CN103314103B - 猪第二型环状病毒、含彼的免疫组合物、检测套组及其应用 - Google Patents

猪第二型环状病毒、含彼的免疫组合物、检测套组及其应用 Download PDF

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Abstract

提供了一种猪第二型环状病毒株，其保藏号为CCTCC No：V201117。还提供了含有该猪第二型环状病毒株的免疫组合物、检测该病毒株的试剂盒、以及该病毒株的用途。

Description

猪第二型环状病毒、含彼的免疫组合物、检测套组及其应用
技术领域
本发明关于动物保健领域，特别是关于一种新颖的猪第二型环状病毒(PCV2)、含有该病毒的免疫组合物、检验套组及应用。
背景技术
猪环状病毒(porcine circovirus，PCV)最早是在猪肾细胞株(PK-15，ATCC CCL33)中被发现，虽然会持续感染该细胞，但是并不产生细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)；另外该病毒虽会感染猪只，但是并不造成猪只产生任何病变。该病毒为一环状单股、全长1759bp的正二十面体(icosahedron)病毒，在1995年被归类为环状病毒科(Circoviridae)的一员。
而1991年首度于加拿大发现的仔猪离乳后多系统耗弱症(Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome，以下简称PMWS)，主要发病的对象为5到12周龄的保育后期及肥育前期仔猪，其临床症状包括渐进性的消瘦、呼吸急促、皮肤苍白及偶尔可见黄疸等，解剖分析可看到间质性肺炎肉芽肿、肝炎、肾炎及淋巴病变等。自从PMWS在加拿大爆发后，北美、欧洲及亚洲等世界各主要国家几乎都有报导PMWS的发生。近年，从罹患PMWS的病猪身上被分离出另一种新的环状病毒，该病毒与当初从PK-15细胞分离出的环状病毒外形非常相似，但是基因组序列的相似度只有68-76％，后来将无致病性的猪环状病毒称为猪第一型环状病毒(porcine circovirus type1，PCV1)，而会造成PMWS的病毒则称为猪第二型环状病毒(porcine circovirus type2，PCV2)。
猪第二型环状病毒(PCV2)属于环状病毒科(circoviridae)，为不具套膜(envelope)的正二十面体(icosahedron)病毒，直径约17nm，病毒核酸为单股环状DNA，在DNA的环状基因组上有一茎-环状(stem-loop)的构造为复制走台点，此为环状病毒共通的特征。PCV2的基因组有1768或1767个核苷酸，是目前已知最小的动物病毒。PCV2基因组序列经软体分析后发现顺时针加上逆时针共有11个开放阅读框架(open reading frame，ORF)，其中ORF1、ORF2是2个最主要的基因。ORF1可转录出Rep及Rep’蛋白，与该病毒的复制有关。而ORF2则是PCV2的外壳蛋白(capsid)，是最有可能诱发出中和抗体的抗原。
PCV2在全世界都有很高的感染率。PCV2会造成猪只育成率及饲料换肉率的降低，而使得养猪业受到极大的冲击与经济损失，所以PCV2检测/诊断试剂及疫苗的开发，可说是刻不容缓且极为重要的事。
发明内容
本发明于第一部份中提供一种新颖的猪第二型环状病毒株，该病毒株系自一受感染的猪只中分离及纯化。该病毒具有如SEQ ID No：1所示的正股基因组序列；经鉴定后，确认该病毒为一种 新颖的猪第二型环状病毒株，命名为猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)。将该病毒株寄存于中国典型培养物保藏中心(China Center For Type Culture Collection，CCTCC)，寄存日为2011年11月5日，寄存编号为CCTCCNo：V201117。
本发明于第二部分中提供一种含有该新颖的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的免疫组合物。于一实施例中，该免疫组合物为一疫苗，系将上述猪第二型环状病毒H株不活化，或进行病毒株弱化，再与一药学上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable vehicle)，制备成一适用本发明疫苗的剂型。然而，该疫苗的剂型包含但不限于：死毒(不活化)疫苗、活毒(减毒)疫苗、次单位疫苗、DNA疫苗、或藉由该新颖猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)或其核苷酸序列、氨基酸序列所制备而得的疫苗。
本发明所述的不活化处理(或去活化处理，inactivated treatment)包含但不限于：去活化剂处理、热处理等适用本发明的不活化方法。其中去活化剂包含但不限于：甲醛(formaldehyde)、多聚甲醛(paraformaldehyde)、β-丙内酯(Beta-Propiolactone，BPL)、2-溴乙胺(binary ethyleneimine，BEI)，或适用本发明的去活化剂等。
其中该药学上可接受的载剂包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellmg agent)、防腐剂(preservative)、润滑剂(lubricant)、界面活性剂(surfactant)、佐剂(adjuvant)，及其他类似或适用本发明的载剂。
其中该佐剂包含但不限于：油质佐剂(如：矿物油、植物油、动物油、佛氏完全佐剂、佛氏不完全佐剂等)、水质佐剂(如：氢氧化铝)、双相油质佐剂(如：水包油包水剂型，w/o/w)、生物型佐剂(如：CpG寡核苷酸、细菌类毒素toxoid)等。其中该双相油质佐剂包含界面活性剂以及油相物质；该界面活性剂包括一或多种下列所选的群组：山梨醇(sorbitol)脂肪酸酯；山梨醇脂肪酸酯与环氧乙烷(ethylene oxide)或环氧丙烷(propylene oxide)浓缩物；甘露醇(mannitol)脂肪酸酯；甘露醇脂肪酸酯与环氧乙烷或环氧丙烷浓缩物；甘露醇脂肪酸酯与下列所选的亲水基：羧酸(carboxylic acid)、胺基(amine)、酰胺(amide)、醇类(alcohol)、聚酯多元醇(polyol)、醚类(ether)、氧基(oxide)的接合物；无水甘露醇(anhydromannitol)脂肪酸酯；无水甘露醇脂肪酸酯与下列所选的亲水基：羧酸、胺基、酰胺、醇类、聚酯多元醇、醚类、氧基的接合物；蔗糖(saccharose)脂肪酸酯；蔗糖脂肪酸酯与环氧乙烷或环氧丙烷浓缩物；甘油脂肪酸酯；甘油脂肪酸酯与环氧乙烷或环氧丙烷浓缩物；脂肪酸与环氧乙烷或环氧丙烷浓缩物；脂肪醇与环氧乙烷或环氧丙烷浓缩物；以及甘油磷脂(glycerophospholipid)。该油相物质包括或多种下列所选的群组：矿物油、植物油以及动物油。
本发明所述的免疫组合物，可进一步包含一种或多种病原抗原，该病原抗原包含但不限于：猪流感病毒(SIV)抗原、猪繁殖与呼吸症候群病毒(PRRSV)抗原、猪霉浆菌(Mycoplasma)、猪小病毒(Parvovirus，PPV)、猪丹毒(Erysipelas)、伪狂犬病(Aueszky′s disease)，且该等病原抗原的形式 包含但不限于：重组蛋白、次单位蛋白、基因缺损的病原、灭活的病原抗原等。
本发明于第三部分中提供一种猪只对抗猪第二型环状病毒(PCV2)病毒的方法，包含使用有效量的上述免疫组合物以施予猪只，以增强该猪只对抗猪第二型环状病毒(PCV2)的免疫力，降低病毒血症的严重性，进而提升、改善其临床症状、存活率、及增重趋势。
本发明于第四部分中提供一种抗猪第二型环状病毒(PCV2)的抗体，通过本发明的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)所制备或衍生而得；该抗体包括但不限于：单株抗体、多株抗体，以及经基因重组的抗体。于一实施例中，该抗体为经由将本发明的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)施打于动物体内而得到的多株抗体。于另一实施例中，该抗体为经由筛选单株化融合瘤所得到的单株抗体。
本发明于第五部分中提供上述新颖的猪第二型环状病毒(PCV2)所含的DNA片段，其具有如SEQ ID No：1，2，4，6所示的序列。该DNA片段的应用包含，但不限于：制成DNA疫苗、次单位疫苗、或用于设计引子或探针以侦测猪第二型环状病毒(PCV2)。于一实施例中，该DNA片段为猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的基因组全长，其具有如SEQ ID No：1所示的序列。于另一实施例中，该DNA片段为猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的开放阅读框架(open readmg fiame，ORF)，包含但不限于：
第一开放阅读框架(ORF1)，其具有如SEQ ID No：2所示的序列，其编码如SEQ ID No：3所示的氨基酸序列；
第二开放阅读框架(ORF2)，其具有如SEQ ID No：4所示的序列，其编码如SEQ ID No：5所示的氨基酸序列；以及
第三开放阅读框架(ORF3)，其具有如SEQ ID No：6所示的序列，其编码如SEQ ID No：7所示的氨基酸序列。
本发明于第六部分中提供一种猪第二型环状病毒(PCV2)的检测套组，该检测套组用以侦测检验样本是否含有猪第二型环状病毒(PCV2)或侦测检验样本内是否含有抗猪第二型环状病毒(PCV2)的抗体。该检测套组包含但不限于：(1)一抗原，该抗原为该猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的病毒抗原，于一实施例中，该抗原置于一抗原盘上，并以去活化剂处理；(2)一抗体，该抗体由该猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)所衍生、制备而得的单株抗体或多株抗体；(3)一经基因重组的抗原或抗体，该基因重组的抗原或抗体利用该猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的全基因组序列(如SEQ ID No：1所示)、或其核苷酸片段(如SEQ ID No：2、4、6所示)所衍生、制备而得；以及(4)一多核苷酸(polynucleotide)，该多核苷酸由该猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的全基因组序列(如SEQ ID No：1所示)、或其核苷酸片段(如SEQ ID No：2、4、6所示)所衍生、制备，如：引子或探针；于一实施例中，该多核苷酸可用以侦测出猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)序列的引子对，如SEQ IDNos：8～11所示。
该检测套组的形式包含但不限于：酵素连结免疫分析(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)套组、微晶片检验套组(Microchip kit)、免疫荧光分析法(immunofluorescent assay，IFA)检测 套组、聚合酶连锁反应(PCR)检验套组、或其他藉由该猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)所制得的检测套组。于一实施例中，该检测套组至少包含一含有该猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的抗原盘，可用以检验样本中是否含有抗猪第二型环状病毒(PCV2)的抗体。
本发明所述的新颖的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)，亦应包含其继代培养的后代，或突变株，但仍具有与本发明所述的病毒特性、基因体(genomic)、或致病性相同。
本发明所述的「DNA(核酸)」、「多核苷酸」、「氨基酸」、「胜肽」、「多胜肽」可为自然存在、单离的、重组的，或人工合成的。
术语“预防、保护、对抗”意谓，相较于未使用本发明免疫组合物的动物的免疫力，使用本发明免疫组合物，将可有效增强免疫动物对抗猪第二型环状病毒(PCV2)的能力，并可预防及保护该免疫动物免于感染猪第二型环状病毒(PCV2)及其衍生的相关疾病。
本说明书中所述的所有技术性及科学术语，除非另外有所定义，皆为该所属领域具有通常技艺者可共同了解的意义。
本发明以下面的实施例予以示范阐明，但本发明不受下述实施例所限制。
附图说明
图1A为未感染猪第二型环状病毒(PCV2)的PK-15细胞，培养4天后细胞生长的形态(100×)；
图1B为感染猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的PK-15细胞，培养4天后细胞生长的形态(100×)。
图2为猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)基因组序列的亲缘树分析图。
图3为猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的ORF2氨基酸序列与美国国家生物技术资讯中心(NCBI)基因资料库(GenBank)中氨基酸序列相似度最高的前三名序列进行比对(alignment)的结果。
图4为猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的ORF2氨基酸序列与猪第二型环状病毒(PCV2)2d亚群的原型株(GenBank编号：ZJ0955b)的ORF2(GenBank登录号：ADD25772)氨基酸序列比对(alignment)的结果。
图5为小鼠经猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)不活化疫苗免疫后，不同时间采集的血液样本以猪第二型环状病毒(PCV2)ELISA测定抗体力价的结果。
图6为仔猪经猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)不活化疫苗免疫后，不同时间采集的血液样本以猪第二型环状病毒(PCV2)IFA测定抗体力价的结果。
图7为仔猪经猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)不活化疫苗免疫后，不同时间的秤重结果所画成的增重趋势图。
具体实施方式
实施例一猪第二型环状病毒(PCV2)的分离与鉴定 
1.种病毒株来源：
受感染的猪只肺脏及淋巴结检体自一养猪场(台湾，新竹)中采集而来。这些受采样的八周龄猪只皆具有仔猪离乳后多系统耗弱症(PMWS)的临床征状。肺脏及淋巴结检体采集后随即置于-70℃中保存。
为了分离检体中的病毒，将已均质化的上述检体0.2ml接种于未受猪环状病毒(PCV)、猪瘟病毒(dassical swine fever virus，CSFV)、猪腺病毒(porcine adenoviruses)、猪小病毒(porcine parvovirus)、猪繁殖与呼吸综合症(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪伪狂犬病(pseudorabies virus，PRV)、猪水泡病病毒(swine vesicular disease virus，SVDV)、霉浆菌及其他细菌污染的猪肾细胞(PK-15)单层细胞或其衍生(derived)的细胞株进行培养，于37℃、5％CO2作用1小时后，以灭菌PBS冲洗3次，置入含2％胎牛血清的新MEM培养液培养4小时，将培养液倒弃，加入300mM的D-glucosamine作用30分钟，以PBS冲洗3次后，置入约含8％胎牛血清的新MEM培养液中，于37℃、5％CO2培养箱内培养72小时，再以免疫荧光分析法(IFA)进行检测有无病毒存在。
免疫荧光分析法(IFA)的步骤如下：样品来自上述接种后的细胞，首先将培养液去除，以1倍PBS洗三次，每次五分钟。加入75μl的80％丙酮(以蒸馏水配制)，于4℃固定三十分钟，将丙酮去除后，以1倍PBS洗三次，每次五分钟。接着将PBS去除，再加入75μl以PBS稀释1500倍的猪环状病毒抗病毒多株抗血清(porcine circovirus anti-viral polyclonal antiserum，)(一级抗体)，于37℃培养箱中培养三十分钟后，再将一级抗体移除，以1倍PBS洗三次，每次五分钟。移除PBS后，加入75μl以PBS稀释1000倍的Rabbit anti-Pig IgG-FITC(whole molecule)(Sigama，F1638)(二级抗体)，于37℃培养箱中培养三十分钟后，将二级抗体去除后，以1倍PBS洗三次，每次五分钟。最后于96孔盘中加入200μl的1倍PBS，以荧光显微镜观察荧光。
选出IFA结果最佳的细胞所感染的病毒为种毒株。并对该病毒株基因组序列进行定序，定序结果如SEQ ID No：1所示，经序列比对鉴定确认为新病毒株(病毒株鉴定方法与结果如下所述)，将之命名为猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)。
2.种病毒株继代：
将上述选出的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)感染新鲜的PK-15细胞或其衍生的细胞株，得到的病毒称之为P1代。收集所培养细胞的上清液(P1代)并将之稀释(比例为1∶2)后，再感染新鲜的PK-15细胞或其衍生的细胞株，培养3天后，收集培养细胞的上清液(含P2代病毒株)，再次稀释(比例为1∶2)并感染新鲜的PK-15细胞或其衍生的细胞株，培养3天后收集上清液得到P3代。重复上述步骤3次以上，以取得猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)P6代。
以PK-15细胞或其衍生的细胞株培养猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的过程中，观察到该病毒株会造成宿主PK-15细胞或其衍生的细胞株产生细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)的现象，CPE现象如图1B所示；其中图1A为未感染猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的PK-15细胞，培养4天后细胞生长的形态(100×)；图1B为感染猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的 PK-15细胞，培养4天后细胞生长的形态(100×)。其中PK-15衍生的细胞株的CPE现象亦可参阅图1B所示。
3.种病毒株鉴定：
本发明所分离得到的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的基因组序列如SEQ ID No：1所示，将SEQ ID No：1所示序列与美国国家生物技术资讯中心(NCBI)基因资料库(GenBank)进行比对，结果如表一所示，猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的基因序列与猪第二型环状病毒(PCV2)相似，相似度可达99％，但并无发现GenBank资料库中有与猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)基因序列完全一样(相似度100％)的猪第二型环状病毒(PCV2)存在。因此，由比对结果可知，本发明所得到的病毒分离株属猪第二型环状病毒(PCV2)一员，目为一株新颖的病毒株。经亲缘关系树分析结果如图2所示，由分析结果可知，猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)属于PCV22d亚群(subgroup)的一员。
表一PCV2H株基因组序列于NCBI比对的结果 
分析结果显示，本发明的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)具有第一开放阅读框架(ORF1)，其具有如SEQ ID No：2所示的序列，其编码如SEQ ID No：3所示的氨基酸序列；第二开放阅读框架(ORF2)，其具有如SEQ ID No：4所示的序列，其编码如SEQ ID No：5所示的氨基酸序列；以及第三开放阅读框架(ORF3)，其具有如SEQ ID No：6所示的序列，其编码如SEQ ID No：7所示的氨基酸序列。
由于猪第二型环状病毒(PCV2)的ORF2基因序列编码的外壳蛋白(capsid)，是较有可能诱发出中和抗体的抗原，因此，本案发明人将猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的ORF2DNA序列(如SEQ ID No：4所示)及氨基酸序列(如SEQ ID No：5所示)与NCBI的资料库(GenBank)进行比对。结果显示，GenBank资料库内并无与猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的ORF2DNA序列或氨基酸序列完全一样(相似度100％)的序列存在，氨基酸序列相似度最高达98％。将氨基酸序列相似度最高的前三名序列与猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的ORF2氨基酸序列进行比对， 结果如图3所示，比对后发现有6个氨基酸不同。而与猪第二型环状病毒(PCV2)2d亚群的原型株(prototype)(GenBank编号：ZJ0955b)的ORF2(GenBank登录号：ADD25772)氨基酸序列相比，结果如图4所示，猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)与该序列有7个氨基酸相异，相似度为97％。
此外，本案发明人亦将猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的ORF1以及ORF3的DNA序列(如SEQ ID No：2及6所示)及氨基酸序列(如SEQ ID No：3及7所示)序列分别与NCBI的GenBank资料库进行比对，结果发现GenBank资料库中亦无与本发明猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的ORF1及ORF3的DNA序列及氨基酸序列完全相同者(相似度100％)。
经上述结果证实，本发明所提供的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)为一新颖的猪第二型环状病毒株(PCV2)，该病毒株已于2011年11月5日寄存于中国典型培养物保藏中心(China Center For Type Culture Collection，CCTCC)，寄存编号为CCTCC No：V201117。
实施例二猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)疫苗的制备 
1.病毒培养
取未受猪环状病毒(PCV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪腺病毒、猪小病毒、猪繁殖与呼吸综合症(PRRSV)、猪伪狂犬病(PRV)、猪水泡病病毒(SVDV)、霉浆菌及其他细菌的污染的PK-15细胞，在37℃、5％CO2之下培养于细胞生长培养基(约含有5％胎牛血清的MEM培养基，pH7.2±0.2)内。待该PK-15细胞铺平长满后，以约0.2％Trypsin-EDTA完整消化细胞，以细胞维持培养基(约含有2％胎牛血清的MEM培养基，pH7.4±0.2)冲散细胞后计算细胞数，加入适量细胞生长培养基，调整细胞数为3.0×105/ml，分装至回转瓶，于37℃下回转培养3～4日之使形成单层细胞。以细胞维持培养基将猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)种毒液调整为104.0TCID50/ml。将已长成单层细胞的回转瓶内的培养基移除，加入PBS洗净细胞面，接种已配制好的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)种毒液，将回转瓶置于37℃下进行病毒增殖培养。病毒接种后48～96小时间，抽样以免疫荧光分析法(IFA)测定病毒含有量，当病毒含有量达106.0TCID50/ml以上时收集病毒液；或当细胞病变(CPE)达70～80％时收集病毒液。
2.不活化处理(inactivated process)
将37％甲醛溶液(formaldehyde)加入步骤所收集的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)病毒液中，并调整甲醛含量至终浓度为0.2％(w/v)，并于37℃下持续震荡至少24小时，较佳可为48小时，以进行不活化处理；经过验证实验确定猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)病毒液已完全不活化后，将含有甲醛的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)病毒液离心，移除上清液以去除甲醛，并将猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)病毒液悬浮于缓冲溶液(如：蒸馏水或磷酸缓冲盐溶液，phosphate buffered saline，PBS)中，即可制得含抗原的疫苗原液(死毒抗原)，并保存于4℃备用。
3.猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)不活化疫苗的调制
取步骤二所制得的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)灭活抗原，加入已灭菌的双相油质 佐剂(如：MONTANIDETM ISA206双相油质佐剂，最终浓度50％，v/v)后，置于乳化桶内混合均匀，进行油质乳化反应，反应完成后即获得猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)不活化油质佐剂疫苗。
对于该领域具有通常技艺者亦可藉由习知技艺，挑选其他适用的佐剂以制备本发明的猪第二型环状病毒(PCV2)不活化疫苗，其中该双相油质佐剂(如：水包油包水剂型，w/o/w)亦可更换但不限为油质佐剂(如：矿物油、植物油、动物油、佛氏完全佐剂、佛氏不完全佐剂等)、水质佐剂(如：氢氧化铝)、生物型佐剂(如：CpG寡核苷酸、细菌类毒素toxoid)等。
实施例三猪第二型环状病毒(PCV2)检测套组的制备-1
于本实施例中，猪第二型环状病毒(PCV2)检测套组为含有本发明猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)病毒抗原的抗原盘。首先将PK-15细胞(或其单株化的细胞株)进行继代培养，将PK-15细胞调整细胞浓度至2×105cells/ml，并取96孔微量平底培养盘，每孔加入PK-15细胞悬浮液50μl，并于每一孔中加入50μl猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)病毒液(1×103TCID50)，再置于37℃、5％CO2的培养箱中培养72小时后，以灭菌PBS清洗2次，以80％丙酮在室温下固定15分钟，再以PBS液清洗3次去除固定液后，倒置放进37℃培养箱中风干后，保存于-20C下备用。该抗原盘可用来检测猪血清样本中是否含有抗猪第二型环状病毒(PCV2)的抗体。(Tischer et al.，1995)
实施例四猪第二型环状病毒(PCV2)检测套组的制备-2
于本实施例中，猪第二型环状病毒(PCV2)检测套组为含有本发明猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的重组外壳蛋白(capsid)(即ORF2基因片段编码的蛋白)的抗原盘。该重组外壳蛋白(capsid)具有如SEQ ID No：5(ORF2氨基酸序列)所示的序列，系作为抗原盘上的抗原。
首先，以聚合酶连锁反应(PCR)增幅本发明猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)ORF2DNA片段。取本发明猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)DNA，将该病毒DNA溶于50μl二次水作为DNA模板。使用GeneAmp PCR System2400反应器(购自Applied Biosystems)进行PCR。取8μl的DNA模版、5μl10倍PCR buffer(MDBio，Inc.)、8μl1.25mM dNTP、50μM正向及反向引子各1μl、0.5μl Pfu DNA polymerase(MDBio，Inc.)，最后以二次水补至总体积为50μl。PCR反应条件为：95℃反应5分钟后，进行95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，共25个循环，最后以72℃反应5分钟以进行延伸反应。将PCR产物以PCR-M纯化套组(Viogene)纯化之。其中该正向引子及反向引子为该领域具有通常技艺，可依本发明所提供的PCV2H株的DNA片段(如：ORF2 DNA片段)为模板以设计之。在本实施例中，该正向引子具有限制酶HindIII切位，而该反向引子具有限制酶XhoI切位。
接着，将该纯化后的PCR产物构筑于pET24a表现载体。先将该PCR产物与pET24a表现载体(Novagen)分别以Hind III及Xho I两种限制酶(New England Biolabs)，于37℃下，进行限制酶切割反应(Restriction Enzyme Cleavage Reaction)8小时。并以PCR-M纯化套组(Viogene)纯化该酶切后的PCR产物及pET24a表现载体。再将酶切后PCR产物与酶切后的pET24a载体进行接合反应 (ligation)，以取得pET24a-ORF2质体，并将该质体利用转殖作用(trarsformation)送入表现宿主大肠杆菌(E.coli)中，经选殖挑选出菌株中带有该PCR产物片段的质体后，进行定序确认增殖的PCR产物序列无误，以得到含有pET24a-ORF2质体的菌株。
再将含有pET24a-ORF2质体的菌株以2ml的LB培养基，于37℃培养16～18小时，再将菌液以1∶50的比例接种至含有25μg/ml kanamycin的新鲜LB培养基中，置于37℃、200rpm的培养箱中培养，直到菌液浓度达O.D600nm为0.6时，加入β-D-thiogalactoside(IPTG)使其最终浓度为1mM，再于37℃、200rpm的培养箱中培养6小时，吸取1ml菌液，经10,000×g离心后，取离心后的菌块以B-PERTM细菌蛋白质萃取试剂(B-PERTM Bacterial Protein Extraction，Pierce Protein Research Produces)来确认重组蛋白为可溶性蛋白或是包涵体(indusion body)。确认方法为于菌块中加入40μl的反应试剂，剧烈震荡(vortex)1分钟后，10,000×g离心，离心后重组蛋白在上层部份为可溶性蛋白，在下层部份则为包涵体。将可溶性蛋白容于SDS-PAGE用的1x sample buffer，下层的菌块则加入2x的SDS-PAGE sample buffer。以干浴槽100℃煮沸20分钟后离心之，吸取上层液体部份，以15％的SDS-PAGE确认重组蛋白表现的情况；确认无误后，取所得的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的重组外壳蛋白(capsid)进行抗原盘的制备。
以pH9.6PBS将所得的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的重组外壳蛋白(capsid)稀释至终浓度为10μg/ml，包覆于96孔微量平底培养盘(100μL/孔)，于37℃下作用2小时后，于4℃包覆过夜；以PBS洗涤3次，每次3～5分钟；每孔加200μL的0.15％BSA阻隔液(blocking solution)阻隔(block)该96孔微量平底培养盘，置于37℃作用2小时后以PBS洗涤，并存放于4℃下作为猪第二型环状病毒(PCV2)检测套组备用。
实施例五抗猪第二型环状病毒H株（PCV2H strain抗体的制备
1.抗PCV2H株的多株抗体：
培养PCV2H病毒株至适当的病毒力价后，采收病毒液进行去活化。将去活化后的病毒液与适用的佐剂(如：弗氏完全佐剂)混合后施与动物(如：鼠、猪、山羊、兔)以进行初级免疫，经适当时间间隔后(如：2～3周)，视需要以不活化后的病毒液及适当的佐剂(如：弗氏不完全佐剂)施与二级免疫。经适当时间间隔后(如：2～3周)，采集免疫动物(如：鼠、猪、山羊、兔)的血清，即制得抗PCV2H株的多株抗体。
其中该抗PCV2H株的多株抗体，可视需要与显色剂或荧光结合。
其中该动物经施予初级免疫及二级免疫后，可视需要增加免疫次数，以提高抗体力价。
其中施与的动物包含，但不限于：鼠、兔、禽(蛋)、猪、山羊、牛、水产动物。
2.抗PCV2H株的单株抗体：
将PCV2H株浓缩的病毒，或其特定PCV2H株的抗原片段(如：ORF2)的抗原蛋白施予动物(如：小鼠)，视需要可添加适当的佐剂(如：弗氏完全佐剂)，以进行初级免疫。经适当时间间隔后(如：2～3周)，视需要以不活化的病毒(或抗原蛋白)及适当的佐剂(如：弗氏不完全佐剂)施与二级免疫。经适当时间间隔后(如：2～3周)，采集免疫动物(如：小鼠)的血清，用以评估适合用以采集 脾脏细胞的小鼠。从该适用的小鼠采集脾脏细胞与骨髓瘤细胞(如：FO细胞株、NS细胞株)以PEG(Polyethylene Glycol，如PEG1500)进行细胞融合。从融合细胞中筛选出具分泌能力的融合瘤并单株化后，可得一适合用以产制抗PCV2H株的单株抗体的融合细胞系。
经上述制备所得的抗体，可用于免疫检测试剂、治疗剂、或加入食品、饲料中使食用者具有免疫力。
实施例六猪第二型环状病毒(PCV2)不活化疫苗的效力试验-1
1.小鼠免疫试验 
用5～6周龄健康雌性清洁级Balb/c小鼠60只作为试验动物，所有小鼠的猪第二型环状病毒(PCV2)酵素结合免疫吸附分析(ELISA)抗体皆呈阴性。将这60只小鼠随机分为4组，每组15只，第1～3组分别以肌肉注射3个批次的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)不活化疫苗，注射剂量为0.2ml/只，两周后用相同免疫剂量加强免疫一次；第4组为空白对照组，隔离饲养观察，首次免疫后第2、3、4、5周分别随机取出5只，采血分离血清，测定血清内猪第二型环状病毒(PCV2)的ELISA抗体力价。
2.血清抗体的判定-以酵素连结免疫分析(ELISA)测定猪第二型环状病毒(PCV2)抗体力价
可采用实施例三或实施例四所制备的抗原盘作为检测套组。以含有500μl/L Tween-20的50mmol/L PBS(pH7.2)(即PBST)洗涤抗原盘3次，每次3～5分钟；再于抗原盘中加入0.15％BSA阻隔液(blocking solution)(200μL/孔)，以阻隔(block)抗原盘，并于37℃下作用2小时后，以PBS洗涤。将待检测的小鼠血清以PBS缓冲液以1∶50倍数稀释，然后再做倍比稀释；每孔加100μL稀释的小鼠血清，于37℃下作用1小时后，以PBS洗涤；然后加入酵素(辣根过氧化酵素(Horseradish peroxidase，HRP)标定的二级抗体(如：兔抗鼠的二级抗体)，于37℃下作用1小时后，以PBS洗涤；接着加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺二盐酸(3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine，TMB)溶液显色，最后用2mM的H2SO4终止反应后判定结果。判定结果标准为：血清样本OD450值/阴性血清OD450值(P/N值)≥2.1为阳性。以P/N值≥2.1的血清最大稀释度作为该血清样本的ELISA抗体力价。
除了本实施例所用的辣根过氧化酵素(HPR)与TMB之外，亦可使用其他具有相同功能的显色试剂、或荧光标记，如：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AP)、4-甲基伞形酮磷酸酯(4-Methylumbelliferyl Phosphate，4-MUP)、荧光异硫氰酸盐(Fluorescein isothiocyanate，FITC)。
3.结果
小鼠经不同批次的疫苗首次免疫后，于首次免疫后第二周起均可从小鼠血清中检测出抗猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)的抗体，再经加强免疫后，其ELISA抗体力价于首次免疫后35天可达1800～2000(图5)；由此可知，本发明所提供的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)不活化疫苗可有效诱发小鼠体内的免疫反应。
实施例七猪第二型环状病毒(PCV2)不活化疫苗的效力试验-2
1.猪体免疫试验 
取约5～6周龄健康仔猪2头，以肌肉注射猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)不活化疫苗，注射剂量为1ml/头，三周后用相同免疫剂量加强免疫次；于首次免疫前(约5～6周龄)、二次免疫前(约8～9周龄)，以及二次免疫后2周(约10～11周龄)分别采集血清及秤重，并以ELISA检测血清中的抗体力价。
2.血清抗体的判定-以酵素连结免疫分析(ELISA)测定猪第二型环状病毒(PCV2)抗体力价
以实施例三或实施例四所制备的抗原盘作为检测套组。以含有500μl/L Tween-20的50mmol/L PBS(pH7.2)(即PBST)洗涤抗原盘3次，每次3～5分钟；再于抗原盘中加入0.15％BSA阻隔液(blocking solution)(200μL/孔)，以阻隔(block)抗原盘，并于37℃下作用2小时后，以PBS洗涤。将待检测的猪血清以PBS缓冲液以1∶50倍数稀释，然后再做倍比稀释；每孔加100μL稀释的猪血清，于37℃下作用1小时后，以PBS洗涤；然后加入二级抗体(如：山羊抗猪的二级抗体)，于37℃下作用1小时后，以PBS洗涤；接着加入TMB溶液显色，最后用2mM的H2SO4终止反应后判定结果。判定结果标准为：血清样本OD450值/阴性血清OD450值(P/N值)≥2.1为阳性。以P/N值≥2.1的血清最大稀释度作为该血清样本的ELISA抗体力价。
3.结果
请参阅表二，仔猪以本发明猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)不活化疫苗免疫后，于首次免疫后三周内可从仔猪血清中检测出抗猪第二型环状病毒H株(PCV2 H strain)的抗体，再经二次免疫后二周内，其ELISA抗体力价可达11,000以上；由此可知，本发明所提供的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)不活化疫苗可有效诱发仔猪体内的免疫反应。
表二以ELISA判定仔猪血清样本中的抗体力价的结果
实施例八猪第二型环状病毒(PCV2)不活化疫苗的效力试验-3
1.猪体免疫试验 
请参阅表三，取约2周龄健康仔猪40头，随机分为4组，每组10头。于3周龄时第1～3组分别以肌肉注射3个批次的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)不活化疫苗，注射剂量为1ml/头，三周后用相同免疫剂量加强免疫一次；第4组为空白对照组，隔离饲养；首免前第1周(约2周龄)及首免疫后第1(约4周龄)、2(约5周龄)、3(约6周龄)和第5周(8周龄)分别采集血清及秤重，并以IFA检测仔猪血清中抗体力价。
表三猪只免疫计划及检测项目
2.血清抗体的判定-免疫荧光分析法(IFA)法测定猪第二型环状病毒(PCV2)抗体力价
将实施例三制得的猪第二型环状病毒(PCV2)抗原盘由-20℃低温保存环境取出之后，倒置放进37℃培养箱中风干。将收集的猪只血清样本先以PBS buffer进行50倍稀释，然后连续以2倍稀释的方式进行稀释，再将稀释的血清样品分注于猪第二型环状病毒(PCV2)抗原盘中，每孔分注50μl。再将抗原盘置于37℃培养30分钟后以PBS清洗3次，以去除未作用的抗体，每孔再加入50μl rabbit-anti-pig IgG FITC conugate(1∶100，Sigma)，避光培养30分钟后以PBS清洗3次，于荧光显微镜下观察，并进行猪第二型环状病毒(PCV2)抗体力价判定。(Rodriguez-Arrioa et al.，2000)
3.结果
3.1抗体力价
请参阅表四及图6所示，仔猪经不同批次的疫苗首次免疫后，于首次免疫后第二周(5周龄)时，其抗体力价已升至约600，而对照组则无变化。再经二次免疫(6周龄)后，发现免疫组的抗体力价皆大幅度提升；于8周龄时，其抗体力价亦较6周龄时更为提升，而对照组仍无变化。
表四以IFA判定仔猪血清样本中的抗体力价的结果
3.2增重趋势
请参阅表五及图7所示，相较于对照组，仔猪经不同批次的疫苗免疫后，免疫组的体重增重趋势，明显高于对照组的增重趋势。至8周龄时，免疫组的仔猪体重明显高于对照组约2公斤。表五猪只的增重趋势(单位：公斤)
因此，经本发明的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)不活化疫苗免疫后的猪只，其抗体力价可大幅度提升，改善猪只的免疫力，进而促使猪只的增重率上升。
实施例九猪第二型环状病毒(PCV2)不活化疫苗的效力试验-4
1.猪体免疫试验 
取14～16日龄猪第二型环状病毒(PCV2)抗体呈阴性的健康仔猪20头，随机分为4组，每组5头。第1～3组分别以肌肉注射3个批次的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)不活化疫苗，注射剂量为1ml/头，两周后用相同免疫剂量加强免疫一次；第4组为空白对照组，隔离饲养；首次免疫后第5周以第二型环状病毒H株(PCV2H strain)(强毒株)(106.0TCID50/ml)攻毒，每头猪滴鼻1ml、肌肉注射2ml，攻毒后第7、11、19和25天采集血清和鼻拭的样品，以PCR检测有无病毒。
2.以PCR侦测猪第二型环状病毒(PCV2)(病毒血症)
以聚合酶连锁反应(PCR)检测猪只血液样本内猪第二型环状病毒(PCV2)。病毒DNA的萃取用试剂，基本步骤为：于200μL血清中加入400μL DNAzol，以12,000rpm/min离心15min后取上清，并加入2倍体积的无水乙醇沉淀，再以12,000rpm/min离心15min后弃掉上清液，以75％乙醇洗涤DNA，再以12,000rpm/min离心5min后弃掉上清液，最后以8mM NaOH溶DNA。
PCR所用的引子序列如下：
PCV2-F1：5’GTGAAGTGGTATTTTGGTGCC3’              (SEQ ID No：8)
PCV2-Ri：5’GTCTTCCAATCACGCTTCTGC3’              (SEQ ID No：9)
预期扩增片段在PCV2ORF1区域，增幅的PCR产物大小为284bp。PCR反应总体积为25μL，含正向引子PCV2-F1 1μL、反向引子PCV2-R1 1μL、25mM Mg2+1.5μL、2.5mM dNTPs2.0μL、10×Mg2+free buffer2.5μL、Taq DNA聚合酶0.2μL、二次蒸馏水11.8μL，以及模板DNA5μL。PCR反应条件为：95℃反应5分钟后，进行94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒，共38个循环，再以72℃反应5分钟以进行延伸反应，最后则维持在4℃。PCR产物以1％琼脂糖凝胶电泳分析。另，用以检测猪只血液样本内猪第二型环状病毒(PCV2)的引子序列亦可为：
PCV2-F2：5’TGTTGGCGAGGAGGGTAATG’3                 (SEQ ID No：10)
PCV2-R2：5’TGGGACAGCAGTTGAGGAGT’3               (SEQ ID No：11)
利用该引子对可增幅的PCR产物大小为676bp。
3.病理解剖和病理组织学观察
猪只于攻毒后第25天宰杀解剖，以观察脏器病理变化，并采集淋巴结和肺脏组织，以4％甲醛固定，制备石蜡切片，进行苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining)，显微镜观察组织病变。
4.结果
4.1病毒血症
从PCR检测病毒血症的结果可知，在攻毒后25天时，免疫组(第1～3组)的病毒血症发生率比未免疫的对照组(第4组)的病毒血症发生率低40～60％(表六)，表示本发明的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)不活化疫苗可诱发猪只产生免疫力、降低病毒血症的严重性、缩短病毒血症的感染时间，进而提供猪只足够的保护效果以抗猪第二型环状病毒(PCV2)的感染。
表六、免疫猪只经猪第二型环状病毒(PCV2)攻毒后，病毒血症的检测结果
a分母为检测猪总头数，分子为PCR结果呈阳性猪头数
4.2病理变化
请参阅表七及表八，猪只攻毒后第25天宰杀解剖，进行病理学观察，结果显示：攻毒对照组中2只仔猪的腹股沟淋巴结、肺门淋巴结和肠系膜淋巴结明显水肿、切面苍白，1只仔猪的肺脏弹性变小、水肿，或肾脏变黄，有少量灰白色点；而免疫组仔猪则皆没有明显的病理变化。
表七、猪攻毒后的肉眼病理变化观察统计结果
a.分母为剖解猪总头数，分子为有病变猪头数；
b.其它病变包括肝胆轻度肿大，肠道鼓气。
表八为不同试验猪只经攻毒后，其病理变化及猪第二型环状病毒(PCV2)检测结果，结果显示：攻毒对照组中各猪只的病理变化明显，如：淋巴结内淋巴细胞缺失(5/5)、巨噬细胞浸润(4/5)、淋巴结中猪第二型环状病毒(PCV2)PCR检测结果均为阳性(5/5))；3只仔猪的肺脏组织有炎性细胞浸润、肺组织中猪第二型环状病毒(PCV2)PCR检测结果有2只仔猪呈阳性；相较于未免疫的对照组仔猪，免疫组仔猪具有病理变化及病毒血症的情况明显减少，3个免疫组中只有1只仔猪(编号：A4)的淋巴结出现组织病理变化，淋巴结和肺组织中猪第二型环状病毒(PCV2)PCR检测结果呈阳性。因此，该三批次的猪第二型环状病毒H株(PCV2 H strain)灭活疫苗对于猪只均有明显保护作用，其保护率约为80％～100％。
表八、不同试验猪只经攻毒后，其病理变化及PCV2检测结果
*分母为检测猪总数，分子为出现该病变或病毒的猪数。
综上所述，本发明所提供的猪第二型环状病毒H株(PCV2H strain)疫苗除可诱发猪只产生免疫力外、亦可降低病毒血症的严重性、缩短病毒血症的感染时间、改善其临床症状，进而对抗猪第二型环状病毒(PCV2)的感染，提供猪只足够的保护效果，促使猪只的生理状况更趋健康(如：增重趋势)，更提供畜猪业者一保护猪只对抗猪第二型环状病毒(PCV2)感染的方法，藉此有效提升猪只饲养率。

Claims (16)

1.猪第二型环状病毒(Porcine Circovirus Type 2,PCV2)H株，其基因组序列如SEQ ID No:1所示。
2.一种含有如权利要求1所述的猪第二型环状病毒H株的免疫组合物。
3.如权利要求2所述的免疫组合物，其中该免疫组合物进一步包含药学上可接受的载体。
4.如权利要求3所述的免疫组合物，其中该载体为一佐剂。
5.如权利要求2所述的免疫组合物，其中该猪第二型环状病毒株H经过灭活处理。
6.如权利要求2所述的免疫组合物，其中该猪第二型环状病毒H株经过减毒处理、或为亚单位形式、或为DNA形式。
7.如权利要求2所述的免疫组合物，进一步包含至少一种病原抗原，该病原抗原选自由下列群组所组成：猪流感病毒(SIV)抗原、猪繁殖与呼吸症候群病毒(PRRSV)抗原、猪支原体(Mycoplasma)抗原、猪细小病毒(Parvovirus,PPV)抗原、猪丹毒(Erysipelas)抗原，以及伪狂犬病(Aujeszky's disease)抗原。
8.一种抗猪第二型环状病毒H株的抗体，所述该抗体可与包含SEQ ID No:4的猪第二型环状病毒(PCV2)相结合；所述猪第二型环状病毒H株的基因组序列如SEQ ID No:1所示。
9.如权利要求8所述的抗体，该抗体包含至少下列其中一种：一单株抗体、一多株抗体，以及一经基因重组的抗体。
10.一种多核苷酸(polynucleotide)，编码如权利要求1所述的猪第二型环状病毒H株的多肽)序列，该多肽的序列包含SEQ ID No:5。
11.如权利要求10所述的多核苷酸，其中该序列包含SEQ ID No:4。
12.一种猪第二型环状病毒H株的检测套组，包含一侦测单元，该侦测单元选自于下列群组所组成中至少一者：一如权利要求1所述的猪第二型环状病毒H株的病毒抗原、一可与包含SEQ IDNo:4的猪第二型环状病毒H株相结合的抗体，所述猪第二型环状病毒H株基因组序列如SEQ IDNo:1所示、一如SEQ ID No:4所示的多核苷酸序列，以及一侦测如SEQ ID No:1所示序列的核酸片段。
13.如权利要求12所述的检测套组，其中该病毒抗原置于一96孔微量平底培养盘上。
14.如权利要求13所述的检测套组，其中该病毒抗原经过灭活处理。
15.如权利要求12所述的检测套组，其中该抗体包含至少下列其中一种：单株抗体、多株抗体、经基因重组的抗体。
16.如权利要求12所述的检测套组，其中该核酸片段的序列为至少下列其中一种：SEQ ID No:8、SEQ ID No:9、SEQ ID No:10，以及SEQ ID No:11。
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