JPH06501845A

JPH06501845A - バキュロウイルス―昆虫細胞発現システムを用いたヒトｃｍｖ糖タンパク質―ｈの発現

Info

Publication number: JPH06501845A
Application number: JP3515610A
Authority: JP
Inventors: パチル，キャロル　エイ．; スペイト，リチャード　アール．
Original assignee: カイロン　コーポレイション
Priority date: 1990-08-02
Filing date: 1991-07-29
Publication date: 1994-03-03
Also published as: WO1992002628A1; PT98566A; EP0541721A4; EP0541721A1; IE912745A1; CA2088599A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】バキュロウィルス−システムを　いたヒトＣＭＶ　タンパク　−Ｈの産朋コど１景技１シＦ野本発明は、概して、ワクチンおよび診断学に関する。より詳しくは、本発明は、組換えヒトＣＭＶ糖タンパク質を生産する方法に関し、特に、有用な量の糖タンパク質−Ｈ（ｇＨ）を発現するバキニロウイルスー昆虫細胞発現システムの使用に関する。

隆１１皿二且里ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）は、人類全体に渡って遍在する物質である。感染は一般に無症候性であるが、免疫無防備状態の個体（移植受容者およびＡ　Ｉ　Ｄ　Ｓ　、１．者）および先天的に感染した新生児においては、深刻な疾患の医学的症状が現れ得る。

ヒトＣＭＶ株はワクチン中でテストされてきたが、実験的な生存する弱毒化されたウィルスワクチンの使用には、反対、　意見が多い。ＣＭＶの生物学の完全な理解が得られていない中で、ワクチンへの最も合理的なアプローチは、ウィルスの表面糖タンパク貫ベースのサブユニットワクチンを開発することであろう。これには、中和抗体を誘起する組換えウイルス性糖タンパク質を用いる。残念ながら、この問題に対するほとんどの組換えアプローチによっては、ワクチンに使用するための大量の糖タンパク質は提供されなかった。

ＣＭＶは、多くの糖タンパク質を特定する（Ｓｔｉｎｓｋｉ、　Ｍ、の（１９７６）　Ｊ　Ｖｉａ虹１９：９２４−９３２：　Ｐｅｒｅｉｒａ、Ｌ、、らの（１９８２）　Ｉｎｆｅａｔ　Ｉｍｍｕｎ　３６：９２４−９３２）。これらの特徴付けをするために、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を用いた、ＣＭｖ感染細胞および精製されたピリオンの研究が行われてきた（Ｐｅｒｅｉｒａ、　Ｌ、らの（１９８４）　ｈ皿旦…ｕｉニア３−８６；　Ｂｒ１ｔｔ、　Ｗ、Ｊ、ノ（１９８４）　肛ユ旦■１３５：３６９−３７８：　Ｎｏｖａｋ、　Ｂ、らの（１９８４）■工ｕ立ｕ１３２：３２５−３３８；　Ｌａｗ、Ｋ、Ｍ、らの（１９８５）　Ｊ　Ｍｅｄ　Ｖｉｒｏ１１７：２５５−２６６；　Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ、　Ｌ、らの（１９ｇ４）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　ＳｃＬ旦ＳＡ　８１：８７６−８８０；ならびにＢｒ１ｔｔおよびＡｕｇｅｒの（１９８６）　Ｊ　Ｖｉ二５８：１８５−１９１）。

ヒトＣＭＶに関連付られてきたポリペプチドの中には、８６ｋＤＭタンパク質（ｇＨ）がある。これは、ＣＭＶ感染細胞およびピリオン中で同定されており、そしてモルモット中で、補体に依存しない中和抗体を誘導することが判明している（　Ｒａｓｍｕｓｓｅｎらの前出のものおよび（１９８５）　■匹旦Ｌ１４５：１８６−１９０；　Ｐａｃｈｌ、Ｃ，らのし組旦■（１９８９）　１６９：４１８−４２６；米国出願第３６７、３６３号）。

Ｃｒａｎａｇｅらの（１９８８）　Ｊ　Ｖｉｒｏｌ　６２：１４１６−１４２２では、ＣＭＶゲノムのマツピングおよび配列分析によって、Ｂｉｎｄｌｌｌ　Ｌと命名されたひとつのフラグメントが、単純ヘルペスウィルス１　（Ｈ３ＶＩ）およびニスブタイン・バールウィルス（ＥＢＶ）のｇＨ遺伝子とある程度の類似性を有するオープンリーディングフレームを含有することが判明したと報告された。この報告はまた、ＣＭＶｇＨ遺伝子の３′末端が、Ｈｉｎｄｌｌｌ　Ｌフラグメントと、その上流に隣接するＨｉｎｄｌｌｌ　Ｄと命名されたＨｉｎｄｌｌ＋フラグメントとの境界のＨｉｎｄｌ１１部位から、２２２ｂｐ離れて位置することを明らかにした。この報告は、ＰＣＴ／ＧＢ８７１００１６４（公開第ＷＯ３７１０５３２６号）に再度記載されている。このＰＣＴ出願には、さらに、ヒトＣＭＶｇＨ遺伝子のクローニングおよび構造、ならびにワクシニアウィルスを用いたその発現が記載されている。

本出願人らは、本明細書中に参考として援用する１９８９年６月１６日に同一出願人により出願された同時係属中の米国出願第３６７．３６３号の中で、ｇＨをコードするヒ）ＣＭＶの構造遺伝子の位置および配列をｇＨアミノ酸配列と共に教示している。

この遺伝子およびその種々の切断型アナログを哺乳類発現ベクター中に挿入し、そして組換えヒトＣＭＶｇＨおよびその切断型アナログを、ＣＯ８細胞中で低レベルではあるが検出可能なレベルにて発現させた。組換えｇＨおよび特定のアナログは、天然タンパク質（ｇｐ８６）に対する中和モノクローナル抗体（マウスモノクローナルＩＧ６、Ｒａｓｍｕｓｓｅｎらの凹（１９８４）　ＬＬ・１１７６−８８０）に対して免疫学的に反応性を有していた。

現在までに成し遂げられた進歩にもかかわらず、ＣＭＶサブユニットワクチンの開発における主たる障壁は、従来の発現システムの何れにおいても、高レベルのヒトＣＭＶｇＨ関連ポリペプチドを発現できていないことである。

最近、バキュロウィルスベクターを利用して、哺乳類構造遺伝子を培養昆虫細胞中に導入し、次いで異種ポリペプチドの発現を得る、発現システムが開発された。これは、何種類かのタンパク質の組換え発現に対しては成功することが判明しティる。例えば、Ｊｕ、　Ｇ、らのＣｕｒｒ、　Ｃｏｍｎ＋ｕｎｉｃ、ｉｎ　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｆ、　−Ｇｅｎｅ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｆｏｒ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ　（１９８７）Ｃ，Ｓ、Ｈ，Ｌ、　Ｐｒｅｓｓ　ｐＪ９〜４５）；　Ａｔｋｉｎｓｏｎ、　Ａ、Ｅ、らのＰｅ５ｔｉｃ、　Ｓ幻工（１９９０）　２＋１：２１５−２２４を参照されたい。

幾つかの例では、ウィルス性タンパク質を発現した。例えば、ＰＣＴ公開東Ｗ０９０１０２５６６（バラミクソウィルス融合タンパク質）；ＥＰＯ公開第３４１．６１１号（イヌハルボウイルスＶ　ｐ−２）；　ＥＰＯ公開第３２９．２５７号（ブラズモジウムサーカムスポロゾイト抗原）　；　ＰＣＴ公開第Ｗ０１１９１０５４２３号（キメラヒト呼吸シンンチアルウイルス性抗原）：およびＥＰＯ公開東２７２．８５１１号（ＨＩ　Ｖ　Ｚ　７　ヘミ−ブタンパフ′ｘ）をＩＮされたい。

幾つかの例では、ヘルペスファミリー中のウィルスのサブ二二、トタンバク質が開示されている。例えば、Ｆｒｅｃｈ、　ＢらのＪ、　Ｖｉｒｏｌ、　（１９９０）　６４：２７５９−２７６７　（Ｅ　Ｂ　Ｖ　ＴＰ−１）；　Ｋｒ１ｓｔｉｅ、　Ｔ、Ｍ、らのＥＭＢＯＪ、（１９８９）　ｉ＋４２２９−４２３８（ＨＳ　Ｖ　ａ　Ｔ　Ｉ　Ｆ）　；　Ｄｏｄｓｏｎ、　Ｍ、Ｓ、らのＪ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｗ、（１９ｇ９）　２６４：２０８３５−２０８３８　（ＨＳ　Ｖ−１へリカーゼ）；　０１ｉｖｏ、　Ｐ、Ｄ、らのＪ、Ｖｉｒｏｌ、（１９８９）　６３：１９６−２０４　（Ｈ３Ｖ−１複製酵素）；ＰＣＴ公開第ｆ０８９／１０９６５（仮性狂犬病および感染性ウシ鼻気管炎ウィルスポリペプチド）：およびＥＰＯ公開東３４０．３５９号（ＣＭＶ即時型タンパク質）を参照されたい。

インフルエンザウィルスのウィルス細胞表面域タンパク質の膜貫通ドメインを除去することによって（Ｓｖｅｄａ、　Ｍ、Ｍ、らのＣｅ１ｌ　（１９８２）　３０：６４９−６５６；　Ｇｅｔｈｉｎｇ、　Ｍ、Ｊ、およびＪ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋの！１ａｔｕｒｅ　（１９８２）　３００：５９８−６０３）および水庖性口内炎ウィルス（Ｒｏｓｅ、Ｊ、に、およびＪ、Ｅ、　ＢｅｒｇｍａｎｎのＣｅ１ｌ　（１９８２）　３０ニア５３−７６２）、哺乳類宿主細胞からの切断型糖タンパク質の分泌が得られる。ＥＰＯ公開第１３９．４１７号もまた参照されたい。上記のように、哺乳類細胞中でのｇＨ発現のためのこのようなアプローチでは、許容可能なレベルの発現を得られていない。

ｌ肚旦皿丞１豆旦斐１補乳類組換え遺伝子発現の一般的な難点は、多くのタンパク質が、多くのシステム中で発現し難い、特に高レベルで発現し難いものであること、および、何れのタンパク質の発現もその成功可能性の予想が難しいことである。

ていない。したがって、本出願人らは、バキ二ロウイルス／毘虫細胞発現システム中でのｇＨの発現を試みた。驚いたことに、免疫学的に宵月なｇＨポリペプチドの発現において、（哺乳類細胞中での発現に比較して）少なくとも１０倍の増加が得られることが分かった。

本発明は、ヒトＣＭＶポリペプチド、特にｇＨアナログを生産するための材料および方法を開示する。この生産は、ａ）ポリペプチドをコードするＤ　Ｎ　Ａを含有する昆虫宿主細胞を提供し；　ｂ）ポリペプチドを発現する条件下で細胞をインキユベートシ；そしてＣ）ポリペプチドを単離することによって行われる。

１つの実施態様において、本発明は、細菌プラスミドで構成されるバキュロウィルストランスファーベクターおよびＣＭＶｇＨポリペプチドをコードするＤ　Ｎ　Ａのセグメントを包ｉする。細菌プラスミドは、バキュロウィルスＤ　Ｎ　Ａに実質的に相同のＤＮＡを含有する。

他の実施態様において、本発明は、ヒトＣＭＶｇＨポリペプチドをコードするＤ　Ｎ　Ａを含有するバキュロウィルスを包含する。この実施態様では、ポリペプチドの発現はバ牛ユロウイルス調節エレメントによって制御される。

さらに他の実施態様は、ヒトＣＭＶｇＨポリペプチドをコードするＤＮＡを含有する昆虫細胞であり、これは、有用な量のポリペプチドを発現できる。

最後の実施態様において、本発明は、ＣＭＶｇＨに対して特異的な抗体に認識されるＣ〜ＩＶｇＨポリペプチドを包含する。この実施態様では、ポリペプチドは以下に開示する方法によって生産される。

１皿亘髪蚤ユ説月図１は、ＣＭＶタウン（Ｔｏｖｎｅ）ゲノム中のｇＨ遺伝子の位置を示す制限地図を示す。ラインＡは、基本的な配列で示された２３５ｋｂのＣＭＶタクンゲノムのＢｉｎｄ目Ｉ制目地制限地図。ユニークな配列を細線で示し、反復エレメントａｈ、ｂ’　３’二二、およびニエを四角形によって示す。ラインＢは、ｇＨをコードする、ＨｉｎｄｌｌＩ　Ａ／ＨからＰｓｔｌまでの３９１０ｂｐのフラグメントの制限地図である。黒太線は、ｇＨコード領域に対応し、矢印は、転写の方何を示す。制限部位の記号は次の通りである二ＡはＡｐａｌを示し；ＢはＢａｍＨＩを示し；　ＢｇはＢｇｌｌ＋を示し；ＢｓはＢｓｐｈ　Ｉを示し；ＥはＥｃｏＲＩを示し；ＨはＨｉｎｄｌｌｌを示し；ＰはＰｓｔｌを示し；ＳはＳｍａｌを示し；ＴはＴｔｈｌｌｌｌを示す。

図２は、ＣＭＶタウンｇＨ遺伝子のヌクレオチド配列である。Ｄ　Ｎ　Ａ配列および推定のアミノ酸配列を示す。推定ＴＡＴＡ、ＣＡＴおよびポリアデニル化配列には下線を施した。

潜在的なＮ−結合グリコリル化部位にはその上側に線を施しており、推定のシグナル配列および膜貫通ドメインには囲いを施している。ｐ８６トリプシンペプチドの位置を破線で示す（Ｇ１ｎ３＝７からＰｒｏ３ｓａ、およびＧ１ｎ３”、ｓからＧ１ｎ３＝７）　。

図３は、ＣＭＶタウンｇＨのバイトロバシー分析の図である。ｇＨタンパク質を、χ軸に沿って左から右へ、Ｍｅｔ＋からＣｙｓ＝ａ２まで示す。各位置での関連する相対的バイトロバシーは、７個のアミノ酸の移動ウィンドウを用いて計算されている。Ｘ軸の上側の各点は、親水性の増加を示し、Ｘ軸の下側の各点は、疎水性の増加を示す。

図４は、制限エンドヌクレアーゼ部位を示す、バキュロウィルス（ＡｃＮＰＶ）発現／ステムでトランスファーベクターとして共通に使用される細菌プラスミドｐＡｃ３７３の図である。プラスミドの太線部分は、白抜きバーで示されているポリヘトリン遺伝子を有するバキュロウィルス配列を示す。ポリヘトリン遺伝子の開始コドン近傍のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列もまた示されている。

「＋１」は、ＡＵＧ開始コドンのｒＡＪに対応する。

図５は、ｇ　Ｈ（ｐＡｃｇＨ２）および切断型ｇ　Ｈ（ｐＡｃｇＨ６）　ｈ　５ンスフアーベクターの図である。このベクターでは、ＣＭＶｇＨコード配列がｐＡｃ３７３のＢａｍＨ１部位中にスプライシングされている。

図６は、切断型ｇＨを発現するバキュロウィルス組換え体に感染した昆虫細胞からの切断型ｇＨの分泌を示す。

図７は、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定された、完全長もしくはＣ末端切断型のバキュロウィルス組換え体に感染したＳｆ９細胞から分泌されたｇＨおよび切断型ｇＨの、経過時間に対する発現を示す。

図８は、哺乳類細胞発現プラスミドｐＣＭＡｄ−Ｈ６でトランスフェクトされた哺乳類ＣＨＯ！ＩＢ胞、およびバキュロウィルス組換え体ｐＡ　ＣｇＦＪ６に感染した昆虫Ｓｆ９細胞によって発現された切断型ｇＨの分泌を示す。

＆豆悲１亙ユ鳳！Ｌ一定１ｒＣＭＶｇＨポリペプチド」は、天然ヒトＣＭＶｇＨの７ラグメントを含有するポリペプチドを言う。したがって、この用語は、ｇＨの天然の配列を含む両方のポリペプチド（完全長および切断型）およびこれらのアナログを包含する。好ましいアナログは、対応する天然アミノ酸に対して実質的に相同のものであり、最も好ましくは、中和エピトープなどの少なくとも１個の天然ｇＨエピトープをコードするものである。ＣＭＶｇＨポリペプチドの特に好ましいクラスは、本発明の昆虫細胞発現宿主からの扁レベルでのＣＭＶｇＨポリペプチドの効率的な発現および／または分泌を促進するために、Ｃ末端膜貫通ドメインの充分な部分が欠失しているものである。約２５個のＣ末端アミノ酸残基（図２のタウン株の７１７位〜７４２位の残基）が膜貫通ドメインを含むと考えらでいるが、他の領域もまた膜貫通結合に不可欠であり得る。膜貫通結合を消失させるかもしくは実質的に低減する、このようなドメインの全てもしくは一部の欠失が望ましい。典型的には少なくとも約５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約１０個の残基、そして最も好ましくは少なくとも約２０個の残基を天然ドメイン配列から欠失させる。１個の株がらのこのような欠失の例には、図２における７３２〜７４２位、７２２〜７４２位、７２０〜７４２位、７１７〜７４２位、および７１２〜７４２位の残基がある。当然、池の機能的欠失は当業者により容易に定められる。これは、昆虫細胞中でポリペプチドを発現することにより、同じかもしくは他のドメインから欠失部分を構築し、そしてこれらをスクリーニングすることによって行われる。欠失に対する唯一の本当の上限は、有用なエピトープ（例えば中和エピトープ）を保持するための実際的な限界である。しかし、典型的には、天然ｇＨ配列の約１００個のアミノ酸、特に１００個のＣ末端残基よりも多く欠失させることはない。膜貫通ドメインの一部の「欠失」とは、特定の天然アミノ酸配列がポリペプチド中に現れないこと、および、　（親水性残基などの）他のアミノ酸が、欠失した残基の代わりとして置換され得ることのみを意味することも理解されたい。本発明のヒトＣＭＶｇＨポリペプチドは、昆虫細胞発現宿主中で生産される。したがって、ポリペプチドが分泌されてグリコジル化された場合には、このポリペプチドは、昆虫綱、抱宿主中のこのポリペプチドの発現に独特なグリコジル化パターンを有することになる。

用語「有効量」とは、投与された被検体中に免疫反応を誘導するためのＣＭＶｇＨポリペプチドの充分な量を言う。免疫反応は、限定することなく、細胞性および／または体液性の免疫の誘導を包含し得る。好ましくは、有効量は、上に定義したように、治療を行うために充分なものである。正確な必要量は、個々の被験体によって異なり、これは、種、年齢、被検体の一般的状態、治療されてる症状の重症度、選択した特定のポリペプチド、投与形態等により左右される。したがって、正確な有効量を指定することは不可能である。しかし、当業者は、ルーチンの実験法のみを使用することによって適切な有効量を決定し得る。

言及するポリペプチドの「フラグメント」は、そのＸ　及するポリペプチド中に見られる任意の連続するアミノ酸配列である。好ましくは、フラグメントはこのポリペプチド由来のエピトープをコードし、最も好ましくは中和エピトープをコードする。第１のポリペプチドは、この第１のポリペプチド中の相同ドメインの両側に池のポリペプチドのフラグメントとは異なるアミノ酸配列がフランキングする場合であっても、この他のフラグメントを含む。

ポリペプチドは、抗体によって特異的に認識され、結合される場合に、抗体に対して「免疫学的に反応性」を有する。

免疫学的反応性は、当該技術において知みれているように、競合アッセイなどの標準イムノアッセイで決定され得る。

「作動可能に連結されたコとは、このように記述された各成分が、意図したように機能できるような関係となるような配置を言う。構造配列に「作動可能に連結された」調節エレメントは、この調節エレメントに適合するような条件下で構造配列の発現が得られるように、連結されている。

用語「ポリペブチトヨは、アミノ駿残基のポリマーを言うものであり、産物の最小長を限定するものではない。したがって、ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が、ポリペプチドの定義の中に含まれる。この用語はまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコジル化、アセチル化、ホスホリル化等を包含する。

ポリヌクレオチドを説明するために本明細書中で使用する本明細書のポリヌクレオチドを説明する用語「組換え体」とは、ゲノム、ｃ　ＤＮＡ、半合成もしくは合成起源のポリヌクレオチドを意味する。このポリペプチドは、その起源もしくは操作によって、（１）これが本来結合しているポリヌクレオチドの全部もしくは一部と結合していない；そして／または（２）これが本来結合しているものとは異なるポリヌクレオチドに結合している。タンパク質もしくはポリペプチドに関して使用する用語「組換え体」は、組換えポリヌクレオチドの発現により生産されたポリペプチドを意味する。「組換え宿主細胞」　「宿主細胞」　「細胞」　「細胞系」　「細胞培養物」、および、単細胞生物として培養された原核微生物もしくは真核細胞系を示す他のこのような用語は、相互に交換可能である。これらは、組換えベクターもしくは池のトランスファーＤＮＡの受容体として用いられ得るかあるいは用いられている細胞を意味し、かつトランスフェクトされた起源細胞の子孫を包含する。１個の親旧胞の子孫が、偶発的または意図的な変異のために、この起源の親に対して、その形態、ゲノムもしくは全Ｄ　Ｎ　Ａ相補体において２ずしも完全に同等でなくてもよいことを理解されたい。所望のペプチドをコードするヌクレオチド配列の存在などの関連特性によって特徴付けされている親に充分類似している、親細胞の子孫は、この定義により意図された子孫に含まれており、そして上の各用語に包含される。

「調節エレメント」は、フード配列に連結されてその配列の発現をもたらすポリヌクレオチド配列を言う。真核生物、特に昆虫細胞中のこの様な調節エレメントの性質は、プロモーター、ターミネータ−、リーダー配列、および、場合によってはエンハンサ−を含む。

「レプリコン」は、細胞内のポリヌクレオチド複製の自律単位として作用する、例えば、プラスミド、コスミド、染色体、ウィルスもしくはファージなどの、任意の遺伝子エレメントである。

言及する配列に「実質的に相同の」配列は、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８５％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％の配列相同性を有する。

本明細書中の用語「形質転換」は、宿主！ｌｌｌｌ心中来のポリヌクレオチドを挿入することを言う。これは、例えば直接の取込み、形質導入もしくは【−交配などの、挿入に使用する方法には関係しない。外来のポリヌクレオチドは、組み込まれていないベクターとして、例えばプラスミドとして推持され得るか、あるいは、宿主ゲノム中に組み込まれ得る。

本明細書中に使用しているように、「治療」は、　（ｉ）従来のワクチンにおけるような感染もしくは再感染の防止、　（ｉｉ）症状の低減もしくは除去、および（１ｉｉ）ウィルスの実質的な除去の何れをも言う。治療は、予防のために（感染前の投与により）行われ得るか、あるいは治療のために（感染中もしくは感染後の投与により）行われ得る。

「ベクター」は、異種ポリヌクレオチドセグメントを付加することにより、その付加されたセグメントの復製および／または発現を引き起こす、プラスミド、トランスファー、ファージ等のレブリフンを言う。

ＬＬ　ｌＩを　る熊Ａ　Ｈのヌクレオチド　１およびアミノ　１の゛ヒトＣＭｖの２種類の主要な実験用分離株は、ＡＤ１６９　（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ、Ｌ、らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　（１９８４）　８１：８７６−８８０）、およびタウン株（Ｐａｃｈｌ、　Ｃ，らの■ユ艮■（１９８９）　１６９：４１８−４２６）である。両方の株はｇＨをコードし、そしてこれらの糖タンパク質は、実質的な配列類似性を有しており、かつ免疫学的に反応性を有する。ＣＭＶの他の株は、ｇＨ配列の供給源用として容易に使用され得る。

２２２６ｂｐのｇＨオープンリーディングフレームを含有する、タウン株ＣＭＶゲノムのＨｉｎｄ　ＩＩＩからＰｓｔ　Ｉまでの３９１０ｂｐのフラグメントの同定および単離は、本明細書に参考として援用されるＰａｃｈｌ、　Ｃらの肛ユ ■■（１９８９＞　１６９：４１８−４２６に記載されており、図１および図２に示されている。ｇＨ配列は、７４２個のアミノ酸（８４，３ｋＤ）であり、膜糖タンパク質の特性を備えている。ハイドロパン−プロフィールの図３には、開裂可能シグナル配列となる可能性を持つ疎水性Ｎ末端ドメインが示される。図２に示すように、ｇＨの推定の外部親水性領域、Ａｒｇ２ａからＡｒｇ−、＋−，までの残基は、Ｎ結合グリコジル化の可能な６個の部位を含有していた。この部位は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒであり、ここでＸは２０個のアミノ酸のうちの任意のものであり得る。

例えばＡＤ１６９もしくはタウン株からのヒトＣＭＶｇＦ（の免疫学的に等価の各フラグメントは、以下のように同定され得る。

即ち、３°および／もしくは５゛末端で切断されており、モして／あるいは１個もしくはそれ以上の内部欠失部分を備えている、タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列のアナログを生産し、このアナログポリヌクレオチド配列を発現し、そして、得られたフラグメントがＣＭＶ抗体と免疫学的に反応するかどうか、もしくはインビボでのこのような抗体、特に中和抗体の産生を誘導するかどうかを決定することによって、同定され得る。例えば、１３個のアミノ酸疎水性ペプチド（Ｍｅｔ３ａｉｌからＡｌａ３ｓ２までの残基）内の欠失もしくはこれら全てを含む欠失によって、ｇＨの分泌が容易になり得る。同様に、Ｃ末端膜貫通領域および内部領域からの３３個の残基（７０９〜７４２位）内部の欠失もしくはこれら全てを含む欠失によって、分泌が容易になる。ｇＨの数個の異なる切断型は、米国出願第３６７、３６３号に記載されている。これには、Ｃ末端最後の２２側の残基の欠失（以下の実施例２に記載のフラグメントと同等）も包含されている。このフラグメントは、推定ｇＨ膜貫通ドメインの最初の３個のアミノ酸を保持している。

Ｂ、ＡタンパクヒトＣＭＶｇＨポリペプチドは、融合タンパク質の形態で生産され得る。成熟タンパク質の発現が望ましい場合には、バキュロウィルスポリペプチドコード配列の開始コドンの前に、異種タンパク質をフードする構造配列をスプラインングする。この開始コドンとしては、例えばポリヘトリン遺伝子の開始コドンＡＴＧがあり、ここでＡは、図４のヌクレオチド↓１である。以下のＩｌ、Ｃ，項を参照のこと。

しかし、状況によっては、融合タンパク質中にバキュロウィルスのポリペプチドの始めの配列を保持することが望ましくなり得る。これは、例えば、昆虫細胞中での分泌効Ｅを向上させるためである。ここで、異種コード配列の導入のためのスプライシング部位は、ウィルスの遺伝子の開始コドンの下流側に位置する。ポリヘトリン遺伝子の一５〜〒１７５位の独特なトランスファーベクター制限部位を有するベクターは、’４ａｘ　Ｓｕｔｒｒｍｅｒｓの研究所（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍＩ（ｈ、、Ｔｅｘａｓ　Ａ　ｒｆｃｕｌｔｕｒａｌ　ＥＸｅｒｉｚｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ　Ｂｕｉｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、　１５５５　（１９８７））から入手可能である。

ＣＭＶｇＨポリペプチドを含有するハイブリ、ドボリペプチドを発現することらまた望ましくなり得る。これは、例えば、発現、分泌、回収もしく１よ免疫原性を改善させるためである。これらのハイブリッドは、以下のようにして生産され得る。即ち、Ｃ〜ｉＶｇＨポリペプチドをコードするＤＮＡを、付加的ポリペプチドフラグメント、例えばＢ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ）、β−ガラクト／ダーゼ、ＳＯＤもしくは：ＬＭ＋＋ンに関連するフラグメントと結合し、そして、バ牛ユコウィルス／昆虫細胞発現７ステム中でこの結合したＤＮＡを発現することによって、生産され得る。ハイブリッドはまた、他のＣＭＶポリペプチド、例えばｇＢ由来の、または池のウィルス、例えばＨ３ＶもしくはＨＢＶ由来のエピトープをコードする配列であり得る。

Ｃ，バキュロウィルス　システムベクターの構築、細胞のトランスフェクション、プラークの採取、培養による細胞の生育等に使用する材料、方法および技術は当譲技術において既知のものであり、これらの技術を記載したマニュアルは入手可能である。しかし、一般的な案内として、手順、材料、および方法を販売元と共に以下に記載する。

一般に、発現／ステムの成分には、トランスファーベクター、即ち通常、バキュロウィルスゲノムのフラグメントおよび発現される異種遺伝子の挿入に好適な制限部位の双方を含有する細菌プラスミド；　トランスファーベクター中のバキュロウィルスに特異的なフラグメントに対して配列相同性（これにより、異種遺伝子のバキュロウィルスゲノム中への相同的組換えが可能となる）を有する野生型バキュロウィルス：ならびに、適切な昆虫宿主細胞および増殖培地が含まれる。

異種遺伝子をトランスファーベクター中に挿入した後に、ベクターおよび野生型ウィルスゲノムを昆虫宿主細胞中にトランスフェクトする。この宿主細胞中で、ベクターおよヒウイルスのゲノムの組換えが生じる。パッケージングされた組換えウィルスを発現し、組換えプラークを同定し、精製する。

バキュロウィルス／昆虫細胞発現システムの材料および方法は、キットの形態で、特に、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ　ＣＡから市販されている。これらの技術は、当業者に一般に既知のものであり、本明細書中に参考として援用するＳｔ＋ｍｍｅｒｓおよびＳ組換え発現システムとして有用な昆虫細胞および適合するベクターは当該分野で既知のものであり、例えば、バキュロウィルス　オートグラフ　カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウィルス（ＡｅＮＰｖ）由来の、昆虫発現およびトランスファーベクターを含んでいる。これはヘルパーに依存しないウィルスの発現ベクターである。このシステム白来のウィルスの発現ベクターは、通常、強力なウィルスのポリヘトリン遺伝子プロモーターを使用することによって、異種遺伝子の発現を行わせる。

外来の遺伝子をバキュロウィルスゲノム中に挿入する前に、プロモーター、リーダー（所望の場合）、目的のコード配列、および転写終結配列を含む上記の成分を、典型的には組み合わせて中間トランスプレースメント構築物（トランスファーベクター）を得る。中間トランスプレースメント構築物を、多（の場合、細菌などの宿主中に安定に維持可能な染色体外エレメント（例えばプラスミド）などのレプリコン中に維持する。レプリコンは、複製システムを有し、これによって、クローニングおよび増幅のための適切な宿主中に維持され得る。

現在、最も一般的に使用されている、外来の遺伝子をＡｅＮＰｖ中に導入するためのトランスファーベクターハ、ｐＡｃ３７３　Ｃ図４）である。当業者に既知の他の多くのベクターもまた設計されている。これらには、例えば、ｐＶＬ９８５が含まれる（これは、ポリヘトリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに改変し、ＡＴＴから３２塩基対だけ下流側にＥａｍｆｌ　ｌクローニング部位を導入するものである；　Ｌｕｃｋｏ豐およびＳｕｍｍｅｒｓの■皿ｎ社＜１９８９）　１７：３１を参照のこと。

非融合異種タンパク質発現のための、トランスファーベクターｐＡｃ３７３およびｐＶＬ９８ｓのＡｃＮＰ’／ポリヘトリン部分を、図４に示す。この図において、記載されている番号は、天然遺伝子内の位置を示し、ここでＡＴＧ＝トンのＡは、＋１である。

図４はまた、トランスファーベクターｐＡｃ３７３の制限エンドヌクレアーゼ地図を示す。この地図は、唯一のＢａ＋ａ旧部位が、ポリヘトリン遺伝子の翻訳開始コドンＡＴＧに対して−８の位置の後に位置している。Ｓｍａｌ、　ＰｓｔｌＳＢｇｌｌｌ、　Ｘｂａｌもしくは５ｓｔｌの開裂部位は存在しない。

プラスミドはまた、通常ポリへドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒらの（１９８ｇ）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、４２：１７７）、ならびに、ｇ、　ｃｏｌｉ、中での選択および増殖のための、原核アンヒシリン耐性（庄）遺伝子および復製のオリジンを含有ス異種遺伝子の挿入後、トランスファーベクターおよび野生型バキュロウィルスゲノムを、昆虫細胞宿主中に共トランスフェクトする。構築物のプロモーターおよび転写終結配列は、典型的にはバキュロウィルスゲノムの２〜５ｋｂの部分を含有する。バキュロウィルスウィルス中の所望の部位に異種ＤＮＡを挿入する方法は、当該分野で既知のものである。　（ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈ　（１９８７）；　Ｊｕら（１９８７）　；　Ｓｍ１ｔｈろのＭｏ１．　Ｃｅ１ｌＢｉｏ１．　（１９１１３）旦；２１５６：　ならびにＬｕｃｋｏｖおよびＳｕｍｍｅｒｓ　（１９８９）を参照のこと）。例えば、挿入は、相同二重交差組換えによって、ポリヘトリン遺伝子などの遺伝子中に行われ得る；挿入はまた、所望のバキュロウィルス遺伝子中に設計された制限酵素部位中にも行われ得る。Ｗｉ　１ｌｅｒらの虹と１組■（１９８９）生、９１゜新たに形成されたバ牛、ｃ７ウイルス発現ベクターを、次に、当業者に既知の技術で、略染性組換えバキュロウィルス中にパッケージングし、プラークを精製する。ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈ　（＋９８７）；　Ｍｉｌｌｅｒら（１９８９）。

Ｃ９２，ベクタープロモーターバ牛ユロウイルス発現ベクターは、通常、バ牛ユロウイルスフロモーターを含有する。バキュロウィルスプロモーターは、バキュロウィルスＲＮＡポリメラーゼと結合し、コード配列（例えば構造遺伝子）の下流（３°）方向への転写を開始させ、ｍＲＮＡにすることができる任意のＤＮＡ配列である。

プロモーターは、コード配列の５°末端近傍に通常位置する転写開始領域を有する。この転写開始領域は、典型的には、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位および転写開始部位を含む。バキコロウイルスプロモーターはまた、エンハンサ−と呼ばれる第２のドメインを有し得る。このエンハンサ−は、存在する場合には、通常構造遺伝子から遠い位置にある。発現は、調節され得るか、あるいは構成的発現であり得る。

構造遺伝子は、感染サイクルの末期に多く転写されるものであり、特に有用なプロモーター配列を提供する。その例としては、ウィルス性ポＩＪへドロンタンパク質をコードする遺伝子由来の配列［ユＬ証Ｒ姐ｆａｒ壮吐ルＬ任ユ舷旺虹旦ヨ。

（Ｗ／ａｌｔｅｒ　Ｄｏｅｒｆｌｅｒｍ＞中の、Ｆｒｔｅｓｅｎらの（１９８６）“Ｔｈｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｊｏｎ　ｏｆ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ”、Ｅ、Ｐ、Ｏ，公開第１２７．８３９号および箆１５５，４７６号コ、および、ｐｌｏタンパク質をコードする遺伝子［Ｖｌａｋらの（１９８８）Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ、　６９ニア６５］がある。

Ｃ１３，細胞内発現および分泌組換えポリペプチドは、細胞内で発現され得るが、あるいは、適切な調節配列を用いて発現される場合には、分泌され得る。外来の非融合タンパク賃の良好な細胞内発現を得るためには、通常、理想的にはＡＴＧ開始シグナルの前に適切な翻訳開始シグナルを含有する短いリーダー配列を有する異種遺伝子が必要である。

所望の場合には、臭化シアンと共にインビトロでインキュベー７１ンすることにより、Ｎ末端のメチオニンを、５５．熟タンパク質から開裂し得る。

あるいは、組換えタンパク質を、宿主細胞から分泌させることもできる。この分泌は、昆虫中に外来のタンパク質を分泌させるリーダー配列フラグメントで構成される、融合タンパク質をコードするキメラＤＮＡ分子を作成することによって行われる。リーダー配列フラグメントは、典型的には、細胞力らのタンパク質の分泌を導く疎水性アミノ酸で構成されるシグナルペプチドをコードする。

適切なシグナル配列をコードするＤＮＡは、分泌された昆虫もしくはバキュロウィルスタンパク質のための遺伝子、例えばバキュロウィルスポリヘトリン遺伝子（Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、（１９８ｇ）　Ｇｅｎｅ、７３：４０９）などから誘導され得る。あるいは、哺乳類細胞の翻訳後修飾（シグナルペプチド開裂、原核開裂、およびホスホリル化など）のためのシグナルが、昆虫細胞によって認識されると思われ、しかも、分泌および核蓄積に必要なシグナルもまた、無を椎動物細胞とを椎動物細胞との間で保存されていると思われるために、昆虫以外を起源とするリーダーを使用することによっても昆虫中での分泌を得ることができる。

この昆虫以外を起源とするリーダーとしては、ヒトα−インターフェロン［Ｍａｅｄａら、（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ、３１５：５９２］、ヒトガストリン放出ペプチドＣＬｅｂａｃｑ−Ｖｅｒｈｅｙｄｅｎら、（１９８ｇ）　Ｍｏ１ｅｃ、Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、、８Ｌ；３１２９コ、　ヒトＩＬ−２［５ＩＩｌｉｔｈら、（１９８５）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８２：８４０４１、マウスＩＬ−３［Ｍｉｙａｊｉｍａら、（１９８７）　Ｇｅｎｅ、５８　：　２７３］、およびヒトグルコセレブロシダーゼ［Ｍａｒｔｉｎら、（１９８ｇ）　ＤＮＡ、ヱ・９９コをフードする遺伝子由来のものなどがある。

Ｃ０４，昆虫細胞培養。

組’ｆＡ　、ｔバキュロウィルス発現ベクターは、数種類の昆虫細胞中に感染させるために開発されている。例えば、組換えバキュロウィルスは、特（こ：　Ａｅｄｅｓ　ａｅ　ｔ’、Ａｕｔｏ　ｒａ　ｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ、　旺吐１１且、Ｄｒｏｓｏ　ｈｉｌａ　ｍｅｌａｎｏ　ａｓｔｅｒＳ江空泣匹扛り江 ■ｎ且ムおよび１江肋Σ工旺ａｎｉのために開発されている（Ｐ、Ｃ，Ｔ、公開第ＷＯ３９１０４６６９９；　Ｃａｒｂｏｎｅｌｌらの（１９８５）　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、５５：１５３；　ｆｒｉｇｈｔの（１９８５）　Ｎａｔｕｒｅ、３２１ニア１８、Ｓｉ　ｉ　ｔｈらの（１９８３）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ、３：２１５６；および、一般的には、Ｆｒａｓｅｒらの（１９８９）　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ１１．　Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、、２Ｓ：２２Ｓを参照のこと）。

バキュロウィルス７発現における異種ポリペプチドの直接および融合発現の双方のための細胞および培地は、市販されている。細胞培養技術は一般に当業者に既知のものであり、Ｓｕｍ＋ｍｅｒおよび５Ｉｌｉｔｈ　（１９８？）中に記載されている。

Ｄ　ＣＭＶ　ＨポリペプチドのＣＭ　Ｖ　ｇ　Ｈポリペプチドを、好ましくは昆虫細胞から分泌させて、回収した培地から精製する。しかし、全培養物からＣＭＶｇＨポリペプチドを精製することも可能である。この精製は、最初に、緩衝食塩水（例えば低張性ＰＢＳ）および通常非イオン性の界面活性剤（例えば１％ＮＰ−４０）を用いて細胞を溶解することによって行われる。典型的には、破砕用緩衝液は、０゜５％のデオ牛／コールナトリウム塩、０．１％のＳＤＳ、および１ｉＭのフェニルメチルスルホニルフルオライド（Ｗｅｉｒ、　Ｊ、　Ｐ、およびＢ、　Ｍｏ５ｓ、　Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、（１９８５）　５６：５３４−５４０）をさらに含有し得る。

ＣＭＶｇＨポリペプチドを、当該分野で周知の技術である免疫沈降（例えばＷｅｉｒおよび！ｆｌｏｓｓ（１９８５）を参照のこと）によって、培地らしくは細胞溶解物の何れかから精製し得る。米国出願第３６７、３６３号に記載されているマウスモノクローナル抗体ＩＧ６　（Ｒａｓｚｕｓｓｅｎら、Ｐ’＋４Ｓ　（１９８４）　８１：８７６８８０）は、以下に記載するように、免疫沈降またはアフィニティーカラムクロマトグラフィーの何れかに使用され得る。

（Ｍ　Ｖ　ｇ　Ｈポリペプチドを精製する特定の方法は、このタンパク質に選択的に結合する上記のｌＧ６モノクローナル抗体を使用したアフィニティークロマトグラフィーである。

抗体を、セルロース、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、架橋されたデキストラン、粒状アガロース、または調整ボアガラスなどの固体支持体に共有結合し得る。この共有結合には、支持体上の官能基および抗体分子上の官能基（即ち反応性アミノ酸側鎖）と反応する三官能結合剤を使用する。５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎｓ　ｏｆ　Ｃ１１ｎｉＣａｌ　Ｂｉｏｃｈｅｚｉｓｔｒ　、　ｖｏｌ、　１　（１９７８）の２０２ページ以下を参照されたい。得られたモノクローナル抗体保持固体用を、ｃ　ｓｉ　ｖに感染した細胞の破砕物もしくはＣＭＶ馴化培地に接触させる。その際には、還元条件、即ち、固定されたモノクローナル抗体にｇＨポリペプチドを結合し得るような、ｐＨ、イオン強度、　（典型的には生理学的な）温度、および滞留時間を用いる。細胞は、音波処理、溶解、もしくは池の方法によって破砕され得る。固体用を、インキュベーションの後に破砕から分離し、そして、緩衝液で洗浄することにより、残留する結合していない破砕物を除去する。タンパク質を、固体用から溶出する。この溶出は、水素結合を解離する溶離剤をその層に通すことによって行われる。ｐＨを約３未満に低下させるベースもしくは約２Ｍを上回るＮａＣ１溶液が、一般に使用される溶離剤である。

あるいは、ヒトＣＭＶｇＨに対して誘起された抗体の分泌によって調製したモノクローナル抗体を使用することができる。糖タンパク質に対するモノクローナル抗体は、Ｋｏｈ　ｌｅｒ。

Ｂ、およびＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｃ，のＮａｔｕｒｅ　（１９７５）　２５６；４９５−４９７に最初に記載された体細胞ハイブリダイゼーション技術によって生産され得る。この手順は、宿主動物（マウスミエローマが入手可能であるため、典型的にはマウスである）を、感染した培養物から得たヒトＣＭＶもしくはタンパク質自体を用いて免疫することを包含する。ＣＭＶは、ＲＰＭＩ　１６４０もしくはダルベツコの最少必須培地などの従来の血清付加液体増殖培地中のヒト繊維芽細胞内で生育され得る。ウィルスは、遠心分離によって培養物の上澄みから沈降し得る。

抗体を生産する細胞（例えば末檎血リンパ球およびスブレノサイト（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅｓ））を、免疫された宿主から取り出し、液体増殖培地中の適切な！ｌ瘍融合パートナーと混合する。この液体増殖培地は、分子ｊ１２０００〜５０００のポリエチレングリコールなどの融合誘導剤を含有する。融合後、細胞を洗浄して、残留する融合培地を除去し、そして）ＩＡＴ培地などの選択増殖培地（即ち、親ａｍｉ株が感受性を有する、添加剤を含有する増殖培地）中でインキュベートする。癌細胞以外の親細胞の、選択培地中での培養物に生存する能力と親腫瘍細胞の不死性とを有するハイブリッド細胞のみが、選択培地中での培養物に生存する。生存しているハイブリッドを増殖させ、そして、これらの培養培地をスクリーニングすることにより抗ＣＭＶ抗体の存在を調べ得る。このスクリーニングは、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、細胞培養物中のウィルス性細胞変性効果（ＣＰＥ）の阻害を検出するマイクロ中和アッセイ、もしくは抗ウィルス活性（例えばプラーク還元）を検出する池のアッセイによって行われる。陽性の培養物をスクリーニングして、これらの培養物のＣＭＶｇＨを区議してこれに結合する能力を調べ得る。このスクリーニングは、これらの陽性の培養物で標識された感染細胞抽出物を免疫沈降させて、そして５ＤＳ−ＰＡＧＥによりその沈降物を分析してｙＡｎされたｇＨａ分を調べることによって、行われる。タンパク質に特異的に結合する抗体を産生ずるハイブリッドを、既知の手順により、サブクローニングして、インビボもしくはインビトロで増殖させ得る。抗体を、場合によっては得られた培地もしくは体液から、免疫グロブリンを単離するための従来の手順によって単離し得る。

Ｅ、ＣＭＶ　Ｈポリペプチドを　るワクチンの一１種類もしくは複数種類の活性成分として１種類もしくは複数種類の免疫原性ポリペプチドを含有するワクチンの調製は、当業者に既知である。典型的には、この様なワクチンを、注射可能物質、即ち溶液もしくは懸濁液として調製する；注射の前に液体に溶解するかもしくは懸濁させるために適切の固体の形態でもまた調製し得る。調製物を乳化するか、あるいは１種類もしくは複数種類のポリペプチドをリポソーム内に被包することも可能である。活性免疫原性成分を、多くの場合、薬学的に許容可能であり、しかもこの活性成分に適合する賦形剤と混合する。適切な賦形剤は、例えば、水、塩水、デ牛ストロース、グリセロール、もしくはエタノール等、およびこれらの組み合わせである。さらに、所望の場合には、ワクチンは、少量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、および／もしくはワクチンの有効性を向上させるアジュバントなどを含有し得る。

有効となり得るアジュバントの例としては、限定はされなイカ：水酸化アルミニウム、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−ス１／オニルーＤ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ツルームラミル−し−７ラニルーＤ−イソグルタミン（ＣＧＰ　１１５３７）、ツルーＭ　Ｄ　Ｐ　トロ　サれる）、Ｎ−アセチルムラミル−し−アラニル−Ｄ−イソグルタミニルーし一アラニンー２−（１° −２°−ジパルミトイルー８ｎ−グリセロ−３−ヒドロ牛ンホスホリロ牛／）− エチルアミン（ＣＧＰ　１９８３５Ａ％ＭＴＰ−ＰＥと祢される、および、ＲＩＢＩがある。これは、２％のスクアレン／Ｔｗｅｅｎ　８０ニマルジヨン中に細菌から抽出した３種類の成分、すなわちモノホスホリルＭＷ貫Ａ、トレ・・ロースジミニレートおよび細胞壁骨格（ＭＰＬ　＋　ＴＤＭ＋　ＣＷＳ）を含有する。好ましくは微粒子（即ちミクロン以下の）エマルシヨンである、ムラミルペプチドおよび抗原の水中曲型エマルジョンを含有するワクチン処方の例は、１９９０年５月２４１Ｆ出願の同一出願人によるＰＣＴ／ＵＳ９０１０２９５４、および１９９０年５月２５Ｂ出願のＥＰＡ第９０．３０５７４４．５号に開示されている。

これらの開示内容は、本明細書中に参考として援用される。

アジユバノドの有効性は、ＣＭＶｇＨポリベブチドエピトーブを含有する免疫原ポリペプチドに対する抗体の誘導を測定することによって、決定され得る。これらの抗体は、種々のアジユバノドから構成されるワクチン中のこのポリペプチドを投与することによって得られる。

ポリペプチドは、中性もしくは塩の形態でワクチンに処方され得る。薬学的に許容可能な塩としては、（ペプチドの遊離アミ７基で形成された）酸付加塩がある。この酸付加塩は、例えば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、ンユウ酸、１酉石酸、マレイン酸などの有機酸で形成される。遊離カルボ牛／ル基で形成された塩は、例えばナトリウム、カリワム、アンモニウム、カル／ラムもしくは水酸化鉄などの無機塩基、および、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−ニチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロ力インなどの有機塩基からも誘導され得る。

ワクチンは、従来、非経口的に、例えば皮下もしくは筋肉の何れかの注射によって投与されている。他の投与形態に適切な他の処方としては、坐薬、および、場合によっては経口処方がある。全薬用には、従来の結合剤および担体が、例えばポリアルキレングリコールもしくはトリグリセリドを含有し得る；この様な坐薬は、約０゜５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の活性成分を含有するａ合物から形成され得る。経口処方は、例えば、製薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、マグネシウムステアレート、ナトリウムサ。

カリシ、セルロース、炭酸マグネ７ウムなどの、通常使用されている賦形剤を含有する。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル、持続放出性処方、もしくは粉末の形態をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の活性成分を含有する。

ワクチンは、その投薬処方に適合するような態様で、予防および／または治療効果が得られるような量だけ投与される。

投与量は、一般に、１回の投薬量当り５μｇ〜２５０μｇの範囲の抗原であるが、これは、治療される被検体、抗体を合成する被検体の免疫／ステムの能力、および所望の保護の程度に依存する。投与する２要のある活性成分の正確な量は、医師の判断に依存し、各個体に対して独特のものとなり得る。

ワクチンを、単一投薬スケジユール、または好ましくは複式投薬スケジュールで投与し得る。復式投薬スケジユールとは、第１次のワクチン投与コースとして１〜１０回の投薬を各々行った後に、免疫反応を維持および／または増強するために必要な時間をおいて、例えば２回目の投薬までに１〜４ケ月おいて、さらに投薬を行い、そして、必要に応じて数ケガ後に１回もしくは複数回の次の投薬を行い得るような投薬スケジュールである。投薬計画はまた、少なくとも部分的には、個体の必要性によって決定され、医師の判断に依存する。

さらに、免疫原ＣＭＶｇＨニビトーブで構成されたポリペプチドを含有するワクチンを、他の免疫調節剤、例えば免疫グロブリンと組み合わせて投与し得る。

この様な組成物は、被験体のＣＭＶ治療に有用である。被験体は、一般に哺乳動物であり、その限りにおいて、ヒト、家畜、ベット、およびスポーツ用動物を含む。

（以下余白）１１１、実施例１　ヒトＣＭＶ″′　Ｈの有用なレベルのＣＭＶｇＨを発現する手段としてバキュロウィルスシステムを使用する可能性を調べるために、完全長ｇＨ（ｇＨ２）　をコードスルバキニロウィルスーｇＨトランスファーベクターを、上記のバキュロウィルス−昆虫細胞発現システムに使用するために調製した。バキュロウィルスベクターｐＡｃ３７３　（図４、Ｓｕｍｍｅｒｓら）を、Ｂａｎ旧で切断し、プラスミドｐＳＶｇＨ２のＮｏｔｌからＸｂａｌまでの２４９５ｂｐのｇＨフラグメント（米国出願第３６７、３６３号に記載）を、このＢａｓ旧部位中に挿入し、連結した。得られたプラスミドは、ｐＡｃｇＨ２と命名され（図５Ａ参照）、これは、バ牛二σウィルスポリヘトリン遺伝子プロモーターによって転写が行われるｇＨ構築物をコードする。

このＤＮＡプラスミドを、野生型バキニロウイルスウイルス性ＤＮＡと混合し、その混合物を、江は並玉」」工１ユ区ム（Ｓｆ９細胞）由来の細胞中にトランスフェクトし、そして組換えプラークを単離して、プラークを精製した。数個の組換えウィルスクローンを用いて細胞を感染させて、感染から４〜６日後に細胞溶解物および順化培地をＥＬＩＳＡおよびウェスタンプロットによって分析した。

完全長ｇ　Ｈ（ｐＡＣｇＨ２）の発現は、全く検出されなかった。

ｐＡＣｇＨ２を含有する組換えバ牛ユ口ウイルスに感染したＳｆ９細胞中でのｇＨの発現を、ラジオ免疫沈降（ＲＩＰ）によっても分析した。この分析には、モノクローナル１０５もしくはヒト血清を用いた。バキュロウィルス−ｐＡＣｇＨ２（完全長ｇＨ）に感染した細胞もしくは培地のＲＩＰから、ｇＨに特異的なバンドは全く検出されなかった。

〜　２　刑ヒトＣ〜１ｖ　ＨのＣ末端ドメインが欠失した、ｇＨのフラグメントをコードするバキュロウィルス −ｇＨトランスファーベクターを調製した。バキュロウィルスベクターｐＡｃ３７３　（図４．５ｉＩｌｉｔｈろ、■ｃ、　Ｖａｎ、　、４ｃａｄ、　Ｓｃｉ、（１９８５＞　８２：８４０４−３４０８）を、ＢａｍＦＪ　＋で切断し、ｐＣＭ６−８６のＮｏｔｌから５ａｌｌまでの２１７８ｂｐの７ラグメント（米国出願策３６７、３６３号寥照）を、このＢａｉＨＩＭＳ位中に挿入し、連結した。

得られたプラスミドは、ｐＡＣｇＨ６（ＡＴＴＣ受託番号６８３７３、図５Ｂ？、咳）と命名され、これは、バキュロウィルスポリヘトリン遺伝子プロモーターによって転写が行われるｇＨ構築物をコードする。この切断ｋｇＨセグメントでは、ｇＨのＣ末端から最後の２２個のアミノ酸を除去することによって、ｇＨの膜貫通領域のほとんどを欠失させた。フラグメントは、ｇＨ模貫通ドメインの最初の３個のアミノ酸（Ｌｅｕ−、＋５−Ｌｅｕ＝！ｈ−Ｍｅｔ−、＝ａ−図２）のみを保持している。

プラスミドを野生型バキュロウィルスウィルスのＤＮＡと混合し、これを用いてＳ　ａｄｏ　ｔｅｒａ　ｆｒｕ　ｉ　ｅｒｄａ細抱に細胞ランスフェクトし、そして組換えプラークをＩＵｉして、そのプラークを精製した。数個の組換えウィルスクローンを用いて細胞を感染させて、感染から４〜６日後に細胞溶解物および順化培地をＥＬＩＳＡおよびウェスタンプロットによって分析した。

全てのｐＡＣｇＨ６含有クローンにおいて、培養培地に対するｇＨ反応性がＥＬＩＳＡ分析によって明らかになった（図６）。これによって、切断型ｇＨがこの／ステム中で発現されたことが判明した。細胞溶解物のＥＬＩＳＡ分析では切断型ｇＨの細胞内での存在を検出できなかった。しかし、ＲＩＰ分析では、切断型ｇＨに関して陽性であり、切断型ｇＨの細胞内での存在が、低レベルではあるが検出可能であることが判明した。

轡　３　バキュロウィルス叫　の　Ｉ　ＨＡ　のｇＨ生産の最適条件を決定するために、バキュロウィルス感染中の切断型ｇＨ含成の経時変化を分析した。図６に示すように、細胞を、低い（０，５ＭＯ＋）多重度もしくは高い（１００ＭＯ＋）多重度でバキュロウィルスｐＡｃｇＨ６組換え体で感染させて、感染から１９時間〜７日後に、順化培地の試料を採取した。高タンパク質培地（Ｇｒｉｃｅの培地に、０．３３％のイーストレート　（Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ）　、０．３３％のラクトアルブミンヒドロライゼートおよび１０％のＦＣＳを加えたもの）を使用した感染では、培地中のｇＨの蓄積量は、４８時間後に安定水準に達したようであった。

これらの結果によって、ｇＨの合成および／または分泌が感染から４８時間後に停止すること、ならびに、高ＭＯ１１ｆ！ｔ、染においてやや高いレベルのｇＨ生産が見られることが分かる。同じ感染を、ＥＸ−ＣＥＬＬ　４００　（Ｊ、Ｒ，５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）低タンパク貫培地を用いても行った（図６）。これらの条件下では、培地中のｇＨの最高レベルは、高タンパク質培地を用いた感染に類似しているが、但し、合成の速度はより遅く、感染から４日後までは安定水準に達することはない。

４　え　Ｈのラジオ切断型ｇＨを発現するバキュロウィルス組換え体を、ラジオ免疫沈降（ＲＩＰ）によっても分析した。その際には、モノクローナルＩＧ６またはヒト血清を使用した。８５ｋＤのｇＨに特異的な主要なバンドおよび７４ｋＤのマイナーバンドを、バキュロウィルスーｐＡＣｇ）ＩＳ　（切断型ｇＨ）組換え体で感染させたＳ、　ｆｒ■江肛ム（ＳＦ３）細胞の細胞溶解物および培地からＲＩＰによって検出した。ごの５時間のパルス中に二つのｇＨバンドを検出した理由はわからないが、しかし、これらの分子が異なるグリコツル化形態を示すものであるという可能性がある。

完全長ｇＨの発現もまたこの技術を用いて調べたが、検出不可能であった。

５　山　の立　での０仝　および　Ｉ　Ｈのλ里旦土五昆虫細胞培養物を、（完全長ｇＨをコードする）　ｐＡＣｇＨ２もしくは（切断型ｇＨをフードする）　ｐＡＣｇＦＩ６の何れかに感染させて、その分泌をＥＬＩＳＡアッセイによって測定した。図７によって、完全長ｇＨの分泌は検出不可能であったが、切断型ｇＨの分泌は２４時間後に容易に検出可能であったことが分かる。

６　および　での　Ｉ　Ｈの１と二土旦止ムｇＨ発現プラスミドｐｃＭＡｄｌ１６でトランスフェクトした安定ＣＨＯ細胞株を単離した（米国出願第３６７、３６３号参照）。このプラスミドは、ｐＡＣｇＨ６に使用されるものと同じ切断型ｇＨフラグメントをコードする。これらの細胞株に対して２回のＭＴＸｔ１幅を行った。そして、これらの細胞株（ＣＨＯ株４０および株１７１．０．１μＭ　ＭＴＸ）からの順化培地中に非常に低レベルのｇＨが検出された。バキュロウィルス感染物からの細胞外ｇＨのレベルを、ＥＬＩＳＡによって、ＣＨＯ産生と比較したところ、バキュロウィルス組換え体によって約１０倍高いレベルのｇＨが産生された（図８）。ＣＲ２株は、実際には、ある程度の切断型ｇＨを発現している。なぜならば、免疫沈降実験によって、細胞内での少量の切断型ｇＨの存在が検出しているが、切断型ｇＨの分泌に関しては検出されていないからである。

これらの結果によって、バキュロウィルスシステムが、驚いたことに、細胞外ｇＨの産生においてＣＨＯ細胞よりも少なくとも１０倍以上効率的であることが証明される。

靴氷岐　疎フｒ’Ｖ−；を白ミーＨｉｎｄ［Ｉ　９４００ＫｐｎＩ　４４６０ＢａｍｈＬ’ＸｂａＩ　５４９５ＰｖｕＩＩ　１１８８５ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ　６１８２ＥＬＩＳＡ　０．０三ＬＩＳＡＯＯ補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）

Claims

【特許請求の範囲】１．プラスミドにより構成されるバキュロウイルス−ｇＨトランスファーベクターであって、該プラスミドが、バキュロウイルスＤＮＡと実質的に相同であるＤＮＡ、および、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）ポリペプチドをコードするＤＮＡのセグメントを含有する、バキュロウイルス−ｇＨトランスファーベクター。２．前記ヒトＣＭＶｇＨポリペプチドが、天然ヒトＣＭＶｇＨの切断型アナログである、請求項１に記載のベクター。３．前記アナログにおいて、天然ヒトＣＭＶｇＨ中に存在する膜貫通結合ドメインの全てまたは一部が欠失している、請求項２に記載のベクター。４．前記アナログにおいて、図２の７０９位から７４２位までの残基の内の少なくとも約１０個の連続するアミノ酸が存在していない、請求項３に記載のベクター。５．ヒトＣＭＶｇＨポリペプチドをコードするＤＮＡを含有するバキュロウイルスベクターであって、該ヒトＣＭＶｇＨポリペプチドの発現がバキュロウイルス調節エレメントによって調節される、バキュロウイルスベクター。６．前記ヒトＣＭＶｇＨポリペプチドが、天然ヒトＣＭＶｇＨの切断型アナログである、請求項５に記載のベクター。７．前記アナログにおいて、天然ヒトＣＭＶｇＨ中に存在する膜貫通結合ドメインの全てまたは一部が欠失している、請求項６に記載のベクター。８．前記アナログにおいて、図２の７０９位から７４２位までの残基の内の少なくとも約１０個の連続するアミノ酸が存在していない、請求項７に記載のベクター。９．前記エレメントがバキュロウイルスポリヘドリン遺伝子プロモーターである、請求項５に記載のバキュロウイルスベクター。１０．ヒトＣＭＶｇＨポリペプチドをコードし、かつ該ヒトＣＭＶｇＨポリペプチドを発現し得るＤＮＡを含有する昆虫細胞。１１．「スポドプテラフラジペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）」由来の細胞である、請求項１０に記載の細胞。１２．前記ヒトＣＭＶｇＨポリペプチドをコードするＤＮＡが、組換えバキュロウイルスによる感染によって導入された、請求項１０に記載の細胞。１３．ヒトＣＭＶｇＨポリペプチドを生産する方法であって、ａ）請求項１０に記載の昆虫細胞を提供する工程であって、前記ＤＮＡが、バキュロウイルス由来のプロモーターによって転写調節される工程、ｂ）該ヒトＣＭＶｇＨポリペプチドが発現される条件下で該細胞をインキユベートする工程、およびｃ）発現された該ヒトＣＭＶｇＨポリペプチドを回収する工程を包含する方法。１４．天然ヒトＣＭＶｇＨの切断型アナログを生産する、請求項１３に記載の方法。１５．前記プロモーターがバキュロウイルスポリヘドリンプロモーターである、請求項１３に記載の方法。１５．前記バキュロウイルスが「オートグラファカリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）」である、請求項１５に記載の方法。１７．前記昆虫細胞宿主細胞が「スポドプテラ　フラジベルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）」由来のものである、請求項１３に記載の方法。１８．前記サイトメガロウイルスがタウン株である、請求項１３に記載の方法。１９．前記サイトメガロウイルスがＡＤ−１６９である、請求項１３に記載の方法。２０．請求項１０に記載の細胞からの分泌によってグリコシル化された、ヒトＣＭＶｇＨポリペプチド。２１．被検体のＣＭＶ感染を治療する方法であって、有効な量の、薬学的に許容可能な担体中のヒトＣＭＶｇＨポリペプチドを投与する工程を包含する方法。２２．薬学的に許容可能な担体中に請求項２０に記載のＣＭＶｇＨポリペプチドを含有する組成物。