CN110101705A

CN110101705A - Bet家族蛋白抑制剂的抗病毒用途

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Publication number: CN110101705A
Application number: CN201910375300.0A
Authority: CN
Inventors: 褚贝贝; 杨国宇; 王江; 李国利; 明胜利
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2019-08-09
Anticipated expiration: 2039-05-07
Also published as: CN110101705B

Abstract

本发明涉及BET家族蛋白抑制剂在制备用于抑制囊膜病毒进入细胞的试剂中的用途。本发明还涉及BET家族蛋白抑制剂在制备用于在对象中抗囊膜病毒感染的药物中的用途。本发明的BET家族蛋白抑制剂优选是BRD4蛋白抑制剂，更优选(+)‑JQ‑1、OXT‑015和/或I‑BET151。本发明发现的BET家族蛋白抑制剂的新用途对生物学，特别是病毒研究和药物开发均有重要的意义。

Description

BET家族蛋白抑制剂的抗病毒用途

技术领域

本发明涉及BET家族蛋白抑制剂的抗病毒用途，特别是在制备用于抑制囊膜病毒进入细胞的试剂中的用途。

背景技术

病毒是危害人类和动物体最重要的病原，给公共安全带来严重的威胁。病毒主要由蛋白质和DNA(或者RNA)组成，而所谓病毒的复制其实是指病毒的遗传物质。病毒是以其基因为模版，借DNA多聚酶或RNA多聚酶以及其他必要因素，指令细胞停止合成细胞的蛋白质与核酸，转为复制病毒的基因组，转录、转译出相应的病毒蛋白，最终释放出子代病毒。从病毒进入宿主细胞开始，经过基因组复制到释放出来，为一个复制周期。病毒生活周期简单分4个步骤：吸附和穿入、脱壳、生物合成、组装成熟和释放。

病毒侵入(即吸附和穿入)是病毒感染的起始，病毒可以通过多种途径侵入宿主细胞，并在宿主细胞体内复制和增殖。病毒中有一类被称为囊膜病毒，这类病毒在侵染细胞时，首先必须将病毒的囊膜和宿主细胞膜融合，才能将其自身的遗传物质释放到细胞中。

接种疫苗和使用抗病毒药物是应对病毒流行的重要手段。然而由于病毒构造很简单、变异能力强，在流行前基本不可能大规模生产疫苗，对动物和人类健康构成持续威胁，随时可能引发新的动物疫情暴发和公共卫生危机。

目前，抗病毒药物主要以靶向病毒的功能性蛋白为主，即针对每一个病毒需要研发针对性的药物。这种抗病毒药物虽然可以达到很高的特异性和选择性，但长期大量使用往往会出现耐药性。针对不同的病毒开发不同的药物，研发周期长，成本也高。病毒作为寄生生活的生物体，必须依赖宿主细胞的资源进行繁殖。

因此，人们期望能够开发一种能够对病毒早期侵入细胞阶段产生抑制作用的药物，由此开发出一种广谱的抗病毒药物。

发明内容

本发明人意外地发现了当前癌症研究领域所关注的BET家族蛋白抑制剂可以有效地阻止病毒进入细胞。进一步的研究显示，这种阻止作用并非适用于所有的病毒，其尤其针对囊膜病毒十分有效。现有技术中对于BET家族蛋白抑制剂是否可以影响病毒侵入尚未报道。

因此，一方面，本发明提供了BET家族蛋白抑制剂在制备用于抑制囊膜病毒进入细胞的试剂中的用途。

在一个实施方式中，所述BET家族蛋白抑制剂是BRD4蛋白抑制剂。

在一个实施方式中，所述BET家族蛋白抑制剂为选自以下的一种或多种：(+)-JQ-1、 OXT-015和I-BET151。

在一个实施方式中，所述抑制囊膜病毒进入细胞为抑制囊膜病毒对细胞的吸附。

在一个实施方式中，所述BET家族蛋白抑制剂通过激活干扰素，来抑制囊膜病毒对细胞的吸附。

在一个实施方式中，所述BET家族蛋白抑制剂通过cGAS-STING-TBK1-IRF3信号通路激活干扰素，来抑制囊膜病毒对细胞的吸附。

在一个实施方式中，所述囊膜病毒为选自以下的一种或多种：正粘病毒、副粘病毒、冠状病毒、疱疹病毒、动脉炎病毒、痘病毒、弹状病毒和流感病毒。

在一个实施方式中，所述囊膜病毒为选自以下的一种或多种：水泡性口炎病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、鼠痘病毒、新城疫病毒、伪狂犬病毒和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒。

在一个实施方式中，所述试剂为用于研究目的，特别是生物学和药学领域研究的试剂。

基于本发明所证实的BET家族蛋白抑制剂可阻止囊膜病毒进入细胞，BET家族蛋白抑制剂可以作为一种潜在的抑制病毒感染，特别是抑制囊膜病毒感染的药物。此药物并非针对某一特定的病毒，可以实现广泛抑制多种不同的囊膜病毒进入细胞的效果。

因此，另一方面，本发明提供了BET家族蛋白抑制剂在制备用于在对象中抗囊膜病毒感染的药物中的用途。

在一个实施方式中，所述抗囊膜病毒感染包括抗所述囊膜病毒对细胞的吸附。

在一个实施方式中，所述对象是哺乳动物。在一个实施方式中，所述哺乳动物为猪或人。

本发明还证实了BET家族蛋白抑制剂可以激活干扰素，尤其是通过 cGAS-STING-TBK1-IRF3信号通路激活干扰素。

因此，又一方面，本发明还提供了BET家族蛋白抑制剂在制备干扰素激活剂中的用途。

在一个实施方式中，所述干扰素为β-干扰素。

在一个实施方式中，所述BET家族蛋白抑制剂通过cGAS-STING-TBK1-IRF3信号通路激活干扰素，优选激活β-干扰素。

本发明还证实了BET家族蛋白抑制剂可以诱导DNA损伤，特别是病毒基因组的 DNA损伤。

因此，再一方面，本发明还提供了BET家族蛋白抑制剂在制备用于诱导DNA损伤的试剂中的用途。

附图说明

图1 (+)-JQ-1、OTX-015和I-BET151对PK15的细胞毒性；

图2 (+)-JQ-1、OTX-015和I-BET151抑制囊膜病毒吸附细胞；

图3 (+)-JQ-1、OTX-015和I-BET151的广谱抗病毒活性；

图4 (+)-JQ-1在体内抑制PRV病毒感染；

图5 (+)-JQ-1在体内抑制VSV病毒感染；

图6 cGAS、STING、TBK1、IRF3基因结构和敲除PK15细胞对应基因后DNA测序结果示意图；

图7 (+)-JQ-1通过CGAS-STING信号通路激活β型干扰素；和

图8 (+)-JQ-1诱导DNA损伤。

具体实施方式

现在详细地参照本发明的代表性实施方案描述本发明。这些实施方案仅仅是例示性的，不应理解为以任何方式限制本发明的范围。相反地，本发明意图涵盖权利要求书所限定的在本发明范围内的所有替代、修改和等同。

除非另外指明，本文所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。

一方面，本发明提供了BET家族蛋白抑制剂在制备用于抑制囊膜病毒进入细胞的试剂中的用途。

在本文中，术语“BET家族蛋白抑制剂”是指对BET家族蛋白成员的包括复制、转录、翻译等生物学活性具有抑制作用的试剂。已知BET家族(bromodomain and extra-terminaldomain)蛋白是一类能够解读遗传密码的蛋白，其通过识别和结合乙酰化的组蛋白或非组蛋白来在基因的转录中发挥重要作用。BET家族蛋白包括BRD2、BRD3、 BRD4和BRDT。BET家族蛋白及其抑制剂是目前癌症研究领域的热点。现有技术中对于BET家族蛋白抑制剂和病毒对于细胞的侵入之间的关系没有报道。

术语“BRD4蛋白抑制剂”是指对BET家族蛋白成员之一的BRD4具有抑制作用的试剂。在一个实施方式中，所述BET家族蛋白抑制剂是BRD4蛋白抑制剂。

“BET家族蛋白抑制剂”的成员是本领域技术人员已知的，包括但不限于(+)-JQ-1、OXT-015和I-BET151。

在本文中，(+)-JQ-1是指具有如下结构的化合物，

在本文中，OXT-015是指具有如下结构的化合物，

在本文中，I-BET151是指具有如下结构的化合物，

在本文中，如果(+)-JQ-1、OXT-015和I-BET151的实际结构与如上的结构式不同，以本领域技术人员可以确定的正确结构为准。在一个实施方式中，所述BET家族蛋白抑制剂选自具有以下结构的化合物中的一种或多种：

对于囊膜病毒而言，本发明发现BET家族蛋白抑制剂可以抑制其侵入细胞。在一个实施方式中，所述抑制囊膜病毒进入细胞为抑制囊膜病毒对细胞的吸附。在本文中，除非另有说明，否则病毒对细胞的吸附、病毒在细胞中的复制和病毒在细胞中的增殖为各自独立的过程。因此，术语“抑制囊膜病毒对细胞的吸附”的过程并不包括抑制囊膜病毒在细胞中复制，以及抑制囊膜病毒在细胞中增殖。

在本文中，术语“囊膜病毒”是指病毒外层具有囊膜的一类病毒的统称。病毒囊膜的主要功能是帮助病毒进入宿主细胞。进入涉及的机理可能包括首先包膜表面上的糖蛋白识别并结合宿主表面受体，接着病毒包膜与宿主细胞膜结合，最后病毒衣壳和病毒基因组进入宿主，完成感染过程。

在本文中，术语“试剂”为用于研究目的，特别是生物学和药学领域研究的试剂。BET 家族蛋白抑制剂可以抑制囊膜病毒进入细胞这一发现，将使得通常其有望在生物学(例如病毒学，兽医学)和药学领域研究中发挥更大的作用。在一个实施方式中，所述试剂为用于研究目的，特别是生物学和药学领域研究的试剂。

本发明的实验已经证明BET家族蛋白抑制剂可阻止囊膜病毒对于细胞的早期攻击，即阻止病毒对于细胞的吸附过程。在病毒感染细胞的过程中，对细胞进行吸附是一个早期且重要的步骤。通过这一重要步骤的抑制，BET家族蛋白抑制剂可以有效抑制囊膜病毒进入细胞。这一发现使得BET家族蛋白抑制剂将在生物学和药学领域研究中发挥更广泛的作用。而且，这种抑制作用与病毒种类无关，使得BET家族蛋白抑制剂有望成为广谱的抗病毒药物。

因此，另一方面，本发明还提供了BET家族蛋白抑制剂在制备用于在对象中抗囊膜病毒感染的药物中的用途。

在本发明中，除非另有说明，术语“抗囊膜病毒感染”仅指阻止病毒侵入/进入对象的细胞。在本文中，术语“侵入”和“进入”可以互换。在一个实施方式中，所述抗囊膜病毒感染为抗所述囊膜病毒对细胞的吸附。不受任何理论束缚，对于病毒复制和增殖的干扰 /抑制的机理与阻止病毒侵入/进入对象的细胞是完全不同的。BET家族蛋白抑制剂在病毒复制和增殖过程中的参与程度有待研究。

在本发明中，术语“抗囊膜病毒感染”还涵盖出于预防性目的对于囊膜病毒感染进行的预防，以及出于治疗性目的对于囊膜病毒感染进行的治疗。上述的术语“治疗”是指疾病、病症或病理状态的完全或部分治愈或消除，包括但不限于选自下列中的一种、或者两种或更多种的组合：减轻或消除引起疾病、病症或病理状态的病因；改善或消除其病理学改变；减轻或消除其一种或多种症状；延缓或停滞其进展；减轻其严重性；降低其发病率；减少其复发；以及改善其预后。术语“预防”是指防止所述疾病、病症或病理状态的发生。

因此，在一个实施方式中，“抗囊膜病毒感染”是指对于囊膜病毒感染进行预防，和/或对于囊膜病毒感染进行治疗。

本发明的这种抗病毒感染的方法不同于现有技术中已有的，例如针对某一特定病毒定向涉及的药物，而是通过阻止囊膜病毒进入对象的细胞，来实现对多种不同囊膜病毒的广泛抑制。

本文所用的术语“对象”是指哺乳动物，包括但不限于灵长类动物(如人、猴、黑猩猩、大猩猩等)、啮齿动物(如大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠、白鼬和类似啮齿动物)、兔形目动物、猪科动物(如猪、小型猪)、马科动物、犬科动物、猫科动物等。在一个实施方式中，所述对象是哺乳动物。在一个实施方式中，所述哺乳动物为猪或人。

在一个实施方式中，本发明还涉及治疗或预防有此需要的对象的囊膜病毒感染的方法，所述方法包括向所述对象给药治疗/预防有效量的BET家族蛋白抑制剂。

如本文中，术语“治疗/预防有效量”指被给药后会实现所述用途或方法所期望的治疗 /预防效力的活性成分的量。在本文所述的用途或方法中，所述BET家族蛋白抑制剂和/ 或所述一种或多种其他抗病毒药物的剂量一般取决于多种因素，包括所治疗的个体、病症或病况的严重性、给药的速率及处方医师的判断。

本发明的“药物”可以进一步包括一种或多种BET家族蛋白抑制剂，和/或一种或多种抗病毒药物，和/或一种或多种药学上可接受/兽医学上可接受的辅料。在一个实施方式中，本发明的药物包括BET家族蛋白抑制剂与其它一种或多种抗病毒药物的组合。在一个实施方式中，本发明的药物包括BET家族蛋白抑制剂与一种或多种药学上可接受/兽医学上可接受的辅料的组合。在一个实施方式中，本发明的药物包括BET家族蛋白抑制剂与其它一种或多种抗病毒药物和一种或多种药学上可接受/兽医学上可接受的辅料的组合。在本文中，术语“药学上可接受/兽医学上可接受的辅料”是本领域技术人员根据常规制药方法可以确定的物质。

在本发明的方法的实施方式中，BET家族蛋白抑制剂作为唯一活性成分，或者与一种或多种其他活性成分组合在一起，给药于所述对象。在预防/组合治疗的情况下，BET 家族蛋白抑制剂与其它一种或多种抗病毒药物可以同时或依次给药于所述个体。

所述一种或多种其他抗病毒药物是本领域已知的对于上述疾病、病症或病理状态具有治疗效力的一种或多种化学治疗剂、生物治疗剂或其组合。通过与BET家族蛋白抑制剂组合使用，可以实现包括但不限于下列效果：组合治疗以提高每种活性成分所带来的整体疗效；降低其他活性成分的剂量以避免副作用；以及保持治疗效力。

本发明不但证实了BET家族蛋白抑制剂具有较低的细胞毒性；而且证实了其可以抑制包括动脉炎病毒、痘病毒、流感病毒和疱疹病毒等多种病毒对于对象细胞的侵入。 BET家族蛋白抑制剂对病毒早期侵入细胞即可产生的抑制作用，使得其可作为一种广谱的抗病毒药物。

进一步的实验显示，BET家族蛋白抑制剂可以激活干扰素。不受任何理论束缚，由于干扰素系统本身对于抗病毒具有一定的作用，诱导机体细胞的抗病毒反应，因此BET 家族蛋白抑制剂对于病毒侵入细胞，特别是病毒对于细胞吸附的抑制作用与其可以激活干扰素有一定的关系。已证实BET家族蛋白抑制剂对于干扰素的激活的至少一条途径是cGAS-STING-TBK1-IRF3信号通路途径。另外的实验数据还显示，BET家族蛋白抑制剂对于诱导病毒DNA损伤也有一定的作用。上述两点发现或许均可以从另一方面解释BET家族蛋白抑制剂的优异抗病毒感染效果。

因此，又一方面，本发明还提供了BET家族蛋白抑制剂在制备干扰素激活剂中的用途。再一方面，本发明还提供了BET家族蛋白抑制剂在制备用于诱导DNA损伤的试剂中的用途。

在一个实施方式中，所述干扰素为β-干扰素。在一个实施方式中，所述BET家族蛋白抑制剂通过cGAS-STING-TBK1-IRF3信号通路激活干扰素，优选激活β-干扰素。

在一个实施方式中，所述干扰素激活剂用作抗病毒感染的药物。在一个实施方式中，所述诱导DNA损伤的试剂用作抗病毒感染的药物。

在一个实施方式中，所述病毒为囊膜病毒。在一个实施方式中，所述囊膜病毒为选自以下的一种或多种：正粘病毒、副粘病毒、冠状病毒、疱疹病毒、动脉炎病毒、痘病毒、弹状病毒和流感病毒。在一个实施方式中，所述囊膜病毒为选自以下的一种或多种：水泡性口炎病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、鼠痘病毒、新城疫病毒、伪狂犬病毒和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒。

本发明证实了BET家族蛋白抑制剂对于囊膜病毒早期侵入细胞的抑制作用；且本发明还证实了BET家族蛋白抑制剂对于囊膜病毒感染细胞具有抗病毒感染作用。上述作用均不受限于具体的囊膜病毒种类或者被感染的细胞的种类，这使得BET家族蛋白抑制剂有望成为一种有用的生物学研究试剂，更特别地，成为一种广谱的抗病毒药物。

下面通过实施例更详细地说明本发明，但这些实施例并不对本发明构成任何限制，本发明的范围仅由权利要求书定义。

实施例

实施例1.BET家族蛋白抑制剂(+)-JQ-1、OTX-015和I-BET151的细胞毒性检测

1、实验材料

1.1细胞，化合物，试剂盒

(+)-JQ-1、OTX-015和I-BET151三种化合物均购自MedChemExpress(MCE)；PK15 细胞购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)；CCK试剂盒(ZP328)购自于北京庄盟国际生物基因科技有限公司。

1.2实验仪器

QuantStudioTM6Flex实时荧光定量PCR仪(Thermo Fisher,USA)；VarioskanFlash 光谱扫描多功能读数仪(Thermo Fisher,USA)。

2、实验方法与结果

2.1细胞培养：37℃，5％CO₂加湿培养箱中培养。使用含有10％FBS、100U/ml 的青霉素和链霉素的DMEM培养基。细胞至90％汇合度后后传代，传代比例1/3-1/4。

2.2细胞毒性检测：PK15细胞按照5ⅹ10³细胞/孔(体积100μl)接种于96孔细胞培养板中，细胞贴壁后备用；用细胞维持液(DMEM+2％血清)将药物按照(+)-JQ-1：0、 0.03、0.1、0.3、1、3、10μΜ；OTX-015：0、0.1、0.3、1、3、10、30μΜ；I-BET151： 0、0.1、0.3、1、3、10、30μΜ不同的浓度梯度配制，每个梯度浓度设2个重复孔，分别于药物处理后24、36、48h于培养上清中加入10μl/孔的CCK试剂，置细胞培养箱中培养2h，用Varioskan Flash光谱扫描多功能读数仪读取吸光值，计算细胞存活率。

3、实验结果

结果显示(图1A,B,C)三种化合物在10μM范围内对PK15细胞完全没有细胞毒性，说明它们具有比较安全的使用范围。在后续实验中，除非另有说明，(+)-JQ-1、 OTX-015和I-BET151的给药剂量按照细胞实验用量为0-10μM。

实施例2.BET家族蛋白抑制剂(+)-JQ-1、OTX-015和I-BET151抑制囊膜病毒吸附细胞的研究

为了验证不同种类BET家族蛋白抑制剂是否均可以抑制囊膜病毒吸附细胞，以及验证这种抑制作用是否对非囊膜病毒的效果，实验中使用三种不同的BET家族蛋白抑制剂，即(+)-JQ-1、OTX-015和I-BET151化合物，以及VSV、PRRSV和PRV等多种不同囊膜病毒，以及Ad作为非囊膜病毒。

1、实验材料

在本发明的本实验以及后续实验中，所用的病毒及其如下：

伪狂犬病毒(PRV，疱疹病毒科)，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV，动脉炎病毒科)，水疱性口炎病毒(VSV，弹状病毒科)，新城疫病毒(NDV，副黏病毒科)，单纯疱疹病毒(HSV，疱疹病毒科)，流感病毒(H1N1，正黏病毒科)，鼠痘病毒(ECTV，痘病毒科)，和腺病毒(Ad5，非囊膜病毒)。

PRV-QXX、NDV-GFP和VSV-GFP由河南农业大学李永涛副教授馈赠；HSV1-F 由福建医科大学馈赠、H1N1-PR8和PRRSV-BJ-4由河南省农科院馈赠；ECTV由武汉病毒所馈赠；Ad5-GFP病毒购自汉恒生物科技(上海)有限公司

2、实验方法

2.1病毒吸附实验：用(+)-JQ-1(1000nM)、OTX-015(10μM)和I-BET151(10μM) 预处理Marc145或PK15细胞4h，然后将细胞放在4℃预冷1h。在4℃下分别孵育 PRRSV-BJ4(Marc145细胞，MOI＝1)、VSV-GFP(PK15细胞，MOI＝0.1)、PRV-QXX (PK15细胞，MOI＝1)和Ad5-GFP(PK15细胞，MOI＝100)1h；将细胞用预冷的PBS洗两遍，洗去未吸附的病毒粒子；提取细胞基因组，对吸附的病毒基因组进行qRT-PCR 分析。

3、实验结果

如图2结果显示(+)-JQ-1、OTX-015和I-BET151化合物可以抑制全部测试的囊膜病毒，即VSV、PRRSV和PRV的吸附，而对非囊膜病毒，即腺病毒则没有作用。

实施例3、BET家族蛋白抑制剂(+)-JQ-1、OTX-015和I-BET151的广谱抗病毒活性的研究

为了验证抗病毒活性是否与病毒种类和细胞类型相关，实验中使用PRV-QXX、HSV1-F、VSV-GFP、PRRSV-BJ4、NDV-GFP、ECTV(MOI＝10)和H1N1PR8等多种不同囊膜病毒；以及A549、Marc145、Vero和MDCK等多种不同细胞系。

1、实验材料

A549、Marc145、Vero和MDCK均购自ATCC。

2、实验方法

2.1病毒感染

(1)细胞计数：将计数孔中培养基弃去，加入300μl的胰蛋白酶，放于细胞培养箱中消化，然后用细胞计数板计数。

(2)病毒稀释：公式为{细胞个数×MOI(感染复数)}÷{TCID₅₀×V(加入病毒液体积)} 计算每毫升培养基需要加入的病毒液体积。病毒液的配制需要用无血清的培养基稀释。

(3)病毒吸附：用稀释好的病毒液，倍比稀释化合物(+)-JQ-1、1-BET151和OTX-015。在加入病毒液稀释的化合物前，先用PBS洗一遍细胞，洗去预处理残留的血清及化合物。然后放入细胞培养箱中吸附1h。

(4)换维持培养液：吸附1h后，先用PBS洗涤2遍细胞，加入1％FBS的含有不同浓度化合物的培养基。

不同病毒对应的细胞系及感染剂量如下：

PK15细胞、PRV-QXX(MOI＝0.1)；A549细胞、HSV1-F(MOI＝1)；PK15细胞、 VSV-GFP(MOI＝0.001)；Marc145细胞、PRRSV-BJ4(MOI＝1)；PK15细胞、NDV-GFP (MOI＝0.1)；Vero细胞、ECTV(MOI＝10)；MDCK细胞、H1N1PR8(MOI＝1)。

2.2病毒的收取

感染24h后，显微镜下观察培养板中细胞病变，当病变达到80-90％时，收取病毒。将培养板放入冰箱反复冻融2次，用移液枪吹打板底的细胞，吸出培养基和细胞至EP 管中，3900g离心10min，将上清以120μl/管分装到2ml离心管中，-80℃保存时间更长。

2.3TCID₅₀测定

将细胞按1×10⁴细胞/孔种于96孔板，100μl/孔；准备12支干净、无菌的离心管；向每支离心管各加入900μl无FBS的培养基；将病毒依次倍比稀释10^-1-10^-12；弃去旧培养基，将病毒稀释液以100μl/孔加入对应的细胞孔；37℃，5％CO₂培养箱中孵育；1 h后弃去稀释病毒液，以150μl/孔加入维持液(含1％FBS的培养基)；37℃，5％CO₂培养箱中孵育；4～5天后观察记录病变孔数及稀释度，计算TCID₅₀。

计算方法：找到大于50％和小于50％病变的两列，然后计算比距。

例如：7列6个病变孔，8列3个病变孔，计算TCID₅₀为10⁷+比距/0.1ml

比距＝(大于50％-50％)/(大于50％-小于50％)＝(6/8-4/8)/(6/8-3/8)＝2/3

3、实验结果

结果显示如图3中所示，不同浓度的(+)-JQ-1、OTX-015和I-BET151化合物均能够显著抑制PRV-QXX、HSV1-F、VSV-GFP、PRRSV-BJ4、NDV-GFP、ECTV和H1N1PR8 等囊膜病毒在几种不同细胞中的含量，而对非囊膜病毒Ad5没有作用。这与(+)-JQ-1、 OTX-015和I-BET151化合物可以有效阻止囊膜病毒进入细胞有关，支持了BET家族蛋白抑制剂具有广谱的抗病毒活性。

实施例4、BET家族蛋白抑制剂(+)-JQ-1在体内抑制PRV病毒感染的研究

为了验证前述BET家族蛋白抑制剂的抗病毒活性在动物体上是否依旧有效，分别使用(+)-JQ-1和PRV为代表进行下述实验。

1、实验方法

1.1荧光定量检测PRV基因组水平：6-8周龄实验小鼠(每组7只)正常饲喂一周后，先颈部肌肉注射(+)-JQ-1(50mg/kg)，再颈部肌肉注射200μl PRV QXX (TCID₅₀＝1x10⁵)，感染6天后取肺，qRT-PCR分析小鼠肺中PRV基因组水平。

1.2小鼠存活率分析：6-8周龄实验小鼠(每组15只)正常饲喂一周后，先颈部肌肉注射(+)-JQ-1(50mg/kg)，再颈部肌肉注射200μl PRV QXX(TCID₅₀＝1x10⁵)，攻毒后每天观察小鼠存活情况，计算小鼠存活率。

1.3HE染色分析：

(1)取材固定：将1.2中小鼠肺脏组织块置于10倍体积以上的4％甲醛溶液中，固定24h。

(2)脱水：组织固定后，用流水冲洗一夜，在依次经过梯度酒精脱水。

(3)透明：二甲苯透明15min，两次。

(4)浸蜡：温度设置为65℃，浸蜡4h，每2h换一次蜡。

(5)包埋、修块

(6)切片：刻度指针到5-8μm；

(7)摊片

(8)HE染色。

(9)封藏。

2、实验结果

结果如图4A显示(+)-JQ-1可以降低小鼠肺中PRV基因组水平，这与其抑制PRV 对于细胞的侵入有关。结果如图4B显示相较于对照组，(+)-JQ-1可以明显提高小鼠存活率。结果如图4C显示PRV病毒感染会导致小鼠肺部炎性细胞浸润，(+)-JQ-1处理后肺部炎性浸润情况明显改观。上述结果进一步证实BET家族蛋白抑制剂的抗病毒活性在动物体上依旧有效。

实施例5、BET家族蛋白抑制剂(+)-JQ-1在体内抑制VSV病毒感染的研究

使用另一种囊膜病毒VSV，进一步验证(+)-JQ-1对其它囊膜病毒对动物体的感染是否依旧有抑制作用。

1、实验方法

1.1荧光定量检测PRV基因组复制：6-8周龄实验小鼠(每组7只)正常饲喂一周后，先颈部肌肉注射(+)-JQ-1(50mg/kg)，再颈部肌肉注射200ul VSV-GFP (TCID₅₀＝1x10⁵)，感染6天后取小鼠肺脏、肝脏、脾脏，qRT-PCR分析小鼠脏器中 VSV基因组水平。

1.2HE染色观察小鼠肺部炎性细胞浸润：将1.1中小鼠肺脏切片，进行HE染色，观察小鼠肺部炎性细胞浸润。

2、实验结果

结果如图5A,B,C显示(+)-JQ-1可以降低小鼠肺中VSV基因组水平，这与其抑制PRV对于细胞的侵入有关。结果如图5D也显示VSV-GFP病毒感染会导致小鼠肺部炎性细胞浸润，(+)-JQ-1处理后肺部情况明显改观。上述结果进一步证实BET家族蛋白抑制剂在动物体上的抗病毒活性并不受限于特定的囊膜病毒。

实施例6、BET家族蛋白抑制剂对于干扰素的作用研究

不受任何理论束缚，推测BET家族蛋白抑制剂的抗病毒感染或许部分与干扰素有关，因此进行以下研究。

实施例6.1cGAS、STING、TBK1、IRF3、IFNAR1基因结构和CRISPR-Cas9敲除 PK15细胞对应基因后DNA的测序

1、实验材料

Crispr/Cas9基因编辑慢病毒质粒lenticrispr v2购自addgene；psPAX2质粒、pMD2.G 质粒、Ampicillin和Puromycin购自Sigma公司；TOP10大肠杆菌感受态实验室自备；BsmB I限制性内切酶、T7酶及T4连接酶购自NEB；基因组DNA提取试剂盒购自上海莱枫。

2、实验方法与结果

2.1sgRNA的序列：不同基因对应的基因组结构如图3。该处最终所用sgRNA序列分别如下：

2.2sgRNA引物设计：

另外，需要在该位点上下游各设计一条引物，扩增片段500-700bp左右，以便后续T7EI酶切，或测序检测阳性克隆。对应扩增PCR引物分别如下：

2.3重组质粒构建：

(1)引物退火杂交，体系:

F(100μM) 5μl

R(100μM) 5μl

PCR仪进行退火杂交

(2)载体酶切，体系

PCR仪中，37℃，3h后，0.8％琼脂糖凝胶电泳，胶回收，加50μl ddH2O。(酶切后有两条带：13000bp+1873bp，回收13000bp片段)。

(4)连接体系：

(5)转化TOP10感受态细胞：

冰浴30min后42℃热激90s，立即置于冰上5min；加入600μl无抗LB摇菌1h；取200μl菌液涂布于LB平板(含Amp 100μg/ml)；倒置于37℃温箱培养14～16h；挑菌测序正确后(挑取4～6个菌落即可，不需要做菌液PCR鉴定)，中提阳性样品。

2.4慢病毒包装：

(1)转染：准备293T/17细胞，T25细胞培养瓶。第二天细胞长至40％，做转染。体系：

B：PEI 16μl → 200μl optiMEM

先将B静置5min，后与A混匀静置25min，加入各瓶细胞的培养液中，混匀，放于37℃温箱继续培养，转染后8-10h换液；

(2)收病毒液：48h后，收集上清放于可暂时存放于4℃，加入新的培养液继续培养；再培养24h，收集上清，与第一次收集的上清混匀，1000g，5min离心去除细胞碎渣，后分装上清，留1支1mL用于感染细胞，其余存放于-80℃。

2.5目的细胞系的感染:

提前准备PK15细胞，种于6孔板中，第二天细胞长至40％左右，用1ml慢病毒液 +1ml新鲜培养液(10％FBS)培养细胞；48h后用含嘌呤霉素10μg/ml的培养液培养细胞，留一孔细胞做空白对照(不感染慢病毒)。观察细胞死亡情况，及时换液，正常消化传代；筛选进行到空白对照细胞全部死掉，使用相应的2μg/ml puro维持培养基进行扩大培养；100mmdish先冻存3支，待T7EI检测后复苏编辑效率较高的sgRNA细胞进行单克隆化。

2.6编辑效果分析：

(1)提取基因组

细胞量可以时，取一部分用于提基因组DNA。

(2)PCR扩增

以200ng基因组DNA为模板，以Q5酶扩增，PCR产物经PCR产物回收试剂盒回收。

(3)PCR产物退火杂交及酶切，体系：

10×NEbuffer 2 1μl

PCR产物(200ng) xμl

ddH₂O 8.6-xμl

引物退火杂交。PCR结束后，每管加入0.4μl T7EI，37℃，30min。

(4)PAGE胶电泳，体系：

电泳缓冲液为1*TBE

电泳结束后，10×SYBR Green I染色1h，凝胶成像系统拍照。测定各条带灰度值，并代入公式中：(1-(1-(b+c/a+b+c))1/2)×100(注：a、b、c代表各电泳条带灰度值)计算编辑效率。

2.7KO单克隆的获取

(1)挑取编辑效率较高的细胞进行单克隆：将细胞进行有限稀释法至0.3个细胞/孔，加至96孔细胞培养板，分四块培养板进行单克隆。

(2)单克隆的鉴定---利用以基因组为模板的PCR产物，经连接T载体并挑取单克隆进行测序，进行序列比对，鉴定基因敲除的细胞系。

结果如图6所示，cGAS、STING、TBK1、IRF3、IFNAR1基因结构和CRISPR-Cas9 敲除PK15细胞对应基因后DNA测序结果表示以上基因均发生基因组编辑，均被成功敲除。

实施例6.2BET家族蛋白抑制剂通过cGAS-STING信号通路激活β型干扰素(IFN)

1、实验材料

BCA试剂盒购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；p-TBK1(#5483),TBK1(#3504),p-IRF3(#29047),IRF3(#11904),p-P65(#3033),P65(#8242),p-STAT1(#9167), STAT1(#9172),STING(#3337)抗体购自CST；actin(A1978)抗体购自Sigma；HEK293、 RAW264.7、HEK293T细胞系均购自ATCC。

2、实验方法及结果

2.1化合物处理：用(+)-JQ-1(300nM)分别处理HEK293、RAW264.7、HEK293T 细胞及野生型、cGAS^-/-、STING^-/-、TBK1^-/-、IRF3^-/-PK15细胞系，于不同时间点加入1ml/ 孔TRIZOL裂解。

2.2qRT-PCR检测干扰素水平

(1)RNA提取

(2)反转录：制备DNase(Progema,M6101)10μl体系，加样体系如下：

PCR程序：

加1μl RQ1DNAse Stop Solution，65℃10min使DNase失效，然后加入1μl oligodT(使用浓度为10μM)70℃5min，速置冰上5min。

向混合液中加入以下预混液(13μl)：

PCR程序：

然后加入75μl DEPC水。

(3)荧光定量

荧光定量PCR预混体系如下：

a＝模板数量 b＝引物对数量

时间	×1	×3.3	×3.3×a	×3.3×a×b
					vol	10μL	28.05μL	28×a
H2O	2.7μL			10.78×a×b
					2×MIX	5μL			20×a×b
引物	0.8μL		2.9×a
					模板	1.5μL	5μL

例如：b＝2a＝5

需要水的量＝10.78×2×5＝107.8μl

2×MIX的量＝20×2×5＝200μl

步骤1和2混匀，分b＝2个28×a＝140μl

需要Primer的量(包括上游和下游)2.9×a＝14.5μl

步骤3的每一管和4中的一种基因的引物混匀

把步骤5中的每管液体分到5个管中，每管28.05μl

需要模板的量5μl

步骤6中的每管的混合液分别和7中的模板混匀，总共33μl

用镊子摆好八联排，并进行标记序号，然后加样。

在PCR仪上进行反应，反应条件：95℃预变性2min；95℃变性15s；60℃退火20 s；72℃延伸20s，40个循环。本实施例中用到的荧光定量PCR引物如下：

(4)荧光定量：结果分析如图7A,B,C,D,E,F中显示，(+)-JQ-1处理可以剂量依赖性增强细胞中干扰素水平，然而在cGAS^-/-、STING^-/-、TBK1^-/-、IRF3^-/-PK15敲除细胞系中(+)-JQ-1不能激活干扰素表达，说明(+)-JQ-1可以通过cGAS-STING-TBK1-IRF3通路激活干扰素。

2.3免疫印迹

(1)蛋白的收取

(2)SDS琼脂糖电泳：先在120V、300mA、300W电压下进行，待溴酚蓝跑到分离胶之后，将电压调至160V、300mA、300W，等溴酚蓝指示剂跑到胶底时结束电泳。

(3)转膜：100V、300mA、300W、1h 10min，转膜成功，胶上有明显蛋白 Marker痕迹。

(4)振荡封闭，加入一抗，一抗是用5％的BSA(1×TBST配制)1:500进行稀释的，振荡孵育4℃过夜；吸取一抗放-20℃保存，膜用TBST洗4次，10min洗2次，5min 洗2次；5％的脱脂奶粉(1×TBST配的)1:5000稀释二抗，转移脱色摇床室温振荡1h；洗膜1×TBST洗10min洗2次，5min洗2次，共洗4次；采用Thermo的ECL显色试剂盒进行显色，合理调整曝光时间。

结果如图7G所示，在HEK293细胞中，(+)-JQ-1可以剂量依赖促进p-TBK1、p-IRF3、p-P65、p-STAT1的表达，然而在STING天然缺失的HEK293T细胞中，(+)-JQ-1不能激活他们的表达，即(+)-JQ-1可以通过cGAS-STING-TBK1-IRF3通路激活干扰素。

前述实验证实了BET家族蛋白抑制剂可以激活干扰素，这或与是BET家族蛋白抑制剂可以抑制病毒对于细胞进入的机理之一；但是此结果似乎依旧阐明为何BET家族蛋白抑制剂仅对于囊膜蛋白的侵入起到有效抑制作用，这一现象难以预期。

实施例7、BET家族蛋白抑制剂诱导DNA损伤的研究

不受任何理论束缚，推测BET家族蛋白抑制剂的抗病毒感染或许部分与诱导DNA损伤有关，因此进行以下研究。

1、实验材料

1.1抗体、细胞、质粒

γ-H2AX(CST,#80312)和H2AX(CST,#7631)抗体均购自于Cell SignalingTechnology(CST)；dsDNA(CBL186)抗体购自于merckmillipore；Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG(H+L)二抗和Alexa Fluor 555山羊抗兔IgG(H+L)二抗购自Invitrogen(美国)； 4',6-二氨基-2-苯吲哚(DAPI)购自ServiceBio；NIH/3T3和A549细胞购自美国模式菌种保藏中心(ATCC)；mCherry-Mito-7(55102)质粒购自addgene。

1.2实验仪器

LSM800激光共聚焦显微镜(ZEISS)

2、实验方法与结果：

2.1化合物处理：将细胞爬片放于24孔细胞板底部，将NIH/3T3、A549和PK15 细胞均按照1ⅹ10⁵细胞/孔(体积500μl)接种于细胞板中，细胞贴壁后备用；将稀释的含有300nM(+)-JQ-1的培养基分别加入到24孔板中，每孔加入500μl，其中DMSO 作为阴性对照，在5％CO₂细胞培养箱中23h。23h后，将另一未处理孔用紫外线处理 (100mJ/cm²)10min，然后放入培养箱至24h。弃去培养液，PBS清洗一遍，加500μl 4％PFA(多聚甲醛)固定细胞。

2.2γ-H2AX免疫荧光法鉴定抑制(+)-JQ-1引起DNA损伤：将3.1中细胞室温固定30min，弃去固定液；加入500μl 0.1％TritonX-100通透细胞，5min后洗去，PBS清洗 3遍；夹出爬片，正面朝上放于干净的缠有封口膜的载玻片上，孵育一抗γ-H2AX(1:200 稀释)和H2AX(1:200稀释)1h，PBS清洗3遍；避光孵育Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG(H+L)二抗和Alexa Fluor 555山羊抗兔IgG(H+L)荧光二抗(1:1000稀释)1h； PBS清洗3遍，超纯水洗3遍；将1:1000稀释的DAPI核染试剂滴加在玻片上，80μl/ 片即可，避光孵育；10min后，PBS清洗3遍，超纯水洗3遍；在一干净载玻片上滴加10μl/片抗荧光淬灭封片剂，将爬片细胞面朝下扣在载玻片上，进行封片；封片剂完全干燥后用激光共聚焦显微镜观察荧光并拍照。

结果(图8A)显示在三种细胞中(+)-JQ-1处理24h后γ-H2AX荧光强度均增强，即(+)-JQ-1可以引起细胞DNA损伤。

2.3质粒转染：将细胞爬片放于24孔细胞板底部，将NIH/3T3细胞均按照1ⅹ10⁵细胞/孔(体积500μl)接种于细胞板中，细胞贴壁后备用；将100μl DMEM加入到1.5 ml EP管中，将1μl mCherry-Mito-7质粒和5μl转染试剂PEI加入EP管中，混合均匀；室温静置25min，均匀滴加入24孔板中；放于37℃培养箱中培养24h。将稀释好的含有300nM JQ-1的培养基加入到24孔板中，每孔加入500μl，其中DMSO作为阴性对照，培养12h。弃去培养液，PBS清洗一遍，加500μl 4％PFA(多聚甲醛)固定细胞。

2.4dsDNA免疫荧光法鉴定抑制BRD4引起DNA泄露：将3.3中细胞室温固定30 min，弃去固定液；加入500μl 0.1％TritonX-100通透细胞，5min后洗去，PBS清洗3 遍；夹出爬片，正面朝上放于干净的缠有封口膜的载玻片上，孵育一抗dsDNA(CBL186) 抗体(1:50稀释)1h，PBS清洗3遍；避光孵育Alexa Fluor 488山羊抗鼠IgG(H+L) 二抗(1:1000)1h；PBS清洗3遍，超纯水洗3遍；将1:1000稀释的DAPI核染试剂滴加在玻片上，80μl/片即可，避光孵育；10min后，PBS清洗3遍，超纯水洗3遍；在一干净载玻片上滴加10μl/片抗荧光淬灭封片剂，将爬片细胞面朝下扣在载玻片上，进行封片；封片剂完全干燥后用激光共聚焦显微镜观察细胞质中非线粒体DNA的含量并拍照(DAPI，蓝色)、线粒体(红色)和DNA(绿色)。

拍照结果(图8B左)及结果分析(图8B右)显示在细胞中(+)-JQ-1处理后细胞质中非线粒体DNA含量明显增多，即化合物处理后细胞中出现DNA泄漏。

在本申请中引用的所有出版物和专利申请指明了本公开内容所属领域的技术水平。它们都通过援引以其整体加入本文。

根据以上描述，本领域技术人员可确定本发明的必要特征，并可在不背离本发明精神和范围下对本发明进行各种变化和修改以使其适于各种用途和条件。所有这样的修改和修改也包括在本发明的范围中。因此，本发明的范围应当由所附的权利要求和它们的法律等同方案来确定。

序列表

<110> 河南农业大学

<120> BET家族蛋白抑制剂的抗病毒用途

<130> I2019TC3173CB

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> sgRNA-cGAS

<400> 1

agtgtaaatg gcgctccaa 19

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> sgRNA-STING

<400> 2

gaatacacgc tccggtggc 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> sgRNA-TBK1

<400> 3

tctcgtagac tttgaggcg 19

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> sgRNA-IRF3

<400> 4

cccttggaag cacggcttg 19

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> F

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(24)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

caccgnnnnn nnnnnnnnnn nnnn 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> R

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(23)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

aaacnnnnnn nnnnnnnnnn nnnc 24

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Q-Sus actin

<400> 7

ctgaacccca aagccaaccg t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Q-Sus actin

<400> 8

ttctccttga tgtcccgcac g 21

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Q-human actin

<400> 9

gcacagagcc tcgcctt 17

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Q-human actin

<400> 10

ccttgcacat gccggag 17

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Q-Mus actin

<400> 11

ccccattgaa catggcattg 20

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Q-Mus actin

<400> 12

acgaccagag gcatacagg 19

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Q-Sus IFN-β

<400> 13

agttgcctgg gactcctcaa 20

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Q-Sus IFN-β

<400> 14

cctcagggac ctcaaagttc at 22

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Q-human IFN-β

<400> 15

caggagagca atttggagga 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Q-human IFN-β

<400> 16

ctttcgaagc ctttgctctg 20

<210> 17

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Q-Mus IFN-β

<400> 17

atgagtggtg gttgcaggc 19

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<220>

<223> Q-Mus IFN-β

<400> 18

tgacctttca aatgcagtag attca 25

Claims

1.BET家族蛋白抑制剂在制备用于抑制囊膜病毒进入细胞的试剂中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其中所述BET家族蛋白抑制剂是BRD4蛋白抑制剂，优选(+)-JQ-1、OXT-015和/或I-BET151。

3.如权利要求1或2所述的用途，其中所述抑制囊膜病毒进入细胞为抑制囊膜病毒对细胞的吸附。

4.如权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述BET家族蛋白抑制剂通过激活干扰素，优选通过cGAS-STING-TBK1-IRF3信号通路激活干扰素，来抑制囊膜病毒对细胞的吸附。

5.如权利要求1-4中任一项所述的用途，其中所述囊膜病毒为选自由以下组成的组的病毒：正粘病毒、副粘病毒、冠状病毒、疱疹病毒、动脉炎病毒、痘病毒、弹状病毒和流感病毒；更优选为选自由以下组成的组的病毒：水泡性口炎病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、鼠痘病毒、新城疫病毒、伪狂犬病毒和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒。

6.如权利要求1-5中任一项所述的用途，其中所述试剂为用于研究目的，特别是生物学和药学领域研究的试剂。

7.BET家族蛋白抑制剂在制备用于在对象中抗囊膜病毒感染的药物中的用途，其中所述BET家族蛋白抑制剂优选是BRD4蛋白抑制剂，更优选(+)-JQ-1、OXT-015和/或I-BET151。

8.如权利要求7所述的用途，其中所述抗囊膜病毒感染包括抗所述囊膜病毒对细胞的吸附。

9.如权利要求7或8所述的用途，其中所述囊膜病毒为选自由以下组成的组的病毒：正粘病毒、副粘病毒、冠状病毒、疱疹病毒、动脉炎病毒、痘病毒、弹状病毒和流感病毒；更优选为选自由以下组成的组的病毒：水泡性口炎病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、鼠痘病毒、新城疫病毒、伪狂犬病毒和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒。

10.如权利要求7-9中任一项所述的用途，其中所述对象是哺乳动物，优选是猪或人。