具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐明本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照Sambrook等《分子克隆,实验手册》第三版(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2001,下同)中所述的条件。
具体实施例描述的方法步骤,本领域的普通技术人员不需付出创造性劳动均能顺利实施。所涉及的细胞系、抗猪瘟和乙脑双价疫苗嵌合缺失突变体感染性cDNA克隆和双价疫苗病毒株都可提供给本发明实施者。
实施例1非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗制备方法
1.引物的设计合成
根据CSFV石门株全长基因组序列(Genbank No.AF092448)、JEV E蛋白编码序列(GenBank No.AB510530.1)、FMDV 2A编码序列(GenBank No.M95781.1)和泛素蛋白Ubi序列(GenBank No.XM_002344708.1),设计合成各种RT-PCR或PCR扩增引物。各引物由Invitrogen公司合成。
各引物序列和编号如下:
1).E2上游片段(770-2440nt)PCR扩增引物
上游引物P1(SEQ ID NO.1):5′-GTGTGCATCGATGGTTGCATACTGC-3′
下游引物P2(SEQ ID NO.2):
5′-CCAATGGTAAGCCTTGTGCCCCAGTTACTAGTAGC-3′
(扩增产物5′端含有ClaI位点)
2).E2下游片段(3560-4461nt)PCR扩增引物
上游引物P3(SEQ ID NO.3)
5′-GGCACAAGGCTTACCATTGGGCCAGGGTGAGGTAG-3′
(引物P2,P3含有重叠区域,见下划线序列)
下游引物P 4(SEQ ID NO.4):5′-GGCAACATGGTACCTGTTATTGAAC-3′
(扩增产物3′端含有KpnI位点)
3).5′非编码区及含Npro前63个核苷酸的PCR扩增引物
上游引物P5(SEQ ID NO.5)
5′-AAGTGCCACCTGACGTCGACAGATC-3′
下游引物P6(SEQ ID NO.6)
5′-GGTTGTGCCTTTCTCCACTCCCATTGG-3′
(扩增产物5′端含有SalI位点)
4).JEV E蛋白抗原表位编码核苷酸(E蛋白第292-402氨基酸)(GenbankNo.AF092448)
的PCR扩增引物
上游引物P7(SEQ ID NO.7)
5′-GTGGAGGACAAACTGGCTCTGAAAGGC-3′
下游引物P8(SEQ ID NO.8)
5′-CTTGAGAAGGTCAAAGCGTGCTTCCAGCTTTG-3′
5).2AUbi片段的PCR扩增引物
上游引物P9(SEQ ID NO.9)
5′-CTTTGACCTTCTCAAGAACTTTGACCTTCTC-3′
下游引物P10(SEQ ID NO.10)
5′-ATGATTCAACTCCATTCCACCGCGGAG-3′
6).CSFV Npro蛋白N端编码区(位于基因组第374-796nt)PCR扩增引物
上游引物P11(SEQ ID NO.11):5′-GGAATGGAGTTGAATCATTTTGAAC-3′
下游引物P12(SEQ ID NO.12):5′-CAGCAGTATGCAACCATCGATGC-3′
(下游3′端引入ClaI位点便于cDNA克隆操作)
2.JEV基因组RNA提取及cDNA合成
取JEV感染的乳鼠脑组织,切成小块,低温条件下研磨,用总RNA提取试剂盒(一步法总RNA抽提试剂盒,BSC51S1,上海华舜生物工程有限公司产品),按试剂盒操作说明书介绍的步骤提取总RNA(包括JEV基因组RNA)。将提取的RNA溶于17μl DEPC处理过的水中,加入1μl JEV E基因逆转录引物(即E基因片段下游PCR扩增引物,SEQ ID NO.8),85℃,5min,迅速置冰浴5min,加入逆转录混合液:5×逆转录酶缓冲液(RT Buffer)5μl,dNTPs(10μM)0.5μl,RNsin 0.5μl,M-MLV 1μl。在PCR热循环仪上进行以下反应:42℃60min,95℃变性5min,置冰浴,获得JEV cDNA模板,-70℃冻存备用。
3.PCR扩增
以CSFV石门株感染性cDNA克隆质粒pT7SM(病毒学报,2005,43-47)为模板,PCR分别扩增E2基因两端序列及含有重叠序列的目的片段,各目的片段的构成、扩增反应体系和具体反应条件如下:
1).E2上游1671bp编码序列(位于CSFV基因组中770-2440nt)扩增:
CSFV cDNA模板(pT7SM) 1μl
P1(10μM) 2μl
P2(10μM) 2μl
dNTP(10μM) 2μl
10×PCR缓冲液 2.5μl
pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl
灭菌双蒸水 9.5μl
用移液器将上述组分混匀,在PCR热循环仪上进行以下反应:94℃变性3min,再94℃30Sec,55℃30Sec,72℃120Sec进行30个循环。
所用PCR试剂包括单核苷酸混合物dNTPs、10×PCR缓冲液和pfu DNA聚合酶,均为Songon生物工程有限公司产品,下同。
2).E2下游902bp编码序列(位于CSFV基因组中位置第3560-4461nt)扩增:
cDNA模板(pT7SM) 1μl
P3(10μM) 2μl
P4(10μM) 2μl
dNTP(10μM) 2μl
10×PCR缓冲液 2.5μl
pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl
灭菌双蒸水 9.5μl
用移液器将上述组分混匀,在PCR热循环仪上进行以下反应:94℃变性3min,再94℃30Sec,55℃30Sec,72℃60Sec进行30个循环。
3).5′非编码区及含Npro前63个核苷酸序列的PCR扩增:
cDNA模板(pT7SM) 1μl
P5(10μM) 2μl
P6(10μM) 2μl
dNTP(10μM) 2μl
10×PCR缓冲液 2.5μl
pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl
灭菌双蒸水 9.5μl
用移液器将上述组分混匀,在PCR热循环仪上进行以下反应:94℃变性3min,再94℃30Sec,55℃30Sec,72℃30Sec进行30个循环。
4).JEV E蛋白抗原区(第292-402位氨基酸)编码核苷酸的PCR扩增
cDNA模板(步骤2制备的cDNA)1μl
P7(10μM) 2μl
P8(10μM) 2μl
dNTP(10μM) 2μl
10×PCR缓冲液 2.5μl
pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl
灭菌双蒸水 9.5μl
用移液器将上述组分混匀,在PCR热循环仪上进行以下反应:94℃变性3min,再94℃30Sec,55℃30Sec,72℃30Sec进行30个循环。
5).2AUbi片段的PCR扩增
DNA模板(Invitrogen公司合成的2AUbiDNA) 1μl
P9(10μM) 2μl
P10(10μM) 2μl
dNTP(10μM) 2μl
10×PCR缓冲液 2.5μl
pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl
灭菌双蒸水 9.5μl
用移液器将上述组分混匀,在PCR热循环仪上进行以下反应:94℃变性3min,再94℃30Sec,55℃30Sec,72℃30Sec进行30个循环。
6).CSFV Npro蛋白N端编码区(位于基因组第374-796nt)PCR扩增
cDNA模板(pT7SM) 1μl
P11(10μM) 2μl
P12(10μM) 2μl
dNTP(10μM) 2μl
10×PCR缓冲液 2.5μl
pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl
灭菌双蒸水 9.5μl
用移液器将上述组分混匀,在PCR热循环仪上进行以下反应:94℃变性3min,再94℃30Sec,55℃30Sec,72℃60Sec进行30个循环。
4.回收产物
将步骤3扩增获得的各种PCR产物利用DNA纯化体系试剂盒(琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒,W5211,上海华舜生物工程有限公司产品)回收纯化PCR产物;分别得到步骤3.1~6)的PCR产物1~6。
5.重叠PCR
1).缺失E2的E2上、下游相邻序列连接DNA片段的重叠PCR扩增
扩增体系和反应条件如下:
步骤4回收纯化E2上游序列PCR产物 2μl
步骤4回收纯化E2下游序列PCR产物 2μl
dNTP(10μM) 2μl
10×PCR缓冲液 2.5μl
pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl
灭菌双蒸水 9.5μl
94℃变性5min,然后94℃30Sec,55℃30Sec,72℃30Sec进行10个循环扩增,然后向反应体系中加入引物P1、P4各2μl,在PCR热循环仪上进行以下反应:94℃变性3min,再94℃30Sec,55℃30Sec,72℃120Sec进行30个循环,产物即为缺失E2基因的两侧相邻序列连接DNA融合片段。
2).含Npro前63个核苷酸的CSFV 5′端、JEV E蛋白抗原表位、2AUbi基因和NproN端编码区的重叠大片段PCR扩增
扩增体系和反应条件如下:
步骤4回收纯化的PCR产物3 1μl
步骤4回收纯化的PCR产物4 1μl
步骤4回收纯化的PCR产物5 1μl
步骤4回收纯化的PCR产物6 1μl
dNTP(10μM) 2μl
10×PCR缓冲液 2.5μl
pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl
灭菌双蒸水 9.5μl
用移液器将上述组分混匀,在PCR热循环仪上进行以下反应:94℃变性5min,然后94℃30Sec,55℃30Sec,72℃30Sec进行10个循环扩增,然后向反应体系中加入引物P5、P12各2μl,在PCR热循环仪上进行以下反应:94℃变性3min,再94℃30Sec,55℃30Sec,72℃240Sec进行30个循环,产物即为由CSFV 5′非编码区及含Npro前63个核苷酸、乙脑E蛋白部分核苷酸、2AUbi和Npro蛋白N端编码区融合构成的DNA片段。
6.CSFV E2基因缺失的感染性cDNA克隆质粒p7SMdelE2的构建
1).用限制性核酸内切酶ClaI和Kpn1双酶消化步骤5.1)制备的E2基因两侧序列融合片段,琼脂糖凝胶电泳,DNA回收试剂盒(W5211,上海华舜生物工程有限公司产品)回收DNA片段(按试剂盒说明书操作);
2).用ClaI和Kpn1双酶消化的CSFV全长感染性cDNA克隆质粒pT7SM,琼脂糖凝胶电泳,DNA回收试剂盒回收目的DNA片段(按试剂盒说明书操作);
3).将上述步骤1)和2)回收片段按4∶1摩尔比例混合,取混合物5μl,加入10×T4DNA连接酶缓冲液1μl,T4DNA连接酶1μl,补加灭菌双蒸水至总体积10μl,混合,4℃连接过夜;
4).连接产物转化CaCl2法制备的感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性重组子克隆,提取质粒DNA,经酶切分析和核苷酸序列测定验证,获得重组质粒p7SMdelE2;
7.表达JEV E蛋白抗原表位的CSFV E2基因缺失感染性cDNA克隆重组质粒p7SMdelE2/JEV-ΔE的构建
1).将E2基因缺失的重组质粒p7SMdelE2用限制性核酸内切酶SalI和ClaI双酶消化,琼脂糖凝胶电泳,DNA回收试剂盒回收目的DNA片段(按试剂盒说明书操作);
2).用SalI和ClaI双酶消化上述步骤5.2)制备的融合DNA片段,琼脂糖凝胶电泳,DNA回收试剂盒回收目的DNA片段(按试剂盒说明书操作);
3).将步骤7.1)和7.2)制备的两种经Sal I和Cla I双酶切目的DNA片段和E2缺失的重组质粒p7SMdelE2片段按4∶1比例混合,取混合物5μl,加入10×T4DNA连接酶缓冲液1μl,T4DNA连接酶1μl,补加灭菌双蒸水至总体积10μl,混均,4℃连接过夜;
4).连接产物转化CaCl2法制备的感受态大肠杆菌DH5α,涂布含氨苄青霉素抗性的琼脂平板培养,挑选阳性重组子接种LB中培养,DNA抽提纯化试剂盒(Omega公司产品,下同)提取质粒DNA,经酶切分析和核苷酸序列测定验证,获得CSFV E2缺失并嵌合JEV E蛋白抗原表位编码区的感染性cDNA克隆重组质粒p7SMdelE2/JEV-ΔE。
8.基因工程双价标记疫苗病毒的拯救
1).将感染性cDNA克隆重组质粒p7SM delE2/JEV-ΔE用限制性核酸内切酶SrfI线性化,琼脂糖凝胶电泳分离,DNA回收试剂盒回收纯化线性化重组质粒DNA(按试剂盒说明书操作);
2).以线性化重组质粒DNA为模板,RNA体外转录试剂盒(Ambion公司产品)体外转录制备RNA(按照试剂盒说明操作),具体地,按试剂盒说明书操作步骤转录RNA,LiCl沉淀、回收,用无RNase的灭菌双蒸水溶解RNA沉淀,取1μl RNA溶液稀释100倍于紫外分光光度计定量测定RNA,变性琼脂糖凝胶电泳步检测RNA分子完整性,-70℃冻存备用。
3).取生长80%单层的PK15/E2p7细胞(见实施例2),采用脂质体Lipofectamine2000,转染步骤8.2)制备的病毒基因组RNA至PK15/E2p7细胞中(按脂质体Lipofectamine2000转染试剂盒说明书操作),转染所用培养液为Opti-MEM(Invitrogen公司产品)。转染6h后,换用含2%胎牛血清的DMEM(DMEM和胎牛血清为Hyclone公司产品,下同),继续培养72h后,冻融细胞培养物,收集上清病毒液。
4).将步骤8.3)收获的病毒液在PK15/E2p7细胞系中传代扩增病毒,获得非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗种毒,分装,-70℃冻存备用。将病毒液按系列倍比稀释接种PK15/E2p7细胞,采用抗-NS3多克隆抗体为一抗,间接免疫荧光染色测定病毒TCID50。
实施例2表达CSFV E2p7蛋白的PK15互补细胞系(PK15/E2p7)的构建
1.表达CSFV E2的真核重组质粒pcDNA3.1/E2p7的构建
1).引物设计:根据CSFV石门株全基因组序列(Genbank No.AF092448),设计一对扩增E2p7基因引物,引物由Invitrogen公司合成。
上游引物P13(SEQ ID NO.13):
5′-CGGGATCCAGAAATGGCCGCATCAACCACGGCATTC-3′(引入BamHI酶切位点)
下游引物P14(SEQ ID NO.14):
5′-CGGAATTCCCTAAACCATGAGCAATGCCACTGT-3′(引入EcoRI酶切位点)
2).以CSFV石门株感染性cDNA克隆质粒pT7SM为模板,PCR扩增E2p7基因序列片段,扩增体系和反应条件如下:
E2p7(CSFV基因组中第2341-3751nt)编码序列扩增:
cDNA模板(pT7SM) 1μl
P13(10μM) 2μl
10
P14(10μM) 2μl
dNTP(10μM) 2μl
10×PCR缓冲液 2.5μl
pfu DNA聚合酶(3U/μl) 1μl
灭菌双蒸水 9.5μl
用移液器将上述组分混匀,在PCR热循环仪上进行扩增反应:94℃变性3min,再94℃30Sec,55℃30Sec,72℃120Sec进行30个循环。
3).取步骤2)扩增的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离,DNA回收试剂盒(W5211,上海华舜生物工程有限公司产品)回收E2p7基因cDNA片段(按试剂盒说明书操作)。
4).取真核表达载体质粒pcDNA3.1+(Invotrigen公司产品),用BamHI和EcoRI双酶消化,琼脂糖凝胶电泳分离,DNA回收试剂盒回收目的DNA片段(按试剂盒说明书操作);
5).构建表达E2p7的真核重组质粒,将回收的E2p7基因酶切片段和pcDNA3.1+载体酶切片段按4∶1比例混合,取混合物5μl,加入10×T4 DNA连接酶缓冲液1μl,T4DNA连接酶1μl,补加灭菌双蒸水至总体积10μl,混合,4℃连接过夜;
6).将步骤5)的连接产物转化CaCl2法制备的感受态大肠杆菌DH5α,涂布含氨苄青霉素抗性的琼脂平板上培养,挑取插入E2p7基因的阳性重组子克隆于LB中培养,DNA抽提纯化试剂盒提取质粒DNA,经酶切鉴定和核苷酸测序验证,获得真核表达质粒pcDNA3.1/E2p7。
2.表达E2p7的PK15细胞系PK15/E2p7的构建
1).将PK15细胞传至6孔细胞培养板(Corning公司产品,下同),置于5%CO237℃培养,待细胞生长至80%单层时,采用脂质体转染试剂Lipofectamine2000,将pcDNA3.1/E2p7转染PK15细胞(按Lipofectamine2000说明书操作),所用培养液为Opti-MEM。转染6h后,换成含2%胎牛血清的DMEM,5%CO237℃继续培养。
2).pcDNA3.1/E2p7转染PK15细胞后,2%胎牛血清的DMEM培养36h,换成含G418(700μg/ml)和5%胎牛血清的新鲜DMEM继续培养。每4-5天更换一次含G418和胎牛血清的新鲜DMEM直到形成细胞克隆。
3).待细胞克隆形成后,0.25%胰酶消化,挑取数个细胞克隆接种在24孔细胞板(Corning公司产品,下同)培养,形成细胞单层后,采用有限稀释法将细胞传至96孔板各孔中,继续用含G418(700μg/ml)和5%胎牛血清的新鲜DMEM培养,待长满单层之后逐渐扩大培养。
3.PK15/E2p7胞系的鉴定
1).待G418筛选的细胞培养扩大后,传代至6孔板中培养至胞形成单层,用CSFVE2单克隆抗体(F48-3-10 Tubingen,Germany)为一抗免疫荧光染色,倒置荧光显微镜下观察结果表明,在PK15/E2p7细胞系中可见E2p7蛋白的表达(图2A、B)。
2).CSFV E2单克隆抗体(F48-3-10)为一抗Western blot检测分析,结果表明,在PK15/E2p7细胞系中能观察到E2p7蛋白的表达(图2C)。
3).用不含G418的5%胎牛血清新鲜DMEM培养基传代培养PK15/E2p7细胞,取各代次细胞免疫荧光染色和Western blot检测,评价PK15/E2p7细胞系的稳定性。
4).将能稳定表达E2p7的PK15细胞克隆扩大培养,冻存于液氮中备用。
实施例3非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗的功能检测
1.间接免疫荧光检测PK15/E2p7细胞中重组病毒的增殖特性
取基因工程双价疫苗重组病毒接种PK15/E2p7细胞,5%CO237℃培养72h,细胞用预冷的甲醛丙酮(1∶1)-20℃固定处理1h,PBS洗涤3-5次,加入抗-NS3兔血清(一抗,由本实验室制备与保存,1∶1000稀释),37℃孵育1h,PBS洗涤3-5次,加入FITC标记的羊抗兔IgG(Pierce公司产品,1∶500稀释),室温避光孵育1h,PBS洗涤,置于倒置荧光显微镜下观察。结果显示:重组病毒接种的PK15/E2p7细胞与抗-NS3多克隆抗体反应,呈绿色荧光(图3A)。未接种重组病毒的PK15/E2p7细胞不与抗-NS3多克隆抗体反应,无荧光(图3B)。
2.Western blot检测双价疫苗重组病毒在PK15/E2p7细胞中表达CSFV NS3蛋白和JEV E抗原蛋白
取基因工程双价疫苗重组病毒接种PK15/E2p7细胞,5%CO237℃培养72h,分别收获细胞培养上清和细胞裂解物,以抗-NS3兔血清(或抗-E兔血清)为一抗,HRP标记羊抗兔IgG为二抗,Western blot分析NS3蛋白(或JEV E蛋白)的表达。如图4所示,重组病毒在PK15/E2p7细胞系上增殖,能有效表达CSFVNS3蛋白(4B)和JEVE蛋白(4C)。
Western blot检测双价疫苗重组病毒在PK15/E2p7细胞中表达CSFV NS3蛋白和JEV E抗原蛋白的具体步骤如下:
(1)样品处理 取双价疫苗重组病毒接种80%单层PK15/E2p7细胞(T25细胞瓶),加入2%胎牛血清的DMEM,5%CO237℃培养72h,分别收获细胞培养上清(5ml)和细胞,上清液真空冻干,加入200μl PBS溶解。用细胞刮收集细胞,200μl PBS重悬细胞。取上述200μl细胞重悬液和200μl上清冻干粉溶解液,分别加入等体积样品缓冲液(Loading buffer)混匀,水浴煮沸5min,冷却备用。
(2)制胶 按下列各组分依次混合,配制分离胶和浓缩胶
分离胶(10%)
1.5mol/L Tris(pH8.0) 1.3ml
30%丙烯酰胺 2ml
ddH2O 1.6ml
10%AP 0.05ml
10%SDS 0.05ml
TEMED 2μl
浓缩胶(5%)
1.5mol/L Tris(pH6.8) 0.25ml
30%丙烯酰胺 0.33ml
ddH2O 1.4ml
10%AP 0.02ml
10%SDS 0.02ml
TEMED 2μl
将配制的分离胶溶液灌入电泳槽平板中,胶面至平板顶端距离保留约1.5cm,缓缓加入1ml双蒸水压封胶层表面,室温静置待胶体凝固,吸出双蒸水,灌入浓缩胶(灌注前新鲜配制),室温静置待胶体凝固备用。
(3)上样 将处理好的蛋白样品,根据预先测定蛋白的浓度取30μl样品加入浓缩胶样品槽中,确保各样品槽中蛋白质加样量相等。
(4)电泳 50V电泳30min,调电压至100V继续电泳至溴酚蓝距底线0.5cm处,关掉电源,取出凝胶,双蒸水洗涤。
(5)转膜 取NC膜和滤纸置入转膜缓冲液(transfer buffer)中浸泡5min,按“阴极-海绵-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-海绵-阳极”顺序铺设凝胶和NC膜,放入电泳槽,调电压至88V,低温(4℃)条件下电转膜3h。
(6)封闭 将NC膜用1×PBST洗涤3-5次,加入含5%脱脂奶粉的PBST封闭缓冲液(blocking buffer),37℃,孵育2h。
(7)与一抗反应用PBST洗涤NC膜3次,每次5min。加入一抗(兔抗CSFVNS3多克隆抗体或兔抗JEVE蛋白多克隆抗体,PBST进行1∶1000稀释),37℃孵育1h。
(8)与二抗反应PBST洗涤NC膜3次,每次5min。加入HRP标记羊抗兔第二抗抗体(31460,Pierce公司产品,用PBST进行1∶2500稀释),37℃孵育1h。
(9)显色PBST洗涤NC膜3次,每次5min。加入DAB显色液(具体配方见《分子克隆,实验手册》),室温避光显色5-10min,双蒸水洗涤NC膜,观察结果(见图3)。
实施例4小鼠模型检测非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗抗JEV的
保护效力
1.小鼠免疫接种
取6-8周龄健康一致雌性BALB/c小鼠45只,随机分成三组,每组15只,分别为双价疫苗接种实验组、乙型脑炎疫苗接种阳性对照组和非疫苗接种阴性对照组。
采用腹膜内注射方法免疫小鼠。免疫剂量如下:
双价疫苗接种实验组:接种剂量为1×105TCID50的双价疫苗病毒液150μl;乙型脑炎疫苗接种阳性对照组:接种剂量为按说明书介绍的1∶50稀释的兽用乙脑灭活疫苗接种150μl;非疫苗接种阴性对照组:腹膜内注射相同体积(150μl)灭菌PBS。
各组小鼠均免疫三次,每次间隔两周。
2.小鼠攻毒试验
最后一次免疫14天后,小鼠尾静脉取血,分离血清,用于血清IgG及中和抗体效价检测。然后,小鼠用3×106PFU(50LD50)剂量的JEV北京强毒株(P3株)(即乙型脑炎京卫研P3株,来自中国药品和生物制品检定所)采用腹膜接种途径进行攻毒感染,攻毒后每天测量记录小鼠体重变化和观察小鼠病死情况。
3.疫苗诱导小鼠体液免疫应答的检测
1).间接ELISA检测小鼠血清抗JEV抗体效价
(1)包被:取感染JEV的BHK-21细胞裂解病毒液,加终浓度至0.05%甲醛灭活,用包被缓冲液(0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液)稀释至病毒滴度为1×107PFU,加到96孔ELISA板(Corning公司产品,下同)各孔中(100μl),4℃包被过夜;
(2)封闭:包被病毒抗原的ELISA酶标板用PBST洗涤3-5次,吸水纸吸干。加含3%BSA的PBST至ELISA板各孔中(300μl/孔),37℃孵育60min,PBST洗涤3-5次。
(3)加待检血清:待检小鼠血清用含1%BSA的PBST作1∶100稀释,稀释血清加入ELISA板各孔中(100μl/孔),37℃孵育1h,PBST充分洗涤5-6次。
(4)加酶标二抗:酶标二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG抗体(31432,Pierce公司产品),用含1%BSA的PBST作1∶5000稀释,加入ELISA板各孔中(100μl/孔),37℃孵育1h,PBST充分洗涤5-6次。
(5)加底物溶液:向ELISA酶标板每孔加入100μl底物显色液,37℃避光反应10min,用2M的H2SO4终止反应,20min内测定OD492值。
(6)OD492值的测定:用自动酶标测定仪在波长492nm处,测定每孔内光密度吸收值(OD492值)。每份样品平行做2孔,计算平均值。
结果如图5A所示,用非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗免疫接种,能诱导小鼠产生高效价抗JEV特异性IgG抗体。
2).中和抗体检测方法
(1)取2×106细胞/ml浓度的BHK-21细胞悬液,接种到96孔平底微量细胞培养板各孔中(100μl/孔);加入含2%胎牛血清的DMEM,5%CO237℃培养至形成70%-80%细胞单层;
(2)将待检测血清56℃灭活30min,用无血清EMEM培养液作2倍系列稀释;将稀释后的血清样品与含100PFU/0.1mL的乙脑病毒(P3株)悬液等体积混合,置37℃孵育1-2h;
(3)用无血清DMEM培养液洗涤BHK-21细胞单层,加入血清/病毒混合液(100μl/孔),37℃孵育1h,吸出血清/病毒混合液,加入含2%胎牛血清的DMEM培养液,37℃继续培养48-72h;
(4)吸弃细胞培养上清,PBS洗涤细胞3-5次,用预冷的甲醛丙酮(1∶1)(100μl/孔),-20℃固定1h,PBS洗涤3-5次,加入1%结晶紫,室温(25℃)染色1h,双蒸水冲洗,加入中性红复染30min;冲洗、晾干后计数空斑;
(5)血清中和抗体效价判定:将能中和JEV感染的血清最高稀释倍数判定为血清中和效价。
结果如图5B所示,用非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗免疫接种,能诱导小鼠产生针对JEV的特异性中和抗体。
4.非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗诱导小鼠抗JEV强毒(P3株)致死感染的保护
JEV强毒株攻毒感染结果显示,实验组小鼠在8天内全部死亡,乙脑灭活疫苗阳性对照组和阴性对照组的小鼠均有约80%的存活,表明表达JEV E蛋白抗原的重组双价减毒活疫苗接种,能诱导与乙脑全病毒灭活疫苗相似的抵抗乙型脑炎强毒株致死攻击感染的保护效力(图5C)。
实施例5非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗免疫接种诱导猪体抗
CSFV的免疫效力检测
1.猪体免疫接种
选取未接种猪瘟和乙脑疫苗、经ELISA检测CSFV和JEV血清抗体阴性的健康2月龄仔猪,随机分成两组,分别用于双价疫苗接种实验组和非疫苗接种阴性对照组。
具体地,取新生未接种猪瘟和乙脑疫苗的4周龄健康仔猪,前腔静脉采血,分离血清,ELISA检测CSFV E2抗体和JEV E抗体。选取两种病毒抗体阴性仔猪8头随机分成两组,分栏饲养,至8周龄再次采血检测血清抗体,抗体阴性的健康仔猪用于实验研究。
疫苗接种实验组:经皮下多点注射和口鼻滴注联合途径免疫接种,皮下接种剂量为2×106TCID50/2ml,每点约200μL;口鼻滴注剂量为8×106TCID50/10m,总免疫量约1×107TCID50/12ml。
非疫苗接种阴性对照组:采用与实验组相同途径和剂量的PBS接种猪体。
疫苗接种后,每天测量疫苗接种组和非疫苗接种对照组猪体温,并观察实验猪的临床症状。
2.猪体攻毒试验
猪体免疫接种23天后,以1×105.5TCID50的CSFV石门强毒株病毒液,采用滴鼻途径攻毒感染,于攻毒感染后每天测量各头猪体温变化、记录猪发病临床症状和死亡数;分别于攻毒后第0、3、7、16和21天前腔静脉采血,一部分血液加入到含有EDTA抗凝剂的血液收集管中,用于白细胞和血小板计数(血细胞自动计数仪:SysmexKX-21N,日本);一部分血液置于不加抗凝剂无菌试管中分离血清,用于检测血清抗CSFV E2IgG抗体以及CSFV中和抗体效价。
1).间接ELISA检测猪血清IgG抗体效价
实验操作与实施例4中步骤1.2)相同,只是待检测血清为猪血清;二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG抗体(BSE0305R,北京博奥森生物技术有限公司产品)。实验结果与图6A所示,CSFV攻毒感染后第3天开始,猪血清特异性IgG持续升高。
2).中和抗体检测
(1)按2×106细胞/ml浓度接种PK15细胞悬液于平底微量96孔培养板中(100μl/孔);5%CO237℃培养至形成70%~80%细胞单层;
(2)将待检测猪血清于56℃灭活30min,用无血清EMEM培养液作2倍系列稀释;将稀释的待检血清与含100TCID50/0.1mL的CSFV病毒液等体积混合,置37℃孵育1-2h;
(3)用无血清DMEM洗涤PK15单层细胞,加入血清/病毒混合液(100μl/孔),37℃孵育1h,吸去血清/病毒混合液,加入含2%胎牛血清的DMEM培养液,5%CO2、37℃继续培养48-72h;
(4)取出细胞培养板,按实施2步骤3所述的间接免疫荧光法检测血清的病毒中和效价(每份血清样品重复2次实验)。具体地,将接种血清/病毒混合液后培养48-72h的PK15细胞,用PBS洗涤3次,预冷的甲醛丙酮(1∶1)-20℃固定1h,依次以兔抗CSFV NS3为一抗(1∶1000稀释)、羊抗兔IgG-FITC为二抗(1∶200稀释)免疫荧光染色,在Olympus倒置荧光显微镜下观察结果。
(5)中和抗体效价判定:以能中和CSFV感染性的血清最高稀释倍数(无荧光染色反应)作为血清的中和效价。
结果如表1所示,CSFV强毒株攻毒感染后第3天开始,疫苗接种猪CSFV中和抗体效价持续升高,非疫苗接种阴性对照组猪均检测不到中和抗体产生。
表1非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗
接种猪和对照实验猪体CSFV强毒致死攻击后血清中和抗体效价
3).疫苗接种诱导猪体抗CSFV强毒致死攻击的免疫保护
实验猪用CSFV强毒攻击感染后观察结果显示(表2和图6C),非疫苗接种阴性对照组实验猪攻毒后,平均体温于第3天开始升高超过40℃,第4天全部4头猪体温超过41℃,并持续到所有猪死亡。本发明所述的疫苗免疫接种猪平均体温只有2天轻微升高(40.3和40.1),然后恢复正常,所有疫苗接种猪存活。
表2非传播抗猪瘟和乙脑基因工程双价标记减毒活疫苗
接种猪和对照实验猪体CSFV强毒致死攻击后体温升高和存活情况
作为猪瘟临床病理特征的指标之一是白血病减少。白细胞计数结果如图6B所示,本发明所述的疫苗免疫接种猪在CSFV强毒攻击感染后白细胞数量保持在6-16×109/L水平以上。非免疫接种对照猪白细胞总数在每次计数时均显著低于疫苗免疫猪,并持续降低,直至实验猪死亡。
实施例6血清CSFV E2抗体检测ELISA方法建立及其应用
1.CSFV E2蛋白包被抗原制备
1).原核表达质粒pMAL-p2X-E2(本实验室构建保存)转化CaCl2制备的大肠杆菌E coli BL21-codonplus(DE3)-RIL感受态细胞,挑取阳性克隆接种到氨苄青霉素和氯霉素的LB中,37℃、200rpm振摇过夜培养;
2).取过夜培养物0.1ml接种于10ml(1∶100比例)含氨苄青霉素和氯霉素的LB中,37℃、200rpm振摇培养至OD600为0.6-0.8,加入1mmol/L IPTG诱导5h;
3).取IPTG诱导培养物,离心分离菌体,SDS-PAGE电泳分析目的蛋白质表达;按照Sambrook等《分子克隆,实验手册》介绍的步骤操作。
4).可溶性表达的MBP-E2蛋白,采用Amylose介质(New England公司产品)进行亲和层析柱层析纯化。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。
5).SDS-PAGE和Western blot分析MBP-E2蛋白的纯度和特异性;
6).参照Bradford方法测定蛋白浓度,以BSA为标准蛋白绘制标准曲线,对MBP-E2蛋白进行定量测定后,分装保存-70℃备用。
2.ELISA检测方法建立
1).试剂的配制:
(1)ELISA包被缓冲液(0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液)
Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g
加水至1L,调pH值至9.6,4℃冰箱保存
(2)ELISA洗涤液(PBST):
NaCl 8g
Na2HPO4 1.44g
KCl 0.2g
KH2PO4 0.24g
加水至1L,使用时加Tween-20终浓度0.05%。
(3)磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH5.0,1L)
Na2HPO4.12H2O 71.6g
柠檬酸 21g
加水定容至1L,4℃冰箱保存
(4)显色液(100ml)
邻苯二胺 40mg
30%H2O2 150μl
磷酸盐-柠檬酸缓冲液(pH5.0) 100ml
新鲜配制。
2).血清E2抗体的ELISA检测方法
(1)包被:用ELISA包被缓冲液(pH9.6)稀释纯化的E2蛋白抗原至终浓度5μg/ml,加到ELISA酶标板的各孔中(100μl/孔),4℃包被过夜;
(2)封闭:取出包被了E2抗原的ELISA酶标板,用PBST洗涤3-5次,吸水纸吸干。加3%BSA封闭液至各孔中(300μl/孔),37℃孵育60min,用PBST洗涤3-5次,吸水纸吸干。
(3)加待检血清:取待检测猪血清用含1%BSA的PBST按1∶200稀释,加到ELISA酶标板各孔中(100μl/孔),37℃孵育1h,PBST洗涤5-6次。
(4)加酶标二抗:用含1%BSA的PBST稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗猪IgG抗体(BSE0305R,北京博奥森生物技术有限公司产品,1∶3000稀释),加到ELISA酶标板各孔中(100μl/孔),37℃孵育1h,PBST洗涤5-6次。
(5)加底物显色溶液:向ELISA酶标板每孔中加入100μl底物显色液,37℃避光显色10min,用2M的H2SO4终止反应,20min内测定OD492值。
(6)OD492值测定:用自动酶标测定仪在波长492nm处,测定每孔内光密度吸收值(OD492值)。每份样品平行做2孔,计算平均值。