JPH09509682A - ペスチウイルスのｔ細胞刺激性タンパク質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本出願は、ペスチウイルス、特に古典的豚熱病ウイルス（ＣＳＦＶ）の免疫原性ポリペプチド、特定的には、非構造タンパク質ｐ１０、より特定的には該タンパク質由来のＴ細胞エピトープ、及びこれらのポリペプチドをコードする核酸分子、並びにこれらのポリペプチド又は核酸分子を含むワクチン及び診断薬に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ペスチウイルスのＴ細胞刺激性タンパク質 本出願は、ペスチウイルス（ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）、特に、古典的豚熱病ウ イルス（ＣＳＦＶ）のＴリンパ球刺激性タンパク質、特定的には、非構造タンパ ク質ｐ１０、より特定的には、該タンパク質由来のＴ細胞エピトープ、を含むポ リペプチド、これらのポリペプチドをコードする核酸、該核酸を含む組換えベク ター、該ベクターで形質転換した宿主細胞、該ポリペプチドを含むワクチン及び 診断薬、並びにそれらの製造法に関する。 ペスチウイルス属は、フラビウイルス科に属し、古典的豚熱病の原因物質であ る古典的豚熱病ウイルス（即ち豚コレラウイルス）、ウシに感染するウシウイル ス性下痢性ウイルス（ＢＶＤＶ）及びヒツジに感染するボーダー病ウイルス（Ｂ ＤＶ）からなる。ペスチウイルスは、エンベロープに包まれた直径４０〜６０ｎ ｍの小型ＲＮＡウイルスである。該ウイルス粒子は、糖タンパク質が包埋された 脂質層に包まれた核キャプシドからなる。ペスチウイルスのゲノムは、約１２． ５ｋＢの一本鎖ＲＮＡからなる。該ゲノムは、翻訳されない部分に隣接する単一 の読み取り枠（Ｏ ＲＦ）を含んでいる。３′末端はポリアデニル化されていない。 ウイルスのタンパク質が、仮想的ポリタンパタ質の同時及び翻訳後プロセシン グにより形成されるのに対し、構造タンパク質はゲノムの５′末端にコードされ る。ペスチウイルスは他のフラビウイルスとは対照的に、５′末端に非構造ｐ２ ３タンパク質をコードする配列を有している。このＮ末端プロテアーゼ（Ｎｐｒ ｏ）は、自己タンパク質分解プロセスにより隣接するタンパク質からスプライシ ングされる。３′末端方向に、ｐ１４核キャプシドをコードする配列、次いで小 胞体（ＥＲ）の内腔の糖タンパク質Ｅ０、Ｅ１及びＥ２の順次配列のトランスロ ケーションを司るシグナル配列が続く。単一の糖タンパク質のスプライシングは 、ＥＲの細胞シグナラーゼによって引き起こされると考えられる。糖タンパク質 は、感染細胞中に、Ｓ−Ｓ−架橋にわたる大きさの複合構造を形成し得る。これ らの複合構造の機能は朱だ解明されていない。 糖タンパク質中には、構造タンパク質の配列以外に、非構造タンパク質ｐ１２ ５、ｐ１０、ｐ３０及びｐ１３３の配列が見られる。細胞変性ウシウイルス性下 痢性ウイルス （ＢＶＤＶ、別のペスチウイルス）における翻訳後プロセスに似て、ｐ８０タン パク質がｐ１２５タンパク質のプロセシング後に検出され得る（Ｄｅｓｐｏｒｔ ，Ｍ．及びＢｒｏｗｎｌｉｅ Ｊ．，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．付録３，２６１− ２６５，１９９１）。ｐ５８及びｐ７５タンパク質にプロセスされるｐ１３３非 構造タンパク質は、ＲＮＡポリメラーゼ配列に類似の配列モチーフを含んでいる 。非構造ＣＳＦＶタンパク質のアミノ酸配列は、おおよそ、本明細書の配列番号 ：１及び２で示されている３−１１４２（ｐ１２５）、１１４３−１２０６（ｐ １０）であると考えられる。ｐ８０のＮ末端は、アミノ酸番号４６０（配列番号 ：１及び２）であると椎定される。ｐ３０の開始は、配列番号：１及び２でも示 されているアミノ酸番号１２０７である。 ＣＳＦＶ Ａｌｆｏｒｔのｐ３０の完 全配列は、Ｍｅｙｅｒｓら（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７１，５５５ー５６７，１９ ８９；図４のアミノ酸２３３７−２６８３）に示されている。これらのタンパク 質をコードするＤＮＡ配列は、本明細書の配列番号：１及びＭｅｙｅｒｓらの文 献（前掲）にも示されている。 ＣＳＦＶに感染すると、急性、最急性、慢性又は臨床的 に見分けにくい症状が発生し得る。該疾患の重篤度は、感染負荷や動物の年齢に 応じて異なり、動物の免疫受容能及び全身的な体質が重要な因子となる。 高ウイルス性株（例えば、ＣＳＦＶ−Ｂｒｅｓｃｉａ株）に感染してから３〜 ５日目後に動物が死に至る最急性疾患期には発熱だけが認められる。高熱に続く 急性疾患期には、白血球の減少、結膜炎及び食欲不振が認められる。該疾患の最 終段階では中枢神経系障害が発生する。別の症状は、胸腺の萎縮、皮膚のチアノ ーゼ、及び血小板減少症が一因となる皮膚出血である。該疾患の急性期における 死亡率は３０〜１００％である。 慢性疾患形態は、亜病原性ウイルス株に感染した後に見られる。この形態は、 子豚が胎盤経由の感染を経て子宮内感染した場合に最も危険である。これらの子 豚は生後わずか６〜８週間しか生存しないが、感染源となる。 生後感染を耐過したブタは、体液性免疫応答の誘発によると考えられる終生免 疫を得る。感染してから２〜３週後に中和抗体が検出される。 この経済的に重大な病気に対処するために数種のワクチンが開発された。不活 化ウイルスを含むワクチンは、ほん の短期問の保護しか与えないので、今ではもう使用されていない（Ｂｉｒｏｎｔ ，Ｐ．及びＬｅｕｎｅｎ，Ｊ．：Ｌｉｅｓｓ，Ｂ．編：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ ｓ ｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｓ．Ｍａｒｔｉｎｕｓ Ｎｉｊｈｏｆｆ Ｐｕｂｌ．，Ｂｏｓｔｏｎ １８１−２ ００ページ，１９８８）。ウサギ（Ｃ株）又は細胞培養（例えば、Ｔｈｉｖｅｒ ｖａｌ株）（Ｌａｕｎａｉｓ，Ｍ．ら，Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｅｔ．，１２３,１ ５３７−１５５４,１９７２;Ｓｈｉｍｉｚｕ Ｙ.，Ｊａｐ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ａｇ ｒ．Ｒｅｓ．Ｓｃｉ．，１３，１６７−１７０，１９８０）中で一連の継代を行 って得られた弱毒化ウイルスを用いてより良好な保護が得られた。 しかし、これらのワクチンの欠点は、予防接種した動物と圃場ウイルスに感染 した動物との見分けがつかないことである。従って、欧州共同体においては、現 在これらのワクチンの使用は禁止されており、古典的豚熱病の防除は、感染した ブタを隔離して殺すことにより行われている。 最近に至り、組換えウイルスをベースとする生ワクチンを用いてかなりの成果 が得られた（ｖａｎ Ｚｉｊｌ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，２７６１−２ ７６５，１９９ １；Ｒｕｍｅｎａｐｆ，Ｔ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６５，５８９−５９７，１９ ９１；Ｈｕｌｓｔ，Ｍ．Ｍ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７，５４３５−５４４２， １９９３）。これらのワクチンは全て、組換えベクターウイルス中での構造糖タ ンパク質の発現に基づいている。 本発明は、ペスチウイルスＴリンパ球刺激性タンパク質又はその免疫原性的に 活性な部分を含むポリペプチドに関する。 そのようなポリペプチドは、通常はそれが結合している他のペスチウイルスを 本質的に含んでいない。特定的に言えば、該Ｔリンパ球刺激性タンパタ質は、古 典的豚熱病ウイルスＴリンパ球刺激性タンパク質又はその免疫原性的に活性な部 分である。 より特定的に言えば、該ポリペプチドは、ＣＳＦＶ非構造ｐ１０タンパク質を 含んでいる。ＣＳＦＶタンパク質はウイルスによって、翻訳後に切断されるポリ タンパク質として発現されるので、ｐ１０タンパク質及びその隣接タンパク質ｐ １２５及び／若しくはｐ３０又はその一部を含むポリペプチドも本明細書で考慮 される。 より特定的に言えば、該ポリペプチドは、アミノ酸配列 Ｓ−Ｔ−Ａ−Ｅ−Ｎ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｆ−Ｇ−Ｙ−Ｖ、最も特定的に は、アミノ酸配列Ｅ−Ｎ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｆを含むＴ細胞エピトープ を含む。 「タンパク質」という用語は一般に、生物学的活性を有するアミノ酸の分子鎖 を指す。１個のタンパタ質は、特定の長さを有するものではなく、必要とあれば 、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏで、例えば、グリコシル化、アミド化、カ ルボキシル化又はリン酸化により修飾し得る。従って、とりわけ、ペプチド、オ リゴペプチド及びポリペプチドがその定義に含まれる。 より具体的に言えば、本発明は、配列番号：２で示されているアミノ酸配列を 有する、Ｔリンパ球刺激性タンパク質又はその免疫原性的に活性な部分を含むポ リペプチド、及びその生物学的機能均等物又は変異体を提供する。 該ポリペプチドの免疫原性的に活性な部分は、アミノ酸配列中のＴ細胞活性化 を誘発し得る部分である。 より特定的には、本発明は、配列番号：６で示されているアミノ酸配列を含む ポリペプチド、さらに特定的には、配列番号：４で示されているアミノ酸配列を 含むポリペプチドを含む。 本明細書に特定的に開示されているタンパク質の生物学的機能均等物又は変異 体は、上記のアミノ酸配列から、例えば、１個以上のアミノ酸を欠失、挿入及び ／又は置換することにより誘導されたタンパク質であるが、ＣＳＦＶの１個以上 の免疫原性決定基を保持している、即ち、前記変異体は宿主動物に免疫応答を誘 発し得る１個以上のエピトープを有している。 本明細書に含まれている特定タンパク質の場合、個々のウイルス株間に自然変 異が存在し得ることを理解されたい。これらの変異は、配列全体におけるアミノ 酸の差異又は該配列におけるアミノ酸の欠失、置換、挿入、逆位又は付加により 示され得る。生物学的及び免疫学的活性を本質的に変化させないアミノ酸置換が 、例えば、Ｎｅｕｒａｔｈらにより“Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”Ａｃａｄｅｍ ｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９７９）に記載されている。関連アミノ 酸間のアミノ酸置換又は進化中にしばしば発生した置換には、Ｓｅｒ／Ａｌａ、 Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｉｌｅ／Ｖａｌがある（Ｄ ａｙｈｏｆ，Ｍ．Ｄ．，Ａｔｌａｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａ ｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔ．Ｂ ｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，１９７ ８，第５巻，付録３参照）。他のアミノ酸置換には、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／ Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、 Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／ Ｖａｌ及びＡｌａ／Ｇｌｕが含まれる。この情報に基づいて、Ｌｉｐｍａｎ及び Ｐｅａｒｓｏｎは、相同タンパク質間の機能的類似性を決定する迅速且つ高感度 のタンパク質比較法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７，１４３５−１４４１，１９８５ ）を開発した。本発明の代表的な実施態様のそのようなアミノ酸置換は、得られ たタンパク質がその免疫反応性を保持している限り、本発明の範囲内に包含され る。 本発明のタンパク質は、公知の有機化学ペプチド合成法のいずれか又は組換え ＤＮＡ技術を用いて製造される。 有機化学ペプチド合成法は、必要なアミノ酸を、ホモジニアス相中又はいわゆ る固相を用いて縮合反応により結合することを含む。 上記縮合反応に用いられる最も一般的な方法は：カルボジイミド法、アジド法 、混合酸無水物法及びＴｈｅ Ｐｅｐ ｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，第１〜 ３巻（Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．及びＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｆ．編）１９７９、１９８ ０、１９８１（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）に記載のような活性 化エステルを用いる方法である。 「固相」を用いた本発明の上記ペプチドの適当なフラグメントの製造は、例え ば、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５，２１４９（１９６３）及びＩｎｔ ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３５，１６１−２１４（１９９ ０）に記載されている。製造すべきペプチドのアミノ酸結合は通常、カルボキシ ル末端側から出発する。この方法の場合、反応性基が存在するか又は反応性基が 導入され得る固相を必要とする。これは、例えば、ベンゼン及びジビニルベンゼ ンと反応性クロロメチル基とのコポリマー、又はヒドロキシメチル若しくはアミ ン基により反応性とされた高分子固相であってよい。 特に適した固相は、例えば、Ｗａｎｇ，Ｊ．によりＡｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ． ９５，１３２８（１９７４）に記載のｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂（ ４−ヒドロキシ−メチル−フェノキシ−メチル−コポリスチレン−１％ ジビニルベンゼン樹脂）である。合成後、該ペプチドを温和な条件下にこの固相 から分離し得る。 タンパク質が、またどのタンパク質がＴ細胞媒介作用に係わっているかを決定 するために、ＣＳＦＶ感染標的細胞を以下のように培養した：ミニチュアピッグ （“ＮＩＨ−Ｍｉｎｉｐｉｇ”；ＭＨＣ^d/dハプロタイプ）から、腎臓を取り出 し、滅菌条件下に細片に切り分けた。臓器片をＰＢＳでリンスし、該部片を培養 フラスコにピペット添加した。コラゲナーゼ−分散溶液を加えた培地中で細片を インキュベートした。ＰＢＳで細胞を組織から洗い落とし、ペレット化し、洗浄 してさらに培養した。 形質転換された安定な細胞系を得るために、細胞をＳＶ−４０の「ｌａｒｇｅ Ｔ」抗原（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａ ｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．，１，３２７−３４１，１９８２；Ｆａｎｎｉｎｇ ，Ｅ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１２８９−１２９３，１９９２）の配列を有 するプラスミドで形質転換した。このようにして得られたＭＡＸ細胞をネオマイ シンアナロゴン Ｇ４１８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）と共に培養して選択し、マ イコプラズマ汚染についてテストした(Ｍｙ ｃｏｐｌａｓｍａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎ ｎｈｅｉｍ)。ＭＡＸ細胞をＤＭＥＭ中で培養し、ＣＳＦＶに感染させた。 ウイルス特異的Ｔリンパ球が認識するエピトープについてＣＳＦＶのゲノムを スクリーニングするために、自己由来のＭＡＸ細胞を異なるウイルスタンパク質 を発現するワクチニアウイルス／ＣＳＦＶ組換え体に感染させた。標的細胞の該 組換え体感染の首尾をワクチニアウイルスの細胞変性効果に基づいて定期的に検 査した。さらに、感染したＭＡＸ細胞の免疫細胞化学的実験及びウエスターンブ ロット分析により、ＣＳＦＶタンパク質が発現したことが示された。 免疫感作したミニチュアピッグから得たエフェクター細胞を、ワクチニアウイ ルス組換え体感染放射性標識標的（又は対照としてのワクチニアウイルス野生型 感染標的）と共に、種々のエフェクター：標的比で４時間同時培養した。遠心後 、それぞれ１００μｌの上清を捕集し、γ線計数器でクロムの放出をｃｐｍとし て測定した。特異的溶解（ｌｙｓｉｓ）％を、次式： により計算した。 標的細胞対照については以下のように行った：放射性同位元素の自然放出（自 然ｃｐｍ）を測定するために、エフェクターを加えずに標的細胞をインキュベー トした。標的細胞中の総クロム取り込みを測定した（総ｃｐｍ）。 このようにして、ＣＳＦＶ特異的ＣＴＬを同定した。さらに細胞変性効果に係 わるエピトープの特性決定をするために、一連の重複ペプチドを合成した。該ペ プチドを丸底プレートのウエル中で１時間インキュベートしてマキシ標的細胞上 にロードした。次いで、エフェクター細胞を１００：１のエフェクター：標的細 胞比になるように加えた。プレートを遠心、インキュベートし、上記のようにク ロムの放出を測定して特異的溶解を決定した。 本発明の第２の実施態様により、精製ペスチウイルスＴリンパ球刺激性タンパ ク質、より特定的には、ＣＳＦＶ Ｔ細胞刺激性タンパク質の全て又は実質的部 分、特に免疫学的に活性な部分をコードする核酸配列が提供される。 本発明の核酸配列は、特定のＣＳＦＶ株から分離し、ポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を含む組換えＤＮＡ技術により増幅させるか、 又は当該分野において公知の技術によりｉｎ ｖｉｔｒｏで化学合成し得る。 本発明はさらに、ＣＳＦＶの上記タンパク質をコードする分離・精製された核 酸配列を提供する。そのような核酸配列は、配列番号：１、配列番号：３及び配 列番号：５で示されている。遺伝暗号の縮重により、コドン中の塩基を置換して 、同一のアミノ酸をコードする別のコドンが得られることは当該分野において周 知であり、例えば、アミノ酸のグルタミン酸をコードするコドンはＧＡＴとＧＡ Ａの両方である。従って、配列番号：２で示されているアミノ酸配列を有するタ ンパク質を発現させるための核酸配列が、配列番号：１で示されている核酸配列 とは異なるコドン組成を有し得ることは明らかである。 そのような核酸配列は、本来、結合も連結もしていない種々の複製配列を作動 可能に連結し得、それによって、適切な宿主のトランスフェクションに用い得る いわゆる組換えベクターが得られる。有用な組換えベクターは、好ましくは、プ ラスミド、バクテリオファージ、コスミド又はウイルスから誘導される。 本発明の核酸配列のクローン化に用い得る特定のベクター又はクローニングベ ヒクルは当該分野において公知であり、なかでも、ｐＢＲ３２２、種々のｐＵＣ 、ｐＧＥＭ及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミドのようなプラスミドベクター； バクテリオファージ、例えば、ｌａｍｂｄａｇｔ−Ｗｅｓ、Ｃｈａｒｏｎ ２８ 及びＭ１３由来のファージ；又はＳＶ４０、アデノウイルス若しくはポリオーマ ウイルスのようなウイルスベクターが含まれる（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．Ｌ． 及びＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔ編，Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，１９８８；Ｌｅｎｓｔｒａ，Ｊ．Ａ．ら，Ａｒ ｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．，１１０，１−２４，１９９０も参照されたい）。本発明の 組換えベクターの構築に用いられる方法は当業者には公知であり、とりわけ、Ｍ ａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ,第２版;Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ ｏｒａｔｏｒｙ，１９８９）に記載されている。 例えば、遺伝子と所望のクローニングベヒクルが共に同 一の制限酵素で切断された場合、それによって相補性ＤＮＡ末端が生じるので、 本発明の核酸配列はクローニングベクターに容易に挿入し得る。 あるいは、一本鎖ＤＮＡを適切なＤＮＡポリメラーゼで消化するか、又は該ポ リメラーゼで一本鎖末端を充填し、制限部位を改変して平滑末端化する必要が生 じ得る。次いで、Ｔ４ＤＮＡリガーゼのような酵素を用いて平滑末端を結合し得 る。 所望なら、ＤＮＡ末端にリンカーを結合して任意の制限部位を作ることもでき る。そのようなリンカーは、制限部位配列をコードする特異的オリゴヌクレオチ ド配列を含み得る。制限酵素で開裂されたベクターや核酸配列は単独重合テイリ ングによっても改変し得る。 本明細書に用いられている「形質転換」とは、例えば、直接取り込み又は形質 導入といった用いられる方法には関係なく、異種核酸配列を宿主細胞に導入する ことを指す。異種核酸配列は、自律複製により維持されるか、あるいは、宿主ゲ ノムに組み込まれ得る。所望なら、指定宿主に適合し得る適切な調節配列を組換 えベクターに付与する。これらの配列は、挿入された核酸配列の発現を調節し得 る。微 生物以外に、多細胞微生物から誘導された細胞培養株を宿主として用いてもよい 。 本発明の組換えベクターは、ｐＢＲ３２２におけるアンピシリン及びテトラサ イクリン耐性、ｐＵＣ８におけるアンピシリン耐性及びβ−ガラクトシダーゼの α−ペプチドのような、所望の形質転換体の選択に用い得る１種以上のマーカー 活性を含むのが好ましい。 適当な宿主細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列若しくは該核酸配列を 含む組み換えベクターにより形質転換され得、且つ所望なら、前記核酸配列によ りコードされる前記ポリペプチドの発現に用い得る微生物又は細胞である。宿主 細胞は、原核性起源のもの、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａ ｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ及びシュードモナス種のような細菌；あるいは 酵母のような真核性起源のもの、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ ｖｉｓｉａｅ又はＨｅＬａ細胞及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞 を含む、昆虫、植物若しくは哺乳動物細胞のようなより高等な真核性細胞であっ てよい。昆虫細胞には、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａのＳｆ９ 細胞系（Ｌｕｃｋｏｗら，Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６，４７−５５，１９８８）が含まれる。真核性クローニ ング系における本発明の核酸配列のクローニング及び発現に関する情報は、Ｅｓ ｓｅｒ，Ｋ．ら（Ｐｌａｓｍｉｄｓ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｓｐｒｉｎｇ ｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，１９８６）に見ることができる。 宿主微生物として、挿入されたペスチウイルス配列を発現し得る他のウイルス を用いてもよい。そのようなウイルスは一般にベクターウイルスと称されている 。 一般に、本発明に有用な組換えベクターの構築には原核細胞が好ましい。Ｅ． ｃｏｌｉ Ｋ１２株、特にＤＨ５ａ又はＭＣ１０６１株はとりわけ有用である。 発現には、本発明の核酸配列を発現ベクターに導入する。即ち、前記配列を発 現調節配列に作動可能に結合する。そのような調節配列は、プロモーター、エン ハンサー、オペレーター、インジューサー、リボソーム結合部位などを含み得る 。従って本発明は、発現調節配列に作動可能に結合した上記ＣＳＦＶタンパク質 をコードする核酸配列を含む組み換えベクターを提供し、該ベクターは、形質転 換された宿主細胞又は微生物中で該ベクターに含まれるＤＮＡ配 列を発現し得る。 形質転換された宿主がＣＳＦＶタンパク質抗原の少なくとも１個以上の免疫原 性決定基を有するポリペプチドを産生する限り、クローニングベクターの選択さ れた部位に挿入されたヌクレオチド配列が所望のポリペプチドの実際の構造遺伝 子の一部ではないヌクレオチドを含むか、又は、所望タンパク質の完全な構造遺 伝子のフラグメントのみを含み得ることは当然であると理解されたい。 宿主細胞が細菌の場合、使用し得る有用な発現調節配列には、Ｔｒｐプロモー ター及びオペレーター（Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ８，４０５７，１９８０）；ｌａｃプロモーター及びオペレーター（Ｃｈａｎｇ ら，Ｎａｔｕｒｅ，２７５，６１５，１９７８）；外膜タンパク質プロモーター （Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．及びＩｎｏｕｇｅ，Ｍ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１，７７ １−７７５，１９８２）；バクテリオファージλプロモーター及びオペレーター （Ｒｅｍａｕｔ，Ｅ．ら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１１，４６７７− ４６８８，１９８３）；α−アミラーゼ（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）プロモーター 及びオペレーター、終結配列、並びに選択された宿主細胞に 適合する他の発現促進及び調節配列が含まれる。宿主細胞が酵母の場合、有用な 発現調節配列の例としては、例えば、α−接合因子が含まれる。昆虫細胞の場合 、バキュロウイルスの多面体（ｐｏｌｙｈｅｄｒｉｎ）又はｐ１０プロモーター (Ｓｍｉｔｈ，Ｇ．Ｅ．ら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ３，２１５６−６ ５，１９８３)を用い得る。宿主細胞が哺乳動物由来のものである場合、有用な 発現調節配列の例としては、ＳＶ−４０プロモーター（Ｂｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｗ． ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２２，５２４−５２７，１９８３）又はメタロチオネイ ンプロモーター（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，Ｒ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２９６，３９− ４２，１９８２）又は熱ショックプロモーター（Ｖｏｅｌｌｍｙら，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４９４９−５３，１９８５）が含 まれる。あるいは、ＣＳＦＶ中に存在する発現調節配列を用いてもよい。遺伝子 発現を最大にするためには、Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＬａｕｅｒ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，６８，４７３，１９７９）も参照されたい。 従って、本発明はさらに、上記核酸配列又は組換え核酸分子若しくは組換えベ クターを有し、該核酸配列の発現に よりペスチウイルスタンパク質を産生し得る宿主細胞又は微生物をも包含する。 ペスチウイルス感染に対する動物の免疫感作、特にＣＳＦＶに対するブタの免 疫感作は、いわゆるサブユニットワクチンとして免疫学的に関連する一般的技術 で本発明のポリペプチドを動物に投与することにより実施し得る。本発明のサブ ユニットワクチンは、場合によって医薬上許容し得る担体の存在下に、純粋形態 のポリペプチドを含み得る。該ポリペプチドは、場合によって、非関連タンパク 質と共有結合し得るが、これは、融合産物の精製に有利であり得る。例としては 、β−ガラクトシダーゼ、プロテインＡ、プロキモシン、血液凝固因子Ｘａなど がある。 これらのポリペプチド自体を用いても保護免疫産生能が低い場合がある。それ らの免疫原性を高めるためには、小さいフラグメントを担体分子に結合するのが 好ましい。これに適した担体は、高分子、例えば、天然ポリマー（ＫＬＨ、アル ブミン、毒素のようなタンパク質）、ポリアミノ酸のような合成ポリマー（ポリ リシン、ポリアラニン）又はサポニン及びパルミチン酸のような両親媒性化合物 のミセルである。あるいは、これらのフラグメントを、そのポ リマー、好ましくは線状ポリマーとして供給してもよい。 必要なら、ワクチンに用いられる本発明タンパク質を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又は ｉｎ ｖｉｖｏで、例えば、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化又はリン 酸化して修飾してもよい。 ワクチンが抗原提示細胞（ＡＰＣ）によってＭＨＣ分子中に提示されたポリペ プチドを含む場合、免疫系はさらに効率的に誘発される。抗原は、本発明のペプ チドの１種がロードされた単球、マクロファージ、組合わせ細胞、ランゲルハン ス細胞及び特に樹状細胞を用いて提示され得る。ＡＰＣのローディングは、本発 明ポリペプチドをＡＰＣ中か又はその近隣に導入することにより達成し得るが、 完全抗原をＡＰＣにプロセスさせる方がより好ましい。このようにして、ｉｎ ｖｉｖｏ状況を最も本物そっくりに模倣する提示が行われる。さらに、細胞が用 いるＭＨＣは、エピトープの提示に適したタイプのものである。 エピトープの提示にＡＰＣを用いることの総体的な利点は、これに関連して用 いられるＡＰＣ細胞を自由に選択できることにある。種々のタイプのＡＰＣから 、刺激性ＡＰＣ及び阻害性ＡＰＣが存在することがわかる。 好ましいのは、いわゆる「プロフェッショナル」抗原提示細胞である記載細胞 型であり、それらは、抗原提示プロセスにおいて重要な機能を有する共刺激性分 子を有することを特徴としている。そのような共刺激性分子は、例えば、Ｂ７、 ＣＴＬＡ−４、ＣＤ７０又は熱安定性抗原である。 抗原提示細胞として作用し得ることも示された線維芽細胞は、これらの共刺激 性分子を有していない。 本発明のポリペプチドに関する情報を有するクローニングベヒクルで既にトラ ンスフェクトされ、ＭＨＣ分子のヌクレオチド配列を含むクローニングベヒクル で同時トランスフェクションされた細胞を用いることも可能である。これらの細 胞は、抗原提示細胞として作用し、ＭＨＣ分子にペスチウイルスエピトープを提 示し、該分子の表面上で発現する。この提示は、該細胞が上記共刺激性分子の１ つ又は同様な機能を有する分子をも発現し得る場合に促進されると考えられる。 この発現は、そのような共刺激性分子をコードする配列情報を有する第３のクロ ーニングベヒクルで該細胞を形質転換又はトランスフェクトした結果であり得る が、該細胞が既に共刺激性分子を産生し得たということでもあり得る。 所望の発現産物の外にも、発現され、且つ該細胞の所望の免疫原性反応に悪影 響を与え得る多くの成分をも有するこれらの細胞を含むワクチンの代わりに、ペ プチドをロードしたＭＨＣ分子を露出するリポソームで、例えばリンホカインで 充填されたリポソームをワクチンに組込むことも可能である。そのようなリポソ ームは免疫Ｔ細胞反応を誘発させる。 ペプチドをｉｎ ｖｉｖｏでも提示されるのと同様に提示することにより、Ｔ 細胞応答が促進される。さらに、比較的大きな抗原提示細胞の天然アジュバント 作用により、Ｂ細胞応答も誘発される。このＢ細胞応答により、とりわけ、ペプ チド−ＭＨＣ複合体に対する抗体が形成される。本発明のペプチドを既に提示し ているＡＰＣの予防接種によって増大するのはこの自然発生現象である。増大す ることにより、Ｔ細胞応答が誘発されるだけでなく、ＭＨＣ−ペプチド複合体に 対する抗体を産生させるＢ細胞応答も開始される。 サブユニットワクチンに替わるものは生ワクチンである。組換えＤＮＡ技術に より、本発明の核酸配列を組換え宿主が複製し得るように宿主細胞又は微生物（ 例えば、細菌又 はウイルス）中に導入し、それによって、挿入された核酸配列がコードするポリ ペプチドを発現させ、感染した宿主ブタに免疫応答を誘発させる。 本発明の好ましい実施態様は、上記異種核酸配列を含み、組換えベクターウイ ルスに感染した宿主細胞又は宿主ブタ中でＤＮＡ配列を発現し得る組換えベクタ ーウイルスである。「異種」という用語は、本発明の核酸配列が通常はベクター ウイルス中には本質的に存在しないことを示す。 さらに、本発明は、核酸配列の発現によりＣＳＦＶタンパク質を産生し得る、 組換えベクターウイルスに感染した宿主細胞又は培養細胞をも包含する。 例えば、周知のｉｎ ｖｉｖｏ相同組換え技術を用いて、本発明の異種核酸配 列をベクターウイルスのゲノムに導入し得る。 第１段階として、ベクターゲノムの挿入領域、即ち、感染又は複製に必要とさ れるようなベクターの主要機能を損うことなく、異種配列の組込みに用い得る領 域に対応するＤＮＡフラグメントを標準ｒｅｃＤＮＡ技術に従ってクローニング ベクターに挿入する。挿入領域は、多数の微生物について記載されている（例え ば、ＥＰ８０，８０６号、 ＥＰ１１０，３８５号、ＥＰ８３，２８６号、ＥＰ３１４，５６９号、ＷＯ８８ ／０２０２２号、ＷＯ８８／０７０８８号、ＵＳ４，７６９，３３０号及びＵＳ ４，７２２，８４８号）。 第２段階として、所望なら、第１段階で得られた組換えベクター分子中に存在 する挿入領域に欠失を導入し得る。これは、例えば、第１段階からの組換えベク ター分子を適切なエキソヌクレアーゼIIIで消化するか又は制限酵素で処理する ことにより実施し得る。 第３段階として、異種核酸配列を、第１段階の組換えベクター中に存在する挿 入領域又は前記組換えベクターから欠失したＤＮＡの代わりに挿入する。挿入領 域のＤＮＡ配列は、ベクターのゲノムとの相同組換えを発生させるのに適した長 さのものでなければならない。その後で、適当な細胞を、野生型ベクターウイル スに感染させるか、又は適切なベクターＤＮＡ配列に隣接する挿入部を含む組み 換えベクターの存在下にベクターのゲノムＤＮＡで形質転換し、それによって、 組換えベクターとベクターゲノムの対応領域間で組み換えが発生する。組換えベ クターの後代は、細胞培養株中で産生され得、例えばハイブリダイゼーション により、異種核酸配列と共に共組込みした遺伝子がコードする酵素活性を検出す るか、又は組換えベクターにより免疫学的に発現された抗原性異種ポリペプチド を検出して遺伝子型又は表現型を選択し得る。 次に、免疫感作のために、これらの組換え微生物をブタに投与し、その後で、 ある期間そのまま維持するか、又は接種した動物体中でさらに複製して、挿入さ れた本発明核酸配列によりコードされるポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで発現さ せ、接種した動物の免疫系を刺激し得る。本発明の核酸配列の組込みに適したベ クターは、種痘ウイルスのようなウイルス、例えば、ワクチニアウイルス（ＥＰ １１０，３８５号、ＥＰ８３，２８６号、ＵＳ４，７６９，３３０号及びＵＳ４ ，７２２，８４８号）、オーエスキーウイルスのようなヘルペスウイルス（ｖａ ｎ Ｚｉｊｌ，Ｍ．ら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ． ６２（６），２１９１−２１９５，１ ９８８）、ブタＲＳウイルス、アデノウイルス若しくはインフルエンザウイルス 、又は細菌、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｕｉｓ、 Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ若しくは特 定のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ種から誘導し得る。こ の種の組換え微生物により、宿主動物中で合成されたポリペプチドが表面抗原と して提示され得る。この関係から、ポリペプチドとＯＭＰタンパク質又は、例え ば、Ｅ．ｃｏｌｉの線毛タンパク質との融合、あるいは微生物によって認識され るシグナル及びアンカー配列の合成が考えられる。所望なら、大きな完全体の一 部としてペスチウイルスのポリペプチドを免疫感作すべき動物内に放出すること も可能である。これらのいずれの場合においても、１種以上の免疫原性産物が発 現し、それによって種々の病原体及び／又は所定病原体の種々の抗原に対する保 護を得ることが可能である。 本発明のベクターワクチンは、組換え細菌又は本発明の核酸配列を含む組み換 えベクターに感染した宿主細胞を培養することにより製造し得、その後で、細胞 及び／又は細胞中で増殖した組換えベクターウイルスを含む組み換え細菌又はベ クターを、場合によって純粋な形態で捕集し、場合によって凍結乾燥形態でワク チンを形成し得る。 本発明の組換えベクターで形質転換した宿主細胞を前記核酸配列によりコード されるポリペプチドの発現に好ましい条件下に培養することもできる。ワクチン は、粗培養物、 宿主細胞溶解物又は宿主細胞抽出物からなる試料を用いて製造し得るが、別の実 施態様においては、その用途に応じて本発明のより精製されたポリペプチドから ワクチンを形成する。産生されたポリペプチドの精製には、本発明の組換えベク ターで形質転換した宿主細胞を適当量培養し、産生されたポリペプチドを、該細 胞から単離するか、又はタンパク質が排出される場合には培地から単離する。培 地中に排出されたポリペプチドは、標準技術、例えば、塩分画法、遠心分離、限 外濾過、クロマトグラフィー、ゲル濾過又はイムノアフィニティークロマトグラ フィーにより分離・精製し得るが、細胞内ポリペプチドは、先ず前記細胞を捕集 し、該細胞を、例えば、超音波処理又はフレンチプレスのような他の機械的破砕 手段により分離し、次いで他の細胞内成分からポリペプチドを分離することによ り該ポリペプチドからワクチンを形成し得る。細胞は、化学的（例えば、ＥＤＴ Ａ若しくはＴｒｉｔｏｎ Ｘ１１４のような界面活性剤）手段又はリゾチーム消 化のような酵素的手段によっても分離し得る。 「裸の」ＤＮＡ、即ち、調節配列を含まない上記定義の核酸を動物に予防接種 することも可能である。次いで、こ のＤＮＡを予防接種した動物のゲノムに組込んで本発明のポリペプチドを発現さ せる。 本発明ワクチンは、予防接種後のＴ細胞及びＢ細胞応答の開始及び維持に対し て促進効果を有する多くの化合物を加えて強化することができる。 このように、ワクチンにサイトカインを加えることによりＴ細胞応答が促進さ れる。適当なサイトカインは、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７又はＩＬ −１２のようなインターロイキン、ＧＭ−ＣＳＦ、ＲＡＮＴＥＳ、腫瘍壊死因子 、及びＩＦＮγのようなインターフェロンである。 本発明のポリペプチドに対する抗体又は抗血清は、受動免疫療法、診断用イム ノアッセイ及び抗イディオタイプ抗体の産生に用い得る。 本発明のワクチンは、慣用の能動免疫感作方式で、即ち、投与製剤に適合し得 るような一回又は繰り返し投与、及び予防上有効な量、即ち、ウイルスＣＳＦＶ によるチャレンジに対してブタに免疫を誘発させる前記抗原を発現させ得る免疫 感作抗原又は組換え微生物量で投与し得る。該ワクチンを慣用の（Ｂリンパ球に 対する）予防接種に加えて投与して、そのような予防接種によってもたらされる 免疫を 増強させることも可能である。免疫とは、予防接種しないグループに比べて、予 防接種した後の動物集団における高レベルの保護の誘発と定義される。 生ウイルスベクターワクチンの場合、動物１匹当たりの用量率は、１０³〜１ ０⁸ｐｆｕの範囲であってよい。本発明の典型的なサブユニットワクチンは、１ μｇ〜１ｍｇの本発明タンパク質を含んでいる。該ワクチンは、経皮、皮下、筋 肉内、腹腔内、静脈内、経口又は経鼻投与し得る。 さらに、該ワクチンは、活性及び／又は貯蔵寿命を増大させるためにしばしば 他の成分と混合した水性媒体又は水含有懸濁液を含んでいてもよい。これらの成 分は、塩、ｐＨ緩衝剤、安定剤（例えば、スキムミルク又はカゼイン水解物）、 乳化剤、免疫応答を増強するアジュバント（例えば、オイル、ムラミル二ペプチ ド、水酸化アルミニウム、サポニン、ポリアニオン及び両親媒性物質）並びに保 存剤であってよい。 本発明のワクチンが、ブタの他の病原体に関連する免疫原又はＡｃｔｉｎｏｂ ａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、仮性狂犬病ウイルス、ブ タインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ ｃｃｕｓ ｓｕｉｓ、伝播性胃腸炎ウイルス、ロタウイルス、Ｅｓｃｈｅｒｉｃ ｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ 、Ｐａｓｔｅｒｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ及びＢｏｒｄｅｔｅｌｌａｂ ｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａの抗原に類似したこれらの免疫原をコードする核酸 配列を含み得ることは明らかである。 本発明はさらに、本発明タンパク質を含む「免疫化学試薬」にも関する。「免 疫化学試薬」という用語は、本発明のタンパク質が、適当な担体に結合している か、又は標識物質を含んでいることを意味する。 使用し得る担体は、例えば、マイクロテストウエル若しくはキュベットの内壁 、管若しくは毛管、膜、フィルター、テストストリップ、又は、例えば、ラテッ クス粒子、赤血球、染料ゾル、金属ゾル、若しくはゾル粒子としての金属化合物 のような粒子の表面である。 使用し得る標識物質は、とりわけ、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、染料 ゾル、金属ゾル又はゾル粒子としての金属化合物である。 本発明の核酸配列は、任意の種類の組織中でペスチウイ ルス関連核酸を検出するためのハイブリダイゼーション実験用の特殊プローブの 設計にも用い得る。 本発明はさらに、ペスチウイルス、特にＣＳＦＶ感染症の診断に有用な前記核 酸配列を含むテストキットをも包含する。 さらに本発明は、イムノアッセイに用いられるテストキットにも関し、該テス トキットは、少なくとも１種の本発明免疫化学試薬を含んでいる。該テストキッ トを用いて生起する免疫化学反応は、サンドイッチ反応、凝集反応、競合反応又 は阻害反応であるのが好ましい。 サンドイッチ反応を実施するためのテストキットは、例えば、マイクロテスト ウエルの内壁のような固体担体に結合した本発明ポリペプチドと、本発明の標識 ポリペプチド又は標識抗抗体のいずれかとから構成し得る。 本発明を以下の実施例により説明する。 実施例実施例１ ：ＣＳＦＶ特異的細胞毒性Ｔリンパ球の同定 ２・１０⁷ＴＣＩＤ₅₀ ＣＳＦＶ株Ａｌｆｏｒｔで繰り返しチャレンジし、ＣＳ ＦＶ株Ｂｒｅｓｃｉａ感染ブタか ら得た血清（１・１０⁵ＴＣＩＤ₅₀）３ｍｌで経鼻的に最終チャレンジした後で 、ＣＳＦＶ株Ｒｉｅｍｓ（４・１０⁵ＴＣＩＤ₅₀筋肉内）で免疫感作したＭＨＣ^{d /d} ハプロタイプの同系交配ミニチュアピッグから末梢血白血球を分離した。細胞 を９６ウエルの丸底マイクロタイタープレートに、ＲＰＭＩ培地（１０％ＦＣＳ ）中１マイクロ培養当たり１〜２・１０⁵細胞の濃度で接種し、同時に感染性ウ イルス（５・１０⁵ＴＣＩＤ₅₀／ｍｌ ＣＳＦＶ−Ａｌｆｏｒｔ）で３〜５日間 再刺激した。 以下の方法で感染標的細胞を培養した：ミニチュアピッグ（“ＮＩＨ−Ｍｉｎ ｉｐｉｇ”；ＭＨＣ^d/dハプロタイプ）から腎臓を取り出し、滅菌条件下に細片 に切り分けた。臓器片をＰＢＳでリンスし、３０〜１００個の細片を培養フラス コ（２５ｃｍ²）中にピペット添加した。該細片を、コラゲナーゼ分散溶液（培 地中１：６に希釈した２．５ｍｇ／ｍｌのストック溶液）を添加した培地（１０ ％ＦＣＳ）中でインキュベートした。細胞を組織からＰＢＳで洗い流し、ペレッ ト化（６分、７５０ｇ）し、ＰＢＳ中で２回洗浄した。細胞を培養フラスコ（２ ５及び７５ｃｍ²）中のＤＭＥＭ（１０％ ＦＣＳ）中で培養した。 安定な形質転換細胞系の標的細胞を得るために、腎細胞を、ＳＶ−４０の「ｌ ａｒｇｅ Ｔ」抗原（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｐ．及びＢｅｒｇ，Ｐ．，Ｊ．Ｍｏｌ ｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．，１，３２７−３４１、１９８２；Ｆａｎ ｎｉｎｇ，Ｅ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６，１２８９−１２９３，１９９２）の 配列を有するプラスミドで形質転換した。このために、精製されたＳＶ−４０プ ラスミドｐＳＶ−３ネオ（Ｄｒ．Ｔ．Ｃ．Ｍｅｔｔｅｎｌｅｉｔｅ ェクチンとを、１：４のＤＮＡ−リポフェクチン比で混合し、室温で１５分間イ ンキュベートした。集密度の大きい（８０％）腎細胞培養体から培地を除去し、 ２ｍｌのＯｐｔｉＭＥＭ−Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｉｂｃｏ）を加えた。次いで、リポ フェクチン／ＤＮＡ懸濁液を滴下し、最初に培養株を３７℃で１２時間インキュ ベートし、次いで、培地を、１０％ ＦＣＳ（ウシ胎児血清）を含むクローニン グ培地〔２：１：１比のＤＭＥＭ：Ｆ１０（Ｇｉｂｃｏ）：Ｆ１２（Ｇｉｂｃｏ ）〕に取り換え、３７℃で培養した。このようにして得られたＭＡＸ細胞を、ネ オマイシン アナロゴン Ｇ４１８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）と共に培養して選択 し、マイコプラズマ汚染についてテストした（マイコプラズマ検出キット、Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）。 １・１０⁶標的細胞をＣＳＦＶ−Ａｌｆｏｒｔに０．５の感染多重度（ｍ．ｏ ．ｉ．）で感染させた。感染後４８時間して細胞をトリプシン処理し、２００μ ｌのＣＴＬアッセイ培地〔ＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ），３％ ＦＣＳ〕中 に捕集した。標的細胞を１００μＣｉのＮａ₂ ⁵¹ＣｒＯ₄で９０分間標識し、３回 洗浄、 １・１０⁴細胞／ｍｌの最終濃度でＣＴＬアッセイ培地に再懸濁した。 エフェクター細胞を、種々のエフェクター：標的比を得るように希釈し、１０ ０μｌ容量の三重ウエルに加えた。エフェクター細胞に１・１０³／ウエルの標 的細胞を加えた。プレートを１００×ｇで５分間遠心し、３７℃で４時間インキ ュベートした。６００×ｇで１０分間遠心した後、それぞれ１００μｌの上消を 捕集し、γ線計数器でクロムの放出をｃｐｍとして測定した。特異的溶解（ｓｐ ｅｃｉｆｉｃ ｌｙｓｉｓ）％を次式により計算した： 以下の方法での標的細胞対照が含まれる：放射性同位元素の自然放出（自然ｃ ｐｍ）を測定するために、エフェクターを加えずに標的細胞をインキュベートし た。さらに、標的細胞中の総クロム取り込みを測定した（総ｃｐｍ）。 結果 細胞毒性Ｔリンパ球によるＣＳＦＶ感染標的細胞の溶解は、対照グループより 高かった（図１）。比較的低いエフェクター：標的細胞比（１２：１）で３０％ を超える高い特異的溶解が達成されたが、これは、高率のＣＳＦＶ特異的細胞毒 性Ｔリンパ球を示している。実施例２ ：切頭型タンパク質を発現する標的細胞の細胞毒性Ｔリンパ球媒介溶解 １・１０⁶ＭＡＸ細胞（実施例１に記載のようにして得た）を、種々のワクチ ニアウイルス／ＣＳＦＶ組み換え体に、２．０の感染多重度で１６時間感染させ た。図２は、ＣＳＦＶのタンパク質の相対位置及び得られたワクチニアウイルス ／ＣＳＦＶ組換え体の同定を示している。 中位の細胞変性効果を示した細胞をトリプシン処理し、２００μｌのＣＴＬア ッセイ培地中に捕集した。アッセイ に使用する前に、標的細胞を１００μＣｉのＮａ₂ ⁵¹ＣｒＯ₄で９０分間標識し、 ３回洗浄して、１・１０⁴細胞／ｍｌの濃度でＣＴＬアッセイ培地に再懸濁した 。 実施例１に記載したのと同じ方法でアッセイを実施した。 結果 クロム放出アッセイの結果は、ＣＳＦＶ特異的ＣＴＬが、ワクチニアウイルス ／ｐ１２５Ｓ組換え体に感染した標的細胞のみを認識することを示した。驚くべ きことには、ウイルス構造タンパク質を発現する標的細胞も自己プロテアーゼを 発現する細胞も特異的細胞毒性Ｔリンパ球によって溶解されなかった（図３）。 ワクチニアウイルス／ｐ１２５Ｓ組換え体により産生されたペプチド産物から 見ると、８０ｋＤのサブユニット又はｐ１０タンパク質が該認識に係わっている ようである（図４、中上のグラフ）。この領域を狭くすると、ワクチニアウイル ス／ＣＳＦＶ組換え体ｐ８０／ＶＺは依然として特異的溶解を示すのに対して、 ｐ８０／ＶＡ及びｐ８０／ＶＸには効果がないようである。これは、Ｔ細胞特異 的エピトープがｐ１２５とｐ１０の間の切断部位近くに存在することを意味して いる（図２参照；ヌクレオチド位置は、 Ｍｅｙｅｒｓら，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７１，５５５−５６７，１９８９により 示されたＣＳＦＶ Ａｌｆｏｒｔの配列による）。エピトープが存在する領域と して同定された領域（該領域は、組換え体ｐ８０／ＶＺには依然として存在する が、ｐ８０／ＶＡ及びｐ８０／ＶＸには存在しない）は、アミノ酸位置２２２３ 〜２２８５〔ＣＳＦＶ Ａｌｆｏｒｔ（Ｍｅｙｅｒｓら，前掲）の配列による、 即ち、配列番号：２のアミノ酸位置１０９３〜１１５５〕に存在する。ＢＶＤＶ 株ｃｐ７のｐ１０のＮ末端タンパク質配列決定により得られたデータから、ＣＳ ＦＶ−Ａｌｆｏｒｔのｐ１２５とｐ１０の間の切断部位がＣＳＦＶ−Ａｌｆｏｒ ｔのアミノ酸位置２２７２と２２７３の間、即ち、配列番号：１のヌクレオチド 位置３４２６と３４２７の間に位置していることが明らかである。実施例３ ：ＣＳＦＶ特異的ＣＴＬにより認識されるＴ細胞エピトープの同定 ウイルス特異的ＣＴＬにより認識されるエピトープを同定するために、配列番 号：２の１０９３〜１１５５位置のアミノ酸領域をカバーするそれぞれ８及び１ ２個のアミノ 酸がオーバーラップするノナペプチド及びペンタデカペプチドを合成した。 １・１０⁶標的細胞を１００μＣｉのＮａ₂ ⁵¹ＣｒＯ₄で９０分間標識し、３回 洗浄して、 ２・１０⁴細胞／ｍｌの最終濃度でＣＴＬアッセイ培地に再懸濁した 。９６ウエル丸底プレートの３重ウエルに５０μｌの標的細胞懸濁液を加えた。 １００μｌのペプチド溶液（ＤＭＳＯ中５ｍｇ／ｍｌのストック溶液;ＲＰＭＩ 培地に１：４０００〜１：５０００希釈して、約５０〜１２５ｎｇ／１０³標的 細胞を得た）と共に１時間インキュベートして、標的細胞にペプチドをロードし た。５０μｌ容量の各ウエルに１・１０⁵エフェクター細胞を加えて、エフェク ター：標的細胞比を１００：１とした。 実施例１及び２に類似の方法でクロム放出アッセイを行った。 結果 異なるペプチドをロードした標的細胞の特異的溶解を図５及び図６に示す。図 ５では、ノナペプチド Ｅ−Ｎ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｆが最大パーセンテ ージの特異的溶解を生起するのに対し、図６では、ペンタデカペプチドＳ −Ｔ−Ａ−Ｅ−Ｎ−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｖ−Ａ−Ｌ−Ｆ−Ｇ−Ｙ−Ｖにより、他のペン タデカペプチドと共にインキュベートした標的細胞に比べて著しく高い標的細胞 溶解が得られたことが示されている。このペンタデカペプチドは、図５で既に同 定されたノナペプチドの配列を含んでいる。しかし、ノナペプチドをロードした ＣＴＬ溶解標的細胞は、ペンタデカマーをロードした標的細胞より効率的であり 、これは、ノナペプチドがブタＭＨＣ−Ｉ分子に対してペンタデカペプチドより 高い親和力を有していることを示唆している。 実施例４：ＣＳＦＶ特異的ＣＴＬの交差反応性 異なるＣＳＦＶ株を感染多重度０．５で４８時間感染させる（実施例１に従っ て実施）か又はワクチニアウイルス組換え体に感染多重度２．０で１６時間感染 させた（実施例２に従って実施）標的細胞を用い、ＣＳＦＶ特異的ＣＴＬの交差 反応性に関する実験を行った。ワクチニアウイル （Ｖａｃ−ｐ１２５Ｓ）の非構造タンパク質ｐ１２５、ｐ１０及びｐ３０のＮ末 端部分、又はＢＶＤＶ株ｃｐ７（Ｖ ａｃ−ｐ１２０Ｓ）の対応タンパク質をコードする配列を含んでいた。ＣＳＦＶ 免疫感作エフェクター細胞のＣＴＬ活性を、標的として感染ＭＡＸ細胞を用いる クロム放出アッセイで測定した。 対照として、非感染標的及びワクチニアウイルス野生型（Ｖａｃ−ＷＲ）感染 標的を用いた。 結果 ＣＳＦＶ株を用いた実験とワクチニアウイルス組換え体を用いた実験の両方の 結果を表Ｉに示す。これらの結果から、ＣＳＦＶ特異的ＣＴＬが異なるＣＳＦＶ 株に感染させた標的細胞を溶解し得たことがわかる。さらに、ＣＳＦＶ特異的Ｃ ＴＬがＢＶＤＶ株の非構造タンパク質を発現する標的細胞を溶解し得たことも示 され、それによって、これらの非構造タンパク質がペスチウイルスに保存され得 るＴ細胞特異的エピトープを有していることが示唆される。 図面の説明 図１ ： 細胞毒性Ｔ細胞による標的細胞のＣＳＦＶ特異的溶解を示すクロム放出アッセイ の結果。○は非感染対照標的細胞、●はＣＳＦＶ感染標的細胞を示す。特異的溶 解％はＹ軸に示され、Ｘ軸はエフェクター：標的細胞比を示す。図２ ： 自己標的細胞の感染に用いたワクチニアウイルス／ＣＳＦ Ｖ組換え体。ＣＳＦＶポリタンパク質並びにそれらのプロセシング産物上のＮ末 端自己プロテアーゼ（Ｎ^pro）の相対位置、構造タンパク質のコア（Ｃ）、Ｅ０ ，Ｅ１、Ｅ２及び非構造タンパク質ｐ１２５、ｐ３０及びｐ１３３が示されてい る。さらに、ワクチニアウイルス／ＣＳＦＶ組換え体として発現されたウイルス タンパク質及び切頭型（ｔｒａｎｃａｔｅｄ）ｐ１２５タンパク質が示されてい る。示されているアミノ酸の位置はＣＳＦＶ−Ａｌｆｏｒｔの配列による。図３ ： 異なるワクチニアウイルス／ＣＳＦＶ組換え体に感染した標的細胞のＣＴＬ媒介 溶解。ＭＡＸ細胞にワクチニアウイルス野生型（Ｖａｃｃ−ＷＲ、○）及びワク チニアウイルス／ＣＳＦＶ組換え体Ｖａｃｃ−Ｎ^proＣ（□）、Ｖａｃｃ−Ｅ０ １２（■）又はＶａｃｃ−ｐ１２５Ｓ（●）を感染させ、ＣＳＦＶ特異的ＣＴＬ に対するクロム放出アッセイにおける標的細胞として用いた。軸は図１に同じ。図４ ： 切頭型非構造タンパク質を発現する標的細胞のＣＴＬ媒介溶解。データの表示 は図３と同様。図５ ： ＣＳＦＶ特異的ＣＴＬによるペプチド標的細胞の溶解。放射性標識したＭＡＸ 細胞を異なるノナペプチドと共にインキュベートした。バーは、１００：１のエ フェクター：標的細胞による特異的溶解％を示す。対照：ＣＳＦＶ感染標的細胞 と非感染標的細胞の特異的溶解。図６ ： ペンタデカペプチドをロードした標的細胞の溶解。説明は図５と同様。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．古典的豚熱病（ＣＳＦ）ウイルスポリペプチドｐ１０又はその免疫原性的に 活性な部分と共に医薬上許容し得る担体を含むことを特徴とする、ＣＳＦに対し てブタを保護するためのワクチン。 ２．ｐ１０ポリペプチドが配列番号２で示されるアミノ酸配列を有することを特 徴とする、請求項１に記載のワクチン。 ３．請求項１又は２に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を有する組換 え微生物と共に医薬上許容し得る担体を含むことを特徴とする、ＣＳＦに対して ブタを保護するためのワクチン。 ４．組換え微生物が、組換えベクターウイルス、好ましくは組換え仮性狂犬病ウ イルスであることを特徴とする、請求項３に記載のワクチン。