JP2759035B2 - 単純ヘルペスウイルス感染防御用ワクチン - Google Patents
単純ヘルペスウイルス感染防御用ワクチンInfo
- Publication number
- JP2759035B2 JP2759035B2 JP4378493A JP4378493A JP2759035B2 JP 2759035 B2 JP2759035 B2 JP 2759035B2 JP 4378493 A JP4378493 A JP 4378493A JP 4378493 A JP4378493 A JP 4378493A JP 2759035 B2 JP2759035 B2 JP 2759035B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hsv
- baculovirus
- gene
- cells
- mice
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 21
- 208000009889 Herpes Simplex Diseases 0.000 title claims description 4
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 68
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 claims description 43
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 21
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 14
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N mifamurtide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)COP(O)(=O)OCCNC(=O)[C@H](C)NC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)OC(O)[C@@H]1NC(C)=O JMUHBNWAORSSBD-WKYWBUFDSA-N 0.000 claims description 2
- 229960005225 mifamurtide Drugs 0.000 claims description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 56
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 56
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 21
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 18
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 17
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 17
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 16
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 16
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 16
- 101150072564 gE gene Proteins 0.000 description 15
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 11
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 9
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 8
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 8
- 241000700326 Human herpesvirus 1 strain KOS Species 0.000 description 7
- YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N Tunicamycin II Natural products O1C(CC(O)C2C(C(O)C(O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)C(O)C(O)C(NC(=O)C=CCCCCCCCCC(C)C)C1OC1OC(CO)C(O)C(O)C1NC(C)=O YJQCOFNZVFGCAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N tunicamycin Chemical compound O([C@H]1[C@@H]([C@H]([C@@H](O)[C@@H](CC(O)[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C(NC(=O)C=C2)=O)O)O1)O)NC(=O)/C=C/CC(C)C)[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O ZHSGGJXRNHWHRS-VIDYELAYSA-N 0.000 description 7
- MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N tunicamycin Natural products CC(C)CCCCCCCCCC=CC(=O)NC1C(O)C(O)C(CC(O)C2OC(C(O)C2O)N3C=CC(=O)NC3=O)OC1OC4OC(CO)C(O)C(O)C4NC(=O)C MEYZYGMYMLNUHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 6
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 4
- 101000807236 Human cytomegalovirus (strain AD169) Membrane glycoprotein US3 Proteins 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 4
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 4
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150031479 US9 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 3
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 3
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 3
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 3
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 206010014025 Ear swelling Diseases 0.000 description 2
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 description 2
- 208000032420 Latent Infection Diseases 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 2
- 210000005252 bulbus oculi Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 208000037771 disease arising from reactivation of latent virus Diseases 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000012536 storage buffer Substances 0.000 description 2
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 2
- QCHFTSOMWOSFHM-WPRPVWTQSA-N (+)-Pilocarpine Chemical compound C1OC(=O)[C@@H](CC)[C@H]1CC1=CN=CN1C QCHFTSOMWOSFHM-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- 241001545522 Aguacate virus Species 0.000 description 1
- 241000256844 Apis mellifera Species 0.000 description 1
- 102100022717 Atypical chemokine receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241001203868 Autographa californica Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 208000001860 Eye Infections Diseases 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000000729 Fisher's exact test Methods 0.000 description 1
- 208000037952 HSV-1 infection Diseases 0.000 description 1
- 206010019973 Herpes virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000678879 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 101900111625 Human herpesvirus 1 Envelope glycoprotein D Proteins 0.000 description 1
- 101900111631 Human herpesvirus 1 Envelope glycoprotein E Proteins 0.000 description 1
- 241000829111 Human polyomavirus 1 Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241000219739 Lens Species 0.000 description 1
- 235000014647 Lens culinaris subsp culinaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108700020497 Nucleopolyhedrovirus polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 241001363994 Plagioscion squamosissimus Species 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical class N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N ammonium thiocyanate Chemical compound [NH4+].[S-]C#N SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 108010034897 lentil lectin Proteins 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000007762 localization of cell Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N methyl alpha-D-mannoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O HOVAGTYPODGVJG-VEIUFWFVSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 238000002962 plaque-reduction assay Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000007639 printing Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 102220201851 rs143406017 Human genes 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
- A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/5555—Muramyl dipeptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16622—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16611—Simplexvirus, e.g. human herpesvirus 1, 2
- C12N2710/16634—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は感染病及び分子生物学の
分野に関する。
分野に関する。
【０００２】
【従来の技術】Ａ．単純ヘルペスウイルス型１(ＨＳＶ
−１)グリコプロテインＥ グリコプロテインＥ(gＥ)は１０の報告された単純ヘル
ペスウイルス型１(ＨＳＶ−１)グリコプロテインの１つ
である。ＨＳＶ−１感染細胞において、gＥは５９ＫＤa
の分子量を有する非グリコシル化ペプチドとして合成さ
れる。非グリコシル化ポリペプチドは切断され、部分的
にグリコシル化されて約６５kＤaの前駆体gＥ(pgＥ)を
生成し、次いでこれは約８０kＤaの分子量を有する熟成
形のgＥまでさらにグリコシル化される。
−１)グリコプロテインＥ グリコプロテインＥ(gＥ)は１０の報告された単純ヘル
ペスウイルス型１(ＨＳＶ−１)グリコプロテインの１つ
である。ＨＳＶ−１感染細胞において、gＥは５９ＫＤa
の分子量を有する非グリコシル化ペプチドとして合成さ
れる。非グリコシル化ポリペプチドは切断され、部分的
にグリコシル化されて約６５kＤaの前駆体gＥ(pgＥ)を
生成し、次いでこれは約８０kＤaの分子量を有する熟成
形のgＥまでさらにグリコシル化される。
【０００３】１０のＨＳＶグリコプロテインはウイルス
の表面に位置し、その幾らかは、ＨＳＩＶ−１感染への
液性(抗体)及び細胞性免疫応答の１次インヂューサー及
び標的であると報告されている。一つの研究では、ブラ
ックローズらは、グリコプロテインＢ及びＤが高中和抗
体力価を誘導し、潜伏ヘルペス感染から保護することを
示した(文献１)。しかしながら彼等は又、グリコプロテ
インＧ、Ｈ及びＩを発現したワクチニアが免疫マウスに
おいて保護応答を生成しないこと(文献１)、及びgＥを
発現したワクチニアが、ＨＳＶに対し非常に弱い中和抗
体応答のみを示すことを見出した。ブラックローズ等は
またワクチニアウイルスにより発現されたgＥのワクチ
ン接種は潜伏感染の確立に対して保護しないし、致死Ｈ
ＳＶ−１攻撃に対してマウスを保護しないことも発見し
た(文献１)。他の研究では、パラ等は補体の存在におい
てのみ、免疫親和性精製gＥに対する抗体がＨＳＶ−１
感染性を中和することを見出した。しかし、さらに中和
力価は低く、中和における抗gＥ抗体の役割の程度は測
定されなかった(文献２)。
の表面に位置し、その幾らかは、ＨＳＩＶ−１感染への
液性(抗体)及び細胞性免疫応答の１次インヂューサー及
び標的であると報告されている。一つの研究では、ブラ
ックローズらは、グリコプロテインＢ及びＤが高中和抗
体力価を誘導し、潜伏ヘルペス感染から保護することを
示した(文献１)。しかしながら彼等は又、グリコプロテ
インＧ、Ｈ及びＩを発現したワクチニアが免疫マウスに
おいて保護応答を生成しないこと(文献１)、及びgＥを
発現したワクチニアが、ＨＳＶに対し非常に弱い中和抗
体応答のみを示すことを見出した。ブラックローズ等は
またワクチニアウイルスにより発現されたgＥのワクチ
ン接種は潜伏感染の確立に対して保護しないし、致死Ｈ
ＳＶ−１攻撃に対してマウスを保護しないことも発見し
た(文献１)。他の研究では、パラ等は補体の存在におい
てのみ、免疫親和性精製gＥに対する抗体がＨＳＶ−１
感染性を中和することを見出した。しかし、さらに中和
力価は低く、中和における抗gＥ抗体の役割の程度は測
定されなかった(文献２)。
【０００４】これらの報告と対照的に、我々はバキュロ
ウイルス系において、ＨＳＶ−１感染に対し強い保護免
疫応答を惹起しうるgＥを発現した。事実、我々の組換
えバキュロウイルス発現gＥによるワクチン接種は高中
和抗体力価、ＤＴＨ応答を誘発し、マウスにおける致死
ＨＳＶ−１攻撃を防御した。我々が得た中和抗体力価
は、パラ等により得られたそれらの免疫親和性精製gＥ
に対する力価より非常に高い(２)か、又はブラックロー
ズ等により得られたそれらのワクシニアにより発現され
たgＥに対する力価より非常に高かった(１)。さらに、
バキュロウイルスにより発現されたgＥに対する我々の
中和抗体力価は、低中和活性でもそれらの免疫親和性精
製gＥと補体の存在を必要としたパラの結果(文献２)と
対照的に、部分的に補体依存であった。大量の高品質生
物活性gＥを生成するこの能力はＨＳＶに対する有効な
ワクチンの開発に重要である。
ウイルス系において、ＨＳＶ−１感染に対し強い保護免
疫応答を惹起しうるgＥを発現した。事実、我々の組換
えバキュロウイルス発現gＥによるワクチン接種は高中
和抗体力価、ＤＴＨ応答を誘発し、マウスにおける致死
ＨＳＶ−１攻撃を防御した。我々が得た中和抗体力価
は、パラ等により得られたそれらの免疫親和性精製gＥ
に対する力価より非常に高い(２)か、又はブラックロー
ズ等により得られたそれらのワクシニアにより発現され
たgＥに対する力価より非常に高かった(１)。さらに、
バキュロウイルスにより発現されたgＥに対する我々の
中和抗体力価は、低中和活性でもそれらの免疫親和性精
製gＥと補体の存在を必要としたパラの結果(文献２)と
対照的に、部分的に補体依存であった。大量の高品質生
物活性gＥを生成するこの能力はＨＳＶに対する有効な
ワクチンの開発に重要である。
【０００５】Ｂ．ＤＮＡ技術 組換えＤＮＡ及び関連技術は、治療又は予防ＨＳＶワク
チンに必要とされる大量の高品質生物活性ＨＳＶグリコ
プロテインＥを有効に供給するのに適用できる。
チンに必要とされる大量の高品質生物活性ＨＳＶグリコ
プロテインＥを有効に供給するのに適用できる。
【０００６】ＤＮＡ技術は、部分的に、複製の起原、１
又はそれ以上の表現型選択特質、発現プロモーター、異
種遺伝子挿入及び残留ベクターのＤＮＡ組換えによる複
製可能発現伝播体又は転置(transplacement)ベクターを
生成することを含む。得られる発現伝播体は形質転換に
より細胞内に導入され、大量の組換え伝播体が転換体を
生長させることにより得られる。遺伝子がコード化され
たＤＮＡメッセージの転写及び翻訳を制御する部分に関
連して適正に挿入される場合、発現伝播体は、挿入遺伝
子がコードするポリペプチド配列を生成しうる。ポリペ
プチドを生成するこの方法は、“発現"と呼ばれる。得
られる生成物は宿主細胞を分解し、適当な精製方法によ
り生成物を回収することにより得られる。
又はそれ以上の表現型選択特質、発現プロモーター、異
種遺伝子挿入及び残留ベクターのＤＮＡ組換えによる複
製可能発現伝播体又は転置(transplacement)ベクターを
生成することを含む。得られる発現伝播体は形質転換に
より細胞内に導入され、大量の組換え伝播体が転換体を
生長させることにより得られる。遺伝子がコード化され
たＤＮＡメッセージの転写及び翻訳を制御する部分に関
連して適正に挿入される場合、発現伝播体は、挿入遺伝
子がコードするポリペプチド配列を生成しうる。ポリペ
プチドを生成するこの方法は、“発現"と呼ばれる。得
られる生成物は宿主細胞を分解し、適当な精製方法によ
り生成物を回収することにより得られる。
【０００７】原核及び真核生物を含む広範囲の宿主細胞
を用いることができる。微生物に加えて、脊椎動物であ
れ、非脊椎動物であれ、多細胞生物から導かれる細胞の
培養物も宿主として用いうる。我々の系は、バキュロウ
イルス、ポリヘドリンプロモーター系及び宿主細胞とし
ての昆虫細胞の使用を含み、大量の生物活性gＥを生成
した。我々の認識によれば、我々はこの系でのgＥ発現
の最初である。本明細書で記載される文献は全て引例と
して明細書記載の一部とする。
を用いることができる。微生物に加えて、脊椎動物であ
れ、非脊椎動物であれ、多細胞生物から導かれる細胞の
培養物も宿主として用いうる。我々の系は、バキュロウ
イルス、ポリヘドリンプロモーター系及び宿主細胞とし
ての昆虫細胞の使用を含み、大量の生物活性gＥを生成
した。我々の認識によれば、我々はこの系でのgＥ発現
の最初である。本明細書で記載される文献は全て引例と
して明細書記載の一部とする。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】発明の要約 本発明は、組換えＤＮＡ技術によるＨＳＶ−１gＥの生
成及びＨＳＶ−１及び／又はＨＳＶ−２感染を防御する
ワクチンにおける免疫原としてのその用途に関する。遺
伝的に設計された免疫原から造られたワクチンは、弱毒
化ウイルスから造られた慣用のワクチンよりも安全であ
る。というのは、レシピエントへの感染の危険がなく、
特にヘルペスウイルスについては、頸部癌の危険があっ
てはならないからである。別法として遺伝的に設計され
たグリコプロテイン又は蛋白生成物を受身免疫治療での
使用のための抗体を生成するのに用いうる。本発明は
又、目的の転置ベクターを含む形質転換細胞系及びＨＳ
Ｖ−１gＥを生成するその培養物にも関する。
成及びＨＳＶ−１及び／又はＨＳＶ−２感染を防御する
ワクチンにおける免疫原としてのその用途に関する。遺
伝的に設計された免疫原から造られたワクチンは、弱毒
化ウイルスから造られた慣用のワクチンよりも安全であ
る。というのは、レシピエントへの感染の危険がなく、
特にヘルペスウイルスについては、頸部癌の危険があっ
てはならないからである。別法として遺伝的に設計され
たグリコプロテイン又は蛋白生成物を受身免疫治療での
使用のための抗体を生成するのに用いうる。本発明は
又、目的の転置ベクターを含む形質転換細胞系及びＨＳ
Ｖ−１gＥを生成するその培養物にも関する。
【０００９】
【課題を解決するための手段及び発明の効果】この目的
のために、我々はＳf９細胞において高レベルのＨＳＶ
−１gＥを発現する組換えバキュロウイルスを構築し
た。しかしながら我々は予期に反して我々の発現gＥに
よるマウスのワクチン接種が高中和抗体力価、ＤＴＨ応
答及び致死ＨＳＶ−１攻撃に対する防御を起こすことを
見出した。従って、方法及び組成物は単一細胞宿主生物
におけるＨＳＶgＥ遺伝子のクローニング及び発現のた
めに提供される。又、これらの新規単一細胞生物を培養
してＨＳＶgＥ遺伝子生成物を生成する方法及び遺伝子
生成物の精製方法をも記載する。
のために、我々はＳf９細胞において高レベルのＨＳＶ
−１gＥを発現する組換えバキュロウイルスを構築し
た。しかしながら我々は予期に反して我々の発現gＥに
よるマウスのワクチン接種が高中和抗体力価、ＤＴＨ応
答及び致死ＨＳＶ−１攻撃に対する防御を起こすことを
見出した。従って、方法及び組成物は単一細胞宿主生物
におけるＨＳＶgＥ遺伝子のクローニング及び発現のた
めに提供される。又、これらの新規単一細胞生物を培養
してＨＳＶgＥ遺伝子生成物を生成する方法及び遺伝子
生成物の精製方法をも記載する。
【００１０】次いでヒト宿主に、好ましくは免疫誘導量
のgＥのみを或いは１又はそれ以上のＨＳＶグリコプロ
テイン又は蛋白と共に、全身性経路、腸内経路又は、眼
経路により接種する。ワクチンは、又、ワクチンのグリ
コプロテイン成分と共に、前又は後に、投与される１又
はそれ以上のアジュバントを含みうる。
のgＥのみを或いは１又はそれ以上のＨＳＶグリコプロ
テイン又は蛋白と共に、全身性経路、腸内経路又は、眼
経路により接種する。ワクチンは、又、ワクチンのグリ
コプロテイン成分と共に、前又は後に、投与される１又
はそれ以上のアジュバントを含みうる。
【００１１】本発明のワクチンは、溶液形、フリーズド
ライ、噴霧乾燥、又は凍結乾燥形で、処理の間にグリコ
プロテイン又は蛋白を保護するために１又はそれ以上の
適当な保存剤及び保護剤と組合せて有利に用いうる。
ライ、噴霧乾燥、又は凍結乾燥形で、処理の間にグリコ
プロテイン又は蛋白を保護するために１又はそれ以上の
適当な保存剤及び保護剤と組合せて有利に用いうる。
【００１２】Ａ．抗原 バキュロウイルス発現gＥは６８及び７０kＤaの見掛け
の分子量を有する二重バンドとしてゲル上を移動した。
組換えgＥは、ツニカマイシン処理に対するその感受性
により証明されるようにグリコシル化されていた。間接
免疫蛍光もそれがＳf９細胞の膜に輸送されることを証
明した。我々の発現gＥをワクチン接種したマウスはＨ
ＳＶ−１中和抗体の高血清力価を示し、これはプラク減
少検定により証明された。グリコプロテインＥもＨＳＶ
−１に対する強い遅延型過敏症(ＤＴＨ)応答を誘導し、
組換えgＥをワクチン接種したマウスは腹腔内及び眼球
致死ＨＳＶ−１攻撃から防御された。
の分子量を有する二重バンドとしてゲル上を移動した。
組換えgＥは、ツニカマイシン処理に対するその感受性
により証明されるようにグリコシル化されていた。間接
免疫蛍光もそれがＳf９細胞の膜に輸送されることを証
明した。我々の発現gＥをワクチン接種したマウスはＨ
ＳＶ−１中和抗体の高血清力価を示し、これはプラク減
少検定により証明された。グリコプロテインＥもＨＳＶ
−１に対する強い遅延型過敏症(ＤＴＨ)応答を誘導し、
組換えgＥをワクチン接種したマウスは腹腔内及び眼球
致死ＨＳＶ−１攻撃から防御された。
【００１３】Ｂ．アジュバント ワクチンは種々のアジュバントとのエマルジョンでしば
しば投与される。アジュバントは、免疫原のみが投与さ
れるよりも少ない用量でより少量の抗原を用いてより永
続性でより高レベルの免疫を獲得するのを助ける。本発
明において用いるアジュバントはアラム、フロインド、
ＭＴＰ−ＰＥ及びＩＳＣＯＭs(ＱuilＡ)を含むがこれに
限らない。加えて、ワクチンは、細胞伝達免疫応答を誘
導するため１又はそれ以上のアジュバントと共に又は非
存在下投与される１又はそれ以上のＨＳＶ−１グリコプ
ロテインを含むリポソーム又は他の膜結合小胞を含みう
る。
しば投与される。アジュバントは、免疫原のみが投与さ
れるよりも少ない用量でより少量の抗原を用いてより永
続性でより高レベルの免疫を獲得するのを助ける。本発
明において用いるアジュバントはアラム、フロインド、
ＭＴＰ−ＰＥ及びＩＳＣＯＭs(ＱuilＡ)を含むがこれに
限らない。加えて、ワクチンは、細胞伝達免疫応答を誘
導するため１又はそれ以上のアジュバントと共に又は非
存在下投与される１又はそれ以上のＨＳＶ−１グリコプ
ロテインを含むリポソーム又は他の膜結合小胞を含みう
る。
【００１４】Ｃ．免疫経路及び供与量 ワクチンは全身経路、全身ワクチン接種と組合せまたは
組合せることなく球眼経路または腸内経路により投与で
きる。全身経路は１又は多用量で、皮下、筋肉、又は静
脈内注射を含むがこれに限らない。眼球経路は、１又は
多用量での眼の結膜下注射、表面滴下、徐放装置、例え
ばコラーゲン保護、ヒドロゲルコンタクトレンズ又はＡ
ＬＺＡ“Ｏcusert"を含むがこれに限らない。
組合せることなく球眼経路または腸内経路により投与で
きる。全身経路は１又は多用量で、皮下、筋肉、又は静
脈内注射を含むがこれに限らない。眼球経路は、１又は
多用量での眼の結膜下注射、表面滴下、徐放装置、例え
ばコラーゲン保護、ヒドロゲルコンタクトレンズ又はＡ
ＬＺＡ“Ｏcusert"を含むがこれに限らない。
【００１５】投与される用量は、変更可能で一般にワク
チン接種を含む１ないし３用量で所望の効果及び選択し
た投与経路に依存する。しかしながら、注射によるヒト
への接種用量は約１０μgから５００μgまで変化する。
眼球ワクチン接種については、ヒト供与量は約１μgか
ら５００μgまで変わり、一方、腸内ワクチン接種につ
いてはヒト供与量は約１μgから８００μgまで変わる。
チン接種を含む１ないし３用量で所望の効果及び選択し
た投与経路に依存する。しかしながら、注射によるヒト
への接種用量は約１０μgから５００μgまで変化する。
眼球ワクチン接種については、ヒト供与量は約１μgか
ら５００μgまで変わり、一方、腸内ワクチン接種につ
いてはヒト供与量は約１μgから８００μgまで変わる。
【００１６】従って本発明の主たる目的は高レベルのＨ
ＳＶ−１gＥを発現することである。
ＳＶ−１gＥを発現することである。
【００１７】本発明の目的は単一ベクター系において１
ウイルス種から高レベルのＨＳＶ−１gＥを発現するこ
とである。
ウイルス種から高レベルのＨＳＶ−１gＥを発現するこ
とである。
【００１８】本発明の目的は、又、組換えバキュロウイ
ルスに感染し、又は形質転換した細胞から高レベルの生
物活性ＨＳＶ−１gＥを発現することである。
ルスに感染し、又は形質転換した細胞から高レベルの生
物活性ＨＳＶ−１gＥを発現することである。
【００１９】本発明の他の目的は、ＨＳＶ−１gＥを生
成する形質転換された細胞系を得ることである。
成する形質転換された細胞系を得ることである。
【００２０】本発明の次の目的は宿主におけるＨＳＶの
処置又は予防のための有効なワクチンを開発することで
ある。
処置又は予防のための有効なワクチンを開発することで
ある。
【００２１】これらの及び他の目的は、以下の記載及び
添付された請求の範囲からこの分野の当業者が容易に明
らかとなろう。
添付された請求の範囲からこの分野の当業者が容易に明
らかとなろう。
【００２２】図面の説明 本発明を添付の図面と共に説明する。図１〜図３は、Ｈ
ＳＶ−１gＥ遺伝子を含むpＡc−gＥ１組換えバキュロウ
イルス転換ベクターの構築の概要図表である。図１：Ｈ
ＳＶ−１株ＫＯＳのgＥ遺伝子を含む組換えベクターの
調製の詳細は以下の詳細な説明に与えられる。図２：太
い黒実線は、バキュロウイルスベクターに挿入された配
列番号１の１,８２２ヌクレオチド分離gＥ断片の範囲を
示す。矢じり形は遺伝子の３'末端を示す。破線は示さ
れたように酵素分解により除かれた部分を示す。gＩ及
びＵＳ９名称は、除去されたこれらの近接遺伝子の隣接
末端の位置を示す。数はカッコにより示された部分にお
けるヌクレオチドの数を示す。gＥ開始ＡＴＧコドンはg
Ｅ断片の開始から２７ヌクレオチドで、それは反対にg
Ｉの３'末端から２０３ヌクレオチドである。gＥＴＡＡ
停止コドンはgＥ断片の末端から１４１ヌクレオチドで
あり、それは逆にＵＳ９遺伝子の開始から２７８ヌクレ
オチドである。従って最終gＥ構築体はgＥを除きＨＳＶ
−１遺伝子を含まず、gＥ以外の如何なるＨＳＶ−１蛋
白も生成できない。図３：最終ベクターにおけるgＥ遺
伝子の開始近くのポリヘドリン遺伝子プロモーター配列
は、修飾ＢamＨＩ／ＢclＩ部位(下線を引いた)、gＥ遺
伝子の２７非コードヌクレオチド及びgＥコード配列の
開始(ＡＴＧ)に続く。
ＳＶ−１gＥ遺伝子を含むpＡc−gＥ１組換えバキュロウ
イルス転換ベクターの構築の概要図表である。図１：Ｈ
ＳＶ−１株ＫＯＳのgＥ遺伝子を含む組換えベクターの
調製の詳細は以下の詳細な説明に与えられる。図２：太
い黒実線は、バキュロウイルスベクターに挿入された配
列番号１の１,８２２ヌクレオチド分離gＥ断片の範囲を
示す。矢じり形は遺伝子の３'末端を示す。破線は示さ
れたように酵素分解により除かれた部分を示す。gＩ及
びＵＳ９名称は、除去されたこれらの近接遺伝子の隣接
末端の位置を示す。数はカッコにより示された部分にお
けるヌクレオチドの数を示す。gＥ開始ＡＴＧコドンはg
Ｅ断片の開始から２７ヌクレオチドで、それは反対にg
Ｉの３'末端から２０３ヌクレオチドである。gＥＴＡＡ
停止コドンはgＥ断片の末端から１４１ヌクレオチドで
あり、それは逆にＵＳ９遺伝子の開始から２７８ヌクレ
オチドである。従って最終gＥ構築体はgＥを除きＨＳＶ
−１遺伝子を含まず、gＥ以外の如何なるＨＳＶ−１蛋
白も生成できない。図３：最終ベクターにおけるgＥ遺
伝子の開始近くのポリヘドリン遺伝子プロモーター配列
は、修飾ＢamＨＩ／ＢclＩ部位(下線を引いた)、gＥ遺
伝子の２７非コードヌクレオチド及びgＥコード配列の
開始(ＡＴＧ)に続く。
【００２３】図４および図５は、バキュロウイルス−g
Ｅのウエスタンブロット分析及びクーマシーブルー染色
である。図４：バキュロウイルス−gＥ発現及びグリコ
シル化のウエスタンブロット分析。昆虫細胞はバキュロ
ウイルス−gＥ組換え体(vＡc−gＥＩ)で感染した(１０
ＰＦＵ／細胞のＭＯＩ、７２時間)。Ｖero細胞はＨＳＶ
−１株ＫＯＳで感染した(１０ＰＦＵ／細胞のＭＯＩ、
２０時間)。全細胞溶解質は１ＢＡ１０モノクローナル
抗体（文献３）を用いてウエスタンブロットにより分析
した。レーン:Ｍ、分子量マーカー;１、４×１０5ＨＳ
Ｖ−１感染Ｖero細胞;２、４×１０3vＡc−gＥＩ感染Ｓ
f９細胞;３、ツニカマイシン処理vＡc−gＥ１感染細胞;
４、野性型ＡcＮＰＶ感染昆虫細胞;５、模擬感染Ｓf９
細胞。示される全レーンは同じゲルの同じ暴露からであ
る。写真の目的のために、レーン４及び５はオートラジ
オグラム上、異なる位置から移動させた。図５：クーマ
シーブルー染色による発現gＥの検出。組換えgＥ又は野
性型バキュロウイルスからの全細胞溶解質(１０pfu／細
胞、感染後７２時間)は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で流
し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。レー
ン;Ｍ、分子量マーカー;Ｂ、野性型バキュロウイルス感
染細胞;gＥ、vＡc−gＥ１感染細胞、感染後７２時間。
矢印は発現gＥの位置(gＥ)及び野性型ポリヘドリン(Ｐ)
蛋白バンドを示す。
Ｅのウエスタンブロット分析及びクーマシーブルー染色
である。図４：バキュロウイルス−gＥ発現及びグリコ
シル化のウエスタンブロット分析。昆虫細胞はバキュロ
ウイルス−gＥ組換え体(vＡc−gＥＩ)で感染した(１０
ＰＦＵ／細胞のＭＯＩ、７２時間)。Ｖero細胞はＨＳＶ
−１株ＫＯＳで感染した(１０ＰＦＵ／細胞のＭＯＩ、
２０時間)。全細胞溶解質は１ＢＡ１０モノクローナル
抗体（文献３）を用いてウエスタンブロットにより分析
した。レーン:Ｍ、分子量マーカー;１、４×１０5ＨＳ
Ｖ−１感染Ｖero細胞;２、４×１０3vＡc−gＥＩ感染Ｓ
f９細胞;３、ツニカマイシン処理vＡc−gＥ１感染細胞;
４、野性型ＡcＮＰＶ感染昆虫細胞;５、模擬感染Ｓf９
細胞。示される全レーンは同じゲルの同じ暴露からであ
る。写真の目的のために、レーン４及び５はオートラジ
オグラム上、異なる位置から移動させた。図５：クーマ
シーブルー染色による発現gＥの検出。組換えgＥ又は野
性型バキュロウイルスからの全細胞溶解質(１０pfu／細
胞、感染後７２時間)は１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で流
し、クーマシーブリリアントブルーで染色した。レー
ン;Ｍ、分子量マーカー;Ｂ、野性型バキュロウイルス感
染細胞;gＥ、vＡc−gＥ１感染細胞、感染後７２時間。
矢印は発現gＥの位置(gＥ)及び野性型ポリヘドリン(Ｐ)
蛋白バンドを示す。
【００２４】図６は、抗バキュロウイルス−gＥ血清に
よるＨＳＶ−１感染性の中和を示す。バキュロウイルス
−gＥ、模擬ワクチン接種(野性型バキュロウイルス)、
又はＨＳＶ−１(株ＫＯＳ)接種マウスからの加熱不活性
化プール血清の系列希釈を本明細書に記載されるように
新鮮な又は加熱不活性化モルモット補体の存在下、１０
０ＰＦＵのＨＳＶ−１株ＫＯＳとインキュベートし、残
留感染ウイルスを力価測定した。
よるＨＳＶ−１感染性の中和を示す。バキュロウイルス
−gＥ、模擬ワクチン接種(野性型バキュロウイルス)、
又はＨＳＶ−１(株ＫＯＳ)接種マウスからの加熱不活性
化プール血清の系列希釈を本明細書に記載されるように
新鮮な又は加熱不活性化モルモット補体の存在下、１０
０ＰＦＵのＨＳＶ−１株ＫＯＳとインキュベートし、残
留感染ウイルスを力価測定した。
【００２５】詳細な説明 本発明は組換えＤＮＡ技術を利用してＨＳＶ−１gＥ又
はその一部をコードするＤＮＡ配列をＤＮＡ転置ベクタ
ーに挿入し、ベクターは外来宿主においてgＥ遺伝子の
発現を増殖し指図することが可能となる。得られる組換
えＤＮＡ分子を昆虫細胞に導入して、宿主細胞によりg
Ｅ又はその一部又はその分子変異体を大量に生成しう
る。生成したgＥは次いで、ＨＳＶ型１及び型２に対す
る免疫療法に用いるために分離、精製する。
はその一部をコードするＤＮＡ配列をＤＮＡ転置ベクタ
ーに挿入し、ベクターは外来宿主においてgＥ遺伝子の
発現を増殖し指図することが可能となる。得られる組換
えＤＮＡ分子を昆虫細胞に導入して、宿主細胞によりg
Ｅ又はその一部又はその分子変異体を大量に生成しう
る。生成したgＥは次いで、ＨＳＶ型１及び型２に対す
る免疫療法に用いるために分離、精製する。
【００２６】以下に示す実施例はバキュロウイルス、ポ
リヘドリンプロモーター系及び宿主細胞としての昆虫細
胞の利用を記載する。しかしながら、別の宿主細胞培養
において望ましいgＥ及びgＥ生成物の発現のための発現
ベクターを構築するため類似の技術を用いることはこの
分野の当業者にとって容易である。従って以下の詳細な
記載は限定する意味にとるべきでなく、本発明の範囲は
添付の特許請求の範囲により最もよく定義される。
リヘドリンプロモーター系及び宿主細胞としての昆虫細
胞の利用を記載する。しかしながら、別の宿主細胞培養
において望ましいgＥ及びgＥ生成物の発現のための発現
ベクターを構築するため類似の技術を用いることはこの
分野の当業者にとって容易である。従って以下の詳細な
記載は限定する意味にとるべきでなく、本発明の範囲は
添付の特許請求の範囲により最もよく定義される。
【００２７】Ａ．ウイルス及び細胞 オートグラファ・カリフォルニカ(Ａutographa califo
rnica)核多角体病ウイルス(ＡcＮＰＶ)のＥ2株及びスポ
ドプレラ・フルギペルダ(Ｓpodoptera frugiperda)ク
ローン９(Ｓf９)細胞を既に記載されるように(文献４)
１０％ウシ胎児血清を含むＴＮＭ−ＦＨを用いて生育し
た。プラク精製ＨＳＶ−(ＭcＫrae及びＫＯＳ株)及びＶ
ero細胞を既に記載されるように(文献５)生育した。
rnica)核多角体病ウイルス(ＡcＮＰＶ)のＥ2株及びスポ
ドプレラ・フルギペルダ(Ｓpodoptera frugiperda)ク
ローン９(Ｓf９)細胞を既に記載されるように(文献４)
１０％ウシ胎児血清を含むＴＮＭ−ＦＨを用いて生育し
た。プラク精製ＨＳＶ−(ＭcＫrae及びＫＯＳ株)及びＶ
ero細胞を既に記載されるように(文献５)生育した。
【００２８】Ｂ．ＡcＮＰＶ組換え転移ベクターの構築 図１に示すように、ＨＳＶ−１株ＫＯＳ(文献６)由来Ｅ
coＲＩＨ制限断片を含むプラスミドpＳＧ２５をＤdeＩ
で消化し、ＨＳＶ−１gＥの完全コード部分を含む断片
を分離した。直線状断片をＢal３１で処理し、次いでＳ
alＩで再び切断した。ＢclＩリンカーの添加後、完全g
Ｅ構造遺伝子をバキュロウイルスポリヘドリン遺伝子プ
ロモーターの調整下、ベクターpＡcＹＭ１(文献４)のＢ
amＨＩ部位に挿入した。下図は、gＥ遺伝子の開始の領
域における最終ベクターのポリヘドリン遺伝子プロモー
ター配列を示す。これは修飾ＢamＨＩ／ＢclＩ部位(下
線)、gＥ遺伝子の２７非コードヌクレオチド及びgＥコ
ード配列(ＡＴＧ)の開始に続く。
coＲＩＨ制限断片を含むプラスミドpＳＧ２５をＤdeＩ
で消化し、ＨＳＶ−１gＥの完全コード部分を含む断片
を分離した。直線状断片をＢal３１で処理し、次いでＳ
alＩで再び切断した。ＢclＩリンカーの添加後、完全g
Ｅ構造遺伝子をバキュロウイルスポリヘドリン遺伝子プ
ロモーターの調整下、ベクターpＡcＹＭ１(文献４)のＢ
amＨＩ部位に挿入した。下図は、gＥ遺伝子の開始の領
域における最終ベクターのポリヘドリン遺伝子プロモー
ター配列を示す。これは修飾ＢamＨＩ／ＢclＩ部位(下
線)、gＥ遺伝子の２７非コードヌクレオチド及びgＥコ
ード配列(ＡＴＧ)の開始に続く。
【００２９】 Ｃ．組換えウイルスのトランスフェクション及び選択 Ｓf９細胞を文献４に記載されるように精製感染バキュ
ロウイルス(ＡcＮＰＶ)ＤＮＡ及びpＡc−gＥlプラスミ
ドＤＮＡに同時移入した。３反復のプラク精製ののち、
３つのポリヘドリン陰性組換えウイルスを選択した。組
換えバキュロウイルスは全て同様の性質を有するgＥを
発現した。一つをさらに研究するために独断的に選び、
vＡc−gＥ１と名づけた。
ロウイルス(ＡcＮＰＶ)ＤＮＡ及びpＡc−gＥlプラスミ
ドＤＮＡに同時移入した。３反復のプラク精製ののち、
３つのポリヘドリン陰性組換えウイルスを選択した。組
換えバキュロウイルスは全て同様の性質を有するgＥを
発現した。一つをさらに研究するために独断的に選び、
vＡc−gＥ１と名づけた。
【００３０】Ｄ．ツニカマイシン処理 感染細胞(１０ＰＦＵ／細胞)を文献７に記載されるよう
にＴＮＭ−ＦＨ培地(Ｊ．Ｒ．Ｈ．バイオサイエンス
ズ、レネクサ、ＫＳ)中４ug／mlツニカマイシン中、感
染後０−４８時間インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
用に収集した。
にＴＮＭ−ＦＨ培地(Ｊ．Ｒ．Ｈ．バイオサイエンス
ズ、レネクサ、ＫＳ)中４ug／mlツニカマイシン中、感
染後０−４８時間インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
用に収集した。
【００３１】Ｅ．ウエスタンブロット ウエスタンイムノブロットを既に記載されるように(文
献８)、変性条件下に実施した。ニトロセルロースブロ
ットを３つの抗gＥモノクローナル抗体Ｆd１７２(文献
９)、７−８(カテルジー等、未発表)、ＩＢＡ１０(文献
３)の一つ、又は全ＨＳＶ−１抗体(精製ＨＳＶ−１ビリ
オンに対してウサギで造られた)と４℃で１時間反応さ
せた。次いでブロットを125Ｉ−プロテインＡと２５℃
で１時間インキュベートし、オートラジオグラフにかけ
た。
献８)、変性条件下に実施した。ニトロセルロースブロ
ットを３つの抗gＥモノクローナル抗体Ｆd１７２(文献
９)、７−８(カテルジー等、未発表)、ＩＢＡ１０(文献
３)の一つ、又は全ＨＳＶ−１抗体(精製ＨＳＶ−１ビリ
オンに対してウサギで造られた)と４℃で１時間反応さ
せた。次いでブロットを125Ｉ−プロテインＡと２５℃
で１時間インキュベートし、オートラジオグラフにかけ
た。
【００３２】Ｆ．マウスの免疫 ２０匹のＢalb／cマウス(６−８週令)に、バキュロウイ
ルス発現gＥに感染したＳf９細胞の凍結融解全細胞溶解
質をワクチン接種した。１×１０6Ｓf９細胞からの溶解
質を、フロインド完全アジュバントと０日に、又はフロ
インド不完全アジュバントと２１及び４２日に、皮下注
射した。腹腔内(i．p．)注射を、ＰＢＳ中１×１０6感
染Ｓf９細胞からの溶解質を用いて同時に行なった。我
々はクーマシーブルー染色から１×１０6バキュロウイ
ルスgＥ感染細胞が約３０μgのgＥを含むことを評価す
る。１８Ｅの模擬ワクチン接種マウスに、同様の方法を
用いて野性型バキュロウイルスに感染したＳf９細胞を
接種した。１１匹のマウスの陽性コントロール群を、２
×１０5ＰＦＵの無毒のＨＳＶ−１株ＫＯＳで３回i．
p．免疫した。最終ワクチン接種３週間後、血清を集
め、各グループごとにプールした。
ルス発現gＥに感染したＳf９細胞の凍結融解全細胞溶解
質をワクチン接種した。１×１０6Ｓf９細胞からの溶解
質を、フロインド完全アジュバントと０日に、又はフロ
インド不完全アジュバントと２１及び４２日に、皮下注
射した。腹腔内(i．p．)注射を、ＰＢＳ中１×１０6感
染Ｓf９細胞からの溶解質を用いて同時に行なった。我
々はクーマシーブルー染色から１×１０6バキュロウイ
ルスgＥ感染細胞が約３０μgのgＥを含むことを評価す
る。１８Ｅの模擬ワクチン接種マウスに、同様の方法を
用いて野性型バキュロウイルスに感染したＳf９細胞を
接種した。１１匹のマウスの陽性コントロール群を、２
×１０5ＰＦＵの無毒のＨＳＶ−１株ＫＯＳで３回i．
p．免疫した。最終ワクチン接種３週間後、血清を集
め、各グループごとにプールした。
【００３３】ＨＳＶ−１眼球防御研究のため、５マウス
／グループを、gＥを発現するバキュロウイルスに感染
した１×１０6Ｓf９細胞からの凍結融解全細胞溶解質を
用いて同様の方法で２回ワクチン接種した。注射は、フ
ロインド完全アジュバントと０日に、フロインド不完全
アジュバントと２１日に皮下に行なった。腹腔内(i．
p．)注射は、ＰＢＳ中１×１０6感染Ｓf９細胞からの溶
解質を用いて同時に行なった。模擬ワクチン接種マウス
は、同様のレジメを用いて野性型バキュロウイルスに感
染したＳf９細胞を接種した。陽性コントロール群のマ
ウスを２×１０5ＰＦＵの無毒のＨＳＶ−１株ＫＯＳで
同じ時間にi．p．免疫した。
／グループを、gＥを発現するバキュロウイルスに感染
した１×１０6Ｓf９細胞からの凍結融解全細胞溶解質を
用いて同様の方法で２回ワクチン接種した。注射は、フ
ロインド完全アジュバントと０日に、フロインド不完全
アジュバントと２１日に皮下に行なった。腹腔内(i．
p．)注射は、ＰＢＳ中１×１０6感染Ｓf９細胞からの溶
解質を用いて同時に行なった。模擬ワクチン接種マウス
は、同様のレジメを用いて野性型バキュロウイルスに感
染したＳf９細胞を接種した。陽性コントロール群のマ
ウスを２×１０5ＰＦＵの無毒のＨＳＶ−１株ＫＯＳで
同じ時間にi．p．免疫した。
【００３４】Ｇ．血清中和検定 インビトロ血清中和検定のため、熱不活性化プール血清
をＭＥＭ中希釈し、１００ＰＦＵのＨＳＶ−１株ＫＯＳ
と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。２.
５％の新鮮な又は熱不活性化モルモット補体を加えて混
合物をさらに３０分間インキュベートした。重複試料を
２４ウエルミクロタイタープレート内のＣＶ−１細胞に
加えて残留ＨＳＶ−１感染性を検定した。プレートを３
７℃７２時間インキュベートし、１％クリスタルバイオ
レットで染色し、プラクを数えた。実験を２回繰り返し
て抗体力価(５０％プラク減少)の平均を血清希釈の逆数
として表わした。
をＭＥＭ中希釈し、１００ＰＦＵのＨＳＶ−１株ＫＯＳ
と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。２.
５％の新鮮な又は熱不活性化モルモット補体を加えて混
合物をさらに３０分間インキュベートした。重複試料を
２４ウエルミクロタイタープレート内のＣＶ−１細胞に
加えて残留ＨＳＶ−１感染性を検定した。プレートを３
７℃７２時間インキュベートし、１％クリスタルバイオ
レットで染色し、プラクを数えた。実験を２回繰り返し
て抗体力価(５０％プラク減少)の平均を血清希釈の逆数
として表わした。
【００３５】Ｈ．遅延型過敏症(ＤＴＨ) gＥに対するＤＴＨ応答を研究するために、マウスを３
回上述のようにワクチン接種した。最終ワクチン接種２
１日後に、マウスに１０μlのＭＥＭ中２×１０6ＰＦＵ
のＵＶ不活性化ＨＳＶ−１(株ＭcＫrae)を右耳の背側に
注射した。耳の厚さは注射直前、注射後２４時間、４８
時間及び７２時間にミクロメーター(ミツトヨ、東京、
日本)を用いて測定し、正味の腫脹(攻撃後攻撃前耳の厚
さを引く)として記録した(文献１０)。コントロールは
ＨＳＶ−１(株ＫＯＳ)ワクチン接種マウス(陽性コント
ロール)及び野性型バキュロウイルス(模擬)ワクチン接
種マウス(陰性コントール)を含んだ。
回上述のようにワクチン接種した。最終ワクチン接種２
１日後に、マウスに１０μlのＭＥＭ中２×１０6ＰＦＵ
のＵＶ不活性化ＨＳＶ−１(株ＭcＫrae)を右耳の背側に
注射した。耳の厚さは注射直前、注射後２４時間、４８
時間及び７２時間にミクロメーター(ミツトヨ、東京、
日本)を用いて測定し、正味の腫脹(攻撃後攻撃前耳の厚
さを引く)として記録した(文献１０)。コントロールは
ＨＳＶ−１(株ＫＯＳ)ワクチン接種マウス(陽性コント
ロール)及び野性型バキュロウイルス(模擬)ワクチン接
種マウス(陰性コントール)を含んだ。
【００３６】Ｉ．ウイルス攻撃 最終ワクチン接種３週間後、マウスは２×１０6ＰＦＵ
(i．p．経路による４ＬＤ５０)又は眼球に２×１０5Ｐ
ＦＵ／眼(眼球経路による１０ＬＤ５０)のビルレントＨ
ＳＶ−１株Ｍckraeでi．p．攻撃した。攻撃したマウス
は２週間モニターした。
(i．p．経路による４ＬＤ５０)又は眼球に２×１０5Ｐ
ＦＵ／眼(眼球経路による１０ＬＤ５０)のビルレントＨ
ＳＶ−１株Ｍckraeでi．p．攻撃した。攻撃したマウス
は２週間モニターした。
【００３７】結果 Ａ．組換えバキュロウイルス発現gＥの構築 ＨＳＶ−１株ＫＯＳから完全gＥオープンリーディング
フレームを含むバキュロウイルス転移ベクター(pＡc−g
Ｅ１)の構築の方法は上記し、図１に示される。図２
は、最終バキュロウイルスベクターに存在するgＥ遺伝
子の程度をより詳細に示す。全gＥ構造遺伝子は、最小
付加５'及び３'配列と共に存在する。５'ＤdeＩ切断及
び続くＢal３１消化の結果、開始gＥＡＴＧコドンの上
流２７ＨＳＶ−１ヌクレオチドのみの封入体となった。
３'末端でＳalＩ制限切断の結果、gＥＴＡＡ終止コドン
の下流１４１ＨＳＶ−１ヌクレオチドのみの封入体とな
った。gＥ断片の５'末端は最も近い上流遺伝子、gＩか
ら２０３ヌクレオチドに始まる。gＥ断片の３'末端は最
も近い下流遺伝子ＵＳ９から２７８ヌクレオチドに終わ
る。従って、gＥ−バキュロウイルス構築体は、付加的
ＨＳＶ−１遺伝子(又はＨＳＶ−１遺伝子の一部)を伴う
ことなく全構造gＥ遺伝子を含む。gＥ以外のＨＳＶ−１
蛋白はこのgＥバキュロウイルスから発現できない。コ
トランスフェクション、ベクターのバキュロウイルスへ
の取込み及び組換え体の分離に続いて、組換えバキュロ
ウイルス中のＨＳＶ−１gＥＤＮＡの存在をサザンブロ
ットハイブリダイゼーションにより証明した。
フレームを含むバキュロウイルス転移ベクター(pＡc−g
Ｅ１)の構築の方法は上記し、図１に示される。図２
は、最終バキュロウイルスベクターに存在するgＥ遺伝
子の程度をより詳細に示す。全gＥ構造遺伝子は、最小
付加５'及び３'配列と共に存在する。５'ＤdeＩ切断及
び続くＢal３１消化の結果、開始gＥＡＴＧコドンの上
流２７ＨＳＶ−１ヌクレオチドのみの封入体となった。
３'末端でＳalＩ制限切断の結果、gＥＴＡＡ終止コドン
の下流１４１ＨＳＶ−１ヌクレオチドのみの封入体とな
った。gＥ断片の５'末端は最も近い上流遺伝子、gＩか
ら２０３ヌクレオチドに始まる。gＥ断片の３'末端は最
も近い下流遺伝子ＵＳ９から２７８ヌクレオチドに終わ
る。従って、gＥ−バキュロウイルス構築体は、付加的
ＨＳＶ−１遺伝子(又はＨＳＶ−１遺伝子の一部)を伴う
ことなく全構造gＥ遺伝子を含む。gＥ以外のＨＳＶ−１
蛋白はこのgＥバキュロウイルスから発現できない。コ
トランスフェクション、ベクターのバキュロウイルスへ
の取込み及び組換え体の分離に続いて、組換えバキュロ
ウイルス中のＨＳＶ−１gＥＤＮＡの存在をサザンブロ
ットハイブリダイゼーションにより証明した。
【００３８】Ｂ．昆虫細胞における発現gＥの同定 昆虫細胞におけるバキュロウイルス発現gＥの大きさを
分析するため、ＨＳＶ−１感染Ｖero細胞又はバキュロ
ウイルス−gＥ組換え体(vＡc−gＥ１)感染Ｓf９細胞か
らの全蛋白抽出物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に流し、
抗gＥモノクローナル抗体ＩＢＡ１０(文献３)を用いウ
エスタンブロッティングにより分析した。これは図４に
示される。ＨＳＶ−１感染Ｖero細胞からのグリコプロ
テインＥは、既に報告されたgＥの明らかな分子量(文献
２)と一致する８０−８５kＤaの見掛けの分子量(図４、
レーン１)を有した。６８及び７０kＤaの見掛けの分子
量を有する、バキュロウイルス−gＥ抽出物からの２つ
のバンドはgＥ特異抗体と強く反応した(図４、レーン
２)。同様の結果が全ＨＳＶ−１抗体及び抗gＥモノクロ
ーナル抗体Ｆd１７２及び７−８に見られた。ウエスタ
ン分析により見られるgＥ発現(蓄積)のレベルは感染後
４８、７２及び９６時間で同じであった。
分析するため、ＨＳＶ−１感染Ｖero細胞又はバキュロ
ウイルス−gＥ組換え体(vＡc−gＥ１)感染Ｓf９細胞か
らの全蛋白抽出物を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上に流し、
抗gＥモノクローナル抗体ＩＢＡ１０(文献３)を用いウ
エスタンブロッティングにより分析した。これは図４に
示される。ＨＳＶ−１感染Ｖero細胞からのグリコプロ
テインＥは、既に報告されたgＥの明らかな分子量(文献
２)と一致する８０−８５kＤaの見掛けの分子量(図４、
レーン１)を有した。６８及び７０kＤaの見掛けの分子
量を有する、バキュロウイルス−gＥ抽出物からの２つ
のバンドはgＥ特異抗体と強く反応した(図４、レーン
２)。同様の結果が全ＨＳＶ−１抗体及び抗gＥモノクロ
ーナル抗体Ｆd１７２及び７−８に見られた。ウエスタ
ン分析により見られるgＥ発現(蓄積)のレベルは感染後
４８、７２及び９６時間で同じであった。
【００３９】モノクローナル抗体ＩＢＡ１０(レーン２)
及び全ＨＳＶ−１抗体(示さず)は５０kＤaの見掛けの分
子量を有するより小さなバンド(図４、レーン２におい
てかすかに見られる)とわずかに反応した。モノクロー
ナル抗体Ｆd１７２及び７−８はこのバンドと反応しな
かった。このバンドの同一性は明らかでないが、それは
gＥ分解生成物を表わしうる。抗gＥ抗血清は野性型バキ
ュロウイルス感染細胞(レーン４)又は未感染Ｓf９細胞
(レーン５)からの如何なるバンドとも反応しなかった。
及び全ＨＳＶ−１抗体(示さず)は５０kＤaの見掛けの分
子量を有するより小さなバンド(図４、レーン２におい
てかすかに見られる)とわずかに反応した。モノクロー
ナル抗体Ｆd１７２及び７−８はこのバンドと反応しな
かった。このバンドの同一性は明らかでないが、それは
gＥ分解生成物を表わしうる。抗gＥ抗血清は野性型バキ
ュロウイルス感染細胞(レーン４)又は未感染Ｓf９細胞
(レーン５)からの如何なるバンドとも反応しなかった。
【００４０】Ｃ．バキュロウイルス発現gＥのグリコシ
ル化及び細胞局在 バキュロウイルス発現gＥがＮ−グリコシル化を受けた
かどうかを測定するため、組換えバキュロウイルス感染
細胞を感染後０−４８時間、ツニカマイシンで処理し
た。ツニカマイシン処理に続いて、ほとんどの６８及び
７０kＤa種は、６４及び６６kＤaの見掛けの分子量を有
する２つのバンドに置換した(図４、レーン３)。これ
は、６８及び７０kＤaポリペプチドがともにＮ−連鎖糖
を含むことを示す。gＥ移動性における変化は、配列分
析(文献１１)により測定されたように、gＥポリペプチ
ドでの２つの潜在的Ｎ−連鎖グリコシル化部位の存在と
一致する。ツニカマイシン処理gＥの大きさも、インビ
トロ翻訳gＥについて報告された６６kＤaの分子量(文献
１２)と一致する。
ル化及び細胞局在 バキュロウイルス発現gＥがＮ−グリコシル化を受けた
かどうかを測定するため、組換えバキュロウイルス感染
細胞を感染後０−４８時間、ツニカマイシンで処理し
た。ツニカマイシン処理に続いて、ほとんどの６８及び
７０kＤa種は、６４及び６６kＤaの見掛けの分子量を有
する２つのバンドに置換した(図４、レーン３)。これ
は、６８及び７０kＤaポリペプチドがともにＮ−連鎖糖
を含むことを示す。gＥ移動性における変化は、配列分
析(文献１１)により測定されたように、gＥポリペプチ
ドでの２つの潜在的Ｎ−連鎖グリコシル化部位の存在と
一致する。ツニカマイシン処理gＥの大きさも、インビ
トロ翻訳gＥについて報告された６６kＤaの分子量(文献
１２)と一致する。
【００４１】gＥ−バキュロウイルス感染細胞の間接免
疫蛍光染色をＦd１７２抗gＥモノクローナル抗体を用い
て行なった。強い細胞表面蛍光が確かなＨＳＶ−１gＥ
(文献１３)と同様に見られ、発現gＥが細胞表面に輸送
されたことを示唆する。
疫蛍光染色をＦd１７２抗gＥモノクローナル抗体を用い
て行なった。強い細胞表面蛍光が確かなＨＳＶ−１gＥ
(文献１３)と同様に見られ、発現gＥが細胞表面に輸送
されたことを示唆する。
【００４２】Ｄ．gＥワクチン接種マウスからの血清に
よるＨＳＶ−１中和 組換えgＥの免疫原性を、上述したようにバキュロウイ
ルス−gＥに感染した全昆虫細胞からの溶解質でマウス
を免疫することにより研究した。これらのマウスは、
又、以下のi．p．攻撃研究に用いた。最終ワクチン接種
３週間後(且つ以下に記載されるi．p．ＨＳＶ−１攻撃
前)、マウスを採血し、それらの血清のＨＳＶ−１中和
活性用を試験した。プールした血清を熱不活性化し、次
いで新鮮な又は熱不活性化モルモット補体の存在下、Ｈ
ＳＶ−１とインキュベートした。免疫マウスからの血清
は、インビトロで高ＨＳＶ−１中和活性を有する(図６
及び表１)。以下の表１に示されるように、中和活性
は、熱不活性化補体(中空円)よりも新鮮な補体(黒ぬり
円)の存在で高かった。加えて、ウエスタンブロット
で、バキュロウイルス−gＥ免疫マウスからの血清はＨ
ＳＶ−１感染Ｖero細胞からの確かなgＥと反応した。従
って、我々のバキュロウイルス発現gＥは、確かなgＥに
対するマウスにおける免疫応答を誘導できるようであっ
た。
よるＨＳＶ−１中和 組換えgＥの免疫原性を、上述したようにバキュロウイ
ルス−gＥに感染した全昆虫細胞からの溶解質でマウス
を免疫することにより研究した。これらのマウスは、
又、以下のi．p．攻撃研究に用いた。最終ワクチン接種
３週間後(且つ以下に記載されるi．p．ＨＳＶ−１攻撃
前)、マウスを採血し、それらの血清のＨＳＶ−１中和
活性用を試験した。プールした血清を熱不活性化し、次
いで新鮮な又は熱不活性化モルモット補体の存在下、Ｈ
ＳＶ−１とインキュベートした。免疫マウスからの血清
は、インビトロで高ＨＳＶ−１中和活性を有する(図６
及び表１)。以下の表１に示されるように、中和活性
は、熱不活性化補体(中空円)よりも新鮮な補体(黒ぬり
円)の存在で高かった。加えて、ウエスタンブロット
で、バキュロウイルス−gＥ免疫マウスからの血清はＨ
ＳＶ−１感染Ｖero細胞からの確かなgＥと反応した。従
って、我々のバキュロウイルス発現gＥは、確かなgＥに
対するマウスにおける免疫応答を誘導できるようであっ
た。
【００４３】
【表１】ＨＳＶ−１gＥを発現する組換えバキュロウイ
ルスで免疫したマウスでの中和抗体及びＤＴＨの誘導 増加した耳の厚さa 中和抗体b (mm×10-2) 免疫 24時間 48時間 72時間 ＋Ｃ' −Ｃ' vＡc−gＥ1 7.0+/-1.2 7.4+/-1.5 14.8+/-1.7c >320 247 ＫＯＳ 8.3+/-1.7 14.7+/-2.7 15.5+/-3.2c >320 >320 模擬(AcNPV) 4.8+/-0.7 5.6+/-1.2 8.1+/-1.5 < 10 < 10 a ６マウス／グループの平均＋／−Ｓ．Ｄ． b 中和力価は、プラク数において５０％減少を生ずる
逆幾何学的平均として表わす。 c vＡc−gＥ１及びＫＯＳワクチン接種マウスの７２時
間での増加した耳の厚さは、スチューデントのt−検定
で模擬ワクチン接種マウスと統計学的に異なった(p＜
０.００１)。
ルスで免疫したマウスでの中和抗体及びＤＴＨの誘導 増加した耳の厚さa 中和抗体b (mm×10-2) 免疫 24時間 48時間 72時間 ＋Ｃ' −Ｃ' vＡc−gＥ1 7.0+/-1.2 7.4+/-1.5 14.8+/-1.7c >320 247 ＫＯＳ 8.3+/-1.7 14.7+/-2.7 15.5+/-3.2c >320 >320 模擬(AcNPV) 4.8+/-0.7 5.6+/-1.2 8.1+/-1.5 < 10 < 10 a ６マウス／グループの平均＋／−Ｓ．Ｄ． b 中和力価は、プラク数において５０％減少を生ずる
逆幾何学的平均として表わす。 c vＡc−gＥ１及びＫＯＳワクチン接種マウスの７２時
間での増加した耳の厚さは、スチューデントのt−検定
で模擬ワクチン接種マウスと統計学的に異なった(p＜
０.００１)。
【００４４】 Ｅ．gＥワクチン接種マウスにおけるＤＴＨ応答の誘導 gＥグリコプロテインに対する遅延型過敏症(ＤＴＨ)応
答を研究するため、６匹マウスのグループを上のように
３回ワクチン接種し、上記したようにＤＴＨ応答測定し
た。gＥ及びＫＯＳワクチン接種マウスは共にＤＴＨ応
答を現した。耳腫脹は攻撃後７２時間でピークに達し
(表１)、次いで３日後腫脹は減少した。７２時間で、g
Ｅワクチン接種マウスにおけるＤＴＨ応答(耳腫脹)はＨ
ＳＶ−１ワクチン接種マウスにおけるものと同等で、野
性型バキュロウイルスマウスにおける腫脹よりも有意に
高かった(p＜０.００１)。
答を研究するため、６匹マウスのグループを上のように
３回ワクチン接種し、上記したようにＤＴＨ応答測定し
た。gＥ及びＫＯＳワクチン接種マウスは共にＤＴＨ応
答を現した。耳腫脹は攻撃後７２時間でピークに達し
(表１)、次いで３日後腫脹は減少した。７２時間で、g
Ｅワクチン接種マウスにおけるＤＴＨ応答(耳腫脹)はＨ
ＳＶ−１ワクチン接種マウスにおけるものと同等で、野
性型バキュロウイルスマウスにおける腫脹よりも有意に
高かった(p＜０.００１)。
【００４５】Ｆ．gＥのワクチン接種によるＨＳＶ−１
攻撃からのマウスの防御 ワクチン接種マウスを、第３接種３週間後、ＨＳＶ−１
株ＭcＫraeのi．p．注射(２×１０6ＰＦＵ)により攻撃
した。以下の表２に示すように、発現gＥでワクチン接
種したマウスの９５％(２０の１９)は致死攻撃から延命
し、一方、模擬ワクチン接種マウスのわずか３９％(１
８の７)が延命した。加えてＫＯＳで免疫したマウスの
１００％が防御された(１１の１１)。従って、発現gＥ
による防御のレベルは、ＫＯＳのそれと類似しており、
模擬ワクチン接種グループより有意に高かった(p＜０.
０１)。
攻撃からのマウスの防御 ワクチン接種マウスを、第３接種３週間後、ＨＳＶ−１
株ＭcＫraeのi．p．注射(２×１０6ＰＦＵ)により攻撃
した。以下の表２に示すように、発現gＥでワクチン接
種したマウスの９５％(２０の１９)は致死攻撃から延命
し、一方、模擬ワクチン接種マウスのわずか３９％(１
８の７)が延命した。加えてＫＯＳで免疫したマウスの
１００％が防御された(１１の１１)。従って、発現gＥ
による防御のレベルは、ＫＯＳのそれと類似しており、
模擬ワクチン接種グループより有意に高かった(p＜０.
０１)。
【００４６】
【表２】ＨＳＶ−１gＥを発現する組換えバキュロウイ
ルスで免疫したマウスの致死腹腔内及び眼球攻撃 i．p．攻撃a 眼球攻撃b 免疫 生存／合計 生存／合計 バキュロウイルス−gＥ １９／２０c (９５％) ５／５c (１００％) ＫＯＳ １１／１１c (１００％) ５／５c (１００％) 模擬(ＡcＮＰＶ) ７／１８ (３９％) ０／５ (０％) a マウスは上記したように３回ワクチン接種し、２×
１０6ＰＦＵ／マウスでi．p．攻撃した。かっこ内の数
字は生存パーセントである。 b マウスは２回ワクチン接種し、２×１０5ＰＦＵ／眼
で眼球に攻撃した。 c バキュロウイルスgＥ及びＫＯＳワクチン接種マウス
の生存率(防御)は、模擬ワクチン接種生存率とは有意に
異なる(フィッシャーの正確な試験、p＜０.０１)。
ルスで免疫したマウスの致死腹腔内及び眼球攻撃 i．p．攻撃a 眼球攻撃b 免疫 生存／合計 生存／合計 バキュロウイルス−gＥ １９／２０c (９５％) ５／５c (１００％) ＫＯＳ １１／１１c (１００％) ５／５c (１００％) 模擬(ＡcＮＰＶ) ７／１８ (３９％) ０／５ (０％) a マウスは上記したように３回ワクチン接種し、２×
１０6ＰＦＵ／マウスでi．p．攻撃した。かっこ内の数
字は生存パーセントである。 b マウスは２回ワクチン接種し、２×１０5ＰＦＵ／眼
で眼球に攻撃した。 c バキュロウイルスgＥ及びＫＯＳワクチン接種マウス
の生存率(防御)は、模擬ワクチン接種生存率とは有意に
異なる(フィッシャーの正確な試験、p＜０.０１)。
【００４７】発現gＥによる全身性ワクチン接種が眼球
感染に対し防御するかどうかを測定するため、２回ワク
チン接種したマウスを最後のワクチン接種３週間後、２
×１０5ＰＦＵ／眼のＨＳＶ−１株ＭcＫraeで眼に攻撃
した。マウスを１０日間モニターした。５匹の模擬ワク
チン接種マウスの５匹(１００％)が有意な眼疾病を示
し、続くＨＳＶ−１攻撃で死亡した。これに対し、全５
匹のgＥ及び全５匹のＨＳＶ−１ワクチン接種マウスは
延命し、明らかな眼疾病は示さなかった(表２参照)。こ
れらの結果は、バキュロウイルス発現gＥの接種がi．
p．及び眼球致死ＨＳＶ−１攻撃に対してマウスを防御
できることを示唆する。
感染に対し防御するかどうかを測定するため、２回ワク
チン接種したマウスを最後のワクチン接種３週間後、２
×１０5ＰＦＵ／眼のＨＳＶ−１株ＭcＫraeで眼に攻撃
した。マウスを１０日間モニターした。５匹の模擬ワク
チン接種マウスの５匹(１００％)が有意な眼疾病を示
し、続くＨＳＶ−１攻撃で死亡した。これに対し、全５
匹のgＥ及び全５匹のＨＳＶ−１ワクチン接種マウスは
延命し、明らかな眼疾病は示さなかった(表２参照)。こ
れらの結果は、バキュロウイルス発現gＥの接種がi．
p．及び眼球致死ＨＳＶ−１攻撃に対してマウスを防御
できることを示唆する。
【００４８】要するに、本発明は、バキュロウイルス発
現系におけるgＥの高レベル発現を含む。この系におい
て発現されたgＥは、グリコシル化され細胞表面に輸送
された。発現gＥ対しマウスで造られた抗体は部分的補
体依存方法でＨＳＶ−１の感染性を中和し、gＥをワク
チン接種したマウスはＨＳＶ−１にＤＴＨ応答を示し
た。より重要なことはgＥを全身的にワクチン接種した
マウスは、致死腹腔内及び致死眼球ＨＳＶ−１攻撃を防
御し、ＨＳＶ−１に対する全てのサブユニットワクチン
においてgＥを有用且つ重要な成分とした。
現系におけるgＥの高レベル発現を含む。この系におい
て発現されたgＥは、グリコシル化され細胞表面に輸送
された。発現gＥ対しマウスで造られた抗体は部分的補
体依存方法でＨＳＶ−１の感染性を中和し、gＥをワク
チン接種したマウスはＨＳＶ−１にＤＴＨ応答を示し
た。より重要なことはgＥを全身的にワクチン接種した
マウスは、致死腹腔内及び致死眼球ＨＳＶ−１攻撃を防
御し、ＨＳＶ−１に対する全てのサブユニットワクチン
においてgＥを有用且つ重要な成分とした。
【００４９】Ｇ．gＥの精製 本発明のバキュロウイルス発現gＥは、免疫親和性クロ
マトグラフィ(文献１５)及び細胞培養物の上清媒体から
の分泌され、先を切り取ったgＥの収集(文献１６)を含
むがこれらに限らない標準的技術(文献１４)によってヒ
トの使用のために精製しうる。
マトグラフィ(文献１５)及び細胞培養物の上清媒体から
の分泌され、先を切り取ったgＥの収集(文献１６)を含
むがこれらに限らない標準的技術(文献１４)によってヒ
トの使用のために精製しうる。
【００５０】１．免疫親和性クロマトグラフィ 免疫親和性クロマトグラフィの方法は(文献１５)に記載
される通りである。本質的にはgＥ蛋白を回転瓶中、レ
ンズ豆レクチンクロマトグラフィ、免疫親和性クロマト
グラフィ及び限外濾過による濃縮の連続的段階により精
製した。第１段階に関し、２lの調整培地は１mＭＰＭＳ
Ｆ及び０.５％アプロチニンを補充し、次いでレンズ豆
レクチン−セファロース−４Ｂ(シグマ・ケミカル・カ
ンパニー・セントルイス・ＭＯ)の３０mlカラム上に５
０ml／hの流速でのせた。カラムを１００mlのＰＢＳ及
び０.５ＭＮalを含有する１００mlのＰＢＳで続けて洗
浄した。結合フラクションを０.５ＭＮaＣl、０.５Ｍα
−メチルマンノシド、０.１％トリトンＸ−１００及び
０.５％アプロチニンを含有するＰＢＳで溶出し、フラ
クションは固相酵素免疫測定法(エリザ)によりgＥにつ
いて検定した。
される通りである。本質的にはgＥ蛋白を回転瓶中、レ
ンズ豆レクチンクロマトグラフィ、免疫親和性クロマト
グラフィ及び限外濾過による濃縮の連続的段階により精
製した。第１段階に関し、２lの調整培地は１mＭＰＭＳ
Ｆ及び０.５％アプロチニンを補充し、次いでレンズ豆
レクチン−セファロース−４Ｂ(シグマ・ケミカル・カ
ンパニー・セントルイス・ＭＯ)の３０mlカラム上に５
０ml／hの流速でのせた。カラムを１００mlのＰＢＳ及
び０.５ＭＮalを含有する１００mlのＰＢＳで続けて洗
浄した。結合フラクションを０.５ＭＮaＣl、０.５Ｍα
−メチルマンノシド、０.１％トリトンＸ−１００及び
０.５％アプロチニンを含有するＰＢＳで溶出し、フラ
クションは固相酵素免疫測定法(エリザ)によりgＥにつ
いて検定した。
【００５１】ピークカラムフラクションをプールし、７
０mgのウサギ抗gＥポリクローナル抗体を臭化シアン活
性化セファロース４Ｂに連結することにより調製した１
０ml免疫親和性カラムに適用した。gＥ特異的ウサギ抗
血清をgＥ蛋白に対して作り、これは、ＨＳＶ−１感染
Ｖero細胞溶解質から調製ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により精製した。カップリングの前に、Ｉ
gＧ強化フラクションを３３％飽和硫酸アンモニウムに
よる沈澱によりgＥ特異的ウサギ抗血清から調製した。
レクチンカラム溶出を免疫親和性カラムに適用したの
ち、カラムを引き続いて２０mlの１０mＭトリス塩酸、p
Ｈ７.５並びにＳＤＳ及びＢＳＡの存在しない１０mlの
ＬＢで、次いで３０mlの１０mＭトリス塩酸、pＨ７.５
−０.５ＭＮaＣlで洗浄した。結合フラクションを３Ｍ
チオシアン酸アンモニウム、pＨ７.５で溶出し、gＥ蛋
白ピークをエリザ及びウエスタン分析により検出した。
ピークフラクションを濃縮し、ＰＭ１０膜(アミコン・
コーポレーション、デンバー、Ｍass．)を用いる限外濾
過により貯蔵緩衝液(１００mＭＮaＣl、１０mＭトリス
塩酸塩、pＨ７.５、１mＭＥＤＴＡ、７.５％グリセロー
ル)中で平衡化した。膜表面に吸収された蛋白を除くた
め、膜を０.１％トリトンＸ−１００を加えた貯蔵緩衝
液で洗浄し、次いでこの洗浄液を初めの濃縮フラクショ
ンと混ぜた。
０mgのウサギ抗gＥポリクローナル抗体を臭化シアン活
性化セファロース４Ｂに連結することにより調製した１
０ml免疫親和性カラムに適用した。gＥ特異的ウサギ抗
血清をgＥ蛋白に対して作り、これは、ＨＳＶ−１感染
Ｖero細胞溶解質から調製ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により精製した。カップリングの前に、Ｉ
gＧ強化フラクションを３３％飽和硫酸アンモニウムに
よる沈澱によりgＥ特異的ウサギ抗血清から調製した。
レクチンカラム溶出を免疫親和性カラムに適用したの
ち、カラムを引き続いて２０mlの１０mＭトリス塩酸、p
Ｈ７.５並びにＳＤＳ及びＢＳＡの存在しない１０mlの
ＬＢで、次いで３０mlの１０mＭトリス塩酸、pＨ７.５
−０.５ＭＮaＣlで洗浄した。結合フラクションを３Ｍ
チオシアン酸アンモニウム、pＨ７.５で溶出し、gＥ蛋
白ピークをエリザ及びウエスタン分析により検出した。
ピークフラクションを濃縮し、ＰＭ１０膜(アミコン・
コーポレーション、デンバー、Ｍass．)を用いる限外濾
過により貯蔵緩衝液(１００mＭＮaＣl、１０mＭトリス
塩酸塩、pＨ７.５、１mＭＥＤＴＡ、７.５％グリセロー
ル)中で平衡化した。膜表面に吸収された蛋白を除くた
め、膜を０.１％トリトンＸ−１００を加えた貯蔵緩衝
液で洗浄し、次いでこの洗浄液を初めの濃縮フラクショ
ンと混ぜた。
【００５２】２．分泌された先を切り取ったgＥの収集 分泌された、先を切り取ったgＥの収集方法は(文献１
６)に記載され、本明細書では繰り返さない。しかしな
がら、基本的に、トランスメンブランアンカー配列をコ
ードしている断片はgＥ遺伝子から除去した。次いで除
去されたgＥ遺伝子を再結合により再構築し、膜外及び
Ｃ末端細胞質内ドメインをコードしている枠配列に入れ
た。生成物は、抗gＥモノクローナル抗体を伴う細胞培
養の上清媒体の免疫沈澱によるトランスフェクション後
測定した。
６)に記載され、本明細書では繰り返さない。しかしな
がら、基本的に、トランスメンブランアンカー配列をコ
ードしている断片はgＥ遺伝子から除去した。次いで除
去されたgＥ遺伝子を再結合により再構築し、膜外及び
Ｃ末端細胞質内ドメインをコードしている枠配列に入れ
た。生成物は、抗gＥモノクローナル抗体を伴う細胞培
養の上清媒体の免疫沈澱によるトランスフェクション後
測定した。
【００５３】Ｈ．医薬組成物 本発明のgＥは、製薬上許容しうる担体賦形剤と混合し
て製薬上有用な組成物を調製する既知方法により処方で
きる。適当な賦形剤やそれらの処方は、例えばイー．ダ
ブリュー．マーチンによるレミントンズ・ファーマシュ
ーティカル・サイエンスズに記載される。これらの組成
物は、有効量のgＥを、宿主に有効に投与するのに適し
た製薬上許容しうる組成物を調製するために適当量の賦
形剤と共に含む。
て製薬上有用な組成物を調製する既知方法により処方で
きる。適当な賦形剤やそれらの処方は、例えばイー．ダ
ブリュー．マーチンによるレミントンズ・ファーマシュ
ーティカル・サイエンスズに記載される。これらの組成
物は、有効量のgＥを、宿主に有効に投与するのに適し
た製薬上許容しうる組成物を調製するために適当量の賦
形剤と共に含む。
【００５４】全く説明のためであって限定を目的とする
ものでなく、本発明による調製された非経口投与のため
の医薬製品の例を記載する。
ものでなく、本発明による調製された非経口投与のため
の医薬製品の例を記載する。
【００５５】ワクチンは、単一用量バイアルの凍結乾燥
バキュロウイルス発現ＨＳＶ−１gＥ単独として、又は
１又はそれ以上の免疫原性ＨＳＶ−１グリコプロテイ
ン、及びアラムを伴う希釈剤のバイアルと組合せて与え
うる。別法としてワクチンは多投与量バイアル及びアラ
ムを伴う希釈剤のバイアルで与えうる。
バキュロウイルス発現ＨＳＶ−１gＥ単独として、又は
１又はそれ以上の免疫原性ＨＳＶ−１グリコプロテイ
ン、及びアラムを伴う希釈剤のバイアルと組合せて与え
うる。別法としてワクチンは多投与量バイアル及びアラ
ムを伴う希釈剤のバイアルで与えうる。
【００５６】記載された本発明から、これらの方法が修
飾できることは明らかであり、修飾は、本発明の精神及
び目的から逸脱せず、この分野の当業者にとって明らか
である。従って本発明は、それらに限るものとして解釈
すべきでなく、添付の請求の範囲の法的範囲に限られる
と解釈すべきことが理解される。
飾できることは明らかであり、修飾は、本発明の精神及
び目的から逸脱せず、この分野の当業者にとって明らか
である。従って本発明は、それらに限るものとして解釈
すべきでなく、添付の請求の範囲の法的範囲に限られる
と解釈すべきことが理解される。
【００５７】引用文献 １．ブラックローズ、ビー．エイ．、クリシュナ．エ
ス．、ミンソン、エイ．シー．及びナシユ、エイ．エ
イ．ワクチニアウイルス組換え体において発現された単
純ヘルペスウイルス型１グリコプロテインの免疫原性、
バイロロジイ(Ｖirology)、１７７、７２７−７３６(１
９９０)。 ２．パラ、エム．エフ．、バウケ．アール．ビー．及び
スペア、ピー．ジー．単純ヘルペスウイルス型１のグリ
コプロテインgＥ: ビリオン感染性に対する及びfc結合
レセプターを誘発したウイルスに対する抗gＥの効果、
ジャーナル・オブ・バイロロジイ(Ｊ．Ｖirol．)、４
１、１２９−１３６(１９８２)。 ３．ドビン、ジー．フランク．アイ．及びフリードマ
ン、エイチ．エム．単純ヘルヘスウイルス型１は、単量
体免疫グロブリンＧ(ＩgＧ)及びＩgＧ錯体について異な
る結合特性を有する２つのＦcレセプターをコード化す
る。ジャーナル・オブ・バイロロジイ(Ｊ．Ｖirol．)、
６４,２７２５−２７３１(１９９０)。 ４．サマーズ．エム．ディ．及びスミス．ジー．エー．
バキュロウイルスベクター及び昆虫細胞培養方法の手
引、テキサス・アグリカルチュラル・エクスペリメンタ
ル・ステイション・ブレチン(Ｔexas Ａgricultural
ＥxperimentalＳtation Ｂulletin)＃１５５５(１９８
７)。 ５．ロック、ディ．エル．ネスバーン、エイ．ビー．ギ
アシ、エイチ．オング．ジェイ．、レウィス、ティ．エ
ル．、ロークンスガード、ジェイ．アール．及びウェシ
ュラー．エス．エル．単純ヘルペスウイルス型１で潜伏
的に感染したウサギの三節神経節におけるウイルスＲＮ
Ａsに関連する潜伏の検出、ジャーナル・オブ・バイロ
ロジイ(Ｊ．Ｖirol．)６１、３８２０−３８２６(１９
８７)。 ６．ゴルディン．エイ．アイ．、サンドリーゴルディ
ン、アール．エム．、レビン．エム．、及びグロギオ
ソ、ジェイ．シー．全ゲノムを表現する単純ヘルペスウ
イルス型１配列のクローニング、ジォーナル・オブ・バ
イロロジイ(Ｊ．Ｖirol．)、３８、５０−５８(１９８
１)。 ７．ラスキィ、エル．エイ．、ドゥベンコ．ディ．、シ
モンセン．シー．シー．、及びバーマン、ピー．ダブリ
ュ．分泌形のクローンされたグリコプロテインＤの予防
接種による致死単純ヘルペスウイルスからマウスの防
御、バイオテクノロジイ(ＢioＴech．)、４、５２７−
５３２(１９８４)。 ８．ギアシ、エイチ．、カイワー．アール．、ネスバー
ン．エイ．ビー．及びウェクスラー、エス．エル．高レ
ベルの生物学的に活性な単純ヘルペスウイルス型１グリ
コプロテインＤを発現する組換えバキュロウイルスの免
疫選択、アーカイブス・オブ・バイロロジィ(Ａrch．Ｖ
ir．)、印刷中(１９９１a)。 ９．チャタージー,エス．コガ．ジェイ．及びウィトレ
イ、アール．ジェイ．細胞融合の誘導における単純性ヘ
ルペスウイルス型１グリコプロテインＥの役割、ジャー
ナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ(Ｊ．Ｇen．Ｖi
rol．)７０、２１５７−２１６１(１９８９)。 １０．ハシュ、エイ．エイ．フィード、エイチ．ジェ
イ．及びフォーティーパパフィオ,アール。単純性ヘル
ペスウイルス感染マウスにおける細胞性免疫:遅延型過
敏症効果の誘導、特徴づけ及び抗ウイルス性効果、ジャ
ーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジイ(Ｊ．Ｇen．
Ｖirol．)、４８、３５１−３５７(１９８０)。 １１．マクゲオク、ディ．ジェイ．、ドラン、エイ．ド
ラン、エス．及びリクソン、エフ．ジェイ。単純性ヘル
ペスウイルス型１のゲノムにおける短ユニーク部分の配
列測定及び遺伝含量、ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジイ．(Ｊ．Ｍol．Ｂiol．)１８１、１−１
３(１９８５)。 １２．リー、ジェイ．ティ．ワイ．、パラ、エム．エ
フ．及びスペア、ピィ．ジェイ。単純性ヘルペスウイル
ス型１ＤＮＡのＳ成分におけるグリコプロテインgＤ及
びgＥの、及び他のポリペプチデの構造遺伝子の位置、
ジャーナル・オブ・バイロロジイ(Ｊ．Ｖirol．)４３、
４１−４９(１９８２)。 １３．ベル、エス．、クラネイジ、エム．、ボリシーウ
ィックズ、エル．及びミンソン、ティー。単純性ヘルペ
スウイルス型１のグリコプロテイン及びＩを発現する組
換えワクチニアウイルスによる免疫グロブリンＧＦcレ
セプターの誘導、ジャーナル・オブ・バイロロジイ
(Ｊ．Ｖirol．)６４、２１８１−２１８６(１９９０)。 １４．マニアティス．ティ．、フラッツ、オー．エフ．
及びサンブルック．ジェイ．分子クローニング、実験手
引書、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリィ
ー、コールド・スプリング・ハーバー、Ｎ．Ｙ． １５．ハクル．シー．、バーク．アール．エル．、スツ
ーグ、エル．エル．、サンチェズーペスカダー、エ
ル．、バン・ネスト、ジィ．マシアーズ、エフ及びディ
ナ、ディ．哺乳動物細胞における細胞内及び分泌形の単
純性ヘルペスウイルス型１グリコプロテインgＢの発現
ジャーナル・オブ・バイロロジイ(Ｊnl．Ｖirol．)６１
(２)、３１５−３２５(１９８７)。 １６．マンサービジ、アール．、グロッシィ、エム．ア
ール．グアランドリ、アール、バルドニ、ピー．ジ
ィ．、マーチニ、エイ．ロタラ、エイ．、リメッシ、ピ
ー．、ディ・ルカ、ディ．、カッサイ、イー．及びバー
バンティーブロダノ、ジィ．ＢＫウイルスエピゾームベ
クターでヒト細胞において本質的に発現された分泌組換
えグリコプロテインＢによる単純性ヘルペスウイルス型
１致死及び潜伏感染からの防御、ジャーナル・オブ・バ
イロロジイ(Ｊnl．Ｖirol．)６４(１)、４３１−４３
６。
ス．、ミンソン、エイ．シー．及びナシユ、エイ．エ
イ．ワクチニアウイルス組換え体において発現された単
純ヘルペスウイルス型１グリコプロテインの免疫原性、
バイロロジイ(Ｖirology)、１７７、７２７−７３６(１
９９０)。 ２．パラ、エム．エフ．、バウケ．アール．ビー．及び
スペア、ピー．ジー．単純ヘルペスウイルス型１のグリ
コプロテインgＥ: ビリオン感染性に対する及びfc結合
レセプターを誘発したウイルスに対する抗gＥの効果、
ジャーナル・オブ・バイロロジイ(Ｊ．Ｖirol．)、４
１、１２９−１３６(１９８２)。 ３．ドビン、ジー．フランク．アイ．及びフリードマ
ン、エイチ．エム．単純ヘルヘスウイルス型１は、単量
体免疫グロブリンＧ(ＩgＧ)及びＩgＧ錯体について異な
る結合特性を有する２つのＦcレセプターをコード化す
る。ジャーナル・オブ・バイロロジイ(Ｊ．Ｖirol．)、
６４,２７２５−２７３１(１９９０)。 ４．サマーズ．エム．ディ．及びスミス．ジー．エー．
バキュロウイルスベクター及び昆虫細胞培養方法の手
引、テキサス・アグリカルチュラル・エクスペリメンタ
ル・ステイション・ブレチン(Ｔexas Ａgricultural
ＥxperimentalＳtation Ｂulletin)＃１５５５(１９８
７)。 ５．ロック、ディ．エル．ネスバーン、エイ．ビー．ギ
アシ、エイチ．オング．ジェイ．、レウィス、ティ．エ
ル．、ロークンスガード、ジェイ．アール．及びウェシ
ュラー．エス．エル．単純ヘルペスウイルス型１で潜伏
的に感染したウサギの三節神経節におけるウイルスＲＮ
Ａsに関連する潜伏の検出、ジャーナル・オブ・バイロ
ロジイ(Ｊ．Ｖirol．)６１、３８２０−３８２６(１９
８７)。 ６．ゴルディン．エイ．アイ．、サンドリーゴルディ
ン、アール．エム．、レビン．エム．、及びグロギオ
ソ、ジェイ．シー．全ゲノムを表現する単純ヘルペスウ
イルス型１配列のクローニング、ジォーナル・オブ・バ
イロロジイ(Ｊ．Ｖirol．)、３８、５０−５８(１９８
１)。 ７．ラスキィ、エル．エイ．、ドゥベンコ．ディ．、シ
モンセン．シー．シー．、及びバーマン、ピー．ダブリ
ュ．分泌形のクローンされたグリコプロテインＤの予防
接種による致死単純ヘルペスウイルスからマウスの防
御、バイオテクノロジイ(ＢioＴech．)、４、５２７−
５３２(１９８４)。 ８．ギアシ、エイチ．、カイワー．アール．、ネスバー
ン．エイ．ビー．及びウェクスラー、エス．エル．高レ
ベルの生物学的に活性な単純ヘルペスウイルス型１グリ
コプロテインＤを発現する組換えバキュロウイルスの免
疫選択、アーカイブス・オブ・バイロロジィ(Ａrch．Ｖ
ir．)、印刷中(１９９１a)。 ９．チャタージー,エス．コガ．ジェイ．及びウィトレ
イ、アール．ジェイ．細胞融合の誘導における単純性ヘ
ルペスウイルス型１グリコプロテインＥの役割、ジャー
ナル・オブ・ジェネラル・バイロロジィ(Ｊ．Ｇen．Ｖi
rol．)７０、２１５７−２１６１(１９８９)。 １０．ハシュ、エイ．エイ．フィード、エイチ．ジェ
イ．及びフォーティーパパフィオ,アール。単純性ヘル
ペスウイルス感染マウスにおける細胞性免疫:遅延型過
敏症効果の誘導、特徴づけ及び抗ウイルス性効果、ジャ
ーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジイ(Ｊ．Ｇen．
Ｖirol．)、４８、３５１−３５７(１９８０)。 １１．マクゲオク、ディ．ジェイ．、ドラン、エイ．ド
ラン、エス．及びリクソン、エフ．ジェイ。単純性ヘル
ペスウイルス型１のゲノムにおける短ユニーク部分の配
列測定及び遺伝含量、ジャーナル・オブ・モレキュラー
・バイオロジイ．(Ｊ．Ｍol．Ｂiol．)１８１、１−１
３(１９８５)。 １２．リー、ジェイ．ティ．ワイ．、パラ、エム．エ
フ．及びスペア、ピィ．ジェイ。単純性ヘルペスウイル
ス型１ＤＮＡのＳ成分におけるグリコプロテインgＤ及
びgＥの、及び他のポリペプチデの構造遺伝子の位置、
ジャーナル・オブ・バイロロジイ(Ｊ．Ｖirol．)４３、
４１−４９(１９８２)。 １３．ベル、エス．、クラネイジ、エム．、ボリシーウ
ィックズ、エル．及びミンソン、ティー。単純性ヘルペ
スウイルス型１のグリコプロテイン及びＩを発現する組
換えワクチニアウイルスによる免疫グロブリンＧＦcレ
セプターの誘導、ジャーナル・オブ・バイロロジイ
(Ｊ．Ｖirol．)６４、２１８１−２１８６(１９９０)。 １４．マニアティス．ティ．、フラッツ、オー．エフ．
及びサンブルック．ジェイ．分子クローニング、実験手
引書、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリィ
ー、コールド・スプリング・ハーバー、Ｎ．Ｙ． １５．ハクル．シー．、バーク．アール．エル．、スツ
ーグ、エル．エル．、サンチェズーペスカダー、エ
ル．、バン・ネスト、ジィ．マシアーズ、エフ及びディ
ナ、ディ．哺乳動物細胞における細胞内及び分泌形の単
純性ヘルペスウイルス型１グリコプロテインgＢの発現
ジャーナル・オブ・バイロロジイ(Ｊnl．Ｖirol．)６１
(２)、３１５−３２５(１９８７)。 １６．マンサービジ、アール．、グロッシィ、エム．ア
ール．グアランドリ、アール、バルドニ、ピー．ジ
ィ．、マーチニ、エイ．ロタラ、エイ．、リメッシ、ピ
ー．、ディ・ルカ、ディ．、カッサイ、イー．及びバー
バンティーブロダノ、ジィ．ＢＫウイルスエピゾームベ
クターでヒト細胞において本質的に発現された分泌組換
えグリコプロテインＢによる単純性ヘルペスウイルス型
１致死及び潜伏感染からの防御、ジャーナル・オブ・バ
イロロジイ(Ｊnl．Ｖirol．)６４(１)、４３１−４３
６。
【００５８】
配列番号：１ 配列の長さ：1822塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列 ATGGATCGCG GGGCGGTGGT GGGGTTTCTT CTCGGTGTTT GTGTTGTATC GTGCTTGGCG 60 GGAACGCCCA AAACGTCCTG GAGACGGGTG AGTGTCGGCG AGGACGTTTC GTTGCTTCCA 120 GCTCCGGGGC CTACGGGGCG CGGCCCGACC CAGAAACTAC TATGGGCCGT GGAACCCCTG 180 GATGGGTGCG GCCCCTTACA CCCGTCGTGG GTCTCGCTGA TGCCCCCCAA GCAGGTGCCC 240 GAGACGGTCG TGGATGCGGC GTGCATGCGC GCTCCGGTCC CGCTGGCGAT GGCGTACGCC 300 CCCCCGGCCC CATCTGCGAC CGGGGGTCTA CGAACGGACT TCGTGTGGCA GGAGCGCGCG 360 GCCGTGGTTA ACCGGAGTCT GGTTATTCAC GGGGTCCGAG AGACGGACAG CGGCCTGTAT 420 ACCCTGTCCG TGGGCGACAT AAAGGACCCG GCTCGCCAAG TGGCCTCGGT GGTCCTGGTG 480 GTGCAACCGG CCCCAGTTCC GACCCCACCC CCGACCCCAG CCGATTACGA CGAGGATGAC 540 AATGACGAGG GCGAGGACGA AAGTCTCGCC GGCACTCCCG CCAGCGGGAC CCCCCGGCTC 600 CCGCCTCCCC CCGCCCCCCC GAGGTCTTGG CCCAGCGCCC CCGAAGTCTC ACATGTGCGT 660 GGGGTGACCG TGCGTATGGA GACTCCGGAA GCTATCCTGT TTTCCCCCGG GGAGACGTTC 720 AGCACGAACG TCTCCATCCA TGCCATCGCC CACGACGACC AGACCTACTC CATGGACGTC 780 GTCTGGTTGA GGTTCGACGT GCCGACCTCG TGTGCCGAGA TGCGAATATA CGAATCGTGT 840 CTGTATCACC CGCAGCTCCC AGAATGTCTG TCCCCGGCCG ACGCGCCGTG CGCCGCGAGT 900 ACGTGGACGT CTCGCCTGGC CGTCCGCAGC TACGCGGGGT GTTCCAGAAC AAACCCCCCA 960 CCGCGCTGTT CGGCCGAGGC TCACATGGAG CCCGTCCCGG GGCTGGCGTG GCAGGCGGCC 1020 TCCGTCAATC TGGAGTTCCG GGACGCGTCC CCACAACACT CCGGCCTGTA TCTGTGTGTG 1080 GTGTACGTCA ACGACCATAT TCACGCCTGG GGCCACATTA CCATCAGCAC CGCGGCGCAG 1140 TACCGGAACG CGGTGGTGGA ACAGCCCCTC CCACAGCGCG GCGCGGATTT GGCCGAGCCC 1200 ACCCACCCGC ACGTCGGGGC CCCTCCCCAC GCGCCCCCAA CCCACGGCGC CCTGCGGTTA 1260 GGGGCGGTGA TGGGGGCCGC CCTGCTGCTG TCTGCACTGG GGTTGTCGGT GTGGGCGTGT 1320 ATGACCTGTT GGCGCAGGCG TGCCTGGCGG GCGGTTAAAA GCAGGGCCTC GGGTAAGGGG 1380 CCCACGTACA TTCGCGTGGC CGACAGCGAG CTGTACGCGG ACTGGAGCTC GGACAGCGAG 1440 GGAGAACGCG ACCAGGTCCC GTGGCTGGCC CCCCCGGAGA GACCCGACTC TCCCTCCACC 1500 AATGGATCCG GCTTTGAGAT CTTATCACCA ACGGCTCCGT CTGTATACCC CCGTAGCGAT 1560 GGGCATCAAT CTCGCCGCCA GCTCACAACC TTTGGATCCG GAAGGCCCGA TCGCCGTTAC 1620 TCCCAGGCCT CCGATTCGTC CGTCTTCTGG TAAGGCGCCC CATCCCGAGG CCCCACGTCG 1680 GTCGCCGAAC TGGGCGACCG CCGGCGAGGT GGACGTCGGA GACGAGCTAA TCGCGATTTC 1740 CGACGAACGC GGACCCCCCC GACATGACCG CCCGCCCCTC GCCACGTCGA CCGCGCCCTC 1800 GCCACACCCG CGACCCCCGG GC 1822
【図１】 ＨＳＶ−１株ＫＯＳのgＥ遺伝子を含む組換
えベクターの調製を示す。
えベクターの調製を示す。
【図２】 バキュロウイルスベクターに挿入された１,
８２２ヌクレオチド分離gＥ断片の範囲を示す。
８２２ヌクレオチド分離gＥ断片の範囲を示す。
【図３】 最終ベクターにおけるgＥ遺伝子の開始近く
のポリヘドリン遺伝子プロモーター配列を示す。
のポリヘドリン遺伝子プロモーター配列を示す。
【図４】 バキュロウイルス−gＥ発現及びグリコシル
化のウエスタンブロット分析を示す薄膜の写真である。
化のウエスタンブロット分析を示す薄膜の写真である。
【図５】 クーマシーブルー染色による発現gＥの検出
を示す薄膜の写真である。
を示す薄膜の写真である。
【図６】 抗バキュロウイルス−gＥ血清によるＨＳＶ
−１感染性の中和を示す。
−１感染性の中和を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:92） (72)発明者 スティーブン・ルイス・ウェクスラー アメリカ合衆国91361カリフォルニア州 ウエストレイク・ビレッジ、セブンオー クス・コート4401番 (72)発明者 ホマヨン・ギアシ アメリカ合衆国90034カリフォルニア州 ロサンジェルス、クレスト・ドライブ 1904番 (56)参考文献 ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．177, （1990），Ｐ．727−736 Ｊ．ＶＩＲＯＬ．，ＶＯＬ．41, （1982）Ｐ．129−136 ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．，ＶＯ Ｌ．３，（1983）Ｐ．2156− (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) A61K 39/245 C12P 21/00 - 21/02 C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/035 C12N 5/00 - 5/10 C12N 7/00 - 7/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (16)
- 【請求項１】 (a) 完全長のＨＳＶ−１gＥとトラン
スメンブランアンカー配列を除去したＨＳＶ−１gＥの
少なくとも１つをコードする遺伝子配列および(b) 該
遺伝子配列がその調節要素に機能的に結合しており、バ
キュロウイルス発現系で作動するプロモーター配列を含
む遺伝子構築体を有する組換えバキュロウイルスの発現
により産生される、ＨＳＶ−１gＥを含む、単純ヘルペ
スウイルス感染の処置または予防のためのワクチン。 - 【請求項２】 遺伝子構築体がpＡc−gＥを含む、請求
項１記載のワクチン。 - 【請求項３】 更に薬理学的に許容可能な担体を含む、
請求項１記載のワクチン。 - 【請求項４】 更に少なくとも一つのアジュバントを含
む、請求項１記載のワクチン。 - 【請求項５】 アジュバントがアラム、フロインド、Ｍ
ＴＰ−ＰＥおよびＩＳＣＯＭｓからなる群から選択され
る、請求項４記載のワクチン。 - 【請求項６】 プロモーターがポリヘドロン遺伝子プロ
モーターである、請求項１記載のワクチン。 - 【請求項７】 完全長のＨＳＶ−１gＥとトランスメン
ブランアンカー配列を除去したＨＳＶ−１gＥの少なく
とも１つをコードする遺伝子配列および該遺伝子配列が
その調節要素に機能的に結合しており、バキュロウイル
ス発現系で作動するプロモーター配列を含む遺伝子構築
体を有する組換えバキュロウイルスを調製する工程、 組換えバキュロウイルスを第１群の宿主細胞に挿入する
工程、 この宿主細胞を培養する工程および培養物からＨＳＶ−
１gＥを回収する工程を含む、単純ヘルペスウイルス感
染の処置または予防のためのワクチンの製造法。 - 【請求項８】 ＨＳＶ−１gＥと薬理学的に許容可能な
担体を含むエマルジョンを調製する工程を更に含む、請
求項７記載の方法。 - 【請求項９】 エマルジョンが少なくとも一つのアジュ
バントを含む、請求項８記載の方法。 - 【請求項１０】 アジュバントがアラム、フロインド、
ＭＴＰ−ＰＥおよびＩＳＣＯＭｓからなる群から選択さ
れる、請求項９記載の方法。 - 【請求項１１】 組換えバキュロウイルスが遺伝子構築
体をバキュロウイルスゲノムへ組込むことによって調製
されるものである、請求項７記載の方法。 - 【請求項１２】 遺伝子構築体がpＡc−gＥを含む、請
求項７記載の方法。 - 【請求項１３】 第１群の宿主細胞が遺伝子構築体を発
現する昆虫細胞である、請求項７記載の方法。 - 【請求項１４】 昆虫細胞がスポドプテラ・フルギペル
ダ由来のものである、請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 プロモーターがポリヘドロン遺伝子プ
ロモーターである、請求項７記載の方法。 - 【請求項１６】 更に第２群の宿主細胞を遺伝子構築体
と野生型バキュロウイルスＤＮＡで共形質転換する工程
と第２群の宿主細胞をスクリーニングして組換えバキュ
ロウイルスを保持する細胞を同定する工程を含む、請求
項７記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US84592092A | 1992-03-04 | 1992-03-04 | |
| US845920 | 1992-03-04 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0614769A JPH0614769A (ja) | 1994-01-25 |
| JP2759035B2 true JP2759035B2 (ja) | 1998-05-28 |
Family
ID=25296432
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4378493A Expired - Fee Related JP2759035B2 (ja) | 1992-03-04 | 1993-03-04 | 単純ヘルペスウイルス感染防御用ワクチン |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0561525A1 (ja) |
| JP (1) | JP2759035B2 (ja) |
| AU (1) | AU660528B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6100064A (en) * | 1984-04-06 | 2000-08-08 | Chiron Corporation | Secreted viral proteins useful for vaccines and diagnostics |
| CA2090303A1 (en) * | 1992-03-18 | 1993-09-19 | Anthony B. Nesburn | Process for the expression of herpes simplex virus type 1 glycoprotein 1 and methods of use |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5171568A (en) * | 1984-04-06 | 1992-12-15 | Chiron Corporation | Recombinant herpes simplex gb-gd vaccine |
| US5679348A (en) * | 1992-02-03 | 1997-10-21 | Cedars-Sinai Medical Center | Immunotherapy for recurrent HSV infections |
| CA2090303A1 (en) * | 1992-03-18 | 1993-09-19 | Anthony B. Nesburn | Process for the expression of herpes simplex virus type 1 glycoprotein 1 and methods of use |
-
1993
- 1993-03-02 EP EP19930301572 patent/EP0561525A1/en not_active Withdrawn
- 1993-03-03 AU AU33959/93A patent/AU660528B2/en not_active Ceased
- 1993-03-04 JP JP4378493A patent/JP2759035B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｊ．ＶＩＲＯＬ．，ＶＯＬ．４１，（１９８２）Ｐ．１２９−１３６ |
| ＭＯＬ．ＣＥＬＬ．ＢＩＯＬ．，ＶＯＬ．３，（１９８３）Ｐ．２１５６− |
| ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ＶＯＬ．１７７，（１９９０），Ｐ．７２７−７３６ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0561525A1 (en) | 1993-09-22 |
| JPH0614769A (ja) | 1994-01-25 |
| AU660528B2 (en) | 1995-06-29 |
| AU3395993A (en) | 1993-09-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Schmaljohn et al. | Antigenic subunits of Hantaan virus expressed by baculovirus and vaccinia virus recombinants | |
| Osterrieder et al. | Protection against EHV-1 challenge infection in the murine model after vaccination with various formulations of recombinant glycoprotein gp14 (gB) | |
| CN107921115B (zh) | 新颖杆状病毒载体及使用方法 | |
| US20240123053A1 (en) | Coronavirus vaccine through nasal immunization | |
| Marín et al. | Immunogenic properties of rabbit haemorrhagic disease virus structural protein VP60 expressed by a recombinant baculovirus: an efficient vaccine | |
| Dummer et al. | Bovine herpesvirus glycoprotein D: a review of its structural characteristics and applications in vaccinology | |
| Ghiasi et al. | Baculovirus-expressed glycoprotein E (gE) of herpes simplex virus type-1 (HSV-1) protects mice against lethal intraperitoneal and lethal ocular HSV-1 challenge | |
| EP0538341B1 (en) | Ehv-4 glycoprotein vaccine | |
| York et al. | Vaccination with affinity‐purified glycoproteins protects chickens against infectious laryngotracheitis herpesvirus | |
| US11020472B2 (en) | Multivalent recombinant SPV | |
| US5632992A (en) | Process for the expression of herpes simplex virus type 1 glycoprotein E and method of use | |
| Ghiasi et al. | Baculovirus expressed herpes simplex virus type 1 glycoprotein C protects mice from lethal HSV-1 infection | |
| Yao et al. | Comparison of immune responses to different foot-and-mouth disease genetically engineered vaccines in guinea pigs | |
| Ghiasi et al. | Expression of herpes simplex virus type 1 glycoprotein I in baculovirus: preliminary biochemical characterization and protection studies | |
| Ghiasi et al. | The US5 open reading frame of herpes simplex virus type 1 does encode a glycoprotein (gJ) | |
| JP2759035B2 (ja) | 単純ヘルペスウイルス感染防御用ワクチン | |
| Wachsman et al. | Regulation of expression of herpes simplex virus (HSV) glycoprotein D in vaccinia recombinants affects their ability to protect from cutaneous HSV-2 disease | |
| Ghiasi et al. | Baculovirus-expressed glycoprotein G of herpes simplex virus type 1 partially protects vaccinated mice against lethal HSV-1 challenge | |
| Ghiasi et al. | Expression and characterization of baculovirus expressed herpes simplex virus type 1 glycoprotein L | |
| Tuchiya et al. | Characterization of rabies virus glycoprotein expressed by recombinant baculovirus | |
| JP2003230396A (ja) | ｇｐ３５０／２２０非スプライシング変異体 | |
| JP2759036B2 (ja) | 単純ヘルペスウイルス感染に対するワクチン | |
| EP0531728A1 (en) | HSV gD2 Baculovirus expression system | |
| JP2023545524A (ja) | 組換えｈｖｔ及びその使用 | |
| JPH07236489A (ja) | ウマヘルペスウイルス感染からウマを防御するためのワクチン |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |