CN114457041B - 一种马立克病病毒gB蛋白的单克隆抗体及制备方法和应用 - Google Patents

一种马立克病病毒gB蛋白的单克隆抗体及制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种抗马立克病病毒gB蛋白的单克隆抗体及制备方法和应用。所述的抗MDV gB蛋白的单克隆抗体5E8由小鼠杂交瘤细胞株gB‑5E8产生，该细胞株保藏编号为CGMCC No:23024，该单克隆抗体重链及轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。本发明其分泌的单克隆抗体5E8可用于所有不同血清型和致病型MDV毒株的IFA和Western blot等免疫学检测分析，在MDV免疫学检测中具有普适性和通用性，具有良好的应用前景。该方法大大提高了筛选针对MDV特定病毒蛋白的单克隆抗体的效率和准确性，同时也为其它疱疹病毒蛋白单克隆抗体的研制提供一种全新思路和可靠的技术手段。

Description

一种马立克病病毒gB蛋白的单克隆抗体及制备方法和应用
技术领域
本发明涉及一种抗马立克病病毒gB蛋白的单克隆抗体及制备方法和应用，属于动物病毒免疫学技术领域。
背景技术
马立克病病毒(Marek’s disease virus，MDV)属于α疱疹病毒，MDV可经空气传播，传染能力强，早期感染雏鸡可引起严重的免疫抑制、外周神经肿大和内脏器官肿瘤为特征的鸡马立克病，最终会导致感染鸡群大批死亡，全球养禽业每年因此约导致10～20亿美元的直接经济损失。MDV共有3种血清型：血清I型(MDV-1)、血清II型(MDV-2)和血清III型(MDV-3)，其中只有MDV-1具有致病性和致瘤性。根据MDV-1分离株致病性的不同，MDV-1又可分为弱毒MDV(mMDV)、强毒MDV(vMDV)、超强毒MDV(vvMDV)以及特超强毒MDV(vv+MDV)。
MDV基因组为线性双股DNA，全长约180kb。主要由一个长独特序列区(Uniquelong，UL)和一个短独特序列区(Unique short，US)构成，在两个独特序列区的两侧，分别是两个序列完全相同的反转重复序列区，包括：长末端重复序列(Terminal repeat long，TRL)和长内部重复序列(Internal repeat long，IRL)以及短末端重复序列(Terminalrepeat short，TRS)和短内部重复序列(Terminal repeat short，IRS)，独特序列区中编码的MDV基因与其它疱疹病毒具有高度的保守性，而MDV特异性的病毒基因则主要位于反转重复序列区TR/IR中。
MDV基因组较大，编码近200个ORF，包括一部分结构基因和功能基因，这其中有一类是编码囊膜糖蛋白的结构基因，如：gB、gC、gD、gE、gI、gK、gL和gM等基因。gB是MDV最保守的一个结构基因，是MDV重要的具有中和活性的抗原基因，在感染和抗感染中和反应中起着重要的免疫保护作用。gB蛋白是由三种分子量不同的糖蛋白(gP100、gP60和gP49)组成的糖蛋白复合物，是一种非分泌性抗原，存在于MDV感染细胞的细胞膜表面和细胞浆内，因为它能引起体液免疫和细胞免疫，因而在MDV基因工程疫苗研制中成为一个十分重要的抗原，它也是目前发现的最重要的保护性抗原。
MDV和其他疱疹病毒一样，是严格的细胞结合性病毒。gB蛋白是MDV编码的具有重要中和活性的囊膜糖蛋白，在MDV基因工程疫苗研制和病毒检测与诊断中也是非常重要的免疫保护性抗原和诊断标识。因此，制备MDV gB蛋白的特异性单克隆抗体，不仅可用于gB蛋白中和抗原表位筛选与鉴定及功能研究，还可用于MDV基因工程疫苗研制。尤其是对于MDV的鉴别诊断技术和产品研发，可以提供重要的关键核心试剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种稳定分泌抗马立克病病毒gB蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株gB-5E8和单克隆抗体5E8的制备方法及应用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
利用MDV为严格的细胞结合性疱疹病毒的特性，收集MDV感染的CEF，利用细胞核蛋白和细胞浆蛋白提取试剂盒分离提取细胞浆蛋白，免疫BALB/c小鼠，利用细胞融合技术建立抗MDV病毒蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株和单克隆抗体库；同时利用MDV感染CEF病毒噬斑和pEGFP-N1-gB真核表达质粒转染的293T细胞做间接免疫荧光实验(IFA)，从抗体库中筛选获得可稳定分泌并特异性识别MDV gB蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株gB-5E8，最终制备获得的单克隆抗体5E8可应用于间接免疫荧光实验IFA和蛋白质印迹分析Western-blot等免疫学检测技术和方法中，为后续MDV gB蛋白的结构和功能研究、中和抗原表位筛选与鉴定、以及MDV鉴别诊断技术和产品研发提供关键核心试剂，同时也为MDV及类似病毒的单克隆抗体的筛选、鉴定和制备提供了一种新的策略和技术方法。
一株分泌抗马立克病病毒MDV gB蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株gB-5E8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23024。
一种抗马立克病病毒MDV gB蛋白的单克隆抗体5E8，所述单克隆抗体5E8是由权利要求1所述鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株gB-5E8所分泌；所述单克隆抗体5E8的轻链型为Kappa，亚型为IgG1。
所述单克隆抗体5E8的重链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述单克隆抗体5E8的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述的单克隆抗体5E8的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用血清1型马立克病病毒超强毒株GX0101感染鸡胚成纤维细胞CEF，随后提取、分离纯化细胞浆蛋白，以所述细胞浆蛋白为免疫原免疫BALB/C小鼠，结合间接免疫荧光实验IFA对免疫小鼠多抗血清进行检测，选择IFA效价最高的小鼠，备用；
(2)利用细胞融合技术对步骤(1)效价最高的小鼠进行处理，制备杂交瘤及细胞上清，结合间接免疫荧光实验IFA检测细胞上清，筛选得到阳性杂交瘤细胞；结合2～3轮亚克隆，构建针对MDV病毒蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞库和单克隆抗体库；
(3)根据NCBI注册的GX0101的基因组序列，GenBank登录号：JX844666.1，合成gB基因全长序列，构建pEGFP-N1-gB真核表达质粒；利用pEGFP-N1-gB真核表达质粒转染293T细胞，瞬时表达MDV gB蛋白后固定细胞，对步骤(2)获得的MDV单克隆抗体杂交瘤细胞上清进行间接免疫荧光实验IFA鉴定，筛选获得一株抗马立克病病毒gB蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株gB-5E8；
(4)选择经产BALB/c母鼠，腹腔注射杂交瘤细胞株gB-5E8制备5E8单克隆抗体腹水。
所述的单克隆抗体5E8在马立克病病毒免疫学检测中的应用。
所述免疫学检测包括但不仅限于间接免疫荧光实验IFA、蛋白质印迹分析Western-blot、酶联免疫吸附实验ELISA或免疫层析试纸技术。
所述的单克隆抗体5E8在免疫学检测试剂中的应用。
所述免疫学检测试剂包括但不限于酶联免疫吸附实验ELISA试剂盒、免疫层析试纸卡或免疫层析试纸条。
本发明有益效果：
(1)本发明依据MDV严格的细胞结合性疱疹病毒的特性，利用细胞核和细胞浆蛋白提取试剂盒分离提取了MDV感染细胞的细胞浆总蛋白作为免疫原。该方法简单快速、可操作性强，仅仅需要1个T75细胞瓶培养的MDV感染CEF样品，就可以提取制备足够多次免疫使用的病毒蛋白免疫原。利用该方法提取的细胞浆蛋白包含种类丰富的MDV病毒蛋白，相对于体外原核表达或真核表达纯化的单一病毒蛋白，本发明提取的细胞浆蛋白不仅包括了病毒编码的许多结构蛋白和非结构蛋白，而且这些病毒蛋白的天然构象和活性未经破坏，比体外表达纯化的蛋白更可靠。利用本发明使用的方法制备的免疫原，一次免疫即可获得几乎针对全部不同病毒蛋白抗体筛选的要求。
(2)本发明利用MDV感染CEF的细胞浆蛋白常规方法免疫小鼠，结合细胞融合技术进行杂交瘤细胞制备，同时利用MDV感染细胞病毒噬斑进行IFA染色检测筛选杂交瘤细胞上清，从而筛选出仅与MDV噬斑特异性结合的杂交瘤细胞，可以快速构建一个特异性针对MDV表达的绝大部分病毒蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞库。理论上来讲，该抗体库中基本包含针对MDV编码的溶细胞性复制期所表达的全部病毒蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，大大提高了筛选针对病毒不同蛋白单克隆抗体的可能性。
(3)本发明的提供的单克隆抗体具有较高特异性，可以同时用于MDV不同血清型和不同毒力的野毒株及疫苗毒株的IFA、Western Blot等多种鉴定方法和检测技术。
(4)本发明的单克隆抗体具有高度的灵敏度，其IgG亚型为IgG1，轻链型为Kappa型，IFA效价可达1∶2.56×105。
(5)本发明筛选得到的单克隆抗体具有稳定的抗体分泌能力，能快速、特异的识别MDV gB蛋白，为MDV抗原快速检测技术相关难题的解决奠定了良好的基础，在MDV免疫学检测技术和诊断试剂研发中具有重要的应用价值。
附图说明
图1利用病毒噬斑的IFA染色进行MDV特异性单克隆抗体的初步筛选结果。
其中：普通光，表示白光条件下观察到的MDV噬斑；免疫荧光，表示IFA检测后特异性绿色荧光染色的MDV噬斑；2F3、4B1、5E8等编号，表示不同单克隆杂交瘤细胞株的克隆编号。
图2真核表达的MDV gB蛋白与单克隆抗体5E8的IFA染色鉴定结果。
其中：HB3，表示MDV gB蛋白的阳性对照抗体；5E8、2F3、4B1、10B2和27H3，表示本发明制备的gB蛋白单克隆抗体；EGFP，表示真核表达质粒自带的绿色荧光蛋白；gB，表示MDVgB蛋白，呈现特异性的红色荧光。
图3MDV感染CEF病毒噬斑筛选鉴定单克隆抗体杂交瘤细胞上清的IFA染色结果。
其中：HB3，表示gB蛋白的阳性对照抗体；5E8，表示本发明制备的gB蛋白单克隆抗体。
图4gB单克隆抗体5E8与不同血清型MDV毒株的IFA染色鉴定结果。
其中：plaque，表示普通光下的MDV噬斑；5E8，表示本发明制备的gB蛋白单克隆抗体在免疫荧光下指示的MDV噬斑；GA、GX0101和Md5，表示不同毒力的MDV-1毒株；HVT，表示MDV-3疫苗株；SB-1，表示MDV-2疫苗株；CVI988，表示MDV-1疫苗株。图5gB单克隆抗体5E8与不同血清型MDV毒株的Western blot鉴定结果。
其中：M，表示蛋白分子量标记；HVT，表示MDV-3疫苗株；SB-1，表示MDV-2疫苗株；CVI988，表示MDV-1疫苗株；GA、GX0101和Md5，表示不同毒力的MDV-1毒株；β-actin，表示宿主细胞的内参蛋白；gB(1)、gB(2)和gB(3)，表示3种不同大小的gB蛋白异形体。
具体实施方式
下面结合实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的保护范围。
在以下实施例中如无特别说明，所涉及的仪器设备均为常规仪器设备；所涉及的试剂为市售常规试剂；所涉及试验方法为常规方法。
实施例一：MDV全病毒蛋白杂交瘤细胞株和抗体库的构建
1、免疫原的制备及小鼠免疫
用国内分离的MDV超强毒株GX0101(山东农业大学崔治中教授馈赠)接种T75细胞瓶中已制备好的鸡胚成纤维细胞(CEF)单层，置37℃、5％CO2培养箱中培养3～4d；显微镜下观察出现典型病毒噬斑后，消化收集细胞，以1000rpm的速度离心10min，收集细胞沉淀，利用Thermo Scientific公司生产的NE-PERTM细胞核蛋白和浆蛋白提取试剂分离纯化病毒感染CEF样品的细胞浆蛋白。测定蛋白含量后，首免加等量弗氏完全佐剂混合乳化，免疫6周龄Balb/C雌性小鼠5只，50μg/只，背部皮下分点注射。加强免疫时加等量弗氏不完全佐剂混合乳化，50μg/只，共免4次，每次间隔3周，4免后15d断尾采血分离血清。
利用IFA检测免疫鼠血清多抗效价。简述如下，复苏液氮中冻存的GX0101病毒种，37℃水浴迅速溶解，1000rpm离心5min后，弃去细胞冻存液，用1mL含1％(v/v)FBS(胎牛血清)的DMEM培养基的维持液重悬细胞，取10μL接种于96孔细胞培养板上的单层CEF，含1％FBS的DMEM培养基的维持液150μL/孔，同时做未接毒的CEF细胞阴性对照，置37℃、5％CO2培养箱中培养3～4d；显微镜下观察接毒细胞出现典型病毒噬斑后，弃去96孔细胞板中维持液，每孔加入预冷的甲醇:丙酮(体积比为1:1)溶液固定细胞，100μL/孔，室温静置10min，弃去细胞固定液，PBST缓冲液(含0.05％(v/v)Tween-20的PBS缓冲液)洗3遍甩干，加入含5％(v/v)脱脂奶的PBST封闭液，200μL/孔，置37℃温箱封闭30min；弃去封闭液，PBST溶液洗3遍，甩干，接毒孔和CEF细胞对照孔分别加倍比稀释的各免疫鼠血清(稀释度为1:100～1:3200)，100μL/孔，置37℃温箱30min；弃去血清液，PBST溶液洗3遍，甩干，加入FITC(异硫氰酸荧光素)标记的羊抗鼠IgG(1:500)二抗稀释液，100μL/孔，置37℃温箱30min；弃去二抗稀释液，PBST溶液洗3遍，最后加PBST溶液100μL/孔，置倒置荧光显微镜下观察。
检测结果显示，5只免疫小鼠均产生了针对MDV的特异性抗体，其中1号鼠和4号鼠的免疫多抗IFA效价最高(表1)。
表1免疫鼠多抗血清IFA效价测定结果
Figure BDA0003549915830000051
注：++，强阳性；+，阳性；-，阴性
2、杂交瘤细胞株和抗体库的构建
选择免疫效价最高的1号小鼠进行超免，融合前腹腔注射不加佐剂的病毒感染CEF细胞浆蛋白(50μg/只)，超免3d后取小鼠脾细胞按常规方法进行细胞融合，将SP20细胞与超免鼠脾细胞分别计数后按照1:10的比例进行混合，用PEG-1500融合剂进行融合，然后细胞用RPMI-1640/HAT培养液分散细胞，接种于40块96孔细胞培养板中，200μL/孔，置37℃、5％CO2培养箱中培养，约10～15d长出较大杂交瘤之后抽取细胞上清进行IFA检测。
同上所述的IFA染色方法，进行杂交瘤细胞上清的第一轮检测和筛选，选择只与GX0101病毒噬斑特异性结合且与CEF细胞无分特异性反应的阳性杂交瘤细胞(如图1所示的克隆编号为2F3、4B1、4F9、5E8、10B1、10B2、10F9、10G9、21G9、24H3、34F2、35G9、6G9E1、6G11F2、1F8F6、4B5B9、4F11E6、5D5G2、5D10H6、5E10E1和5F6H9的不同单克隆杂交瘤细胞株)，分别转至24孔板扩大培养，复测后选取各阳性孔杂交瘤细胞以有限稀释法进行2～3次亚克隆，末次亚克隆后选出状态良好、生长旺盛的强阳性单克隆细胞株进一步扩大培养，离心收集细胞，用细胞冻存液(体积比为DMSO∶小牛血清∶DMEM＝1∶5∶4)重悬后存于液氮罐中保种，同时留取各杂交瘤细胞上清，-20℃保存备用，从而建立一个MDV全病毒蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞库和单克隆抗体库。
实施例二：抗MDV gB蛋白单克隆抗体的筛选、鉴定和制备
1、gB蛋白单克隆抗体的初步筛选
为验证筛选的单克隆抗体杂交瘤细胞上清针对MDV gB蛋白的特异性，根据NCBI注册的GX0101(GenBank登录号：JX844666.1)的基因组序列，合成gB基因全长序列，构建pEGFP-N1-gB真核表达质粒，按照LipofectamineTM 2000(Thermo Fisher)说明书，转染提前制备的24孔板293T细胞单层(汇合度约为80％～90％)，转染后48h用预冷的甲醇:丙酮(体积比为1:1)溶液固定细胞，100μL/孔，室温静置10min，弃去细胞固定液，PBST缓冲液(含0.05％(v/v)Tween-20的PBS缓冲液)洗3遍甩干，加入含5％(v/v)脱脂奶的PBST封闭液，200μL/孔，置37℃温箱封闭30min；弃去封闭液，PBST溶液洗3遍，甩干；分别孵育gB蛋白阳性对照抗体HB3(英国Pirbright研究所馈赠)和实施例一筛选获得的阳性杂交瘤细胞上清液，37℃温箱30min，PBST洗3遍；加DyLight 594标记的羊抗鼠IgG(1:1000)二抗稀释液，37℃温箱30min，PBST洗3遍；加PBST，200μL/孔，置荧光显微镜下观察结果。
结果显示，在荧光显微镜下，用pEGFP-N1-gB质粒转染293T细胞48h后，大部分细胞呈现出EGFP蛋白的自发绿色荧光，同时阳性对照抗体HB3也可与大部分293T细胞特异性结合，在DyLight 594标记的羊抗鼠IgG的指示下呈特异性的红色荧光染色，且能与细胞自发绿色荧光共定位(图2)，表明本发明构建的pEGFP-N1-gB质粒能够在293T细胞中正确的瞬时表达gB蛋白且具备良好的生物学活性。同时，从MDV全病毒蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞库中发现多株杂交瘤，如分别命名为gB-5E8、gB-2F3、gB-4B1、gB-10B2和gB-27H3的杂交瘤细胞上清也呈现类似的gB蛋白染色和EGFP自发荧光共定位结果(图2)。上述实验结果表面，利用MDV感染CEF的病毒噬斑进行IFA检测，可从本发明建立的MDV全病毒蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞库和单克隆抗体库中，快速高效的筛选到针对MDV gB蛋白的特异性单克隆抗体。
后续实验中，本发明将对单克隆抗体杂交瘤gB-5E8的相关性能进行进一步的深入分析和鉴定。该鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株gB-5E8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.23024，保藏时间为2021年9月1日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2、gB蛋白单克隆抗体的IFA复检
取GX0101病毒种感染CEF单层，出现明显噬斑后固定细胞，同上所述分别孵育单克隆抗体杂交瘤gB-5E8的细胞上清和抗FITC标记的羊抗鼠IgG(1:500)二抗稀释液进行IFA负检。
结果显示，在荧光显微镜下可观察到单抗gB-5E8细胞上清液与阳性对照抗体HB3一样，可特异性结合GX0101感染CEF形成的病毒噬斑，呈现特异性的绿色荧光(图3)，相关结果表明gB-5E8杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体确实可特异性识别gB蛋白，命名为MDV gB蛋白5E8单克隆抗体。
3、单克隆抗体腹水的制备及IFA效价测定
选择经产的雌性BALB/c小鼠，腹腔内注射500μL灭菌石蜡，刺激免疫细胞用以促进杂交瘤细胞的增殖。7～10d后离心收集gB-5E8杂交瘤细胞并用灭菌PBS洗涤2次，按照每只约3×106～6×106个细胞的量注入小鼠腹腔，逐日观察小鼠状态，约10d左右待小鼠腹部膨大后抽取腹水，8000r/min，4℃离心20min去除油脂及细胞沉淀，收集腹水上清，-80℃保存备用；
用PBS将单抗腹水上清从1:1000开始进行2倍比梯度稀释至1:1.024×106，将GX0101感染并出现明显病毒噬斑的CEF单层进行细胞固定，分别孵育上述2倍比稀释的单抗腹水和FITC标记的羊抗鼠IgG(1:500)二抗稀释液进行IFA染色检测，结果显示5E8单抗腹水的IFA效价可达1∶2.56×105。
4、单克隆抗体亚型鉴定
按Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(小鼠单克隆抗体分型试剂盒)使用说明书进行操作，对5E8单克隆抗体的亚型进行鉴定。结果显示，5E8单克隆抗体的亚型为IgG1，轻链型为Kappa型(表2)。
表2 5E8单克隆抗体的亚型鉴定
Figure BDA0003549915830000081
注：+，阳性；-，阴性
5、单克隆抗体可变区基因的扩增与序列分析
根据鼠源单克隆抗体的序列特征，分别设计扩增重链可变区和轻链可变区的PCR扩增引物SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.8(表3)。上述引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成。
表3用于单克隆抗体重链和轻链基因扩增的PCR引物序列表
Figure BDA0003549915830000082
通过PCR扩增，分别获得单克隆抗体5E8重链和轻链可变区基因产物，经过克隆后送至生工生物工程(上海)有限公司测序。经测序分析，单克隆抗体5E8的重链可变区和轻链可变区基因序列分别为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，由其推导的单克隆抗体5E8的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列分别为SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
SEQ ID NO.1：
Figure BDA0003549915830000083
SEQ ID NO.2：
Figure BDA0003549915830000084
SEQ ID NO.3：
Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Arg ValSer Cys Lys Ala Ser Arg Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Leu Ile Glu Trp Val Lys GlnArg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Asp SerAsn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Glu Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser SerThr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe CysAla Gly His Tyr Tyr Gly Ser Leu Phe Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr ValThr Val Ser Ser
SEQ ID NO.4：
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly GluLys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu His TrpTyr Gln Gln Lys Ser Glu Thr Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Gly Thr Ser Asn LeuAla Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser LeuThr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp SerSer Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
应用例一：不同血清型和致病型MDV的间接免疫荧光实验(IFA)检测
选择不同血清型和不同致病型的MDV毒株，包括MDV-3疫苗株(HVT)、MDV-2疫苗株(SB-1)和不同致病型的MDV-1疫苗株(CVI988)或强毒株(GA、GX0101和Md5)，分别接种CEF单层细胞，形成典型的病毒噬斑后固定细胞。同前所述，分别孵育5E8单克隆抗体腹水(1:100000)和FITC标记的羊抗鼠IgG(1:500)二抗稀释液，进行IFA染色检测。
如图4所示的检测结果显示，MDV-3疫苗株(HVT)、MDV-2疫苗株(SB-1)和不同致病型的MDV-1毒株(CVI988、GA、GX0101和Md5)感染CEF单层细胞形成的病毒噬斑，均可被5E8单克隆抗体结合并呈现出特异性的绿色荧光染色。上述结果表明，本发明制备的gB蛋白5E8单克隆抗体可识别全部3种不同血清型和不同致病型MDV毒株，具备普适性和通用性。
应用例二、不同血清型和致病型MDV的蛋白印迹分析(Western blot)
选择不同血清型和不同致病的MDV毒株，包括MDV-3疫苗株(HVT)、MDV-2疫苗株(SB-1)和不同致病型的MDV-1疫苗株(CVI988)或强毒株(GA、GX0101和Md5)，分别接种CEF单层细胞，形成典型的病毒噬斑后消化收集细胞培养物，同时以未感染病毒的CEF细胞样品为阴性对照，分别提取细胞总蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后将其转印到硝酸纤维素膜上，用含5％脱脂奶的PBST封闭液，室温封闭2h；弃去封闭液，PBST溶液洗3遍；孵育5E8单克隆抗体腹水(1:100000)，4℃过夜，PBST溶液洗3遍；孵育HRP标记的羊抗鼠IgG(H+L)(1:1000)，室温2h；弃去二抗稀释液，PBST溶液洗3遍，用AEC酶底物试剂盒显色后观察结果。
如图5所示的检测结果显示，Western blot分析结果与IFA染色的结果完全一致，即所有不同血清型和不同致病型的MDV毒株感染的CEF细胞蛋白样品中，在40kD～100kD大小范围内，使用5E8单克隆抗体均可检测到3条大小不等的MDV gB蛋白特异性条带；而CEF阴性对照样品中，除检测到预期大小的β-actin内参蛋白外无任何gB蛋白条带被检出。这些结果与此前文献报道所述的gB蛋白是由三种分子量不同的糖蛋白(gP100、gP60、和gP49)组成的糖蛋白复合物相一致。上述结果表明，本发明制备的5E8单克隆抗体可特异性识别全部3种不同血清型和不同致病型MDV毒株，可用于所有MDV毒株的Western blot特异性检测和分析，具备普适性和通用性。
上述免疫学检测与分析应用的结果表明，本发明制备的单克隆抗体5E8是抗MDV-1gB蛋白的特异性抗体，可用于不同毒力或致病型MDV-1毒株的IFA和Western blot等免疫学检测和分析，在gB蛋白功能研究和MDV免疫学检测方面具有普适性和通用性，适用于MDV与其它家禽病毒的鉴别诊断，具有开发MDV免疫学诊断试剂的良好应用前景。
上述实施例对本发明作了详细说明，本领域技术人员能够理解，在不脱离本发明宗旨的前提下，还可以对上述实施例中各具体参数和步骤进行类似变化或等同替换，形成多个具体实施例，这些变化均属于本发明的常见变化，都应在本发明的保护范围内，在此不再一一详述。
序列表
<110> 河南省农业科学院
<120> 一种马立克病病毒gB蛋白的单克隆抗体及制备方法和应用
<130> 单克隆抗体的制备
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ctgcagcagt caggagctga gctggtaagg cctgggactt cagtgagggt gtcctgcaag 60
gcttctagat acgccttcac taattacttg atagagtggg taaagcagag gcctggacag 120
ggccttgagt ggattggagt gattaatcct ggaagtggtg attctaatta caatgagaag 180
ttcaagggcg aggcaacact gactgcagac aaatcctcca gcactgccta catgcagctc 240
agccgcctga catctgatga ctctgcggtc tatttctgtg cgggacatta ctacggtagt 300
ctcttctttg cctactgggg ccaagggacc acggtcaccg tctcctca 348
<210> 2
<211> 325
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gacattgagc tcacccagtc tccagcactc atggctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60
atcacctgca gtgtcagctc aagtataagt tccagcaact tgcactggta ccagcagaag 120
tcagaaacct cccccaaacc ctggatttat ggcacatcca acctggcttc tggagtccct 180
gttcgcttca gtggcagtgg atctgggacc tcttattctc tcacaatcag cagcatggag 240
gctgaagatg ctgccactta ttactgtcaa cagtggagta gttacccgta cacgttcgga 300
ggggggacca agctggaaat aaaac 325
<210> 3
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser Val Arg
1 5 10 15
Val Ser Cys Lys Ala Ser Arg Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Leu Ile Glu
20 25 30
Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile
35 40 45
Asn Pro Gly Ser Gly Asp Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Glu
50 55 60
Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu
65 70 75 80
Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Gly His
85 90 95
Tyr Tyr Gly Ser Leu Phe Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 4
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Val Ser Ser Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Glu Thr Ser Pro Lys Pro Trp
35 40 45
Ile Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu
65 70 75 80
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro
85 90 95
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
aggtsmarct gcagsagtcw gg 22
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
tgaggagacg gtgaccgtgg tcccttggcc cc 32
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
gacattgagc tcacccagtc tcca 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
ccgtttgatt tccagcttgg tgcc 24

Claims (6)

1.一株分泌抗马立克病病毒MDV gB蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞株，其特征在于，所述单克隆抗体杂交瘤细胞株为鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株gB-5E8，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.23024。
2.一种抗马立克病病毒MDV gB蛋白的单克隆抗体5E8，其特征在于，所述单克隆抗体5E8是由权利要求1所述鼠源单克隆抗体杂交瘤细胞株gB-5E8所分泌；所述单克隆抗体5E8的轻链型为Kappa，亚型为IgG1。
3.如权利要求2所述的单克隆抗体5E8在检测马立克病病毒的非诊断目的的免疫学检测方法中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述免疫学检测方法包括但不仅限于间接免疫荧光实验IFA、蛋白质印迹分析Western-blot、酶联免疫吸附实验ELISA或免疫层析试纸技术。
5.如权利要求2所述的单克隆抗体5E8在制备免疫学检测试剂中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述免疫学检测试剂包括但不限于酶联免疫吸附实验ELISA试剂盒、免疫层析试纸卡或免疫层析试纸条。
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马立克氏病病毒囊膜糖蛋白B基因原核表达产物单抗的制备;韩凌霞等;《动物医学进展》;20011231;第51-58页 *

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