CN114540312B

CN114540312B - 一种血清1型马立克病病毒pp38单克隆抗体的制备方法及应用

Info

Publication number: CN114540312B
Application number: CN202210261763.6A
Authority: CN
Inventors: 滕蔓; 罗俊; 罗琴; 张改平; 郑鹿平; 刘金玲; 卢清侠; 柴书军; 赵东; 程娜
Original assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Henan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2022-03-16
Filing date: 2022-03-16
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2042-03-16
Also published as: CN114540312A

Abstract

本发明属于基因编辑技术在动物免疫学技术领域中的新应用，公开了一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术筛选和鉴定抗血清1型马立克病病毒特异性pp38蛋白单克隆抗体的方法及应用。其中抗MDV‑1特异性pp38蛋白的单克隆抗体31G7由小鼠杂交瘤细胞株pp38‑31G7产生，该细胞株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No:23025，单克隆抗体31G7的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.3，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO.4。该单克隆抗体31G7可以鉴别区分MDV‑2和MDV‑3毒株，适用于临床中疑似病例的MDV不同血清型流行毒株的鉴别诊断。本发明方法大大提高了筛选针对MDV特定病毒蛋白的单克隆抗体的效率和准确性，同时也为其它疱疹病毒蛋白单克隆抗体的研制提供一种全新思路和可靠的技术手段。

Description

一种血清1型马立克病病毒pp38单克隆抗体的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建血清1型马立克病病毒MDV-1特异性pp38基因编辑缺失毒株，进行MDV-1特异性pp38蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选、鉴定、单克隆抗体制备及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

鸡马立克病(Marek’s disease，MD)是由马立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)早期感染雏鸡引发的一种最重要的免疫抑制病及肿瘤病。主要特征是外周神经、内脏器官(性腺、肝、脾、肺、肾、腺胃、肠道等)、虹膜、肌肉及皮肤内发生淋巴样细胞浸润，并最终发展成为淋巴瘤。MDV可经空气传播，传染能力强，最终会诱发宿主产生内脏肿瘤和大批死亡，对全球养禽业年均导致约10-20亿美元的巨大经济损失，加上MDV感染宿主后产生免疫抑制导致临床疫苗免疫预防效果不佳而产生间接影响，经济损失无法估量。

MDV共有三种不同的血清型：血清1型(MDV-1)、血清2型(MDV-2)和血清3型(MDV-3，即火鸡疱疹病毒HVT)。其中，只有MDV-1毒株具有致病性和致瘤性。根据致病性的不同，MDV-1毒株又可分为温和毒(Mild MDV，mMDV)、强毒(Virulent MDV，vMDV)、超强毒(Veryvirulent MDV，vvMDV)以及特超强毒(Very virulent plus MDV，vv+MDV)。

MDV病毒基因组为线性双股DNA，全长约180kb。主要由一个长独特序列区(Uniquelong，UL)和一个短独特序列区(Unique short，US)构成，在两个独特序列区两侧分别是两个序列完全相同的反转重复序列区：长末端重复序列(Terminal repeat long，TRL)和长内部重复序列(Internal repeat long，IRL)以及短末端重复序列(Terminal repeat short，TRS)和短内部重复序列(Terminal repeat short，IRS)，独特序列区中编码的病毒基因与其它疱疹病毒具有高度保守性，而MDV特异性的病毒基因则主要位于反转重复序列区TR/IR中。三种血清型MDV存在大部分相同的结构基因和功能基因外，致病性的MDV-1还被发现和鉴定编码7个病毒特异性的基因，包括原癌基因meq、pp38基因、病毒端粒酶RNA(vTR)、病毒脂肪酶(vLIP)、病毒相关IL8基因(vIL8)和1.8kb mRNA以及潜伏感染相关转录因子(LATs)。

在MDV-1特异性基因中，38ku磷蛋白pp38是最早被发现的。pp38在MD肿瘤和细胞系中的表达存在差异，且是迄今为止在MDV诱发的肿瘤及非生产性肿瘤细胞系中唯一能检出的MDV-1特异性抗原，参与淋巴瘤细胞MSB-1转化状态的维持。此外，pp38还参与淋巴细胞的早期细胞裂解性感染，对于产生足够量的潜伏感染T细胞以及体内转化状态的维持来说是必需的。

pp38蛋白是MDV-1特有的病毒蛋白，制备识别该病毒蛋白的特异性单克隆抗抗，不仅可用于MDV-1特异性毒株的快速鉴定，还可以为进一步研究揭示pp38蛋白的功能，以及为MDV快速检测诊断试剂的研发提供关键核心试剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于CRISPR/Cas9基因编辑技术构建血清1型马立克病病毒MDV-1特异性pp38基因编辑的缺失毒株，并将其应用于MDV-1特异性pp38蛋白单克隆抗体的快速筛选、鉴定及应用。

还提供一种稳定分泌抗血清1型马立克病病毒MDV-1特异性pp38蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株pp38-31G7和单克隆抗体31G7的制备及应用方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

利用MDV为严格的细胞结合性疱疹病毒的特性，收集MDV感染的CEF，利用细胞核蛋白和细胞浆蛋白提取试剂盒提取细胞浆蛋白，免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术建立抗MDV病毒蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株和单克隆抗体库；同时以MDV-1特异性pp38基因为靶点，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，构建pp38基因编辑缺失的MDV-1毒株GX0101Δpp38，然后用亲本毒株GX0101和pp38基因编辑缺失毒株GX0101Δpp38做间接免疫荧光实验IFA进行交叉筛选，从MDV单克隆抗体杂交瘤细胞库中筛选鉴定可特异性识别pp38蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株pp38-31G7，最终制备获得的特异性单克隆抗体31G7可应用于间接免疫荧光实验IFA、免疫组织化学IHC、蛋白质印迹分析Western-blot以及免疫共沉淀IP等免疫学检测方法中，为pp38蛋白的功能研究、MDV快速检测和诊断试剂研发提供了关键核心试剂，同时也为MDV及类似病毒的单克隆抗体筛选、制备和鉴定提供了一种新的策略和技术方法。

一种分泌抗血清1型马立克病病毒pp38蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株pp38-31G7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23025。

所述单克隆抗体31G7是由权利要求1所述鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株pp38-31G7所分泌；所述单克隆抗体31G7的轻链为Kappa型，亚型为IgG1。

所述单克隆抗体31G7的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述单克隆抗体31G7的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

所述的单克隆抗体31G7的制备方法，包括以下步骤：

(1)用血清1型马立克病病毒超强毒株GX0101感染鸡胚成纤维细胞CEF，随后提取病毒感染CEF的细胞浆蛋白，以所述细胞浆蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术制备杂交瘤细胞，筛选培养上清阳性的杂交瘤细胞，结合2～3轮亚克隆，筛选并构建特异针对病毒蛋白的杂交瘤细胞株和单克隆抗体库；

(2)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建血清1型马立克病病毒特异性pp38基因编辑缺失的毒株GX0101Δpp38；

(3)利用间接免疫荧光实验IFA，以野生型亲本毒株GX0101和突变型基因编辑缺失毒株GX0101Δpp38，对步骤(1)所得杂交瘤细胞株和单克隆抗体库进行差异筛选和交叉鉴定，即得。

步骤(1)免疫原的制备方法为：将GX0101接种于单层鸡胚成纤维细胞CEF，置37℃、5％(v/v)CO₂培养箱中培养3-4d；出现典型病毒噬斑后，收集细胞，以1000rpm的速度离心10min，收集细胞沉淀，提取病毒感染CEF样品的细胞浆蛋白；

初次免疫采用细胞浆蛋白加等量弗氏完全佐剂混合乳化，免疫6周龄Balb/C雌性小鼠，50μg/只，背部皮下分点注射；加强免疫采用细胞浆蛋白加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，50μg/只，共免4次，每次间隔3周，4免后15d断尾采血分离血清；超免采用不加佐剂的细胞浆蛋白，50μg/只，3d后取小鼠脾细胞进行细胞融合。

步骤(2)的具体方法为：

根据GX0101的pp38基因及其邻近序列，使用GenScript’s gRNA在线设计软件设计gRNA，分别合成靶向pp38基因5’端和3’端的gRNA各3个，所述gRNA双链引物oligo的序列分别如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.16所示；并将6个gRNA的双链DNA分别克隆至pX459载体质粒中；

选取构建成功的pX459-gRNA质粒，将5’端和3’端gRNA质粒两两组合共9对质粒，分别转染CEF培养24h，然后接种GX0101、感染24h后收集细胞培养物提取总DNA，利用pp38F/pp38R引物对进行PCR鉴定，并对PCR产物进行电泳分析；所述pp38F/pp38R引物对的序列如SEQ ID NO.17/SEQ ID NO.18所示；

选取编辑效率最高的一对gRNA组合编辑的病毒感染细胞，采用有限稀释法进行病毒克隆纯化，经过多轮纯化最终筛选鉴定获得一株pp38基因完全编辑缺失的病毒株GX0101Δpp38。

所述的单克隆抗体31G7在免疫学检测方法或制备免疫学检测试剂中的应用。

所述免疫学检测方法包括但不限于间接免疫荧光实验IFA、免疫组织化学IHC、蛋白质印迹分析Western-blot或免疫共沉淀IP。

所述免疫学检测试剂包括但不限于酶联免疫吸附实验ELISA试剂盒、免疫层析试纸卡或免疫层析试纸条。

本发明有益效果：

(1)本发明依据MDV严格的细胞结合性疱疹病毒的特性，利用细胞核和细胞浆蛋白提取试剂盒提取MDV感染细胞的浆蛋白作为免疫原。该方法简单快速、可操作性强，仅仅需要1个T75细胞瓶培养的MDV感染CEF细胞样品，就可以提取制备足够多次免疫使用的蛋白免疫原。利用该方法提取的细胞浆蛋白包含种类丰富的MDV病毒蛋白，相对于体外原核表达或真核表达纯化的单一病毒蛋白，本发明提取的细胞浆蛋白不仅包括了病毒编码的许多结构蛋白和非结构蛋白，而且这些病毒蛋白的天然构象和活性未经破坏，比体外表达纯化的蛋白更可靠。利用本发明的方法制备的免疫原，一次免疫即可获得几乎针对全部不同病毒蛋白抗体筛选的要求。

(2)本发明利用MDV感染CEF的细胞浆蛋白免疫小鼠，结合细胞融合技术进行杂交瘤细胞建库，同时利用MDV感染细胞病毒噬斑进行IFA染色检测筛选杂交瘤细胞上清，从而筛选出与仅与MDV噬斑特异性结合的阳性杂交瘤细胞，可以快速构建一个特异性针对MDV表达的绝大部分病毒蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞库。理论上来讲，该抗体库中基本包含针对MDV编码的溶细胞性复制期所表达的全部病毒蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，大大提高了筛选针对病毒不同蛋白单克隆抗体的可能性。

(3)本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，首先成功构建了MDV特异性pp38基因编辑缺失的毒株，然后用野生型亲本毒株和突变型pp38基因编辑缺失毒株做IFA染色交叉筛选，从MDV病毒蛋白抗体库中筛选鉴定特异性识别pp38蛋白的单克隆抗体，这种交叉筛选方法具有快速、直观、准确和特异性强的优点，为MDV编码的病毒蛋白及其他同类DNA病毒蛋白单克隆抗体的研制提供了一种全新的技术思路，这在国内外均尚未见研究报道，极具创新性。

(4)本发明的单克隆抗体具有很强的特异性，可以同时用于MDV-1不同毒力的分离株以及MDV-1疫苗株的IFA、Western blot以及IHC等多种免疫学检测，可以有效区分MDV-2和MDV-3(即HVT)毒株，用于不同血清型MDV的分型和鉴别诊断。

(5)本发明的单克隆抗体具有很高的灵敏度，其亚型为IgG1，轻链为Kappa型，IFA效价可达1∶2.56×10⁵。

(6)本发明筛选得到的单克隆抗体具有稳定的抗体分泌能力，能快速、特异的识别MDV-1pp38蛋白，为MDV毒株的抗原快速检测的技术难题的解决奠定很好基础，在MDV免疫学检测技术和诊断试剂研发中具有重要的应用价值。

附图说明

图1 MDV-1pp38基因编辑分析及病毒克隆纯化鉴定的PCR结果；

其中：A，表示不同的gRNA组合对MDV-1超强毒株GX0101的pp38基因编辑的PCR鉴定结果；B，表示第一轮挑选纯化的病毒单噬斑pp38基因编辑的PCR鉴定结果；C，表示第二轮挑选纯化的病毒噬斑pp38基因编辑的PCR鉴定结果；R1，表示第一轮病毒克隆纯化；R2，表示第二轮病毒克隆纯化；C1～C8，表示病毒单噬斑克隆号。

图2 GX0101Δpp38基因编辑位点的测序鉴定结果；

其中：A，表示GX0101和GX0101Δpp38基因编缉位点序列之间的比对分析图；B，表示GX0101Δpp38基因编缉位点的序列分析波峰图；GX0101，表示MDV-1亲本毒株；GX0101Δpp38，表示pp38基因编辑缺失毒株；DSB，表示gRNA剪切双链缺口；虚线箭头，表示gRNA靶点序列；PAM，表示前间隔序列邻近基序。

图3 GX0101Δpp38感染CEF中部分病毒基因相对表达水平的RT-qPCR分析结果；

其中：Relative expression level，表示基因相对表达水平；GX0101，表示MDV-1亲本毒株；GX0101Δpp38，表示pp38基因编辑缺失毒株；pp38、gB、RLORF6、UL6、UL13、UL42和UL52，表示MDV-1毒株编码的不同病毒蛋白基因。

图4 GX0101Δpp38感染CEF中Meq和pp38蛋白表达的IFA鉴定结果；

其中：GX0101，表示MDV-1亲本毒株；GX0101Δpp38，表示pp38基因编辑缺失毒株；Meq，表示MEQ蛋白；pp38，表示pp38蛋白；Merge，表示MEQ蛋白和PP38蛋白的重叠分析。

图5 GX0101和GX0101Δpp38毒株交叉筛选杂交瘤细胞上清的IFA染色结果；

其中：GX0101，表示MDV-1亲本毒株；GX0101Δpp38，表示pp38基因编辑缺失毒株；BD1，表示pp38蛋白的阳性对照抗体；31G7，表示本发明制备的MDV-1pp38蛋白单克隆抗体。

图6 pp38真核表达蛋白与MDV-1单克隆抗体31G7的特异性染色IFA鉴定结果。

其中：BD1，表示pp38蛋白的阳性对照抗体；31G7，表示本发明制备的MDV-1pp38蛋白单克隆抗体；EGFP，表示真核表达质粒自带的绿色荧光蛋白；pp38，表示pp38蛋白。

图7 pp38单克隆抗体31G7与不同血清型MDV代表毒株的IFA和Western blot检测结果。

其中：A，表示IFA检测结果；B，表示Western blot检测结果；plaque，表示普通光下的MDV病毒噬斑；31G7，表示本发明制备的MDV-1pp38蛋白单克隆抗体；β-actin，表示鸡的内参蛋白；GX0101、Md5和GA，表示不同的MDV-1代表性强毒株；CVI988，表示MDV-1的CVI988疫苗株；SB-1，表示MDV-2的疫苗株；HVT，表示MDV-3的疫苗株。

图8 pp38单克隆抗体31G7对MDV-1感染鸡羽髓囊上皮细胞的IHC检测结果。

其中：A、B和C，表示MDV-1病毒感染鸡羽髓囊上皮细胞IHC染色结果；D，表示病毒未感染阴性对照鸡羽髓囊上皮细胞IHC染色结果。

图9 pp38单克隆抗体31G7与MDV-1感染细胞蛋白的IP检测结果。

其中：M，表示蛋白分子量标记(kD，千道尔顿)；NCAb+GX0101，表示阴性抗体对照组；31G7+GX0101，表示pp38单克隆抗体实验组。

图10 pp38单克隆抗体31G7的IP蛋白的质谱分析图。

具体实施方式

下面结合实施例来说明本发明的具体实施方式，以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的保护范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一：MDV单克隆抗体交瘤细胞株和抗体库的构建

1、免疫原制备及小鼠免疫

用国内分离的MDV超强毒株GX0101(山东农业大学崔治中教授馈赠的BAC克隆毒株)接种于T75细胞瓶中的单层鸡胚成纤维细胞(CEF)，置37℃、5％CO₂培养箱中培养3-4d；显微镜下观察出现典型病毒噬斑后，收集细胞，以1000rpm的速度离心10min，收集细胞沉淀，利用Thermo Scientific公司生产的NE-PER^TM细胞核蛋白和浆蛋白提取试剂分离纯化病毒感染CEF样品的细胞浆蛋白。测定蛋白含量后，加等量弗氏完全佐剂混合乳化，免疫6周龄Balb/C雌性小鼠5只，50μg/只，背部皮下分点注射。加强免疫时加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，50μg/只，共免4次，每次间隔3周，4免后15d断尾采血分离血清。

利用IFA检测免疫鼠血清多抗效价。简述如下，复苏液氮中冻存的GX0101病毒种，37℃水浴迅速溶解，1000rpm离心5min后，弃去细胞冻存液，用1mL含1％(v/v)FBS(胎牛血清)的DMEM培养基的维持液重悬细胞，取10μL接种于96孔细胞培养板上的单层CEF，含1％FBS的DMEM培养基的维持液150μL/孔，同时做未接毒CEF细胞对照，置37℃、5％CO₂培养箱中培养3-4d；显微镜下观察接毒细胞出现典型病毒噬斑后，弃去96孔细胞板中维持液，每孔加入预冷的甲醇:丙酮(体积比为1:1)溶液固定细胞，100μL/孔，室温静置10min，弃去细胞固定液，PBST缓冲液(含0.05％(v/v)Tween-20的PBS缓冲液)洗3遍甩干，加入含5％(v/v)脱脂奶的PBST封闭液，200μL/孔，置37℃温箱封闭30min；弃去封闭液，PBST溶液洗3遍，甩干，接毒孔和CEF细胞对照孔分别加倍比稀释的各免疫鼠血清(稀释度为1:100～1:3200)，100μL/孔，置37℃温箱30min；弃去单抗上清液，PBST溶液洗3遍，甩干，加入FITC(异硫氰酸荧光素)标记的羊抗鼠IgG(1:500)二抗稀释液，100μL/孔，置37℃温箱30min；弃去二抗稀释液，PBST溶液洗3遍，最后加PBST溶液100μL/孔，置倒置荧光显微镜下观察，检测结果显示，5只免疫小鼠均产生了针对MDV的特异性抗体，其中1号鼠和4号鼠的免疫效价较高(表1)。

表1免疫鼠多抗血清IFA效价测定结果

注：++，强阳性；+，阳性；-，阴性

2、杂交瘤细胞株和单克隆抗体库的构建

选择免疫效价最高的1号小鼠进行超免，融合前腹腔注射不加佐剂的GX0101病毒感染CEF细胞浆蛋白(50μg/只)，超免3d后取小鼠脾细胞按常规方法进行细胞融合，将SP20细胞与超免鼠脾细胞分别计数后按照1:10的比例进行混合，用PEG-1500融合剂进行融合，然后细胞用RPMI-1640/HAT培养液分散细胞，接种于40块96孔细胞培养板中，200μL/孔，置37℃、5％CO₂培养箱中培养，约10～15d长出较大杂交瘤之后抽取细胞上清进行检测。

用上述IFA方法检测杂交瘤细胞上清，选择只与GX0101病毒噬斑特异性结合的阳性杂交瘤细胞转至24孔板扩大培养，复测后选取各阳性孔杂交瘤细胞以有限稀释法进行2～3次亚克隆，末次亚克隆后选出状态良好、生长旺盛的强阳性单克隆细胞株扩大培养，离心收集细胞，用细胞冻存液(体积比为DMSO：小牛血清：DMEM＝1：5：4)重悬后存于液氮中，同时留取各细胞上清液，-20℃保存备用。

实施例二：GX0101Δpp38基因编辑缺失毒株的构建及鉴定

1、GX0101Δpp38基因编辑缺失毒株的构建

根据GX0101(GenBank登录号：JX844666.1)的pp38基因及其邻近序列，使用GenScript’s gRNA在线设计软件(https://www.genscript.com)设计gRNA，分别合成靶向pp38基因5'端和3'端的各3个gRNA的上下游oligo(表2)，将6个gRNA互补双链DNA分别克隆至pX459质粒载体中。

表2 pp38基因编辑的gRNA oligo及PCR鉴定引物序列表

注：下划线显示为BbsⅠ限制性内切酶位点，斜体加粗显示为gRNA oligo 5’端额外添加的G或C

选取构建成功的3’端和5’端pX459-gRNA质粒，分别进行两两组合(共计9个组合，包括gRF1/gRR1、gRF2/gRR1、gRF3/gRR1、gRF1/gRR2、gRF2/gRR2、gRF3/gRR2、gRF1/gRR3、gRF2/gRR3和gRF3/gRR3)，按照TransIT-X2^TM Dynamic Delivery System说明书转染提前一天制备好的24孔板CEF单层(细胞汇合度约为80％-90％)，转染后24h，弃去转染试剂，更换新的培养基，以5000PFU/孔的接毒量接种GX0101，继续培养48h，待CEF上出现典型噬斑后，用0.25％(w％)胰蛋白酶消化上述细胞，充分吹悬后取一半细胞悬液以1000r/min离心10min，弃掉上清后，用1×DNA提取缓冲液(10mmol/L Tris HCl，1mmol/L EDTA，25mmol/LNaCl和10μg/mL的蛋白酶K)吹悬，金属浴65℃保温30min、95℃变性5min提取细胞和病毒总DNA。

用表2列示的pp38F/pp38R引物对进行PCR鉴定，反应程序为：95℃5min预变性；95℃30s，58℃1min，72℃2min，30个循环；72℃延伸5min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析。电泳分析结果显示(图1A)，未转染pX459-gRNA质粒的病毒感染CEF样品中仅扩增出约1295bp的特异性目的条带；9个pX459-gRNA组合质粒转染并感染病毒的CEF样品中有6个组合除了扩增出1295bp的野生型条带外，在约600bp左右均出现大小不等的特异性基因编辑条带；CEF阴性对照组则无任何扩增条带。

选取编辑效率较高的gRNA组合gRF2/gRR1编辑的病毒感染细胞培养物，采用有限稀释法接种新的6孔板CEF单层，同上培养3～5d进行病毒克隆纯化。随机挑选72个病毒单噬斑转至24孔板单层CEF中(1个噬斑/孔)，继续培养48h后分别消化细胞，分别对克隆编号为C1～C8的病毒单噬斑进行取样、PCR鉴定并进行电泳分析(图1B)，选择PCR仅扩增出613bp编辑小条带的阳性克隆孔，进行第二轮单噬斑克隆纯化，最终PCR扩增结果显示随机挑选的全部单噬斑病毒克隆均仅扩增出613bp编辑小条带(图1C)，确证pp38基因已被完全编辑缺失。

将该基因编辑缺失毒株命名为GX0101Δpp38，并对基因编辑小条带进行测序分析，结果表明GX0101的pp38基因被上述gRNA组合完全编辑且与预期编辑发生的位点和缺失大小完全相符(图2)，确证获得了MDV-1pp38基因编辑缺失的GX0101Δpp38毒株。

2、GX0101Δpp38基因编辑缺失毒株的鉴定

为了验证GX0101Δpp38基因编辑缺失毒株中相关病毒编码基因的表达情况，选择pp38、meq、gB、RLORF6、UL6、UL13、UL42、UL52等基因进行了表达分析。用GX0101和GX0101Δpp38毒株分别感染CEF，48h后收集细胞样品并提取总RNA，按照PrimeScript^TM RT reagentKit with gDNA Eraser试剂盒说明书，将提取的RNA样品反转录为cDNA，然后利用SYBRGreen qPCR Mix法(实时荧光定量PCR)测定上述基因的相对表达量。

以meq基因为内参分析的结果显示，亲本毒株GX0101中上述基因均正常表达；基因编辑缺失毒株GX0101Δpp38中除了pp38基因未检测到表达之外，其余基因均正常表达(图3)。上述结果进一步证实GX0101Δpp38为pp38基因被完全编辑缺失的MDV-1毒株，且没有影响到其他相关病毒基因的表达。

此外，为了验证GX0101Δpp38基因编辑缺失毒株中相关病毒蛋白的表达情况，以pp38和MEQ蛋白为对象分别进行了IFA检测。用GX0101和GX0101Δpp38分别感染CEF，待出现明显噬斑后固定细胞，分别用抗MDV-meq多克隆抗体和抗MDV-pp38的阳性对照单克隆抗体BD1(均为英国Pirbright研究所馈赠)以及DyLight 594标记的羊抗兔IgG(1:1000)和DyLight 488标记的羊抗鼠IgG(1:1000)二抗稀释液进行IFA检测。

结果显示，GX0101和GX0101Δpp38感染CEF后，均能形成典型且形态相似的病毒噬斑，说明pp38基因的缺失不影响病毒粒子的形成，并且在荧光显微镜下GX0101亲本毒株感染的CEF细胞中均可观察到两种不同荧光着染的病毒噬斑，说明亲本毒株中MEQ蛋白和pp38蛋白均正常表达；而GX0101Δpp38基因编辑缺失毒株感染的CEF细胞中，仅能观察到MEQ蛋白阳性对照抗体IFA实验组可观察到特性性荧光着染的病毒噬斑，pp38蛋白阳性对照抗体IFA实验组未观察到任何荧光噬斑，说明GX0101Δpp38病毒株的MEQ蛋白正常表达，而基因编辑缺失导致pp38蛋白因无表达(图4)，进一步证实GX0101Δpp38为MDV-1pp38基因编辑完全缺失的毒株。

实施例三：抗MDV-1特异性pp38蛋白单克隆抗体的筛选及鉴定

1、单克隆抗体的筛选

用GX0101和GX0101Δpp38分别感染CEF，待出现明显病毒噬斑后固定细胞，分别孵育实施例一构建所得的MDV单克隆抗体库中留存的单克隆抗体杂交瘤细胞上清和FITC标记的羊抗鼠IgG(1:500)二抗稀释液进行IFA交叉染色检测和筛选分析，并设置pp38蛋白阳性对照抗体(BD1)为参照组。

IFA结果显示，GX0101和GX0101Δpp38感染CEF后，均能形成典型且形态相似的病毒噬斑，荧光显微镜下观察，多株杂交瘤细胞分泌的上清液可特异性结合GX0101感染CEF形成的病毒噬斑并呈现绿色荧光染色，其中以编号为pp38-31G7的杂交瘤细胞上清的荧光染色最强，而对应的GX0101Δpp38感染CEF形成的病毒噬斑均未出现特异性荧光染色(图5)。上述结果表明，pp38-31G7杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体为特异性识别pp38蛋白的单克隆抗体。

其中，该鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株pp38-31G7已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.23025，保藏时间为2021年9月1日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

2、单克隆抗体的特异性鉴定

为了验证筛选出的单克隆抗体杂交瘤细胞上清针对MDV-1毒株pp38蛋白的特异性，根据NCBI注册的GX0101(GenBank登录号：JX844666.1)的pp38基因序列，合成pp38基因全长序列，构建pEGFP-N1-pp38真核表达质粒，按照Lipofectamine^TM 2000(Thermo Fisher)说明书，转染提前制备好的24孔板293T细胞单层(汇合度约为80％-90％)，转染后48h用预冷的甲醇:丙酮(体积比为1:1)溶液固定细胞，100μL/孔，室温静置10min，弃去细胞固定液，PBST缓冲液(含0.05％(v/v)Tween-20的PBS缓冲液)洗3遍甩干，加入含5％(v/v)脱脂奶的PBST封闭液，200μL/孔，置37℃温箱封闭30min；弃去封闭液，PBST溶液洗3遍，甩干；分别孵育pp38蛋白阳性对照抗体BD1(英国Pirbright研究所馈赠)和本发明pp38-31G7单克隆杂交瘤细胞上清，37℃温箱30min，PBST洗3遍；加DyLight 594标记的羊抗鼠IgG(1:1000)二抗稀释液，37℃温箱30min，PBST洗3遍；加PBST，200μL/孔，置荧光显微镜下观察结果。

结果显示，在荧光显微镜下，pEGFP-N1-pp38质粒转染293T细胞48h后大部分细胞呈现出自发EGFP绿色荧光，阳性对照抗体BD1与部分293T细胞特异性结合，在DyLight594标记的羊抗鼠IgG的指示下呈现红色荧光染色，且能与细胞自发绿色荧光共定位，表明构建的pEGFP-N1-pp38质粒能够正确表达pp38蛋白。同时，本发明新筛选鉴定的单克隆抗体杂交瘤细胞株pp38-31G7的细胞上清也获得类似结果(图6)，表明pp38-31G7杂交瘤细胞株分泌的抗体为特异性针对pp38蛋白的单克隆抗体。

3、单克隆抗体腹水制备及IFA效价测定

选择经产的雌性BALB/c小鼠，腹腔内注射500μL灭菌石蜡，刺激免疫细胞用以促进杂交瘤细胞的增殖。7～10d后离心收集pp38-31G7杂交瘤细胞并用灭菌PBS洗涤2次，按照每只约3×10⁶～6×10⁶个细胞的量注入小鼠腹腔，及时观察小鼠状态，约10d左右待小鼠腹部膨大后抽取腹水，8000r/min，4℃离心20min去除油脂及细胞沉淀，收集腹水上清，-80℃保存备用；

用PBS将单抗腹水上清从1:1000开始进行2倍比梯度稀释至1:1.024×10⁶，将GX0101感染并出现明显病毒噬斑的CEF进行细胞固定，分别孵育上述2倍比稀释的单抗腹水和FITC标记的羊抗鼠IgG(1:500)二抗稀释液进行IFA检测，31G7单抗腹水经IFA检测效价可达1：2.56×10⁵。

4、单克隆抗体亚型鉴定

31G7单克隆抗提亚型的鉴定按Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(小鼠单克隆抗体分型试剂盒)使用说明书操作。结果显示，31G7株的单克隆抗体亚型为IgG1，轻链为Kappa型(表3)。

表3单克隆抗体亚型鉴定

注：+，阳性；-，阴性

5、单克隆抗体可变区基因的扩增与序列分析

根据鼠源单克隆抗体的序列特征，分别设计扩增重链可变区和轻链可变区的PCR引物(表4)。上述引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表4用于单克隆抗体重链和轻链基因扩增的PCR引物序列表

通过PCR扩增，分别获得单克隆抗体31G7的重链和轻链可变区基因产物，经过克隆后送至生工生物工程(上海)有限公司测序。经测序分析，单克隆抗体31G7的重链可变区和轻链可变区基因序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，由其推导的单克隆抗体31G7的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

SEQ ID NO.1：

aggtgaagct gcagcagtct ggaggaggct tggtacagcc tgggggttct ctgagactctcctgtgcaac ttctgggttc accttcactg atcactacat gagctgggtc cgccagcctc caggaaaggcacttgagtgg ttgggtttta ttagaaacaa agctaatggt tacacaacag actacagtgc atctgtgaagggtcggttca ccatctccag agataaatct caaagcatcc tctatcttca aatgaacacc ctgagagctgaggacagtgc cacttattac tgtgcaagag atggggatta cggccccctt gactactggg gccaagggaccacggtcacc gtctcctca

SEQ ID NO.2：

gacattgagc tcacccagtc tccagcactc atggctgcat ctccagggga gaaggtcaccatcacctgca gtgtcagctc aagtataagt tccagcaact tgcactggta ccagcagaag tcagaaacctcccccaaacc ctggatttat ggcacatcca acctggcttc tggagtccct gttcgcttca gtggcagtggatctgggacc tcttattctc tcacaatcag cagcatggag gctgaagatg ctgccactta ttactgtcaacagtggagta gttacccgta cacgttcgga gggggcacca agctggaaat caaac

SEQ ID NO.3：

Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser LeuArg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp His Tyr Met Ser Trp ValArg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Arg Asn Lys Ala AsnGly Tyr Thr Thr Asp Tyr Ser Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg AspLys Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser AlaThr Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln GlyThr Thr Val Thr Val Ser Ser

SEQ ID NO.4：

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly GluLys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu His TrpTyr Gln Gln Lys Ser Glu Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn LeuAla Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser LeuThr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp SerSer Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

应用例一、MDV-1特异性pp38蛋白的间接免疫荧光实验(IFA)

选择不同血清型和不同毒力的MDV毒株，包括MDV-1毒株(CVI988、GA、Md5和GX0101)、MDV-2毒株(SB-1)和MDV-3毒株(HVT)分别接种CEF单层细胞，形成典型病毒噬斑后固定细胞，同前所述分别孵育31G7单克隆抗体腹水(1:100000)和FITC标记的羊抗鼠IgG(1:500)二抗稀释液进行IFA检测。

如图7A所示，检测结果显示，不同毒力MDV-1毒株(CVI988、GA、Md5和GX0101)感染的CEF单层细胞形成的病毒噬斑均呈现出特异性的荧光染色，而MDV-2毒株(SB-1)和MDV-3毒株(HVT)感染的CEF单层细胞形成的病毒噬斑均没有特异性绿色荧光染色。上述结果表明，本发明制备的31G7单克隆抗体特异性识别MDV-1毒株而不识别MDV-2和MDV-3毒株，可用于MDV-1毒株的IFA特异性检测和分析。

应用例二、MDV-1特异性pp38蛋白的蛋白印迹分析(Western blot)

选择不同血清型和不同毒力的MDV毒株，包括MDV-1毒株(CVI988、GA、Md5和GX0101)、MDV-2毒株(SB-1)和MDV-3毒株(HVT)分别接种CEF单层细胞，形成典型病毒噬斑后消化收集细胞培养物，同时以未感染病毒的阴性CEF细胞样品为对照，分别提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后将其转印到硝酸纤维素膜上，用含5％脱脂奶的PBST封闭液，室温封闭2h；弃去封闭液，PBST溶液洗3遍；孵育31G7单克隆抗体腹水(1:100000)，4℃过夜，PBST溶液洗3遍；孵育HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)(1:1000)，室温2h；弃去二抗稀释液，PBST溶液洗3遍，用AEC酶底物试剂盒显色。

如图7B所示，检测结果显示，Western blot实验结果与IFA结果完全一致，即不同毒力MDV-1毒株(CVI988、GA、Md5和GX0101)感染的CEF细胞样品在38kD左右均出现特异性反应条带，而MDV-2毒株(SB-1)和MDV-3毒株(HVT)感染的CEF细胞样品以及CEF阴性对照细胞样品均无任何特异性反应条带。这与此前文献报道的pp38蛋白是MDV-1编码的特异性蛋白的结果一致，且与预期的病毒蛋白分子大小一致。上述结果表明，本发明制备的31G7单克隆抗体特异性识别MDV-1毒株而不识别MDV-2和MDV-3毒株，可用于MDV-1毒株的Western blot特异性检测和分析。

应用例三、MDV-1特异性pp38蛋白的免疫组织化学检测(IHC)

用MDV-1超强毒株GX0101腹腔接种1日龄SPF鸡，在病毒感染后14d采集攻毒鸡腹部羽毛囊组织，剪去羽毛，将羽髓部迅速置液氮中冷冻，制作冰冻切片，固定于载玻片上。同时以病毒未感染鸡的羽髓囊组织切片作为阴性对照组。冰冻切片用冷丙酮在4℃固定10～20min；PPS洗3次，3％H₂O₂灭活内源性过氧化物酶，避光放置20min；PBS洗3次；擦干净切片背面水分及切片正面组织周围的水分(保持组织呈湿润状态)，滴加10％牛血清(PBS)，37℃，封闭15min；用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加31G7单克隆抗体腹水(1:100000)4℃过夜；PBS洗3次，加HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)(1:1000)，37℃，1h；PBS洗3次，DAB显色5min，蒸馏水充分冲洗终止；室温，苏木素复染1min，自来水冲洗掉多余的苏木素，0.5％盐酸乙醇分化1～2s，自来水冲洗返蓝约10min；80％、90％、95％乙醇速洗，每级数秒到十几秒，光镜下监控细胞核与细胞质量颜色对比，100％乙醇2次，每次1～2min；二甲苯透明2次，每次1～2min，中性树胶封固(图8)，显微镜下观察结果。

如图8所示，检测结果显示，在GX0101感染鸡羽囊上皮细胞内呈现特异性的棕色染色(图8A、8B、8C)，而病毒未感染阴性对照鸡的羽囊上皮细胞未见染色现象(图8D)，说明本发明制备的31G7单克隆抗体在MDV感染鸡羽髓囊组织IHC实验中可特异性的识别表达于羽囊上皮细胞内的pp38蛋白，该抗体可应用于MDV-1毒株的IHC检测和分析。

应用例四、MDV-1特异性pp38蛋白的免疫沉淀分析(IP)

用GX0101感染3个T75细胞瓶的CEF单层，3d后形成典型病毒噬斑时收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解缓冲液，置冰上处理10min，4℃、12000rpm离心10min，收集上清，置冰上备用。

各取Protein A/G Magnetic Beads磁珠50μL，置2个1.5mL EP管中，分别加入400μLPBST，充分混匀，置磁力架上，磁性分离洗涤2次。洗涤后的磁珠，每管分别孵育阴性对照抗体(NCAb)、31G7单克隆抗体(400μL PBST稀释至终浓度20μg/mL)，置翻转混合仪，室温孵育30min，磁性分离收集磁珠，分别加入400μL PBST置磁力架上，磁性分离洗涤，重复4次。

取病毒感染细胞裂解上清液，分别加入上述吸附阴性对照抗体、31G7抗体并充分洗涤后的磁珠EP管中，充分混匀，置翻转混合仪，室温孵育30min，磁性分离收集磁珠，分别加入400μL PBST，置磁力架上磁性分离洗涤，重复4次。磁性分离收集磁珠，各加入30μL 1×SDS-PAGE Loading Buffer，混合均匀，95℃加热5min，收集上清进行SDS-PAGE检测。蛋白胶按照快速银染试剂盒(碧云天)说明书进行染色并观察结果。

如图9所示，检测结果显示，阴性对照抗体泳道仅出现单克隆抗体重链特异性蛋白条带(56kD)，而31G7单克隆抗体泳道除了出现重链(56kD)和轻链(25kD)条带之外，在38kD处还出现了一条明显的蛋白条带，切胶收集该蛋白条带，送样至上海欧易生物公司进行质谱分析。

如图10所示，将质谱分析获得的分离肽段与MDV-1编码蛋白进行比对分析，结果证明该蛋白条带为MDV-1表达的特异性pp38蛋白。上述结果表明，本发明制备的31G7单克隆抗体可用于MDV-1毒株的pp38蛋白的IP检测和分析。

上述免疫学检测与分析应用的结果表明，本发明制备的单克隆抗体31G7是抗MDV-1特异性pp38蛋白的抗体，不仅可用于不同毒力MDV-1毒株的IFA、Western blot、IHC以及IP等免疫学检测和分析，还可以用于鉴别区分MDV-2和MDV-3毒株，适用于不同血清型MDV毒株的鉴别诊断，具有开发MDV免疫学诊断试剂的良好应用前景。

上述实施例对本发明作了详细说明，本领域技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中各具体参数和步骤进行类似变更或等同替换，形成多个具体实施例，这些变化均属于本发明的常见变化，都应在本发明的保护范围内，在此不再一一详述。

序列表

<110> 河南省农业科学院

<120> 一种血清1型马立克病病毒pp38单克隆抗体的制备方法及应用

<130> 单克隆抗体的制备

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 359

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

aggtgaagct gcagcagtct ggaggaggct tggtacagcc tgggggttct ctgagactct 60

cctgtgcaac ttctgggttc accttcactg atcactacat gagctgggtc cgccagcctc 120

caggaaaggc acttgagtgg ttgggtttta ttagaaacaa agctaatggt tacacaacag 180

actacagtgc atctgtgaag ggtcggttca ccatctccag agataaatct caaagcatcc 240

tctatcttca aatgaacacc ctgagagctg aggacagtgc cacttattac tgtgcaagag 300

atggggatta cggccccctt gactactggg gccaagggac cacggtcacc gtctcctca 359

<210> 2

<211> 325

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gacattgagc tcacccagtc tccagcactc atggctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

atcacctgca gtgtcagctc aagtataagt tccagcaact tgcactggta ccagcagaag 120

tcagaaacct cccccaaacc ctggatttat ggcacatcca acctggcttc tggagtccct 180

gttcgcttca gtggcagtgg atctgggacc tcttattctc tcacaatcag cagcatggag 240

gctgaagatg ctgccactta ttactgtcaa cagtggagta gttacccgta cacgttcgga 300

gggggcacca agctggaaat caaac 325

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Thr Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp His Tyr

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly

35 40 45

Phe Ile Arg Asn Lys Ala Asn Gly Tyr Thr Thr Asp Tyr Ser Ala Ser

50 55 60

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Gln Ser Ile Leu

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Asp Gly Asp Tyr Gly Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 4

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser

20 25 30

Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Thr Ser Pro Lys Pro Trp

35 40 45

Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

caccgcgtgc atgtcatttt tcgc 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

aaacgcgaaa aatgacatgc acgc 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

caccggtgca ggcattgtcg ttgg 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

aaacccaacg acaatgcctg cacc 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

caccgggtat gttagtcggt agaa 24

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

aaacttctac cgactaacat accc 24

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

caccgaacag aagcggaatg cgccg 25

<210> 12

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

aaaccggcgc attccgcttc tgttc 25

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

caccgtcgcc gacgaggcag ggcat 25

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

aaacatgccc tgcctcgtcg gcgac 25

<210> 15

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

caccgcgaag ggctgacggc gtctt 25

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

aaacaagacg ccgtcagccc ttcgc 25

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

tggtggggag atagtctcgg 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

tgatcggtgg tgtaaccgtg 20

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

aggtsmarct gcagsagtcw gg 22

<210> 20

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc cc 32

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

gacattgagc tcacccagtc tcca 24

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

ccgtttgatt tccagcttgg tgcc 24

Claims

1.一种分泌抗血清1型马立克病病毒pp38蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株pp38-31G7，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23025。

2.一种抗血清1型马立克病病毒pp38蛋白的单克隆抗体31G7，其特征在于，所述单克隆抗体31G7是由权利要求1所述鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株pp38-31G7所分泌；所述单克隆抗体31G7的轻链为Kappa型，亚型为IgG1。

3.如权利要求2所述的单克隆抗体31G7，其特征在于，所述单克隆抗体31G7的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求2所述的单克隆抗体31G7，其特征在于，所述单克隆抗体31G7的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

5.如权利要求2所述的单克隆抗体31G7在制备免疫学检测试剂中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述免疫学检测试剂包括酶联免疫吸附实验ELISA试剂盒、免疫层析试纸卡或免疫层析试纸条。