CN101481675A

CN101481675A - 一种抗猪瘟多表位dna疫苗及构建方法和应用

Info

Publication number: CN101481675A
Application number: CNA2009100604316A
Authority: CN
Inventors: 潘兹书; 万超; 张楚瑜
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Changzhou same Thai biopharmaceutical Polytron Technologies Inc
Priority date: 2009-01-06
Filing date: 2009-01-06
Publication date: 2009-07-15
Anticipated expiration: 2029-01-06
Also published as: CN101481675B

Abstract

本发明提供了一种抗猪瘟多表位DNA疫苗及构建方法和应用。通过筛选出CSFV E2和E^rns抗原区编码基因片段并与tPA信号肽融合，克隆到pVAX1真核表达载体构建了抗猪瘟多表位DNA疫苗。该疫苗为Escherichia coli DH5α(ptPAs/ΔE2/ΔE^rns)，CCTCC，M208254。抗猪瘟多表位DNA疫苗编码CSFV E2、E^rns囊膜糖蛋白主要抗原表位和tPA信号肽。能增强保护性抗原的表达量和分泌性；显著提高该DNA疫苗的免疫保护效果。该疫苗成本低廉、结构稳定、不需要冷链运输和低温保存、储存期长、安全有效等特点。这种抗猪瘟多表位DNA疫苗免疫接种猪能诱导产生针对猪瘟强毒株致死攻击的完全保护，并能加速免疫猪对感染病毒的清除，结合血清中猪瘟病毒特异性NS3抗体和/或猪瘟病毒基因组核酸的检测，能够广泛用于猪场中猪瘟净化、预防和根除。

Description

一种抗猪瘟多表位DNA疫苗及构建方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。本发明涉及一种由编码tPA信号肽核苷酸序列、编码猪瘟病毒石门株E2和E^rns蛋白抗原表位区核苷酸序列、抗原表位之间的连接序列和真核表达载体pVAX1构成的抗猪瘟多表位DNA疫苗，同时涉及抗猪瘟多表位DNA疫苗的构建方法，还涉及抗猪瘟多表位DNA疫苗在作为制备治疗或预防猪瘟药物中的应用。

技术背景

猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的、猪的一种高度致死性烈性传染病，呈世界性分布，给养猪业造成严重危害，经济损失巨大。国际兽医局(OIE)制定的《国际动物卫生法典》中，猪瘟被列入必须报告的法定传染病之一。我国也将猪瘟作为I类动物疫病加以重点控制。自50年代以来，我国自行研制的猪瘟兔化弱毒疫苗(“C”株)的广泛应用，在控制猪瘟大流行中发挥了重要作用。然而，猪瘟兔化弱毒疫苗五十多年的长期使用，并未能有效控制猪瘟的发生和传播。近年来，我国的猪瘟发生呈明显上升态势，并出现诸如散发流行、慢性猪瘟、持续感染和妊娠母猪带毒综合征等许多新特点。病毒逃避机体的免疫清除和在猪体内局部的持续存留，疫苗制品质量问题，运输和保存不当导致疫苗效力降低或失效，以及疫苗株毒力返强的回复突变等是其主要原因。在美国，通过实施对自然感染猪的诊断、扑杀等根除措施，已于1976年消灭了猪瘟；欧共体国家(EC)执行统一的猪瘟扑灭计划，为根除猪瘟，明确禁止使用猪瘟弱毒活疫苗接种；我国是农业大国，养猪业是广大农民经济收入的支柱产业之一。近年来因传染病死亡生猪占养猪总数的8％—10％，其中1/3由猪瘟所致。猪瘟的发生和流行，是制约农村养猪业发展的瓶颈，更是限制我国生猪和肉制品出口的主要原因之一。为满足我国对猪瘟预防、控制和最终根除的需要，研制新一代抗猪瘟疫苗制品以替代传统的猪瘟兔化弱毒疫苗，势在必行。

近年来发展起来的DNA疫苗，被誉为第三次疫苗革命。DNA疫苗新技术的核心是将编码病原体保护性抗原的核酸序列组装到含有必要表达调控元件的真核表达载体中，然后用其直接注射接种动物，利用动物细胞的酶系合成DNA疫苗编码的保护性抗原蛋白，经机体免疫系统的抗原加工和递呈，诱导机体产生针对该病原体的特异性免疫应答。编码病毒抗原基因的DNA疫苗接种既能诱导产生抗病毒抗体，阻止病毒感染发生，还可诱导T细胞的特异性细胞毒效应(CTL)，清除机体内病毒感染细胞。与常规的减毒活苗疫苗或灭活疫苗相比，DNA疫苗具有以下特点：1)只含有部分病毒基因组序列，不会因病毒毒力回复或灭活失败而导致疫苗病例；安全性类似灭活疫苗；2)抗原在细胞内表达，模拟了病毒感染后的抗原合成和递呈过程，可同时诱导抗原特异的体液和细胞免疫，保护效力类似于减毒活疫苗；3)通过特定抗体或病毒基因组核酸检测区分病毒自然感染和疫苗接种猪，是一种标记疫苗；4)安全稳定，无毒副作用；5)发酵、纯化等生产工艺简单，大规模制备成本很低；6)储存运输简单，储存时间长，无需冷链。

CSFV是基因组约12.3kb的正链RNA病毒，基因组编码一个3898个氨基酸组成的多聚蛋白，经病毒和/或宿主细胞编码的酶加工成12种成熟的病毒蛋白。研究证实，CSFV编码的12种蛋白中，囊膜糖蛋白E2和E^rns是主要的保护性抗原。目前已有构建CSFV E2单基因DNA疫苗的报道(余兴隆等，2000，Llilianne，2005)，但这种基于E2基因构建的DNA疫苗在猪体的免疫保护效力需要改进。

本发明在分析CSFV石门株的E2和E^rns抗原结构和表位序列的基础上，借鉴国内外CSFV分子生物学和免疫学研究的最新成果，借助计算机辅助设计与实验研究相结合，构建并筛选出由编码tPA信号肽、E2和E^rns抗原表位、以及两者之间加入柔性肽连接序列构成的、安全、有效的抗猪瘟多表位DNA疫苗。

本发明的优势在于：与已报道的CSFV E2 DNA疫苗相比较，抗猪瘟多表位DNA疫苗包含CSFV囊膜E2和E^rns的保护性抗原区域并将两者融合，增加了免疫保护性抗原表位；多表位疫苗能有效的应对病毒的变异和免疫反应中的某些不利因素；多表位疫苗通过串联不同抗原表位，可以选择诱导的免疫方式及提高免疫效果；通过引入tPA信号肽，增加了保护性抗原的表达量和分泌特性。该新型疫苗免疫接种能诱导机体产生更高水平的体液和细胞免疫应答，显著提高了疫苗的抗猪瘟效果，使其更具开发价值，可用于替代现行使用的猪瘟兔化弱毒疫苗，具有良好的开发应用前景。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种抗猪瘟多表位DNA疫苗，该疫苗成本低廉、结构稳定、不需要冷链运输和低温保存、储存期长、安全有效等特点。

本发明的另一个目的是在于提供了一种抗猪瘟多表位DNA疫苗构建方法。该疫苗具有制备简单，操作简便。

本发明的再一个目的是在于提供了一种抗猪瘟多表位DNA疫苗在作为制备治疗或预防猪瘟药物中控制和根除的应用。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种新型抗猪瘟多表位DNA疫苗，由编码tPA信号肽核苷酸序列、E2核苷酸序列和Erns抗原表位核苷酸序列、真核表达载体pVAX1、以及两两之间柔性肽连接序列构成，其特征在于：编码E2抗原区核苷酸序列位于猪瘟病毒基因组全长cDNA中第2371至2922位核苷酸，编码Erns抗原区核苷酸序列位于猪瘟病毒基因组全长cDNA中第1297-1764位核苷酸。DNA疫苗质粒的结构见图1。

一种新型抗猪瘟多表位DNA疫苗，其特征是：由tPA信号肽、E2抗原基因片段和Erns抗原基因片段构成的完整DNA疫苗核苷酸序列，具有SEQ ID NO.10所示核苷酸序列。

一种新型抗猪瘟多表位DNA疫苗，其特征是：由tPA信号肽、E2抗原基因片段和Erns抗原基因片段构成的完整DNA疫苗核苷酸编码的氨基酸序列，氨基酸序列具有SEQ ID NO.11所示氨基酸序列。

一种新型抗猪瘟多表位DNA疫苗，其特征是：Escherichia coli DH5α(ptPAs/ΔE2/ΔE^rns)，中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，M208254，保藏日期：2008年12月15日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。

一种新型抗猪瘟多表位DNA疫苗，其特征是：抗猪瘟多表位DNA疫苗作为制备治疗或预防猪瘟的药物在控制和根除中的应用。

本发明提供的抗猪瘟多表位DNA疫苗，由编码tPA信号肽、猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2、E^rns的抗原决定簇及两者之间由甘氨酸构成的柔性连接肽的核苷酸序列、以及真核表达载体pVAX1构成，其特征在于：所述抗猪瘟多表位DNA疫苗包含囊膜糖蛋白E2、E^rns主要抗原决定簇和tPA信号肽编码序列(SEQ ID NO.9)(序列的获得详见具体实施例1)。

在本发明的一个方面，提供了一种构建的DNA融合分子，它包括：编码具有猪瘟病毒囊膜糖蛋白E2和E^rns抗原区多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列分别为猪瘟病毒基因组中第2371至2922位核苷酸序列(SEQ ID NO.7)和从猪瘟病毒基因组中第1297至1764位核苷酸序列(SEQ ID NO.8)；所述的序列编码一个分子分泌型融合多肽核苷酸序列，该核苷酸具有SEQ ID NO.10所示的序列(详见具体实施例1)。

在本发明的另一方面，提供了一种真核重组质粒ptPAs/ΔE2/ΔE^rns，由上述构建的DNA融合分子和pVAX1真核表达载体构成(详见具体实施例1)。

在本发明的再一方面，提供了一种制备真核重组质粒ptPAs/ΔE2/ΔE^rns的方法(详见具体实施例1第7、8步骤和实施例4)，该重组质粒ptPAs/ΔE2/ΔErns编码多表位保护性抗原蛋白质序列(SEQ ID NO.11)(详见具体实施例1)和在预防、控制猪瘟中的应用(具体实施例3)。

本发明的ptPAs/ΔE2/ΔE^rns的核苷酸序列或其片断可以用重叠PCR和/或PCR扩增方法获得。根据本发明所公开的各种引物核苷酸序列，用猪瘟病毒标准石门株或地方分离株基因组RNA制备的cDNA为模板，扩增得到所需序列。然后按所公开的构建步骤，将其克隆到pVAX1真核表达载体，转化感受态大肠杆菌DH5a[天根生化科技(北京)有限公司产品，下同]，采用Omega小量质粒提取试剂盒(Plasmid Mini Kit I，D6943-01，Omega公司产品，下同)操作手册小量制备质粒，进行测序，验证DNA疫苗表达阅读框和序列正确，无碱基突变，即获得抗猪瘟多表位DNA疫苗。

抗猪瘟多表位DNA疫苗的大量制备按常规方法(Sambrook等人《分子克隆，实验手册》第三版。New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)进行(详见具体实施例4)。

附图说明

图1为一种抗猪瘟多表位DNA疫苗结构与组成示意图

图2为间接免疫荧光检测ptPAs/ΔE2/ΔErns转染细胞中重组蛋白(Erns抗原)表达：由图可知，本发明所构建提供的抗猪瘟多表位DNA疫苗能在真核细胞PK15(猪肾细胞系，A.重组质粒ptPAs/ΔE2/ΔE^rns转染PK细胞经免疫荧光染色观察；B.载体质粒pVAX1转染PK细胞经免疫荧光染色观察。来自中国典型培养物保藏中心，CTCC，下同)中表达Erns抗原。

图3Westernblot检测ptPAs/ΔE2/ΔErns重组蛋白(E2抗原)表达：由图可知，本发明所构建提供的抗猪瘟多表位DNA疫苗能在真核细胞PK15中表达E2抗原，包括在细胞内和分泌两种形式表达。1.pVAX1转染细胞裂解液；2.pVAX1转染细胞上清液；3.ptPAs/ΔE2/ΔE^rns转染细胞裂解液；4.ptPAs/ΔE2/ΔE^rns转染细胞上清液。

图4CSFV石门强毒株攻毒后，该DNA疫苗接种猪和对照实验猪体温变化曲线：由图可知，CSFV石门强毒株攻毒后试验猪体温变化曲线，“pVX1”表示pVAX1载体质粒接种猪体温变化；“ptPAs/ΔE2/ΔErns”表示DNA疫苗免疫接种猪体温变化。

对照组猪用CSFV石门强毒株攻毒后体温于第二天开始升高超过40℃，3头猪中2头在第三天超过41℃，并持续到死亡；另1头对照组猪体温持续在40-41℃之间，到第9天升高至41.2℃，持续至死亡。DNA疫苗免疫接种猪体温于第三天开始升高至40-40.3℃，持续2-4天后降至40℃以下，在第10天时体温全部恢复正常。

图5CSFV石门强毒株攻毒后白细胞数量变化：由图可知，经本发明所构建的抗猪瘟多表位DNA疫苗免疫接种猪在CSFV强毒攻击感染后白细胞数量保持在5-10×10⁹/L水平。接种pVAX1对照组猪体白细胞总数在每次计数时均显著低于疫苗免疫组约2倍左右，并持续降低。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照Sambrook等人《分子克隆，实验手册》第三版(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

具体实施例描述的方法步骤，本领域的普通技术人员不需付出创造性劳动均能顺利实施。所涉及的DNA疫苗质粒、工程菌株都可提供给本发明实施者。

实施例1 抗猪瘟多表位DNA疫苗及其制备方法

1.引物的设计、合成

根据猪瘟病毒石门株(为中国猪瘟病毒强毒标准株，来源中国兽医药品监察所)囊膜糖蛋白E2和E^rns.基因序列分析设计两对特异性引物，用于PCR扩增编码猪瘟病毒E2、E^rns主要抗原区的基因片段；根据编码人tPA信号肽的核苷酸序列设计一对特异性引物，用于PCR扩增编码tPA信号肽的核苷酸序列。各引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成；各引物的序列和编号如下：

1).E2抗原区PCR扩增引物

上游引物P1(+)(SEQ ID NO.1)：

5′-TCTCTTCACGGCTAGCCTGCAAGGAAGA-3′

下游引物P1(-)(SEQ ID NO.2)：

5′-CCGGATCCACCTCCGCCGGTACCGCCCCCCAACTTACAGTAGAATAGA-3′(在上游引物上加入8bp的tPA序列TCTCTTCA；在下游引物5′端引入酶切位点KpnI和BamHI，为了保证酶切效率加入CC)。

2).Erns抗原多表位PCR扩增引物

上游引物P2(+)(SEQ ID NO.3)

5′-GAGGTACCGGAGGTGGCAACTATACGTGCTGTAAGTTACAGA-3′(上游引物加入KpnI酶切位点GGTACC)

下游引物P2(-)(SEQ ID NO.4)

5′-CCGGATCCTTTGCTTCTACCCTCCAACC-3′

(下游引物加入BamHI酶切位点GGATCC)

3).tPA信号肽编码序列合成引物

上游引物P3(+)(SEQ ID NO.5)

5′-CGAAGCTTACCATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGA-3′(上游引物加入Hind III酶切位点AAGCTT)

下游引物P3(-)(SEQ ID NO.6)

5′-GCTAGCCGTGAAGAGATTTCGCTGGGCGAAACGAAGACTGCTCCACACAGCAGCA-3′(下游引物中包含8bp的E2序列GCCGATCG)

2.猪瘟病毒总RNA的提取及cDNA的合成

取200μl感染猪瘟病毒的猪全血或增殖CSFV的PK15细胞(如果是冻存样品则在室温下解冻)，用总RNA提取试剂盒(一步法总RNA抽提试剂盒，BSC51S1，上海华舜生物工程有限公司产品)，按试剂盒操作说明书介绍的方法提取病猪全血样品总RNA。提取的RNA溶于16μl焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的双蒸馏水中，加入1μl E2片段PCR扩增引物P1(-)(SEQ ID NO.2)，85℃，5min，迅速置冰浴5min，加入逆转录反应混合液：5×逆转录酶缓冲液(RT Buffer)5μl，核苷酸混合物(dNTPs)(10μM)0.5μl，核酸酶抑制剂(RNsin)0.5μl，逆转录酶(M-MLV)1μl。在PCR热循环仪上进行以下反应：42℃30分钟，95℃变性5分钟，置冰浴，冻存备用。

3.3.以步骤2合成的cDNA为模板，PCR分别扩增E2、E^rns抗原区编码基因片段cDNA序列(SEQ ID NO.7、8)；重叠PCR扩增tPA信号肽编码序列(SEQ IDNO.9)，具体反应条件如下：

1).E2抗原区编码序列扩增：

cDNA模板 1μl

P1(+)(10μM) 2μl

P1(-)(10μM) 2μl

dNTP(10μM) 2μl

10×PCR缓冲液 2.5μl

pfuDNA聚合酶(3U/μl) 1μl

灭菌双蒸水 9.5μl

用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：94℃变性3分钟，再94℃30秒，55℃30秒，70℃30秒进行30个循环。

2).E^rns抗原区编码序列扩增：

cDNA模板 1μl

P2(+)(10μM) 2μl

P2(-)(10μM) 2μl

dNTP(10μM) 2μl

10×PCR缓冲液 2.5μl

pfuDNA聚合酶(3U/μl) 1μl

灭菌双蒸水 9.5μl

3).tPA信号肽编码序列扩增：

P3(+)(10μM) 2μl

P3(-)(10μM) 2μl

dNTP(10μM) 2μl

10×PCR缓冲液 2.5μl

pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl

灭菌双蒸水 9.5μl

用移液器将上述组分混匀，在PCR热循环仪上进行以下反应：94℃变性3分钟，94℃10秒，55℃20秒进行30个循环。

(所用PCR试剂包括核苷酸混合物dNTPs、10×PCR缓冲液和pfu DNA聚合酶，均为Songon生物工程有限公司产品，下同)。

4.步骤3扩增的tPA信号cDNA序列和E2、E^rns抗原区基因cDNA序列的PCR产物，分别利用DNA纯化体系试剂盒(琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，W5211，上海华舜生物工程有限公司产品，按试剂盒说明书操作，下同)回收纯化目的DNA片段。

5.重叠PCR方法扩增tPAs/ΔE2融合片段。

扩增条件如下：

步骤4回收纯化tPA信号肽编码序列PCR产物 2μl

步骤4回收纯化E2抗原区编码序列PCR产物 2μl

dNTP(10μM) 2μl

10×PCR缓冲液 2.5μl

pfuDNA聚合酶(3U/μl) 1μl

灭菌双蒸水 9.5μl

94℃变性5分钟，然后94℃30秒，55℃30秒，70℃30秒进行10个循环扩增，然后向反应体系中加入引物P1(+)、P3(-)各2μl，在PCR热循环仪上进行以下反应：94℃变性3分钟，再94℃30秒，55℃30秒，70℃30秒进行30个循环，产物即为重组的tPAs/ΔE2融合片段，DNA纯化试剂盒回收产物DNA。

6.重组质粒DNA的构建步骤

1)将tPAs/ΔE2融合片段用限制性核酸内切酶BamHI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳，DNA纯化试剂盒回收DNA片段；用BamHI和HindIII双酶消化的pVAX1(Invitrogen公司产品)，琼脂糖凝胶电泳，DNA纯化试剂盒回收DNA片段，将双酶消化后的tPAs/ΔE2抗原区融合片段和pVAX1的质粒DNA片段按4:1比例混合，加入10×连接酶缓冲液1μl，T4 DNA连接酶1μl，补加灭菌双蒸馏水至总体积10μl，4℃连接过夜；连接产物用氯化钙(CaCl₂)法(分子克隆，实验手册》第三版)转化感受态大肠杆菌DH5a，挑选阳性重组子克隆，Omega小量质粒提取试剂盒提取质粒DNA，经酶切鉴定和核苷酸序列测定验证，获得重组质粒ptPAs/ΔE2；

2)将E^rns抗原区片段用限制性核酸内切酶KpnI和BamHI双酶消化，琼脂糖凝胶电泳，DNA纯化试剂盒回收DNA片段；用KpnI和BamHI双酶消化ptPAs/ΔE2质粒，琼脂糖凝胶电泳，DNA纯化试剂盒回收DNA片段，将KpnI和BamHI双酶消化后的E^rns抗原区片段和ptPAs/ΔE2质粒DNA片段按4:1比例混合，加入10×连接酶缓冲液1μl，T4DNA连接酶1μl，补加灭菌双蒸馏水至总体积10μl，4℃连接过夜；连接产物用CaCl₂法转化感受态大肠杆菌DH5a，挑选阳性重组子克隆，Omega小量质粒提取试剂盒提取质粒DNA，经酶切鉴定和核苷酸序列测定验证，获得编码分泌型多抗原表位融合多肽tPAs/ΔE2/ΔE^rns核苷酸序列(SEQ ID NO.10)的重组质粒ptPAs/ΔE2/ΔE^rns，，此即抗猪瘟多表位DNA疫苗质粒。

7.制备ptPAs/ΔE2/ΔE^rns工程菌DH5α

取DNA疫苗质粒ptPAs/ΔE2/ΔE^rns，用CaCl₂法转化感受态大肠杆菌DH5a，筛选获得阳性重组子，即获得含有重组质粒ptPAs/ΔE2/ΔE^rns的工程菌DH5a(具体实验操作按《分子克隆，实验手册》介绍的步骤进行)。

8.抗猪瘟多表位DNA疫苗的小量制备

本发明的抗猪瘟多表位DNA疫苗(ptPAs/ΔE2/ΔE^rns)用上述工程菌株DH5a制备。细菌培养按常规方法进行(按照Sambrook等人《分子克隆，实验手册》第三版)；采用Omega小量质粒提取试剂盒制备DNA疫苗质粒，具体按操作手册进行。步骤如下：

1)将ptPAs/ΔE2/ΔE^rns工程菌DH5α平板划线培养，形成单菌落，挑取单菌落接种5-10ml LB培养基37℃振摇培养过夜。

2)取1-5ml菌液至离心管中，10000×g离心10分钟或4000×g离心15分钟收集细菌。

3)加入200μl的溶液1(Solution I)[已加入核酸酶A(RNaseA)]，涡旋振荡器或移液器吹打重悬细菌。加入400μl的溶液2(Solution II)，颠倒混匀数次，让细菌充分接触溶液。加入350μl的溶液3(Solution III)，迅速颠倒充分混匀至出现白色沉淀(溶液1、2和3的配方见Sambrook等人《分子克隆，实验手册》第三版)。

4)10000-12000×g，4℃离心10分钟，去除蛋白质和染色体DNA。

5)小心吸取上清转移至干净的DNA结合柱中，室温(20-25℃，下同)10000-12000×g离心1分钟，使裂解液完全通过柱子；

6)去除废液，加入500μl的缓冲液HB(Buffer HB)洗涤DNA结合柱。室温条件下，10000-12000×g离心1分钟，去除废液并加入700μl的DNA洗涤缓冲液HB(Wash Buffer HB)，室温，10000-12000×g离心1分钟；重新加入700μl的DNA洗涤缓冲液HB，室温，10000-12000×g离心1分钟；室温13000×g离心2分钟彻底去除废液。

7)DNA结合柱转至干净的离心管中，加入30-50μl的洗脱缓冲液(ElutionBuffer)。室温，13000×g离心1分钟。收集虑过液，得到了ptPAs/ΔE2/ΔE^rns的DNA疫苗。取1.0μl在紫外分光光度计定量测定纯化质粒DNA含量，-70℃冻存备用。得到一种Escherichia coli DH5α(ptPAs/ΔE2/ΔE^rns)，中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，M208254。

实施例2 抗猪瘟多表位DNA疫苗功能检测(抗猪瘟多抗原表位DNA疫苗的抗原表达检测)，抗猪瘟多表位DNA疫苗作为制备治疗或预防猪瘟的药物在控制和根除中的应用。

用脂质体Lipofectamine200将ptPAs/ΔE2/ΔE^rns重组质粒转染PK15细胞(具体操作见《分子克隆，实验手册》)，同时设空载体pVAX1对照，36h后分别收获细胞和培养上清，采用间接免疫荧光检测E^rns抗原的表达；间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和免疫印渍(Westernblot)检测E2抗原PK15细胞培养上清和细胞裂解液中的表达。

1.间接免疫荧光检测PK-15细胞中重组蛋白tPAs/ΔE2/ΔE^rns(SEQ ID NO.11)(E^rns抗原)表达

所制备的DNA疫苗质粒ptPAs/ΔE2/ΔE^rns转染PK细胞，5％CO₂37℃培养72h后，细胞用甲醛丙酮(1:1)固定处理1h，然后用PBS洗涤3次，加入抗E^rns兔血清(一抗，1:1000)(抗E^rns兔血清由本实验室制备[具体方法见Chen L.et al，2007，Protein Expression and Purification，55：379-387])，37℃孵育1h，PBS洗涤3次，加入FITC标记的羊抗兔IgG(二抗，1:500，Pierce公司产品)，室温孵育1h，PBS洗涤后于倒置荧光显微镜观察。转染DNA疫苗质粒ptPAs/ΔE2/ΔE^rns的PK15细胞能与特异性E^rns多克隆抗体反应，呈绿色荧光(图2A)，转染载体质粒pVAX1的PK15不与E^rns多克隆抗体反应，无荧光(图2B)。

2.间接ELISA法检测PK-15细胞中重组蛋白tPAs/ΔE2/ΔE^rns(SEQ ID NO.11)(E2抗原)表达

1)样品处理将转染重组质粒ptPAs/ΔE2/ΔE^rns和对照质粒pVAX1的PK15细胞，5％CO₂，37℃培养36h后，分别收获细胞培养上清和细胞，PK15细胞用刮刷收集，用250μl PBS重悬。上清液真空冻干，加入250μl PBS溶解，用作抗原包被液。

2)间接ELISA检测

(1)包被：将上述制备的上清液和细胞裂解液分别用PBS进行1∶1稀释，加入96孔ELISA板，每孔100μl，4℃包被过夜，用洗液PBST(0.05％Tween 20的磷酸盐缓冲液，下同)洗涤6次，5min/次，滤纸吸干。

(2)封闭：每孔加封闭液300μl[封闭液组成：含3％牛血清蛋白(BSA)的PBST]，37℃条件下封闭60min后，洗涤6次。

(3)与一抗反应：一抗为小鼠抗CSFV E2单克隆抗体(见Weiland，E.等Veterinary Microbiology，1995，47：111-118.)，一抗用含1％牛血清蛋白(BSA)的PBST按1：1000倍稀释，每孔加100μl，37℃作用1h后，洗涤6次。

(4)与酶标二抗反应：酶标二抗为HRP(辣根过氧化物酶，下同)标记羊抗鼠IgG抗体(31432，Pierce公司产品)，按1:5000稀释，每孔加入100μl，37℃温箱内作用1h后，洗涤6次。

(5)加底物溶液：每孔加入100μl显色液[含0.004％邻苯二胺(OPD)和0.045％双氧水(H₂O₂)]，37℃避光显色10min，用2摩尔硫酸(2M H₂SO₄)终止反应，20min内测定OD₄₉₂光密度值。

(6)OD₄₉₂值的测定：用自动酶标测定仪在波长492nm处，测定每孔内光密度吸收值(OD₄₉₂)。每份样品平行做3孔，取其平均值。

结果表明，ptPAs/ΔE2/ΔE^rns转染PK15细胞培养上清和细胞裂解液OD₄₉₂值是pVAX1质粒转化PK细胞对照组的2-3倍(p<0.05)(表1)，表明该多表位DNA疫苗在PK细胞中以细胞内和分泌两种形式表达融合蛋白。

表1 ELISA检测重组蛋白(E2抗原)在PK细胞中的表达

检测样品	OD₄₉₂(Mean±SD)
检测样品	OD₄₉₂(Mean±SD)	ptPAs/ΔE2/ΔE^rns转染PK细胞裂解液	0.533±0.020
ptPAs/ΔE2/ΔE^rns转染PK细胞上清液	0.722±0.026	ptPAs/ΔE2/ΔE^rns转染PK细胞裂解液	0.533±0.020
ptPAs/ΔE2/ΔE^rns转染PK细胞上清液	0.722±0.026	pVAX1转染PK细胞裂解液	0.216±0.010
pVAX1转染PK细胞上清液	0.245±0.010	pVAX1转染PK细胞裂解液	0.216±0.010

3.免疫印渍(Western blot)检测PK15细胞中重组蛋白(SEQ ID NO.11)(E2抗原)的表达

(1)样品处理将转染重组质粒ptPAs/ΔE2/ΔE^rns和对照质粒pVAX1的PK15细胞，5％ CO₂，37℃培养36h后，分别收获细胞培养上清和细胞，细胞用刮刷收集，用200μl PBS重悬。上清液真空冻干，加入200μl PBS溶解。取200μl细胞重悬液和上清冻干粉重悬液，分别加入等体积样品缓冲液(Loading buffer)(组分见《分子克隆，操作手册》第三版)混匀，100℃煮沸5分钟，冷却备用。

(2)制胶按下列体积和顺序依次加入各组分，分别配制分离胶和浓缩胶。

分离胶(10％)

1.5mol/L Tris(pH8.0) 1.3ml

30％丙烯酰胺 2ml

dH₂O 1.6ml

10％AP 0.05ml

10％SDS 0.05ml

TEMED 2μl

浓缩胶(5％)

1.5mol/L Tris(pH6.8) 0.25ml

30％丙烯酰胺 0.33ml

ddH2O 1.4ml

10％AP 0.02ml

10％SDS 0.02ml

TEMED 2μl

先将分离胶灌入，胶面至距离顶端约1.5cm，缓缓加入1ml双蒸馏水于上层压封凝胶，室温静置待胶体凝固，倒出双蒸馏水，滤纸吸干，然后灌入浓缩胶(灌注前配制)，同时插入样品梳，室温静置待胶体凝固，取出样品梳备用。

(3)上样分别取处理好的蛋白样品10μl加入浓缩胶样品槽中，确保各样品槽中加样体积相等。

(4)电泳50V电泳30分钟，调节电压至100V继续电泳，直到溴酚蓝距底线0.5cm处停止电泳，取出凝胶，清水洗涤。

(5)转膜取硝酸纤维素(NC)膜、海绵和滤纸分别用转膜缓冲液(transfer buffer)浸泡5分钟，按阴极-海绵-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-海绵-阳极顺序铺设凝胶和NC膜，放入电泳槽，采用88V电压，4℃条件下电泳3h。

(6)封闭取出NC膜，用1×PBST洗涤3-5分钟，加入含5％脱脂奶粉的PBST的封闭缓冲液(blocking buffer)，37℃，孵育2h。

(7)与一抗反应用PBST洗NC膜3次，每次5分钟。加入一抗(兔抗CSFV E2多克隆抗体，用PBST进行1:1000倍稀释)，37℃，孵育1h。

(8)与二抗反应PBST洗NC膜3次，每次5分钟。加入HRP标记羊抗兔IgG抗体(二抗，31460，Pierce公司产品，用PBST作1:2500倍稀释)，37℃孵育1h，4℃或室温摇1h。

(9)显色PBST洗涤NC膜3次，每次5分钟。加入二氨基联苯胺(DAB)显色液(具体配方见《分子克隆，实验手册》)，室温避光显色5-10分钟，清水洗NC膜后拍照保存(图2)。

实施例3 抗猪瘟多表位DNA疫苗猪体免疫效力检测

将所构建的抗猪瘟多表位DNA疫苗质粒溶解于灭菌的PBS(pH7.2)，稀释至DNA终浓度为1mg/ml；用于猪体免疫接种。

1.猪体免疫接种

2月龄CSFV血清抗体阴性猪6头，随机分成两组，每组3头猪，试验组用DNA疫苗ptPAs/ΔE2/ΔE^rns免疫；对照组用载体质粒pVAX1免疫。具体地，试验前选取新生未进行猪瘟疫苗免疫接种的4周龄健康仔猪，前腔静脉采血分离血清，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测猪瘟病毒E2抗体，E2抗体阴性仔猪分栏饲养，至8周龄再次采血检测猪瘟病毒E2抗体，挑选E2抗体阴性、健康状况良好的仔猪，随机分组，每组3头，做好标记，用于DNA疫苗免疫接种。

试验组：将纯化的DNA疫苗质粒ptPAs/ΔE2/ΔE^rns溶解于灭菌的PBS(pH7.2)中，稀释至终浓度1mg/mL，用力振荡混匀，采用股四头肌、左右胸头肌和耳朵皮内多点接种，每点200μL，共1mL。免疫3次，每次间隔15天。

对照组：将纯化的pVAX1质粒分别溶解于灭菌的PBS(pH7.2)，稀释至终浓度1mg/mL，用力振荡混匀，采用股四头肌、左右胸头肌和耳朵皮内多点接种，每点200μL，共1mL。免疫3次，每次间隔15天。

2.猪体攻毒

最后一次免疫后第15天，以3×10⁵TCID₅₀剂量的CSFV强毒石门株，采用肌肉途径注射攻毒，攻毒后每日用体温计测量各试验猪体温变化，并于攻毒后第0、4、8和12天采血，取20μl用于计数白细胞数量；剩余全血分离血清，检测血清中和抗体效价。

1)白细胞计数方法

取20μl猪全血加入到380μl 3％的冰醋酸稀释液中，混匀，室温静置20分钟，取10μl滴入盖有干净盖玻片的细胞计数板，使稀释的细胞悬液充满盖玻片下面的计数室。待白细胞下沉后，将计数板置于显微镜低倍镜下，数出位于计数室四角的4个大方格(每个大方格分16个中方格)中的白细胞的总数。计数时，要注意显微镜的载物台应平置，以免血细胞向一边集中。

计算方法(血液稀释倍数1:20)

细胞数(细胞/ml)＝(数得细胞数/4)×10⁴×20(细胞/ml)

细胞数(细胞/L)＝(数得细胞数/4)×10⁴×20×10³(细胞/L)

2)中和抗体检测方法

按2×10⁶细胞/ml浓度将PK15细胞悬液接种平底微量96孔培养板中(100μl/孔)；5％ CO₂37℃培养至细胞形成70％-80％单层，将待检血清56℃灭活30分钟，用无血清EMEM培养液作2倍系列稀释；将稀释的待检血清与含200TCID₅₀/0.1mL的猪瘟病毒悬液等体积混合，置37℃孵育1-2h；用无血清DMEM培养基(SH30002.01，HyClone公司产品)洗涤PK15细胞单层，然后，加入血清病毒混合物，37℃孵育1h，吸出血清病毒混合物，加入含2％小牛血清的DMEM培养液(小牛血清，2600202，HyClone公司产品)，37℃继续培养48-72h；按前述的间接免疫荧光法检测PK15细胞中是否有CSFV病毒增殖，计算血清的病毒中和效价(每份血清样品重复2次实验)。具体地，将接种了CSFV与血清中和混合物的PK15细胞，用100％丙酮固定在盖玻片上。依次加入一抗(小鼠抗CSFV E2单克隆抗体，1：100)、二抗(兔抗猪IgG/FITC，B649019，上海沪尚生物科技有限公司，1:100)进行抗原抗体免疫反应，Olympus倒置荧光显微镜观察。PK15细胞呈绿色荧光为阳性反应。以血清的最高稀释倍数并能中和CSFV感染(无荧光染色反应)作为血清的中和效价。

3.猪体试验结果

1)CSFV石门强毒感染攻毒后猪体温变化

对照组猪用CSFV石门强毒株攻毒后体温于第二天开始升高超过40℃，3头猪中2头在第三天超过41℃，并持续到死亡；另1头对照组猪体温持续在40-41℃之间，到第9天升高至41.2℃，持续至死亡。DNA疫苗免疫接种猪体温于第三天开始升高至40-40.3℃，持续2-4天后降至40℃以下，在第10天时体温全部恢复正常(图3)。

2)CSFV石门强毒感染攻毒后猪血清中和抗体效价

试验组和对照组猪于攻毒后第0，4，8，12天的中和抗体效价见表2(其中，N表示采血时猪已死亡，无检测结果)。

表2 实验猪攻毒前后血清中和抗体效价

3)CSFV石门强毒感染攻毒后第0，4，8，12天猪的白细胞数量变化如图4。该DNA疫苗免疫组试验猪外周血白细胞数量在5-10×10⁹水平；pVAX1对照组试验猪白细胞显著减少(约减少2倍，并持续减少)；

4)CSFV石门强毒感染攻毒后猪的存活情况

对照组3头猪用CSFV石门强毒株攻毒后分别在第3，10和11天死亡；DNA疫苗免疫接种3头猪全部成活(表3)。

表3 试验组与对照组猪强毒攻毒后存活情况

实施例4 抗猪瘟多表位DNA疫苗大量提取及纯化

抗猪瘟多抗原表位DNA疫苗大量提取及纯化(具体方法见《分子克隆，实验手册》第三版)。

1)将ptPAs/ΔE2/ΔE^rns工程菌DH5α平板划线培养，形成单菌落，挑取菌落接种5-10ml LB培养基37℃振摇培养8h，然后按培养物：LB＝1:1000接种于1000mlLB培养基中，37℃摇动培养14h。

2)用50ml的离心管收集菌液，5000rpm，离心10min，弃上清，可用多管多次收集。加入10ml溶液1(Solution I)重悬细菌，合并成两管(10ml/管)；每管加入20ml溶液2(SolutionII)，轻轻旋转，颠倒充分混匀4-6次，室温放置不超过5min；每管加入冰预冷的溶液3(Solution III)15ml，迅速轻轻颠倒混匀4-6次，冰上放置20min，以促进沉淀形成。

3)4℃，13000rpm，离心30min，转移上清至另一支干净离心管中，4℃，13000rpm，离心15min；转移上清至另一支干净离心管中，加入60％体积的(18ml)异丙醇(室温)，混匀，室温放置10min，15000rpm，离心30min，缓慢地倒出上清(切勿将管底的DNA沉淀一并弃去)；用70％的冰乙醇20ml洗涤沉淀物，合并至一支离心管中，15000rpm，离心10min，缓慢地倒出上清，充分晾干；

4)加入3ml37℃预热的1×TE溶液，37℃温育15min；加入等体积冰预冷的5摩尔(5M)氯化锂(LiCl)溶液，充分混匀，4℃，10000rpm，离心10min；转移上清至另一支干净离心管中，加入等体积(6ml)异丙醇沉淀质粒DNA，室温条件下，10000rpm，离心10min；弃尽上清，加入70％冰预冷乙醇10ml洗涤沉淀物，15000rpm，离心5min，充分晾干；

5)加入1ml 37℃预热的1×TE溶液(pH8.0)，37℃温育15min，分装于2支1.5离心管中；每管加入RNase A 50μl(200μl/ml)，37℃温育30min；取出，加入含13％(W/V)聚乙二醇8000(PEG8000)的1.6M氯化钠(NaCl)溶液500μl，充分混匀，室温静置20min，12000rpm，离心5min，弃上清，回收沉淀的质粒DNA；

6)用400μl 37℃预热的1×TE溶液溶解质粒DNA，37℃温育15min；加入等体积的酚:氯仿(200μl:200μl，氯仿:异戊醇＝24:1(v/v))，充分混匀，12000rpm，离心10min；转移上层水相至另一支干净离心管中，加入等体积的氯仿:异戊醇＝24:1(v/v)400μl，充分混匀，12000rpm，离心10min；转移上层水相至另一支干净离心管中，加入1/10体积(40μl)3M的醋酸钠(NaAc)溶液，充分混匀，再加入2倍体积(800μl)冰预冷的无水乙醇，轻轻混匀，冰浴10min，4℃，12000rpm，离心5min，弃尽上清，回收质粒DNA；加入4℃预冷的70％的乙醇200μl，振荡混匀，4℃，12000rpm，离心5min，重复此步骤3次；吸除残余乙醇，室温充分晾干；

7)加入1ml 37℃预热的1×TE溶液溶解凉干的DNA，37℃温育30min，混匀，获得纯化的DNA疫苗制品。取1.0μl电泳检测DNA纯度；取1.0μl紫外分光光度计定量测定DNA浓度，分装DNA，-70℃保存备用。

SEQUENCELISTING

<110>武汉大学

<120>一种抗猪瘟多表位DNA疫苗及构建方法和应用

<130>一种抗猪瘟多表位DNA疫苗及构建方法和应用

<160>11

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>1

<210>2

<211>48

<212>DNA

<213>人工合成

<400>2

<210>3

<211>42

<212>DNA

<213>人工合成

<400>3

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工合成

<400>4

<210>5

<211>59

<212>DNA

<213>人工合成

<400>5

<210>6

<211>55

<212>DNA

<213>人工合成

<400>6

<210>7

<211>81

<212>DNA

<213>人

<400>7

<210>8

<211>651

<212>DNA

<213>猪瘟病毒

<400>8

<210>9

<211>468

<212>DNA

<213>猪瘟病毒

<400>9

<210>10

<211>1113

<212>DNA

<213>人工合成

<400>10

<210>11

<211>403

<212>PRT

<213>人工合成

<400>11

Claims

1.一种抗猪瘟多表位DNA疫苗，其特征是：Escherichia coli DH5α(ptPAs/ΔE2/ΔE^rns)，CCTCC，M208254。

2.一种分离的融合基因，其序列为SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列。

3.一种分离的融合多肽，其序列为SEQ ID NO.11所示的氨基酸序列。

4.一种制备权利要求1所述的抗猪瘟多表位DNA疫苗的方法，包括下列步骤：

A.引物的设计、合成：

B.猪瘟病毒总RNA的提取及cDNA的合成：

取200μl感染猪瘟病毒的猪全血或增殖CSFV的PK15细胞，用总RNA提取试剂盒，提取病猪全血样品总RNA，提取的RNA溶于16μl焦碳酸二乙酯处理过的双蒸馏水中，加入1μl E^rns片段PCR扩增引物P2(+)，85℃，5min，置冰浴5min，加入逆转录反应混合液：5×逆转录酶缓冲液5μl，核苷酸混合物0.5μl，核酸酶抑制剂0.5μl，逆转录酶1μl，在PCR热循环仪上进行以下反应：42℃30分钟，95℃变性5分钟，置冰浴，冻存备用；

C.以步骤B合成的cDNA为模板，PCR分别扩增E2、E^rns抗原区基因片段

cDNA序列；重叠PCR扩增tPA信号肽cDNA序列；

D.步骤C扩增的tPA信号cDNA序列和E2、Erns抗原区基因cDNA序列的PCR产物，分别利用DNA纯化体系试剂盒回收纯化目的DNA片段；

E.重叠PCR方法扩增tPAs/ΔE2融合片段：

扩增条件如下：

步骤D回收纯化tPA信号肽编码序列PCR产物 2μl

步骤D回收纯化E2抗原区编码序列PCR产物 2μl

dNTP(10μM) 2μl

10×PCR缓冲液 2.5μl

pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl

灭菌双蒸水 9.5μl

F.重组质粒DNA的构建步骤：

1)将tPAs/ΔE2融合片段用限制性核酸内切酶BamHI和HindIII双酶切，琼脂糖凝胶电泳，DNA纯化试剂盒回收DNA片段；用BamHI和HindIII双酶消化的pVAX1，琼脂糖凝胶电泳，DNA纯化试剂盒回收DNA片段，将双酶消化后的tPAs/ΔE2抗原区融合片段和pVAX1的质粒DNA片段按4:1比例混合，加入10×连接酶缓冲液1μl，T4 DNA连接酶1μl，补加灭菌双蒸馏水至总体积10μl，4℃连接过夜；连接产物用氯化钙法转化感受态大肠杆菌DH5a，挑选阳性重组子克隆，Omega质粒提取试剂盒提取质粒DNA，经酶切鉴定和核苷酸序列测定验证，获得重组质粒ptPAs/ΔE2；

2)将E^rns抗原区片段用限制性核酸内切酶KpnI和BamHI双酶消化，琼脂糖凝胶电泳，DNA纯化试剂盒回收DNA片段；用KpnI和BamHI双酶消化ptPAs/ΔE2质粒，琼脂糖凝胶电泳，DNA纯化试剂盒回收DNA片段，将KpnI和BamHI双酶消化后的E^rns抗原区片段和ptPAs/ΔE2质粒DNA片段按4:1比例混合，加入10×连接酶缓冲液1μl，T4 DNA连接酶1μl，补加灭菌双蒸馏水至总体积10μl，4℃连接过夜；连接产物用CaCl₂法转化感受态大肠杆菌DH5a，挑选阳性重组子克隆，Omega质粒提取试剂盒提取质粒DNA，经酶切鉴定和核苷酸序列测定验证，获得重组质粒ptPAs/ΔE2/ΔE^rns，抗猪瘟多表位DNA疫苗质粒；

G.制备ptPAs/ΔE2/ΔE^rns工程菌DH5α：

取DNA疫苗质粒ptPAs/ΔE2/ΔE^rns，用CaCl₂法转化感受态大肠杆菌DH5a，筛选获得阳性重组子，获得含有重组质粒ptPAs/ΔE2/ΔE^rns的工程菌DH5a；

H.抗猪瘟多表位DNA疫苗的制备：其步骤是：

1)将ptPAs/ΔE2/ΔE^rns工程菌DH5α平板划线培养，形成单菌落，挑取单菌落接种5-10ml LB培养基37℃振摇培养过夜；

2)取1-5ml菌液至离心管中，10000×g离心10分钟或4000×g离心15分钟收集细菌；

3)加入200μl的溶液1，涡旋振荡器或移液器吹打重悬细菌，加入400μl的溶液2，颠倒混匀，让细菌接触溶液，加入350μl的溶液3，颠倒充分混匀至出现白色沉淀；

4)10000-12000×g，4℃离心10分钟，去除蛋白质和染色体DNA；

5)吸取上清转移至干净的DNA结合柱中，室温10000-12000×g离心1分钟，使裂解液完全通过柱子；

6)去除废液，加入500μl的缓冲液HB洗涤DNA结合柱，室温条件下，10000-12000×g离心1分钟，去除废液并加入700μl的DNA洗涤缓冲液HB，室温，10000-12000×g离心1分钟；重新加入700μl的DNA洗涤缓冲液HB，室温，10000-12000×g离心1分钟；室温13000×g离心2分钟彻底去除废液；

7)DNA结合柱转至干净的离心管中，加入30-50μl的洗脱缓冲液，室温，13000×g离心1分钟，收集虑过液，得到了ptPAs/ΔE2/ΔE^rns的DNA疫苗。

5.权利要求1所述的一种抗猪瘟多表位DNA疫苗(ptPAs/ΔE2/ΔE^rns)在制备治疗或预防猪瘟的药物中的应用。