UA110632C2 - Цирковірус свиней 2 типу (цвс2), імуногенна композиція, що містить його, набір для аналізу та їх застосування - Google Patents

Цирковірус свиней 2 типу (цвс2), імуногенна композиція, що містить його, набір для аналізу та їх застосування Download PDF

Info

Publication number
UA110632C2
UA110632C2 UAA201309034A UAA201309034A UA110632C2 UA 110632 C2 UA110632 C2 UA 110632C2 UA A201309034 A UAA201309034 A UA A201309034A UA A201309034 A UAA201309034 A UA A201309034A UA 110632 C2 UA110632 C2 UA 110632C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
strain
tsvs2
cvs2
antigen
porcine circovirus
Prior art date
Application number
UAA201309034A
Other languages
English (en)
Inventor
Тсунь-Юньг Ко
Хсу Чунг Габріель Чень
Чунг-Чін У
Хань-Тін Чень
Original Assignee
Сбк Вірбак Лімітед
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сбк Вірбак Лімітед filed Critical Сбк Вірбак Лімітед
Publication of UA110632C2 publication Critical patent/UA110632C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5252—Virus inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55566—Emulsions, e.g. Freund's adjuvant, MF59
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/00061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2750/00063—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/10011—Circoviridae
    • C12N2750/10071—Demonstrated in vivo effect
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/01—DNA viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms

Abstract

Винахід належить до штаму цирковірусу свиней 2 типу (ЦВС2), який був депонований у Китайському центрі колекції типових культур (ССТСС) під номером доступу V201117. Винахід також передбачає імуногенні композиції, що містять новий штам ЦВС2, набір для аналізів на ЦВС2 і застосування нового штаму ЦВС2.

Description

Галузь винаходу
Даний винахід стосується галузі ветеринарії, зокрема, нового штаму цирковірусу свиней 2 типу (ЦВС2), імуногенної композиції, що містить штам вірусу, набору для аналізу на ЦВС2 і застосування штаму вірусу.
Передумови винаходу
Уперше цирковірус свиней (ЦВС) був виявлений у клітинній лінії нирок свині (РК-15, АТОС
СС 33). Незважаючи на те, що цирковірус свиней може постійно контамінувати клітини РК-15, вірус не викликає цитопатичний ефект (СРЕ) на контаміновані клітини РК-15. Більше того, ЦВС, отриманий з РК-15, вважається непатогенним. Незважаючи на те, що цирковірус свиней може інфікувати свиней, він не викликає патологічних змін у інфікованих свиней. Цирковірус свиней являє собою вірус ікосаєдричної форми з одноланцюговою ДНК та кільцевим геномом з 1759 пар основ (п.0о.). ЦВС, отриманий з РК-15, в 1995 році був віднесений до родини Сігсомігідає.
В 1991 році в Канаді у свиней уперше був зареєстрований синдром мультисистемного виснаження після відлучення (РМУУ5). РМУУЗ вражає поросят віком від 5 до 12 тижнів. Клінічно він характеризується такими симптомами, як прогресуюча втрата ваги, задишка, блідість і періодична жовтяниця. Характерні для нього мікроскопічні осередки ушкодження включають виснаження лімфоїдної тканини з гістіоцитарними інфільтратами в межах лімфоїдних органів, пневмонію, гранульоматозне запалення, гепатит та нефрит. Після спалаху 1991 року в Канаді про РМУУЗ повідомляли в багатьох країнах Північної Америки, Європи та Азії. Пізніше зі свиней з РМУУ5 був виділений новий цирковірус. Оскільки морфологія цирковірусу свиней, виділеного при РМУУ5, дуже подібна морфології ЦВС, отриманого з РК-15, два цирковірусу свиней мають тільки 6895-7695 гомології в їхніх геномних послідовностях. Непатогенний ЦВС, отриманий з РК- 15, і патогенний ЦВС, отриманий при РМУУ5, були додатково ідентифіковані як цирковірус свиней 1 типу (ЦВС) і цирковірус свиней 2 типу (ЦВС), відповідно.
Цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2) також належить до родини Сігсомігідае. ЦВС2 являє собою вірус без оболонки, ікосаеєдричної форми, діаметром 17 нм з одноланцюговою кільцевою ДНК і відомий як один із найменших вірусів тварин. Кільцевий геном ЦВС2 містить точку початку реплікації зі структурою типу "стебло-петля", яка є загальною характеристикою цирковірусів.
Геном ЦВС2 включає 1767 або 1768 нуклеотидів і, як передбачається, має 11 потенційних
Зо відкритих рамок зчитування (ОКЕ). Серед 11 ОКЕ ОКЕ 1 та ОКЕ 2, імовірно, є найбільш важливими генами, які кодують реплікацію білків (Кер та Кер) та капсидний білок (Сар), відповідно. Капсидний білок (Сар), який кодується геном ОКЕ2 ЦВС2, цілком імовірно, буде являти собою антиген, який індукує вироблення нейтралізуючих антитіл.
Інфекція ЦВС2 поширена на більшості свиноферм у світі. Було виявлено, що ЦВС2 є причиною низьких рівнів виживання та низьких коефіцієнтів конверсії корму (ЕСЕ) в інфікованих свиней і призводить до великих економічних втрат у свинарстві. Отже, важливо розробити набори для аналізів на ЦВС2 і вакцину проти ЦВС2.
Короткий опис винаходу
Перший аспект даного винаходу стосується штаму ЦВС2, який був виділений зі свиней, у котрих проявлялись клінічні симптоми синдрому мультисистемного виснаження після відлучення (РІМУУ5), та в подальшому досліджений та підтверджений як новий штам ЦВС2 (штам ЦВС2 Н). Позитивний (ж) ланцюг геному штаму ЦВС2 (штаму ЦВС Н) має послідовність
ДНК 5ЕО ІО Мо: 1. Новий штам ЦВС2 був депонований у Китайському центрі колекції типових культур (ССТСОС) 5 листопада 2011 року під номером доступу М201117.
Другий аспект даного винаходу стосується імуногенної композиції, що містить новий штам
ЦВС2 (штам ЦВС Н). В одному переважному варіанті здійснення імуногенна композиція являє собою вакцину, що містить інактивований вірус або атенуйований вірус нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н) і фармацевтично прийнятний носій. Однак типи вакцини включають без обмеження інактивовану вакцину, живу (атенуйовану) вакцину (через ослаблення вірусу), субодиничну вакцину, ДНК-вакцину та інші вакцини, отримані та вироблені на основі нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н) або з ДНК або амінокислотних послідовностей нового штаму
ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н).
Спосіб інактивації (або обробка, яка інактивує) даного винаходу включає без обмеження обробку інактивуючим реагентом, теплову обробку та інші способи обробки, відомі фахівцеві в даній галузі. Інактивуючі реагенти включають без обмеження формальдегід, параформальдегід, бета-пропіолактон (ВРІ)), бінарний етиленімін (ВЕЇ) або інші інактивуючі реагенти, придатні для даного винаходу.
Фармацевтично прийнятні носії включають без обмеження розчинник, емульгатор, суспендуючу речовину, деструктор, зв'язувальну речовину, наповнювач, стабілізатор, 60 хелатоутворювач, розріджувач, загусник, консервант, змащувальну речовину, поверхнево-
активну речовину, ад'ювант або інші придатні носії.
Ад'ювант включає без обмеження масляний ад'ювант (такий як мінеральне масло, рослинна олія, тваринний жир, повний ад'ювант Фрейнда, неповний ад'ювант Фрейнда і т.д.), водний ад'ювант (такий як гідроксид алюмінію), двофазний ад'ювант для утворення емульсій (такий як "вода в маслі у воді", в/м/в, емульсійний ад'ювант), біологічний ад'ювант (такий як Сро- олігодеоксинуклеотид і токсоїд) і т.д. Двофазний ад'ювант для утворення емульсій включає поверхнево-активну речовину та маслянисту речовину. Поверхнево-активна речовина являє собою одну або декілька речовин, вибраних із групи, що включає складний ефір сорбіту та жирної кислоти; концентрат складного ефіру сорбіту і жирної кислоти та етиленоксиду (або пропіленоксиду); складний ефір маніту та жирної кислоти; концентрат складного ефіру маніту і жирної кислоти та етиленоксиду (або пропіленоксиду); складний ефір модифікованого маніту і жирної кислоти з гідрофільною групою, яка являє собою одну або декілька груп, вибраних з групи, що включає карбонову кислоту, амін, амід, спирт, поліол, простий ефір та оксид; складний ефір ангідроманіту та жирної кислоти; складний ефір модифікованого ангідроманіту та жирної кислоти з гідрофільною групою, яка являє собою одну або декілька груп, вибраних із групи, що включає карбонову кислоту, амін, амід, спирт, поліол, простий ефір та оксид; складний ефір сахарози та жирної кислоти; концентрат складного ефіру сахарози і жирної кислоти та етиленоксиду (або пропіленоксиду); складний ефір гліцерину та жирної кислоти; концентрат складного ефіру гліцерину і жирної кислоти та етиленоксиду (або пропіленоксиду); концентрат жирної кислоти та етиленоксиду (або пропіленоксиду); концентрат жирного спирту та етиленоксиду (або пропіленоксиду) і гліцерофосфоліпід. Масляниста речовина являє собою одну або декілька речовин, вибраних із групи, що включає мінеральне масло, рослинну олію та тваринний жир.
Імуногенна композиція даного винаходу додатково містить щонайменше один антиген патогену. Антигени патогенів включають без обмеження антиген вірусу свинячого грипу (51ІМ), антиген вірусу репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (РКЕК5БУМ), антиген мікоплазми, антиген парвовірусу свиней (РРМ), антиген бешихи свиней та антиген вірусу псевдосказу (хвороби Ауески). Типи антигенів патогенів включають без обмеження рекомбінантні білки, субодиничні білки, патогени з дефектом гена, антигени інактивованих патогенів і т.д.
Зо Третій аспект даного винаходу стосується способу захисту свиней від інфекції ЦВС2, який включає введення імунологічно ефективної дози зазначеної імуногенної композиції ЦВС2 свині для підвищення її імунітету проти інфекції ЦВС2, зменшення тяжкості вірусемії та клінічних симптомів, а також підвищення рівня виживання та маси тіла.
Четвертий аспект даного винаходу стосується антитіла до ЦВС2, отриманого з нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н). Антитіло включає без обмеження моноклональні антитіла, поліклональні антитіла та отримані способами генної інженерії антитіла. В одному переважному варіанті здійснення антитіло являє собою поліклональне антитіло, отримане через ін'єкцію тварині нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н). В іншому переважному варіанті здійснення антитіло являє собою моноклональне антитіло, отримане через скринінг бібліотеки гібридом моноклональних антитіл.
П'ятий аспект даного винаходу стосується фрагментів ДНК нового штаму ЦВС2 (штаму
ЦВС2 НН). Фрагменти ДНК мають нуклеотидні послідовності 5ЕО ІЮ Мо: 1, 2, 4 та 6.
Застосування фрагментів ДНК включають без обмеження виробництво ДНК-вакцини та субодиничної вакцини та конструювання праймерів або зондів для виявлення ЦВС у зразку. В одному переважному варіанті здійснення фрагмент ДНК являє собою послідовність повнорозмірного геному (ЗЕО ІО Мо: 1) нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н). В іншому переважному варіанті здійснення фрагменти ДНК являють собою відкриті рамки зчитування (ОКЕ) нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС Н), які включають без обмеження відкриту рамку зчитування 1 (ОКЕ1), що має нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 2, яка
БО кодує амінокислотну послідовність ХЕО ІЮ Мо: З, відкриту рамку зчитування 2 (ОКЕ2), що має нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮО Мо: 4, яка кодує амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ Мо: 5, та відкриту рамку зчитування З (ОКЕЗ), що має нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮО Мо: б, яка кодує амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ Мо: 7.
Шостий аспект даного винаходу стосується набору для аналізу на ЦВС2. Набір для аналізу застосовується для виявлення ЦВС2 або антитіл до ЦВС2 у досліджуваному зразку. Набір для аналізу містить без обмеження (1) антиген нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н), в одному переважному варіанті здійснення, антиген нанесений на планшет з антигеном та інактивований інактивуючим реагентом; (2) моноклональне або поліклональне антитіло, отримане з нового бо штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н); (3) отриманий(е) способами генної інженерії антиген або антитіло, одержані з послідовності повнорозмірного геному (ЗЕО ІЮО Мо: 1) або нуклеотидних фрагментів (ЗЕ ІЮ Мо: 2, 4 їі 6) нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВСО2 Н); ї (4) полінуклеотид, отриманий з послідовності повнорозмірного геному (ЗЕО ІО Мо: 1) або нуклеотидних фрагментів (5ЕО ІО Мо: 2, 4 та 6) нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н). Полінуклеотид включає без обмеження праймери та зонди. В одному переважному варіанті здійснення полінуклеотид являє собою праймер, який може бути застосований для виявлення нового штаму ЦВС2 (штаму
ЦВС Н), і при цьому праймери мають нуклеотидні послідовності зБЕО ІО Мо: 8-11.
Типи набору для аналізу включають без обмеження набір для твердофазного імуносорбентного аналізу (ЕГІЗА), набір з мікрочіпом, набір для імунофлуоресцентного аналізу (ІРА), набір для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) та інші набори для аналізів, отримані на основі нового штаму ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н). В одному переважному варіанті здійснення набір для аналізу містить щонайменше планшет з антигеном, який включає новий штам ЦВС2 (штам
ЦВС Н), і при цьому набір для аналізу може застосовуватися для виявлення антитіл до ЦВС2 у досліджуваному зразку.
Новий штам ЦВС2 (штам ЦВС2 Н) даного винаходу включає всі субкультивовані пасажі та мутанти, які мають подібні вірусні характеристики, геном або патогенність, як у нового штаму
ЦВС2 (штаму ЦВС2 Н).
Вирази "ДНК (нуклеїнова кислота)", "полінуклеотид", "амінокислота", "пептид", "поліпептид" у даному винаході можуть зустрічатися в природному, виділеному, рекомбінантному або синтетичному стані.
Вирази "попередження", "захист" і "проти" стосуються результатів спостереження, які порівнювали з результатами спостереження стосовно невакцинованих розкритою імуногенною композицією тварин, при цьому вакциновані розкритою імуногенною композицією тварини можуть мати підвищену здатність протистояти інфекції ЦВС2 і спорідненим захворюванням, що виникли в результаті інфекції ЦВС2.
Значення технічних і наукових виразів, як описано в даному документі, може бути чітко зрозумілим фахівцем в даній галузі.
Даний винахід більш докладно описаний в нижченаведених ілюстративних прикладах. Хоча приклади можуть представляти тільки вибрані варіанти здійснення даного винаходу, слід
Зо розуміти, що нижченаведені приклади є ілюстративними, а не обмежуючими.
Короткий опис графічних матеріалів
Фігура 1А: неінфіковані клітини РК-15, культивовані протягом 4 днів (масштаб (100х)); фігура 18: клітини РК-15, інфіковані штамом ЦВС Н, культивовані протягом 4 днів (масштаб (100х)).
Фігура 2: філогенетичний аналіз геномної послідовності штаму ЦВС2 Н.
Фігура 3: вирівнювання амінокислотної послідовності ОКЕ2 (5ЕО ІО Мо: 5) штаму ЦВС2 Н та трьох інших амінокислотних послідовностей, які мають найбільшу схожість послідовностей з амінокислотною послідовністю ОКЕ2 штаму ЦВС2 Н у базі даних СепрапКк Національного центру біотехнологічної інформації (МСВІ).
Фігура 4: вирівнювання амінокислотної послідовності ОКЕ2 штаму ЦВС2 Н та амінокислотної послідовності ОКЕ2 (доступ в Сепрапк: АЮО25772) прототипу ЦВС2 2а (доступ в бепрапк: 2209555).
Фігура 5: результати ЕГІЗА ЦВС2 зразків сироватки, взятих у різні моменти часу в мишей, вакцинованих інактивованою вакциною на основі штаму ЦВС2 Н.
Фігура 6: результати ІРА ЦВС2 зразків сироватки, взятих у різні моменти часу в поросят, вакцинованих інактивованою вакциною на основі нового штаму ЦВС2 Н.
Фігура 7: маси тіл поросят, вакцинованих інактивованою вакциною на основі штаму ЦВС Н.
Докладний опис переважних варіантів здійснення
Приклад 1. Виділення та ідентифікація ЦВС2 1. Джерело та виділення посівного вірусу
Зразки тканини відбирали з легенів та лімфовузлів поросят на свинофермі в Синьчжу,
Тайвань. У даних поросята 8-тижневого віку проявлялися клінічні симптоми синдрому мультисистемного виснаження після відлучення (РУММ5). Зразки легенів та лімфовузлів збирали та заморожували при -70 "С.
Для виділення вірусів зразки тканин гомогенізували, та 0,2 мл кожного гомогенату інокулювали в моношар клітин РК-15 або їх похідні клітинні лінії, які не містять цирковірус свиней (ЦВС), вірус класичної чуми свиней (С5ЕМ), аденовірус свиней, парвовірус свиней, вірус репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (РКК5ЗМ), вірус псевдосказу (РЕМ), вірус везикулярної хвороби свиней (ЗМОМ), мікоплазму та бактерії. Після інкубування протягом 1 години при 37 "С, 595 СО», клітини три рази відмивали стерильним фосфатно-буферним бо сольовим розчином (РВ5). Потім протягом 4 годин клітини інкубували в середовищі МЕМ, яке містило 296 ЕВ5, при 37 "С, 595 СО». Після цього середовище МЕМ видаляли та клітини інкубували з 300 мМ О-глюкозаміну протягом 30 хвилин. Потім клітини три рази відмивали стерильним РВ5 та інкубували протягом 72 годин у середовищі МЕМ, яке містило 895 ЕВ5, при 37"С, 595 СО». Наприкінці культури клітин досліджували на ЦВС2 за допомогою імунофлуоресцентного аналізу (ІРА).
Протокол ІРА описаний наступним чином. По-перше, клітини зразків три рази відмивали стерильним РВ5, 5 хвилин щоразу, і фіксували за допомогою 75 мкл 8095 ацетону протягом 30 хвилин при 4 "С. Потім ацетон видаляли та клітини відмивали три рази стерильним РВ5, 5 хвилин щоразу. Після цього клітини інкубували з 75 мкл противірусної поліклональної імунної сироватки до цирковірусу свиней (ММКОФ) (первинне антитіло, розведення 1:1500 в РВ5) протягом 30 хвилин при 37 "С. Потім видаляли імунну сироватку та клітини відмивали три рази стерильним РВ5, 5 хвилин щоразу. Після цього клітини інкубували з 75 мкл кон'югату РІТС-ІДа кроля до антитіла свині (ціла молекула) (Зідта, Е1638) (вторинне антитіло, розведення 1:1000 в
РВ5) протягом 30 хвилин при 37 "С. Потім антитіло видаляли та клітини відмивали три рази стерильним РВ5, 5 хвилин щоразу. Наприкінці кожний зі зразків клітин в 96б-лунковому культуральному планшеті поміщали в 200 мкл РВ5З5 для флуоресцентного мікроскопічного дослідження.
Вірус, який інфікував клітини та дав найбільшу кількість позитивних результатів ІРА, вибирали в якості посівного вірусу. Потім визначали геномну послідовність посівного вірусу, як зазначено в 5ЕО ІО Мо: 1. Послідовність вирівнювали, аналізували та наприкінці затверджували в якості нового штаму ЦВС (аналізи та результати вирівнювання послідовності описані нижче).
Даний новий штам ЦВС2 назвали штамом ЦВС Н. 2. Пересівання посівного вірусу
Свіжоотримані клітини РК-15 або їх похідні клітинні лінії інокулювали новим штамом ЦВС2 (штамом ЦВС Н), та вірус, отриманий з інокульованих клітин, являв собою пасаж 1 (Р:и) штаму
ЦВС Н. Супернатант культури клітин, який містив Рі штаму ЦВС2 Н, збирали, розводили (1:2) та інокулювали у свіжоотримані клітини РК-15 або їх похідні клітинні лінії. Після цього інокульовані клітини інкубували протягом З днів, супернатант культури клітин, який містив пасаж 2 (Рг) штаму ЦВС2 Н, збирали, розводили (1:2) та інокулювали у свіжоотримані клітини РК-15
Зо або їх похідні клітинні лінії. Інокульовані клітини інкубували протягом З днів і надалі збирали супернатант культури клітин, який містив пасаж З (Рз) штаму ЦВС2 Н. Процес повторювали ще три рази для одержання пасажу 6 (Ре) штаму ЦВС2 Н.
Під час процесу культивування клітин РК-15 або їх похідних клітинних ліній, які інокульовані штамом ЦВС Н, в інокульованих клітинах спостерігали цитопатичний ефект (СРЕ), як показано на фіг. 18. Крім того, на фіг. ТА показана морфологія та ріст неінокульованих клітин РК-15 через 4 дні культивування (100х), тоді як на фіг. 18 показана морфологія та ріст інокульованих штамом ЦВС2 Н клітин РК-15 через 4 дні культивування (100х). Подібним чином, СРЕ, спостережуваний у похідних клітинних лініях РК-15, які інокульовані штамом ЦВС Н, на фіг. 18 може бути наведений для порівняння. 3. Ідентифікація посівного вірусу
Геном штаму ЦВС Н, виділеного в даному винаході, має нуклеотидну послідовність зЕО ІЮ
Мо: 1. Нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ Мо: 1 порівнювали з послідовностями в базі даних
Сепрапк Національного центру біотехнологічної інформації (МСВІ). Результати порівняння показали, що штам ЦВС2 Н був на 9995 гомологічним деяким послідовностям ЦВС (таблиця 1), але в базі даних не було послідовності, ідентичної (гомологічної на 10095) геномній послідовності штаму ЦВС2 Н (ЗЕО ІО Мо: 1). Таким чином, на підставі результатів вирівнювання показано, що вірус, виділений у даному винаході, штам ЦВС2 Н, належить до родини ЦВС2 і є новим штамом. На підставі філогенетичного аналізу геномної послідовності штаму ЦВС2 Н, представленого на фіг. 2, показано, що штам ЦВС2 Н є членом підгрупи ЦВС2 24.
Таблиця 1
Результати порівняння геномної ДНК штаму ЦВС Н та послідовностей у базі даних Сепрапк МСВІ із застосуванням МСВІ ВІ А5Т
Максимальний | Сумарний | Максимальна
Номер доступу Опис . показник показник ідент.
НМОЗ38017.1. | Чирковірус свиней 2, 3236 3236 штам ВОН цирковірус свиней 2, о а,и001710.1 ізопят В.109016 3236 з2г36 9996 цирковірус свиней 2, о
ЕЕРб675230.1 штам СХНІ-1 3236 з2г36 9996 цирковірус свиней 2, о сиОО083583.1 ізолят ЦВС2С53 з2г30 з2г30 9996 цирковірус свиней 2, о ,ОоЗ59002.1 штам СХО839 3230 з2г30 9996 цирковірус свиней 2, о
Еоб44929.1 ізопят СІ 08 3230 з2г30 9996 цирковірус свиней 2, о
Еда26398.1 штам СХ? -1 3230 з2г30 9996
НМО38030.1. | Чирковірус свиней 2, 3229 3229 99925 штам АН цирковірус свиней 2, о нМтв17103 з22я з22я зо,
Аналіз показує, що штам ЦВС2 Н даного винаходу має відкриті рамки зчитування (ОКЕ) 1, 2 та 3. ОКЕ1 має нуклеотидну послідовність 5ЕО ІО Мо: 2, яка кодує амінокислотну послідовність
ЗЕО ІЮ Мо: 3. ОКЕ2 має нуклеотидну послідовність 5ЕО ІЮ Мо: 4, яка кодує амінокислотну послідовність ЗЕО ІЮ Мо: 5. ОКЕЗ має нуклеотидну послідовність ЗЕО ІЮ Мо: б, яка кодує амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ Мо: 7.
Оскільки капсидний білок, який кодується геном ОКЕ2 ЦВС2, цілком імовірно, був би антигеном, який індукує вироблення нейтралізуючих антитіл, то нуклеотидну послідовність (ЗЕО
ІО Мо: 4) та амінокислотну послідовність (ЗЕО ІЮО Мо: 5) ОКЕ2 штаму ЦВС2 Н порівнювали з послідовностями в базі даних Сепрапк МСВІ. Результати порівняння показали, що в базі даних
Сепрапк МОВІ немає послідовності, ідентичної (гомологічної на 10095) нуклеотидній послідовності (ЗЕО ІЮ Мо: 4) або амінокислотній послідовності (ЗЕО ІЮ Мо: 5) ОКЕ2 штаму
ЦВС Н. Найбільша гомологія між амінокислотною послідовністю ОКЕ2 штаму ЦВС2 Н (ЗЕО ІО
Мо: 5) і послідовностями в базі даних Сепрапк складає 9895. На фіг. З показане вирівнювання амінокислотної послідовності ОКМЕ2 штаму ЦВС2 Н (ЗЕО ІО Мо: 5) і верхні три послідовності з найбільшою гомологією, при цьому вирівнювання вказує на те, що 6 амінокислот 5ЕО ІЮ Мо: 5 відрізняються від верхніх трьох послідовностей. Амінокислотну послідовність (ЗЕ ІЮ Мо: 5)
ОКЕ2 штаму ЦВС2 Н додатково порівнювали з амінокислотною послідовністю (доступ в
Сепрапк: А0О25772) ОКЕ2 прототипу ЦВС2 підгрупи 24 (доступ в СепрапкК: 29009555), і результати, показані на фіг. 4, вказують на те, що у двох послідовностях відрізняються 7 амінокислот, і дві послідовності мають гомологію 97905.
На додаток, нуклеотидні послідовності (ЗЕО ІЮО Мо: 2 ї 6) та амінокислотні послідовності (ЗЕО ІО Мо: З ї 7) ОРМЕ1 та ОКЕЗ штаму ЦВС2 Н порівнювали з послідовностями в базі даних
Сепрапк МСВІ. Результати порівняння показали, що в базі даних Сепрапк МСВІ немає послідовності, ідентичної (гомологічної на 10095) нуклеотидним послідовностям або амінокислотним послідовностям ОКЕТ або ОКЕЗ штаму ЦВС2 Н.
Дослідження вказують на те, що штам ЦВС2 Н даного винаходу є новим штамом цирковірусу свиней 2 типу (ЦВС2). Новий штам ЦВС2 був депонований у Китайському центрі
Зо колекції типових культур (ССТСС) 5 листопада 2011 року під номером доступу М201117.
Приклад 2. Одержання вакцини на основі штаму ЦВС2 Н 1. Культивування вірусу
Клітини РК-15, які не містили цирковірус свиней (ЦВС), вірус класичної чуми свиней (СЕМ), аденовірус свиней, парвовірус свиней, вірус репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (РКК5ЗУ), вірус псевдосказу (РЕМ), вірус везикулярної хвороби свиней (ЗМОМ), мікоплазму та бактерії, культивували в ростовому середовищі для культур клітин (середовище МЕМ, що містило 595 ЕВ5, рН 7,2:50,2) при 37 "С, 595 СО». Після утворення моношару клітин РК-15 клітини
РК-15 розділяли 0,296 трипсином-ЕДТА та суспендували в підтримуючому середовищі для культур клітин (середовище МЕМ, що містило 295 ЕВ5, рН 7,4:20,2) для підрахунку клітин. Потім клітини розбавляли ростовим середовищем для культури клітин до кінцевої концентрації 3,0х105 клітин/мл та розподіляли по ролер-флаконам для культивування протягом 3-4 днів при 37 "С, щоб досягти моношару, що злився. Після цього середовище для культур клітин видаляли з ролер-флаконів і клітини відмивали РВ5. Вихідний розчин вірусу штаму ЦВС2 Н розводили підтримуючим середовищем для культур клітин до кінцевої концентрації 1059 ТСІОво/мл та інокулювали ним моношари клітин РК-15 у ролер-флаконах. Для культивування вірусу інфіковані клітини інкубували протягом 48-96 годин при 37 "С. Титр вірусу штаму ЦВС2 Н контролювали за допомогою імунофлуоресцентного аналізу (ІРА). Потім для отримання розчину вірусу штаму ЦВС2 Н збирали супернатант культур клітин, коли титр вірусу досягав 1050
ТОіІОво/мл або вище, або коли цитопатичний ефект (СРЕ) досягав 7095 -- 80965. 2. Спосіб інактивації
Тридцять сім відсотків (3795, за вагою) формальдегіду додавали до розчину вірусу штаму
ЦВС2 Н, отриманого на вищевказаному етапі, до кінцевої концентрації 0,295 (вага/об'єм), а потім вірус інактивували шляхом безперервного струшування з формальдегідом протягом щонайменше 24 годин, переважно 48 годин, при 37 "С. Після того, як вірус був повністю інактивований, розчин вірусу штаму ЦВС2 Н, що містив формальдегід, центрифугували для видалення формальдегіду. Потім центрифугований розчин вірусу суспендували в буферному розчині, такому як дистильована вода або фосфатно-буферний сольовий розчин (РВ5), і суспендований розчин вірусу, що являв собою інактивований вихідний розчин антигену інактивованої вакцини на основі штаму ЦВС2 Н, зберігали при 4 "С для подальшого застосування. 3. Одержання інактивованої вакцини на основі штаму ЦВС2 Н
Стерилізований двофазний ад'ювант для утворення емульсій, такий як масляний ад'ювант вакцини МОМТАМІОЕ"М |БЗА 206 для емульсії вода в маслі у воді (в/м/в), додавали до інактивованого вихідного розчину антигену інактивованої вакцини на основі штаму ЦВС2 Н до
Зо кінцевої концентрації 5095 (об'єм/об'єм) в резервуарі для емульсії для змішування та емульгування. Емульгований продукт являє собою інактивовану вакцину на основі штаму ЦВС2
Н з маслом-ад'ювантом.
Інші придатні ад'юванти для інактивованої вакцини ЦВС2 даного винаходу, відомі фахівцям у даній галузі, також можуть застосовуватися в даному винаході в якості ад'ювантів. Двофазний ад'ювант для утворення емульсій (такий як емульсійний ад'ювант вода в маслі у воді), застосовуваний у даному прикладі, може бути замінений без обмеження масляним ад'ювантом (таким як мінеральне масло, рослинна олія, тваринний жир, повний ад'ювант Фрейнда, неповний ад'ювант Фрейнда і т.д.-), водним ад'ювантом (таким як гідроксид алюмінію) або біологічним ад'ювантом (таким як Сро-олігодеоксинуклеотид та токсоїд).
Приклад 3. Одержання набору для аналізу на ЦВС2 - 1
Набір для аналізу на ЦВС2 у даному прикладі являє собою планшет з антигеном, що містить вірусний антиген штаму ЦВС2 Н. По-перше, клітини РК-15 або їх моноклональні клітинні лінії культивували, трипсинізували та повторно суспендували в середовищі для культур клітин при кінцевій концентрації 2х105 клітин/мл. П'ятдесят мікролітрів (мкл) клітин РК-15 та 50 мкл вихідного розчину вірусу штаму ЦВС2 Н (1х103 ТСІОзо/мл) додавали в кожну лунку 96-лункового планшета для культур клітин (плоске дно) та інкубували протягом 72 годин при 37 "С, 595 СО».
Клітини, інфіковані штамом ЦВС2 Н, двічі відмивали стерильним РВЗ та фіксували 80905 ацетоном протягом 15 хвилин при кімнатній температурі. Потім видаляли ацетон і три рази відмивали клітини стерильним РВ5. Після цього планшет перевертали і потім просушували в термостаті при 37 "С. Просушений планшет являє собою планшет з антигеном, що містить вірусний антиген штаму ЦВС2 Н, і може бути використаний в аналізі ЕГІЗА для визначення кількості антитіл до ЦВС2 у зразку сироватки. Потім планшет зберігали при -20 С для подальшого застосування (Тізсепег зі співавт., 1995).
Приклад 4. Одержання набору для аналізу на ЦВС2 - 2
Набір для аналізу на ЦВС2 у даному прикладі являє собою планшет з антигеном, що містить рекомбінантний капсидний білок штаму ЦВС2 Н. Рекомбінантний капсидний білок являє собою антиген планшета з антигеном. Капсидний білок кодується геном ОКЕ2 штаму ЦВС2 Н та має амінокислотну послідовність 5ЕО ІЮ Мо: 5.
Нуклеотидну послідовність ОКЕ2 штаму ЦВС2 НН спочатку ампліфікували шляхом бо полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР). Вірусну ДНК штаму ЦВС2 Н застосовували в якості матричної ДНК у реакції ПЛР. Прямий праймер і зворотний праймер конструювали для ампліфікації нуклеотидної послідовності ОКЕ2. Прямий праймер у даному прикладі має сайт розщеплення Ніпап, а зворотний праймер у даному прикладі має сайт розщеплення Хпо |.
Праймери можуть бути сконструйовані фахівцями в даній галузі згідно нуклеотидної послідовності ОКЕ2 (ЗЕО ІО Мо: 4) даного винаходу. Для реакції ПЛР ПЛР-суміш, що містила 8 мкл матричної ДНК, 5 мкл 10х буфера ПЛР (МОВІО, Іпс.), 8 мкл аМмТР (кожного по 1,25 мМ), 1 мкл кожного праймера (кожного по 50 мкМ) і 0,5 мкл Ріш ДНК-полімерази (МОВІо, Іпс.), у кінцевому об'ємі 50 мкл поміщали в реактор СепеАтр РСК бузіет 2400 (Арріїей Віозувіе тв).
Реакцію ПЛР починали з вихідного етапу попереднього нагрівання ПЛР-суміші при 957 протягом 5 хвилин та ампліфікацію ДНК виконували за 25 циклів при наступних параметрах: денатурування при 95 "С протягом 30 секунд, відпалювання при 55 "С протягом 30 секунд і подовження при 72 "С протягом 30 секунд. Реакцію ПЛР завершили етапом кінцевого добудування протягом 5 хвилин при 72 "С. Продукти ПЛР очищали за допомогою набору для
РСВ-М Сієап Ор (Міодеп).
Після очищення продукти ПЛР вбудовували у вектор експресії рЕТ24а. Очищені продукти
ПЛР та вектор експресії рРЕТ24а (Момадеп) розщеплювали двома ферментами рестрикції (Мем/
Епдіапа Віоїаре5), Ніпа Ш ї Хпо І, відповідно, протягом 8 годин при 37 "С. Після реакції розщеплення ферментами рестрикції розщеплені продукти ПЛР та вектор експресії рЕТ24а очищали за допомогою набору для РСК-М СіІеап Ор (міодеп), відповідно. Очищені продукти
ПЛР пришивали до очищеного вектора експресії рЕТ24а і продукт зшивання трансформували в клітину-хазяїна (Е. соїї). Відбирали трансформанти, а клон з відповідною послідовністю ідентифікували шляхом секвенування ДНК і позначили як рРЕТ24а-ОВЕ2.
Бактерії з рЕТ24а-ОРГ2 культивували в 2 мл бульйону І В протягом 16-18 годин при 37 "С, а потім культуру додавали у свіжий бульйон І В, що містив 25 мкг/мл канаміцину, у співвідношенні 1:50 і культивували при 37 "С, 200 об./хв. Коли оптична густина культури при довжині хвилі 600 нм (00600) досягала 0,6, то в культуру додавали ізопропіл-Д-Ю-тіогалактозид (ІРТО) до кінцевої концентрації 1 мМ та інкубували культуру ще протягом б годин при 37 "С, 200 об./хв. Один мілілітр культури центрифугували (10000 х 9) і потім за допомогою В-РЕВТМ Васіегіа! Ргоївіп
Ехігасіоп (Ріегсе Ргоївїп Кезеагосп Ргодисе5) визначали, були рекомбінантні білюи розчинними
Зо білками чи вірусним включенням. Сорок мікролітрів (мкл) реагенту додавали до центрифугованих бактерій та збовтували на вихровій мішалці протягом 1 хвилини. Суміш потім центрифугували при 10000 х д. Білки, суспендовані в супернатанті, являли собою розчинні білки, тоді як білки в нижній частині (осад) являли собою вірусні включення. Розчинні білки розчиняли в їх буфері для зразка для аналізу 505-РАСЕ, тоді як вірусні включення змішували з 2х буфером для зразка для аналізу ЗХО5-РАСЕ. Обидва зразки кип'ятили протягом 20 хвилин і потім центрифугували. Білки в супернатанті обох зразків розділяли за допомогою 1595 505-
РАСЕ для аналізу експресії рекомбінантного капсидного білка штаму ЦВС2 Н. Після аналізів рекомбінантні капсидні білюи штаму ЦВС2 Н застосовували для отримання планшетів з антигеном.
Рекомбінантний капсидний білок штаму ЦВС2 Н розводили РВ5 (рН 9,6) до кінцевої концентрації 10 мкг/мл. Розведений рекомбінантний білок наносили на 96-лунковий планшет для культури клітин (плоске дно) (100 мкл/лунка) при 37 "С протягом 2 годин та потім при 47 протягом ночі. Після цього кожну лунку планшета відмивали три рази РВ5 протягом 3-5 хвилин і додавали 200 мкл 0,1595 блокувального розчину ВБА для блокування рекомбінантного білка протягом 2 годин при 37 "С. Потім кожну лунку планшета відмивали РВЗ і планшет зберігали при 4 "С для подальшого застосування.
Приклад 5. Одержання антитіл до штаму ЦВС2 Н 1. Поліклональні антитіла до штаму ЦВС2 Н
Інактивований штам ЦВС Н з достатнім титром вірусу змішували з придатним ад'ювантом, таким як повний ад'ювант Фрейнда. Насамперед сумішшю заражали тварин, таких як миші, свині, кози та кролики, а за необхідності після відповідного періоду часу (такого як 2-3 тижні) можна було провести другу імунізацію. Після ще одного відповідного періоду часу (такого як 2-3 тижні) сироватку заражених тварин збирали як поліклональні антитіла до штаму ЦВС2 Н.
За необхідності поліклональні антитіла до штаму ЦВС2 Н можуть бути кон'юговані з хромогенними або флуоресцентними репортерами.
За необхідності заражені тварини можуть бути додатково вакциновані для підвищення титру антитіл після першої або другої імунізації.
Тварини, які можуть бути заражені для вироблення поліклональних антитіл до штаму ЦВС2
Н, включають без обмеження мишей, кроликів, птахів (яйця), свиней, кіз, велику рогату худобу
Гс10) та водних тварин.
2. Моноклональні антитіла до штаму ЦВС2 Н
Інактивованим штамом ЦВС2 Н з достатнім титром вірусу або специфічним фрагментом антигену (наприклад, ОКЕ2) штаму ЦВС2 Н в першу чергу заражали тварину (таку як миша). За необхідності інактивований вірус або фрагмент антигену може бути змішаний з придатним ад'ювантом, таким як повний ад'ювант Фрейнда. Також за необхідності після відповідного періоду часу (такого як 2-3 тижні) може бути проведена друга імунізація. Після ще одного відповідного періоду часу (такого як 2-3 тижні) сироватку зараженої тварини брали для оцінки, чи були клітини селезінки тварини придатними для вироблення моноклональних антитіл до штаму ЦВС2 Н. Злиття придатних клітин селезінки, взятих у заражених тварин, і клітин мієломи (таких як клітинна лінія БО та клітинна лінія М5) здійснювали із застосуванням поліетиленгліколю (РЕС, такого як РЕС1500). Гібридоми, які виробляють антитіла відповідної специфічності, відбирали зі злитих клітин і потім субклонували для того, щоб вони стали гібридомами, які придатні для вироблення моноклональних антитіл до штаму ЦВС2 Н.
Моноклональні антитіла до штаму ЦВС2 Н можна застосовувати в наборах для аналізів, при лікуванні або в харчовій або кормовій добавці для підвищення імунітету у тварин.
Приклад 6. Випробування ефективності інактивованої вакцини на основі ЦВС2 - 1 1. Протокол вакцинації та забір зразків
Мишей ВаїБр/с п'ятитижневого-шеститижневого віку без особливих патогенів (РЕ) довільно розподіляли на 4 групи по 15 мишей у кожній. Аналіз ЕІ І5А показав, що всі 60 мишей були негативні відносно антитіл до ЦВС2. Мишам з 3 вакцинних груп (груп 1-3) робили внутрішньом'язову ін'єкцію інактивованої вакцини на основі штаму ЦВС2 Н по 0,2 мл з З різних партій, відповідно. Через два тижні після першої імунізації (р...) мишей з З вакцинних груп повторно імунізували такою самою дозою вакцини з З різних партій. Мишей із групи 4 не вакцинували, і вони служили в якості негативного контролю. На 2, 3, 4 та 5 тижні після першої імунізації (р.і.) випадково відбирали по 5 мишей з кожної групи для забору зразків сироватки. Усі зразки сироватки аналізували за допомогою ЕГІЗА. 2. Виявлення антитіл до ЦВС2 за допомогою ЕГІЗА
Планшети з антигеном, отримані в прикладі З або 4, у даному прикладі можуть застосовуватися в якості планшетів для ЕГІЗА. Планшети для ЕГІЗБА промивали З рази 50
Зо ммоль/л РВ5 (рН 7,2), що містив 500 мкл/л Ту"ееп-20 (тобто РВЗТ), щоразу протягом 3-5 хвилин. Для блокування планшетів для ЕГІЗА у кожну лунку планшетів для ЕГІЗА додавали по 200 мкл 0,1595 блокувального розчину ВЗА, а потім планшети для ЕГІ5А інкубували протягом 2 годин при 37 "С. Після цього планшети для ЕГІЗА промивали РВ5. Зразки сироватки мишей розводили в п'ятдесят разів (1:50) за допомогою РВ5, а потім виконували послідовні 2-разові розведення. Розведені зразки сироватки додавали в лунки планшетів для ЕГІ5А (100 мкл/лунка) і планшети інкубували протягом 1 години при 37 "С. Після інкубування планшети промивали
РВ5. Потім у лунки додавали вторинне антитіло (таке як вторинне антитіло кролика до антитіла миші), кон'юговане з пероксидазою хріну (НЕР). Після інкубування протягом 1 години при 37 "С планшети промивали РВ5. Для візуалізації результатів у лунки додавали 3,3,5,5'- тетраметилбензидин (ТМВ). Після інкубування реакцію зупиняли шляхом додавання 2 мМ
Н»5О.. Результати представляли як співвідношення позитивних-негативних / (Р/М).
Співвідношення Р/М розраховували шляхом ділення оптичної густини при 450 нм (ОЮз450) даного досліджуваного зразка на ОО45о стандартного негативного контролю. Співвідношення Р/М 2 2,1 вважали позитивними. Максимальними значеннями розведень співвідношень Р/М 2 2,1 вважали титри антитіл з ЕГІ5А зразків сироватки.
На додаток до НЕР ї ТМВ у даному прикладі також можна застосовувати інші хромогенні репортери або флуоресцентні мітки з такою самою функцією, такі як лужна фосфатаза (АР), 4- метилумбеліферилфосфат (4-МОР) та флуоресцеїнізотіоціанат (БІТ С). 3. Результати
Через 2 тижні після першої імунізації (р.і-) антитіла до штаму ЦВС2 Н виявили у всіх вакцинованих мишей. Після другої імунізації титри антитіл з ЕГІБА у вакцинованих мишей досягали 1800-2000 на 35-й день після першої імунізації (а.р.і) (фіг. 5). Отже, результати вказували на те, що інактивована вакцина на основі штаму ЦВС2 Н даного винаходу була здатна ефективно індукувати імунні відповіді в мишей.
Приклад 7. Випробування ефективності інактивованої вакцини на основі ЦВС2 - 2 1. Протокол вакцинації та забір зразків
Двом здоровим поросятам 5-б-тижневого віку робили внутрішньом'язову ін'єкцію 1 мл інактивованої вакцини на основі штаму ЦВС2 Н, відповідно. Через три тижні після першої імунізації (р.ї.) поросят повторно імунізували такою самою дозою вакцини. Зразки сироватки бо брали в обох поросят перед першою імунізацією (5-6-тижневий вік), перед другою імунізацією
(8-9-тижневий вік) і через 2 тижні після другої імунізації (10-11-тижневий вік). Обох поросят зважували в ті самі моменти часу, у які брали сироватку. Усі зразки сироватки аналізували за допомогою ЕГІЗА. 2. Виявлення антитіл до ЦВС2 за допомогою ЕГІЗА
Планшети з антигеном, отримані в прикладі З або 4, у даному прикладі можуть застосовуватися в якості планшетів для ЕГІЗА. Планшети для ЕГІЗА промивали 3 рази 50 ммоль/л РВ5 (рН 7,2), що містив 500 мкл/л Ту"ееп-20 (тобто РВЗТ), щоразу протягом 3-5 хвилин. Для блокування планшетів для ЕГІЗА у кожну лунку планшетів для ЕГІ5ЗА додавали по 200 мкл 0,1595 блокувального розчину В5А, а потім планшети для ЕЇГГ І5А інкубували протягом 2 годин при 37 "С. Після цього планшети для ЕГІЗА промивали РВ5. Зразки сироватки свиней розводили в п'ятдесят разів (1:50) за допомоги РВ5, а потім виконували послідовні 2-разові розведення. Розведені зразки сироватки додавали в лунки планшетів для ЕГІЗА (100 мкл/лунка) і планшети інкубували протягом 1 години при 37 "С. Після інкубування планшети промивали
РВ5. Потім у лунки додавали вторинне антитіло (таке як вторинне антитіло кози до антитіла свині), кон'юговане з пероксидазою хріну (НЕР). Після інкубування протягом 1 години при 37 "С планшети промивали РВ5 Для візуалізації результатів у лунки додавали 3,3,5,5- тетраметилбензидин (ТМВ). Після інкубування реакцію зупиняли шляхом додавання 2 мМ
Н»5О.. Результати представляли як співвідношення позитивних-негативних / (Р/М).
Співвідношення Р/М розраховували шляхом ділення оптичної густини при 450 нм (ОЮз450) даного досліджуваного зразка на ОО45о стандартного негативного контролю. Співвідношення Р/М 2 2,1 вважали позитивними. Максимальними значеннями розведень співвідношень Р/М 2 2,1 вважали титри антитіл з ЕГІЗА зразків сироватки. 3. Результати
Через З тижні після першої імунізації (р.ї) антитіла до штаму ЦВС2 Н виявили в обох вакцинованих поросят. Через 2 тижні після другої імунізації титри антитіл з ЕГІЗА у вакцинованих поросят складали більше 11000 (таблиця 2). Отже, результати вказували на те, що інактивована вакцина на основі штаму ЦВС2 Н даного винаходу була здатна ефективно індукувати імунні відповіді в мишей.
Таблиця 2
Титри антитіл у вакцинованих поросят згідно ЕГІЗА . ВО . вдо Через 2 тижні після другої забору зразків (5-6б-тижневий вік) (8-9-тижневий вік) 10-11-тижневий вік)
Коо)
Приклад 8. Випробування ефективності інактивованої вакцини на основі ЦВС - З 1. Протокол вакцинації та забір зразків
Сорок здорових поросят 2-тижневого віку випадково розподіляли на 4 групи по 10 поросят у кожній. У віці З тижнів поросятам з З вакцинних груп (груп 1-3) робили внутрішньом'язову ін'єкцію інактивованої вакцини на основі штаму ЦВС Н по 1 мл із З різних партій, відповідно.
Через три тижні після першої імунізації (р.і-) поросят повторно імунізували такою самою дозою вакцини. Поросят із групи 4 не вакцинували, і вони служили в якості негативного контролю.
Зразки сироватки брали у всіх поросят за 1 тиждень до першої імунізації (2-тижневий вік) і на 1, 2, З та 5 тижнях після першої імунізації (4-, 5-, 6- та в8-тижневий вік, відповідно). Всіх поросят зважували у віці 3, 4, 5, 6 та 8 тижнів. Усі зразки сироватки аналізували за допомогою ЕГГ ІЗА.
Таблиця З
Схема вакцинації та забору зразків
Вік. 2 З 4 5 (тижні) вакцинація вакцинація
Тест 1 Взяття крові, Взяття Взяття Взяття Взяття
ІРА крові, ІА крові, ІРА крові, ІА крові, ІА тег) днеюваня оваюрання звоюрання | еежувеня звеквення 2. Виявлення антитіл до ЦВС2 за допомогою ІБА
Планшети з антигеном, отримані в прикладі 3, застосовували в даному прикладі. Планшети з антигеном брали з -20 "С для відтавання та просушували при 37 "С. Зразки сироватки свиней розводили в п'ятдесят разів (1:50) за допомогою РВ5, а потім виконували послідовні 2-разові розведення. Розведені зразки сироватки додавали в лунки планшетів з антигеном (50 мкл/лунка) і планшети інкубували протягом 30 хвилин при 37 "С. Після інкубування планшети промивали З рази РВ5 для видалення необ'єднаних антитіл. Потім у лунки додавали п'ятдесят мікролітрів (50 мкл) дО кролика до антитіла свині, кон'югованого з РІТС (1:100, 5ідта). Після інкубування в темряві протягом 30 хвилин планшети промивали З рази РВ5 і розглядали під флуоресцентним мікроскопом для підрахунку титру антитіл до штаму ЦВС2 Н (Коагідне2-Аттідіа зі співавт., 2000). 3. Результати 3.1 Титр антитіл
Через 2 тижні після першої імунізації (р.ії.) зразки сироватки вакцинованих поросят (у віці 5 тижнів) згідно ІРА мали титри приблизно 600, тоді як зразки сироватки контрольної групи згідно
ІРА мали титри приблизно 200 (таблиця 4 та фіг. 6). Після другої імунізації згідно ІРА титри у вакцинованих поросят (у віці б тижнів) різко підвищувалися (згідно ІБА титри складали більше 13000). У вакцинованих поросят у віці 8 тижнів титри згідно ІРА складали більше 46000, тоді як у невакцинованих поросят титри згідно ІРА були дуже низькими, приблизно 170.
Таблиця 4
Титри антитіл до штаму ЦВС2 Н у вакцинованих поросят згідно ІБА ее; 5317331753173 1 група 4 3.2. Приріст маси
Вакциновані поросята мали більш високий приріст маси, ніж невакциновані поросята в контрольній групі (таблиця 5 і фіг. 7). У віці 8 тижнів вакциновані поросята були приблизно на 2 кг важчими за невакцинованих поросят.
Таблиця 5
Маси тіл невакцинованих поросят (кг) зт! 31731751 51. (контроль)
Отже, результати вказували на те, що інактивована вакцина на основі штаму ЦВС2 Н даного винаходу була здатна ефективно індукувати імунні відповіді у свиней, підвищувати імунітет у свиней і, таким чином, збільшувати приріст маси у свиней.
Приклад 9. Випробування ефективності інактивованої вакцини на основі ЦВС - 4 1. Протокол вакцинації та інфікування ЦВС2
Поросят у віці чотирнадцяти-шістнадцяти днів випадково розподіляли на 4 групи по 5 поросят у кожній. Усі 20 поросят були негативні відносно антитіл до ЦВС2. Поросятам з З вакцинних груп (груп 1-3) робили внутрішньом'язову ін'єкцію інактивованої вакцини на основі штаму ЦВС Н по 1 мл з З різних партій, відповідно. Через два тижні після першої імунізації (р...) поросят повторно імунізували такою самою дозою вакцини. Поросята із групи 4 були невакцинованими та служили в якості негативного контролю. Через 5 тижнів після першої імунізації проводили контрольне зараження всіх поросят вихідним розчином вірусу штаму ЦВС2
Н (вірулентного штаму) у дозі 1050 дозу зараження 5095 культури тканини на мл (1050
ТОСІОво/мол). Проводили контрольне зараження кожного поросяти інтраназально 1 мл вихідного розчину вірусу та внутрішньом'язово 2 мл вихідного розчину вірусу. Зразки сироватки та мазків з носа відбирали через 7, 11, 19 і 25 днів після контрольного зараження для виявлення вірусемії
ЦВС2 за допомогою ПЛР. 2. Виявлення вірусемії ЦВС2 за допомогою ПЛР
Рівні вірусної ДНК у взятих після контрольного зараження ЦВС2 зразках сироватки свиней визначали із застосуванням ПЛР. Вірусну ДНК виділяли за допомогою реагенту ОМА7окВ.
Спершу до 200 мкл сироватки додавали 400 мкл реагенту ОМА7о1їФ і суміш центрифугували при 12000 об./хв. протягом 15 хвилин. Супернатант змішували з подвійним об'ємом абсолютного етанолу для преципітації ДНК. Потім суміш центрифугували при 12000 об./хв. протягом 15 хвилин і видаляли супернатант. Осад ДНК відмивали 7595 етанолом, центрифугували при 12000 об./хв. протягом 15 хвилин для видалення етанолу та зрештою розчиняли у 8 мм Маон.
Праймери для ПЛР, застосовувані для виявлення вірусемії ЦВС2, мають наступні послідовності
ЦВС2-Е1:5' ЗОЗТСДАСТОСТАТТТТОСТОСС 3 (ЗЕО ІО Мо: 8),
Зо ЦВС2-К1І:5 СТСТТССААТСАСОСТТСТОС 3 (ЗЕО ІЮ Мо: 9).
Праймери ЦВС2-Е1 (прямий) і ЦВС2-К1 (зворотний) застосовували для ампліфікації фрагмента з 284 п.о. із ОМЕ1 ЦВС2. ПЛР-суміш із кінцевим об'ємом 25 мкл містила 1 мкл прямих праймерів, 1 мкл зворотних праймерів, 1,5 мкл 25 мМ Маг", 2,0 мкл 2,5 мМ амтР, 2,5 мкл 10х буфера, що не містив Мд?", 0,2 мкл Тад ДНК-полімерази, 11,8 мкл дистильованої води та 5 мкл матричної ДНК. Реакцію ПЛР починали з вихідного етапу попереднього нагрівання
ПЛР-суміші при 95 "С протягом 5 хвилин та ампліфікацію ДНК виконували за 38 циклів при наступних параметрах: денатурування при 94 "С протягом 30 секунд, відпалювання при 557 протягом 30 секунд і подовження при 72 "С протягом 30 секунд. Реакцію ПЛР завершили етапом кінцевого добудування протягом 5 хвилин при 72 "С і потім зберігали при 4 "С. Продукти
ПЛР потім аналізували в 195 агарозному гелі та візуалізували за допомогою забарвлювання бромідом етидію.
Крім того, інша пара праймерів для ПЛР, застосовувана для виявлення вірусемії ЦВС2, мала наступні послідовності
ЦВС2-Е2:5 ТТ ТООСОАССАСОСТААТО З (ЗЕО ІЮ Мо: 10),
ЦВС2-К2:5 ТОССАСАССАСТТОАССАСТ З (ЗЕО І Мо: 11).
Праймери ЦВС2-Е2 (прямий) і ЦВС2-К2 (зворотний) застосовували для ампліфікації фрагмента з 676 п.о. із ЦВС2. 3. Розтин і дослідження на патології
На 25 день після контрольного зараження поросят умертвляли та розтинали для дослідження патологічних порушень в органах і забору зразків лімфатичних вузлів і легенів.
Зразки тканин фіксували в 495 формальдегіді, заливали в парафін і потім робили зрізи. Зрізи тканин забарвлювали гематоксиліном та еозином (НЕ) і розглядали під мікроскопом. 4. Результати 4.1. Оцінка вірусемії
Результати ПЛР показали, що через 25 днів після контрольного зараження випадків вірусемії у вакцинованих поросят (групи 1-3) було на 4095 - 6095 менше, ніж випадків вірусемії в невакцинованих поросят (група 4) (таблиця 6). Результати показали, що інактивовані вакцини на основі штаму ЦВС2 Н даного винаходу були здатні індукувати імунітет у свиней, зменшувати тяжкість та тривалість вірусемії у свиней і захищати свиней від інфікування ЦВС2.
Таблиця 6
Вірусемія в сироватці свиней, визначувана за допомогою ПЛР
Група До зараження Дні після контрольного зараження
РУ й група 1 група 2 група З група 4 ру 0/5 дв 3/5 дв 3/5 контроль а Знаменники представляють кількості підданих випробуванню поросят, а чисельники представляють кількості поросят з вірусемією. 4.2. Гістопатологічне дослідження
Через 25 днів після контрольного зараження поросят умертвляли та розтинали. Збільшення пахових, середостінних і брижових лімфовузлів виявили в 2 невакцинованих поросят, і зрізи лімфатичних вузлів були бліді. В іншого невакцинованого поросяти були не спалі, тверді легені, набряк легенів і покриті білими плямами нирки. У всіх вакцинованих поросят не виявили важких патологічних порушень (таблиці 7 та 8).
Таблиця 7
Патологічні порушення у вакцинованих і невакцинованих поросят
Патологічне порушення . «д: Слабке
Група Збільшення - |Покриті білими : Інше . : Набряк легенів збільшення Ь лімфовузлів плямами нирки . порушення селезінки група 1 група 2 група З група 4 ру 2/5 1/5 1/5 1/5 0/5 (контроль) а Знаменники представляють кількості розітнутих поросят, а чисельники представляють кількості поросят з патологічними порушеннями. ь |Інше порушення включає слабке збільшення печінки або жовчного міхура та кишковий метеоризм.
У таблиці 8 показані результати мікроскопічного гістопатологічного дослідження зрізів тканин і результати оцінки вірусемії ЦВС2 за допомогою ПЛР. Практично у всіх невакцинованих поросят (група 4) спостерігали гістопатологічні зміни в лімфовузлах, такі як лімфопенію та інфільтрацію макрофагами, і всі взяті зразки лімфовузлів від невакцинованих поросят були позитивні на ввірусемію РСМ2. Крім того, в З невакцинованих поросят спостерігали гістопатологічні зміни в легенях, такі як інфільтрацію клітинами запалення, і 2 взятих зразка тканин легенів від невакцинованих поросят були позитивні на вірусемію ЦВС2. У порівнянні з невакцинованими поросятами у вакцинованих поросят проявлялося значне зменшення гістопатологічних змін та вірусемії ЦВС2. Гістопатологічні зміни у лімфовузлах спостерігали тільки в 1 вакцинованого поросяти (свиня Мо А4) з 15 (групи 1-3), і взяті зразки лімфатичних вузлів від вакцинованого поросяти (свиня Мо А4) були єдиними позитивними на вірусемію ЦВС2 лімфовузлами. Результати показали, що інактивована вакцина на основі штаму ЦВС2 Н даного винаходу була здатна захищати свиней від інфікування ЦВС, і ступінь захисту складав 8095 «- 10095.
Таблиця 8
Мікроскопічне гістопатологічне дослідження зрізів тканин і оцінка вірусемії РСМ2 за допомогою ПЛР після контрольного зараження ЦВС2 пт ри Дві птн ря Частота |. упінь г Свиня Важкі : Інфільтрація Важкі |Інфільтрація захворю- рупа 4 Лімфо НИ : захисту зміни пенія гами зміни запалення РМУМ5 (Се
А ЇЇ - 1-17 - 1-1 - 1-1 -1- 1
А ЇЇ - 11-11 -1 1-1 - 1-11
АЗ ЇЇ - ЇЇ - 1-1 -1- 1-1 -1 1 гупаї 24 ЇЇ 7-11 х ЇЇ ж || | - 1-1 хх
ША т о 3 Гол по з 1 ол ол ло роміж-
Ше м | в ві вон) в | в піДСУМОК вії - 1-1 1-1 -1- 1-1 -1- 1 в Її - Її - 1 - 1-1 - 1 - 1-1 - 1 вз Її - | - Її - 1-1 - 1 - 1-1 - 1 гупа2 ГГ 84 ЇЇ 7-1 1-1 1-1: 1 7 1 1 1
ВО т 3 Гол 1 3 1 ол 1 роміж- підсумок се Її - 1-1 - 1-1 - 1-1 -1- 1 бе Її - | - 177-11-11 - 1-1 -1 1 631 - 1-1 - 1-1 - 1-1 -1 1. гупаз 94 ЇЇ 1 Її 1-1 1 1-1 1 шо т 3 Гол 1 3 1 оз 1 роміж- підсумок 01 їж | 5 | їх: 1-1: раї ях | я | ях || 5 | з- || хх 03 Її - | «5 | т || - | х- || хх
Грула4 | 04 | - | хх | 5 |(5| - | - |-Ї -5 Ї (онтрольу 0511 51-11 3 11-15 1
Проміж-
РАН СЯ ШИ СТЕ НЕЗНО ЕЗНСЯ ЩО підсумок х Знаменники представляють кількості розітнутих поросят, а чисельники представляють кількості поросят з патологічними порушеннями.
На підставі всіх результатів інактивована вакцина на основі штаму ЦВСО2 Н даного винаходу ефективно індукує імунітет у свиней, захищає вакцинованих свиней від інфікування. ЦВС2, зменшує тяжкість та тривалість вірусемії у свиней, зводить до мінімуму клінічні симптоми та збільшує приріст маси тіла.
Зрозуміло, що багато змін і модифікації вищеописаного варіанта здійснення даного винаходу можуть бути виконані без відхилення від його сутності. Відповідно, винахід розкритий для сприяння прогресу в науці та корисних галузях техніки та повинен обмежуватися тільки обсягом формули винаходу.
ПЕРЕЛЬК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ
«Но» СЬК Вірбак Лімітед «ГНЕ» Цнрковірує свиней тних РОМА), іченогенна компезнція, що містить його, набір» дня аназізу та їх застосування «Бо «1 «щі» 1767 «а ДНК «ат Штам МН ошерковірусу свиней 2 ву «оо «од» Геном послідонність штаму Но цнрковіртеу свиней Є тицу «НК 1 вссачсусає стсчесвася дсадсвсске дсаосассє свабачсазе асосссвчса адазлавакує зазавзсечая сссозвасває асзавадУса счзсесссвася ссозававесе
І тсстсезвача суласасаву зазабсасччу васкессває сессесізЗееє зассвЕсса во беЕсссачЧеода дувачакнас чадузачасс дваасассоса сесасвучая сбедесвасе
Ісав ФчсавдастекЕ заквавтнсуа ачбечсаске соачЕасосяс сзоссасасев
ЗО авдаааседаз зудазесацає садевовата заозаєсзесу сацкавацава десявеккає
ЗО . страсачанкч сачизсвсоб зчассксват часаасячач Єдвсоскссев аоссасечеча жа чеассЕкЯсЕ сдоздззсчаа ачессевкоа сечі довов чевзасвосое кас йо
Кспаваассе сеасадоєка зебсоавесЕс счаааогове содоваансо сасвапсосу ща аккзоззааєс ззакеаснсоас чекав одесасеся зкчксачевая есе 60 ссЧесвассе соасачасссв счавассасас асточчааввос воствазаваєх аачсечеочх «Ак асееЕсаєсса косчсзазааа ЧеЧаксчка ссзасдчассо ссасоауссча соуссчеену па вічаєссосасзе чЧазасєссєає часове с сЕведвевеє коаавассаам сорока
ТО тажссекЖКс Ууусссчевяе аЕбсхаасса ссежсансв Чассссчскя чавсочевеє ва ссесввебцс басоссансх зсазавосєс ссбассузат чассаєсссоє Ббуубасесе
Во ачазазааксє Касадавсва сбесаспоачч вачеаауосса збречссасе срссссосс я . сасасссоча астосасає дЗаваєвевкє «сота сеБЕВЕсвасу Єовквасете ха
«1» ДЕК «1 Штам НИ цирковіруєу свиней є тнеу «лах «ІЗ» Послідовність ДНК відкритої рамки зчитування І (ОБЕЇ) штаму Н цнрковіруєу свиней о типу «МН зкчсссзоса здаасааточ пачдадосоза сессавссас зкааааччсо Фосасксасу по сіцазізаєс сіссесуавнуз соаодсопсвзач загватаєсчеу чзасбоссаве скссстаєсе ї820 часта та ссЗссочсуа пузачасавеї Чачоаасасуєс чдавасасссса ссгасза 18 ккечегаакс бсчебаадаа довавйссксК авказадісв вубодусаскЕ кадсасссосє аа сзссзсабсо зазааясчад зоедласачає садсвоваса зауавсаєву седбсазацаа Зо часазесїкає КчасачайбУ буЧдадевесе атаєстсзвч часаасзаай засос 360 зехастасва акассссціЕ Чозозасо аусссоЗоВ ссассасапа дсадеаесоє 488 чзЕвасасЕва бсздавайтк ссосччаско зесоавс сузаваитзач счадаазвагєзч «й седазусєчкс згісодвачає чаасуксасас доссассессЯ язссасссяє чсасочсвав ай зипсзаасядо стуєтсавесЕ сесадасссу давассасає ассзуазасєс акствчаває БО звяхсчсччс асззсасез будековазва чсчасоста ссчасчасті: стасососсоу БО сівосчсаче васчаєскасі чачассссзе зассовкаєс сєбрруаєссаї Єчачасбава тив чкчеааско бвсстЕЕсК дчсссуєсвав абссідатєта ссвдсавеся дасосстЕку тво
Чвасзасаст сесскавссус сутсосадес Ясзлавастс сстаєсудву давоасьвее 845 косо ахких ссазавзаєлос гасзцвасва кссвсоодаце «водоудсса зкксвпЕкакв зпВ секс ссиссс сасусостча абскосайа даватайвкт асгучд 45 «а «а 14 «1 БЛОК. «213» Штам МН пврковіруєу свиней З ту «гад» «23» Амінокиелотна послідовність відкритої рамку зчитування І СОКЕІ) штаму Н пирковірусу свиней 2 тишу «Об»
Меї Бко бек Був Був Зек 0Т1Уу Ак йек й1у Рко іп ко Кіз Був Аг і шк: ши 10 15
Ткр Уві ре Тах бец Ап Аби Рко бек бів Авробіз Ас Був Ббжа К1е кН З за вка Бій їм Бко 116 Бек Вей вве АзроТук Бе ї1і6 тба1 01у 03 515 8 148 45 5іу вп 01) 010 бі Ака Тк ро Пів Бе зійп п1Уу РВе Дія Ап вве
ЗО а БО
Чаї Гу буз бій Тв рве Авпоцуз Уві Був ТКр Тек рве бі Аа Вхд «5 78 15 ко
Сук Ні Ї116 Бій буз діа буз Зі Тв о Аяр об) сій йзпобуз 013 тує за ах
Су ек був біц біу Ай Бей без Т16 б) був б1у Ат Ро АкЧ бек їв 105 що пін бі їй Ака Бек Аво їв Бе ТАаАх Аза Уа) Звк Ттвх їм Без 518 5 МЖИ 125
Чех Зі Щек їеи чаї Твх Уді Віз біз біп Нів вро уаї їТву Ре ув іх 135 іа
Акч Аза Ре АкЯ б4іуУу ев йіз біз (ез Без Буз Уа Бех сьу Муз Меє 145 150 155 їво
Піо Гжз ко Авроїхо Був ТВЕ Ави Уві Ніз Заї Т1е уаї бі РКО вхо 1855 176 178 щу Су 01У був бек Пух ТЕр Лів Аза два бе Аза АвроБко біз ТвЕ іно 155 ї5а
ТВх тує Тев Був Бто Рко Ако Аво оба Тер оТхроАяр 61У Тук Вів б1у 195 205 208 ші 5із Ма) ЗУаї Ууаї Ті Ав Аво бе Тух бі ТІвБ о лви ро Тко Авр 213 215 яко
Авроїви меш) АкЯ Пео Сув Ар оАту тТУЖ Бко ївц їв Уві С1о тв рт ко 230 35 240
Зіу Бу Твк Узі Рус ББе ем Аій Аку Бех Ї1їє Бей тів ТвЕ Ве Азму 245 259 й іп ТВЕ ко Сец біз Тер оТуює лек бак Тк Аза Уаї Бго віх Мак сів 280 шо 265 270 ів ем Тк Аху Аху Її3їе ТВ Зек без Маії Бе Тхвр оцув вза Аза ТЕ 75 шт 2ь чі біз бек Так бів; 105 щу оіУу ій Ре Уві Тк Пе) бек Ре рхо «ВИ 225 300
Су Рхо Бій вне РКО Ту п1М ів Азпотук 05 З1о «и» 4 «АВ» 705 «ві» ДНК «3» Штам М цирковірусу свиней 2 типу «320» «аа» Послідовність ДНК відкритої рамки зчитування 2 (ОКЕ2 штаму Н цирковіруєу свиней З типу «ВО А акозсзсайс саацоувоечея ггасесзсача сЗдладасвос дсссоссдсвоа созссстоаче о сачзайєсокос чдесзосснис ссодчосайхо сасососчсс весУксасио сізпавазача і29 зазайксцуцив сстбозасас ссодосестсос сопасозкоя чсБарассчо савоавааси іо авсвдгсачая сесситссся зчазкяавоозос всчзассаслат ссзахтаєссза сао ай спссссоалозо позооссаваа ссосстсасії дбсасссссКУ закастясаєч аабаасазад 3по чеказаччко аабкссацес сгостосссся ассвоссвзаа ЯбчЧасаччада авбозасосих з астаостаєта кЕсссазасуа бааєсесваба асадвасчєеса ВвЕдссескайи стасоалосос 20 сахчсазасї зстсевосса ссаєбдесата асосадсссе єсесссассоя стсосацево «во сЕвасосста авасскокесЕ Єбевсазуася ассозутаст бсесвасссав євасааааоа 540 зассвасест Ззуссуачасе асааастаєв давазсусаз ассасукасо сстгсдасасе БОС чсусссузаз асзакактака созосвучає сСасзабаєсс зсасавссат зсасусасаа во сссвзавоавас ссввкссксая зувобсссоса стсеаассста вес тах «10» 5 «а а «ага» ВЛОК кої» Штам А цирковірусу свиней 2 ту «ва
«а23» Амінокислотна послідовність відкритої рамки зчитування 2 (ОБКЕ2) штаму БЕ цирковірусу свиней 2 тину «МН 5
Меї Тк ТУК Бко Акз Ак Ако Тук Аха Ах лЛка Акт Віз Ако Рко Вед ї з 10 15 бек Мія їез 1у 01в їі Бей Аку Ак Ак бо Ткр без ува1ї НІВ рко щО ай За
Акч Ні Ахта Тут АКч Тер о Ака АкЯ Гуд лап о біу їїе ве дав ТВ Агу 35 40 45
Їївзи век Ах ТМ о ї1їе бі Тух Тис Маї Буз був Тих ТВху Уві Аве ЖВе 5О 55 вО хо Бег Тер Авп Уві АлроМеб Меб Аку Ре Авп о г1е Ази Авр Ре Тец що 7 75 во хо то с0іу 0іу біу бЗех щеж Рг Без ТБг Мав Бо Рпе сій Тує ТУує
В Зо зб
Акц о ї1їе Акз ПУБ чаї пуз чаї їі Ре ТкроБкго Сув чех Ро їТіе ТЕ 125 116 бій пі дво о Ака біу уві бек бек ТЬх Аїа чаї Ті Їж Азюр Авр Аза 115 120 125
Бе таї Тк Гу Аза Ап оліа грец ТЕ Тук др ро Тук Чаї Ав тує 130 135 140
Зак Зах Ахе Кі ТБЕ Те Твх о біп рко Бе Зев ТУук Кі ак Акч Тук 145 150 ї53 160
БВе ТВ Рхо Муз Рко Ма1 бео АзроАка ТВХ їі лвроТуУує Ре біб рко тб ЯК: та
АзпоАвв уз Ага Ав ста Гей Теробез Аху Беч ія Твх ТВ бту Ави 159 185 196 чаї АЮ МНів Уві сі ре су ТК Аза Ре зІій Азп обБеє Ге Тук дар 1935 (0 25 зЗіб Ар о Тух Аа о тТіє Ака Хі6є Тв Меї ТУж Уаї бій Бе Акч пій Ева щі 215 вч
Азв'ієнй му Авр ВБКто РкоОо Бей Мал ВКкОо Муз аа 230 «бе «211315 «212» ДНК «13» Пам Н дирковіруєу свиней 2 тину вели «ода» Паспідовність ДАК відкритої рамки зчитування З ОКЕЗ) штаму Н дирковіруєх свищей є типу «щЮ» б згсасавсса ссссассвсє сасЕКссзуЗ сус сатусчасев сс КО зааазвеЕтсвоха доссакЕтаЄ ЕКсСтассаса сосзЧекеацце сссбасазаєцча са асатє ї28 саксЕжссяа бсасусітех ссасесстосос астсасстео азаватсову ссвацосссоса 1850 чавасссссУ аезазсзста сазодусусто стстчусласу устсзассадас гсссусбике 240 саасаваччс:в стсасазсаз свазвоавозкс ассссзссої сосссопадаєс базове сее Зоо зевабесрахс вебда З15
«а Це 7 «11» 10 «12» БІЛОК «2132 Штам Н пирковірусу свиней 2 типу «ДМ «аа» Амінокислотна послідовність відкритої рамки зчитування З (ОКЕЗІ штаму М цирковірусу свиней 2 типу «НЕ
Має Узі Те її рко Вхо во Уві бак Ака Тв о Вде Ро Уві Суз Ту й н то 18
Рве Ак чаї Суз Був ї1е Зак Зак Ро де Аза РВе Ата ТК о РхО АКо и 8 30
Ткр о Бхо Ніз Азп АвроУаї Тук ті Аку їв БкКо К1е ТВжх бей їжи Нів чо а вве Бгто А1з нів пе біп Бу ре бек біп Рго Аза б1іч Ме Вес Авр
Гуз хи Ту Аха Уві Пи їв) пух дв о біУу Нів бій Тк Рко Аа бе
Сіп бій зіу Твх Ніяз дек Зех Аку січ Уві ТВж Рко ГПеб бек Зео Ага ве за 25
Зак Аку Бех Зек ТБк о ббе Тук бід «ЦК» В «І» і «вза» ДНК се у» Штучна послідаанить «арх «аз» Праймерозона для виявлення цирковірусу сяиней 2 типу «НК В отоВАСТСсТ АТТТТОВТОС Є жі «ка Ц» «1» 1 «а1и» ДНК «13» ПШеучна вослілдавність «Од» «33» Праймерзенд для внявлення цирковірусу свиней 2 типу «Ой» 9
СТОВТССААТ САСОСТКСЮО С 81 кН 10 «І» 20 «12» ДНК «13» Шкучна послідовність «ра «да» Праймер'зонд дія виявлення цирковіруєх свиней я типу «о» 10
ТУГТООСОВО САООСТААТО 20 «ЦЕ «ДР 20 «1» ДНК «2132 Штучна послідовність «а «раз» Праймер/зонл для внявлення церковіруєу свиней 2 типу «00
ТОсСАСАССА СТРОДсСЛСТ га

Claims (17)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Цирковірус свиней 2 типу (ЦВС), який містить геномну послідовність 5ЕО 1О МО.
2. Цирковірус свиней 2 типу (ЦВС) за п. 1, який був депонований у Китайському центрі колекції типових культур (ССТСС) під номером доступу М201117.
3. Цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2) за п. 1, де ЦВС2 здатний викликати цитопатичний ефект (СРЕ) у клітинній лінії РК-15 або її похідних клітинних лініях.
4. Імуногенна композиція, яка містить цирковірус свиней 2 типу (ЦВС) за п. 1.
5. Імуногенна композиція за п. 4, яка додатково містить фармацевтично прийнятний носій.
6. Імуногенна композиція за п. 5, де носій являє собою ад'ювант.
7. Імуногенна композиція за п. 4, де ЦВС2 оброблений способом інактивації.
8. Імуногенна композиція за п. 4, де ЦВС2 є атенуйованим; або з ЦВС2 за п. 1 отримані або вироблені субодиниця, ДНК.
9. Імуногенна композиція за п. 4, яка додатково містить щонайменше один патогенний антиген, вибраний із групи, що включає антиген вірусу свинячого грипу (5ІМ), антиген вірусу репродуктивно-респіраторного синдрому свиней (РАВБУ), антиген мікоплазми, антиген парвовірусу свиней (РРУ), антиген бешихи свиней та антиген вірусу псевдосказу.
10. Спосіб захисту свині від інфікування цирковірусом свиней 2 типу, що включає етап, на якому проводять зараження свині імуногенною композицією за п. 4 для підвищення імунітету проти ЦВС у свині.
11. Полінуклеотид, який містить нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид ЦВС за п. 1, при цьому поліпептид має послідовність 5ХЕО ІО МО:5.
12. Полінуклеотид за п. 11, де нуклеотидна послідовність містить послідовність 5ЕО ІО МО:4.
13. Набір для аналізу на цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2), що містить елемент для виявлення, який являє собою одне або декілька, вибраних із групи, що включає вірусний антиген вірусу за п. 1, полінуклеотид за п. 11 і фрагмент нуклеїнової кислоти, що виявляє послідовність 5ЕО І МО:1.
14. Набір для аналізу на цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2) за п. 13, де вірусний антиген осаджений на планшет.
15. Набір для аналізу на цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2) за п. 14, де вірусний антиген оброблений способом інактивації.
16. Набір для аналізу на цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2) за п. 13, де полінуклеотид містить послідовність 5БЕО 1О МО:4.
17. Набір для аналізу на цирковірус свиней 2 типу (ЦВС2) за п. 13, де фрагмент нуклеїнової кислоти містить щонайменше одну з 5ЕО ІЮ МО:8, 5ЕО ІЮО МО:9, 5ЕО І МО:10 та 5ЕО ІЮ МО:11.
зврвон ще пе о пи п их о о я о. Аа п в; 5 с.
о п. с о с о с с о. Ох о ен п Щ шк схопити «ЛЕ нюх ви совок 0 о совка КО У ЗУ о . ОКХ Ох а с З З Зх ЗК о. З З СХ о 5 . . . . хх КВ ОО . | . ши с о Фіг ІВ . . . НЄ :
Б Мо КОМ а ж ох БО Пе су ж Я яд. хх Мо ма СУ ОО, Ще в КУ За я я Лех а. ні Є ж я АН сг, о жо кс ФУ люком Ж хв У В ЕК ИК що Як о 5 хх бю Я ке й й Боля я Я ве ж С ЗУ «2 чиї КЗ й ої ЗАОЖ а Ж, се чер поет У ши є А щі я с В у. 7 щі щі кА ЩЕ. щи а х «Хай ще у у Бу теж ЕК Б Кв С ШИ Я, Я до ЯМ ОВ т, щ Я ованее ий во я ай ба т» ОВК у пт Жвви СК ФК Ве в У Я як ВО хо у ку Біт М у ВЕ КЗ г що ве щи ще у й РР лк Лють зо Яру п 5 Не Ще РИН и Е. юки ТЯ Зою вх Сх їх ки «й Кк: 1, Піх, ср кл дк Жид; вс Так у дн НеИНЯ У ятот Тов я Й У т. й ко х «З р ПО 1: ; окт Мо ах ще уча Б яко ре а - й и пав че хе т соя жу СУМ ух 117 5 кат а; Сех ен БО НЩЕХ и Ки МО ишее ПІ: и юю В ех сх ВУ тодкву, с тон не У вина кое сво» Ото у от Ні и ОК дих пла АЕН тут Мч УЖ рах ко феЯ в пі КАМ их пок тВ в СЯ де ВЕ пе ПЛ ее УшШНИ ще.
АЕН, та я ке ТЕ Бей - нк КЦЛКО ее АТ ей Є ВОМУ ВКе В ба Кк КК На «А СН З ша ЕН. ху Ах Тв сежврі я вік з сво м М х 77 : хх ой "пКЕБОКВЯЕ З "рен Вк воюгів о МИНЕ НЯ в ПОМ вявюнняя твірусв ЗБ КЕН ТВЕДжкіх т й Не ж ЩО ХКкднвн Звірхея ЗВ ПОВИ ТУ Твінує НЯ : г; Н лося Сх ї віряж Й М УЗ Баш ТО 11 шо в 7 мими вен Й се ПТК НВ ЕВІь пн Я їх ; еще КУТ ДЕя 26 як КА» Зо ВН Ах г - З ща Яви зв йеж К Тими я с й ит, ; т й те ших У ам кю сце рення х м я зд й дн, бванвй с вало свати Аз х хх зних ТК мок й; в НК й . ун, А осв щи» САН Кроти ях «о х се шин кв ВТ тв века Кк. в ее ших до у Кк ках СД Ею, "оре ЩЕ сосна х о ей БЗше -йіт її я як Й у й век: о Си лю ру КоЯ хо ТТ х ОДА Ж по БУХ ху? М, «Ж фея а НЕ ї тт кв 5, ЖК А дв АЕ у еле НЕ ми Теж вх ро м оц ча Же й ЕР мн Я й М: ща СЕ НЕ нини ЗК ох, З : СоИК, й Же бе ЗЕ БР оК ка ся Я З зе Я ШК о В Ши 2; ТгРІї: Ех КАТА ке г ОК до К Тов око Ва а Ух а що ДАН ОО ЗКУ ож вя кова Я Жду и ХО МВ СЯ З Ж косу сх Ех хх хх ХЕ БА -аА Є ШАНИ ВЕ Із а АН ше ВХ Я Я АК де жі. шк и хм ж, й Я їх У ДООБКОВ Де ххх що Ж. в З мо КО Я кв. ке я КУ т У кош я Я ух ГУ С ЕІ ЕЕ в а 5 ФЧнк.2 ово ве р ж раллі ж пз б ро хо ж в. М: ії ом: Ж аж Б І ОН за Мі м ож ма ва в ож скоб» Мюойх ж ше РОЖа їх рене е - С а о ж ще де Жйо же ЖК Во Бе вч о вч ох їха а ба 05 Ж Ка Ще оба Каож КАШ АШАНКЗ Го ков Я и ШИ КУ СЕС СХ СХ Ж , СКС СВ ж СРО ж фе їз обдоіїв ох Ма ма ва оваох ее и и Я СЯ СХ ОХ СЯ ж ом ж йог о Ка ж ЕЕ ф-но БЯ Х ов б оє КО ОКО ж жа лока хх а їж їз дах вв ном жк з Из не Ми ЖСЯ 1 Я Я ж рій лк й оба ба ух баз Б вої ж ба їм б ок не А ШИН ШИ ЩЕ рай шр ж о сбопох йо їм У беж пі 0 го ГАС жк ОСІ Ср ж ПОЗ ОСЬ в ОБ ОБЯ Бч ж їч км 03 мож З Я Ек М м щі жк рожа жо жо ШО ШОКОМ Сх дока ув уж км ж Ма Бер Бек фо Ж Ко Керч їм ож Сх оба їн ба ож яко ша ка Ж нях екшн Ше Ще Мом мож Їж їз г їх 0 0 ж пе ве ба й ой йо пр) М ж кдож ж ж Ж вро ові ом Ох я 8-3 Б дя Ж да їх; ба ож ща ма вро Ж кову р ж Те їж фе їмо ж Їж. їза З (МОЖ суп век Бо ою 0 Бб я жк ССО СЯ Пе пу чо дб ож па око М; ж й б ба хож перо у ож ж Ко КОЖ кві вок ж ЛО рок мо в ж ге а о ОО ро ра ра кож ЩщОщОощощож хо о ямок ор ря вх ев о ж вмре ж 2-го р р ж пт ой й ох ра ся ка ко ШК пра с ух ж ка ее Ше Ши ШЕУ уКоОо Му ж рі о| 0 жк Ка Екч Ге чок шоп рок по пз ба 0) ж їз їм оїж бах б м я їм Ж ві нен я ж я дя їм ой ож да Коб йно ФС ОВ Сх й жа кока Ж ЩО п З ях ож Пк ях ОБ ОЕЄ БЕЖ - ваз я і ж нер Не їз Бяз ба ря ж ев Кв ж 3 КЗ р ж и ше и ШЕ ес В ях М МИ А ЖЕ З ги с а МИ я Я са сис с ж ж ж ж жк па ба бношеож ЩО щі ді ж ГИ ШЕ Я ШЕ А ШЕУ їм ба Ка гу ж І ж жа я п бе Сб й ж тт Що ом ож па КОВО ж с ОСИ ок їз лох ім оннож Щоб; ор ру ох ПС (С ж їз ма ло жк Ор ох попа ще боОж СЕ ЄЮ СТ я моря ря мож зм ше ж ока Ж пе же ШЕ о ШИЯ СЕС СО С се фе У мож вро й т Ж ння ж б оба ра дя ж ме ум ув уко ж Бах Ба о рзч о бчож сесесн ся к фу одьойч ба ж щеворн ом знох ко о КО жбОж С С ж нак Кз Є Об; бро 898 ОБ Я Вч ж ок ві і) х Їх їа Їх мох Ср сь ж СО (Ох ща У а дк ж Гн З ак ЯН іх УЕ но М о рн уж УЗ ні Я ж (А ж ма а ша ж Ж ЕЕ ЕЗ Б б ж шо жк їй п ре ож -оня ніж Ге Ви Шия ШК Я З м р во ж їБ й; ба сб ож в о жк кВ ко кб ке кож ж Оп сМ ох й й во 2 ж їм їщ (рої Ж ОБО г З а ж по т б ож щорік 000 Мода ва жо Ж п. б бо бабок З с що шок Бе Бе Бя о Бя ож ОшОошОжеше й б р ож і ка є є Ж шоб умови ж БЕЗ БЕЗ б БЕ жк ой ре дбож меж З БЕя: бка Гі беж й Бя ж вч ож я ба Терор ж» т о ОоОж мк о оОж СОС С ж пбобб ра раож ФО ОО ССС ж Го МЛ З а ЖЕ З Пі па об бо Сж МЛ Й Кк В З ж пе ой; йог ох п б б 03 Ж їз ке обноОбожк мк жк пише ше а (Фор ой аж б Б обя я в вІовЯ о БЯ врок ОО ж Моря рмоунож СЕ р й ож ув ут ув ди ж ка Я кі ж Ба бя ба фе ож ме шк у» уж - кщокцоке ох СЯ СЯ СЯ СХ ж «ооо жа ов в В: ж БОБ Б вч ж ші по ож : 2-9 Б ще з ЗНИщИИ ве в ще ша Є Б в па ше щу Му жи ре брова же гм Фо Ех гу МУ кох зеросв оз г ро с я ЗНО рот г» Щоо-нН Ю ШИ ее очи оц Хо ки М ке ж: ВИС Е: зер м І ее Я са се Коереся з -»зЗ' мі щем З м я -ма Фе овес в ща ща КО еокіоки БО Щояко«ож Я кп що
«не. 3
Вож м. Но х І т Ж рок гер В ма м и Ед ен дока Сх межа С ж шок ва Ба Ж п ж ба баож ож КК Ох С ж ж ШКО ж їх ДЗ мі ЖІ ок кв ж СЕ СМ ж тот ж Ба ойож БОБ ж о ж да ж о шк да їб о неви ж ва ж І Я ж рол біодч ож п я ж да оба ж кн ж МО є Щодо ЖК а б ож Шо бКож ОО ж ЩО ж КС ж Ба Б ж КОКО КЗ в Ж Мі а ж о Ж вк ж нку ж Кв ж Мова У ПЗ їж Па жмож шу ОЖ ев ж Кр ж ме ож їх мож с ж кома ж па ря жк па овкрож МОЖ МмОомож БОБ Ж Сех важ Кекс ха їж баз ЇЗЯ Ж ПУ беж ово воря ж Си ж ПО жЖ в вок РОрж в уж паї ж оо що х ох тож Уж ж та жк ер ж їх 05 пз оч Ж ЦЕ ж Жовя ях п сок ож па ба ж їробож Мода ж Па іх їз ба м -рх пророк ба. бу жк СЯ СК ж пек Ж шо ж пе дя ж БЕ ок оно х Му м» ж Що Я ж вон жк ЕН ДАК У ох т ов4 Сх об ж си СЕ ж ЯКО ЕОК бе лож ца Ома и р ж Ко М. Ск ро ор ох і: Ше ША пе обо В Осож о ж ем ж тоб СО ж З ж ож їй 0бож С ОК як ож пк ОЖОож і ж СК ж Ше а Ж щ щ х в-во Щоб ж ос жк ба ож С ДЕ Ву йюж пн ж водо р кі кож ба я ж З ОБ. ж Ян Ж Їж зм як що ж (ож мож Ср ж ож ж іо ож па м що Ж Б Ж СЕ жк па де Ж нож ех Я б Ж ЩІ доз ж я да Ок крок Ж що що їб ож це що ШОВ ох Ок м ско що ко обо ж кош ож ра о бож товщ ох зов ож ші ожмоЖ й бок кмохщоОЖ в-ва хм ЦЕ ж пр ж СО не Б Б ож їж й ож мови ж Бе ба ж Фея о ряож т овож я. Кк що ОК СЕ СХ з щоорох ШУ БОЖ са ма ж шок ж що ЕІ з окр ж б йо ж а пбож ї.оїмож У Ж іі ж од ж о Ж -щ ож пе ще ож тк пз в ож ще Її» Ж кі ок б вя сто шжоВ ке вно СВ СВ ж бро ж ДОБ ох Ба Ж ка ОЖОоЖ -о б» ж троє ер «і га і ще | УНН --ОсЯ де ос де М це ї- о ї- о ре со. їх 1 е- З ої ро шо а що п в М, се щі Ох - з ще ше ва я Є ще Б З Ба ще о ше що Я є
Чну. 4
32 с яку кох, теє - В год ши п 2 В Ж с В х ее що ЕЕ К-Я м й ре коп що пово Ма ОН совет с 0 шу знов о. ооо о. Я он о : с о но о і о ех М З ок 7 ІА жантнозвдню БЕЗ чне, 5
« БО0О0 ря сф то00о0 | Он пен щу чно 5 60000 - те -/й я Я ПОДО ннннннннннннатетннаяееенннннннепннннанееннннн Ен чен, руна з пря ення НН сіісккнннння -їй нм ння чере Грува 7 в. м я 4 ПН знфен Група З т. 20000 фен ення ен» Група 4 10000 й мк в потен ння (кантооть в. й 5 б В 10 Вік (тижні)
«Не. б ЗЕ - - сне с-ще синю ин " сен Прут і: собів яко. Група я Я пфнннннннннневннннннннневннненнніовоненннннне неон нсвнненнннннненнннннніовенннннініенннннннннненнененнннн зендівння уунтроль) З 4 й о а 10 Вік (тижні)
Фі. 7
UAA201309034A 2010-12-22 2011-12-20 Цирковірус свиней 2 типу (цвс2), імуногенна композиція, що містить його, набір для аналізу та їх застосування UA110632C2 (uk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201061426087P 2010-12-22 2010-12-22
PCT/CN2011/084277 WO2012083837A1 (zh) 2010-12-22 2011-12-20 猪第二型环状病毒、含彼的免疫组合物、检测套组及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA110632C2 true UA110632C2 (uk) 2016-01-25

Family

ID=46313165

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201309034A UA110632C2 (uk) 2010-12-22 2011-12-20 Цирковірус свиней 2 типу (цвс2), імуногенна композиція, що містить його, набір для аналізу та їх застосування

Country Status (14)

Country Link
US (2) US9101571B2 (uk)
EP (2) EP3604504A1 (uk)
JP (2) JP2014507124A (uk)
KR (1) KR101740764B1 (uk)
CN (1) CN103314103B (uk)
AU (1) AU2011348702B2 (uk)
BR (1) BR112013015675A2 (uk)
DK (1) DK2657333T3 (uk)
EA (1) EA028376B1 (uk)
ES (1) ES2763327T3 (uk)
MX (1) MX351578B (uk)
TW (2) TWI442935B (uk)
UA (1) UA110632C2 (uk)
WO (1) WO2012083837A1 (uk)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA113192C2 (xx) * 2011-12-06 2016-12-26 Імуногенна композиція проти цирковірусу свиней типу 2 (pcv2)
CN103893750B (zh) * 2012-12-31 2015-11-25 普莱柯生物工程股份有限公司 一种抗猪伪狂犬病、猪流感疫苗组合物及其应用
EP2994162B1 (en) 2013-05-08 2021-04-07 Pharmgate Biologics Inc. Vaccine for pcv2 and mycoplasma
WO2015026912A1 (en) 2013-08-23 2015-02-26 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Porcine circovirus type 2 (pcv2) subunit vaccine
CN104749361B (zh) * 2015-01-21 2017-04-19 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 猪圆环病毒2型抗原捕获elisa试剂盒
CN105445457B (zh) * 2015-03-24 2017-08-11 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所 检测猪圆环病毒2型Cap蛋白的单克隆抗体及试剂盒
MX2017014414A (es) 2015-05-14 2018-03-16 Merial Inc Metodo para la produccion de circovirus porcino y vacunas pcv2.
CN105606804A (zh) * 2016-01-20 2016-05-25 福州大北农生物技术有限公司 一种猪圆环病毒灭活疫苗效力检验方法
CN107686833B (zh) * 2016-04-18 2021-02-19 华南农业大学 一种猪细小病毒毒株及其应用
WO2018083154A1 (en) 2016-11-03 2018-05-11 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vaccine against porcine parvovirus
MY191895A (en) 2016-11-03 2022-07-18 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Vaccine against porcine parvovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus and methods of production thereof
CN109206509B (zh) * 2017-06-29 2021-07-20 洛阳普泰生物技术有限公司 与伪狂犬病病毒gD蛋白结合的单克隆抗体及其应用
CN107308446B (zh) * 2017-07-14 2021-03-23 瑞普（保定）生物药业有限公司 一种猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产方法
CN107227380A (zh) * 2017-07-26 2017-10-03 杭州师范大学 一种同步检测pcv2和prv感染的引物序列及方法
CN110343670B (zh) * 2018-04-04 2022-08-30 普莱柯生物工程股份有限公司 表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒弱毒株、及其制备方法和应用
CN110387355B (zh) * 2018-04-18 2022-08-30 普莱柯生物工程股份有限公司 表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒株、疫苗及其制备方法和应用
BR112020025211A2 (pt) * 2018-06-11 2021-03-09 Ceva Sante Animale Vacinação contra circovírus suíno
CN109468413B (zh) * 2018-12-14 2021-09-10 湖南中净生物科技有限公司 一种母猪繁殖障碍病原检测引物、试剂盒、病原检测方法和应用
RU2697849C1 (ru) * 2019-04-26 2019-08-21 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности" (ФГБНУ ВНИТИБП) Способ диагностики цирковируса свиней
CN110041409B (zh) * 2019-05-07 2022-09-06 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种突变型猪圆环病毒2型病毒及应用
CN110698542B (zh) * 2019-09-16 2022-03-22 长江大学 人工改造的猪圆环病毒2型Rep′蛋白、ELISA检测试剂盒及其应用
CN110711202B (zh) * 2019-10-25 2022-08-19 湖南农业大学 Phb2基因或蛋白的抑制剂在制备抗猪圆环病毒2型药物中的应用
FR3120944A1 (fr) 2021-03-21 2022-09-23 Virbac Procédé de détermination de l’âge optimum de vaccination de porcelets par mesure d’une teneur en anticorps dans le colostrum de truies au sein d’un élevage
CN114317456A (zh) * 2021-12-15 2022-04-12 成都史纪生物制药有限公司 一种猪圆环病毒2型毒株的灭活方法及猪圆环病毒疫苗
CN115094060A (zh) * 2022-06-23 2022-09-23 湖南农业大学 基于LAMP-CRISPR/Cas12a可视化检测PCV2核酸的试剂盒及方法
CN115947794A (zh) * 2022-07-19 2023-04-11 沈阳农业大学 一种pcv2 orf3特异性多肽及应用
CN116813718B (zh) * 2023-08-30 2023-10-27 北京瑞阳瑞泰生物科技有限公司 一种重组猪圆环病毒2型Cap蛋白三聚体及其表达体系和应用

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UA78180C2 (uk) 1997-10-03 2007-03-15 Меріаль Кільцевий вірус свині типу ii, вакцини та діагностичні реагенти
FR2781159B1 (fr) 1998-07-06 2000-10-06 Merial Sas Vaccin circovirus et parvovirus porcin
US7211379B2 (en) 1997-10-03 2007-05-01 Merial Sas Prevention of myocarditis, abortion and intrauterine infection associated with porcine circovirus-2
US6391314B1 (en) 1997-10-03 2002-05-21 Merial Porcine circoviruses vaccines diagnostic reagents
US6517843B1 (en) 1999-08-31 2003-02-11 Merial Reduction of porcine circovirus-2 viral load with inactivated PCV-2
US7192594B2 (en) 1997-10-03 2007-03-20 Merial Limited Postweaning multisystemic wasting syndrome and porcine circovirus from pigs
FR2772047B1 (fr) 1997-12-05 2004-04-09 Ct Nat D Etudes Veterinaires E Sequence genomique et polypeptides de circovirus associe a la maladie de l'amaigrissement du porcelet (map), applications au diagnostic et a la prevention et/ou au traitement de l'infection
US20040062775A1 (en) 1997-12-05 2004-04-01 Agence Francaise De Securite Sanitaire Des Aliments Circovirus sequences associated with piglet weight loss disease (PWD)
US6497883B1 (en) 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
US6943152B1 (en) 1999-06-10 2005-09-13 Merial DNA vaccine-PCV
US20030096377A1 (en) * 2001-06-28 2003-05-22 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Differential PCR-RFLP assay for detecting and distinguishing between nonpathogenic PCV-1 and pathogenic PCV-2
US7276353B2 (en) 2001-12-12 2007-10-02 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
US7279166B2 (en) 2001-12-12 2007-10-09 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Chimeric infectious DNA clones, chimeric porcine circoviruses and uses thereof
DK2371383T3 (en) 2005-12-29 2015-11-30 Boehringer Ingelheim Vetmed Use of a PCV2 immunogenic composition for reduction of clinical symptoms in pigs
EP1941903A1 (en) * 2007-01-03 2008-07-09 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Prophylaxis and treatment of PRDC
US20090317423A1 (en) * 2008-01-23 2009-12-24 Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc. Pcv2 mycoplasma hyopneumoniae immunogenic compositions and methods of producing such compositions
CN101343671A (zh) * 2008-08-25 2009-01-14 湖南省兽医总站 猪2型圆环病毒pcr快速检测试剂盒
TWI367256B (en) * 2008-10-07 2012-07-01 Academia Sinica Vaccine composition and kit providing protective immunity against porcine circovirus 2
EP2367933A1 (en) * 2008-11-28 2011-09-28 Ceva Sante Animale Novel porcine circovirus type 2b isolate and uses thereof
CN101549155B (zh) * 2009-05-27 2012-05-09 福州大北农生物技术有限公司 猪圆环病毒ⅱ型灭活疫苗及其制备方法
UA113192C2 (xx) * 2011-12-06 2016-12-26 Імуногенна композиція проти цирковірусу свиней типу 2 (pcv2)

Also Published As

Publication number Publication date
US9770501B2 (en) 2017-09-26
AU2011348702B2 (en) 2016-06-16
US20150297709A1 (en) 2015-10-22
EP2657333A1 (en) 2013-10-30
JP2014507124A (ja) 2014-03-27
MX2013007211A (es) 2014-03-12
JP2016052313A (ja) 2016-04-14
EA201370140A1 (ru) 2013-10-30
CN103314103A (zh) 2013-09-18
TWI508974B (zh) 2015-11-21
CN103314103B (zh) 2015-06-24
JP6150864B2 (ja) 2017-06-21
US9101571B2 (en) 2015-08-11
WO2012083837A1 (zh) 2012-06-28
EP2657333A4 (en) 2014-11-12
KR20130098430A (ko) 2013-09-04
EP3604504A1 (en) 2020-02-05
BR112013015675A2 (pt) 2020-10-06
MX351578B (es) 2017-10-19
ES2763327T3 (es) 2020-05-28
EA028376B1 (ru) 2017-11-30
DK2657333T3 (da) 2019-12-09
TW201437226A (zh) 2014-10-01
TWI442935B (zh) 2014-07-01
KR101740764B1 (ko) 2017-05-26
US20120164170A1 (en) 2012-06-28
AU2011348702A1 (en) 2013-07-18
EP2657333B1 (en) 2019-10-02
TW201225975A (en) 2012-07-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA110632C2 (uk) Цирковірус свиней 2 типу (цвс2), імуногенна композиція, що містить його, набір для аналізу та їх застосування
Ju et al. Immunogenicity of a recombinant pseudorabies virus expressing ORF1–ORF2 fusion protein of porcine circovirus type 2
CN102065890B (zh) 嵌合体猪圆环病毒PCV2Gen-1Rep及其用途
ES2655013T3 (es) Proteínas sintéticas de la cápside y usos de las mismas
CN109125719A (zh) 一种含猪圆环病毒3型、猪圆环病毒2型抗原的免疫原性组合物及其应用
CN104968365A (zh) 支原体疫苗的制备方法
CN104059889B (zh) 伪狂犬病病毒变异株双基因缺失毒株及其构建方法和应用
CN110387355A (zh) 表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒株、疫苗及其制备方法和应用
Bhuyan et al. The construction of recombinant Lactobacillus casei expressing BVDV E2 protein and its immune response in mice
CN109134619B (zh) 猪圆环病毒2型抗原、其制备的免疫原性组合物、制备方法和应用
Liu et al. Recombinant invasive Lactobacillus plantarum expressing the J subgroup avian leukosis virus Gp85 protein induces protection against avian leukosis in chickens
CN109010818A (zh) 一种预防和/或治疗猪圆环病毒感染的二联疫苗组合物及其制备方法和应用
KR102239927B1 (ko) 불활화된 소 로타바이러스를 함유하는 백신 조성물
Guo et al. A commercial PCV2a-based vaccine is effective in protection from experimental challenge of PCV2 mutant with two amino acids elongation in capsid protein
US11090378B2 (en) Porcine parainfluenza virus compositions and related methods
CN106497951B (zh) 一种VP2融合基因、重组狂犬病病毒rHEP-rVP2株、构建方法及其应用
CN109125720A (zh) 一种含猪圆环病毒3型抗原的免疫原性组合物及其应用
KR102365039B1 (ko) 부유세포 배양에 적응된 A/ASIA/Sea-97 유전형 구제역 바이러스 백신주 및 이의 제조방법
CN110343670B (zh) 表达猪圆环病毒Cap蛋白基因的重组猪伪狂犬病病毒弱毒株、及其制备方法和应用
WO2022026534A1 (en) Sars-cov-2 immunogenic compositions and methods for protecting against sars-cov-2 clinical signs
CN105505937B (zh) 抗猪瘟病毒感染的siRNA及其应用
WO2022246449A1 (en) Sars-coronavirus 2 (sars-cov-2) spike protein subunit vaccines