JPH07236489A - ウマヘルペスウイルス感染からウマを防御するためのワクチン - Google Patents
ウマヘルペスウイルス感染からウマを防御するためのワクチンInfo
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- JPH07236489A JPH07236489A JP6316814A JP31681494A JPH07236489A JP H07236489 A JPH07236489 A JP H07236489A JP 6316814 A JP6316814 A JP 6316814A JP 31681494 A JP31681494 A JP 31681494A JP H07236489 A JPH07236489 A JP H07236489A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 ＥＨＶゲノムの遺伝子１５内に挿入または欠
失を有するＥＨＶを含むウマヘルペスウイルス（ＥＨ
Ｖ）ワクチンを提供する。 【効果】 ウマ病原体に対する確実で安全な、長期持続
性のある免疫が与えられる。
失を有するＥＨＶを含むウマヘルペスウイルス（ＥＨ
Ｖ）ワクチンを提供する。 【効果】 ウマ病原体に対する確実で安全な、長期持続
性のある免疫が与えられる。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ウマヘルペスウイルス
突然変異株、ウマヘルペスウイルス核酸配列を含む組換
えＤＮＡ分子、該組換えＤＮＡ分子でトランスフェクト
した又はウマヘルペスウイルス突然変異株に感染させた
宿主細胞、及び前記ウマヘルペスウイルス突然変異株を
含むワクチンに関する。
突然変異株、ウマヘルペスウイルス核酸配列を含む組換
えＤＮＡ分子、該組換えＤＮＡ分子でトランスフェクト
した又はウマヘルペスウイルス突然変異株に感染させた
宿主細胞、及び前記ウマヘルペスウイルス突然変異株を
含むワクチンに関する。
【０００２】
【従来の技術】ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）は、潜
在性疾病から致命的疾病に至る様々なウマ感染を引き起
こす抗原の異なる生物学的要素群を含んでいる。
在性疾病から致命的疾病に至る様々なウマ感染を引き起
こす抗原の異なる生物学的要素群を含んでいる。
【０００３】ウマヘルペスウイルス−１（ＥＨＶ−１）
は至る所に存在し、流産の流行、気道疾患及び中枢神経
系疾患に関連する経済的に非常に重要なウマ病原体であ
る。幼少ウマの上方気道に一次感染すると熱性疾患が生
じ、これは８〜１０日間続く。既に免疫のあるメスウマ
が気道から再度感染して、症状が現れないことがあり得
る。その結果、一般に兆候なしに流産をおこす。神経系
症候群は、呼吸器疾患又は流産に関連し、年齢を問わず
両性の動物に作用して、共調不能、薄弱（ｗｅａｋｎｅ
ｓｓ）及び後方マヒを引き起こし得る（Ｔｅｌｆｏｒ
ｄ， Ｅ．Ａ．Ｒ．等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８９，
３０４−３１６，１９９２）。
は至る所に存在し、流産の流行、気道疾患及び中枢神経
系疾患に関連する経済的に非常に重要なウマ病原体であ
る。幼少ウマの上方気道に一次感染すると熱性疾患が生
じ、これは８〜１０日間続く。既に免疫のあるメスウマ
が気道から再度感染して、症状が現れないことがあり得
る。その結果、一般に兆候なしに流産をおこす。神経系
症候群は、呼吸器疾患又は流産に関連し、年齢を問わず
両性の動物に作用して、共調不能、薄弱（ｗｅａｋｎｅ
ｓｓ）及び後方マヒを引き起こし得る（Ｔｅｌｆｏｒ
ｄ， Ｅ．Ａ．Ｒ．等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １８９，
３０４−３１６，１９９２）。
【０００４】ＥＨＶ−２、即ちウマサイトメガロウイル
スは、至る所に存在し、抗原が異種であり、通常成長が
遅く、既知の疾病を引き起こさないウイルス群である。
スは、至る所に存在し、抗原が異種であり、通常成長が
遅く、既知の疾病を引き起こさないウイルス群である。
【０００５】ＥＨＶ−３、即ちウマコウ疹ウイルスは、
メスウマ及びオスウマの比較的軽い生殖器表面の発疹を
引き起こす病原体である。
メスウマ及びオスウマの比較的軽い生殖器表面の発疹を
引き起こす病原体である。
【０００６】以前にＥＨＶ−１の亜型２として分類され
たＥＨＶ−４は、散発性ＥＨＶ−４誘発流産が報告され
てはいるが、主に呼吸器疾患に関連する。
たＥＨＶ−４は、散発性ＥＨＶ−４誘発流産が報告され
てはいるが、主に呼吸器疾患に関連する。
【０００７】ＥＨＶのゲノム構造は、２個の共有結合セ
グメント（ＵL及びＵS）からなる二本鎖線状ＤＮＡ分子
を含む他のαヘルペスウイルスのゲノム構造と類似して
いる。ＵSセグメントは逆方向反復によりフランキング
されている。
グメント（ＵL及びＵS）からなる二本鎖線状ＤＮＡ分子
を含む他のαヘルペスウイルスのゲノム構造と類似して
いる。ＵSセグメントは逆方向反復によりフランキング
されている。
【０００８】ＥＨＶ−１ゲノムの特性分析はＷｈａｌｌ
ｅｙ， Ｊ．Ｍ．等により報告されており（Ｊ． Ｇｅ
ｎ． Ｖｉｒｏｌ． ５７， ３０７−３２３， １９
８１）、ＥＨＶ−４ゲノムの特性分析はＣｕｌｌｉｎａ
ｎｅ， Ａ．Ａ．等により開示されている（Ｊ． Ｇｅ
ｎ． Ｖｉｒｏｌ． ６９， １５７５−１５９０，１
９８８）。
ｅｙ， Ｊ．Ｍ．等により報告されており（Ｊ． Ｇｅ
ｎ． Ｖｉｒｏｌ． ５７， ３０７−３２３， １９
８１）、ＥＨＶ−４ゲノムの特性分析はＣｕｌｌｉｎａ
ｎｅ， Ａ．Ａ．等により開示されている（Ｊ． Ｇｅ
ｎ． Ｖｉｒｏｌ． ６９， １５７５−１５９０，１
９８８）。
【０００９】ＥＨＶの分子生物学に関する研究の大半は
ＥＨＶ−１に関するものであった。最近、ＥＨＶ−１の
完全ＤＮＡ配列が１９９２年にＴｅｌｆｏｒｄ等により
発表された（上掲）。ゲノムが約１５０，０００ｂｐか
らなることが判明し、現在までに７６個の異なる遺伝子
が認識されている。これらの遺伝子は、ＥＨＶ−１ゲノ
ム上に正確にマッピングされ、これらの遺伝子と対応す
るＨＳＶ−１類似体との関係がこの文献内で決定されて
いる。これは、ＨＳＶ−１類似体ＵL４５と共直線性の
ＥＨＶ−１ゲノムのＵLセグメント内にマッピングされ
た遺伝子１５を含んでいる。以前には、ＥＨＶ−１の
（糖）タンパク質をコードする数種の遺伝子、例えばｇ
Ｂ（Ｗｈａｌｌｅｙ， Ｊ．Ｍ．等，Ｊ． Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ． ７０， ３８３−３９４）、ｇＣ（Ａｌ
ｌｅｎ， Ｇ．Ｐ．等，Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．
６２， ２８５０−２８５８， １９８８）、ｇＤ，
ｇＩ，ｇＥ（Ａｕｄｏｎｎｅｔ， Ｊ．Ｃ．等，Ｊ．
Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７１， ２９６９−２９７
８， １９９０）、ｇＨ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｇ．
Ｒ．等，ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ １， ２４１−２
４９， １９９１）、及びＴＫ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，
Ｇ．Ｒ．等， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．
１６， １１３０３−１１３１７， １９８８）がマ
ッピングされた。
ＥＨＶ−１に関するものであった。最近、ＥＨＶ−１の
完全ＤＮＡ配列が１９９２年にＴｅｌｆｏｒｄ等により
発表された（上掲）。ゲノムが約１５０，０００ｂｐか
らなることが判明し、現在までに７６個の異なる遺伝子
が認識されている。これらの遺伝子は、ＥＨＶ−１ゲノ
ム上に正確にマッピングされ、これらの遺伝子と対応す
るＨＳＶ−１類似体との関係がこの文献内で決定されて
いる。これは、ＨＳＶ−１類似体ＵL４５と共直線性の
ＥＨＶ−１ゲノムのＵLセグメント内にマッピングされ
た遺伝子１５を含んでいる。以前には、ＥＨＶ−１の
（糖）タンパク質をコードする数種の遺伝子、例えばｇ
Ｂ（Ｗｈａｌｌｅｙ， Ｊ．Ｍ．等，Ｊ． Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ． ７０， ３８３−３９４）、ｇＣ（Ａｌ
ｌｅｎ， Ｇ．Ｐ．等，Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ．
６２， ２８５０−２８５８， １９８８）、ｇＤ，
ｇＩ，ｇＥ（Ａｕｄｏｎｎｅｔ， Ｊ．Ｃ．等，Ｊ．
Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７１， ２９６９−２９７
８， １９９０）、ｇＨ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ， Ｇ．
Ｒ．等，ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ １， ２４１−２
４９， １９９１）、及びＴＫ（Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，
Ｇ．Ｒ．等， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．
１６， １１３０３−１１３１７， １９８８）がマ
ッピングされた。
【００１０】ＥＨＶ−４の（糖）タンパク質をコードす
る数種の遺伝子、例えばｇＨ及びｇＢ（Ｎｉｃｏｌｓｏ
ｎ， Ｌ．等，Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７１，
１７９３−１８００， １９９０）、ｇＥ（Ｃｕｌｌ
ｉｎａｎｅ， Ａ．等，１９８８、上掲）、ＴＫ（ＰＣ
Ｔ出願ＷＯ９２／０１０４５）、並びにｇＣ（Ｎｉｃｏ
ｌｓｏｎ， Ｌ．等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９， ３
７８−３８７， １９９０）のマップ位置及びヌクレオ
チド配列も決定されている。後者は、ＥＨＶ−１遺伝子
１５類似体のヌクレオチド配列も開示している。
る数種の遺伝子、例えばｇＨ及びｇＢ（Ｎｉｃｏｌｓｏ
ｎ， Ｌ．等，Ｊ． Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ． ７１，
１７９３−１８００， １９９０）、ｇＥ（Ｃｕｌｌ
ｉｎａｎｅ， Ａ．等，１９８８、上掲）、ＴＫ（ＰＣ
Ｔ出願ＷＯ９２／０１０４５）、並びにｇＣ（Ｎｉｃｏ
ｌｓｏｎ， Ｌ．等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９， ３
７８−３８７， １９９０）のマップ位置及びヌクレオ
チド配列も決定されている。後者は、ＥＨＶ−１遺伝子
１５類似体のヌクレオチド配列も開示している。
【００１１】更に、ＥＨＶ−１遺伝子及びＥＨＶ−４遺
伝子が互いに非常に共直線性であり、またＨＳＶ−１の
対応部分（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）とも共直線性で
あることが実証された（Ｔｅｌｆｏｒｄ等、１９９２
年、 上掲； Ｃｕｌｌｉｎａｎｅ等、１９８８年、上
掲）。このことは、特定ウイルスのある遺伝子が他のヘ
ルペスウイルスに位置的な対応部分を有することを示し
ている。
伝子が互いに非常に共直線性であり、またＨＳＶ−１の
対応部分（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）とも共直線性で
あることが実証された（Ｔｅｌｆｏｒｄ等、１９９２
年、 上掲； Ｃｕｌｌｉｎａｎｅ等、１９８８年、上
掲）。このことは、特定ウイルスのある遺伝子が他のヘ
ルペスウイルスに位置的な対応部分を有することを示し
ている。
【００１２】
【発明が解決しようする課題】ワクチン接種によるＥＨ
Ｖ感染の抑制は長年探求されてきた目標であった。これ
らのウイルスに対する現在のワクチンは化学的に不活化
したウイルス又は弱毒生ウイルスを含んでおり、これら
は多数回の投与を必要とし、また効能が限定されてい
る。
Ｖ感染の抑制は長年探求されてきた目標であった。これ
らのウイルスに対する現在のワクチンは化学的に不活化
したウイルス又は弱毒生ウイルスを含んでおり、これら
は多数回の投与を必要とし、また効能が限定されてい
る。
【００１３】不活化ワクチンは一般に、ごく低レベルの
免疫を誘発し、追加免疫を必要とし、不利にはアジュバ
ントを必要とし、且つ製造コストが高い。更には、幾つ
かの感染ウイルス粒子は不活化処理しても生存し、動物
への投与後に疾病を引き起こす。
免疫を誘発し、追加免疫を必要とし、不利にはアジュバ
ントを必要とし、且つ製造コストが高い。更には、幾つ
かの感染ウイルス粒子は不活化処理しても生存し、動物
への投与後に疾病を引き起こす。
【００１４】一般には、弱毒生ウイルスワクチンの方
が、（しばしば体液及び細胞で）長時間持続する免疫応
答を誘発し、製造も簡単なために好ましい。
が、（しばしば体液及び細胞で）長時間持続する免疫応
答を誘発し、製造も簡単なために好ましい。
【００１５】今日までのところ、組織培養でビルレント
株の連続継代によって弱められた生ウマヘルペスウイル
スを主成分とする弱毒生ウマヘルペスウイルスワクチン
しか市販されていない。しかしながら、この処理によっ
て、非調整（ｕｎｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）突然変異がウ
イルスゲノム内に導入されて、毒性及び免疫性が異質な
ウイルス粒子集団となる。更には、このような従来の弱
毒生ウイルスワクチンが毒性を取り戻すことによって、
接種動物が羅患し、病原体が他の動物に蔓延する可能性
があり得ることはよく知られている。更には、既存の弱
毒生ウマヘルペスウイルスワクチンでは、ウマヘルペス
ウイルス感染について陽性血清試験が得られている。か
くして、既存のウマヘルペスウイルスワクチンでは、特
定動物がビルレントウイルスの（潜伏）キャリアーであ
るのか、それともワクチン接種を受けているのかを（血
清）試験、例えばＥｌｉｓａで決定することはできな
い。
株の連続継代によって弱められた生ウマヘルペスウイル
スを主成分とする弱毒生ウマヘルペスウイルスワクチン
しか市販されていない。しかしながら、この処理によっ
て、非調整（ｕｎｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ）突然変異がウ
イルスゲノム内に導入されて、毒性及び免疫性が異質な
ウイルス粒子集団となる。更には、このような従来の弱
毒生ウイルスワクチンが毒性を取り戻すことによって、
接種動物が羅患し、病原体が他の動物に蔓延する可能性
があり得ることはよく知られている。更には、既存の弱
毒生ウマヘルペスウイルスワクチンでは、ウマヘルペス
ウイルス感染について陽性血清試験が得られている。か
くして、既存のウマヘルペスウイルスワクチンでは、特
定動物がビルレントウイルスの（潜伏）キャリアーであ
るのか、それともワクチン接種を受けているのかを（血
清）試験、例えばＥｌｉｓａで決定することはできな
い。
【００１６】更には、ウマヘルペスウイルス株をウマヘ
ルペスウイルス感染及び他のウマ病原体を共に防御する
ワクチンとして使用することができれば有利であろう。
これは、ウマヘルペスウイルスの複製によってウマヘル
ペスウイルス抗原及び他のウマ病原体の抗原が共に発現
されるように、ウマ病原体の関連抗原をコードする遺伝
子をウマヘルペスウイルスのゲノム内に挿入することに
より達成され得る。
ルペスウイルス感染及び他のウマ病原体を共に防御する
ワクチンとして使用することができれば有利であろう。
これは、ウマヘルペスウイルスの複製によってウマヘル
ペスウイルス抗原及び他のウマ病原体の抗原が共に発現
されるように、ウマ病原体の関連抗原をコードする遺伝
子をウマヘルペスウイルスのゲノム内に挿入することに
より達成され得る。
【００１７】
【課題を解決するための手段】本発明は、ＥＨＶの遺伝
子１５に及ぶ領域内のＥＨＶゲノムに突然変異を含んで
いるＥＨＶ突然変異株を提供する。
子１５に及ぶ領域内のＥＨＶゲノムに突然変異を含んで
いるＥＨＶ突然変異株を提供する。
【００１８】突然変異とは、前記領域の遺伝子情報が、
天然ＥＨＶのゲノムの同領域に存在する遺伝子情報に対
して変化することと理解する。
天然ＥＨＶのゲノムの同領域に存在する遺伝子情報に対
して変化することと理解する。
【００１９】突然変異は例えば、核酸の置換、欠失、挿
入若しくは逆位、又はこれらの組み合わせであり、これ
らによって、ＥＨＶ遺伝子１５によってコードされる任
意の抗原又は機能ポリペプチドを産生することのできな
いＥＨＶ突然変異株が生じる。
入若しくは逆位、又はこれらの組み合わせであり、これ
らによって、ＥＨＶ遺伝子１５によってコードされる任
意の抗原又は機能ポリペプチドを産生することのできな
いＥＨＶ突然変異株が生じる。
【００２０】好ましくは、ＥＨＶゲノムの限定された領
域に導入された突然変異は、ＥＨＶ遺伝子１５の全体若
しくは一部分の欠失、及び／又はその部分への異種核酸
配列の挿入である。
域に導入された突然変異は、ＥＨＶ遺伝子１５の全体若
しくは一部分の欠失、及び／又はその部分への異種核酸
配列の挿入である。
【００２１】特に、本発明は、ＥＨＶの遺伝子１５に及
ぶＥＨＶゲノムの領域に導入された異種核酸配列を含ん
でいることを特徴とする挿入ＥＨＶ突然変異株を提供す
る。
ぶＥＨＶゲノムの領域に導入された異種核酸配列を含ん
でいることを特徴とする挿入ＥＨＶ突然変異株を提供す
る。
【００２２】本発明のＥＨＶ突然変異株は、入手可能な
任意のＥＨＶ株、例えば株Ｍ８、Ａｂ４、Ｋｅｎｔｕｃ
ｋｙ Ｄ又はＴ４３１及び１９４２から誘導され得る。
任意のＥＨＶ株、例えば株Ｍ８、Ａｂ４、Ｋｅｎｔｕｃ
ｋｙ Ｄ又はＴ４３１及び１９４２から誘導され得る。
【００２３】本明細書で使用する“挿入ＥＨＶ突然変異
株”という用語は、異種核酸配列、即ちＥＨＶ内に天然
に確認されるＥＨＶ遺伝子１５内には存在しない核酸配
列を含んでいるＤＮＡのウイルスゲノム内への取り込み
によって遺伝学的に修飾した感染性ウイルスを意味す
る。
株”という用語は、異種核酸配列、即ちＥＨＶ内に天然
に確認されるＥＨＶ遺伝子１５内には存在しない核酸配
列を含んでいるＤＮＡのウイルスゲノム内への取り込み
によって遺伝学的に修飾した感染性ウイルスを意味す
る。
【００２４】挿入ＥＨＶ突然変異株によって細胞が感染
すると、細胞は、異種ポリペプチド形態で異種遺伝子を
発現し得る。
すると、細胞は、異種ポリペプチド形態で異種遺伝子を
発現し得る。
【００２５】“ポリペプチド”という用語は、アミノ酸
の分子鎖を意味し、産物の特定長さを意味するものでは
なく、必要とあれば、例えばグリコシル化、アミド化、
カルボキシル化又はリン酸化によってｉｎ ｖｉｖｏ又
はｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾させることができる。従って、
とりわけペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質がポ
リペプチドの定義に包含される。
の分子鎖を意味し、産物の特定長さを意味するものでは
なく、必要とあれば、例えばグリコシル化、アミド化、
カルボキシル化又はリン酸化によってｉｎ ｖｉｖｏ又
はｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾させることができる。従って、
とりわけペプチド、オリゴペプチド及びタンパク質がポ
リペプチドの定義に包含される。
【００２６】有用なＥＨＶ突然変異株の前提条件は、異
種核酸配列の挿入のような突然変異が、ＥＨＶの重要な
機能（例えば感染又は複製に必要な機能）を破壊せず
に、ＥＨＶゲノムの任意の位置又は領域、即ち突然変異
の取り込みのために使用され得る位置又は領域に取り込
まれることである。
種核酸配列の挿入のような突然変異が、ＥＨＶの重要な
機能（例えば感染又は複製に必要な機能）を破壊せず
に、ＥＨＶゲノムの任意の位置又は領域、即ち突然変異
の取り込みのために使用され得る位置又は領域に取り込
まれることである。
【００２７】本発明で取り上げた突然変異の取り込みの
ための領域、即ちＥＨＶの遺伝子１５は以前は、非重要
領域であるとして同定されなかった。驚くべきことに、
ＥＨＶの重要な機能を破壊せずに、異種核酸配列の挿入
又はこの領域（の一部分）の欠失のような突然変異が許
容されることが判明した。
ための領域、即ちＥＨＶの遺伝子１５は以前は、非重要
領域であるとして同定されなかった。驚くべきことに、
ＥＨＶの重要な機能を破壊せずに、異種核酸配列の挿入
又はこの領域（の一部分）の欠失のような突然変異が許
容されることが判明した。
【００２８】予期しないことであったが、先に規定した
領域内への突然変異の導入が、ＥＨＶ突然変異株の防御
性に作用せずに、生ＥＨＶ突然変異株の毒性を弱めるこ
とが判明した。この発見により、例えば前記領域内に欠
失又は挿入をもたらすことによって弱毒ＥＨＶ突然変異
株の産生が可能となる。この突然変異株は、ワクチン接
種すべき動物に生形態で投与することができる。
領域内への突然変異の導入が、ＥＨＶ突然変異株の防御
性に作用せずに、生ＥＨＶ突然変異株の毒性を弱めるこ
とが判明した。この発見により、例えば前記領域内に欠
失又は挿入をもたらすことによって弱毒ＥＨＶ突然変異
株の産生が可能となる。この突然変異株は、ワクチン接
種すべき動物に生形態で投与することができる。
【００２９】“ＥＨＶの遺伝子１５”という用語は本明
細書では、ＥＨＶの型とは関係なく、糖タンパク質Ｃ相
同体（ｇＣ）をコードする遺伝子に隣接し、更には遺伝
子１５の読み取り枠（ＯＲＦ）の５’フランキング遺伝
子間配列、即ちｇＣ相同体をコードする遺伝子と遺伝子
１５との間のヌクレオチド配列を含んでいるＥＨＶゲノ
ム３’に存在するＯＲＦを同定するために使用する。
細書では、ＥＨＶの型とは関係なく、糖タンパク質Ｃ相
同体（ｇＣ）をコードする遺伝子に隣接し、更には遺伝
子１５の読み取り枠（ＯＲＦ）の５’フランキング遺伝
子間配列、即ちｇＣ相同体をコードする遺伝子と遺伝子
１５との間のヌクレオチド配列を含んでいるＥＨＶゲノ
ム３’に存在するＯＲＦを同定するために使用する。
【００３０】ＥＨＶ−１のｇＣ相同体をコードする遺伝
子の正確な位置は（ＢａｍＨＩ Ｈ断片上に）マッピン
グされ、１９８８年にＡｌｌｅｎ等により配列決定され
ている（上掲）。ＥＨＶ−４については、Ｎｉｃｏｌｓ
ｏｎ等から同様の情報が入手可能である（１９９０年、
上掲）。
子の正確な位置は（ＢａｍＨＩ Ｈ断片上に）マッピン
グされ、１９８８年にＡｌｌｅｎ等により配列決定され
ている（上掲）。ＥＨＶ−４については、Ｎｉｃｏｌｓ
ｏｎ等から同様の情報が入手可能である（１９９０年、
上掲）。
【００３１】ＥＨＶ−１及びＥＨＶ−４の遺伝子１５は
それぞれ、Ｔｅｌｆｏｒｄ等（１９９２年、上掲）及び
Ｎｉｃｏｌｓｏｎ等（１９９０年、上掲）により同定さ
れている。しかしながら、ＥＨＶの遺伝子１５とＨＳＶ
−１又はＶＺＶに位置的対応部分を有する遺伝子との間
に配列の相同性は存在しないように思えた。
それぞれ、Ｔｅｌｆｏｒｄ等（１９９２年、上掲）及び
Ｎｉｃｏｌｓｏｎ等（１９９０年、上掲）により同定さ
れている。しかしながら、ＥＨＶの遺伝子１５とＨＳＶ
−１又はＶＺＶに位置的対応部分を有する遺伝子との間
に配列の相同性は存在しないように思えた。
【００３２】ＥＨＶ−１の遺伝子１５のＯＲＦは塩基対
２１１７０（開始）−２０４８７（終止）に及び（Ｔｅ
ｌｆｏｒｄ等、１９９２年、上掲）、２２７アミノ酸を
有するポリペプチドをコードする（ＤＮＡ配列及びアミ
ノ酸配列を配列番号１及び２に示す）。
２１１７０（開始）−２０４８７（終止）に及び（Ｔｅ
ｌｆｏｒｄ等、１９９２年、上掲）、２２７アミノ酸を
有するポリペプチドをコードする（ＤＮＡ配列及びアミ
ノ酸配列を配列番号１及び２に示す）。
【００３３】ＥＨＶ−４の遺伝子１５のＯＲＦは、塩基
対２１１０（開始）−２７９０（終止）に及び（Ｎｉｃ
ｏｌｓｏｎ等、１９９０年、上掲）、２２６アミノ酸を
有するポリペプチドをコードする（ＤＮＡ配列及びアミ
ノ酸配列を配列番号３及び４に示す）。
対２１１０（開始）−２７９０（終止）に及び（Ｎｉｃ
ｏｌｓｏｎ等、１９９０年、上掲）、２２６アミノ酸を
有するポリペプチドをコードする（ＤＮＡ配列及びアミ
ノ酸配列を配列番号３及び４に示す）。
【００３４】本発明の好ましい実施態様では、ＥＨＶ突
然変異株は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードする遺伝子１５のＯＲＦに及ぶ領域
内に突然変異を有するＥＨＶ−１であるか、又は配列番
号４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
する遺伝子１５のＯＲＦに及ぶ領域内に突然変異を有す
るＥＨＶ−４である。
然変異株は、配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポ
リペプチドをコードする遺伝子１５のＯＲＦに及ぶ領域
内に突然変異を有するＥＨＶ−１であるか、又は配列番
号４に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコード
する遺伝子１５のＯＲＦに及ぶ領域内に突然変異を有す
るＥＨＶ−４である。
【００３５】特に、前記領域は、それぞれ配列番号１
（ＥＨＶ−１）又は配列番号３（ＥＨＶ−４）に示すヌ
クレオチド配列を有する。
（ＥＨＶ−１）又は配列番号３（ＥＨＶ−４）に示すヌ
クレオチド配列を有する。
【００３６】各ＥＨＶゲノムのＤＮＡ配列については、
個々のＥＨＶウイルス間に自然変異が存在し得ることが
理解されよう。これらの変異は１個以上のヌクレオチド
の欠失、置換、挿入、逆位又は付加となり得る。
個々のＥＨＶウイルス間に自然変異が存在し得ることが
理解されよう。これらの変異は１個以上のヌクレオチド
の欠失、置換、挿入、逆位又は付加となり得る。
【００３７】上記ＥＨＶ変種は、本明細書に記載の遺伝
子１５の配列とは異なる対応遺伝子１５をコードし得
る。かかる変種ＯＲＦをコードするＤＮＡ配列は、配列
番号１及び３に示したＤＮＡ配列とハイブリダイズした
り、物理マップを比較して前記遺伝子をコードする類縁
領域の位置を決定するなど、幾つかの方法でその位置を
決定し得る。従って本発明は、任意のＥＨＶ株から入手
可能な突然変異を導入する領域を与える。
子１５の配列とは異なる対応遺伝子１５をコードし得
る。かかる変種ＯＲＦをコードするＤＮＡ配列は、配列
番号１及び３に示したＤＮＡ配列とハイブリダイズした
り、物理マップを比較して前記遺伝子をコードする類縁
領域の位置を決定するなど、幾つかの方法でその位置を
決定し得る。従って本発明は、任意のＥＨＶ株から入手
可能な突然変異を導入する領域を与える。
【００３８】更に、上記領域のＤＮＡ配列に関連するＤ
ＮＡ配列をもたらす上記変種を生じる遺伝子工学技術を
使用し得る可能性もある。かかる関連ＤＮＡ配列を特徴
とする突然変異がＥＨＶゲノム内に位置する領域中に取
込まれたＥＨＶ突然変異株も本発明の範囲内に含まれる
ことは明らかである。
ＮＡ配列をもたらす上記変種を生じる遺伝子工学技術を
使用し得る可能性もある。かかる関連ＤＮＡ配列を特徴
とする突然変異がＥＨＶゲノム内に位置する領域中に取
込まれたＥＨＶ突然変異株も本発明の範囲内に含まれる
ことは明らかである。
【００３９】更に、上記領域はウイルスの必須機能を示
さないので、該領域を一部または全部欠失させ、次いで
所望であれば異種核酸配列を前記欠失中に取込むことが
できる。
さないので、該領域を一部または全部欠失させ、次いで
所望であれば異種核酸配列を前記欠失中に取込むことが
できる。
【００４０】遺伝子１５の挿入不活化のためにＥＨＶゲ
ノム中に挿入される異種核酸配列は、例えばウイルス、
原核細胞、真核細胞または合成物質などの任意の供給源
から誘導し得る。
ノム中に挿入される異種核酸配列は、例えばウイルス、
原核細胞、真核細胞または合成物質などの任意の供給源
から誘導し得る。
【００４１】本発明の特定の実施態様においては前記挿
入異種核酸配列は非コーディングオリゴヌクレオチドで
あり、その長さ及び配列は限定的ではないが、長さは８
〜１００ヌクレオチドであるのが好ましい。
入異種核酸配列は非コーディングオリゴヌクレオチドで
あり、その長さ及び配列は限定的ではないが、長さは８
〜１００ヌクレオチドであるのが好ましい。
【００４２】極めて適当な非コーディングオリゴヌクレ
オチドは、適当な、例えば固有の制限酵素切断部位のほ
かに、存在し得る読み枠のそれぞれに、両方向で翻訳終
結コドンを含む。
オチドは、適当な、例えば固有の制限酵素切断部位のほ
かに、存在し得る読み枠のそれぞれに、両方向で翻訳終
結コドンを含む。
【００４３】本発明の別の目的は、ウマヘルペスウイル
ス感染に対するワクチンだけでなく他のウマ感染症に対
するワクチンをも製造するために使用し得る突然変異ウ
マヘルペスウイルスを提供することである。安全な弱毒
化ウマヘルペスウイルス突然変異株の生体をベースとす
るかかるベクターワクチンは、免疫宿主の感染細胞内で
他の病原体の抗原を発現することによりその病原体に対
して免疫化する可能性を与えるが、これは、特定のウマ
ヘルペスウイルスとは異種のポリペプチドをコードする
異種核酸配列を、上記のウマヘルペスウイルスゲノムの
領域に挿入することにより得ることができる。
ス感染に対するワクチンだけでなく他のウマ感染症に対
するワクチンをも製造するために使用し得る突然変異ウ
マヘルペスウイルスを提供することである。安全な弱毒
化ウマヘルペスウイルス突然変異株の生体をベースとす
るかかるベクターワクチンは、免疫宿主の感染細胞内で
他の病原体の抗原を発現することによりその病原体に対
して免疫化する可能性を与えるが、これは、特定のウマ
ヘルペスウイルスとは異種のポリペプチドをコードする
異種核酸配列を、上記のウマヘルペスウイルスゲノムの
領域に挿入することにより得ることができる。
【００４４】前記異種核酸配列は、ウマインフルエンザ
ウイルス、ウマロタウイルス、ウマ感染性貧血ウイル
ス、動脈炎ウイルス、脳炎ウイルス、ウマボルナ病ウイ
ルス、ウマベルネ（Ｂｅｒｎｅ）ウイルス、Ｅ．ｃｏｌ
ｉまたはストレプトコッカス・エクイヌスのごときウマ
病原体の抗原をコードし得る。
ウイルス、ウマロタウイルス、ウマ感染性貧血ウイル
ス、動脈炎ウイルス、脳炎ウイルス、ウマボルナ病ウイ
ルス、ウマベルネ（Ｂｅｒｎｅ）ウイルス、Ｅ．ｃｏｌ
ｉまたはストレプトコッカス・エクイヌスのごときウマ
病原体の抗原をコードし得る。
【００４５】異種とは、特定タイプのＥＨＶ、例えばＥ
ＨＶ−１を、別のタイプのＥＨＶ、例えばＥＨＶ−４の
抗原をコードする核酸配列を取込むためのベクターウイ
ルスとして使用したり、またはこの逆を行い得ることを
意味する。
ＨＶ−１を、別のタイプのＥＨＶ、例えばＥＨＶ−４の
抗原をコードする核酸配列を取込むためのベクターウイ
ルスとして使用したり、またはこの逆を行い得ることを
意味する。
【００４６】ＥＨＶ突然変異株による異種核酸配列の発
現には、該異種核酸配列に操作可能に連結された適当な
プロモーターが必然的に要求される。
現には、該異種核酸配列に操作可能に連結された適当な
プロモーターが必然的に要求される。
【００４７】プロモーターの選択は、真核細胞、原核細
胞、または、ＥＨＶ突然変異株に感染した細胞内で遺伝
子転写を誘導し得るウイルスプロモーター、例えばレト
ロウイルス長鎖末端反復配列（Ｇｏｒｍａｎら，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９，６７
７７−６７８１，１９８２）、ＳＶ４０プロモーター
（Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＢｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
０９，１４２２−１４２７，１９８０）またはサイトメ
ガロウイルス直前（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）
プロモーター（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら，Ｃｅｌｌ ４
１，５２１−５３０，１９８５）にまで及ぶことは当業
者には明らかである。
胞、または、ＥＨＶ突然変異株に感染した細胞内で遺伝
子転写を誘導し得るウイルスプロモーター、例えばレト
ロウイルス長鎖末端反復配列（Ｇｏｒｍａｎら，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９，６７
７７−６７８１，１９８２）、ＳＶ４０プロモーター
（Ｍｕｌｌｉｇａｎ及びＢｅｒｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
０９，１４２２−１４２７，１９８０）またはサイトメ
ガロウイルス直前（ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｅａｒｌｙ）
プロモーター（Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら，Ｃｅｌｌ ４
１，５２１−５３０，１９８５）にまで及ぶことは当業
者には明らかである。
【００４８】ＤＮＡ配列をクローニングベクター中に挿
入する公知の方法及びｉｎ ｖｉｖｏ同種組換えまたは
コスミドクローニング技術を使用し、突然変異をウマヘ
ルペスウイルスゲノム中に導入し得る（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｔ．ら（１９８２），“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌ
ｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；欧州特許出願第７４．８０８
号明細書；Ｂ．及びＪｅｎｋｉｎｓ，Ｆ．Ｊ．（１９８
５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，１２０８；Ｈｉｇｕｃ
ｈｉ，Ｒ．ら，（１９８８），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１６，７３５１）。
入する公知の方法及びｉｎ ｖｉｖｏ同種組換えまたは
コスミドクローニング技術を使用し、突然変異をウマヘ
ルペスウイルスゲノム中に導入し得る（Ｍａｎｉａｔｉ
ｓ，Ｔ．ら（１９８２），“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌ
ｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；欧州特許出願第７４．８０８
号明細書；Ｂ．及びＪｅｎｋｉｎｓ，Ｆ．Ｊ．（１９８
５），Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９，１２０８；Ｈｉｇｕｃ
ｈｉ，Ｒ．ら，（１９８８），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉ
ｄｓ Ｒｅｓ．１６，７３５１）。
【００４９】簡単に述べると、これは、ウマヘルペスウ
イルスＤＮＡを用いて組換えするための組換えＤＮＡ分
子を構築することにより行い得る。かかる組換えＤＮＡ
分子は、任意の適当なプラスミド、コスミド、ウイルス
またはファージから誘導し得、上記同定領域のウマヘル
ペスウイルスＤＮＡを含むベクターＤＮＡを含む。
イルスＤＮＡを用いて組換えするための組換えＤＮＡ分
子を構築することにより行い得る。かかる組換えＤＮＡ
分子は、任意の適当なプラスミド、コスミド、ウイルス
またはファージから誘導し得、上記同定領域のウマヘル
ペスウイルスＤＮＡを含むベクターＤＮＡを含む。
【００５０】適当なクローニングベクターの例として
は、プラスミドベクター（例えばｐＢＲ３２２）、種々
のｐＵＣ及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド、コスミ
ドベクター（例えばＴＨＶ、ｐＪＢ８、ＭＵＡ−３及び
ＣｏｓＩ）、バクテリオファージ（例えばλ−ｇｔ−Ｗ
ＥＳ−λ Ｂ、カロン２８及びＭ１３ｍｐファージ）ま
たはウイルスベクター（例えばＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウ
イルス、ポリオーマ及びアデノウイルス）が挙げられ
る。本発明に使用されるベクターは更に、例えばＲｏｄ
ｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．及びＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔ
編，Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎ
ｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ
ｓ，１９８８のごとき文献に略述されている。
は、プラスミドベクター（例えばｐＢＲ３２２）、種々
のｐＵＣ及びＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド、コスミ
ドベクター（例えばＴＨＶ、ｐＪＢ８、ＭＵＡ−３及び
ＣｏｓＩ）、バクテリオファージ（例えばλ−ｇｔ−Ｗ
ＥＳ−λ Ｂ、カロン２８及びＭ１３ｍｐファージ）ま
たはウイルスベクター（例えばＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウ
イルス、ポリオーマ及びアデノウイルス）が挙げられ
る。本発明に使用されるベクターは更に、例えばＲｏｄ
ｒｉｇｕｅｚ，Ｒ．Ｌ．及びＤ．Ｔ．Ｄｅｎｈａｒｄｔ
編，Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎ
ｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ
ｓ，１９８８のごとき文献に略述されている。
【００５１】上記領域に導入する欠失は、まず、切断部
位が遺伝子１５の読み枠内またはその近傍に正確に位置
する１種以上の酵素を用いて制限酵素消化することによ
りＥＨＶの遺伝子１５を担う組換えＤＮＡ分子内に導入
し得る。残りの組換えＤＮＡ分子を再環化すると、上記
同定領域内に存在するコーディング配列の少なくとも一
部が欠失した誘導体がもたらされ得る。或いは、遺伝子
１５の配列内に存在する制限酵素切断部位内から出発し
て１つまたは２つの方向で順次欠失（ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｉｖｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を導入してもよい。Ｂａｌ
Ｉ、Ｂａｌ３１またはエキソヌクレアーゼＩＩＩのごと
き酵素をこのために使用し得る。再環化した分子をＥ．
ｃｏｌｉ細胞中に形質転換し、上記領域内に導入された
欠失の寸法を決定するために、個々のコロニーを制限マ
ップ作成によって分析することができる。欠失の正確な
位置は配列決定によって決定し得る。
位が遺伝子１５の読み枠内またはその近傍に正確に位置
する１種以上の酵素を用いて制限酵素消化することによ
りＥＨＶの遺伝子１５を担う組換えＤＮＡ分子内に導入
し得る。残りの組換えＤＮＡ分子を再環化すると、上記
同定領域内に存在するコーディング配列の少なくとも一
部が欠失した誘導体がもたらされ得る。或いは、遺伝子
１５の配列内に存在する制限酵素切断部位内から出発し
て１つまたは２つの方向で順次欠失（ｐｒｏｇｒｅｓｓ
ｉｖｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）を導入してもよい。Ｂａｌ
Ｉ、Ｂａｌ３１またはエキソヌクレアーゼＩＩＩのごと
き酵素をこのために使用し得る。再環化した分子をＥ．
ｃｏｌｉ細胞中に形質転換し、上記領域内に導入された
欠失の寸法を決定するために、個々のコロニーを制限マ
ップ作成によって分析することができる。欠失の正確な
位置は配列決定によって決定し得る。
【００５２】異種核酸配列の挿入が所望される場合は、
ＥＨＶ遺伝子１５を含む組換えＤＮＡ分子を適当な制限
酵素で消化して直線状分子を生成し、次いで所望であれ
ばプロモーターに結合させた異種核酸配列を該直線状分
子に連結し、更に組換えＤＮＡ分子を再環化し得る。
ＥＨＶ遺伝子１５を含む組換えＤＮＡ分子を適当な制限
酵素で消化して直線状分子を生成し、次いで所望であれ
ばプロモーターに結合させた異種核酸配列を該直線状分
子に連結し、更に組換えＤＮＡ分子を再環化し得る。
【００５３】必要によっては、異種核酸配列の挿入と同
時にＥＨＶ遺伝子１５中に欠失を導入する。
時にＥＨＶ遺伝子１５中に欠失を導入する。
【００５４】ＥＨＶ遺伝子１５を切断するために使用さ
れる適当な制限酵素は例えばＳｃａＩ（ＥＨＶ−１）及
びＢｇｌＩＩ、ＮａｒＩまたはＸｂａＩ（ＥＨＶ−４）
である。
れる適当な制限酵素は例えばＳｃａＩ（ＥＨＶ−１）及
びＢｇｌＩＩ、ＮａｒＩまたはＸｂａＩ（ＥＨＶ−４）
である。
【００５５】本発明のＥＨＶ突然変異株の製造にｉｎ
ｖｉｖｏ同種組換え法を適用する場合は、欠失遺伝子１
５配列または挿入異種核酸配列にフランキングするＥＨ
Ｖ配列は、ウイルスＥＨＶゲノムによるｉｎ ｖｉｖｏ
同種組換えが起こるのに適当な長さ、例えば５０〜３０
００ｂｐであるべきである。
ｖｉｖｏ同種組換え法を適用する場合は、欠失遺伝子１
５配列または挿入異種核酸配列にフランキングするＥＨ
Ｖ配列は、ウイルスＥＨＶゲノムによるｉｎ ｖｉｖｏ
同種組換えが起こるのに適当な長さ、例えば５０〜３０
００ｂｐであるべきである。
【００５６】続いて、細胞、例えばウマ皮膚細胞（ＮＢ
Ｌ−６）のごときウマ細胞または例えばＰＫ１３、Ｖｅ
ｒｏ及びＢＨＫ細胞のごとき他の種由来の細胞を、適当
なＥＨＶ配列によってフランキングされた突然変異を含
む組換えＤＮＡ分子の存在下にＥＨＶ ＤＮＡを用いて
トランスフェクトすると、組換えＤＮＡ分子中のＥＨＶ
配列とＥＨＶゲノム中の対応配列との間で組換えが起こ
る。
Ｌ−６）のごときウマ細胞または例えばＰＫ１３、Ｖｅ
ｒｏ及びＢＨＫ細胞のごとき他の種由来の細胞を、適当
なＥＨＶ配列によってフランキングされた突然変異を含
む組換えＤＮＡ分子の存在下にＥＨＶ ＤＮＡを用いて
トランスフェクトすると、組換えＤＮＡ分子中のＥＨＶ
配列とＥＨＶゲノム中の対応配列との間で組換えが起こ
る。
【００５７】次いで組換えウイルスの子孫を細胞培養物
中で生産し、それを例えばハイブリダイズしたり、異種
核酸配列と同時に組込まれた遺伝子によってコードされ
る酵素活性を検出したり、組換えＥＨＶによって免疫的
に発現される抗原性異種ポリペプチドを検出するなど、
遺伝子型及び表現型によって選択し得る。組換えウイル
スは、ネオマイシン、ゲンタンマイシンまたはミコフェ
ノール酸のごとき化合物に対する耐性に基づいて陽性の
ものを選択することもできる。選択したＥＨＶ突然変異
株を細胞培養物中で大規模に培養し、前記ＥＨＶによっ
て発現される物質または異種ポリペプチドを含むＥＨＶ
突然変異株をそこから回収することができる。
中で生産し、それを例えばハイブリダイズしたり、異種
核酸配列と同時に組込まれた遺伝子によってコードされ
る酵素活性を検出したり、組換えＥＨＶによって免疫的
に発現される抗原性異種ポリペプチドを検出するなど、
遺伝子型及び表現型によって選択し得る。組換えウイル
スは、ネオマイシン、ゲンタンマイシンまたはミコフェ
ノール酸のごとき化合物に対する耐性に基づいて陽性の
ものを選択することもできる。選択したＥＨＶ突然変異
株を細胞培養物中で大規模に培養し、前記ＥＨＶによっ
て発現される物質または異種ポリペプチドを含むＥＨＶ
突然変異株をそこから回収することができる。
【００５８】或いは、全ＥＨＶゲノムを包含する複数の
一部重複フラグメントを含むと共に、１つのコスミドは
突然変異遺伝子１５を含むＥＨＶゲノムの１つのフラグ
メントからなるコスミドセットの同時トランスフェクシ
ョンによって（ｄｅ Ｗｉｎｄ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ ６４，４６９１−４６９６，１９９０）、
本発明のＥＨＶ突然変異株を生産することもできる。
一部重複フラグメントを含むと共に、１つのコスミドは
突然変異遺伝子１５を含むＥＨＶゲノムの１つのフラグ
メントからなるコスミドセットの同時トランスフェクシ
ョンによって（ｄｅ Ｗｉｎｄ，Ｎ．ら，Ｊ．Ｇｅｎ．
Ｖｉｒｏｌ ６４，４６９１−４６９６，１９９０）、
本発明のＥＨＶ突然変異株を生産することもできる。
【００５９】本発明のＥＨＶ突然変異株を生産するため
に使用し得る極めて適したコスミドセットは実施例１に
示す。ＥＨＶ−１遺伝子１５は、ｂｐ．１〜４２７５０
に広がるコスミド２Ｄ３内にクローニングされたＥＨＶ
−１挿入物中に位置する（番号はＴｅｌｆｏｒｄら，１
９９２，前出から誘導されてたものである）。
に使用し得る極めて適したコスミドセットは実施例１に
示す。ＥＨＶ−１遺伝子１５は、ｂｐ．１〜４２７５０
に広がるコスミド２Ｄ３内にクローニングされたＥＨＶ
−１挿入物中に位置する（番号はＴｅｌｆｏｒｄら，１
９９２，前出から誘導されてたものである）。
【００６０】別の好ましい実施態様においては、本発明
は上記のごときＥＨＶ突然変異株を提供するが、この突
然変異株は更に、ＥＨＶゲノムの別の遺伝子内の突然変
異、所望であれば弱毒化突然変異、特に欠失または挿入
を含む。
は上記のごときＥＨＶ突然変異株を提供するが、この突
然変異株は更に、ＥＨＶゲノムの別の遺伝子内の突然変
異、所望であれば弱毒化突然変異、特に欠失または挿入
を含む。
【００６１】上記突然変異は、遺伝子がもはや機能性ポ
リペプチドを発現できずに毒性が低下したＥＨＶ突然変
異株を生じるような遺伝子の失活化をもたらし得る。こ
れは、例えばｇＥ、ＴＫ、ＲＲまたはＵL２１をコード
する遺伝子（Ｔｅｌｆｏｒｄら，１９９２，前出；Ｒｏ
ｂｅｒｔｓｏｎら，１９８８，前出；国際特許出願公開
第ＷＯ ９２／０１０４５号明細書）内に突然変異を導
入することにより行い得る。
リペプチドを発現できずに毒性が低下したＥＨＶ突然変
異株を生じるような遺伝子の失活化をもたらし得る。こ
れは、例えばｇＥ、ＴＫ、ＲＲまたはＵL２１をコード
する遺伝子（Ｔｅｌｆｏｒｄら，１９９２，前出；Ｒｏ
ｂｅｒｔｓｏｎら，１９８８，前出；国際特許出願公開
第ＷＯ ９２／０１０４５号明細書）内に突然変異を導
入することにより行い得る。
【００６２】本発明の生きたＥＨＶ突然変異株、特に特
定のウマ病原体の１種以上の異種ポリペプチドを発現す
る生きたＥＨＶ突然変異株を使用してウマを予防接種し
得る。かかる生ベクターワクチンによる予防接種のあと
は、好ましいことに接種宿主においてＥＨＶ突然変異株
が複製され、ＥＨＶポリペプチドと一緒に異種ポリペプ
チドがｉｎ ｖｉｖｏで発現される。接種宿主において
発現されたポリペプチドは、ＥＨＶ及び特定の病原体の
両方に対して免疫応答を誘起する。特定の病原体から誘
導される異種ポリペプチドが感染防御免疫応答を刺激し
得る場合、本発明のＥＨＶ突然変異株を接種された動物
は、その病原体による感染に対して免疫となる上に、Ｅ
ＨＶによる感染に対しても免疫となる。即ち、本発明の
ＥＨＶゲノムの領域に取り込まれた異種核酸配列はｉｎ
ｖｉｖｏで継続的に発現され、ウマ病原体に対する確
実で安全な、長期持続性のある免疫を与える。
定のウマ病原体の１種以上の異種ポリペプチドを発現す
る生きたＥＨＶ突然変異株を使用してウマを予防接種し
得る。かかる生ベクターワクチンによる予防接種のあと
は、好ましいことに接種宿主においてＥＨＶ突然変異株
が複製され、ＥＨＶポリペプチドと一緒に異種ポリペプ
チドがｉｎ ｖｉｖｏで発現される。接種宿主において
発現されたポリペプチドは、ＥＨＶ及び特定の病原体の
両方に対して免疫応答を誘起する。特定の病原体から誘
導される異種ポリペプチドが感染防御免疫応答を刺激し
得る場合、本発明のＥＨＶ突然変異株を接種された動物
は、その病原体による感染に対して免疫となる上に、Ｅ
ＨＶによる感染に対しても免疫となる。即ち、本発明の
ＥＨＶゲノムの領域に取り込まれた異種核酸配列はｉｎ
ｖｉｖｏで継続的に発現され、ウマ病原体に対する確
実で安全な、長期持続性のある免疫を与える。
【００６３】１種以上の異種ポリペプチドを含有及び発
現する本発明のＥＨＶ突然変異株は一価または多価ワク
チンとして作用し得る。
現する本発明のＥＨＶ突然変異株は一価または多価ワク
チンとして作用し得る。
【００６４】生ワクチン製造のためには、本発明のＥＨ
Ｖ突然変異株をウマ由来の細胞培養物または他の種由来
の細胞上で増殖させ得る。このように増殖させたウイル
スを、組織細胞培養液及び／または細胞を回収すること
により入手し得る。生ワクチンは懸濁液の形態で製造す
ることもできるし、凍結乾燥してもよい。
Ｖ突然変異株をウマ由来の細胞培養物または他の種由来
の細胞上で増殖させ得る。このように増殖させたウイル
スを、組織細胞培養液及び／または細胞を回収すること
により入手し得る。生ワクチンは懸濁液の形態で製造す
ることもできるし、凍結乾燥してもよい。
【００６５】免疫有効量のＥＨＶ突然変異株に加え、ワ
クチンは医薬的に容認可能な担体または希釈剤を含み得
る。
クチンは医薬的に容認可能な担体または希釈剤を含み得
る。
【００６６】本発明に有用な医薬的に容認可能な担体ま
たは希釈剤の例としては、安定剤（例えばＳＰＧＡ）、
炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、
しょ糖、グルコース、デキストラン）、タンパク質（例
えばアルブミンまたはカゼイン）、タンパク質含有物
（例えばウシ血清またはスキムミルク）及び緩衝液（例
えばリン酸緩衝液）が挙げられる。
たは希釈剤の例としては、安定剤（例えばＳＰＧＡ）、
炭水化物（例えばソルビトール、マンニトール、澱粉、
しょ糖、グルコース、デキストラン）、タンパク質（例
えばアルブミンまたはカゼイン）、タンパク質含有物
（例えばウシ血清またはスキムミルク）及び緩衝液（例
えばリン酸緩衝液）が挙げられる。
【００６７】必要によっては、アジュバント活性を有す
る１種以上の化合物をワクチンに添加してもよい。適当
なアジュバントとしては例えば水酸化アルミニウム、リ
ン酸アルミニウムもしくは酸化アルミニウム、油性エマ
ルジョン（例えばＢａｙｏｌＦ(R)またはＭａｒｃｏｌ
５２(R)）、サポニンまたはビタミンＥ可溶化物が挙
げられる。
る１種以上の化合物をワクチンに添加してもよい。適当
なアジュバントとしては例えば水酸化アルミニウム、リ
ン酸アルミニウムもしくは酸化アルミニウム、油性エマ
ルジョン（例えばＢａｙｏｌＦ(R)またはＭａｒｃｏｌ
５２(R)）、サポニンまたはビタミンＥ可溶化物が挙
げられる。
【００６８】有効な投与量は、対象動物の年齢及び体重
並びに投与形態に従って変わる。適当な用量は例えばウ
マ１頭当たり１０3・0〜１０8・0 ＴＣＩＤ50のＥＨＶ突
然変異株であり得る。
並びに投与形態に従って変わる。適当な用量は例えばウ
マ１頭当たり１０3・0〜１０8・0 ＴＣＩＤ50のＥＨＶ突
然変異株であり得る。
【００６９】また、本発明のＥＨＶ突然変異株を使用し
て不活化ワクチンを製造することもできる。
て不活化ワクチンを製造することもできる。
【００７０】動物に投与するためには、本発明のＥＨＶ
突然変異株は特に鼻腔内、皮内、皮下または筋肉内に与
え得る。
突然変異株は特に鼻腔内、皮内、皮下または筋肉内に与
え得る。
【００７１】
【実施例】実施例１ ＥＨＶ-１ウィルスを発生させるためのコスミドの構築 スーパーコス(SuperCos)１コスミドベクターキットを、
ストラタジーン社（カタログ＃２５１３０１）から購入
した。このベクターに更なる制限酵素部位を付加するこ
とにより、更に修飾した。以下の制限酵素部位：Ｂａｍ
ＨＩ、Ｉ-ＳｃｅＩ、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ、ＥｃｏＲ
Ｖ、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ、Ｉ-ＳｃｅＩ、およびＢａｍ
ＨＩを含有するＤＮＡリンカーをファルマシア社から購
入した。スーパーコス１ベクターおよびリンカーの両方
を、製造元の指示書に従いＢａｍＨＩ（ニューイングラ
ンドバイオラボ社）で切断した。ＢａｍＨＩで消化した
ベクターを製造元の指示書に従いアルカリホスファター
ゼ（ニューイングランドバイオラボ社）で脱燐酸化し
た。ＢａｍＨＩで消化したリンカーを、次いで、製造元
の指示書に従いＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングラン
ドバイオラボ社）でスーパーコス１ベクター中にライゲ
ーションした。次いで、その結果できたベクターを、更
にＥＨＶ-１インサートのクローニング用に用いた。
ストラタジーン社（カタログ＃２５１３０１）から購入
した。このベクターに更なる制限酵素部位を付加するこ
とにより、更に修飾した。以下の制限酵素部位：Ｂａｍ
ＨＩ、Ｉ-ＳｃｅＩ、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ、ＥｃｏＲ
Ｖ、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ、Ｉ-ＳｃｅＩ、およびＢａｍ
ＨＩを含有するＤＮＡリンカーをファルマシア社から購
入した。スーパーコス１ベクターおよびリンカーの両方
を、製造元の指示書に従いＢａｍＨＩ（ニューイングラ
ンドバイオラボ社）で切断した。ＢａｍＨＩで消化した
ベクターを製造元の指示書に従いアルカリホスファター
ゼ（ニューイングランドバイオラボ社）で脱燐酸化し
た。ＢａｍＨＩで消化したリンカーを、次いで、製造元
の指示書に従いＴ４ＤＮＡリガーゼ（ニューイングラン
ドバイオラボ社）でスーパーコス１ベクター中にライゲ
ーションした。次いで、その結果できたベクターを、更
にＥＨＶ-１インサートのクローニング用に用いた。
【００７２】ＥＨＶ-１感染の重度の兆候を示すウマか
ら単離した病原性ＥＨＶ-１菌株であるＥＨＶ-１ Ｍ８
菌株からウィルスのＤＮＡを得た。この菌株を、ベロ(V
ero)細胞の集密的細胞単層上で１：１のＭＯＩでインキ
ュベーションした。８０％ＣＰＥ細胞で４日後、上澄の
凍結、解凍を３回繰り返した。細胞の構成成分を取り除
くために、ソーバル(Sorval)高速遠心機（ＲＣ-５Ｃ）
内で５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離にかけた。次い
で、上澄を取りだし、ベックマンの超遠心機（Ｌ８-７
０）内で１９，０００ｒｐｍで２時間遠心分離にかけ
た。ペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。各々１０
ｍＭおよび２％の最終濃度になるようにＥＤＴＡおよび
ＳＤＳを加えウィルスを溶解することによりＤＮＡ抽出
を行った。
ら単離した病原性ＥＨＶ-１菌株であるＥＨＶ-１ Ｍ８
菌株からウィルスのＤＮＡを得た。この菌株を、ベロ(V
ero)細胞の集密的細胞単層上で１：１のＭＯＩでインキ
ュベーションした。８０％ＣＰＥ細胞で４日後、上澄の
凍結、解凍を３回繰り返した。細胞の構成成分を取り除
くために、ソーバル(Sorval)高速遠心機（ＲＣ-５Ｃ）
内で５０００ｒｐｍで３０分間遠心分離にかけた。次い
で、上澄を取りだし、ベックマンの超遠心機（Ｌ８-７
０）内で１９，０００ｒｐｍで２時間遠心分離にかけ
た。ペレットを１ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。各々１０
ｍＭおよび２％の最終濃度になるようにＥＤＴＡおよび
ＳＤＳを加えウィルスを溶解することによりＤＮＡ抽出
を行った。
【００７３】この混合物を、次いで、もはや境界面が観
察されなくなるまで標準技法により少なくとも３回フェ
ノールで抽出した。次いで、ＤＮＡを、２倍量の１００
％エタノールで室温で沈澱させた。１２０００ｒｐｍで
１０分間回転させた後、エタノールを除去し、ペレット
を７０％エタノールで洗浄した。次いで、ペレットを風
乾し、水に再懸濁した。
察されなくなるまで標準技法により少なくとも３回フェ
ノールで抽出した。次いで、ＤＮＡを、２倍量の１００
％エタノールで室温で沈澱させた。１２０００ｒｐｍで
１０分間回転させた後、エタノールを除去し、ペレット
を７０％エタノールで洗浄した。次いで、ペレットを風
乾し、水に再懸濁した。
【００７４】ＥＨＶ-１ＤＮＡを切断または消化してコ
スミドセットに必要なインサートを得た。ＥＨＶ-１Ｄ
ＮＡをＰａｃＩ（ニューイングランドバイオラボ社）で
消化することによりコスミドを構築した。Ｍ８ Ｐａｃ
-１消化物をフェノールで抽出した後、その末端をＴ４
ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ
社）で平滑処理し、次いで、製造元の指示書に従ってア
ルカリホスファターゼ（ニューイングランドバイオラボ
社）で脱燐酸化した。コスミドベクターをＥｃｏＲＶ
（ニューイングランドバイオラボ社）で消化し、インサ
ートをＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイ
オラボ社）でベクター内にライゲーションした。ライゲ
ーションミックスを、製造元の指示書に従いパッケージ
ングミックス（Gigapackパッケージング抽出物、ストラ
タジーン社）内にパックした。パックしたＤＮＡを、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１を一晩培養した新鮮な培養物に加
え、３７℃で１時間静置した。細菌懸濁液を、次いで、
アンピシリンを含有する寒天プレート上に広げた。制限
酵素分析によりそのインサートについて全てのコロニー
を分析した。別のコスミド構築のために同様の手法に従
ったが、但し、ウィルスのＤＮＡは、ＡｓｃＩ、Ａｓｅ
Ｉ、ＲｓｒＩまたはＮｏｔＩで消化し、次いで、全ての
末端は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑処理し、ベク
ターのＥｃｏＲＶ部位内にインサートをライゲーション
した。コスミドの第三世代を得るために、ウィルスのＤ
ＮＡを、１９Ｇニードルを介して２回切断し、末端を、
次いで、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑処理し、フェ
ノール抽出および沈澱後、インサートを、コスミドベク
ターのＥｃｏＲＶ部位内に再度クローンした。インサー
トを有するベクターを、次いで、パックし、細菌に導入
し、コロニーを分析した。得られた全てのコロニーか
ら、多重消化により制限酵素地図を決定した。次いで、
クローンの制限酵素地図とＥＨＶ-１の制限酵素地図と
を比較することにより異なるクローンの位置を決定し
た。これらの方法により生じた全コスミドおよびそれら
の特徴を図１にまとめた。これらのデータに基づいてい
くつかのコスミドセットを形成し、新規なウィルスを生
じさせるその能力について検査した。表１に示したコス
ミドセットを用い、生存ウィルスを再生することが可能
である。ウィルスの再生のために、Ｓｃｅ-Ｉ（ニュー
イングランドバイオラボ社）消化によりＥＨＶ-１イン
サートをコスミドから切り取った。次いで、ＢＨＫ細胞
の集密的細胞単層を、燐酸カルシウム法により各コスミ
ドのセット０．２μｇでトランスフェクションした。こ
の方法で、トランスフェクション１回当たり生存ウィル
スが存在する３０個以上のプラークを得た。
スミドセットに必要なインサートを得た。ＥＨＶ-１Ｄ
ＮＡをＰａｃＩ（ニューイングランドバイオラボ社）で
消化することによりコスミドを構築した。Ｍ８ Ｐａｃ
-１消化物をフェノールで抽出した後、その末端をＴ４
ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ
社）で平滑処理し、次いで、製造元の指示書に従ってア
ルカリホスファターゼ（ニューイングランドバイオラボ
社）で脱燐酸化した。コスミドベクターをＥｃｏＲＶ
（ニューイングランドバイオラボ社）で消化し、インサ
ートをＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ニューイングランドバイ
オラボ社）でベクター内にライゲーションした。ライゲ
ーションミックスを、製造元の指示書に従いパッケージ
ングミックス（Gigapackパッケージング抽出物、ストラ
タジーン社）内にパックした。パックしたＤＮＡを、
Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ１を一晩培養した新鮮な培養物に加
え、３７℃で１時間静置した。細菌懸濁液を、次いで、
アンピシリンを含有する寒天プレート上に広げた。制限
酵素分析によりそのインサートについて全てのコロニー
を分析した。別のコスミド構築のために同様の手法に従
ったが、但し、ウィルスのＤＮＡは、ＡｓｃＩ、Ａｓｅ
Ｉ、ＲｓｒＩまたはＮｏｔＩで消化し、次いで、全ての
末端は、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑処理し、ベク
ターのＥｃｏＲＶ部位内にインサートをライゲーション
した。コスミドの第三世代を得るために、ウィルスのＤ
ＮＡを、１９Ｇニードルを介して２回切断し、末端を、
次いで、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑処理し、フェ
ノール抽出および沈澱後、インサートを、コスミドベク
ターのＥｃｏＲＶ部位内に再度クローンした。インサー
トを有するベクターを、次いで、パックし、細菌に導入
し、コロニーを分析した。得られた全てのコロニーか
ら、多重消化により制限酵素地図を決定した。次いで、
クローンの制限酵素地図とＥＨＶ-１の制限酵素地図と
を比較することにより異なるクローンの位置を決定し
た。これらの方法により生じた全コスミドおよびそれら
の特徴を図１にまとめた。これらのデータに基づいてい
くつかのコスミドセットを形成し、新規なウィルスを生
じさせるその能力について検査した。表１に示したコス
ミドセットを用い、生存ウィルスを再生することが可能
である。ウィルスの再生のために、Ｓｃｅ-Ｉ（ニュー
イングランドバイオラボ社）消化によりＥＨＶ-１イン
サートをコスミドから切り取った。次いで、ＢＨＫ細胞
の集密的細胞単層を、燐酸カルシウム法により各コスミ
ドのセット０．２μｇでトランスフェクションした。こ
の方法で、トランスフェクション１回当たり生存ウィル
スが存在する３０個以上のプラークを得た。
【００７５】
【表１】
【００７６】（菌株Ａｂ４のそれとの比較から誘導され
るナンバリング）。
るナンバリング）。
【００７７】実施例２ ＥＨＶ-１遺伝子１５ミュータントの作製 遺伝子１５を不活性にするために、１００μｇ／ｍｌの
エチジウムブロマイドの存在下、コスミド２Ｄ３をＳｃ
ａＩ（ニューイングランドバイオラボ社）で消化した。
ＳｃａＩは、コスミド２Ｄ３内で６箇所切断するが、エ
チジウムブロマイドの存在下で消化を行うことによる全
鎖長直鎖のコスミド分子の産生は、好都合である。Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ
社）により平滑末端コスミドにし、次いで、これらの末
端を、アルカリホスファターゼで脱燐酸化した。全解読
枠内に３個の終結コドン、およびＩ-ＰｐｏＩ認識配列
（配列番号：５）を含む５７ｂｐリンカーを直線化した
２Ｄ３内にライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨＩ
の形質転換後に生じた全てのクローンを、制限酵素分析
により分析した。遺伝子１５のみにリンカーインサート
を有するクローンを単離した。遺伝子１５ ２Ｄ３／１
５ｓｉ（図２および表１）中のコスミド２Ｄ３をリンカ
ーインサートを有するコスミドで置換し、上記のような
形質転換を行うことにより、ミュータントウィルスの再
生を行った。再生したウィルスは、プラークを３回精製
し、制限酵素分析により分析した。
エチジウムブロマイドの存在下、コスミド２Ｄ３をＳｃ
ａＩ（ニューイングランドバイオラボ社）で消化した。
ＳｃａＩは、コスミド２Ｄ３内で６箇所切断するが、エ
チジウムブロマイドの存在下で消化を行うことによる全
鎖長直鎖のコスミド分子の産生は、好都合である。Ｔ４
ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングランドバイオラボ
社）により平滑末端コスミドにし、次いで、これらの末
端を、アルカリホスファターゼで脱燐酸化した。全解読
枠内に３個の終結コドン、およびＩ-ＰｐｏＩ認識配列
（配列番号：５）を含む５７ｂｐリンカーを直線化した
２Ｄ３内にライゲーションした。Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨＩ
の形質転換後に生じた全てのクローンを、制限酵素分析
により分析した。遺伝子１５のみにリンカーインサート
を有するクローンを単離した。遺伝子１５ ２Ｄ３／１
５ｓｉ（図２および表１）中のコスミド２Ｄ３をリンカ
ーインサートを有するコスミドで置換し、上記のような
形質転換を行うことにより、ミュータントウィルスの再
生を行った。再生したウィルスは、プラークを３回精製
し、制限酵素分析により分析した。
【００７８】実施例３ 遺伝子１５組換え体ＥＨＶ-１の作製 １．遺伝子１５欠失／挿入ミュータントの構築 ＥＨＶ-１コスミド２Ｄ３をＢａｍＨＩで消化した。そ
の結果できた、遺伝子１５相同体（２０４８７-２１１
４６）を含有する７ｋｂ断片（１９３９８-２６２６
０）を、ｐＩＣ２ＯＨ（Marsh, J.L., Erfle, M. and W
ykes, E. J. 1984,Gene 32, 481-485)のＢａｍＨＩ部
位内にクローンした。ＳｔｕＩを用い、遺伝子１５内で
（２０７１９で）このプラスミド構築物を直線化した。
直線化プラスミドを、次いで、Ｂａｌ ３１エキソヌク
レアーゼ消化に供し、インキュベーション時間を変えて
インキュベーションした後、プラスミドを平滑末端に
し、配列番号：５のオリゴヌクレオチドにライゲーショ
ンし、再環状化して遺伝子１５の欠失した部分にリンカ
ーインサートを有するプラスミドを作製した。この構築
物を７Ｇ５と命名した。制限酵素地図作製および、配列
番号：５に示したオリゴヌクレオチド内のＣＭＡおよび
ＣＭＢ部位を用いた配列決定により、欠失の範囲を測定
し、挿入を確認した。欠失は、ヌクレオチド２０６３９
から２０８９４までとして示した。遺伝子１５を含有す
る６００塩基対断片を生じさせる、７Ｇ５のＤｒａＩ／
ＮｒｕＩ二重消化により二番目の遺伝子１５欠失／挿入
構築物を作製し、これを、ｐＧＥＭ-３ＺのＳａｌＩ部
位にクローンした。この構築物を遺伝子１５-Ｅ３と命
名した。
の結果できた、遺伝子１５相同体（２０４８７-２１１
４６）を含有する７ｋｂ断片（１９３９８-２６２６
０）を、ｐＩＣ２ＯＨ（Marsh, J.L., Erfle, M. and W
ykes, E. J. 1984,Gene 32, 481-485)のＢａｍＨＩ部
位内にクローンした。ＳｔｕＩを用い、遺伝子１５内で
（２０７１９で）このプラスミド構築物を直線化した。
直線化プラスミドを、次いで、Ｂａｌ ３１エキソヌク
レアーゼ消化に供し、インキュベーション時間を変えて
インキュベーションした後、プラスミドを平滑末端に
し、配列番号：５のオリゴヌクレオチドにライゲーショ
ンし、再環状化して遺伝子１５の欠失した部分にリンカ
ーインサートを有するプラスミドを作製した。この構築
物を７Ｇ５と命名した。制限酵素地図作製および、配列
番号：５に示したオリゴヌクレオチド内のＣＭＡおよび
ＣＭＢ部位を用いた配列決定により、欠失の範囲を測定
し、挿入を確認した。欠失は、ヌクレオチド２０６３９
から２０８９４までとして示した。遺伝子１５を含有す
る６００塩基対断片を生じさせる、７Ｇ５のＤｒａＩ／
ＮｒｕＩ二重消化により二番目の遺伝子１５欠失／挿入
構築物を作製し、これを、ｐＧＥＭ-３ＺのＳａｌＩ部
位にクローンした。この構築物を遺伝子１５-Ｅ３と命
名した。
【００７９】２．７Ｇ５および遺伝子１５-Ｅ３のＥＨ
Ｖ-１ ＤＮＡを用いたコトランスフェクション ストラタジーン燐酸カルシウムプロトコールを用い、直
径８ｃｍの組織培養プレート上でＢＨＫ細胞またはブタ
の腎臓（ＳＫ）細胞の細胞単層に、６μｇのＥＨＶ-１
ゲノムＤＮＡおよび細胞（乳児ハムスターの腎臓、ＢＨ
Ｋ）ＤＮＡ調製物ならびに２μｇの７Ｇ５もしくは遺伝
子１５-Ｅ３をトランスフェクションした。ＤＮＡ-燐酸
塩沈澱物と共に５時間インキュベーションし、細胞を、
ヘペス緩衝生理食塩水（ｐＨ６．９）に加えた２５％
（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯで３分間″ショック″をかけた（ト
ランスフェクション効率を高めるために）。培地中での
２回の洗浄後、細胞は、２％仔ウシ胎児血清を有するＭ
ＥＭに加えた１．５％低融点アガロースを重層し、３７
℃でインキュベーションした。４-５日培養後、プラー
クを観察した。この時点で重層を取りだし、４℃で貯蔵
した。細胞単層をニトロセルロースフィルターに接着
し、１．５Ｍ-塩化ナトリウム／０．５Ｍ-水酸化ナトリ
ウムに浸したワットマンの濾紙上で５分間インキュベー
ションすることにより細胞を破裂（または、ＤＮＡを変
性）させた。１Ｍ-トリスＣｌ（ｐＨ７．４）／１．５
Ｍ-塩化ナトリウムでアルカリを中和し、２ｘＳＳＣで
２回洗浄し、濾紙を真空オーブン内で８０℃で２時間加
熱した。濾紙を１Ｍ-塩化ナトリウム／０．１％（ｗ／
ｖ）ＳＤＳで７０℃で３０分間洗浄して蛋白および細胞
破片を除去し、続いて、Ｈ-ミックス（１Ｍ-塩化ナトリ
ウム、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび４ｘデンハルト
液を含有する１０ｍＭ-トリスＣｌ（ｐＨ８．０））中
で６０℃で３０分間プレハイブリダイゼーションした。
配列番号：５の32Ｐ-末端標識した一本鎖またはアンチ
センスストランドを、次いで、Ｈ-ミックスに加え、濾
紙を一晩ハイブリダイゼーションした。全てのものが
０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する２ｘＳＳＣ、１ｘ
ＳＳＣおよび０．５ｘＳＳＣを用い、６５℃で一連の１
５分の洗浄により、非特異的ハイブリダイゼーションシ
グナルを除去した。濾紙を、-７０℃で２日間Ｘ線フィ
ルムに露出した。
Ｖ-１ ＤＮＡを用いたコトランスフェクション ストラタジーン燐酸カルシウムプロトコールを用い、直
径８ｃｍの組織培養プレート上でＢＨＫ細胞またはブタ
の腎臓（ＳＫ）細胞の細胞単層に、６μｇのＥＨＶ-１
ゲノムＤＮＡおよび細胞（乳児ハムスターの腎臓、ＢＨ
Ｋ）ＤＮＡ調製物ならびに２μｇの７Ｇ５もしくは遺伝
子１５-Ｅ３をトランスフェクションした。ＤＮＡ-燐酸
塩沈澱物と共に５時間インキュベーションし、細胞を、
ヘペス緩衝生理食塩水（ｐＨ６．９）に加えた２５％
（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯで３分間″ショック″をかけた（ト
ランスフェクション効率を高めるために）。培地中での
２回の洗浄後、細胞は、２％仔ウシ胎児血清を有するＭ
ＥＭに加えた１．５％低融点アガロースを重層し、３７
℃でインキュベーションした。４-５日培養後、プラー
クを観察した。この時点で重層を取りだし、４℃で貯蔵
した。細胞単層をニトロセルロースフィルターに接着
し、１．５Ｍ-塩化ナトリウム／０．５Ｍ-水酸化ナトリ
ウムに浸したワットマンの濾紙上で５分間インキュベー
ションすることにより細胞を破裂（または、ＤＮＡを変
性）させた。１Ｍ-トリスＣｌ（ｐＨ７．４）／１．５
Ｍ-塩化ナトリウムでアルカリを中和し、２ｘＳＳＣで
２回洗浄し、濾紙を真空オーブン内で８０℃で２時間加
熱した。濾紙を１Ｍ-塩化ナトリウム／０．１％（ｗ／
ｖ）ＳＤＳで７０℃で３０分間洗浄して蛋白および細胞
破片を除去し、続いて、Ｈ-ミックス（１Ｍ-塩化ナトリ
ウム、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳおよび４ｘデンハルト
液を含有する１０ｍＭ-トリスＣｌ（ｐＨ８．０））中
で６０℃で３０分間プレハイブリダイゼーションした。
配列番号：５の32Ｐ-末端標識した一本鎖またはアンチ
センスストランドを、次いで、Ｈ-ミックスに加え、濾
紙を一晩ハイブリダイゼーションした。全てのものが
０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する２ｘＳＳＣ、１ｘ
ＳＳＣおよび０．５ｘＳＳＣを用い、６５℃で一連の１
５分の洗浄により、非特異的ハイブリダイゼーションシ
グナルを除去した。濾紙を、-７０℃で２日間Ｘ線フィ
ルムに露出した。
【００８０】３．組換え遺伝子１５-ＥＨＶ-１の同定お
よび検証 オリジナルのプレート上のプラークの位置、オートラジ
オグラフのスポットおよびオリエンテーション（プレー
ト、重層、フィルターおよびフィルム上に印をつけた）
を用い、アガロースのプラグを可能性のある組換えプラ
ークの位置で重層からパンチした。これらを０．５ｍｌ
の培地と共に撹拌してウィルスを放出させ、更にＳＫま
たはＢＨＫ細胞を感染させるのに用いた。これらの感染
物から得た上澄を段階希釈により用いて更にＳＫまたは
ＢＨＫ細胞を感染させ、これを、ウィルス吸着後、重層
し、次いで、オリジナルのコトランスフェクションのた
めに上記で述べたものと同じ方法で処理した。プラーク
を１または２回精製した後、配列番号：５のアンチセン
スストランドで大部分のプラークがハイブリダイズした
ことを観察した。その結果、４個のプラークから精製し
たウィルスを取り上げ、大きいフラスコのＢＨＫまたは
ＳＫ細胞を感染させるのに用いた。ＤＮＡをこれらの細
胞（オリジナルのコトランスフェクションに用いたよう
な、ウィルスおよび細胞ＤＮＡのミックス）から精製
し、ＰＣＲによる分析およびＤＮＡ配列決定（ＣＭＡお
よびＣＭＢを用い）に供してウィルスゲノム内の欠失／
挿入遺伝子１５ミュータントの存在を確認した。
よび検証 オリジナルのプレート上のプラークの位置、オートラジ
オグラフのスポットおよびオリエンテーション（プレー
ト、重層、フィルターおよびフィルム上に印をつけた）
を用い、アガロースのプラグを可能性のある組換えプラ
ークの位置で重層からパンチした。これらを０．５ｍｌ
の培地と共に撹拌してウィルスを放出させ、更にＳＫま
たはＢＨＫ細胞を感染させるのに用いた。これらの感染
物から得た上澄を段階希釈により用いて更にＳＫまたは
ＢＨＫ細胞を感染させ、これを、ウィルス吸着後、重層
し、次いで、オリジナルのコトランスフェクションのた
めに上記で述べたものと同じ方法で処理した。プラーク
を１または２回精製した後、配列番号：５のアンチセン
スストランドで大部分のプラークがハイブリダイズした
ことを観察した。その結果、４個のプラークから精製し
たウィルスを取り上げ、大きいフラスコのＢＨＫまたは
ＳＫ細胞を感染させるのに用いた。ＤＮＡをこれらの細
胞（オリジナルのコトランスフェクションに用いたよう
な、ウィルスおよび細胞ＤＮＡのミックス）から精製
し、ＰＣＲによる分析およびＤＮＡ配列決定（ＣＭＡお
よびＣＭＢを用い）に供してウィルスゲノム内の欠失／
挿入遺伝子１５ミュータントの存在を確認した。
【００８１】
配列番号：１ 配列の長さ：６８４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ウマヘルペスウイルス１ 株名：Ａｂ４ 配列の特徴 特徴を表わす記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．６８４ 配列：
【００８２】
【表２】
【００８３】配列番号：２ 配列の長さ：２２７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列：
【００８４】
【表３】
【００８５】配列番号：３ 配列の長さ：６８１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ウマヘルペスウイルス４ 株名：１９４２ 配列の特徴 特徴を表わす記号：ＣＤＳ 存在位置：１．．６８１ 配列：
【００８６】
【表４】
【００８７】
【表５】
【００８８】配列番号：４ 配列の長さ：２２６ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列：
【００８９】
【表６】
【００９０】配列番号：５ 配列の長さ：５７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の特徴 特徴を表わす記号：− 存在位置：１．．５７ 他の情報：／ラベル＝合成リンカー 配列：
【００９１】
【表７】
【図１】 生成された全ての、ＥＨＶ−１ゲノムの表記
のフラグメントを含む一部重複コスミドをまとめて示す
図である。上段はＥＨＶ−１ゲノムのＢａｍＨＩ制限酵
素マップを示す。
のフラグメントを含む一部重複コスミドをまとめて示す
図である。上段はＥＨＶ−１ゲノムのＢａｍＨＩ制限酵
素マップを示す。
【図２】ＥＨＶ−１遺伝子１５-突然変異株の一般生産
方法を示す。
方法を示す。
【図３】遺伝子１５プラスミド欠失構築物を示す。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 7/00 9281−4Ｂ // Ｃ０７Ｋ 14/03 8318−4Ｈ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 レズリー・ニコルソン イギリス国、スコツトランド、グラスゴ ー・ジー・11・５・アール・エフ、ダルク ロス・ストリート・６、フラツト・２／２
Claims (12)
- 【請求項１】 ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）の遺伝
子１５に及ぶ領域内のＥＨＶゲノムに突然変異を含んで
いるＥＨＶ突然変異株。 - 【請求項２】 ＥＨＶ突然変異株が、配列番号２に示す
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子
１５に及ぶ領域内に突然変異を有するＥＨＶ−１である
ことを特徴とする請求項１に記載のＥＨＶ突然変異株。 - 【請求項３】 ＥＨＶ突然変異株が、配列番号４に示す
アミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする遺伝子
１５に及ぶ領域内に突然変異を有するＥＨＶ−４である
ことを特徴とする請求項１に記載のＥＨＶ突然変異株。 - 【請求項４】 突然変異が挿入及び／又は欠失であるこ
とを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の
ＥＨＶ突然変異株。 - 【請求項５】 突然変異が、ウマ病原体の抗原をコード
する異種遺伝子を含む挿入であることを特徴とする請求
項４に記載のＥＨＶ突然変異株。 - 【請求項６】 ＥＨＶの遺伝子１５に及ぶＥＨＶゲノム
の領域及びそのフランキング配列を含み、前記遺伝子が
突然変異を含んでいる核酸分子。 - 【請求項７】 請求項６に記載の核酸分子を含んでいる
組換えＤＮＡ分子。 - 【請求項８】 請求項７に記載の組換えＤＮＡ分子でト
ランスフェクトした宿主細胞。 - 【請求項９】 細胞培養株を請求項７に記載の組換えＤ
ＮＡ分子及びＥＨＶゲノムＤＮＡでトランスフェクトす
ることを特徴とする請求項１から５のいずれか一項に記
載のＥＨＶ突然変異株の製造方法。 - 【請求項１０】 請求項１から５のいずれか一項に記載
のＥＨＶ突然変異株に感染させた細胞培養株。 - 【請求項１１】 請求項１から５のいずれか一項に記載
のＥＨＶ突然変異株と、医薬的に許容できる担体又は希
釈剤とを含んでなるワクチン。 - 【請求項１２】 ウマに請求項１１に記載のワクチンを
投与することからなる感染症に対するウマの免疫方法。
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-
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