JPH05227973A - マレック病に対する組換えワクチン - Google Patents
マレック病に対する組換えワクチンInfo
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Abstract
をコードする核酸配列、かかる核酸配列を含む組換え核
酸分子、前記核酸配列を含むベクターウイルス、かかる
核酸配列を用いて形質転換された宿主細胞、マレック病
ウイルスポリペプチド、かかるポリペプチドに反応性を
示す抗体、及びマレック病に対するワクチン。 【効果】 上記タンパク質は、MDV感染または疾患に
対して家禽を免疫するのに使用することができる。MD
06 MDVタンパク質をコードする核酸配列は、遺伝
子工学技術によるタンパク質製造に適用することもでき
るし、ベクターワクチンの製造に適用することもでき
る。
Description
リペプチドをコードする核酸配列、かかる核酸配列を含
む組換え核酸分子、前記核酸配列を含むベクターウイル
ス、かかる核酸配列を用いて形質転換された宿主細胞、
マレック病ウイルスポリペプチド、かかるポリペプチド
に反応性を示す抗体、及びマレック病に対するワクチン
に係わる。
スであるマレック病ウイルス(MDV)によって引き起
こされる家禽の悪性リンパ増殖性疾患である。MDは、
世界中の家禽生産国のいたるところで発生している。集
約生産システム下で飼育されたニワトリはMDによる損
失を被ることは免れ得ない。MDは約6週齢以上のニワ
トリに感染するが、12〜24週齢の間に最も多発す
る。
過性麻痺の3つの形態のMDが認識されている。
因する末梢神経肥大を特徴としており、麻痺が主な臨床
症状である。致死率は可変であるが、通常は10〜15
%以下である。
汎性のリンパ腫瘍がある。この形態のMDによる致死率
は通常は古典的形態よりも高い。ワクチン未接種の集団
においては10〜30%の罹患率が一般的であり、集団
の70%までを巻き込む発病もあり得る。古典的及び急
性MDの病理学的病変は実質的に類似であって、悪性形
質転換Tリンパ芽球の増殖、及び、正常組織、即ち古典
的形態のケースでは末梢神経中への、また急性形態のケ
ースでは内臓臓器中への該Tリンパ芽球の浸潤を含む。
リの脳炎の原因となることも判っている。
以下の3つの血清型に大別される。
性であるマレック病ウイルスの天然有毒株、及びその弱
毒化非病原性株、 2型:マレック病ウイルスの天然非病原性株、並びに 3型:ニワトリ対して非病原性であるシチメンチョウヘ
ルペスウイルスHVT。
と病原性及び発癌性は失われるが、免疫原性はなくなら
ないことが判った。HPRS−16及びCVI−988
由来の弱毒化株はワクチンとして適用されている。SB
−I及びHN−I MDV株(血清型2)も予防接種に
有効であることが示されている。最初はシチメンチョウ
から単離されたHVTは、シチメンチョウ及び家禽にお
いては非病原性であり、抗原性の点で血清型1及び2の
MDウイルスと関連をもち、MDに対するワクチンとし
て広く使用されている。
を感染源即ち病源から隔離する管理方法をとったり、遺
伝的に耐性のある品種を使用したり、予防接種するなど
による対応策がとられている。しかしながら、管理方法
によるものは一般にコスト面で効率的でなく、遺伝的に
制御された優れた耐性を有する家禽品種の選択に関して
の進歩は期待されるほどでない。今日では、MDの対応
策はほぼ完全に予防接種に基づいている。
ウイルスワクチンまたは改変された生ウイルスワクチン
からなる。しかしながら、不活化ワクチンは追加免疫を
必要とし、不利なことにはアジュバントを含んでおり、
製造するのが高価であり、投与するのに労力を要する。
更に、ある種の感染ウイルス粒子は不活化過程において
生き残り、動物に投与した後に病気を惹起し得る。
くは体液性及び細胞性の両反応に基づく免疫応答を惹起
するが故に好ましい。これまでは血清型1のMDV株を
ベースとするワクチンのみが、有毒株を組織培養体中で
数代培養することにより製造することができた。しかし
ながらこの処理のため、制御し得ない突然変異がウイル
スゲノム中に導入され、毒性(virulence)及
び免疫特性に関して異種のウイルス粒子の集団をもたら
す。細胞培養物中での継代の間の過剰な弱毒化は、上記
ワクチンにとって問題となり得る。ワクチンが有毒では
ないことを保証しながらそれが依然として保護性である
ことを保証するという微妙なバランスが得られねばなら
ない。更に、このような従来の弱毒化生ウイルスワクチ
ンは毒性を取り戻して接種動物を発病させたり、病原体
を他の動物に拡散する恐れがあり得ることが良く知られ
ている。生HVTワクチンによってはあまり防御されな
いMDウイルスの極めて有毒な野生株の存在が報告され
ており、世界中の種々の場所で甚だしい損失の原因とな
っている。血清型2及び3の株からなる二価ワクチン
は、場合によっては極めて有毒な野生単離体に対して適
度に有効である。血清型1の血清抗原を含む多価ワクチ
ンは、上記極めて有毒な株に対する免疫を誘発すること
においてずっと有効であるはずである。
ンを構築することができる。かかるワクチンは、MDV
病原体に対する防御免疫応答を誘発し得て且つ生ワクチ
ンまたは不活化ワクチンの前述の欠点をもたない、必須
及び関連MDV免疫原性材料、または前記材料をコード
する遺伝情報のみを含む。
家禽を免疫するためのワクチン製造に適用し得る、MD
Vタンパク質MD06の1つ以上の抗原決定基(imm
unogenic determinant)を有し、
SEQ ID NO:2に示したアミノ酸配列またはそ
の機能性変形体(functional varian
t)を有するポリペプチドをコードする単離・精製され
た核酸配列を提供する。
は、MDVゲノム内の非反復長鎖(unique lo
ng,UL)領域と内部反復構造要素(IRL)との接
合部近傍に位置しており、推定分子量32kDaに相当
するアミノ酸約290個の長さのポリペプチドをコード
する。
は、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、即ちリ
ボ核酸配列及びデオキシリボ核酸配列の両方を指す。原
則として、この用語は分子の一次構造を指す。即ちこの
用語は、二重鎖及び一重鎖DNAと、二重鎖及び一重鎖
RNAと、それらの変形体とを含む。
学的活性を有するアミノ酸の分子鎖を指しており、特定
の長さの生成物を指しているわけではなく、必要であれ
ば例えばグリコシル化、アミド化、カルボキシル化また
はホスホリル化によってinvivoまたはin vi
troで修飾することができるものであって、特に、ペ
プチド、オリゴペプチド及びタンパク質がこれに含まれ
る。
基を有するポリペプチド”なる用語は、家禽においてM
DV感染または疾患に対する免疫応答を誘発し得る1つ
以上のエピトープを有するポリペプチドを指す。
チドの機能性変形体をコードする核酸配列もまた本発明
の範囲に含まれる。かかる機能性変形体は、SEQ I
DNO:2に特に記載したアミノ酸配列から誘導される
アミノ酸配列を有するポリペプチドであるが、MDVタ
ンパク質の1つ以上の抗原決定基を保有している。即
ち、前記変形体は、家禽においてMDV感染または疾患
に対して免疫応答を誘発し得る1つ以上のエピトープを
有する。
に含まれる特定のポリペプチドにおいて、マレック病ウ
イルスの個々のウイルスまたは株間に天然変異が存在し
得ることを理解されたい。かかる変異は、配列全体にお
けるアミノ酸相違、即ち前記配列中のアミノ酸の欠失、
置換、挿入、逆位もしくは付加によって示され得る。生
物学的及び免疫学的活性を実質的に変えないことが推定
され得るアミノ酸置換が記載されている。関連アミノ酸
間のアミノ酸置換または進化の過程で多発する置換は特
にSer/Ala、Ser/Gly、Asp/Gly、
Asp/Asn、Ile/Valである〔Dayho
f,M.D.,Atlas of protein s
equence and structure,Na
t.Biomed.Res.Found.,Washi
ngton D.C.,1978,vol.5,sup
pl.3参照〕。この情報に基づき、LipmanとP
earsonは、迅速で且つ高感度のタンパク質比較方
法〔Science 227,1435−1441,1
985〕を開発し、同種ポリペプチド間の機能的類似性
(functional similarity)を決
定した。このような同種の機能性変形体をコードする核
酸配列も本発明の範囲内に含まれる。更に、かかる種々
の機能性変形体をコードする核酸配列を製造するために
組換えDNA技術を使用し得る可能性もある。
S−16、Conn A、RB−IB、CVI−988
またはMd 11といったMDV株の単離体から誘導す
ることができるが、GA株〔Eidson and S
chnitte,AvianDiseases 12,
467,1968〕が最も好ましい株である。
ごときその機能性変形体をコードする核酸配列は、血清
型2または3に属するMDV株、例えばHN、HPRS
−24、SB−1またはFC126から誘導することも
できる。
た情報によって、当業者は、本明細書に特に開示するM
D06 MDVタンパク質に対応する免疫学的特性を有
する上述の種々の機能性変形体ポリペプチドをコードす
る核酸配列を単離及び同定することができる。このため
には、一般に適用されているサザンブロット法またはコ
ロニーハイブリダイゼーションを使用することができる
〔Experiments in Molecular
Biology,ed.R.J.Slater,Cl
ifton,U.S.A.,1986;Singer−
Sam,J.et al.,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.80,802−806,1983;Ma
niatis T.et al.,Molecular
Cloning,A laboratory Man
ual,second edition,Cold S
pring Harbor Laboratory P
ress,USA,1989〕。例えば、特定のMDV
株から誘導される制限酵素消化DNAフラグメントを電
気泳動し、ニトロセルロースフィルター片上に移動さ
せ、またはその後に“ブロット”する。そうすると、S
EQ ID NO:2に示したアミノ酸配列から逆翻訳
された既知の標識DNA、即ち“プローブ”に、フィル
ター上に存在するいずれかの同種DNA配列にプローブ
がハイブリダイズし得る特定の塩濃度及び温度条件下で
ハイブリダイズすることにより、フィルター上の機能性
変形体ポリペプチドをコードする核酸配列を同定するこ
とができる。フィルターを洗浄した後、ハイブリダイズ
した材料はオートラジオグラフィーによって検出するこ
とができる。一旦関連配列を同定したならば、アガロー
スゲル電気泳動ののちに、SEQ ID NO:2に示
したポリペプチドに対する機能性変形体ポリペプチドを
コードするDNAフラグメントを回収することができ
る。
ynhら〔In:D.Glover(ed.),DNA
Cloning:A Practical Appr
oach,IRL Press Oxford,49−
78,1985〕によって記載されているようにλgt
11ファージ中でクローニングし、細菌宿主中で発現さ
せることができる。次いで組換えファージを、SEQ
ID NO:2に示した精製MD06 MDVに対して
産生されたポリクローナル血清を用いてスクリーニング
し、変異ポリペプチドの対応する免疫学的領域の存在を
決定することができる。上述の方法は実施例1において
詳細を示す。MD06 MDVタンパク質に対して誘導
される、本明細書において使用されるポリクローナル血
清の製造は後述する。
単離し、それをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を含
む組換えDNA技術によって複製することもできるし、
または当分野において公知の技術によってin vit
roで化学的に合成することもできる。
D NO:1に示したDNA配列の少なくとも一部分を
含むことを特徴とする。
ドの縮重によって、他のコドンとなるがそれでも同じア
ミノ酸をコードするようにコドン中の塩基を置換するこ
とができる。例えばアミノ酸の1つであるグルタミン酸
に対するコドンは、GAT及びGAAの両方である。そ
の結果、SEQ ID NO:2に示したアミノ酸配列
を有するポリペプチドの発現においては、SEQ ID
NO:1に示した核酸配列とは異なるこのような別の
コドン組成を有する変異核酸配列を使用することができ
る。
パク質をコードする核酸配列または上述のごときその機
能性変形体のフラグメントも本発明に含まれる。
は、本発明の核酸配列またはポリペプチドの配列を含む
DNAまたはアミノ酸配列を意味する。前記フラグメン
トは、MD06 MDVタンパク質の1つ以上の抗原決
定基を有するポリペプチドであるかまたはそれをコード
するものであり、従って、家禽における免疫応答を誘発
し得るMD06タンパク質の1つ以上のエピトープを有
する。使用可能なポリペプチドフラグメントを決定する
方法はその概略を後述する。フラグメントは特に、DN
Aに対しては制限エンドヌクレアーゼを、またポリペプ
チドに対してはプロテアーゼを使用し、前駆分子を酵素
切断することにより作製することができる。他の方法と
しては、フラグメントの化学的合成またはDNAフラグ
メントによるポリペプチドフラグメントの発現を挙げる
ことができる。
タンパク質の1つ以上の抗原決定基を保有している限り
は、特に例示したポリペプチドの上記機能性変形体をも
たらす全ての改変が本発明の範囲内に含まれる。
たは本来結合していない種々の複製実施DNA配列に連
結して、適当な宿主の形質転換に使用し得る所謂組換え
ベクター分子とすることができる。有効な組換えベクタ
ー分子は、例えばプラスミド、バクテリオファージ、コ
スミドまたはウイルスから誘導されるのが好ましい。
使用され得る特定のベクターまたはクローニングビヒク
ルは当分野において良く知られており、特に、pBR3
22、種々pUC、pGEM及びブルースクリプト(B
luescript)プラスミドといったプラスミドベ
クター、λgt−Wes−λB、Charon 28及
びM13誘導ファージといったバクテリオファージ、並
びに、SV40、アデノウイルスもしくはポリオーマウ
イルスといったウイルスベクターを挙げることができる
〔Rodriquez,R.L.及びD.T.Denh
ardt,ed.,Vectors:A survey
of molecular cloning vec
tors and their uses,Butte
rworths,1988;Lenstra,J.A.
et al.,Arch.Virol.110,1−2
4,1990参照〕。本発明の組換えベクター分子の構
築に使用される方法は当業者には公知であり、特に、M
aniatis,T.ら〔Molecular Clo
ning A Laboratory Manual,
second edition;Cold Sprin
g HarborLaboratory,1989〕に
記載されている。
中に挿入するのは、例えば遺伝子と所望のクローニング
ビヒクルとを、相補的DNA末端を生成したのと同じ制
限酵素で切断しておけば容易に行なうことができる。
適当なDNAポリメラーゼを用いてその一重鎖末端に充
填することにより制限部位を改変して、ブラント末端を
形成することが必要となり得る。次いで、T4 DNA
リガーゼのような酵素を用いてブラント末端を連結する
ことができる。
結することにより任意の制限部位を生成することができ
る。このようなリンカーは、制限部位配列をコードする
特定のオリゴヌクレオチド配列を含み得る。制限酵素で
切断されたベクター及び核酸配列は、ホモポリマーテー
リング(homopolymeric tailin
g)よって改変することもできる。
えば直接取込みまたは形質導入などの使用する方法に関
係なく、異種核酸配列を宿主細胞中に導入することを指
す。異種核酸配列は、自律的複製によって維持され得る
か、或いは宿主ゲノム中に組込まれ得る。所望であれ
ば、予定される宿主に適合し得ると共に挿入された核酸
配列の発現を調節し得る適当な制御配列を組換えベクタ
ー分子に与える。微生物に加え、多細胞生物由来の細胞
培養物も宿主として使用し得る。
22においてはアンピシリン及びテトラサイクリン耐
性、pUC8においてはアンピシリン耐性及びβ−ガラ
クトシダーゼ活性のような、所望の形質転換体を選択す
るのに使用し得る1種以上のマーカー活性物質を含むこ
とが好ましい。
する核酸配列によってまたはかかる核酸配列を含む組換
えベクター分子によって形質転換され得て、且つ所望で
あればそれを使用して前記核酸配列によってコードされ
る前記ポリペプチドを発現させ得る原核または真核細胞
である。宿主細胞は、原核細胞起源のもの、例えばEs
cherichia coli、Bacillus s
ubtilis及びPseudomonas種のような
細菌、または真核細胞起源のもの、例えばSaccha
romyces cerevisiaeのような酵母
や、例えばHeLa細胞及びチャイニーズハムスター卵
巣(Chinese hamster ovary,C
HO)細胞を含む昆虫、植物もしくは哺乳動物細胞のよ
うなより高等の真核細胞とすることができる。昆虫細胞
としては、Spodopterafrugiperda
のSf9細胞系〔Luckow et al.,Bio
−technology 6,47−55,1988〕
を挙げることができる。真核細胞クローニング系におけ
る本発明の核酸配列のクローニング及び発現に関する情
報は、Esser,K.ら〔Plasmids of
Eukaryotes,Springer−Verla
g,1986〕に見ることができる。
る上でDNA配列をクローニングするには、原核細胞が
好ましい。例えばE.coli K12や、DH5αま
たはJM101のような誘導株が特に有効である。
ベクター中に導入する。即ち本発明の核酸配列を発現制
御配列に操作可能なように連結する。このような制御配
列は、プロモーター、エンハンサー、オペレーター、イ
ンデューサー、リボソーム結合部位などを含む得る。従
って本発明は、その中に含まれるDNA配列を形質転換
宿主細胞中で発現し得る、発現制御配列に操作可能なよ
うに連結されているMD06 MDVタンパク質をコー
ドする核酸配列を含む組換えベクター分子を提供する。
部位に挿入されているヌクレオチド配列は、形質転換宿
主がMD06 MDVタンパク質の1つ以上の抗原決定
基を有するポリペプチドを産生する限りは、所望のポリ
ペプチドに対する実際の構造遺伝子の一部分ではないヌ
クレオチドを含むこともできるし、所望のタンパク質に
対する全構造遺伝子のフラグメントのみを含むこともで
きる。
制御配列の例としては、Trpプロモーター及びオペレ
ーター〔Goeddel,et al.,Nucl.A
cids.Res.8,4057,1980〕、lac
プロモーター及びオペレーター〔Chang,et a
l.,Nature 275,615,1978〕、外
膜タンパク質プロモーター〔Nakamura,K.及
びInouge,M.,EMBO J.1,771−7
75,1982〕、バクテリオファージλプロモーター
及びオペレーター〔Remaut,E.et al.,
Nucl.Acids Res.11,4677−46
88,1983〕、α−アミラーゼ(B.subtil
is)プロモーター及びオペレーター、終結配列、並び
に選択された宿主細胞と適合し得る他の発現増強及び制
御配列を挙げることができる。宿主細胞が酵母であるな
らば、有効な発現制御配列の例としては、例えばα接合
因子を挙げることができる。昆虫細胞においてはポリヘ
ドリンまたはバキュロウイルスのp10プロモーターを
使用することができる〔Smith,G.E.eta
l.,Mol.Cell.Biol.3,2156−6
5,1983〕。宿主細胞が哺乳動物起源のものである
ならば、有効な発現制御配列の例としては例えばSV4
0プロモーター〔Berman,P.W.et a
l.,Science 222,524−527,19
83〕、メタロチオネインプロモーター〔Brinst
er,R.L.,Nature 296,39−42,
1982〕、または熱ショックプロモーター〔Voel
lmy et al.,ProcNatl.Acad.
Sci.USA 82,4949−53,1985〕を
挙げることができる。或いは、MDV中に存在する発現
制御配列、特にMD06タンパク質の発現を調節するも
のも適用することができる。遺伝子発現を最大にするた
めには、Roberts及びLauer〔Method
s in Enzymology 68,473,19
79〕も参照されたい。
え発現ベクター分子を用いて形質転換され、該核酸配列
の発現によってMD06 MDVタンパク質を産生し得
る宿主細胞をも提供する。
示されたアミノ酸配列またはその機能性変形体を有する
が、ウイルス全体または通常該ウイルスに伴う他のタン
パク質は実質的に含まない、MD06 MDVタンパク
質の1つ以上の抗原決定基を有する精製ポリペプチドを
も提供する。
ノ酸配列の誘導体、即ち機能性変形体もまた本発明の範
囲内にあると理解されたい。
ペプチドの機能性変形体としては、他の血清型1のMD
ウイルス株中(または血清型2もしくは3に属するウイ
ルス株中)に存在する対応するポリペプチドを挙げるこ
とができる。前記等価物は、該等価物をコードする遺伝
子の発現により産生され得るが、この遺伝子は、本明細
書中に与えられた上述のごとき情報を使用することで同
定及び単離される。
の免疫のため、またはMD06 MDVタンパク質の免
疫原性フラグメントを実質的に含む診断のために使用し
得るポリペプチドも本発明に含まれる。アミノ酸配列中
でこのような使用可能なポリペプチドフラグメントを検
出する種々の方法が公知である。
当な免疫化学的に活性の免疫原性フラグメントは、特許
WO 86/06487号,Geysen,H.M.ら
〔Proc.Natl.Acad.Sci.81,39
88−4002,1984〕、所謂ペプスキャン法(p
epscan method)に基づくGeysen,
H.M.ら〔J.Immunol.Meth.102,
259−274,1987〕に見出すことができる。ペ
プスキャン法においては、問題の完全ポリペプチドの部
分配列に対応していて一部重複する一連のポリペプチド
を合成し、それらの抗体との反応性を調査する。
ドの多数の領域を、理論的考察及び既に知られているエ
ピトープとの構造的一致に基づき、エピトープとして指
定することができる。これらの領域の決定は、Hopp
及びWoods〔Proc.Natl.Acad.Sc
i.78,3824−3828,1981〕の親水性基
準とChou及びFasman〔Advances i
n Enzymology 47,45−148,19
87〕の二次構造予測の組合せに基づいて行い得る。
rzofskyの両親媒性基準〔Science,23
5,1059−62,1987〕を用いて理論的基礎の
もとに同様に誘導することができる。
核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を有するポ
リペプチドが使用される。
は、例えば、本発明のポリペプチドを所謂サブユニット
ワクチンとして免疫学的に有意な状況において動物に投
与することにより行ない得る。本発明のサブユニットワ
クチンは、必要によっては医薬的に容認可能な担体の存
在下に、純粋形態のポリペプチドを含み得る。ポリペプ
チドは必要によっては、例えば融合生成物の精製におい
て有利となり得る非関連タンパク質に共有結合すること
もできる。この例としては、β−ガラクトシダーゼ、プ
ロテインA、プロキモシン、血液凝固因子Xaなどを挙
げることができる。
に対する中和抗体を産生する能力が低くなり得る。免疫
原性を高めるために、小フラグメントは担体分子に結合
させることが好ましい。これに適した担体としては、天
然ポリマー(key hole limpetヘモシア
ニン、アルブミン、毒素のようなタンパク質)、合成ポ
リマー(ポリリシン、ポリアラニンのようなポリアミノ
酸)、または両親媒性化合物(例えばサポニン)のミセ
ルような巨大分子を挙げることができる。或いはこれら
のフラグメントは、好ましくは直鎖状のポリマーとして
提供することもできる。
れるポリペプチドは、例えば前記ポリペプチドをMDV
から単離したり、組換えDNA技術または化学的合成と
いった当分野においては公知の方法によって作製するこ
とができる。
明に従うポリペプチドは、例えばグルコシル化、アミド
化、カルボキシル化またはホスホリル化によってin
vitroまたはin vivoで修飾することができ
る。
ターワクチンである。本発明の核酸配列は微生物(例え
ば細菌またはウイルス)中に組換えDNA技術によっ
て、組換え微生物が尚も複製可能であり、従って挿入さ
れた核酸配列によってコードされるポリペプチドを発現
し、感染宿主動物において免疫応答を誘発するように導
入される。
クターウイルスに感染した宿主細胞または宿主動物中で
DNA配列を発現し得る、上述の異種核酸配列を含む組
換えベクターウイルスである。“異種”なる用語は、本
発明の核酸配列がベクターウイルス中に通常は実際に存
在しないか、または天然ベクターウイルス中と同じ遺伝
的状況において存在しないことを示唆する。
DVタンパク質を産生し得る、組換えベクターウイルス
に感染させた宿主細胞または細胞培養物をも含む。
使用し、異種核酸配列、例えば本発明の核酸配列をベク
ターウイルスのゲノム中に導入することができる。
ち、感染または複製に必要なもののようなベクターの必
須機能を破壊することなく異種配列の組込みに使用し得
る領域に対応するDNAフラグメントを、標準recD
NA技術に従ってクローニングベクター中に挿入する。
多数の微生物に関して挿入領域が報告されている〔例え
ば欧州特許第80,806号、欧州特許第110,38
5号,欧州特許第83,286号、欧州特許第314,
569号、WO88/02022号及びWO88/07
088号〕。
得られた組換えベクター分子中に存在する挿入領域中に
欠失を導入することができる。これは、例えば、第1の
ステップで得られた組換えベクター分子を適当なエキソ
ヌクレアーゼIIIで消化するか、または制限酵素処理す
ることにより行ない得る。
分子中に存在する挿入領域または前記組換えベクター分
子から欠失させたDNAの箇所に、異種核酸配列を挿入
する。挿入領域のDNA配列は、ベクターゲノムとの相
同的組換えが起こり得るような適当な長さのものである
べきである。次いで、適当な細胞を野生型ベクターウイ
ルスに感染させるか、または、適当なベクターDNA配
列をフランキング配置させた挿入物を含む組換えベクタ
ー分子の存在下にベクターゲノムDNAを用いて形質転
換し、それによって組換えベクター分子とベクターゲノ
ムの対応する領域間で組換えを起こす。組換えベクター
子孫は細胞培養液中で産生させることができ、例えばハ
イブリダイズしたり、異種核酸配列と一緒に組み込んだ
遺伝子によってコードされる酵素活性を検出したり、ま
たは組換えベクターによって発現される抗原性異種ポリ
ペプチドを免疫学的に検出することにより、遺伝子型ま
たは表現型で選択することができる。
に投与し、所定時間維持し、またときには接種動物の体
内で複製させ、本発明の挿入核酸配列によってコードさ
れるポリペプチドをin vivoで発現させ、接種動
物の免疫系を刺激する。本発明の核酸配列の取込みに適
したベクターは、(トリ)ポックスウイルス(例えばワ
クシニアウイルスまたはニワトリポックスウイルス(欧
州特許第314,569号及びWO88/02022
号))、ヘルペスウイルス(例えばHVTのようなマレ
ック病ウイルスのワクチン株(WO 88/07088
号)または血清型1もしくは2のMDV株)、アデノウ
イルスもしくはインフルエンザウイルスといったウイル
ス、または、例えばE.coliもしくは特定のサルモ
ネラ種のような細菌から誘導することができる。これら
のベクターは、ポリペプチドが宿主動物の免疫系によっ
て効率的に認識されるように設計することができる。こ
の点については、前記ポリペプチドを、合成シグナル及
びアンカー配列、または、例えばニューカッスル病ウイ
ルス由来の赤血球凝集素ノイラミニダーゼタンパク質の
ような別のウイルスもしくは細菌病原体由来の抗原と融
合することが考えられる。前記免疫原性ポリペプチド
は、所望であればより大きなものの一部として、免疫さ
れるべき動物内部で放出させることも可能である。この
ような場合には全て、1種以上の免疫原性産物が、種々
の病原体及び/または所与の病原体の種々の抗原に対す
る防御を起こす発現をなすことが可能である。
含む組換えベクターウイルスに感染させた宿主細胞を培
養し、その後、ウイルスを含む細胞及び/または細胞中
で増殖した組換えベクターウイルスを、必要によっては
純粋形態で回収することにより製造することができる。
ベクターワクチンを製造する別の可能性は、本発明の核
酸配列を感染性細菌または寄生生物内に取込み、かかる
改変感染体を培養することである。必要によっては純粋
形態で回収した後、必要であれば凍結乾燥形態のワクチ
ンを製造することができる。
れた宿主細胞は、前記核酸配列によってコードされるポ
リペプチドの発現に好ましい条件下に培養することがで
きる。ワクチンは、粗培養体、宿主細胞溶解物または宿
主細胞抽出物の試料を使用して製造することができる
が、別の実施態様においては、より精製された本発明の
ポリペプチドが、その用途に応じてワクチンに成形され
る。産生されたポリペプチドを精製するためには、本発
明の組換えベクターで形質転換された宿主細胞を適量で
培養し、産生されたポリペプチドをかかる細胞から、ま
たはタンパク質が分泌されるのであれば培地から単離す
る。培地中に分泌されたポリペプチドは、標準的な技
術、例えば塩析、遠心分離、限外濾過、クロマトグラフ
ィー、ゲル濾過またはイムノアフィニティークロマトグ
ラフィーによって単離及び精製することができるが、細
胞内ポリペプチドは、まず前記細胞を回収し、例えば超
音波処理またはフレンチプレスのような他の機械的破砕
手段によって細胞を破砕し、次いでポリペプチドを他の
細胞内成分から分離することにより単離することがで
き、そうしてポリペプチドをワクチンに成形する。細胞
破砕は、化学的手段(例えばEDTA処理)またはリゾ
チーム消化のような酵素的手段によっても行ない得る。
抗血清は、受動免疫療法、診断イムノアッセイ及び抗イ
ディオタイプ抗体の産生に使用し得る可能性がある。
を使用し、ポリクローナル、単一特異性及びモノクロー
ナルいずれの抗体をも生産することができる。ポリクロ
ーナル抗体が所望であれば、ポリクローナル血清を作製
及び処理する技術は当分野において公知である〔例えば
Mayer and Walter,eds,Immu
nochemical Methods in Cel
l and Molecular Biology,A
cademic Press,London,198
7〕。簡単に述べると、選択した哺乳動物、例えばウサ
ギに上述の免疫原を、免疫1回当たり約20μg〜約8
0μgのタンパク質の量で(複数回)注射する。免疫
は、容認可能なアジュバント、一般的には等容量の免疫
原及びアジュバントを用いて与えられる。容認可能なア
ジュバントとしては、完全フロイント、不完全フロイン
ト、ミョウバン沈降物または油中水型エマルジョンを挙
げることができるが、初回免疫には完全フロイントアジ
ュバントが好ましい。不完全フロイントアジュバントは
全ての追加免疫に対して好ましい。初回免疫は、約1m
lのエマルジョンをウサギの背部の複数の皮下部位に投
与することからなる。等容量の免疫原を使用する二次免
疫は約1カ月の間隔で、個々のウサギの血清中に適当な
レベルの抗体が現れるまで続けて与える。血液を採取
し、当分野においては公知の方法によって血清を単離す
る。
を精製タンパク質を用いて前述のごとく免疫することに
より製造した多特異性抗血清から、Hallらの方法
〔Natuer 311,379−387 1987〕
の改良法によってアフィニティー精製する。本明細書に
おいて使用される単一特異性抗体とは、単一抗体種また
は関連抗原に対して同種結合特性を有する複数抗体種と
定義される。本明細書において使用される同種結合と
は、特定の抗原またはエピトープに結合する抗体種の能
力を指す。
示すモノクローナル抗体は、近親交配マウス、好ましく
はBalb/cを適当なタンパク質で免疫することによ
り作製することができる。マウスを、等容量の容認可能
なアジュバント中の0.5mlの用量当たり約100n
g〜約10μgの免疫原で腹腔内に免疫する。このよう
な容認可能なアジュバントとしては、完全フロイント、
不完全フロイント、ミョウバン沈降物及び油中水型エマ
ルジョンを挙げることができる。初回免疫の約14、2
1及び63日後、アジュバントなしで等容量の免疫原を
マウスに静脈内追加免疫する。最後の追加免疫の約3日
後、個々のマウスの抗免疫原抗体を血清学的に調査す
る。抗体を産生したマウスの脾細胞を単離し、SP−2
/0などのようなネズミ骨髄腫細胞と当分野においては
公知の技術によって融合する〔Kohler and
Milstein,Nature 256;495−4
97,1975〕。ヒポキサンチン、チミジン及びアミ
ノプテリンを含有させたダルベッコ改良イーグル培地
(DMEM)のような適当な細胞培地中での増殖によ
り、ハイブリドーマ細胞を選択する。抗体産生ハイブリ
ドーマを、好ましくはMacPhersonの軟寒天法
〔Soft Agar Techniques,Tis
sue Culture Methods and A
pplications,Kruse and Pat
erson,eds.,AcademicPress,
276,1973〕を使用してクローニングする。適当
な培地中で培養するために、個々のコロニーを培養プレ
ートの個別のウェル中に移す。適当な免疫原を用いてス
クリーニングすることによって抗体産生細胞を同定す
る。免疫原に陽性を示すハイブリドーマ細胞を、当分野
においては公知の技術によって維持する。特定の抗モノ
クローナル抗体は、このハイブリドーマをin vit
roで培養するか、または、当分野においては公知の方
法によってハイブリドーマを注入してからマウスの腹水
を採取することにより製造することができる。
病原体の抗原の“内部像(internal imag
e)”を保持しており、ワクチンにおいて免疫原として
使用され得る免疫グロブリンである〔Dreesman
et al.,J.Infect.Disease
151,761,1985〕。抗イディオタイプ抗体を
産生させる技術は当分野において公知である〔MacN
amara et al.,Science 226,
1325,1984〕。
ームにおいて投与することができる。即ち、投与製剤に
適合し得る態様で且つ予防上及び/または治療上有効な
つまり免疫原性となる量、即ち有毒MDVによる攻撃に
対して動物体内で免疫を誘導する抗原またはそれを発現
し得る組換え微生物の量で、1回または複数回投与する
ことができる。免疫とは、予防接種後の動物集団におい
て、予防接種していないグループと比較してより高いレ
ベルの防御が誘導されることと定義される。
動物当たりの投与量は、1×102〜1×106注入単位
(injectivity units)とすることが
できる。
は、10μg〜1mgの本発明のポリペプチドを含む。
肉内、腹腔内、静脈内、経口または鼻腔内投与すること
ができる。
は保存寿命を増大するために、多くは他の成分と混合し
た水性媒質または水含有懸濁液を含むことができる。こ
れらの成分は、塩、pH緩衝液、安定化剤(例えばスキ
ムミルクまたはカゼイン加水分解物)、免疫応答を向上
するための乳化剤アジュバント(例えばオイル、ムラミ
ルジペプチド、水酸化アルミニウム、サポニン、ポリア
ニオン及び両親媒性物質)、及び保存剤であり得る。
するために、感染性気管支炎ウイルス(IBV)、ニュ
ーカッスル病ウイルス(NDV)、感染性滑液嚢病ウイ
ルス(IBDV)または本明細書に記載のものとは異な
るマレック病ウイルスの抗原のような、他の家禽病原体
に関係する免疫原を含むこともできるし、かかる免疫原
をコードする核酸配列を含むこともできることは明らか
である。
む“免疫化学試薬”にも係わる。
リペプチドを適当な支持体に結合させたり、またはそれ
に標識物質を与えることを意味している。
クロ試験ウェル、キュベット、試験管もしくは毛細管の
内壁、膜、フィルター、試験ストリップ、またはラテッ
クス粒子、赤血球、染料ゾル、金属ゾルもしくはゾル粒
子としての金属化合物のような粒子の表面を挙げること
ができる。
性同位元素、蛍光化合物、酵素、染料ゾル、金属ゾル、
またはゾル粒子としての金属化合物を挙げることができ
る。
組織中でMDV関連核酸を検出するためのハイブリダイ
ゼーション実験用の特定のプローブを設計することがで
きる。
断に有効な前記核酸配列を含む試験キットも提供する。
免疫化学試薬を含む、イムノアッセイに使用される試験
キットにも係わる。
学反応は好ましくは、サンドイッチ反応、凝集反応、競
合反応または阻害反応である。
験キットは例えば、固体支持体例えばマイクロ試験ウェ
ルの内壁に結合させた本発明のポリペプチドと、本発明
の標識ポリペプチドまたは標識抗体かのいずれかとから
なる得る。
リーニング ライブラリーの構築に使用したベクターはλgt11
〔Young,R.A.and Davis,R.W.
Proc.Natl.Acad.Sci.80,119
4−1198,1983〕及びλEMBL−3であっ
た。λgt11発現ベクターのゲノムは、酵素β−ガラ
クトシダーゼをコードする機能的LacZ遺伝子を含ん
でおり、カルボキシ末端近傍に唯一のEcoRI制限部
位を有する。MDVゲノム由来のDNA断片を前記部位
に挿入すると、β−ガラクトシダーゼの主要部分に融合
したMDV特異的ポリペプチドからなるタンパク質の発
現をもたらし得る。複雑な多数のDNA断片を表わすラ
イブラリーは、MDV感染トリ由来の血清のような抗体
プローブによって認識される融合タンパク質を産生する
組換えクローンについて高密度でスクリーニングするこ
とができる。
ーは、平均サイズ約18kbpの挿入物を含む約100
個の独立のλEMBL−3組換え体からなった。これら
の組換え体を、MDV株GAに感染したニワトリ胚線維
芽細胞(CEF)の全DNA含有物を表わすファージラ
イブラリーをMDV特異的配列を含むBamHIプラス
ミドクローンのプールからなるプローブ〔Fukuch
i et al.,J.Virol.51,102,1
984〕とハイブリダイスさせることにより選択した。
増幅したGA特異的EMBL−3ライブラリー由来のD
NAを、制限酵素AluI、RsaI及びHaeIII
の混合物を用いて部分消化することにより断片化した。
大きさ0.5〜4.0kbの断片を単離し、dG残基で
テーリングし、λgt10ベクター〔Le Bouc
et al.,FEBS lett.196,108,
1986;Huynh et al.,in:Clon
ing Techniques,A Practica
l Approach,ed.Glover,D.,4
9−78,1985〕の唯一のEcoRI部位中に合成
アダプターによって挿入し、有効サイズ4×104pf
uを有するライブラリーを得た。ファージを増幅し、C
sCl勾配上で精製し、DNAを抽出し、EcoRIに
よる制限によって挿入物を回収した。最後に、これらの
挿入物をλgt11ベクターのEcoRI部位に連結
し、MDVに対するニワトリ血清を用いて組換えファー
ジをスクリーニングした。
〔Cornell University,NY,US
A〕から入手したMDV由来GA株の有毒性継代物で単
冠ハクショクレグホン(single−comb wh
ite leghorns,SPAFAS)を感染させ
ることにより得た。12週間にわたって血清を採取し、
ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)の組織培養体中のMD
Vプラークへの結合について、間接蛍光法によって試料
を個々に試験した。
択した。これら試料の混合物を100倍に希釈して使用
し、Young,R.A.ら〔Proc.Natl.A
cad.Sci.U.S.A.82,2583,198
5〕に従ってニトロセルロースフィルター上でλgt1
1ライブラリーをスクリーニングした。フィルターのイ
ンキュベーションのための第2抗体は、アルカリホスフ
ァターゼ結合ウサギ抗ニワトリ血清〔Sigma,s
t.Louis,USA〕であり、ニトロブルーテトラ
ゾリウム/5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホ
スフェート呈色反応〔McGadey,Histoch
emie 23,180,1970〕によって陽性シグ
ナルを発色させた。一連の候補試料を選択し、組換え体
を均一になるまでプラーク精製した。
ループは、交差ハイブリダイゼーション実験によると、
強力な類似性を有する挿入配列を含んでいた。それらの
1つを選択し、約500bpのDNA挿入物をpGEM
3Z〔Promega,Madison,USA〕に移
入し、プラスミドpMD06を得た。
造分析 既に構築されているMDV株GA特異的EMBL−3ラ
イブラリーを、pMD06由来の標識挿入物をプローブ
として使用し、レプリカフィルター上でスクリーニング
した。陽性シグナルを選択し、プラーク精製し、増幅し
たファージ調製物からDNAを抽出した。候補試料の1
つをλGA08と称し、これを、制限マッピングと、p
MD06由来の標識挿入物をプローブとして使用するサ
ザンブロットハイブリダイゼーションによって分析し
た。λGA08の17kbの挿入物中に存在する5.0
kbのSalI断片に対して強いハイブリダイゼーショ
ンが認められた。この特定の断片をpGEM3Z中にサ
ブクローニングしてpMD11を得、その制限マップを
図1に示す。3.3kb及び0.9kbの2つのpst
I断片をpGEM5Z中にサブクローニングにすること
によりpMD11由来の関連断片を得て、それぞれpM
D23及びpMD24と称した。図1に示した0.9k
bのEcoRI制限断片の領域のヌクレオチド配列を分
析した。
7,1984〕によって記載されたようにエキソヌクレ
アーゼIII処理によって生成される順次欠失されたサブ
クローンに基づいて、プラスミドpMD11またはpM
D23の両鎖を分析した。全ての反応は、T7ポリメラ
ーゼ配列決定キット〔Pharmacia Inc.,
Piscataway,NJ〕を使用し、二重鎖DNA
調製物において実施した。Gene−Masterワー
クステーション〔Bio−Rad,Richmond,
CA〕製のショットガンハンドラーを使用し、ゲル読取
り値を集計した。この分析結果はSEQ ID NO:
1に示し、約290個のアミノ酸のMD06抗原を実質
的にコードする830個のヌクレオチドの読み枠が明ら
かとなった。前記アミノ酸からなる一次構造をSEQ
ID NO:2に示す。
スベクターとして使用する、ニューカッスル病ウイルス
(NDV)由来の赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ(H
N)タンパク質との融合ポリペプチドとしての抗原MD
06の発現 ベクター生物中での抗原の発現については、抗原が細胞
表面に露出していれば宿主免疫系が関連抗原エプトープ
を認識する効率を増大すると考えることができる。この
ような担体タンパク質の例としてはNDV由来のHNを
挙げることができる。このタンパク質をコードする遺伝
子を、トリウイルスベクター、例えばHVTのゲノム中
に、細胞に組換えウイルスを感染させた後にHNが効率
的に合成されるように挿入することができる。そうする
と、MD06の実質的な部分をコードするDNA断片
は、HNに対するコード領域内の適正な位置に、適正な
向き及び読み枠が保守されるように組み込まれる。感染
細胞によって合成された融合ポリペプチドは細胞表面に
導かれ得、HNのアミノ末端配列を介して形質膜中に正
しく固定される。
仲介するベクタープラスミド Igarashi、T.ら〔Virology 15
7,351,1987〕によって公表されたようなHV
Tのゲノム構造に基づき、ウイルスの非反復短鎖配列要
素(Unique−short sequence e
lement,Us)中のある領域を、外来遺伝子の挿
入のために選択した。対応するDNA断片を、HVT感
染CEF由来の全DNAを部分消化することにより構築
したλEMBL3ライブラリーからスクリーニングし
た。BamHI制限部位を全く含まないことを特徴とす
るλ単離体の1つの挿入物をλHVT04と称した。1
7.5kbの挿入断片中に存在する配列は、逆反復構造
(inverted repeat structur
e)〔Igarashi,T.et al.,197
8,前出〕の一部を含むUs領域の大部分を表わしてい
た。λHVT04由来の1.2kbのXhoI制限断片
の1つを、SalIで消化したpGEM3Z中にサブク
ローニングし、DNA断片の挿入に使用し得る唯一のB
glII部位を含むプラスミドpMD07を得た(図
2)。HVTウイルスのゲノム中に挿入された後に外来
遺伝子の発現を誘導し得る強力なプロモーターを、Ro
us Sarcoma Virus(RSV)のLTR
配列から選択した。pRSVcat〔Gorman e
t al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
79,6777,1982〕由来の580bpのNde
I/HindIII制限断片においてプロモーターをマ
ッピングし、断片の両側をpGEM3Z(Promeg
a)のHindIII及びPstI部位間に二重鎖合成
リンカーを介して挿入した。ベクターpGEM3Z由来
のHindIII部位とLTRプロモーターを保持する
RSV断片のNdeI部位の間を、一方の部位ではHi
ndIIIと、他方の部位ではNdeIと適合する付着
端を含む30bpのリンカーで結合した。しかしなが
ら、結合後、6塩基対の認識配列の外側のヌクレオチド
が故意に改変するため、両制限部位は復元されない。こ
れら2つの部位を除去するほかに、リンカー自体の内に
存在する新たな制限部位(BamHI)を対応する位置
に形成した。LTR断片由来のHindIII部位をp
GEM3Z由来のPstI部位に連結するが、この場合
には両端部の認識配列を破壊することなく、3つの便宜
的な唯一の制限部位BglIII、XhoI及びEco
RVをpGEM3Zのポリリンカー中に既に存在するも
の、例えばPstI、SalI、HhoI及びBamH
Iに加えて、20bpの第2リンカーを合成した。得ら
れたpGEM3Zの誘導体をpVEC01と称し、これ
は、LTRプロモーター配列と、その直後に、外来遺伝
子の挿入に使用し得る7つの制限部位とを保有する65
0bpの制限断片を含んでいた。650bp断片のいず
れか一方の端部にBamHI制限部位をフランキング配
置し、pMD07由来の1.2kbHVT挿入物中に存
在する唯一のBglII部位に移入した。上記2つの制
限酵素によって生成された付着端は適合可能であるが、
BglIIまたはBamHIに対するもとの認識配列の
いずれもが連結によって復元されない。得られた構築物
のうちTRsに向かう向きでLTRを保有するものをp
VEC04と称し、制限マッピングによってチェックし
た(図3)。この汎用HVT組換えベクターの構造によ
って、LTRプロモーターの直ぐ下流に外来遺伝子を挿
入することができ、従って完全な発現カセットをHVT
ゲノム中にin vivo組換えによって組込むことが
できる。LTRの下流にある種々の制限部位の位置、特
に酵素BglII、XhoI及びEcoRVに対するも
のは、複数の遺伝子挿入さえ行ない得るように設計され
ている。
4への挿入 NDV株Clone 30のDNAライブラリー〔In
tervet Int.,Holland〕からHNを
コードする遺伝子を単離した。胚形成期の卵(embr
yonated eggs)上で増殖させたウイルスか
らゲノムRNAを調製し、ランダムな10塩基のオリゴ
マーを使用して反応を生起し、逆転写酵素を用いて第1
cDNA鎖を合成した。BamHI制限部位がフランキ
ング配置されており且つ完全HNタンパク質をコードす
るDNA断片をpGEM4Z〔Promega,Mad
ison,USA〕中にクローニングし、得られたプラ
スミドをpNDV03と称した。次いで、2.1kbの
BamHI断片を組換えベクターpVEC04のBgl
II部位中に移入してpNDV05を得た。図4に示し
たような物理的マップに基づく制限分析によって、LT
Rプロモーターに対する挿入遺伝子の正しい向きを検証
した。
子とNDV由来のHNとの融合体の構築 HN由来のコード領域の配列の調査により、遺伝子の
3’末端部分に存在するEcoRI制限部位のGAAコ
ドンは、SEQ ID NO:1に示したMD06をコ
ードする遺伝子の第2コドンと同じ読み枠を有すること
が明らかとなった。pMD11またはpMD23から誘
導された0.9kbのEcoRI断片を、pNDV05
中の関連EcoRI制限部位に正しい向きで組込むと、
完全MD06抗原に融合されたほぼ完全なHNタンパク
質を含むポリペプチドが合成される。pNDV05から
誘導されたこの特定のプラスミド構築物をpNDV10
と称し、その制限マップを図5に示す。
子の3’末端に存在するEcoRV部位にマーカー遺伝
子を組込むことも考えられる。E.coli由来のla
cZ遺伝子のようなマーカー遺伝子の存在は、β−ガラ
クトシダーゼ活性及び目的の融合ポリペプチドの両方を
発現する組換えHVTウイルスの検出を容易にする。
から調製した全DNAと一緒にCEF中に、Morga
nら〔Avian Diseases 34,345,
1990〕によって記載された改良を含むGraham
及びv.d.Eb〔Birology 52,456,
1973〕に従うリン酸カルシウムDNA沈降に基づく
方法によって導入した。構築物由来のプラスミドDNA
2μgをHVT感染細胞由来のDNA15μgと、終容
量560μlのH2O中で混合し、750μlのHBS
P(20mM KCl,560mM NaCl,24m
Mグルコース,3mM Na2HPO4,100mM H
EPES,pH7.0)に加えた。190μlの1M
CaCl2溶液を徐々に加えることにより沈澱物を形成
し、混合物を室温で30分間インキュベートした。この
間に、2%のウシ胎児血清を補充したイーグルの最小必
須培地のグラスゴーの改良に基づく組成を有する6/B
8の培地中に10日齢胚由来の二次CEFを含む懸濁液
15mlを、80cm2ペトリ皿中に5×105細胞/m
lの密度で播種した。リン酸カルシウム沈降DNAを細
胞懸濁液に静かに加え、空気中に5%のCO2を含む加
湿インキュベーター内で37℃でインキュベートした。
5時間後、培地を取り出し、等容量のHBSP及び30
%グリセロールを含む溶液10mlを細胞上に層状に流
し入れた。1〜2分間インキュベートした後、溶液を除
去し、細胞を培地6/B8で洗浄し、新たな培地を入れ
て3〜5日間、ウイルスCPEが発生するまでインキュ
ベートした。NDVのHNに融合したMD06抗原を発
現するHVT組換え体を、MDV抗原またはNDV由来
のHNタンパク質に対する特異的一価または多価血清を
使用する免疫蛍光染色法によって検出した。
を、(図3及び実施例3のセクションAに記載した)プ
ラスミドpVEC04中に存在するようなLTRプロモ
ーターの下流に組込み、次いで発現カセットをHVTベ
クターウイルスのゲノム中にin vivo組換えによ
って挿入することにより、抗原MD06を非融合ポリペ
プチドとして発現させた。このために、ATG開始コド
ンの上流の60bp及びTAA終結コドンの下流の40
bp(SEQ ID NO:1)に合成プライマーを配
置させてPCR増幅することによって、pMD23(実
施例2参照)由来のDNA断片上に遺伝子を単離した。
両プライマー中に新たに形成されたGGATCC配列の
存在により1.0kbのBamHI制限断片を単離する
ことができ、それをプラスミドpGEM3ZのBamH
I部位中にサブクローニングし、pMD56を得た。挿
入物の正しい配列構造を確認した後、BamHIで消化
することにより断片を再度単離し、次いで、pVEC0
4のBglII制限部位中に挿入することにより、pM
D58を得た(図6)。次いで、LTRプロモーターの
制御下に天然MD06抗原をコードする遺伝子のHVT
ゲノム中に組込むステップを実施例3のセクションDに
記載のごとき実施した。MD06抗原を発現する組換え
HVTウイルスを、MD06のE.coli発現断片に
対する特異的多価血清を使用して、感染CEF上で免疫
蛍光染色法によって検出した。限界希釈法及び単一プラ
ークの反復単離により、組換え体を均一体に精製した。
の情報: (i)配列の特徴: (A)長さ:290アミノ酸 (B)型:アミノ酸 (D)トポロジー:直鎖状 (ii)配列の種類:タンパク質 (xi)配列:配列番号(SEQ ID NO):2:
D11の制限酵素マップである。この断片は、pMD0
6の挿入物に強力にハイブリダイズした。
NA断片の制限酵素マップである。4つの読み枠(OR
F)及びそれらの間の非コード配列からなる挿入領域の
相対位置が示されている。
T断片の唯一のBglII部位中に挿入されたLTRプ
ロモーターを示すpVEC04の制限酵素マップであ
る。
は、pVEC04(図3参照)のBglII部位に挿入
された、BamHI部位が側部に付いた(flanke
d)NDV−HN遺伝子を含んでいる。
は、MD06ポリペプチドを実質的にコードする0.9
KbのEcoRI断片を、pNDV05(図4参照)の
約3200番目の塩基に位置するEcoRI部位に挿入
することによりpNDV05から誘導される。
は、抗原MD06をコードし且つ非翻訳フランキング配
列を含む完全遺伝子を挿入することによってpVEC0
4から誘導される。1.0kbのBamHI断片上に位
置する遺伝子は、PCR増幅によってpMD23(図1
参照)から単離された。
Claims (15)
- 【請求項1】 SEQ ID NO:2に示されたアミ
ノ酸配列を有するかまたはその機能性変形体であること
を特徴とするMD06 MDVタンパク質の1つ以上の
抗原決定基を有するポリペプチドをコードする核酸配
列。 - 【請求項2】 前記核酸配列が、SEQ ID NO:
1に示されたDNA配列の少なくとも一部を含むことを
特徴とする請求項1に記載の核酸配列。 - 【請求項3】 請求項1または2に記載の核酸配列を含
む組換えベクター分子。 - 【請求項4】 前記核酸配列が、発現制御配列に操作可
能なように結合されていることを特徴とする請求項3に
記載の組換えベクター分子。 - 【請求項5】 請求項1または2に記載の異種核酸配列
を含む組換えベクターウイルス。 - 【請求項6】 請求項1もしくは2に記載の核酸配列ま
たは請求項3もしくは4に記載の組換えベクター分子を
用いて形質転換されたか、或いは請求項5に記載の組換
えベクターウイルスに感染させた宿主細胞。 - 【請求項7】 SEQ ID NO:2に示されたアミ
ノ酸配列またはその機能性変形体を有するMD06 M
DVタンパク質の1つ以上の抗原決定基を有するポリペ
プチド。 - 【請求項8】 請求項1または2に記載の核酸配列によ
ってコードされるMDVポリペプチド。 - 【請求項9】 請求項6に記載の宿主細胞を培養するこ
とを含む、請求項7または8に記載のポリペプチドを発
現する方法。 - 【請求項10】 請求項7または8に記載のポリペプチ
ドに免疫反応性を示す抗体または抗血清。 - 【請求項11】 請求項5に記載の組換えベクターウイ
ルスと、請求項6に記載の宿主細胞と、請求項7もしく
は8に記載のポリペプチドまたは請求項9に記載の方法
によって製造されたポリペプチドと、容認可能な担体と
を含むことを特徴とする、マレック病に対する家禽保護
用ワクチン。 - 【請求項12】 MDVの抗原決定基をもつ請求項7ま
たは8に記載のポリペプチドを含む、イムノアッセイに
使用するための免疫化学試薬。 - 【請求項13】 請求項6に記載の感染宿主細胞を培養
するステップと、組換えベクターウイルスを回収するス
テップと、ウイルス材料を、免疫活性を含む医薬製剤に
製剤化するステップとを含む、MDVワクチンの製造方
法。 - 【請求項14】 請求項7もしくは8に記載のポリペプ
チドまたは請求項9に記載の方法によって製造されたポ
リペプチドを、免疫活性を含む医薬製剤に製剤化するこ
とを含む、MDVワクチンの製造方法。 - 【請求項15】 請求項11に記載のワクチンを動物に
投与することからなる、MDV感染または疾患に対して
家禽を保護する方法。
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