在這種大量競爭 中,快速達到一足夠的保護程度(受到保護以對抗野生型 病毒感染之豬隻數目)是具有迫切的重要性,在第一次接 種疫苗後等待數週進行第二次疫苗接種以達到保護性,會 極度地防礙並延遲疾病的控制。多種製造重組表現的E 2 蛋白質之方法間存在差異性,即使當E 2 (片段)表現於 桿狀病毒中時,在較早所報導的製造E 2蛋白質之培養物 中,E 2蛋白質(片段)的產率係介於2 0 — 9 0微克/ 毫升間(Hulst et al·,J. Vir. 5435-5442,1993 ; Hulst and Moormann, Cytotechnology 20:271-279, 1996),進一步需 要以單株抗體來進行免疫親合性純化,以得到對於單一注 射接種疫苗之必須及相關的E 2抗原性質量。另一種方法 (使用敘述於EP 0 3 8 9 0 3 4中的E 2片段)係使用 由昆蟲細胞的懸浮液中所收集而不經過進一步免疫親合性 純化之E 2,會得到一種在獲得滿意的(保護性的)免疫I 反應前注射兩次之E 2爲主的疫苗。在其他方面中這些問I (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2丨〇Χ297公釐) 1225094 A7 B7 五、發明説明(β) 題係關於在起始物質例如細胞培養物懸浮液中,由其中製 備疫苗之相關抗原物質的低濃度,在此情況下爲Ε 2蛋白 質(片段)。在理論上,可藉由在此技術已知的純化及濃 縮方法來進一步累積抗原質量,但是,此種方法並未得到 一種商業上有吸引性的疫苗,而是造成每劑量之高成本。 使用本發明所提供的方法在5 0公升的發酵槽中進行的生 產常規性地得到約2 0 0 - 3 0 0微克/毫升C S F V Ε 2蛋白質片段之產率,足以使每一培養物理論上接種疫 苗於1 0 0 · 0 0 0個動物。以含有約1 0 7 丁 C I D 5 〇 /毫升的1至1 0毫升病毒接種量之0 · 5至1 · 5 * 1 0 6細胞/毫升的密度來感染細胞,當高於5 0 - 8 0 %的細 胞顯示C Ρ Ε時較佳地收集培養物,此係感染後大約1 〇 0 — 1 5 0小時。在先前的Ε 2蛋白質製造培養物中,細 胞(同時地)受到Μ〇I値> 1之感染,得到三倍低於本 發明所提供者之蛋白質產率。在本發明所提供的方法中, 5 0公升的發酵槽係以生長於5公升發酵槽中的5公升細 胞懸浮液,或是生長於1公升發酵槽中的1 0公升所有懸 浮液來接種。最初的細胞密度係爲3 * 1 0 5細胞/毫升, 在加入病毒於懸浮液之前,使細胞生長至所計算的細胞密 度。下游的處理是藉由微過濾法來除去細胞及多角體素爲 開始,一中空的纖維微過濾裝置係連接到發酵槽且以〇 · |
2 2微米的孔徑使物質通過過濾膜module,留滞流體係再 循環於發酵槽中,且滲透流體係收集於1 0 0公升的容器 內,當過濾完成時,現在爲不含細胞但仍含感染性桿狀病I _________ _ [ 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -鲁衣.
、1T 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225094 Α7 Β7 五、發明説明(0) 毒之抗體溶液在1 0 0公升的容器中被去活性。一般而言 ,2—溴乙基一溴化銨(B EA)被加入懸浮液中使最終 濃度達到8 — 1 2 mM,藉著加入2M的Na OH使pH 値由約5 · 8提高至8 · 2 — 8 · 7,此p Η値的變化使 Β Ε Α轉變爲Β Ε I ( 2—溴乙基一溴化亞安),此係爲 一種D N A去活化劑,小心監測並調整p Η値在6 - 1 0 且使溫度保持在3 4 - 3 9 °C。在去活化6小時之後,抗 原溶液被轉移至第二個去活化的容器中,此可確保容器中 的所有物質已與Β Ε I接觸且因而被去活化,含有病毒但 非含有Β Ε I之液體滴可存在於第一容器中,但不是存在 於第二容器中。以ΙΟ4— 1〇7 pfu/毫升的濃度存 在之桿狀病毒係被降解至<107 pfu/毫升之値(每 10立方公分<1個病毒顆粒),此係與基於可感染宿主 動物(如FMD )的病毒之疫苗所用者一般相同,豬隻並 非爲桿狀病毒之宿主,去活化的大量抗體被儲存於=- 2 0°C直到其被製成配方成爲一水-油-水乳液時。在接種疫 苗後2週直到至少6個月,含有3 2微克的E 2 (劑量體 積2毫升)之單一劑量足以給予對抗典型豬熱病之保護性 (> P D 9 5 )。製造方法係以直接程序之大量化以及可 能使用2 5 0公升或甚至更大的發酵槽之這類方法來設計 ,一穩定培養物製造之大量化也是直接的;祇是使用較多 的培養燒瓶。但是,在5 0公升的發酵槽中所達到的一般 總蛋白質製造需要約7 〇 〇 〇個τ1 7 5的組織培養燒瓶 ,因爲一氧氣及p Η電極之存在,故細胞生長及感染較好 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格Ul〇X297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1Τ 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 1225094 A7 __ B7 ____ 五、發明説明(許) 可在一發酵槽中監測且調整。在組織培養燒瓶中,可能會 存在燒瓶間的變化性,但其無法被定量’去活化之監測及 調整在容器中係比在穩定培養物製造中更正確。若以本發 明所提供的方法使細胞生長,表現於3 E v s (在吾人硏 究機構中)中的其他蛋白質之體積生產量亦相當地增加’ 舉例來說,使用1 0公升的發酵槽可藉由3 - 4因子來增 加牛F S Η的產率,每一個爲0 · 003的Μ〇1値之2 種重組桿狀病毒以1 · 1*10 6細胞/毫升之細胞密度來 共同感染細胞,振盪燒瓶中懸浮液培養物內BVDV及 ns蛋白質的不同E 2蛋白質或是B VD V及/或C S F V 之產率增加三倍,此方法也可應用於其他的重組蛋白質。 表1·以免疫螢光技術在不同組織的低溫恒溫部分上進行病毒抗原之偵測 ----衣-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 經濟部智慧射產局員工消費合作社印製 麟 動物編號 實驗室 組織 死亡 號碼 扁桃腺 脾臟 腎臟 迴腸 d.p.c. A. 443 1 _ - - - 20 2微克E2 444 2 - - - - 20 445 3 - - - - 20 446 4 - - - - 20 447 5 + - + + 9 448 6 - - - - 9 449 (S) 7 + + + + 20 450 (S) 8 + + + + 20 B. 435 9 - - - - 20 8微克E2 436 10 - _ - 20 437 11 - - - - 20 ------------55—— 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X297公釐) 1225094 五、發明説明 438 12 - - 讎 - 20 439 13 - - - - 20 440 14 + + + … 18 441⑻ 15 + + + + 20 442⑸ 16 + + + + 20 C. 427 17 - - _ - 20 32微克 E2 428 18 - - - - 20 329 19 - - 20 430 .20 - - - - 20 431 21 - - - - 20 432 22 - - - 霸 20 433 (S) 23 - _ - - 20 434 (S) 24 - - - - 20 D. 59 25 + + + + 10 60 26 + + + + 1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 沒有螢光被偵測到 + =螢光被偵測到 …=無數據 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 *=在實驗20d.p.c.最終時將動物殺死 表2·病毒中和化試驗之結果 族群 動物編號 實驗室 接種疫苗後的天數 號碼 0 14 21 41 (死亡時) A. 443 1 <12.5 19 75 >1600 2微克E2 444 2 <12 <12 19 >1600 445 3 <12.5 <12 <12 >1600 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 1225094 A7 B7 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 五、發明説明(0) 446 4 <12.5 <12.5 12 >1600 447 5 <12.5 <12.5 19 <12.5 448 6 <12.5 19 37 449⑻ 7 <12.5 <12.5 <12.5 <12.5 450⑸ 8 <12.5 <12.5 <12.5 <12.5 B. 435 9 <12.5 <12.5 100 >1600 8微克E2 436 10 <12.5 <12.5 400 >1600 437 11 <12.5 75 600 >1600 438 12 <12.5 37 400 >1600 439 13 <12.5 37 75 >1600 440 14 <12.5 <12.5 37 600 441⑶ 15 <12.5 <12.5 <12.5 <12.5 442 (S) 16 <12.5 <12.5 <12.5 <12.5 C. 427 17 <12.5 50 150 >1600 32微克 E2 428 18 <12.5 37 600 >1600 329 19 <12.5 >1600 1200 >1600 430 20 <12.5 <12.5 50 >1600 431 21 <12.5 <12.5 800 >1600 432 22 <12.5 <12.5 800 >1600 433 (S) 23 <12.5 <12.5 <12.5 <12.5 434 (S) 24 <12.5 <12.5 <12.5 <12.5 D. 59 25 <12.5 <12.5+ <12.5 + 60 26 <12.5 <12.5 <12.5 + ---=無數據 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) ______;_____5° 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X 297公釐)
Claims (1)
1225094 Μ7 A8 B8 C8 D8 、申請專利範圍 1·一種製造包含典型豬熱病毒E2蛋白質或其片段 的疫苗之方法,其包含使昆蟲細胞於一培養容器內的生長 培養基中生長,以一種具有感染複製數介於0 · 0 0 0 1 和0·01間之編碼該蛋白質或其片段的重組桿狀病毒的 一接種量感染該等細胞,培養該等細胞直到5 0 - 1 0 0 %的細胞顯示細胞致病效果,將細胞物質移除,且將疫苗 配製。 2 ·根據申請專利範圍第1項之方法,其中該等細胞 係以5 X 1 0 5至1 · 5 X 1 0 6細胞/毫升之密度被感染 3 ·根據申請專利範圍第1項之方法,其中該感染複 製數係介於0 · 0 0 1和0 · 0 0 5之間。 4 ·根據申請專利範圍第3項之方法,其中該感染複 製數係介於0 · 0 0 1和0 · 0 0 3之間。 5·根據申請專利範圍第1至4項中任一項之方法, 其中當該蛋白質或其片段於生長培養基中的最終濃度介於 1 0 0微克/毫升及3 0 0微克/毫升之間時,該細胞物 質被移除。 6·根據申請專利範圍第1至4項中任一項之方法, 其中該疫苗係藉由加入一佐劑而配製。 7 ·根據申請專利範圍第6項之方法,其中該佐劑包 含一種雙重水於油乳液。 8·—種根據申請專利範圍第1至7項中任一項之方 法所得到的疫苗,其中該疫苗每劑量含有該蛋白或片段至 9 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) *11-· 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 1225094 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 少32微克,以及該疫苗於單次疫苗接種後可提供保護以對 抗典型豬熱病,不需經過免疫親和純化。 9 ·根據申請專利範圍第8項之疫苗,其中該疫苗係 配製爲以一劑量單次接種後在P D 9 5含量給予對抗典型 豬熱病毒感染之保護性,而不須經免疫親和性純化。 10·—種根據申請專利範圍第1至7項中任一項之 方法所得到的製劑,其中該製劑含有該蛋白或片段的最終 濃度介於100微克/毫升和300微克/毫升。 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 'II
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) I22|5094
時間 (hpi) 存活 死亡 總數 (劃) 存活率 (%) 存活inf (#/ml) 死亡inf Inf (%) Ε2含量 _ώ1) -1 0.612*106 0.018*106 0.630* 106 97.1 0 0 0.0 0.0 20.75 1.305* 106 0.048*106 1.353*!06 96.5 0 0 0.0 0.0 44.25 2.030” 06 0.110*106 2.140*106 94.9 0 0 0.0 0.0 94.75 2.215*106 0.415*106 2.540*106 83.7 0.715*106 0.3 95 *3 Ο6 43.7 96.8 115 1.145*106 1.6】0*]06 2.755*106 \4l.6 0.585*106 1.550* 106 77.5 171.0 139 0.608* 106 2.168*106 2.766* 106 21.9 (0.364* 106 2.316* 106 90.1 193.5 164.5 僅取樣,並乏 艮計算細胞數目 176.9 191 0.072* 106 2.540* 106 2.612*106 2.8 0.072* 106 2.540* ΙΟ6 100 176.4 215 僅取樣,並$ 樹算細胞數目 136.6 288 僅取樣,並未計算細胞數目 102.0 306.5 僅取樣,並未計算細胞數目 96.6 m- 振盪燒瓶第2號 振盪燒瓶第3號 時間 (hpi) 存活 死亡 總數 存活率 (%) 存活inf (漏) 死亡inf (#/ml) Inf (%) Ε2含量 (μ_) -1 hpi 0.736* 106 0.024* 106 0.760* Η)6 96.8 0 0 0.0 0 20.75 1.179*106 0.045* 106 1.224* 106 96.3 0 0 0.0 0 44.25 2.075*] Ο6 0.085*106 2.160* 106 96.1 0 0 0.0 0 94.75 1.815*106 0.525* 106 2.340* 106 77.6 0.475* 106 0.485* 106 41.0 101 Π5 1.285* 106 1.510*106 2.795*106 46.0 0·6】5*】06 1.425* 106 73.0 196 139 1.060* 106 3.420* 106 4.480* ΙΟ6 23.7 0.584*106 3.380*106 88.5 233 164.5 僅取樣,並> 樹算細胞數目 204 ]9I 0.104*] Ο6 2.692*】06 2.796* ΙΟ6 3.7 0.104*106 2.692* ΙΟ6 100 212 2J5 僅取樣,並身 巧十算細胞數目 14】 288 僅取樣,並3 S十算細胞數目 N.D. 306.5 僅取樣,並未計算細胞數目 N.D. N.D.=未偵測到
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