CN104826098B - 一种a型口蹄疫标记疫苗及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种A型口蹄疫标记疫苗及其构建方法，所公开的标记疫苗的种毒为具有SEQ ID NO：3基因片段的A/rV‑2病毒，该基因片段编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO：4，其缺失口蹄疫病毒3A蛋白的104‑115位氨基酸。本发明构建的口蹄疫标记病毒感染的动物在血清学上能够明显地与野生型病毒感染的动物相区分；本发明的口蹄疫分子标记疫苗免疫猪具有良好的免疫原性。因此，用本发明方法构建的A型口蹄疫病毒可以用来发展鉴别诊断(DIVA)的疫苗，用于我国当前A型FMD的防控。

Description

一种A型口蹄疫标记疫苗及其构建方法

技术领域

本发明涉及一种A型口蹄疫标记疫苗及其构建方法，属于动物医学与免疫生物学领域。

背景技术

口蹄疫(FMD)是猪、牛和羊等偶蹄动物感染的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病传染性极强，其爆发和流行会给畜牧业以及相关行业带来巨大损失，被世界动物卫生组织(FAO/OIE)列为必报疫病之首，我国规定为一类动物传染病。

FMD的病原为口蹄疫病毒(FMDV)，具有7个不同的血清型(A、O、C、AsiaI、SAT I、SATII和SAT III)和许多的亚型，型间不交叉保护。我国是FMD的重灾国，O型FMD流行已久，且危害最为严重。但近几年来，A型FMD在我国呈现出流行爆发，给我国养殖业造成了巨大的经济损失。传统上，针对O型FMD标记疫苗的研究已经取得了较为显著的进展，但是针对具有鉴别诊断的A型FMD标记疫苗的研究在国内尚未报到。

我国对FMD的防控主要采取以疫苗免疫为主，结合限制动物移动、扑杀染毒病畜及同群畜、封锁、隔离、消毒等一系列综合防控措施。因此，疫苗的免疫保护和精确区分疫苗免疫动物与自然感染动物是FMD防控的两个关键环节。虽然，目前我国上市的A型FMDV灭活疫苗在FMD防控中发挥了重要作用，但面对流行毒的变异和新谱系毒株的传入，需要筛选与当前流行毒株相匹配的疫苗候选株。另外，传统FMD灭活疫苗免疫的动物在血清学上无法与自然感染的动物相区分，而以检测非结构蛋白抗体为金标准的鉴别诊断方法会因疫苗的不完全纯化和动物的多次免疫而影响检测结果，干扰疫病的血清学监控和流行病学调查，阻碍着FMD的控制和根除。因此本领域存在对能与当前流行毒株相匹配，又能够区分自然感染和疫苗免疫的A型口蹄疫标记疫苗的迫切需要。

申请人早期在针对O型FMD疫苗研究时曾研发了一种针对O型口蹄疫的标记疫苗(Marker vaccine或叫DIVA疫苗)，并申请了专利CN102614507A，但口蹄疫病毒型间不交叉保护，因此，此种疫苗不能用于A型口蹄疫的防控。到目前为止，人们已经研发了许多的标记疫苗，包括DNA疫苗，亚单位疫苗，肽疫苗以及利用反向遗传操作技术发展的各种基因修饰的疫苗。但是从疾病流行病学的监控和疫病净化的需求考虑，鉴别诊断的疫苗应该通过缺失病毒免疫优势的表位或某些病毒蛋白来设计。针对这种需求，Fowler VL等通过缺失FMDV结构蛋白G-H环来发展标记疫苗，实际应用表明尽管这个标记疫苗能够完全保护牛对强病毒的攻击并能达到鉴别诊断的目的，但FMDV的G-H环和是主要的中和抗原位点，该区域的缺失，导致疫苗的免疫原性降低，影响免疫效果。Uddowla S等发展了FMDV 3B蛋白缺失和或3D蛋白修饰的A型致弱标记疫苗，实际应用显示此类标记苗能够满足免疫保护和鉴别诊断的需要，但疫苗过度致弱不能诱导良好的保护性的免疫反应。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明公开了一种与当前流行毒株相匹配、免疫原性好、能区分野毒感染和疫苗免疫动物的A型口蹄疫标记疫苗及其构建方法。

具体的说，本发明是通过如下技术方案实现的：

一种A型口蹄疫标记疫苗，所采用的种毒为具有SEQ ID NO：3基因片段的A/rV-2病毒，该基因片段编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO：4，其缺失口蹄疫病毒3A蛋白的104-115位氨基酸。

申请人进行的实验研究表明，上述疫苗对猪等动物的保护效力达到11.84PD50/头份，明显优于OIE推荐的6 PD50的标准，显示了良好的免疫原性。另外，标记病毒感染的动物可以用针对3A AEKNPLE表位的单抗阻断ELISA明显地与野生型病毒感染的动物相区分，可用作发展DIVA疫苗用于我国A型FMD的预防。

本领域技术人员可以理解，作为完整口蹄疫病毒灭活疫苗，需要将种毒进行培养和灭活，然后与佐剂等进行混合制成可直接使用的疫苗，疫苗的生产过程是本领域技术人员所熟知的，此处不予赘述。

相应的，本发明公开了上述标记疫苗的构建方法，包括如下步骤：1)构建A型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒；

2)以步骤1)为基础，构建缺失3A蛋白104-115编码区的A型口蹄疫病毒基因组全长cDNA的重组质粒；

3)以步骤2)为基础，拯救缺失口蹄疫病毒3A蛋白104-115编码区的A型口蹄疫病毒，作为A型口蹄疫标记疫苗的种毒。

步骤1)所得重组质粒，进行测序验证，表明构建的重组质粒含A型口蹄疫病毒全长核苷酸序列，如SEQ ID NO：1所示；该序列第5387-5845核苷酸编码的氨基酸为口蹄疫病毒3A蛋白(如SEQ ID NO：2所示)。

步骤2)所得重组质粒，进行测序验证，表明构建的重组质粒含A型口蹄疫病毒3A104-115位氨基酸(104-115位氨基酸，SEQ ID NO：1中5696-5731核苷酸编码该氨基酸)缺失的全长cDNA克隆。重组质粒中3A蛋白的核苷酸和编码的氨基酸分别SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示。

在步骤1)中，采用四组扩增引物分别扩增A型口蹄疫全基因组序列，四组引物分别为A1组引物SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6；A2组引物SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8；A3组引物SEQID NO：9、SEQ ID NO：10；A4组引物SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12。

步骤1)构建重组质粒的步骤为A1、A2组引物扩增片段进行融合PCR，融合后的片段与pSK载体分别经SphI/XbaI双酶切后连接转化得重组质粒pSK-A12，所得重组质粒与引物A3扩增的片段分别用XbaI/BglII双酶切后连接转化得重组质粒pSK-A123；A4引物扩增的片段与pSK载体分别用BglII/NotI双酶切后连接转化得重组质粒pSK-A4；pSK-A123与pSK-A4分别用BglII/NotI双酶切后连接转化得含A型口蹄疫病毒基因组的全长cDNA序列的重组质粒pQAGD。

步骤2)扩增所用引物为AGD1组引物：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14；AGD2组引物：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16。

步骤2)的操作过程为以pSK-A4为模板，分别用AGD1组引物和AGD2组引物扩增，所得扩增片段以SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：16引物进行融合PCR；融合的扩增片段以用BglII/Hind III酶消化，pSK-A4用Hind III/Not I酶消化，pSK-A1234用Not I/Bgl II消化，三片段连接得到含3A蛋白104-115位氨基酸缺失的A型口蹄疫病毒基因组全长重组质粒pQAGD/3A104-115。

如上所述，由于本发明的种毒构建的A型口蹄疫标记疫苗具有所述的技术进步，因此本发明还公开了上述所得A型口蹄疫标记疫苗在动物免疫A型口蹄疫传染病中的应用。

本发明采用基因技术构建了含当前流行的A型口蹄疫病毒的全长感染性克隆，然后以此为框架构建了含口蹄疫非结构蛋白3A免疫优势表位缺失的标记病毒。该标记病毒在细胞上连续传代，非结构蛋白引入的缺失稳定存在；标记病毒感染的动物用针对3AAEKNPLE表位的单抗阻断ELISA能明显地与野生型病毒感染的动物相区分；另外本发明的口蹄疫分子标记疫苗免疫猪具有良好的免疫原性。因此用本发明方法构建的A型口蹄疫病毒可以用来发展鉴别诊断(DIVA)的疫苗，用于我国当前A型FMD的防控。

附图说明

图1为FMDV A/GDMM/CHA/2013株全基因组PCR产物(1.DL12000 DNA marker；2.A1PCR片段；3.A2PCR片段；4.A1和A2 PCR融合片段；5.A3 PCR片段；6.A4 PCR片段)。

图2为FMDV A/GDMM/CHA/2013株全长cDNA分子克隆的构建策略。

图3为重组质粒的酶切鉴定图(1，3，5，7.DL12000 DNA marker；2.pSK-A12质粒SpeI和Xba I酶切；4.pSK-A123质粒Kpn I酶切；6.pSK-A4质粒Bgl II和Pst I酶切；8.pSK-A1234质粒Sph I和Ecro I酶切)。

图4为重组质粒pQAGD/3A_104-115转染BSR/T7细胞60h后引起的CPE(左：正常BSR/T7细胞，右：出现CPE的BSR/T7细胞)

图5为标记病毒A/rV-2和A/GDMM/CHA/2013病毒3A蛋白氨基酸的比对图。

图6为间接免疫荧光检测重组病毒。

图7为A/rV-2和A/GDMM/CHA/2013病毒感染牛3A单抗阻断ELISA检测结果(免疫前(day 0和免疫后28天(day 28)的阻断率取四个动物的平均值)。

图8为A/rV-2和A/GDMM/CHA/2013病毒感染猪3A单抗阻断ELISA检测结果(免疫前(day 0和免疫后28天(day 28)的阻断率取三个动物的平均值)。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步加以说明，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

本发明的实施过程，是按照如下步骤实现的：

一、基因组全长cDNA克隆的构建

根据已经公布的A型FMDV全基因组序列，将A/GDMM/CHA/2013株(GenBank：KF450794.1)基因组分为4个重叠的片段(此处所称的重叠是指上一基因片段的末端与下一基因片段的开头部分具有数十个到几百个左右的核苷酸重叠，具体的重叠区域的选择无特殊限制)，设计合成4对寡核苷酸引物，引物的序列依次为A1(+)：SEQ ID NO：5、A1(-)：SEQID NO：6；A2(+)：SEQ ID NO：7、A2(+)：SEQ ID NO：8；A3(+)：SEQ ID NO：9、A3(-)：SEQ IDNO：10；A4(+)：SEQ ID NO：11、A4(-)：SEQ ID NO：12。

用RNeasy mini Kit(Qiagen)提取口蹄疫病毒株的总RNA，分别用A2(-)，A3(-)和A4(-)引物，反转录合成第一链cDNA，反转录反应体系见表1。

表1：反转录反应体系

试剂	剂量(μL)
		5×RT Buffer	4
dNTP(10mmol/μL)	2
		下游引物	1
RNasin inhibitor(20U/μL)	0.5
		AMV Reverse Transcriptase(10U/μL)	2
RNA	10.5
		总体系	20

反应条件：离心混匀后，42℃水浴1h，置-20℃冰箱中备用。

以反转录的第一链cDNA为模板，用引物A1(+)/A1(-)、A2(+)/A2(-)、A3(+)/A3和A4(+)/A4(-)扩增4个相互重叠的cDNA片段，扩增片段分别命名为A1、A2、A3和A4(见图1)，扩增体系见表2。

表2：PCR反应体系

扩增程序为：94℃预变性1min后，98℃ 20min，68℃ 1min/1kb，30个循环后，72℃8min。

纯化回收A1和A2片段，并以回收的这两个片段为模板，用引物A1(+)/A2(-)进行融合PCR，得A12片段。A12与pSK载体(全称pBluescriptSKhdv载体，公开于《华北农学报》2010年第25卷第3期，曹伟军，李平花，白兴文等，口蹄疫病毒O/HN/93疫苗株的拯救及病毒活性鉴定，申请人承诺公众在本发明申请日20年内均可从中国农业科学院兰州兽医研究所获得该载体)分别用SphI/XbaI双酶切消化后，纯化回收相应的目的片段，连接、转化和筛选阳性克隆，得到重组质粒pSK-A12。重组质粒pSK-A12和A3片段分别用XbaI/BglII双酶切消化后，纯化回收相应的目的片段，连接、转化和筛选阳性克隆，得到重组质粒pSK-A123。A4片段和pSK载体分别用BglII/NotI双酶切消化后，纯化回收相应的目的片段，连接、转化和筛选阳性克隆，得到重组质粒pSK-A4。最后用BglII/NotI分别消化重组质粒pSK-A123和pSK-A4，纯化回收相应的目的片段，连接、转化和筛选阳性克隆，得到含FMDV的全长cDNA克隆pQAGD，整个构建过程如图2所示，所有重组质粒进行酶切鉴定，都得到与预期相符的目的条带(见图3)。

将酶切鉴定正确的全长质粒pQAGD进行测序验证，结果显示，在载体的SphI/NotI位点间插入了SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，即A/GDMM/CHA/2013株FMDV全基因组序列。3A蛋白的编码基因序列位于第5387-5845核苷酸，编码的氨基酸如SEQ ID NO：2所示。

二、缺失3A蛋白104-115氨基酸编码区的A型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒的构建

口蹄疫病毒3A非结构蛋白的109-115位氨基酸(AEKNPLE)为免疫优势的B细胞表位，选择包含该区段的基因组104-115作为缺失的靶点。所用的引物包括A/GD5321(+)：SEQID NO：13、A/GD_104-115(-)：SEQ ID NO：14；A/GD_104-115(+)：SEQ ID NO：15、A/GD6767(-)：SEQID NO：16。

以pSK-A4为模板，分别用A/GD5321(+)/A/GD_104-115(-)和A/GD_104-115(+)/A/GD6767(-)引物对，PCR分别扩增得到C片段(C片段核苷酸序列为SEQ ID NO：1中第5321-5751)和D(D片段序列为SEQ ID NO：1中第5751-6786核苷酸)片段。纯化的C片段和D片段等量混合做为模板，以A/GD5321(+)/A/GD6767(-)为引物PCR扩增得CD片段(CD片段的序列为SEQ IDNO：1中第5321-6786位核苷酸)，然后将pSK-A4用Hind III/Not I酶消化，CD片段用Bgl II/Hind III酶消化后，pSK-A1234用Not I/Bgl II消化后，分别纯化回收相应的片段，三片段连接得到重组质粒pQAGD/3A_104-115。将该质粒进行测序验证，结果表明得到了3A 104-115位氨基酸(104-115位氨基酸为SEQ ID NO：1中5696-5731核苷酸编码104-115位氨基酸)缺失的FMDV A/GDMM/CHA/2013株全长cDNA克隆。重组质粒pQAGD/3A_104-115中3A蛋白的核苷酸和编码的氨基酸分别见SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

三、拯救3A 104-115位氨基酸缺失的重组病毒

在该步骤中，BHK-21细胞购自中国兽医监察所，产品目录号为BHK21F5620071213.BSR/T7细胞从德国购买，该细胞在文献“Generation of bovinerespiratorysyncytial virus(BRSV)from cDNA：BRSV NS2 is not essential for virusreplication in tissue culture，and the human RSV leader region acts as afunctional BRSV genome promoter”，Journal of Virology，1999，73(1)：251-259中公开。

用QIAGEN Plasmid Midi Kits制备质粒pQAGD/3A_104-115，Not I线化回收后用Lipofectamine^TM2000介导转染生长至长满70％～80％的BSR/T7细胞；转染后5h加入1mLGMEM完全培养基，置37℃ CO₂培养箱继续培养；转染60h后细胞出现明显的细胞病变(cytopathogenic effct，CPE)(见图4)；72h后收获细胞，反复冻融三次后在BHK-21上连续传代，拯救的基因工程病毒命名为A/rV-2。

四、重组病毒A/rV-2的鉴定

1、RT-PCR鉴定重组病毒基因

取转染的细胞上清，用RNAasy Mini Kit提取细胞毒总RNA，RT-PCR方法扩增含有3A基因的特定片段，纯化回收后送上海桑尼有限公司测序，测定的3A基因所编码的氨基酸与A/GDMM/CHA/2013相对应的氨基酸比对，用于扩增含3A基因的特定片段的RT-PCR引物为A/GD5321(+)、A/GD6767(-)。

结果显示：上述所构建的A/rV-2基因组序列正确，含3A 104-115位氨基酸的缺失(见图5)。

2、间接免疫荧光鉴定病毒蛋白

BHK-21单层细胞(分与六孔培养板)生长至70％时接种转染的上清，8h后吸弃培养液，用PBS缓冲液漂洗3次，吸完残液；3.7％多聚甲醛室温固定30min，PBS缓冲液洗涤3次；加0.5％ Triton X-100室温作用10min，PBS缓冲液洗涤3次，吸干残液；滴加FMDV 3A单抗3A24或3B单抗3B4B1，37℃孵育1h，PBS漂洗3次后；加FITC标记的山羊抗小鼠IgG抗体(Sigma)，37℃孵育1h，PBS漂洗3次后；用甘油封片于Olympus荧光显微镜下观察并拍照。

结果表明，接种转染上清的BHK细胞用3A单抗作用看不到可见的绿色荧光，而用3B单抗作用则看到明显的可见荧光，对照细胞3A和3B单抗作用均看不到可见荧光，说明实施例1拯救的重组病毒为正确的构建(见图6)。3A单抗3A24在文献《口蹄疫病毒非结构蛋白3A单克隆抗体的制备和鉴定》，中国兽医科学2010，40(04)：331-336中公开过，3B单抗3B4B1在文献《口蹄疫病毒非结构蛋白3B单克隆抗体的制备与鉴定》，江苏农业学报，2009，25(2)：296-300中公开过，公众可从中国农业科学院兰州兽医研究所获得。

3、拯救病毒的遗传稳定性分析

将A/rV-2病毒按10％接种量接种BHK-21细胞，连续传代，观察出现典型细胞病变的时间，并对5、15、20代病毒进行RT-PCR检测拯救病毒3A蛋白氨基酸的变化。检测所用引物为：A/GD5321(+)、A/GD6767(-)。

结果表明，拯救病毒A/rV-2用小方瓶连续传至第6代后，出现的CPE的时间趋于稳定，100％病变时间约10-12h，小方瓶20代病毒转入大转瓶，100％病变时间约为12-14h，病变时间稳定。拯救病毒5、15、20代3A基因的序列测定结果表明，3A蛋白104-115位氨基酸的缺失稳定存在。

4、动物实验

选取60日龄健康易感的猪和1岁左右的黄牛各8头(A型口蹄疫液相阻断ELISA抗体效价＜1∶6，3ABC抗体阴性)，分为两组，每组包含4个猪和4个牛。第一组动物肌肉注射A/rV-2病毒液2ml(含10⁷ TCID₅₀)，第二组动物肌肉注射A/GDMM/CHA/2013病毒液2ml(含10⁷TCID₅₀)。接种后，每天观察所有试验动物出现口蹄疫临床症状的情况，所有接种的动物2天后均表现体温升高，食欲减退，精神萎靡，到接种第7天，所有动物均在蹄部和/或口腔舌面出现口蹄疫水泡性症状，动物养至28天后采血，分离血清备用。

5、表位AEKNPLE特异性抗体的检测

为了检测A/rV-2和A/GDMM/CHA/2013病毒接种的动物是否发展针对3A AEKNPLE表位的抗体反应，动物接种前和接种28天的血清用3A单抗阻断ELISA检测，步骤如下：

①包被：用包被缓冲液稀释2C多抗至工作浓度，加入酶标板，每孔加100μL，4℃过夜，将此酶标板用PBST洗涤5遍，拍干；

②封闭：每孔加封闭液100μL，37℃封闭1h，用PBST洗涤3遍，拍干；

③用2C多抗捕获2C3AB蛋白：用血清稀释液(将2C3AB蛋白稀释至工作浓度，每孔100μL加入酶标板，37℃反应1h，PBST洗涤5遍，拍干；

④加待测血清：用血清稀释液(血清稀释液：含10％马血清(Hyclone)，0.25％酪蛋白，1％海藻糖，0.01％硫柳汞的0.01M磷酸盐(PBS)溶液)将阳性、阴性对照血清及待测血清样品1∶5稀释，每孔100μL加入酶标板，反应24小时，PBST洗涤5遍，拍干；

⑤加酶标3A单抗：用血清稀释液将酶标3A单抗稀释至最适工作浓度，每孔100μL加入酶标板，37℃反应1h，PBST洗涤5遍，拍干；

⑥加底物显色每孔：100μL加入TMB底物溶液，37℃避光反应10～15min；

⑦终止：每孔加入0.3mol/L H₂SO4使反应终止；

⑧测定OD值：用酶标仪测定450nm波长OD值；

⑨计算血清样品抗体阻断率：根据评判标准判定结果，阻断率(％)＝[(阴性参考血清OD-样品OD)/阴性参考血清OD]×100，阻断率大于或等于46％，样品判为3A蛋白104-115位氨基酸表位抗体阳性，阻断率小于0.46，样品判为3A蛋白104-115位氨基酸表位抗体阴性。

结果显示，所有接种A/GDMM/CHA/2013病毒的动物均产生针对该表位的抗体(阻断率大于46％)，而所有接种重组病毒A/rV-2的动物均不产生针对该表位的抗体(阻断率小于46％)。由此表明可以通过检测针对缺失表位的抗体来区分口蹄疫自然感染的动物和疫苗免疫的动物，动物免疫前和免疫后阻断率见图7。

五、疫苗制备

1、制苗病毒的大量增殖培养

培养BHK21细胞至单层细胞长满后，向其中加入A/rV-2病毒液和培养液，其中病毒液按10％体积比例加入，补加培养液至培养容器体积的1/20～1/30；37℃继续培养，待95％以上细胞出现细胞CPE时，收获病毒液即为病毒培养物，置-20-40℃保存。

2、病毒液的检验

(1)无菌检验：按《中国兽药典》进行，均应无细菌、支原体生长和外源病毒污染。

(2)病毒含量的测定：用DMEM液(pH值7.6)进行10倍系列稀释制苗病毒液后，每个稀释度分别接种BHK21细胞单层，每个稀释度接种4个细胞管，每管1ml，置36～37℃培养72小时，观察CPE，按Karber法计算TCID₅₀，每毫升病毒含量均应不低于10^7.0TCID₅₀。

(3)生产毒种特异性检验：将生产毒种与不同血清型的FMDV及猪水泡病阳性血清进行细胞中和试验，结果显示，制苗毒液仅可被A型FMD阳性血清中和，生产毒种具有FMD A型特异性。

3、病毒灭活：

将制苗病毒液经80目铜纱网滤过除去细胞碎片，用7.5％碳酸氢钠溶液调pH值为7.6～7.8，加入青霉素(100IU/ml)、链霉素(100μg/ml)，用2mmol/L BEI(Sigma公司)溶液在30℃下灭活28小时，加入经滤过除菌的硫代硫酸钠溶液，使其终浓度为2％，置2～8℃保存备用。

4、疫苗配制：

IS201佐剂产品名称为Montanide ISA201VG，购自法国SEPPIC公司，产品目录号为：L01408；用灭活的病毒液(抗原)和佐剂配制“抗原/佐剂/抗原”双相佐剂型疫苗，灭活病毒液与IS201佐剂混合乳化，体积比为50％∶50％，振荡或乳化机搅拌均匀后即为A型FMDV标记疫苗，置4-8℃保存。

5、疫苗的检验

(1)性状

①外观：乳白色或淡粉红色粘滞性均匀乳状液。

②剂型：水包油包水型(W/O/W)，取一清洁吸管，吸取少许疫苗滴于清洁冷水表面，应呈云雾状扩散。

③粘度：用1ml吸管(出口内径1.2mm)吸取25℃左右的疫苗1ml，令其垂直自然流出0.4ml，所需时间应小于或等于8秒。

④稳定性：吸取疫苗10ml加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，水相析出应不超过0.5ml。

(2)无菌检验：按《中国兽药典》进行，应无菌生长。

(3)安全检验

①用体重20～25g的小鼠4只，每只皮下注射疫苗0.5ml，连续观察7日，不应出现因注射疫苗引起的死亡或明显的口蹄疫症状。

②用至少45～50日龄的健康易感猪(口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体滴度＜1∶8，3ABC抗体阴性)3头，每头耳根后肌肉注射疫苗6ml，连续逐日观察10天，均不应出现口蹄疫症状或明显的因注射疫苗引起的毒性反应。

(4)效力检验：按现行《中国兽药典》方法进行，用45日龄以上的健康易感猪(口蹄疫O型液相阻断ELISA抗体滴度＜1∶6，3ABC抗体阴性)15头，分3组，每组5头；按1头份、1/3头份、1/9头份疫苗剂量分别耳根后肌肉注射；28天后，将免疫猪15头，连同对照组2头，每头猪耳根后肌肉接种1000ID50/2mlA/GDMM/CHA/2013鼠毒，连续观察10天。结果显示，对照猪全部四蹄出现水泡，免疫猪除1/3头份和1/9头份各有1头2蹄出现口蹄疫水泡型症状外，其余免疫猪在整个实验期间无任何口蹄疫临床症状，根据Spearman-Karber方法，计算每头份疫苗含11.84PD₅₀，对A型口蹄疫病毒的免疫保护效力大于OIE推荐的6PD₅₀，是理想的抗A型FMDV的疫苗。

综上，实施例1中得到的标记病毒感染的动物能够用3A单抗阻断ELISA与野毒感染动物相区分，标记病毒制备的疫苗的PD₅₀达11.84每头份，大于OIE推荐的6PD₅₀。因此本发明获得标记疫苗是理想的DIVA疫苗，能够用配套的鉴别诊断方法区分感染和疫苗免疫的动物，从而达到即能免疫预防又能鉴别诊断的目的，满足FMDV的控制和净化需求。

表3：FMDV A/GDMM/CHA/2013毒株攻毒保护结果

注：“-”表示没有任何FMD的临床症状；“+”表示2蹄出现水泡型症状；“++”表示四蹄出现水泡型症状。

Claims (6)

1.一种A型口蹄疫标记疫苗，其特征在于所采用的种毒为具有SEQ ID NO：3基因片段的A/rV-2病毒，该基因片段编码的氨基酸序列为序列表SEQ ID NO：4，其缺失口蹄疫病毒3A蛋白的104-115位氨基酸。

2.如权利要求1的标记疫苗的构建方法，其特征在于包括如下步骤：1)A型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒的构建；2)以步骤1)为基础，缺失口蹄疫病毒3A蛋白104-115氨基酸编码区的A型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒的构建；3)以步骤2)为基础，拯救缺失3A蛋白104-115编码序列的A型口蹄疫病毒，作为A型口蹄疫标记疫苗的种毒。

3.根据权利要求2的方法，其特征在于步骤1)采用四组扩增引物分别扩增A型口蹄疫全基因组序列，四组引物分别为A1组引物SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6；A2组引物SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8；A3组引物SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10；A4组引物SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12。

4.根据权利要求3的方法，其特征在于步骤1)构建重组质粒的步骤为A1、A2组引物扩增片段进行融合PCR，融合后的片段与pSK载体分别经SphI/XbaI双酶切后连接转化得重组质粒pSK-A12，所得重组质粒与引物A3组扩增的片段分别用XbaI/Bgl II双酶切后连接转化得重组质粒pSK-A123；A4引物扩增的片段与pSK载体分别用Bgl II/NotI双酶切后连接转化得重组质粒pSK-A4；pSK-A123与pSK-A4分别用Bgl II/NotI双酶切后连接转化得含当前流行的A型口蹄疫病毒基因组全长cDNA的重组质粒pQAGD。

5.根据权利要求4的方法，其特征在于以pSK-A4为模板，分别用AGD1组引物和AGD2组引物扩增，所得扩增片段以SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：16引物进行融合PCR；融合的扩增片段以用Bgl II/Hind III酶消化，pSK-A4用Hind III/NotI酶消化，pSK-A1234用Not I/Bgl II消化，三片段连接得到含缺失3A蛋白104-115编码区的A型口蹄疫病毒基因组全长cDNA的重组质粒pQAGD/3A104-115；扩增所用引物为AGD1组引物：SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14；AGD2组引物：SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16。

6.权利要求1所述的A型口蹄疫标记疫苗在制备防控A型口蹄疫的药物中的应用。