CN102614507A

CN102614507A - 一种o型口蹄疫分子标记疫苗及其制备方法

Info

Publication number: CN102614507A
Application number: CN2012100359867A
Authority: CN
Inventors: 刘在新; 卢曾军; 李平花; 白兴文; 付元芳; 孙普; 陈应理; 李冬; 包慧芳; 曹轶梅; 谢宝霞; 殷宏
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2012-02-17
Filing date: 2012-02-17
Publication date: 2012-08-01
Anticipated expiration: 2032-02-17
Also published as: CN102614507B

Abstract

本发明公开了一种O型口蹄疫分子标记疫苗，标记疫苗种毒为rV-O/3Ad病毒，rV-O/3Ad的基因组序列为SEQ ID NO：2，所述rV-O/3Ad病毒含3A 91～114位氨基酸的缺失，并且含有缅甸98 VP1氨基酸序列。用本发明方法得到的疫苗免疫动物5次后，动物血清中检测不到缺失3A 91～114位优势表位的抗体。因此，用本发明方法得到的疫苗免疫动物，能准确区分感染动物和免疫动物。

Description

一种O型口蹄疫分子标记疫苗及其制备方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及的是一种O型口蹄疫分子标记疫苗及其制备方法。

背景技术

口蹄疫(foot-and-mouth disease，FMD)是危害偶蹄动物的烈性传染病，尤其对主要畜种猪、牛、羊的危害特别严重，能造成畜种生产力下降和不良的社会影响，社会经济损失巨大。因该病传染性极强，世界动物卫生组织(FAO/OIE)将其列为头号必报烈性传染病，国际贸易予以严格限制。我国将该病列为一类动物传染病之首。在世界上许多国家，尤其是非洲、亚洲和南美洲国家，该病发生次数频繁，流行严重。此外，不时出现全球的流行性爆发。

口蹄疫的病原是口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，FMDV)。口蹄疫病毒有7个血清型(A，O，C，Asial，SAT1，SAT2和SAT3)，各型中又有许多基因和抗原性有差异的分离株，差异主要表现在结构蛋白VP1上。VP1是口蹄疫病毒的主要抗原表位区，能激发产生主要的中和抗体。口蹄疫病毒血清型由结构蛋白决定，非结构蛋白无血清型之分。和大多数病毒一样，口蹄疫病毒的基因组上既有组成病毒粒子的结构蛋白基因，也有仅参与复制过程而非病毒粒子成分的非结构蛋白基因(non-structure proteins，NSPs)(Forss S，Strebel K，Beck E，et al.Nucleotide sequence and genome organization offoot-and-mouth disease virus，Nucleic Acids Research，1984，12：6587-6601，Acharya R，Fry E，Stuart D I，et al.The three-dimersional structure of foot and mouth disease virus at

Nature，1989，337：709-716)。口蹄疫病毒感染动物后，在体内大量复制时，既能产生结构蛋白(VP4，VP2，VP3和VP1)，也能产生非结构蛋白(L，2A，2B，2C，3A，3B，3C，3D以及一些非结构蛋白的前体蛋白，如3AB，3ABC)(Belsham GJ.Distinctive featuresof foot-and-mouth disease virus，a member of the picornavirus family；aspects of virus proteinsynthesis，protein processing and structure.Prog Biophy Mol Biol，1993，60：241-260.)。两者作为抗原，刺激动物体产生相应的抗体。因此，感染动物体内既有结构蛋白抗体，也有非结构蛋白抗体。据此，可以判定动物是否感染(过)口蹄疫病毒。

口蹄疫病毒感染动物可变成无症状的病毒携带者，是口蹄疫传播的一大隐患。因此，除患病动物外，无症状的病毒携带者成为预防和控制口蹄疫的重点监控对象。

预防和控制口蹄疫采取的措施是严格检疫，进出口限制，屠宰患病动物，及有计划地实施疫苗免疫易感动物。检疫的技术难题是如何区分感染动物和免疫动物。

目前，区分口蹄疫感染动物和免疫动物的策略是检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体。其理论依据是口蹄疫病毒在感染动物体内复制产生的非结构蛋白，刺激动物体产生相应的抗体；而疫苗免疫动物的血清中检测不到相应的抗体，因疫苗制造工艺的除细胞碎片环节去除了大部分非结构蛋白。研究表明，在众多非结构蛋白中，检测3AB或3ABC抗体区分感染动物和免疫动物的可信度最高(Sorensen KJ，Madsen KA，Madsen EA，et al..Differentntiation of infection from vaccination in foot-and-mouth disease by the detection ofantibodies to the non-structural proteins 3D，3AB and 3ABC in ELISA using antigensexpressed in baculovirus.Arch Virol，1998，143：1-16，)。因此，国际上多个实验室建立了不同模式的检测3AB、3A或3ABC抗体ELISA方法(Alfonso Clavijo，Peter Wright，PaulKitching，et al.Developments in diagnostic techniques for differentiating infection fromvaccination in foot-and-mouth disease.The Veterinary Journal，2004，167：9～22.)。世界动物卫生组织(FAO/OIE)的动物疫病诊断手册中推荐应用该法(Manual of diagnostic tests andvaccines for terrestrial animals，http\\www.oie.int)。

口蹄疫免疫常用疫苗是灭活疫苗。该苗的生产采用的是病毒接种细胞、组织培养物，病毒增殖后，收获培养物，加化学灭活剂(如二乙烯亚胺，BEI)使病毒失去感染性，与佐剂混合乳化制成疫苗。病毒在细胞内增殖，结构蛋白和非结构蛋白同时表达，但部分非结构蛋白的一个可能的特性是与细胞膜成份结合，在疫苗制造工艺的除细胞碎片环节去除了。然而，游离的，以及与病毒粒子大小相近的非结构蛋白复合物是难以清除的，在疫苗中或多或少的残留，多次免疫动物后也能产生相应的抗体(Bergmann I E，MaliratE V，Neitzert E，Beck N，et al.Improvement of a serodiagnostic strategy for foot-and-mouthdisease virus surveillance in cattle under systematic vaccination：a combined system of anindirect ELISA-3ABC with an enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay.Arch Virol，2000，145：473～489)，给区分感染动物和免疫动物带来了障碍。世界动物卫生组织(FAO/OIE)的动物疫苗手册中将口蹄疫疫苗免疫动物3次能否产生非结构蛋白抗体，作为疫苗评价的一项指标(Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals，http\\www.oie.int)。

口蹄疫灭活疫苗的制造要动用活病毒，考虑到严格的生物安全，已开始了口蹄疫基因工程疫苗的研制和使用。但一些基因工程疫苗也使用了口蹄疫病毒的一些非结构蛋白基因(Abrams C C，King A M Q，Belsham G J.Assembly of foot-and-mouth disease virusempty capsids synthesized by a vaccinia virus expression system.J Gen Virol，1995，76：3089-3098.)，在疫苗中存有这些非结构蛋白，多次免疫动物后也能产生相应的抗体，同样给区分感染动物和免疫动物带来了障碍。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种O型口蹄疫分子标记疫苗及其制备方法。

本发明的技术方案如下：

一种O型口蹄疫分子标记疫苗，标记疫苗种毒为rV-O/3Ad病毒，rV-O/3Ad的基因组序列为SEQ ID NO：2，所述rV-O/3Ad病毒含3A91～114位氨基酸的缺失，并且含有缅甸98VP1氨基酸序列。

所述的O型口蹄疫分子标记疫苗的制备方法，包括以下步骤：A1、O型口蹄疫病毒基因组RNA全长cDNA重组质粒构建；A2、置换VP1基因和缺失3A蛋白91～114氨基酸编码区的O型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒构建；A3、拯救缺失3A蛋白91～114位氨基酸编码区的基因工程病毒，作为标记疫苗种毒。A4、利用针对3A蛋白91～114氨基酸的单克隆抗体建立的竞争ELISA方法可以鉴别该疫苗毒株免疫动物与口蹄疫病毒自然感染动物。

用本发明方法得到的疫苗免疫动物5次后，动物血清中检测不到缺失3A 91～114位优势表位的抗体。因此，用本发明方法得到的疫苗免疫动物，能准确区分感染动物和免疫动物。

附图说明

图1为FMDV OZK/93-08株全长cDNA分子克隆的构建策略，图中文字中间删除线表示改变了原序列中限制性内切酶位点；

图2为重组质粒pOMQ-Z123的EcoR I酶切鉴定.1，重组质粒酶切后电泳条带；M，DNA分子质量标准电泳条带；

图3为重组质粒pSK-Z4D NotI和BglII酶切鉴定.1，重组质粒酶切后电泳条带；M，DNA分子质量标准电泳条带；

图4为重组质粒pOMQ-Z1234D EcoR I酶切鉴定.1，重组质粒酶切后电泳条带；M，DNA分子质量标准电泳条带；

图5为含嵌合缅甸98vp1并含3A氨基酸缺失的ozk/93全长克隆的构建示意图；

图6为病毒rV-O/3Ad感染BHK-21细胞后引起的CPE.A，正常BHK-21细胞；B，出现CPE的细胞；

图7为拯救病毒rV-O/3Ad与OZK/933A蛋白氨基酸的比对；

图8为拯救病毒rV-O/3Ad与OZK/93VP1蛋白氨基酸的比对；

图9为间接免疫荧光检测拯救病毒在BHK上的复制；A，接种rV-O/3Ad病毒的BHK-21细胞；B，未接种病毒的BHK-21细胞；

图10为电镜下rV-O/3Ad拯救病毒粒子；

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一、O型口蹄疫病毒基因组RNA全长cDNA重组质粒构建

设计合成下列寡核苷酸引物，按图1策略构建O型口蹄疫病毒OZK/93-08株基因组RNA全长cDNA重组质粒。

Z1：agactagttaatacgactcactatagggttgaaagggggcgctagggt(SEQ ID NO：4)

Z1-2：tggttggggggggggggggggtgaa(SEQ ID NO：5)

Z2：ttcaccccccccccccccccaacca(SEQ ID NO：6)

Z2-2：agcgtggagtcgagcacagtac(SEQ ID NO：7)

Z3：ggtctaagcaggtttccacaactg(SEQ ID NO：8)

Z3-2：aactgcagtgcttcgtgctgccctttctcaatg(SEQ ID NO：9)

Z4：gctaagcttggaactccacgaaaaggtgtcga(SEQ ID NO：10)

Z4-2：ttggcgcgccgcggccgcttttttttttttttttttttt(SEQ ID NO：11)

T1：gaaaacgcctgaggccgccgcacactgcatt(SEQ ID NO：12)

T1-2：aatgcagtgtgcggcggcctcaggcgttttc(SEQ ID NO：13)

T2：gtgaagaagatatctgactcgctctccagt(SEQ ID NO：14)

T2-2：actggagagcgagtcagatatcttcttcac(SEQ ID NO：15)

提取口蹄疫病毒OZK/93-08株(购买自国家农业部指定的口蹄疫病毒保藏机构国家口蹄疫参考实验室)的总RNA，分别用Z2-2、Z3-2和Z4-2引物，合成第一链cDNA。以第一链cDNA为模板，用4对引物Z1/Z1-2、Z2/Z2-2、Z3/Z3-2和Z4/Z4-2，扩增获得4个相互重叠的cDNA双链片段，分别命名为Z1cDNA、Z2cDNA、Z3cDNA和Z4cDNA片段。

Z3cDNA和pBluescript II SK-质粒载体(Invitrogen公司)分别用XbaI和BglII消化后连接，得到重组质粒pSK-Z3。

Z4cDNA和pBluescript II SK-质粒载体分别用BglII/NotI消化后连接，得到重组质粒pSK-Z4。

利用QuikChangeLightning Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司)定点突变试剂盒，以引物对T1/T1-2和T2/T2-2进行定点突变引入分子标签。分别依次突变了重组质粒pSK-Z3中2985位的NotI位点和4238位的BglII位点，得到阳性重组质粒pOZKF-Z3。

Z1cDNA和Z2cDNA混合作模板，用一对引物Z1/Z2-2进行融合PCR，得Z12cDNA。Z12cDNA与pMD20-T质粒(大连宝生物公司)连接，得到重组质粒pMD-Z12。pMD-Z12和pBluescript II SKhdv质粒载体(Invitrogen公司)分别用KpnI/XbaI双酶切消化后，纯化回收相应的目的片段，连接得到重组质粒pOZKF-Z12。用BglII/XbaI分别双酶切消化重组质粒pOZKF-Z12和pOZKF-Z3，纯化回收相应的目的片段，连接得到重组质粒pOZKF-Z123。最后用BglII/NotI消化重组质粒pOZKF-Z123和Z4cDNA片段，纯化回收，连接得到含口蹄疫病毒OZK/93-08株全基因组cDNA克隆的重组质粒pOZKF-Z1234。测得pOZKF-Z1234的核酸序列见SEQ ID NO：1，即口蹄疫病毒OZK/93-08株全基因组序列(SEQ ID NO：1；结构蛋白VP1基因序列位于3228-3867，3A蛋白基因序列位于5332-5760，3A的91～114位氨基酸编码序列位于5602-5643：)。

二、置换VP1基因和缺失3A蛋白91～114氨基酸编码区的O型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒构建

考虑到近年的口蹄疫优势流行毒为缅甸98系，为增强本发明的适用性，将pOZKF-Z1234中口蹄疫病毒的主要抗原表位区VP1基因置换，并缺失3A蛋白91～114氨基酸编码区。

设计合成下列寡核苷酸引物(用于构建嵌合缅甸98病毒VP1序列所用的引物)并由上海桑尼有限公司合成：

E2888(+)：CAACCTACACTTCATGTTCACAGG(SEQ ID NO：16)

MQVP1(-)：CTCGCCTGTCGAAGTGGTCTGCGTGCGGGCGTCAAC(SEQ ID NO：17)

MQVP1(+)：GTTGACGCCCGCACGCAGACCACTTCGACAGGCGAG(SEQ ID NO：18)

MQVP2(-)：CTTGAGGAGGTCGAAGTTCAGAAGCTGTTTTGCGGG(SEQ ID NO：19)

MQVP2(+)：CCCGCAAAACAGCTTCTGAACTTCGACCTCCTCAAG(SEQ ID NO：20)

E4183(-)：ACCGGTGTCAGCTAGCATGA(SEQ ID NO：21)

OZ5269(+)：CAAGAAGTGATTGAGCGGGT(SEQ ID NO：22)

OZD91(-)：GCGCTGGCGCCACTCGCCTCCAGTGAGTCATCCACTGACT(SEQ ID NO：23)

OZD91(+)：AGTCAGTGGATGACTCACTGGAGGCGAGTGGCGCCAGCGC(SEQ ID NO：24)

OZ6811(-)：TTTGTCCTCTTCAGACATCT(SEQ ID NO：25)

1)根据样品量，按下表列量混合试剂进行反转录；

2)按下表列量混合试剂，进行PCR；扩增程序为，94℃3min；94℃1min，55℃90sec，72℃90sec，30个循环，72℃延伸5min。

试剂	需用量(μl)
		25mM MgCl₂	3.0
10×buffer	5.0
		10mM dNTPs	4.0
正链引物(25pmol/μl)	0.5
		负链引物(25pmol/μl)	0.5
DNA聚合酶(5U/μl)	0.5
		RT产物	5.0

无菌蒸馏水	31.5
		总体积	50.0

用RNeasy mini Kit(Qiagen)提取口蹄疫病毒O/CHN/Mya98/2010S株(购买自国家农业部指定的口蹄疫病毒保藏机构国家口蹄疫参考实验室)的总RNA，用MQVP1(-)引物，合成第一链cDNA。以第一链cDNA为模板，用MQVP1(+)/MQVP2(-)引物扩增获得缅甸98口蹄疫病毒的VP1基因，命名为E片段(E片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：2中第3216-3890位核苷酸)。然后以pOZK-Z123质粒为模板，用E2888(+)/MQVP1(-)和MQVP2(+)/E4183(-)为引物，分别PCR扩增D片段(D片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：2中第2888-3251位核苷酸)和F(F片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：2中第3855-4203位核苷酸)片段。扩增的D、E、F三片段用凝胶纯化回收做模板，用E2888(+)/E4183(-)引物融合扩增DEF(DEF片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：2中第2888-4203位核苷酸)。该片段经BssH II和Nhe I酶消化并纯化回收后插入用同样酶消化的质粒pOZK-Z123中，得到的阳性重组质粒记作pOMQ-Z123，用EcoR I酶切鉴定，能够酶切为3条预期大小的DNA片段(1407，470和6485bp)，如图2所示。

以已构建保存的质粒pSK-Z4为模板，分别用OZ5269(+)/OZD91(-)和OZD91(+)/OZ6811(-)引物对，PCR分别扩增得M片段(M片段的核苷酸序列为SEQ IDNO：2中第5269-5621位核苷酸)和N片段(N片段的核苷酸序列为SEQ ID NO：2中第5582-6783位核苷酸)。纯化的M片段和N片段等量混合做为模板，以OZ5269(+)/OZ6811(-)为引物PCR扩增得MN片段(MN片段的核苷酸序列为SEQ IDNO：3中第5269-6783位核苷酸)。该MN片段含FMDV非结构蛋白3A91～114位氨基酸的缺失)。MN片段用Bgl II/EcoR I(TakaRa)内切酶消化后，插入用BglII/EcoR I(TakaRa)酶消化的质粒pSK-Z4中，得到阳性重组质粒记作pSK-Z4D。用Bgl II和Not I(TakaRa)进行酶切鉴定，能够酶切为两条预期大小的DNA片段(2849和2809bp)，如图3所示。用Not I和Bgl II双酶切质粒pSK-Z4D，回收Z4D片段，将其插入用同样酶消化的重组质粒pOMQ-Z123中，得到的阳性质粒记作pOMQ-Z1234D。该质粒用EcoR I进行酶切鉴定，能够酶切为四条预期大小的DNA片段(1407，470，3688和5635bp)，如图4所示。重组质粒pOMQ-Z1234D即为含缅甸98病毒VP1基因和缺失3A蛋白91～114位氨基酸的O型口蹄疫病毒基因组全长cDNA克隆。全长感染性cDNA构建过程见图5。

三、3A蛋白氨基酸缺失的基因工程病毒拯救

BHK-21细胞购自中国兽医监察所，产品目录号为BHK21F5620071213。

用QIAGEN Plasmid Midi Kits(QIAGEN公司)提取质粒pOMQ-Z1234D和pcDNAT7P。pcDNAT7P质粒在文献“《中国农业科学》2009年第42卷第2期，李平花，白兴文，卢曾军等，“细胞内转录拯救Asial型口蹄疫病毒”中公开过，公众可从中国农业科学院兰州兽医研究所获得。

用Not I线化pOMQ-Z1234D后，加入蛋白酶K(终浓度为0.25μg/mL，Invitrogen公司)，37℃温育30min后，纯化后作为转染cDNA模板。常规培养的单层BHK-21细胞生长至70％～80％时用于转染。转染时各取2μg线化cDNA模板和pcDNAT7P用Lipofectamine^TM2000(Invitrogen公司)介导转染BHK-21细胞。转染后6h吸去细胞上清，加入2mL含8％胎牛血清的DMEM培养基(Invitrogen公司)，置37℃5％CO2培养箱，48h后收获病毒，冻融1次后，在BHK-21上连续10传代，出现典型细胞病变(CPE)(见图6)，收集病毒液，即为目的病毒，命名为rV-O/3Ad。用该病毒在培养的BHK-21细胞上传代增殖30代，-70℃保存各代病毒备用。

四、病毒rV-O/3Ad的鉴定

1、RT-PCR鉴定重组病毒基因

取连续传10代的rV-O/3Ad细胞毒，用RNAasy Mini Kit提取细胞毒总RNA，RT-PCR方法扩增含VP1基因和3A基因的特定片段，纯化回收后送上海桑尼有限公司测序，测定的VP1和3A基因所编码的氨基酸与OZK/93相对应的氨基酸比对，比对结果见图7和图8。RT-PCR所用引物为：

NK61(-)：GACATGTCCTCCTGCATCTG(SEQ ID NO：26)；VP31(+)：TAGTGCTGGYAARGACTTTG(SEQ ID NO：27)；用于扩增含VP1基因的特定片段。

OZ5269(+)：CAAGAAGTGATTGAGCGGGT (SEQ ID NO：28)；OZ6811(-)：TTTGTCCTCTTCAGACATCT(SEQ ID NO：29)；用于扩增含3A基因的特定片段。

结果显示：rV-O/3Ad病毒含3A91～114位氨基酸的缺失(图7)，并且含有缅甸98VP1氨基酸序列(SEQ ID NO：3)，OZK/93-08疫苗毒株与缅甸98流行毒株VP1氨基酸序列比对结果见图8所示，OZK/93-08病毒株的VP1氨基酸序列见SEQ ID NO：4。测序及氨基酸序列分析结果表明本发明构建的rV-O/3Ad基因组序列正确。重组病毒rV-O/3Ad的基因组序列见SEQ ID NO：2；嵌合的缅甸98系病毒VP1基因序列位于3228-3867，3A蛋白的基因序列位于5332-5718)。

2、间接免疫荧光鉴定病毒蛋白

接种病毒的BHK-21(单层细胞生长至70％)，24h后进行间接免疫荧光法鉴定。一抗为O型口蹄疫病毒兔阳性血清，二抗为加FITC羊抗兔IgG(Sigma公司)，同时设正常细胞对照。接种病毒的BHK细胞中可见绿色特异性荧光，而正常细胞对照无可见荧光(如图9所示)。表明，病毒与O型口蹄疫病毒兔阳性血清能够相互结合。

3、电镜检查

在BHK-21细胞中增殖后收获的细胞毒200mL，冻融2～3次后，加BEI灭活，4℃6000rpm离心40min，收集病毒上清，4℃45000rpm离心3h，沉淀加500μL NET缓冲液重悬，负染后电镜观察。结果检查到直径约为25nm、球形的口蹄疫病毒粒子(图10)。

4、拯救病毒的遗传稳定性分析

将rV-O/3Ad病毒按10％接种量接种BHK-21细胞，连续传代，观察出现典型细胞病变(CPE)的时间，并对5、10代病毒进行RT-PCR检测拯救病毒3A缺失氨基酸的变化。RT-PCR检测的引物为：

OZ5269(+)：CAAGAAGTGATTGAGCGGGT(SEQ ID NO：30)

OZ6811(-)：TTTGTCCTCTTCAGACATCT(SEQ ID NO：31)

实验设3次重复。

结果：拯救病毒rV-O/3Ad连续传至第8代后，出现的CPE的时间趋于稳定，100％病变时间约8～10h，20代病毒转入大转瓶，100％病变时间约为11～12小时，病变时间稳定。拯救病毒5和10代3A基因的序列测定结果表明，3A蛋白91～114位氨基酸的缺失在连续传代过程中未发生变化。

五、疫苗制备方法

1、拯救病毒的大量增殖培养

静止或旋转培养BHK21细胞至单层细胞长满，向其中加入rV-O/3Ad病毒液和培养液，其中病毒液按5～15％体积比例加入，补加培养液至培养容器体积的1/20-1/30；37℃继续培养，待出现细胞病变效应(cytopathogenic effct，CPE)，收获病毒液即为病毒培养物，置-20℃～-40℃保存。

培养液的组成为：水解乳蛋白液(93％～97％)、氨基酸溶液(2％～5％)、抗生素液(1％)、HEPES液(0.5％)，加7.5％的NaHCO₃调pH至7.5～7.7；所述百分含量为体积百分含量，水解乳蛋白液、氨基酸溶液、抗生素液和HEPES液均购自Invitrogen公司。

2、病毒灭活

用BEI(Sigma公司)灭活大量增殖的病毒液。

3、疫苗配制

IS201佐剂产品名称为Montanide ISA201VG，购自法国SEPPIC公司，产品目录号为L01408。

用灭活病毒液(抗原)和佐剂配制疫苗，如下：(1)“抗原/佐剂/抗原”双相佐剂型。灭活病毒液与IS201佐剂(法国SEPPIC)混合乳化。灭活病毒液与IS201佐剂的体积比为50％∶50％，振荡或乳化机搅拌均匀后即成。置4～8℃。

将得到的疫苗记作“O型口蹄疫分子标记疫苗”。

六、免疫动物

田间临床健康猪30头，牛20头，平均分2组。一组免疫上述“O型口蹄疫分子标记疫苗”，肌肉接种，2ml/头。另一组接种常规口蹄疫灭活疫苗，肌肉接种，2ml/头。

常规疫苗的制备方法：用OZK/93-08株病毒液，按《中华人民共和国兽药典》中兽用生物制品的口蹄疫灭活疫苗规程制备。

疫苗接种动物每间隔至少14天接种一次，连续接种5次。最后一次接种后14-20天，采集免疫动物的血清。

七、血清抗体检测

待检血清：上述免疫血清。口蹄疫病毒感染猪血清20份，牛血清10份。

酶标3A单抗：使用EZ-Link Plus Activated Peroxidase试剂盒，用辣根过氧化物酶标记口蹄疫病毒非结构蛋白3A的91～114位氨基酸表位单克隆抗体。

血清稀释液：含10％马血清(Hyclone)，0.25％酪蛋白，1％海藻糖，0.01％硫柳汞的0.01M磷酸盐(PBS)溶液。

按以下步骤检测。

1、包被：用包被缓冲液(0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液)稀释基因工程表达的口蹄疫病毒非结构蛋白3A或3AB至1μg/ml，加入96孔酶标板，每孔加100μL，4℃过夜。将此酶标板用PBST洗涤5遍，拍干；

2、封闭：每孔加封闭液(含1％明胶的PBS溶液)100μL，37℃封闭1h，用PBST洗涤3遍，拍干；

3、于血清稀释板中，将待测血清按1∶5稀释于血清稀释液中，吸取稀释好的样品液加入包被好抗原的酶标板中，每孔加入100μL，室温过夜振荡作用18～24h；

4、次日，用1×PBST洗涤液洗板，反复洗5次，最后一次拍干；

5、将酶标3A单抗1∶100稀释至血清稀释液中，加入酶标板，每孔加入100μL，37℃作用1h；

6、同上洗涤，最后一次拍干，每孔加入100μL的底物溶液，37℃作用10～15min；

7、加终止液，每孔100μL，轻振混匀，于10min内用酶标仪读450nm吸光值(OD₄₅₀)；

8、竞争率计算：竞争率(PI)＝1-样品OD₄₅₀/阴性对照OD₄₅₀；

9、判定标准：血清竞争率大于或等于0.46判为3A蛋白91～114位氨基酸表位抗体阳性，血清竞争率小于0.46判为3A蛋白91～114位氨基酸表位抗体阴性。

血清检测结果列下表。

以上结果表明，用常规灭活疫苗免疫动物5次，用3A蛋白表位单抗竞争ELISA法能检测到群体动物血清中有相应的抗体；而用本发明方法得到的疫苗免疫动物5次后，群体动物血清中检测不到非结构蛋白3A抗体。因此，用本发明方法得到的疫苗免疫动物，能准确区分感染动物和免疫动物。

Claims

1.一种O型口蹄疫分子标记疫苗，其特征在于，标记疫苗种毒为rV-O/3Ad病毒，rV-O/3Ad的基因组序列为SEQ ID NO：2，所述rV-O/3Ad病毒含3A 91～114位氨基酸的缺失，并且含有缅甸98 VP1氨基酸序列。

2.根据权利要求1所述的O型口蹄疫分子标记疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：A1、O型口蹄疫病毒基因组RNA全长cDNA重组质粒构建；A2、置换VP1基因和缺失3A蛋白91～114氨基酸编码区的O型口蹄疫病毒基因组全长cDNA重组质粒构建；A3、拯救缺失3A蛋白91～114位氨基酸编码区的基因工程病毒，作为标记疫苗种毒；A4、利用针对3A蛋白91～114氨基酸的单克隆抗体建立的竞争ELISA方法可以鉴别该疫苗毒株免疫动物与口蹄疫病毒自然感染动物。