CN112029735B - 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3b优势表位缺失标记毒株及其制备方法和应用 - Google Patents

一种口蹄疫病毒非结构蛋白3b优势表位缺失标记毒株及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112029735B
CN112029735B CN202010893827.5A CN202010893827A CN112029735B CN 112029735 B CN112029735 B CN 112029735B CN 202010893827 A CN202010893827 A CN 202010893827A CN 112029735 B CN112029735 B CN 112029735B
Authority
CN
China
Prior art keywords
foot
marker
strain
mouth disease
virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010893827.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112029735A (zh
Inventor
李平花
刘在新
卢曾军
马雪青
孙普
白兴文
曹轶梅
李坤
李冬
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Original Assignee
Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS filed Critical Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority to CN202010893827.5A priority Critical patent/CN112029735B/zh
Publication of CN112029735A publication Critical patent/CN112029735A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112029735B publication Critical patent/CN112029735B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
    • C12N2770/32121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
    • C12N2770/32134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
    • C12N2770/32141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/32143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
    • C12N2770/32151—Methods of production or purification of viral material
    • C12N2770/32152—Methods of production or purification of viral material relating to complementing cells and packaging systems for producing virus or viral particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明提供了一种口蹄疫病毒非结构蛋白3B优势表位缺失标记毒株及其制备方法和应用，属于生物技术和生物制品技术领域。口蹄疫病毒非结构蛋白3B优势表位缺失标记毒株，在非结构蛋白3B基础上发生优势表位完全缺失得到的口蹄疫病毒；所述非结构蛋白3B基础上发生优势表位完全缺失包括3B1中由GPYAGP突变为GPAAP、3B2中由GPYAGP突变为GPAAP和3B3中GPYEGP突变为GPYEAA。所述标记毒株在制备区分感染和疫苗免疫的口蹄疫标记疫苗中的应用，可以满足免疫预防和鉴别诊断的目的，用于我国FMD的有效预防、控制和净化。

Description

一种口蹄疫病毒非结构蛋白3B优势表位缺失标记毒株及其制 备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术和生物制品技术领域，具体涉及一种口蹄疫病毒非结构蛋白3B优势表位缺失标记毒株及其制备方法和应用。
背景技术
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus，FMDV)引起猪、牛、羊等主要家畜和野生偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病，该病传播迅速、发病率高，危害巨大，给畜牧业发展造成了巨大的危害。
传统灭活疫苗的免疫接种是我国预防和控制FMD的最有效手段，但常规灭活疫苗不能够区分疫苗免疫和野毒感染动物，致使我国FMD不能有效的控制和净化。近年来，随着RNA病毒反向遗传操作和基因重组等技术的成熟以及伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸障碍病毒和鸡马立克病病毒等优势表位缺失标记病毒的成功研制为FMD标记疫苗的发展提供了新的思路。研究者通过缺失FMDV结构蛋白G-H环，缺失前导蛋白L和3B或L和3D蛋白的修饰，缺失3A的优势表位等构建FMD标记病毒，发展鉴别诊断的标记疫苗。研究表明这些疫苗可以满足免疫预防和鉴别诊断的目的。但是，FMDV G-H环优势抗原表位的缺失会严重影响疫苗的免疫原性，弱毒疫苗存在毒力返祖的风险，基因大片段的缺失会影响病毒的复制能力，因此，本领域仍然需要发展更优质的FMD标记病毒疫苗候选株，为FMD的有效预防、控制和净化以及我国无疫区的建设提供有效的技术支撑。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种口蹄疫病毒非结构蛋白3B优势表位缺失标记毒株及制备方法和应用。本发明成功构建的口蹄疫病毒非结构蛋白3B优势表位缺失标记毒株O/rV-1/3B6用于制备可精准区分感染和疫苗免疫的口蹄疫标记疫苗，用于我国FMD的有效预防、控制和净化。
本发明提供了一种口蹄疫病毒非结构蛋白3B优势表位缺失标记毒株，在非结构蛋白3B基础上发生优势表位完全缺失得到的口蹄疫病毒；
所述非结构蛋白3B基础上发生优势表位完全缺失包括3B1中由GPYAGP突变为GPAAP、3B2中由GPYAGP突变为GPAAP和3B3中GPYEGP突变为GPYEAA。
优选的，优势表位缺失后的非结构蛋白3B的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。
优选的，优势表位缺失后的非结构蛋白3B的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。
优选的，所述口蹄疫病毒包括O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia17个血清型口蹄疫病毒。
优选的，所述标记毒株能在细胞上引起FMDV典型的CPE能力；
所述标记毒株不能与3B单抗4B1发生免疫反应；
所述标记毒株传代20代后遗传稳定；
所述标记毒株复制和生长能力与未标记的亲本病毒一致。
本发明提供了所述标记毒株的构建方法，包括以下步骤：
1)将含所述标记毒株中优势表位缺失非结构蛋白3B的Z4 DNA片段插入Puc18载体中，得到的重组质粒用Bgl II和NotI内切酶消化，得到含突变的非结构蛋白3B的Z4DNA片段；
2)将所述含突变的非结构蛋白3B的Z4 DNA片段插入口蹄疫疫苗株全长感染性克隆中，得到全长重组质粒；
3)将所述全长重组质粒线性化后转染细胞，得到的拯救病毒为口蹄疫病毒非结构蛋白3B优势表位缺失标记毒株。
优选的，当所述口蹄疫病毒为O型口蹄疫病毒时，人工合成含3B蛋白优势表位缺失的OZK/93-08病毒Z4片段，并克隆到pUC18载体中，得到重组质粒pUC-Z43B6；
所述口蹄疫疫苗株全长感染性克隆为OZK/93-08疫苗株全长感染性克隆pOZKF-Z1234；
所述全长重组质粒记为pOFS/3B6。
本发明提供了所述标记毒株或所述构建方法得到的标记毒株在制备区分感染和疫苗免疫的口蹄疫标记疫苗中的应用。
本发明提供了所述标记毒株或所述构建方法得到的标记毒株在制备区分感染和疫苗免疫生物制品中的应用。
本发明提供了一种用于区分感染和疫苗免疫的口蹄疫标记疫苗，由所述标记毒株制备得到。
本发明提供的口蹄疫病毒非结构蛋白3B优势表位缺失标记毒株，在非结构蛋白3B基础上发生优势表位完全缺失得到的口蹄疫病毒；所述非结构蛋白3B基础上发生优势表位完全缺失包括3B1中由GPYAGP突变为GPAAP、3B2中由GPYAGP突变为GPAAP和3B3中GPYEGP突变为GPYEAA。本发明所述含FMDV非结构蛋白3B的全长重组质粒后续转染细胞后能成功拯救得到FMDV，本发明所述3B蛋白氨基酸的突变修饰完全消除了FMDV与3B单抗4B1的反应能力，且后续制备得到的重组FMDV O/rV-1/3B6具有与亲本病毒相似的生长特性和复制能力，O/rV-1/3B6所含3B蛋白的突变修饰没有明显影响标记FMDV的生长特性和复制能力；所述标记毒株能在细胞上引起口蹄疫病毒典型的CPE能力，且经过20代传代3B蛋白未发生回复突变，表明所述标记FMDV具有较好的遗传稳定性。此外，本发明成功构建的标记病毒O/rV-1/3B6制备的疫苗多次免疫动物后均检测不到针对3B表位的抗体。可见，本发明成功构建的FMDVO/rV-1/3B6可以用于发展可精准区分感染和疫苗免疫的FMD标记疫苗，可以满足免疫预防和鉴别诊断的目的，用于我国FMD的有效预防、控制和净化。
附图说明
图1为本发明提供的FMDV 3B蛋白突变的示意图；
图2为本发明提供的重组质粒的酶切鉴定图，泳道1、2、3、4、5和7为重组质粒pOFS/3B1～pOFS/3B6 Bgl II/Not I酶切鉴定；泳道6为DL12000DNAmarker；
图3为本发明提供的重组质粒pOFS/3B1和pOFS/3B6转染BSR/T7细胞引起的CPE结果；
图4为本发明提供的O/rV-1/3B1和O/rV-1/3B6重组FMDV 3B蛋白部分测序峰图，其中A为O/rV-1/3B1重组FMDV 3B蛋白部分测序峰图，B为O/rV-1/3B6重组FMDV 3B蛋白部分测序峰图；
图5为本发明提供的重组FMDV O/rV-1/3B1和O/rV-1/3B6的免疫荧光检测图；
图6为本发明提供的重组FMDV O/rV-1/3B1和O/rV-1/3B6的Western blot检测图；
图7为本发明提供的P10、P15和P20代重组病毒O/rV-1/3B6与OZK/93-08病毒3B蛋白氨基酸序列的比对图；
图8为本发明提供的FMDV的蚀斑表型；
图9为本发明提供的FMDV的一步生长曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种口蹄疫病毒非结构蛋白3B优势表位缺失标记毒株，在非结构蛋白3B基础上发生优势表位完全缺失得到的口蹄疫病毒；
所述非结构蛋白3B基础上发生优势表位完全缺失包括3B1中由GPYAGP突变为GPAAP、3B2中由GPYAGP突变为GPAAP和3B3中GPYEGP突变为GPYEAA。
研究表明，结构蛋白优势抗原表位的缺失会影响FMD疫苗的免疫原性，为了得到能够区分感染和疫苗免疫更优质的标记毒株，FMD标记疫苗候选毒株通过缺失非结构蛋白免疫优势的B细胞表位设计。所述标记毒株中非结构蛋白3B优势表位缺失的策略是以3B单抗识别的关键氨基酸突变修饰和缺失最少为目的。优势表位缺失后的非结构蛋白3B的氨基酸序列优选如SEQ ID No.14所示(GPAAPLERQKPLKVKARLPQQEGPAAPMERQKPLKVKAKAPVVKEGPYEAAVKKPVALKVRAKNLIVTE)。优势表位缺失后的非结构蛋白3B的核苷酸序列优选如SEQ IDNo.13所示(GGACCCGCCGCGCCACTCGAACGTCAGAAACCTCTTAAAGTGAAAGCCAGGTTGCCACAACAAGAGGGACCTGCCGCTCCGATGGAGCGGCAGAAACCGCTGAAAGTGAAAGCAAAAGCCCCCGTCGTGAAGGAAGGACCCTACGAGGCGGCGGTGAAAAAGCCTGTCGCTTTGAAAGTGAGAGCAAAGAACTTGATCGTCACTGAG)。所述口蹄疫病毒优选包括O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3和Asia17个血清型口蹄疫病毒。由于7种血清型的口蹄疫病毒中关键氨基酸2PYAGP6是保守的氨基酸序列，因此，本发明中提供的非结构蛋白3B基础上发生优势表位完全缺失的标记方法适用于所有血清型的口蹄疫病毒株。为了清楚说明构建方法及构建的标记毒株的特性，在本发明实施例中，以O型病毒株为例进行实验，但是不能理解为对本发明的限制。
在本发明中，经过上述优势抗原表位的缺失突变，能够成功拯救得到标记口蹄疫病毒株，且所述标记毒株优选具有FMDV典型的CPE能力；所述CPE是指线化的FMDV全长克隆转染BSR/T7细胞后，正常细胞变圆，变大，个别成葡萄串状分布。与其他类型的缺失突变方案(pOFS/3B2～pOFS/3B5)相比，本发明提供的缺失突变方法没影响FMDV的拯救。
在本发明中，所述标记毒株优选不能与3B单克隆抗体发生免疫反应，优选不能与4B1单抗反应；所述3B单抗4B1在文献《口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体的制备与鉴定》，江苏农业学报,2009,25(2):296～300中公开过，由杂交瘤细胞株4B1分泌得到的单克隆抗体，公众可从中国农业科学院兰州兽医研究所获得。本发明所述FMDV3B优势表位完全缺失的突变方案与其他缺失突变方案(pOFS/3B1)相比，虽然pOFS/3B1能成功拯救得到重组病毒，但是该突变方案得到的标记病毒仍能与4B1单抗发生反应，说明该突变方案不能完全消除重组FMDV与4B1单抗的反应能力。同时，免疫荧光结果以及Westernblot结果一致表明，本发明构建的重组FMDV O/rV-1/3B6所含3B1、3B2和3B3氨基酸的修饰突变完全消除了重组病毒与4B1单抗的反应能力。
在本发明中，由于标记病毒容易在传代过程中发生回复突变，为了验证所述标记毒株的遗传稳定性，将所述标记毒株优选传代5、10、20代后进行RT-PCR和序列的测定，结果表明传代病毒所含的3B蛋白未发生氨基酸的突变，说明所述标记毒株遗传稳定。
在本发明中，分别对标记毒株进行噬斑表型和一步生长曲线的实验，结果表明，所述标记毒株复制能力和生长能力优选与未标记的亲本病毒一致。
本发明提供了所述标记毒株的构建方法，包括以下步骤：
1)将含所述标记毒株中优势表位缺失非结构蛋白3B的Z4 DNA片段插入pUC18载体中，得到的重组质粒用Bgl II和Not I内切酶消化，得到含突变的非结构蛋白3B的Z4DNA片段；
2)将所述含突变的非结构蛋白3B的Z4DNA片段插入口蹄疫疫苗株全长感染性克隆中，得到全长重组质粒；
3)将所述全长重组质粒线性化后转染细胞，得到的拯救病毒为口蹄疫病毒非结构蛋白3B优势表位缺失标记毒株。
在本发明中，当所述口蹄疫病毒为O型口蹄疫病毒时，优选人工合成含3B蛋白优势表位缺失OZK/93-08病毒的Z4片段，并克隆到pUC-18载体中，得到重组质粒pUC-Z43B6。所述疫苗株全长感染质粒为OZK/93-08疫苗株全长感染性克隆pOZKF-Z1234。所述OZK/93-08病毒，保藏于农业部兽医局指定国家口蹄疫参考实验室，公众可通过农业部兽医局批示的委托函获得，同时在CN101948811 A专利中记载。本发明对所述插入载体的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的插入载体的方法即可。所述全长重组质粒线性化用的酶优选为NotI。本发明对所述拯救病毒的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的拯救病毒的方法即可。Z4片段的核苷酸序列在公开号CN1019488811 A、专利名称为用反向遗传操作拓展口蹄疫疫苗株抗原谱及疫苗制备方法的专利中记载，其序列见该专利序列SEQ ID NO.1中第5289-8137位核苷酸。所述pOZKF-Z1234参见专利公布号CN101948811 A、发明名称利用反向遗传操作拓展口蹄疫疫苗株抗原谱及疫苗准备方法的专利。所述全长重组质粒记为pOFS/3B6。
本发明提供了所述标记毒株或所述构建方法得到的标记毒株在制备区分感染和疫苗免疫的口蹄疫标记疫苗或其他生物制品中的应用。
本发明提供了一种用于区分感染和疫苗免疫的口蹄疫标记疫苗，由所述标记毒株制备得到。
本发明对标记疫苗的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的疫苗制备方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的一种口蹄疫病毒非结构蛋白3B优势表位缺失标记毒株及制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1、含FMDV 3B蛋白优势表位关键氨基酸缺失或修饰全长克隆的构建方法：
丙氨酸扫描的研究结果表明FMDV特异的3B单抗4B1识别FMDV 3B1，3B2和3B3蛋白的关键氨基酸肽段为2PYAGP6。以FMD疫苗毒株O/ZK/93-08感染性克隆pOZKF-Z1234为骨架，利用基因合成技术，突变修饰FMDV非结构蛋白3B1，3B2和3B3优势表位的氨基酸，尝试构建一株3B蛋白优势表位完全消除的FMD标记病毒。
在金唯智生物有限公司基因合成含3B蛋白氨基酸突变修饰(见图1)的OZK/93-08病毒Z4片段，并将其分别克隆到pUC18载体中，重组质粒分别命名为pUC-Z43B6。将pUC-Z43B6重组质粒分别用Bgl II和Not I内切酶消化，回收Z4片段，并将其插入用同样内切酶消化的OZK/93-08疫苗株全长感染性克隆pOZKF-Z1234中，得到全长重组质粒pOFS/3B6。构建的全长重组质粒分别用Bgl II和Not I酶切鉴定和序列测定。
酶切结果表明，重组质粒切出与预期相符的目的条带，见图2。全长重组质粒的测序结果也表明成功构建了含FMDV 3B蛋白预期突变修饰的全长cDNA克隆。全长重组质粒3B蛋白的核酸序列和氨基酸序列见表1和序列表。
表1重组质粒的3B核苷酸和氨基酸序列
Figure BDA0002657799730000071
2、重组FMDV的拯救
用NotⅠ线化全长重组质粒pOFS/3B6，然后用DNA片段回收试剂盒纯化回收，作为转染模板。常规培养的单层BSR/T7细胞(BSR/T7细胞在文献《中国预防兽医学报》2016年第2期，袁红，李平花等“O型与A型口蹄疫重组标记疫苗病毒株的制备及鉴定”中公开，公众可从中国农业科学院兰州兽医研究所获得)生长至70％～80％时用于转染。具体步骤：取灭菌的1.5mL离心管，分别加入250μL的Opti-MEM培养液，在其中EP管中分别加入2.5μg线化质粒，另EP管中分别加入20μL的脂质体2000，分别吹打混匀；室温放置5min后将两管溶液混合，静置20min。与此同时，将分至6孔板中的细胞用Opti-MEM培养基温和冲洗两遍，20min后，将DNA-脂质体混合液分别加入细胞培养板中，轻轻混匀，置含5％CO2的培养箱中培养，5h后加入1mL完全培养基，置5％CO2的培养箱中继续培养。期间观察转染细胞出现致CPE的情况。
转染结果表明，转染pOFS/3B6质粒的细胞在转染后60h都出现FMDV典型的CPE，即正常细胞变圆，变大，个别成葡萄串状分布，对照细胞生长良好(见图3)。72h后收获转染样品，反复冻融3次后，在BHK-21上连续传4代。结果表明，已经出现CPE的转染上清在传代过程中，细胞出现CPE的时间越来越短，病变更加典型，表明全长重组质粒pOFS/3B6所含3B蛋白的突变修饰(见表1和序列表)并没影响FMDV的拯救。拯救的重组FMDV命名为O/rV-1/3B6。
3、重组口蹄疫病毒的鉴定
3.1、RT-PCR鉴定
取pOFS/3B6质粒转染的上清用RNAasy Mini Kit提取细胞毒总RNA，用引物OZ5269(+)/OZ6811(-)(OZ5269(+)：caagaagtgattgagcgggt，SEQ ID NO.15，OZ6811(-):tttgtcctcttcagacatct，SEQ ID NO.16)RT-PCR扩增含3B基因的特定片段，纯化回收后送金唯智生物有限公司测序，验证重组病毒的正确性。
测序结果表明：重组病毒O/rV-1/3B6含3B预期氨基酸的突变修饰(见图4)，表明本发明成功构建了含预期3B蛋白突变修饰的FMDV。
3.2、间接免疫荧光
BHK-21单层细胞(分至六孔培养板)生长至70％时接种拯救病毒O/rV-1/3B6以及OZK/93-08病毒，37℃孵育6h后弃培养液，PBS洗涤2次，4％冷多聚甲醛固定20min，PBS洗三遍，然后用0.2％Triton X-100通透10min，PBS洗3遍后用抗FMDV特异的3B单抗4B1不同稀释度37℃孵育1h，PBS洗3遍后加FITC标记的山羊抗小鼠的IgG抗体，37℃孵育1h，然后PBS洗3遍。最后加入0.5μg/mL DAPI(PBS配制)染色10min，PBS洗3遍后置于共聚焦荧光显微镜下拍照。同时设正常细胞对照。
结果表明，接种OZK/93-08病毒的BHK-21细胞用不同稀释度的3B单抗4B1作用，能看到可见的绿色荧光，而接种O/rV-1/3B6病毒的细胞用不同稀释度3B单抗4B1作用，则看不到任何可见的绿色荧光，对照细胞用3B单抗作用看不到任何可见的绿色荧光(见图5)。说明拯救的重组病毒为FMDV，O/rV-1/3B6重组病毒不能与3B单抗4B1作用，表明O/rV-1/3B6所表达3B蛋白的突变修饰(表1和序列表)能完全消除重组FMDV与3B单抗4B1的反应能力。免疫荧光的结果表明，构建的重组FMDV O/rV-1/3B6所含3B1、3B2和3B3氨基酸的修饰突变完全消除了重组病毒与3B单抗4B1的反应能力。
3.3Westernblot
为了进一步验证3B单抗4B1能否与O/rV-1/3B6重组病毒作用，BHK-21单层细胞生长至90％满时，接种FMDV O/rV-1/3B6以及OZK/93-08，感染8h后弃培养液，用PBS(0.01mol/L，pH值7.2)漂洗2次后收集细胞，用PBS重悬，反复冻融裂解后离心，取上清进行SDS-PAGE。PAGE分离的蛋白分别转印到NC膜上，然后用FMDV特异的3B单抗4B1和辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠的IgG进行免疫印记，最后用显影液显影拍照。
结果表明：OZK/93-08病毒感染的BHK-21细胞均能与3B单抗4B1反应，出现特异的3B蛋白条带，而O/rV-1/3B6病毒感染的BHK-21细胞则不能与3B单抗反应，检测不到3B特异的蛋白条带(见图6)。WB结果进一步表明O/rV-1/3B6所含3B蛋白的突变修饰完全消除了重组病毒与3B单抗4B1的反应能力。
免疫荧光和Westernblot的研究结果表明，O/rV-1/3B6所含3B蛋白氨基酸的突变修饰则完全消除了其与3B单抗4B1的反应能力，适合发展FMD标记疫苗候选毒株。
3.4、拯救病毒的遗传稳定性分析
将重组病毒O/rV-1/3B6按10％接种量接种BHK-21细胞，连续传代，观察每代病毒出现95％CPE的时间。结果表明传代4次以后拯救的FMDV出现95％CPE时间稳定在8-11h左右，与亲本病毒基本一致。将病毒连续传至20代(P20)，取P10，P15，P20细胞毒，提取总RNA后，用引物OZ5269(+)/OZ6811(-)(OZ5269(+)：caagaagtgattgagcgggt，SEQ ID NO.15，OZ6811(-)：tttgtcctcttcagacatct，SEQ ID NO.16)RT-PCR扩增含3B基因的特定片段，并送金唯智生物有限公司进行序列测定，验证3B蛋白的基因稳定性。
结果表明，3B蛋白氨基酸的突变修饰在连续传代过程中稳定存在，适合做遗传标记。P10、P15和P20代重组病毒与亲本病毒3B蛋白氨基酸的比对分析见图7。
3.5标记病毒的噬斑表型
为了验证3B蛋白氨基酸的突变修饰是否影响病毒的复制能力，将第5代重组病毒O/rV-1/3B6和亲本病毒OZK/93-08分别作10倍系列稀释，然后将不同稀释度病毒分别接种长满的单层BHK-21细胞(200μL/孔，6孔板)，置于CO2培养箱，每10min摇动1次。1h后加入2mL黄芪胶混合液(1份2×MEM，1份1.2％黄芪胶，1％血清)静止培养。48h后吸弃培养液，用PBS洗涤2次后加入固定液(50％丙酮+50％甲醇)室温固定30min。之后结晶紫染色1h，清水冲洗，观察病毒的噬斑表型。
结果表明FMDV O/rV-1/3B6和OZK/93-08均可在BHK-21细胞上形成噬斑，且噬斑形态相似，表明3B蛋白优势表位的完全消除并没明显影响重组FMDV在BHK-21细胞上的复制能力(见图8)。
3.6标记病毒的一步生长曲线
为了进一步验证3B蛋白氨基酸的突变修饰是否影响病毒的复制能力，将第5代重组病毒O/rV-1/3B6和亲本病毒OZK/93-08以5个MOI(Multiplicity of infection，MOI)的病毒感染量接种长满的单层BHK-21细胞(25mL培养瓶)，吸附1h后弃病毒液，用MEM洗2次后，加5mL MEM培养基并置于37℃的CO2培养箱继续培养。接种后4、8、12、20h分别收取样品，反复冻融3次后在BHK-21单层细胞上(96孔板)按照常规方法测定病毒的滴度(TCID50)(实验重复2次)，绘制病毒的一步生长曲线。
结果表明重组病毒O/rV-1/3B6和亲本病毒OZK/93-08具有相似的生长特性，3B蛋白优势表位的完全消除并没有明显影响重组病毒O/rV-1/3B6在BHK-21细胞上的复制能力(见图9)。
4、动物实验
因FMDV OZK/93-08对牛高度致弱，因此选取60日龄健康易感的猪10头(O型口蹄疫液相阻断ELISA抗体和3ABC抗体均为阴性)，分为3组。第1组(4只猪)肌肉注射FMDV OZK/93-082ml(含107TCID50)，第2组(4只猪)肌肉注射FMD重组病毒O/rV-1/3B62ml(含107TCID50)，第3组(2只猪)接种同样剂量的PBS。接种后每天观察所有试验动物出现FMD临床症状的情况。
实验结果表明，重组FMDV和亲本病毒接种猪2d后，所有接种病毒的动物均表现体温升高，食欲减退，精神萎靡。到接种第6d天，所有动物均在蹄部和/或舌面出现水泡性症状，而对照动物在整个实验过程中未出现发烧和水泡性症状。收集发病动物的水泡并对其按照上述方法进行RT-PCR和序列的测定。结果表明发病动物水泡皮内均含与预期接种病毒一样的序列，说明动物出现水泡性症状是由接种的FMDV引起的，而且重组病毒和亲本病毒均对猪有很强的致病性。收集重组病毒和亲本病毒感染猪28天的血清，检测动物接种FMDV后产生的结构蛋白抗体(LPBE)和非结构蛋白(3ABC)抗体。结果表明，接种FMDV的所有动物均产生了很高的结构蛋白抗体和非结构蛋白抗体(见表2)，表明接种的FMDV在动物体内进行了有效的复制。
5、3B优势表位特异性抗体的检测
为了检测标记病毒O/rV-1/3B6和亲本病毒O/ZK/93-08接种动物是否发展针对3B优势表位的抗体，动物接种前和接种28天的血清用3B单抗4B1阻断ELISA检测，操作流程如下：
(1)加待测血清：取试剂盒包被的96孔板，每孔加入80μl血清稀释液，然后依次加入20μl待测血清和阳、弱阳性与阴性对照血清。待测样本加一孔，阴性、弱阳性与阳性对照血清平行加两孔，混匀，封口膜封口，振荡混匀后，在15～25℃孵育16～20小时后加1×洗涤液洗板5次，拍干。
(2)加酶标的3B单抗：用血清稀释液1：100比例稀释100倍浓缩HRP标记3B单抗，每孔加入100μl，15～25℃孵育60分钟后用1×洗涤液洗板5次，拍干。
(3)底物显色：每孔加入100μl TMB底物，置15～25℃避光孵育10～15分钟。
(4)终止：每孔加入100μl终止液使反应终止。
(5)测定OD值：用酶标仪测定450nm波长OD值。
(6)按照式a计算血清样本的抗体阻断率(PI)：
PI＝(1-测试样本OD450nm值/阴性对照平均OD450nm值)×100％式a；
(7)结果判定：PI值大于或等于50％，样品应判定为口蹄疫病毒非结构蛋白3B抗体阳性，PI值小于50％，样品应判定为口蹄疫病毒非结构蛋白3B抗体阴性。
试剂盒检测结果显示，所有接种OZK/93-08病毒的动物均产生了针对3B优势表位的抗体(阻断率大于50％)，而所有接种标记病毒O/rV-1/3B6的动物均不产生针对该表位的抗体(阻断率小于50％)(表2)，表明该重组病毒可以用来发展可区分感染和疫苗免疫动物的FMD标记疫苗，用于我国O型FMD的有效防控。
表2 FMDV接种动物的发病情况和抗体水平
Figure BDA0002657799730000121
注：“+”表示2蹄出现水泡型症状；“++”表示四蹄出现水泡型症状。
3ABC抗体效价≥0.2为3ABC抗体阳性；“Y”表示3B表位抗体阳性，“N”表示3B表位抗体阴性。
6、口蹄疫常规疫苗和标记疫苗的多次免疫
按照口蹄疫常规疫苗的制备方法(见《中华人民共和国兽药典》)大量增殖OZK/93-08和O/rV-1/3B6病毒，病毒用BEI灭活后按常规方法制备水包油FMD灭活疫苗。选45日龄以上的健康易感猪30头，牛30头(猪、牛口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体和3ABC抗体均为阴性)，随机分为分2组，每组含猪、牛各15头。第一组免疫OZK/93-08疫苗，第二组接种标记病毒灭活疫苗，2ml/头。疫苗接种动物每间隔14天重复免疫，连续免疫5次。最后一次免疫后21天，采集免疫动物的血清置-20℃备用。
7、3B优势表位特异性抗体的检测
为了检测标记病毒O/rV-1/3B6和亲本病毒O/ZK/93-08免疫动物是否发展针对3B优势表位的抗体，动物免疫前和多次免疫后21天的血清如上项5的方法进行检测。
结果表明，所有多次免疫OZK/93-08疫苗的动物，1/15的猪和2/15的牛产生了针对3B优势表位的抗体(阻断率均大于50％)，说明常规FMD灭活疫苗免疫动物5次，用3B单抗阻断ELISA方法能够检测到群体动物血清中相应的抗体，这将严重影响以检测病毒非结构蛋白3ABC抗体为金标准的鉴别诊断结果，不利于我国口蹄疫的控制和净化。而本发明构建的FMDV标记病毒O/rV-1/3B6接种动物后均不产生针对3B表位的抗体(阻断率大于50％)，制备的疫苗多次免疫动物也均不产生针对3B表位的抗体(阻断率小于50％)(表3)，表明本发明成功构建的3B非结构蛋白优势表位缺失的FMDV O/rV-1/3B6制备的疫苗免疫动物，能用3B单抗发展的配套诊断方法精准区分自然感染和疫苗免疫的动物。因此，本发明构建的FMDV标记病毒O/rV-1/3B6，可以用于发展具有鉴别诊断的口蹄疫标记疫苗，用于我国口蹄疫的有效预防、控制和净化。
表3动物免疫前和免疫后血清的3B表位抗体检测结果
Figure BDA0002657799730000131
对比例1～4
按照实施例1构建重组质粒的方法进行构建标记毒株，区别在于3B蛋白的优势抗原表位的缺失突变的方案不同，按照表4中4种突变方案构建全长重组质粒。将得到的4种pOFS/3B2～5质粒分别用Bgl II和Not I酶切鉴定和序列测定。酶切结果表明4个重组质粒切出与预期相符的目的条带，见图2。
表4重组质粒的3B核苷酸和氨基酸序列
Figure BDA0002657799730000141
按照实施例1的方法将pOFS/3B2～5质粒进行重组FMDV的拯救。结果表明，转染pOFS/3B2～5质粒的细胞，转染72h后仍生长良好，看不到任何明显的CPE。72h后收获所有转染样品，反复冻融3次后，在BHK-21上连续传4代。结果表明，转染pOFS/3B2～5质粒的细胞连续盲传4代，仍看不到FMDV典型的CPE，
另外对这些转染和盲传未出现任何CPE的全长质粒pOFS/3B2～5进行额外2次重复转染，并对转染的样品继续盲传，结果表明这些质粒转染的细胞在转染72h后仍看不到FMDV典型的CPE，转染的样品盲传4代也未出现FMDV典型的CPE，说明全长重组质粒pOFS/3B2～5所含3B蛋白的修饰突变(见表1和附录序列)不能够拯救活的FMDV。
对比例5
按照实施例1构建重组质粒的方法进行构建标记毒株，区别在于3B蛋白的优势抗原表位的缺失突变的方案不同，按照表5中突变方案构建全长重组质粒。将得到的pOFS/3B1质粒用Bgl II和Not I酶切鉴定和序列测定。酶切结果表明重组质粒切出与预期相符的目的条带，见图2。
表5重组质粒的3B核苷酸和氨基酸序列
Figure BDA0002657799730000142
按照实施例1的方法将pOFS/3B1质粒进行重组FMDV的拯救。转染结果表明，转染pOFS/3B1质粒的细胞在转染后60h都出现典型的CPE，即正常细胞变圆，变大，个别成葡萄串状分布，对照细胞生长良好(见图3)。72h后收获所有转染样品，反复冻融3次后，在BHK-21上连续传4代。结果表明，已经出现CPE的转染上清在传代过程中，细胞出现CPE的时间越来越短，病变更加典型，表明全长重组质粒pOFS/3B1所含3B蛋白的突变修饰并没影响活的FMDV的拯救。拯救的重组FMDV分别命名为O/rV-1/3B1。
按照实施例1的方法将O/rV-1/3B1进行免疫荧光实验。结果表明，接种O/rV-1/3B1和OZK/93-08病毒的BHK-21细胞用不同稀释度的3B单抗作用，均能看到可见的绿色荧光(见图5)。说明本发明拯救的重组病毒O/rV-1/3B1为FMDV，重组FMDV O/rV-1/3B1仍能与3B单抗4B1作用，表明O/rV-1/3B1所表达3B蛋白的突变修饰(表5和序列表)不能消除3B单抗4B1与FMDV的反应能力。
按照实施例1的方法将O/rV-1/3B1进行Westernblot实验。结果表明：OZK/93-08和O/rV-1/3B1病毒感染的BHK-21细胞均能与3B单抗反应，出现特异的3B蛋白条带，
免疫荧光和Westernblot的研究结果表明，重组FMDV O/rV-1/3B1所表达的3B蛋白的突变修饰不能够完全消除其与3B单抗的反应能力，不适合发展FMD标记疫苗候选毒株。
综上，为了发展更优质的FMD标记疫苗候选毒株，本发明以FMDV 3B单抗4B1识别FMDV 3B1，3B2和3B3蛋白的肽段2PYAGP6中氨基酸突变或最少缺失为目的，通过基因合成，设计并构建了6种含3B蛋白优势表位不同氨基酸突变修饰(3B蛋白对应的核苷酸和氨基酸见附录)的FMDV全长克隆，Not I线化后转染BSR/T7细胞，只有全长质粒pOFS/3B1和pOFS/3B6(3B对应的核苷酸和氨基酸序列见附录)转染细胞后能成功拯救到FMDV，其余四个全长质粒(pOFS/3B2～5)(3B对应的核苷酸和氨基酸序列见附录)多次转染和转染上清盲传均不能拯救到FMDV。而拯救的两个重组病毒(O/rV-1/3B1和O/rV-1/3B6)免疫荧光和Westernblot结果表明，只有重组FMDV O/rV-1/3B6所表达3B蛋白的突变修饰完全消除了FMDV与3B单抗4B1的反应能力。蚀斑表型和一步生长曲线表明重组FMDV O/rV-1/3B6具有与亲本病毒相似的生长特性，O/rV-1/3B6所含3B蛋白的突变修饰没有明显影响重组FMDV的生长特性。本发明成功构建的标记病毒O/rV-1/3B6接种动物后均不产生针对3B表位的抗体(阻断率大于50％)，同时本发明成功构建的标记病毒O/rV-1/3B6制备的疫苗多次免疫动物后均检测不到针对3B表位的抗体，因此，本发明成功构建的FMDV O/rV-1/3B6可以用于发展可精准区分感染和疫苗免疫的FMD标记疫苗，用于我国FMD的有效预防、控制和净化。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3B优势表位缺失标记毒株及其制备方法和应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaccctacg ccgggccact cgaacgtcag aaacctctta aagtgaaagc caggttgcca 60
caacaagagg gaccttacgc cggtccgatg gagcggcaga aaccgctgaa agtgaaagca 120
aaagcccccg tcgtgaagga aggaccctac gaggggccgg tgaaaaagcc tgtcgctttg 180
aaagtgagag caaagaactt gatcgtcact gag 213
<210> 2
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys
1 5 10 15
Ala Arg Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr Ala Gly Pro Met Glu Arg
20 25 30
Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Val Val Lys Glu Gly
35 40 45
Pro Tyr Glu Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Arg Ala
50 55 60
Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu
65 70
<210> 3
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaccctaca ccgccgcact cgaacgtcag aaacctctta aagtgaaagc caggttgcca 60
caacaagagg gaccttacac cgctgcgatg gagcggcaga aaccgctgaa agtgaaagca 120
aaagcccccg tcgtgaagga aggaccctac gaggcggcgg tgaaaaagcc tgtcgctttg 180
aaagtgagag caaagaactt gatcgtcact gag 213
<210> 4
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Gly Pro Tyr Thr Ala Ala Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys
1 5 10 15
Ala Arg Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Tyr Thr Ala Ala Met Glu Arg
20 25 30
Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Val Val Lys Glu Gly
35 40 45
Pro Tyr Glu Ala Ala Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Arg Ala
50 55 60
Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu
65 70
<210> 5
<211> 213
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggagcctaca ccgggctcct cgaacgtcag aaacctctta aagtgaaagc caggttgcca 60
caacaagagg gagcctacac tggtctgatg gagcggcaga aaccgctgaa agtgaaagca 120
aaagcccccg tcgtgaagga aggaccctac gaggcggcgg tgaaaaagcc tgtcgctttg 180
aaagtgagag caaagaactt gatcgtcact gag 213
<210> 6
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Gly Ala Tyr Thr Gly Leu Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys
1 5 10 15
Ala Arg Leu Pro Gln Gln Glu Gly Ala Tyr Thr Gly Leu Met Glu Arg
20 25 30
Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Val Val Lys Glu Gly
35 40 45
Pro Tyr Glu Ala Ala Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Arg Ala
50 55 60
Lys Asn Leu Ile Val Thr Glu
65 70
<210> 7
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggacccgccg ggccactcga acgtcagaaa cctcttaaag tgaaagccag gttgccacaa 60
caagagggac ctgccggtcc gatggagcgg cagaaaccgc tgaaagtgaa agcaaaagcc 120
cccgtcgtga aggaaggacc cgaggggccg gtgaaaaagc ctgtcgcttt gaaagtgaga 180
gcaaagaact tgatcgtcac tgag 204
<210> 8
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Gly Pro Ala Gly Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala
1 5 10 15
Arg Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Ala Gly Pro Met Glu Arg Gln Lys
20 25 30
Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Val Val Lys Glu Gly Pro Glu
35 40 45
Gly Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Arg Ala Lys Asn Leu
50 55 60
Ile Val Thr Glu
65
<210> 9
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggacccgccg cgccactcga acgtcagaaa cctcttaaag tgaaagccag gttgccacaa 60
caagagggac ctgccgctcc gatggagcgg cagaaaccgc tgaaagtgaa agcaaaagcc 120
cccgtcgtga aggaaggacc cgaggcggcg gtgaaaaagc ctgtcgcttt gaaagtgaga 180
gcaaagaact tgatcgtcac tgag 204
<210> 10
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Gly Pro Ala Ala Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala
1 5 10 15
Arg Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Ala Ala Pro Met Glu Arg Gln Lys
20 25 30
Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Val Val Lys Glu Gly Pro Glu
35 40 45
Ala Ala Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Arg Ala Lys Asn Leu
50 55 60
Ile Val Thr Glu
65
<210> 11
<211> 204
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggacccgccg cgccactcga acgtcagaaa cctcttaaag tgaaagccag gttgccacaa 60
caagagggac ctgccgctcc gatggagcgg cagaaaccgc tgaaagtgaa agcaaaagcc 120
cccgtcgtga aggaaggacc cgccgcgccg gtgaaaaagc ctgtcgcttt gaaagtgaga 180
gcaaagaact tgatcgtcac tgag 204
<210> 12
<211> 68
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gly Pro Ala Ala Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala
1 5 10 15
Arg Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Ala Ala Pro Met Glu Arg Gln Lys
20 25 30
Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Val Val Lys Glu Gly Pro Ala
35 40 45
Ala Pro Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Arg Ala Lys Asn Leu
50 55 60
Ile Val Thr Glu
65
<210> 13
<211> 207
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ggacccgccg cgccactcga acgtcagaaa cctcttaaag tgaaagccag gttgccacaa 60
caagagggac ctgccgctcc gatggagcgg cagaaaccgc tgaaagtgaa agcaaaagcc 120
cccgtcgtga aggaaggacc ctacgaggcg gcggtgaaaa agcctgtcgc tttgaaagtg 180
agagcaaaga acttgatcgt cactgag 207
<210> 14
<211> 69
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Gly Pro Ala Ala Pro Leu Glu Arg Gln Lys Pro Leu Lys Val Lys Ala
1 5 10 15
Arg Leu Pro Gln Gln Glu Gly Pro Ala Ala Pro Met Glu Arg Gln Lys
20 25 30
Pro Leu Lys Val Lys Ala Lys Ala Pro Val Val Lys Glu Gly Pro Tyr
35 40 45
Glu Ala Ala Val Lys Lys Pro Val Ala Leu Lys Val Arg Ala Lys Asn
50 55 60
Leu Ile Val Thr Glu
65

Claims (8)

1.一种口蹄疫病毒非结构蛋白3B优势表位缺失标记毒株，其特征在于，在非结构蛋白3B基础上发生优势表位完全缺失得到的口蹄疫病毒；
所述非结构蛋白3B基础上发生优势表位完全缺失为3B1中由GPYAGP突变为GPAAP、3B2中由GPYAGP突变为GPAAP和3B3中GPYEGP突变为GPYEAA；
优势表位缺失后的非结构蛋白3B的氨基酸序列如SEQ ID No.14所示。
2.根据权利要求1所述标记毒株，其特征在于，优势表位缺失后的非结构蛋白3B的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。
3.根据权利要求1或2所述标记毒株，其特征在于，所述标记毒株能够在BHK-21细胞上引起致细胞病变效应；
所述标记毒株不能与3B单抗4B1发生反应；
所述标记毒株传至20代后3B蛋白的突变修饰稳定存在；
所述标记毒株复制和生长能力与未标记的亲本病毒一致。
4.权利要求1~3任意一项所述标记毒株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）将含权利要求1~3任意一项所述标记毒株中优势表位缺失非结构蛋白3B的Z4片段插入pUC18载体中，得到的重组质粒用Bgl II和Not I内切酶消化，得到含突变的非结构蛋白3B的Z4片段；
Z4片段的序列如下：
GGAACTCCACGAAAAGGTGTCGAGTCACCCGATTTTTAAACAGATCTCAATCCCTTCCCAAAAGTCTGTGCTGTACTTTCTCATTGAGAAAGGGCAGCACGAAGCAGCAATCGAGTTCTTTGAGGGGATGGTTCACGATTCTATCAAGGAGGAGCTCCGACCCCTCATTCAACAGACCTCATTTGTGAAGCGCGCCTTCAAGCGCCTGAAGGAGAATTTTGAGATTGTAGCCCTGTGTTTAACCCTCTTGGCAAACATAGTGATCATGCTACGCGAAGCGCGCAAGAGGCGCCAGTCAGTGGATGACTCACTGGATGACGACGCGGCTCTTGACGATGCGGAAAAGAACCCTCTAGAGGCGAGTGGCGCCAGCGCCGTTGGTTTCAGAGAGAGATCCCCCACCGAGCAAAAGACGTGCGACGACGTGAACACTGAGCCCGTTGTGCCCGGGAGGGAACAACCGCGAGCTGAAGGACCCTACGCCGGGCCACTCGAACGTCAGAAACCTCTTAAAGTGAAAGCCAGGTTGCCACAACAAGAGGGACCTTACGCCGGTCCGATGGAGCGGCAGAAACCGCTGAAAGTGAAAGCAAAAGCCCCCGTCGTGAAGGAAGGACCCTACGAGGGGCCGGTGAAAAAGCCTGTCGCTTTGAAAGTGAGAGCAAAGAACTTGATCGTCACTGAGAGTGGAGCACCACCGACCGACTTGCAAAAGATGGTCATGGGCAACACTAAACCCGTCGAGCTCATCCTCGATGGCAAGACGGTGGCTATCTGCTGTGCTACTGGAGTGTTTGGCACTGCCTACCTCGTGCCTCGTCATCTCTTCGCAGAGAGGTATGACAAGATCATGTTGGACGGCAGAGCCTTGACAGACAGTGACTACAGAGTGTTTGAGTTTGAGATTAAAGTAAAAGGACAGGACATGCTCTCAGACGCTGCTCTCATGGTGTTACACCGTGGGAACCGCGTGCGAGATATCACGAAGCATTTTCGCGATGTAGCGAGAATGAAGAAGGGAACCCCCGTCGTCGGCGTGATCAACAACGCTGATGTCGGGAGACTCATATTCTCTGGTGAAGCCCTCACTTACAAGGACATTGTCGTGTGCATGGACGGAGACACCATGCCTGGGCTCTTTGCCTACAGAGCTTCCACCAAGGCGGGCTACTGTGGAGGAGCCGTCCTGGCAAAAGACGGGGCCGAGACGTTCATCGTCGGCACCCACTCTGCAGGTGGCAACGGTGTGGGATATTGTTCATGCGTTTCCCGCTCAATGCTTCTGAAAATGAAGGCACACATCGATCCCGAACCACACCACGAGGGGTTGATTGTCGACACCAGAGACGTGGAAGAGCGCGTGCACGTGATGCGCAAAACCAAGCTCGCGCCCACCGTAGCGCACGGTGTGTTCAACCCCGAATTCGGGCCTGCCGCTCTGTCCAACAAGGACCCACGCCTGAATGAGGGGGTTGTCCTCGACGATGTCATTTTCTCCAAACACAAAGGAGACACAAAGATGTCTGAAGAGGACAAAGTGCTGTTCCGGCGCTGTGCTGCTGACTACGCGTCACGCTTACACAGCGTGTTGGGGACGGCAAATGCCCCACTGAGCATTTACGAGGCTATCAAAGGCGTCGACGGACTCGACGCCATGGAACCGGATACCGCGCCCGGTCTCCCCTGGGCTCTCCAGGGGAAACGCCGCGGTGCCCTGATCGACTTTGAAAACGGCACCGTCGGGCCCGAGGTCGAGGCAGCCCTCAAGCTCATGGAGAGACGTGAGTACAAGTTCGTCTGCCAGACCTTCCTGAAGGACGAGATTCGCCCGCTGGAGAAGGTGCGCGCTGGCAAGACACGCATTGTCGACGTCCTGCCTGTTGAACACATCCTCTACACCAGGATGATGATTGGTAGATTCTGCGCCCAAATGCACTCAAACAACGGACCGCAAATTGGCTCGGCGGTCGGTTGCAACCCTGACGTTGATTGGCAAAGATTTGGCACACATTTCGCCCAGTACAAAAACGTGTGGGATGTGGACTATTCGGCCTTTGATGCTAACCACTGCAGTGATGCGATGAACATCATGTTCGAGGAGGTGTTCCGCACGGAGTTTGGCTTCCACCCGAACGCCGAGTGGATTCTGAAGACTCTAGTGAACACGGAGCACGCCTATGAGAACAAGCGTATCACCGTCGAGGGTGGAATGCCATCTGGTTGTTCCGCAACAAGCATTATCAACACAATTTTGAACAACATCTACGTGCTCTACGCCCTGCGCAGACACTATGAGGGAGTCGAGCTGGACACTTACACCATGATCTCCTACGGAGACGACATCGTGGTGGCGAGTGATTACGACCTGGACTTTGAGGCCCTTAAGCCTCACTTCAAGTCCCTTGGTCAAACCATTACTCCAGCCGACAAAAGCGACAAAGGTTTTGTTCTTGGTCACTCCATTACCGATGTCACTTTCCTCAAAAGACACTTCCACATGGATTACGGAACTGGGTTTTACAAACCTGTGATGGCCTCGAAGACCCTCGAGGCCATCCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGATCTCCGTGGCAGGACTCGCCGTCCATTCTGGACCCGACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCCCTTCCAAGGCCTCTTTGAGATTCCAAGCTACAGATCACTTTACCTGCGTTGGGTGAACGCCGTGTGCGGTGACGCATAATCCCTCAGATGTCACTACTGGCAAAAAGACCCTGAGGCGCGCGACGCCGTAGGAGTGAAAAACCGCAAAGGTTTTTCCCACTTCCTATTTCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA；
2）将所述含突变的非结构蛋白3B的Z4片段插入口蹄疫疫苗株全长感染性克隆中，得到全长重组质粒；
3）将所述全长重组质粒线性化后转染细胞，得到的拯救病毒为口蹄疫病毒非结构蛋白3B优势表位缺失标记毒株。
5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，当所述口蹄疫病毒为O型口蹄疫病毒时，人工合成含3B蛋白优势表位缺失的OZK/93-08病毒Z4片段，并克隆到pUC18载体中，得到重组质粒pUC-Z43B6；
所述口蹄疫疫苗株全长感染性克隆为OZK/93-08疫苗株全长感染性克隆pOZKF-Z1234；
所述全长重组质粒记为pOFS/3B6。
6.权利要求1~3任意一项所述标记毒株或权利要求4或5所述构建方法得到的标记毒株在制备区分感染和疫苗免疫的口蹄疫标记疫苗中的应用。
7.权利要求1~3任意一项所述标记毒株或权利要求4或5所述构建方法得到的标记毒株在制备区分感染和疫苗免疫的口蹄疫标记病毒生物制品中的应用。
8.一种用于区分感染和疫苗免疫的口蹄疫标记疫苗，其特征在于，由权利要求1~3任意一项所述标记毒株制备得到。
CN202010893827.5A 2020-08-31 2020-08-31 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3b优势表位缺失标记毒株及其制备方法和应用 Active CN112029735B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010893827.5A CN112029735B (zh) 2020-08-31 2020-08-31 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3b优势表位缺失标记毒株及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010893827.5A CN112029735B (zh) 2020-08-31 2020-08-31 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3b优势表位缺失标记毒株及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112029735A CN112029735A (zh) 2020-12-04
CN112029735B true CN112029735B (zh) 2022-04-12

Family

ID=73586362

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010893827.5A Active CN112029735B (zh) 2020-08-31 2020-08-31 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3b优势表位缺失标记毒株及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112029735B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114315984B (zh) * 2021-12-29 2023-02-03 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种用于制备prrsv基因ii型表位缺失疫苗毒株的n蛋白表位突变标记及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6951717B1 (en) * 1993-06-07 2005-10-04 Trimeris, Inc. Methods and compositions for inhibition of membrane fusion-associated events, including HIV transmission
CN104805061A (zh) * 2014-01-24 2015-07-29 中国科学院上海巴斯德研究所 一种能感染中国仓鼠卵巢细胞病毒适应株及其应用
CN107201346A (zh) * 2017-03-22 2017-09-26 中国农业科学院兰州兽医研究所 3b蛋白优势表位缺失的口蹄疫标记疫苗株及其构建方法和应用
CN109293747A (zh) * 2018-09-26 2019-02-01 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 口蹄疫病毒非结构蛋白3b抗原表位肽及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8765141B2 (en) * 2010-07-01 2014-07-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary Of Agriculture Development of a marker foot and mouth disease virus vaccine candidate that is attenuated in the natural host
CN104826098B (zh) * 2015-05-14 2017-08-29 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种a型口蹄疫标记疫苗及其构建方法
CN109536461B (zh) * 2018-11-23 2020-07-03 中国农业科学院兰州兽医研究所 一种o型口蹄疫病毒突变株及其制备方法和应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6951717B1 (en) * 1993-06-07 2005-10-04 Trimeris, Inc. Methods and compositions for inhibition of membrane fusion-associated events, including HIV transmission
CN104805061A (zh) * 2014-01-24 2015-07-29 中国科学院上海巴斯德研究所 一种能感染中国仓鼠卵巢细胞病毒适应株及其应用
CN107201346A (zh) * 2017-03-22 2017-09-26 中国农业科学院兰州兽医研究所 3b蛋白优势表位缺失的口蹄疫标记疫苗株及其构建方法和应用
CN109293747A (zh) * 2018-09-26 2019-02-01 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） 口蹄疫病毒非结构蛋白3b抗原表位肽及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A Safe Foot-and-Mouth Disease Vaccine Platform with Two Negative Markers for Differentiating Infected from Vaccinated Animals;Sabena Uddowla et al.;《Journal of Virology》;20120822;第86卷(第21期);第11675-11685页 *
An ELISA based on the repeated foot-and-mouth disease virus 3B epitope peptide can distinguish infected and vaccinated cattle;Mingchun Gao et al.;《Appl Microbiol Biotechnol》;20111230;第93卷;第1271-1279页 *
口蹄疫病毒非结构蛋白3B优势表位关键位点鉴定与缺失标记病毒构建;寻广谨;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士) 农业科技辑》;20180515(第05期);第D050-190页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN112029735A (zh) 2020-12-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR0179994B1 (ko) 칠면조의 재조합 포진바이러스 및 이로부터 유도된 생존상태의 벡터 백신
KR100204438B1 (ko) 치킨 아네미아 바이러스 백신 및 진단방법
CN110545841A (zh) 猪冠状病毒疫苗
CN107201346B (zh) 3b蛋白优势表位缺失的口蹄疫标记疫苗株及其构建方法和应用
WO2022007742A1 (zh) 一种重组的伪狂犬病病毒及其疫苗组合物
CN113061587B (zh) 一种抗原谱拓展o型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用
CN112011521A (zh) 一种重组新城疫病毒载体新型冠状病毒疫苗候选株及其构建方法和应用
CN114854698B (zh) 一种复制滴度提高的o型口蹄疫病毒株及其构建方法和应用
CN113308441B (zh) 一株猫疱疹病毒i型病毒株及其应用
CN113943714A (zh) 一种猫杯状病毒毒株及其应用
US5283191A (en) Mareks&#39; disease virus vaccine
CN103555680A (zh) 一种具有免疫原性的prrsv病毒样颗粒及其制备与应用
CN112029735B (zh) 一种口蹄疫病毒非结构蛋白3b优势表位缺失标记毒株及其制备方法和应用
CN113913461A (zh) 牛病毒性腹泻e0-e2基因重组腺病毒疫苗构建方法
CN111454989B (zh) 一种嵌合型基因i型乙型脑炎病毒病毒样颗粒疫苗及其制备方法和应用
CN111073861B (zh) 人呼吸道合胞病毒毒株、应用、抗体或杂交瘤细胞或抗血清
JP3375347B2 (ja) マレック病に対する組換えワクチン
CN113347992A (zh) 重组病毒和其用途
CN114315984B (zh) 一种用于制备prrsv基因ii型表位缺失疫苗毒株的n蛋白表位突变标记及其应用
CN113337476B (zh) 一种口蹄疫O型PanAsia-2谱系储备疫苗毒株及其构建方法和应用
CN111647610B (zh) 一种互换ha和ns1缺失基因包装信号的h9n2亚型禽流感病毒及其构建方法和应用
EP0704529A2 (en) Vaccine against rabbit hemorrhagic disease virus
CN1283788C (zh) 表达猪繁殖与呼吸综合征病毒的重组伪狂犬病毒及应用
US5690939A (en) Recombinant vaccine against marek&#39;s disease
CN115896043B (zh) 一种o型口蹄疫疫苗候选株及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant