CN103933581A - 一种基于csf-fmd二联基因工程疫苗的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于CSF-FMD二联基因工程疫苗的制备方法，公开了基于猪瘟病毒和猪O型口蹄疫病毒二联核酸疫苗的研究及应用。基于猪瘟病毒和猪O型口蹄疫病毒二联核酸疫苗主要原料为：pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-O-VP1真核质粒。本发明本发明针对CSFVE2基因和FMDV-OVP1进行核酸疫苗研究，可刺激动物机体产生相应高水平的抗体，体现出很强的特异性。针对CSFV和FMDV-O引发猪的感染和传播，通过E2基因和VP1基因对两种病毒起到防控效果，可达到安全和有效的效果。

Description

一种基于CSF-FMD二联基因工程疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及一种基于CSF-FMD二联基因工程疫苗的研究及应用。

背景技术

猪瘟(Swine Fever，SF)又名猪霍乱(Hog Cholera，HC)，欧洲也称之为古典猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)，是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一种高度接触性、急性传染病。其特征是发病急、高热稽留，微循环血管壁变性及其导致的全身泛发性小点出血，内脏器官中的多发性出血、坏死和梗死，具有很强的传染性和很高的致死率。被世界动物卫生组织（World organization of animal health，OIE）列为法定报告的动物疫病之一，我国将其列为一类动物传染病。猪瘟病毒基因组为单股正链 RNA，全长大约为12.3kb。其放阅读框(Open Reading Frame，ORF)编码的多聚蛋白经加工切割成12种蛋白质，其中 C、E0、E1、E2 等 4 种蛋白是成熟病毒粒子的组成成分，被称为结构蛋白；其余 8 种蛋白的为非结构蛋白。而E2蛋白是猪瘟病毒最主要的保护性抗原蛋白，在感染细胞中以同源二聚体或与E1形成异源二聚体形式存在于病毒粒子及感染的细胞表面。研究表明，E2蛋白的糖基化位点与病毒的毒力有着直接的关系。在四种结构蛋白中，E2蛋白保守性最低，最易发生变异。许多学者认为CSFV 的E2抗原变异有可能是导致该病毒逃脱或抵御免疫保护的主要原因。

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus，FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触性人畜共患传染病。该病传播快，传播途径广，发病率高，对家畜养殖业危害极大，该病主要侵害牛、猪、羊和骆驼等家畜及多种野生偶蹄动物。被OIE列为法定上报疫病，而我国将其列为一类动物疫病的首位。口蹄疫病毒具有多型易变的特点，目前有7 个血清主型，分别为O、A、C、SAT 1、SAT2、SA T3 和亚洲Ⅰ型( Asia Ⅰ) 。我国口蹄疫的病毒型为O、A 型和亚洲Ⅰ型。口蹄疫病毒为单股正链RNA病毒，基因组全长约8500个核苷酸(nt)。其放阅读框(Open Reading Frame，ORF)共同编码一多聚蛋白。多聚蛋白经3次裂解后，形成3～4种病毒结构蛋白(VPO或VP4、VP2、VP3、VP1)和8~9种非结构蛋白。FMDV抗原变异是由衣壳蛋白VP1-VP4的氨基酸残基决定的。其中VPl最容易发生变异，它暴露于病毒表面，是决定病毒抗原性的主要成分，能诱导机体产生保护性的中和抗体；而VP4几乎不发生变异。FMDV抗原变异主要发生在FMDV衣壳蛋白VPl的G-H环上，是由抗原表位的氨基酸缺失、添加或替换造成的。FMDV的这种变异有可能使病毒突变株逃避抗体的中和或调理作用，获得持续感染的机会。

近年来，猪瘟的流行和发病特点发生了很大变化，出现了以繁殖障碍和仔猪先天性感染为特征的非典型猪瘟，表现为症状温和，隐形带毒，有些地区经常发生疫苗免疫失败或免疫无效的现象。而口蹄疫大面积爆发和流行一波未平一波又起，我国应用弱毒疫苗和灭活疫苗，取得了一定的防制效果。但无论是弱毒疫苗还是灭活疫苗都是由完整病毒粒子制成的疫苗，都无法逃避安全性问题。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于：提供一种安全的基于CSF-FMD二联基因工程疫苗的制备方法。

本发明的技术方案：一种基于CSF-FMD二联基因工程疫苗的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：

（1）猪瘟病毒病料CSFV-E2的RT-PCR扩增；猪O型口蹄疫病毒病料FMDV-O VP1的RT-PCR扩增；

（2）回收RT-PCR产物，与pMD19-T载体连接；将连接产物转化入大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞培养，挑取上述转化平皿中的白色菌落，接种到含有氨苄青霉素的2×YT液体培养基中，振荡培养至混浊，提取质粒并进行酶切鉴定，筛选出阳性并进行测序；

（3）将所构建重组质粒pMD19-CSFV-E2与pcDNA3.1（+）载体分别进行BamH I和EcoR I双酶切，回收纯化目的片段，将二者用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化至DH5α感受态细胞，获得阳性重组质粒pcDNA3.1-CSFV-E2，利用试剂盒提取质粒，进行BamH I和EcoR I双酶切及PCR鉴定，并送测序验证；

（4）将所构建重组质粒pMD19-FMDV-O-VP1与pcDNA3.1-CSFV-E2分别进行BamH I和Hind                                                双酶切，回收纯化目的片段，将二者用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化至DH5α感受态细胞，获得阳性重组质粒pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-O-VP1，利用试剂盒提取质粒，进行BamH I和Hind 双酶切及PCR鉴定，并送公司测序验证。

 本发明有益效果：本发明将预防并控制CSFV和FMDV-O对猪的感染；本发明所制备核算疫苗适用于对猪的免疫，为猪瘟病毒和猪O型口蹄疫病毒的防治提供安全有效的免疫产品，并减少对养猪业带来的经济损失。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果：   

（1）安全性好：本发明是针对猪瘟病毒和猪O型口蹄疫病毒其中一个重要的阅读框展开研发，通过对猪制定合理的免疫程序，从而达到对猪瘟病毒和猪O型口蹄疫病毒的预防与控制，可达到很好的免疫效果，而不产生致病性。

（2）特异性好：本发明针对CSFV E2基因和FMDV-O VP1基因进行核酸疫苗研究，可刺激动物机体产生相应高水平的抗体，体现出很强的特异性。

附图说明

图1为本发明猪瘟病毒和猪O型口蹄疫病毒二联核酸疫苗的研究及应用流程图。

具体实施方式

本发明的实施例：

基于猪瘟病毒和猪O型口蹄疫病毒二联核酸疫苗的研究及应用的主要原料：

真核表达质粒pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-O-VP1、胰蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、无内毒素质粒抽提相关试剂等。

所述的基于猪瘟病毒和猪O型口蹄疫病毒二联核酸疫苗的研究及应用制备步骤包括：

第一，引物的设计及合成

登录GeneBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)获取CSFV-GZ-2009株(登录号：HQ380231.1)、C-ZJ-2008株(登录号：HM175885.1)、JL1(06)株(登录号：EU497410.1)和Shimen/HVRI株(登录号：AY775178.1)序列，以Bioedit软件比对选取序列后经Primer Premier 5 软件设计猪瘟病毒E2基因特异性引物。

登录GeneBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)获取EGY 10/2011株(登录号：KC440883.1)、O/S15KOR/2002株(登录号：KF694745.1)、AFG_016/2003 株(登录号：HQ268526.1)和MAY/3/2000株(登录号：HQ632768.1)序列，以Bioedit软件比对选取序列后经Primer Premier 5 软件设计猪O型口蹄疫病毒VP1基因特异性引物；

第二，最佳反应体系的确定  

猪瘟RT-PCR扩增体系：

RT反应体系：5×Buffer 4.0 μL、CSFV E2-P1(10μmol/L) 1.0 μL、CSFV E2-P2 (10μmol/L) 1.0 μL、dNTP(10mmol/L) 1.0 μL、RNA模板 11.0 μL、MLV 1.0 μL、RNA抑制酶 1.0 μL，总体积20.0 μL。

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5.0 μL、dNTP(10mmol/L) 1.0 μL、DNA模板 1.0 μL、CSFV E2-P1(10μmol/L) 1.0 μL、CSFV E2-P2 (10μmol/L) 1.0 μL、Taq DNA聚合酶(2.5 U/??L) 1.0 μL、ddH₂O 40.0 μL，总体积50.0 μL。

RT的反应参数：45℃反转录60min，95℃灭活5min；PCR反应参数为：94℃预变性5min。94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸90s共30个循环，最后72℃延伸10min。

口蹄疫RT-PCR扩增体系：

RT反应体系：5×Buffer 4.0 μL、FMDV-OVP1-P1 (10μmol/L) 1.0 μL、FMDV-OVP1-P2 (10μmol/L) 1.0 μL、dNTP(10mmol/L) 1.0 μL、RNA模板 11.0 μL、MLV 1.0 μL、RNA抑制酶 1.0 μL，总体积20.0 μL。

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5.0 μL、FMDV-OVP1-P1 (10μmol/L) 1.0 μL、FMDV-OVP1-P2 (10μmol/L) 1.0 μL、dNTP(10mmol/L) 1.0 μL、DNA模板 1.0 μL、Taq DNA聚合酶(2.5 U/??L) 1.0 μL、ddH₂O 40.0 μL，总体积50.0 μL。

RT的反应参数：45℃反转录60min，95℃灭活5min；PCR反应参数为：94℃预变性5min。94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸90s共30个循环，最后72℃延伸10min。

第三，CSFV E2基因和FMDV-O VP1基因的克隆  

RT-PCR产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，切下含目的条带的凝胶，参照胶回收试剂盒说明书回收RT-PCR产物，用常规方法与pMD19-T载体连接；将连接产物转化入大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞，37℃培养12 h，挑取上述转化平皿中的白色菌落，接种到含有氨苄青霉素的2×YT液体培养基中，37℃振荡培养过夜至混浊，提取质粒并进行酶切鉴定，筛选出阳性并进行测序。

第四，真核质粒pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-O-VP1的构建

将所构建重组质粒pMD19-CSFV-E2与pcDNA3.1（+）载体分别进行BamH I和EcoR I双酶切，回收纯化目的片段，将二者用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，连接产物转化至DH5α感受态细胞，获得阳性重组质粒pcDNA3.1-CSFV-E2。利用试剂盒提取质粒，进行BamH I和EcoR I双酶切及PCR鉴定。所述真核构建体系为：目的DNA片段 6μL、pcDNA3.1（+） 1μL、T4 DNA ligase 1μL、10×T4 DNA ligase buffer 2.5μL、灭菌ddH₂O 14.5 μL，总体积25.0 μL。

将所构建重组质粒pMD19-FMDV-O-VP1与pcDNA3.1-CSFV-E2分别进行BamH I和Hind 双酶切，回收纯化目的片段，将二者用T4 DNA连接酶于16℃连接过夜，连接产物转化至DH5α感受态细胞，获得阳性重组质粒pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-O-VP1。利用试剂盒提取质粒，进行BamH I和Hind 双酶切及PCR鉴定，并送公司测序验证。所述真核构建体系为：目的DNA片段 2.5μL、pcDNA3.1-CSFV-E2 1μL、T4 DNA ligase 1μL、10×T4 DNA ligase buffer 2.5μL、灭菌ddH₂O 18 μL，总体积25.0 μL。

第五，真核质粒pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-O-VP1体外培养

所述体外表达，培养并收获处于指数生长期的Vero细胞，用胰蛋白酶消化后用6 mL营养液悬浮细胞。然后取6孔细胞培养板，加1 mL上述细胞悬液和1 mL生长液，放入37℃ 5% CO2 恒温培养箱培养24 h，使细胞达70%~80%融合时进行转染。参照Lipofecttamine TM2000试剂说明书进行重组质粒pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-O-VP1转染试验。在培养箱中培养48h，检测转染水平，同时设置转染空质粒pcDNA3.1（+）和不转染质粒的细胞作为对照。

第六，基于猪瘟病毒和猪O型口蹄疫病毒二联核酸疫苗的研究及应用，动物性实验如下：

（1）经扩增培养pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-O-VP1后，制备大量无内毒素的pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-O-VP1质粒，免疫小白鼠，监测小白鼠血清中CSFV和FMDV特异性抗体水平。（2）免疫小白鼠，5~6周龄小白鼠（购自贵阳医学院）随机分成5组，分别为生理盐水空白组，pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-O-VP1真核质粒试验组，pcDNA3.1(+)空质粒试验组，猪瘟疫苗组和口蹄疫疫苗组。（3）免疫程序为：相同部位肌肉注射，在首免前2d注射0.25％普鲁卡因100μl/只，每组质粒免疫剂量为100μg/只，于首免后间隔14d加免一次。（4）分别于首免后0、7、14、21、28、35d小鼠血清，用间接ELISA法测定血清中CSFV和FMDV-O的抗体水平。（5）CSFV抗体阳性判定值为1.971，FMDV-O抗体阳性判定值为1.879。pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-O-VP1真核质粒刺激小鼠机体产生抗体水平出现很高的阳性水平。

第七，临床应用  

pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-O-VP1质粒接种免疫猪，监测其刺激猪产生的抗体水平，以验证方法的临床应用性。

通过第一至第七步骤的比较及验证，证实基猪瘟病毒和猪O型口蹄疫病毒二联核酸疫苗的研究及应用确实能使小鼠机体产生抗猪瘟病毒和猪O型口蹄疫病毒的高抗体水平。

Claims (1)

1.一种基于CSF-FMD二联基因工程疫苗的制备方法，其特征在于：包含以下步骤：

（1）猪瘟病毒病料CSFV-E2的RT-PCR扩增；猪O型口蹄疫病毒病料FMDV-O VP1的RT-PCR扩增；

（2）回收RT-PCR产物，与pMD19-T载体连接；将连接产物转化入大肠埃希氏菌DH5α感受态细胞培养，挑取上述转化平皿中的白色菌落，接种到含有氨苄青霉素的2×YT液体培养基中，振荡培养至混浊，提取质粒并进行酶切鉴定，筛选出阳性并进行测序；

（3）将所构建重组质粒pMD19-CSFV-E2与pcDNA3.1（+）载体分别进行BamH I和EcoR I双酶切，回收纯化目的片段，将二者用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化至DH5α感受态细胞，获得阳性重组质粒pcDNA3.1-CSFV-E2，利用试剂盒提取质粒，进行BamH I和EcoR I双酶切及PCR鉴定，并送测序验证；

（4）将所构建重组质粒pMD19-FMDV-O-VP1与pcDNA3.1-CSFV-E2分别进行BamH I和Hind                                                双酶切，回收纯化目的片段，将二者用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化至DH5α感受态细胞，获得阳性重组质粒pcDNA3.1-CSFV-E2-FMDV-O-VP1，利用试剂盒提取质粒，进行BamH I和Hind 双酶切及PCR鉴定，并送公司测序验证。