CN105505937B - 抗猪瘟病毒感染的siRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了抗猪瘟病毒感染的siRNA及其应用，属于抗猪瘟病毒siRNA的鉴定及其应用领域。本发明首先公开了分别靶向猪瘟病毒基因组Npro、P7、NS5A和NS5B基因的抗猪瘟病毒感染的siRNA，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1‑12所示。本发明进一步利用构建的重组猪瘟病毒筛选出对猪瘟病毒干扰或抑制活性最强的siRNA，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.12所示。本发明还公开了含有所述抗猪瘟病毒感染的siRNA的表达载体及其应用。本发明抗猪瘟病毒感染的siRNA对猪瘟病毒抑制活性强，具有制备成预防或治疗猪瘟的药物或试剂的潜力。

Description

抗猪瘟病毒感染的siRNA及其应用
本申请是申请号为“201410252667.0”、申请日为“2014年6月9日”、发明名称为“抗猪瘟病毒感染的siRNA及其应用”的分案申请。
技术领域
本发明涉及抗猪瘟病毒siRNA，尤其涉及靶向猪瘟病毒基因组的抗猪瘟病毒感染的siRNA，本发明进一步涉及靶向猪瘟病毒基因组的具有抗猪瘟病毒感染活性的siRNA在制备预防或治疗猪瘟的药物或试剂中的应用，属于抗猪瘟病毒siRNA的鉴定及其应用领域。
背景技术
猪瘟(classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(classical swine fevervirus，CSFV)引起的一种接触性、致死性传染病，以高热和出血为其典型特征，发病率和死亡率极高，被世界动物卫生组织(OIE)列为必须申报的动物疫病。
猪瘟病毒(CSFV)是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus)的成员，为单股正链线性RNA分子。CSFV基因组大小为12.3kb，两端分别为5′端非翻译区(untranslatedregion，UTR)和3′端UTR，中间包含一个大的开放阅读框(Open reading frame，ORF)，其中ORF编码一个由3898个氨基酸残基组成的多聚蛋白。该多聚蛋白在病毒感染的宿主细胞内，受宿主或病毒特有的蛋白酶的水解作用，可裂解为11种病毒特异性蛋白，包括4种病毒结构蛋白(C、Erns、E1和E2)和7种非结构蛋白(Npro、P7、NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)(Moennig,V.,2000.Introduction to classical swine fever:virus,disease and controlpolicy.Vet.Microbiol.73,93–102.)。
RNA干扰(RNA interference,RNAi)是抗病毒感染最有效的方法之一。应用RNAi技术可以减少病毒RNA的数量、阻断病毒蛋白的表达以及抑制病毒的复制等，此技术已在多种疾病的基因治疗研究中，发挥出了巨大的潜力和独特的效果。现有的研究表明，靶向猪瘟病毒Npro、NS3、NS4A和NS5B基因的siRNA可以抑制CSFV的复制(Xu,X.,Guo,H.,Xiao,C.,Zha,Y.,Shi,Z.,Xia,X.,Tu,C.,2008.In vitro inhibition of classical swine fevervirus replication by siRNAs targeting Npro and NS5B genes.Antiviral Res.78,188–193；Li,J.,Dai,Y.,Liu,S.,Guo,H.,Wang,T.,Ouyang,H.,Tu,C.,2011.In vitroinhibition of CSFV replication by multiple siRNA expression.Antiviral Res.91,209–216.)。
CSFV P7为II类离子通道蛋白，在瘟病毒的生命周期中起着至关重要的作用，并与病毒的致病性有关(Gladue,D.P.,Holinka,L.G.,Largo,E.,Sainz,I.F.,Carrillo,C.,O'Donnell,V.,Baker-Branstetter,R.,Lu,Z.,Ambroggio,X.,Risatti,G.R.,Nieva,J.L.,Borca,M.V.,2012.Classical swine fever virus p7protein is a viroporin involvedin virulence in swine.J.Virol.86,6778–6791.)。NS5A在CSFV生命周期的确切功能知之甚少，迄今尚无靶向CSFV P7和NS5A基因的抗猪瘟病毒siRNA的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供分别靶向猪瘟病毒基因组Npro、P7、NS5A和NS5B基因的具有抗猪瘟病毒感染活性的siRNA，这些siRNA具有应用于预防或治疗猪瘟的药物或试剂的潜力，实现对猪瘟的有效防治。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案实现的：
本发明根据猪瘟病毒基因组Npro基因的编码序列，设计靶向猪瘟病毒基因组Npro基因的抗猪瘟病毒siRNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1-3所示。
本发明根据猪瘟病毒基因组P7基因的编码序列，设计靶向猪瘟病毒基因组P7基因的抗猪瘟病毒siRNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.4-6所示。
本发明根据猪瘟病毒基因组NS5A基因的编码序列，设计靶向猪瘟病毒基因组NS5A基因的抗猪瘟病毒siRNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.7-9所示。
本发明根据猪瘟病毒基因组NS5B基因的编码序列，设计靶向猪瘟病毒基因组NS5B基因的抗猪瘟病毒siRNA，其核苷酸序列为SEQ ID NO.10-12所示。
本发明为了鉴定所设计的这些siRNA是否具有抗猪瘟病毒感染的活性，本发明构建了表达萤火虫荧光素酶基因的重组猪瘟病毒CSFV-NproFluc，本发明将猪瘟重组病毒CSFV-NproFluc提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9058；分类命名为：表达萤火虫荧光素酶基因的重组猪瘟病毒。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2014年04月11日；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明利用所构建的表达萤火虫荧光素酶(Fluc)基因的重组猪瘟病毒评估靶向猪瘟病毒基因组Npro、P7、NS5A和NS5B基因的12条抗猪瘟病毒siRNA分子，检测结果证实，siNpro-108(SEQ ID NO.1)、siNS5A-239(SEQ ID NO.7)和siNS5B-1234(SEQ ID NO.12)是对猪瘟病毒的干扰或抑制活性最强的siRNA分子。
其中，本发明提供了1个靶向CSFV基因组Npro基因的具有抗猪瘟病毒活性的siRNA，其对猪瘟病毒的干扰或抑制活性较强，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了利用重组猪瘟病毒CSFV-NproFluc筛选出的1个靶向CSFV基因组P7基因的抗猪瘟病毒siRNA，对猪瘟病毒具有较强干扰效果，其核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示；所述siRNA是本发明首次公开的靶向CSFV基因组P7基因的抗猪瘟病毒siRNA。
本发明同时利用CSFV-NproFluc及其亲本病毒Shimen株评估了筛选获得的靶向四种基因的干扰能力由强到弱的4个siRNA分子在不同浓度的抗病毒效果。所述抗猪瘟病毒siRNA为siNpro-108、siNS5B-1234、siNS5A-734和siP7-55，分别靶向猪瘟病毒基因组的Npro、NS5B、NS5A和P7基因，其核苷酸序列分别为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.9或SEQID NO.4所示。
本发明分析了上述抗猪瘟病毒siRNA在不同浓度(50nm、100nm和150nm)的抗病毒效果。结果表明，所述4种siRNA在50nm、100nm和150nm均对猪瘟病毒有显著的抑制作用。对于150nM的siScr处理的细胞,CSFV-NproFluc的Fluc活性值为105.59，而150nM的siNpro-108、siP7-55、siNS5A-734和siNS5B-1234处理的细胞的Fluc活性值分别为103.08、104.40、104.08和103.55，与siScr处理细胞相比，Fluc活性分别降低了332、15.8、32.45和113.2倍。同时150nm的siNpro-108、siP7-55、siNS5A-734和siNS5B-1234处理细胞的亲本病毒Shimen株滴度分别为101.09、102.38、101.87和101.54TCID50/mL，与siScr处理细胞的Shimen株的滴度相比，分别降低了870.9、44.3、111.3和313.3倍，该结果与Fluc活性测定的结果一致，进一步证实本发明提供的siRNA具有应用于制备抗猪瘟病毒药物或试剂的潜力。
本发明还提供了含有所述抗猪瘟病毒感染活性的siRNA的表达载体；所述表达载体选自腺病毒载体、慢病毒载体、反转录病毒载体或质粒载体中的任意一种；由于质粒作为载体，其投递的有效性和在体内效用的持续性均不太理想；而慢病毒和反转录病毒载体虽然能够持久表达外源的shRNA，但会导致基因整合到宿主染色体上；腺病毒载体具有高效、制备纯化简单、宿主范围广及稳定性好等优点，因此，本发明中的表达载体优选为腺病毒载体。
本发明还提供了所述抗猪瘟病毒siRNA在制备预防或治疗猪瘟的药物或试剂中的用途。
本发明所筛选出的抗猪瘟病毒siRNA对CSFV干扰或抑制活性强，可用于制备预防或治疗猪瘟的药物或试剂。
本发明进一步提供了一种应用所述的siRNA在预防或治疗猪瘟病毒感染中的应用，包括：将siRNA直接转染到动物细胞内；或者通过构建siRNA表达载体，将单一siRNA连接至表达载体，转染宿主；在宿主体内表达相应的siRNA，抑制猪瘟病毒的复制或者抑制靶基因的表达，达到预防或治疗猪瘟的作用。
当靶向CSFV基因组一个基因位点的siRNA的抑制效果不显著时，还可以联合几个基因位点使用，即将靶向CSFV基因组不同基因的多个siRNA串联在表达载体上，转染宿主；在宿主体内表达相应的siRNA，可以更好抑制猪瘟病毒的复制或者抑制靶基因的表达，能达到更好的预防或治疗猪瘟的效果。
本发明的技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
本发明成功筛选出了分别靶向猪瘟病毒基因组的Npro、NS5A和NS5B基因的3个对猪瘟病毒的干扰或抑制活性最强的siRNA(siNpro-108、siNS5A-239和siNS5B-1234)；另外，本发明首次公开了靶向猪瘟病毒基因组NS5A基因和P7基因的抗猪瘟病毒siRNA序列；本发明公开的抗猪瘟病毒siRNA对猪瘟病毒的干扰或抑制活性强，用于制备预防或治疗猪瘟的药物或试剂，可实现对猪瘟的有效防治。
本发明所涉及到的术语定义
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“反向遗传操作技术”意指通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，在DNA分子水平上对病毒基因组进行体外人工操作，如进行基因点突变、缺失、插入、颠换、转位和互补等改造，以此来研究RNA病毒的基因复制与表达调控机理、RNA编辑和自发重组与诱导重组、病毒与宿主间的相互作用关系、抗病毒策略、基因治疗研究，以及构建新型病毒载体来表达外源基因和进行疫苗的研制等。
术语“基因组”意指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子(部分病毒是RNA)。
术语“核苷酸序列”意指DNA或RNA中碱基的排列顺序。
术语“病毒滴度”意指病毒的毒力或毒价，衡量病毒滴度的单位有最小致死量(MLD)、最小感染量(MID)、半数致死量(LD50)和半数组织感染量(TCID50)。
术语“siRNA”意指一种小RNA分子(21-25核苷酸)，由Dicer(RNaseⅢ家族中特异性识别双链RNA的酶)加工而成；siRNA是siRISC的主要组成成分，在RNAi过程中作为指导特异性切割作用的“向导”，激发与之互补的目标mRNA的沉默。
附图说明
图1为CSFV-NproFluc的免疫荧光试验检测结果；
图2为CSFV-NproFluc的Fluc基因表达的动力学；
图3为CSFV-NproFluc用于抗病毒siRNA的筛选结果；**，p＜0.01；
图4为CSFV-NproFluc对于不同浓度抗病毒siRNA的剂量依赖性实验结果；**，p＜0.01；
图5为siRNA对亲本病毒Shimen株的抑制效果验证结果；**，p＜0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
1、实验材料
CSFV石门(Shimen)株(GenBank登录号AF092448.2)和PK-15细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室保存；SK6细胞由瑞典国家兽医研究所Lihong Liu博士惠赠。
包含Fluc基因的质粒pGEM-luc购自Promega公司；CSFV Shimen株的全长感染性克隆pBRCISM由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室构建和保存。
针对CSFV E2蛋白的单克隆抗体由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室制备和保存；FITC标记的羊抗鼠IgG购自Sigma公司。双荧光素酶检测试剂盒购自Promega公司。
实施例1抗猪瘟病毒siRNA的设计及筛选
1、试验方法
1.1携带Fluc基因的猪瘟重组病毒的拯救
本发明通过重叠PCR方法将萤火虫荧光素酶基因克隆到猪瘟病毒Shimen株全长感染性克隆pBRCISM的Npro编码区内第412位碱基和第413位碱基之间(即Npro蛋白第13位和第14位氨基酸之间)，构建出含有Fluc基因的CSFV全长感染性克隆，命名为pBRCISM-NproFluc。
利用基于RNA聚合酶II的反向遗传操作技术用pBRCISM-NproFluc拯救出5株携带Fluc基因的重组猪瘟病毒，即：CSFV-NproFluc、CSFV-NproFluc-1、CSFV-NproFluc-2、CSFV-NproFluc-3和CSFV-NproFluc-4，其中重组病毒CSFV-NproFluc在所表现出的Fluc活性以及遗传稳定性方面明显优于另外4株重组猪瘟病毒。
本发明将性能最为优异的猪瘟重组病毒CSFV-NproFluc提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC No.9058。
1.2重组病毒的间接免疫荧光试验(IFA)
将拯救的重组病毒CSFV-NproFluc接种于生长至70％的SK6细胞中，2h后用磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗2遍并换为新鲜的含4％胎牛血清的DMEM，在5％CO2、37℃环境中继续培养，48h后用抗E2单克隆抗体进行IFA试验，以未感染细胞做阴性对照(NT)。
具体操作如下：弃掉培养液，用PBS清洗细胞2遍，然后用冷无水乙醇固定细胞，30min后加入抗E2单克隆抗体，在室温下作用2h后用PBS洗涤细胞5次，并加入1：90稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，于室温中避光作用1h，用PBS洗涤细胞5次，5min/次，在倒置荧光显微镜下观察并拍照。
1.3重组病毒的荧光素酶活性分析
将SK6细胞接种于24孔细胞培养板中，当细胞生长至80％时，分别用拯救的重组病毒CSFV-NproFluc和亲本病毒Shimen株按MOI＝0.1剂量感染SK6细胞，并置于5％CO2、37℃环境中继续培养。在感染后12h、24h、36h、48h、60h和72h，将细胞培养上清弃掉，并用PBS洗涤细胞1次，然后加入裂解液，每孔加入100μL裂解液，在冰上裂解15min后，将细胞裂解液加入含有荧光素酶检测试剂的白板中，立即放入荧光检测仪读数。
1.4 RNA设计及干扰试验
本发明设计了12种特异性干扰CSFV基因组编码序列的siRNA分子，分别靶向Npro、P7、NS5A和NS5B基因的编码序列，siRNA分子核苷酸序列见表1。
RNA干扰试验在48孔细胞培养板中进行，将100nM的各siRNA分子用X-tremeGENEsiRNA干扰分子转染试剂分别转染长满70％单层的PK-15细胞，6h后换为含2％胎牛血清细胞DMEM，24h后每孔接50TCID50的重组病毒CSFV-NproFluc，并换为含4％胎牛血清的DMEM，48h后测定萤火虫荧光素酶活性值。
表1干扰性RNA分子名称及序列
1.5 CSFV-NproFluc对于不同浓度抗病毒siRNA的剂量依赖性试验
为了进一步验证不同浓度siRNA对CSFV-NproFluc的抑制效果，本发明分析了靶向四种基因的干扰能力由强到弱的4个siRNA分子(siNpro-108、siP7-55、siNS5A-734和siNS5B-1234)在不同浓度的抗病毒效果。具体方法如下：将上述4种siRNA分子用X-tremeGENE siRNA转染试剂以不同浓度(50nM、100nM和150nM)转染长满70％单层的PK-15细胞的48孔细胞培养板中，每个浓度重复3个孔，6h后换为含2％胎牛血清DMEM，24h后每孔接50TCID50的重组病毒CSFV-NproFluc，并换为含4％胎牛血清的DMEM，48h后测定萤火虫荧光素酶活性值。以3次重复试验结果的算术平均值作为该孔萤火虫荧光素酶活性值。
1.6 siRNA对亲本病毒Shimen株的抑制效果试验
为了进一步验证上述siRNA对Shimen株的抑制效果，并比较基于重组病毒和亲本病毒的两种不同筛选方法，本发明分析了上述4个siRNA分子(siNpro-108、siNS5B-1234、siNS5A-734和siP7-55)在不同浓度对Shimen株抗病毒效果。
同时本发明利用CSFV亲本病毒Shimen株评估了筛选获得的在不同浓度的抗病毒效果。
具体方法如下：将上述4种siRNA分子用X-tremeGENE siRNA转染试剂以不同浓度(50nM、100nM和150nM)转染长满70％单层的PK-15细胞的48孔细胞培养板中，每个浓度重复3个孔，6h后换为含2％胎牛血清DMEM，24h后每孔接50TCID50的亲本病毒Shimen株，并换为含4％胎牛血清的DMEM，48h后反复冻融细胞收毒，用IFA测定每孔病毒的滴度，按照Reed-Münch公式计算，以3次重复试验结果的算术平均值作为该孔病毒的滴度。
1.7统计学分析
应用SAS统计学软件对所有数据进行统计学分析，比较各组间的差异。其中*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001。
2、试验结果
2.1重组病毒的间接免疫荧光试验结果
间接免疫荧光试验证实，重组病毒CSFV-NproFluc能被猪瘟病毒E2抗体所识别(图1)。
2.2重组病毒的荧光素酶活性分析结果
分别用重组病毒CSFV-NproFluc和亲本病毒Shimen株按MOI＝0.1剂量感染SK6细胞，并在感染后12h、24h、36h、48h、60h和72h测量Fluc的活性。
结果表明，在感染后12h，CSFV-NproFluc的Fluc活性约为Shimen株感染细胞的15倍，而在感染后60h，Fluc活性达到峰值，约为Shimen株感染细胞的5×106倍(图2)。
2.3 RNA干扰试验结果
本发明针对Npro、P7、NS5A和NS5B基因的12条CSFV特异性siRNA进行了检测。结果表明，在干扰分子浓度为100nM时，Fluc活性降低，尤其是siNpro-108(p＝0.0011)、siNS5A-239(p＝0.0032)和siNS5B-1234(p＝0.0054)处理的细胞，Fluc活性显著下降(图3)。RNA干扰试验结果表明，这些siRNA具有制备抗猪瘟病毒药物或试剂的潜力。
2.4 CSFV-NproFluc对于不同浓度抗病毒siRNA的剂量依赖性实验结果
试验结果表明，4种siRNA(siNpro-108、siP7-55、siNS5A-734和siNS5B-1234)在不同浓度(50nM、100nM和150nM)均对CSFV-NproFluc病毒有显著的抑制作用(图4)。对于150nM的siScr处理的细胞,CSFV-NproFluc的Fluc活性值为105.59，而150nM的siNpro-108、siP7-55、siNS5A-734和siNS5B-1234处理的细胞的Fluc活性值分别为103.08、104.40、104.08和103.55，与siScr处理细胞相比，Fluc活性分别降低了332、15.8、32.45和113.2倍。
2.5 siRNA对亲本病毒Shimen株的抑制效果
本发明分析了4种基因的siRNAs(siNpro-108、siP7-55、siNS5A-734和siNS5B-1234)在不同浓度(50、100和150nM)的对亲本病毒Shimen株的抗病毒效果。结果表明，4种siRNA在50nM、100nM和150nM不同浓度均对亲本病毒Shimen株有显著的抑制作用(图5)。对于150nM的siScr，亲本病毒Shimen株滴度达到104TCID50/mL，与未经siRNA处理的细胞的Shimen株滴度(约104.44TCID50/mL)类似，而150nM的siNpro-108、siP7-55、siNS5A-734和siNS5B-1234处理的细胞的Shimen株滴度分别为101.09、102.38、101.87和101.54TCID50/mL，与siScr处理细胞的Shimen株的滴度相比，分别降低了870.9、44.3、111.3和313.3倍(图5)。以上结果与Fluc活性测定的结果一致，进一步证实这些siRNA具有制备抗猪瘟病毒药物或试剂的潜力。

Claims (4)

1.靶向猪瘟病毒NS5B基因的具有抗猪瘟病毒感染活性的siRNA，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID NO.12所示。
2.含有权利要求1所述具有抗猪瘟病毒感染活性的siRNA的表达载体，其特征在于：所述表达载体选自腺病毒载体、慢病毒载体或质粒载体中的任意一种。
3.按照权利要求2所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为腺病毒载体。
4.权利要求1所述的具有抗猪瘟病毒感染活性的siRNA在制备预防或治疗猪瘟的药物或试剂中的应用。
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