CN113368112B - Usp1-uaf1抑制剂在制备药物中的应用，药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药物领域，具体公开了USP1‑UAF1抑制剂在制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用，药物组合物。本发明先在化合物库中筛选出ML323，通过Western blot、Q‑PCR等验证ML323对PRRSV在细胞感染中的作用，再分别针对USP1、UAF1设计siRNA，验证下调USP1、UAF1表达对PRRSV感染的影响，同时构建USP1过表达细胞系，验证上调USP1表达对PRRSV感染的影响。实验结果表明，ML323对PRRSV在细胞中的增殖具有抑制作用，特别是ML323抑制细胞USP1、UAF1表达，抑制PRRSV N蛋白表达，抑制PRRSV ORF7mRNA表达。

Description

USP1-UAF1抑制剂在制备药物中的应用，药物组合物
技术领域
本发明属于药物领域，具体涉及USP1-UAF1抑制剂在制备防治猪繁殖与呼吸综合征药物中的应用，以及药物组合物。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是引起猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的病原体。该病主要侵害猪的呼吸道系统和生殖系统，怀孕母猪感染后主要表现为情绪低落，食欲不振，耳朵腹部皮肤发绀，随后发生早产，流产，死胎，木乃伊胎，产后仔猪死亡率增加；公猪表现为厌食、嗜睡、受精率和配种率下降，育肥猪则出现食欲不振、呼吸困难。
PRRSV属于动脉炎病毒科、动脉炎病毒属，是一种含有囊膜的单股正链RNA病毒。它的基因组大小约为15.4kb，包含至少10个开放阅读框(ORF)，由5’端至3’端分别编码ORF1a-ORF1b-ORF2a-ORF2b-ORF3-ORF4-ORF5/ORF5a-ORF6-ORF7。ORF1a和ORF1b约占整个基因组的75％，主要编码非结构蛋白，其编码的蛋白主要发挥RNA复制酶和RNA聚合酶作用。ORF2至ORF7编码8种结构蛋白，主要参与形成病毒粒子。
PRRSV的感染特征极其复杂，作为RNA病毒其基因组极易变异，直到当前仍有新的变异株出现。PRRS还被认为是一种免疫抑制性疾病，可以抑制天然免疫，如对体液免疫有部分抑制作用并延迟中和抗体的产生，也可以抑制细胞免疫，一旦感染便会终生带毒，且具有垂直传播特点，致使仔猪生存率下降。PRRSV对养猪业造成了巨大的损失，虽然有疫苗使用，但是不能做到全面有效的保护，究其原因在于市场上的疫苗质量参差不齐，每个养殖场的免疫背景也不清晰，加之疫苗免疫程序不能做到严格管控，部分不合格疫苗和不规范操作加剧了PRRSV感染，使得防控工作难度加大。并且到目前为止尚未研究出有效的药物用于PRRSV的疾病防治。因此，筛选有效的抗病毒药物成为预防和治疗PRRS的主要手段之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种USP1-UAF1抑制剂在制备药物中的应用，尤其是ML323在制备抗病毒药物，特别是抗PRRSV感染药物中的应用。
同时，本发明还提供一种包含USP1-UAF1抑制剂的药物组合物。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
USP1-UAF1抑制剂在制备药物中的应用，具体的，USP1-UAF1抑制剂在制备抗病毒药物中的应用。
作为一种优选的实施方案，USP1-UAF1抑制剂在制备抗PRRSV感染药物中的应用。
作为一种优选的实施方式，所述USP1-UAF1抑制剂为ML323。进一步优选地，所述ML323在制备抗PRRSV感染药物中的应用。
ML323是一种强效的、选择性的USP1-UAF1抑制剂，CAS：1572414-83-5，分子式：C23H24N6，分子量：384.48，结构式如下：
Figure BDA0003057195160000011
作为一种优选的实施方式，ML323在制备抗PRRSV感染药物中的应用，具体的，ML323抑制PRRSV在细胞中的感染。实验结果表明，ML323对PRRSV在细胞中的复制和增殖具有抑制作用，特别是ML323抑制细胞USP1、UAF1蛋白的表达，降低USP1、UAF1 mRNA的表达水平，从而抑制PRRSV N蛋白的表达，抑制PRRSV ORF7 mRNA的表达，抑制PRRSV子代病毒粒子的形成。随着ML323浓度的增加，抑制效应逐渐加强；随着ML323作用时间的延长，抑制效应也逐渐加强。并且，ML323对PRRSV感染细胞无毒性作用，不影响细胞的正常增殖。进一步的实验结果表明，PRRSV的非结构蛋白Nsp1β主要是K48泛素化类型的修饰，ML323对USP1去泛素化作用的抑制促进了Nsp1β在K48位的泛素化链的形成，从而降低了Nsp1β的表达。
药物组合物，至少包含USP1-UAF1抑制剂，所述USP1-UAF1抑制剂优选ML323。
作为一种优选的实施方式，所述药物为抗病毒药物。进一步优选地，所述抗病毒药物为抗PRRSV感染药物。
作为一种优选的实施方式，所述药物组合物中ML323的质量百分含量为0.01％-99.99％。进一步优选地，所述药物组合物中ML323的质量百分含量为0.01-50％。进一步优选地，所述药物组合物中ML323的质量百分含量为0.1-5％。
作为一种优选的实施方式，所述药物组合物中还包含药学上可接受的载体或辅料。
作为一种优选的实施方式，所述ML323作为唯一的药物活性成分，或者与其他药物活性成分联合使用。
作为一种优选的实施方式，所述药物组合物可以制成固体制剂或液体制剂。所述固体制剂(口服)如散剂(包括预混剂)、水溶性粉剂(包括水扩散性粉剂、水溶性颗粒剂)、片剂等。所述液体制剂如溶液剂(包括混悬液、乳浊液)、注射剂(包括水针、粉针)等。
本发明的有益效果：
本发明以PRRSV-BJ4和PRRSV-GFP为模式病毒，利用构建的小分子化合物库筛选显著抑制PRRSV感染并与泛素化相关的小分子化物。以USP1-UAF1复合体的特异性抑制剂ML323为切入点，通过RT-qPCR等方法验证ML323对PRRSV在MARC-145细胞和PAM-Tang细胞中增殖的调控作用，并呈浓度依赖性和时间依赖性。利用siRNA干扰细胞内USP1、UAF1的表达，同时构建过表达细胞系，验证其在PRRSV感染细胞过程中的作用。通过Co-IP方法挖掘PRRSV-BJ4编码病毒蛋白主要结合的泛素化位点，明确PRRSV-BJ4编码病毒蛋白对泛素化作用的调控机制。Western blot、RT-qPCR、TCID50等实验结果表明，ML323可以抑制PRRSV在MARC-145、PAM-Tang细胞中的增殖，PRRSV感染促进USP1、UAF1的表达；siRNA干扰UAF1、USP1表达后，Western blot、RT-qPCR、滴度等实验验证PRRSV感染会受到显著抑制，而过表达USP1会显著促进PRRSV的增殖；Co-IP实验发现PRRSV-BJ4的非结构蛋白Nsp1β主要结合K48类型的泛素，并且ML323抑制USP1去泛素化作用的发挥促进了Nsp1β在K48位的泛素化链的形成。
以上实验结果表明，PRRSV感染会促进USP1、UAF1的表达，而USP1-UAF1复合体的特异性抑制剂ML323可以抑制病毒感染。ML323促进Nsp1βK48泛素链的形成，抑制Nsp1β的表达，从而抑制病毒感染。本发明将小分子化合物ML323制备成药物用于PRRS的抗感染治疗，为PRRS治疗药物的开发提供了新的思路。
附图说明
图1为实验例中抑制PRRSV-GFP小分子化合物的筛选结果，A-E分别为Simvastatin、CAY10603、NK598、KH-CB19、ML323对PRRSV-GFP病毒的影响；
图2为实验例中ML323对MARC-145细胞毒性的检测结果，ML323在1μM、3μM、10μM、20μM浓度下的处理MARC-145不同时间点，通过CCK-8检测后在1μM、3μM、10μM浓度下对MARC-145细胞无毒性；
图3为实验例中ML323抑制PRRSV在MARC-145感染作用的验证；A：随着ML323浓度的增加，MARC-145细胞中USP1、UAF1蛋白水平和PRRSV-BJ4病毒的N蛋白的表达水平得到抑制，并且随着化合物浓度的增加，抑制情况也更加显著；B：MARC-145细胞中USP1、UAF1的mRNA水平和PRRSV-BJ4病毒的OPF7的mRNA水平随着化合物浓度增加，逐渐加剧抑制作用；C：荧光拍照结果和流式检测结果显示PRRSV-GFP病毒的荧光含量也随着ML323的浓度变化显著抑制；D：TCID50测定的自带病毒的含量也随着ML323的浓度增加逐渐加剧了抑制作用；
图4为实验例中ML323抑制PRRSV在PAM-Tang感染作用的验证，A-C分别显示PAM-Tang细胞中USP1、UAF1的mRNA水平和PRRSV-BJ4病毒的OPF7的mRNA水平随着ML323浓度增加，抑制作用逐渐加剧；
图5为实验例中ML323以时间依赖抑制PRRSV感染MARC-145细胞，A-C分别显示MARC-145细胞中USP1、UAF1的mRNA水平和PRRSV-BJ4病毒的ORF7的mRNA水平随着化合物作用不同时间点均被抑制；
图6为实验例中ML323以时间依赖抑制PRRSV感染PAM-Tang细胞，A-C分别显示PAM-Tang细胞中USP1、UAF1的mRNA水平和PRRSV-BJ4病毒的ORF7的mRNA水平随着化合物作用不同时间点均被抑制；
图7为实验例中MARC-145-siUAF1细胞系干扰效率的检测结果；A：Western Blot结果显示，UAF1siRNA1更为显著的抑制UAF1蛋白的表达；B：Q-PCR结果显示，UAF1siRNA1更为显著的抑制UAF1 mRNA的表达；
图8为实验例中干扰UAF1抑制PRRSV感染MARC-145细胞的实验结果；A：干扰MARC-145细胞中的UAF1的蛋白抑制PRRSV-BJ4病毒N蛋白的表达；B：干扰UAF1显著抑制PRRSV-BJ4病毒ORF7的mRNA；C：瞬时转染siUAF1到MARC-145细胞中显著抑制PRRSV-BJ4子代病毒的形成；D：荧光拍照和流式检测结果都显示，MARC-145-UAF1siRNA1细胞中PRRSV-GFP病毒的荧光显著低于正常细胞；
图9为实验例中PAM-Tang-UAF1siRNA细胞系干扰效率的检测结果；A：WesternBlot结果显示，UAF1siRNA2对UAF1蛋白的干扰效率更加显著；B：Q-PCR结果显示，UAF1siRNA2对UAF1的mRNA的水平抑制效果更明显；
图10为实验例中干扰UAF1抑制PRRSV感染PAM-Tang细胞的实验结果；A：干扰PAM-Tang细胞中的UAF1的蛋白抑制PRRSV-BJ4病毒N蛋白的表达；B：干扰UAF1显著抑制PRRSV-BJ4病毒ORF7的mRNA；
图11为实验例中MARC-145-USP1siRNA细胞系干扰效率的检测结果；A：Q-PCR结果显示，USP1siRNA3更为显著的抑制USP1的mRNA水平；B：Western Blot结果也同样显示，USP1siRNA3对USP1蛋白水平有更为显著的下调作用；
图12为实验例中干扰USP1抑制PRRSV感染MARC-145细胞的实验结果；A：干扰MARC-145细胞中的USP1的蛋白抑制PRRSV-BJ4病毒N蛋白的表达；B：干扰USP1显著抑制PRRSV-BJ4病毒ORF7的mRNA；C：瞬时转染USP1siRNA到MARC-145细胞中显著抑制PRRSV-BJ4子代病毒的形成；
图13为实验例中PAM-Tang-USP1siRNA细胞系干扰效率的检测结果；A：WesternBlot结果显示，USP1siRNA1对PAM-Tang细胞中USP1蛋白干扰效率最为显著；B：Q-PCR结果显示，USP1siRNA1对USP1的mRNA有最显著的干扰效率；
图14为实验例中干扰USP1抑制PRRSV感染PAM-Tang细胞的实验结果；A：PAM-Tang细胞中的USP1蛋白下调后抑制PRRSV-BJ4病毒N蛋白的表达；B：干扰PAM-Tang细胞中的USP1显著抑制PRRSV-BJ4病毒ORF7的mRNA；
图15为实验例中MARC-145-USP1过表达细胞系构建表达结果，Western Blot结果显示，过表达USP1后MARC-145细胞中的USP1蛋白水平显著增加；
图16为实验例中过表达USP1促进PRRSV感染MARC-145细胞的实验结果；A：过表达MARC-145细胞中的USP1蛋白促进PRRSV-BJ4病毒N蛋白的表达；B：过表达USP1显著促进PRRSV-BJ4子代病毒的形成；C：荧光拍照结果和流式检测结果显示PRRSV-GFP病毒的荧光含量在过表达USP1得到显著的促进；
图17为实验例中PAM-Tang-USP1过表达细胞系构建表达结果，Western Blot结果显示，过表达USP1后PAM-Tang细胞中的USP1蛋白水平显著增加；
图18为实验例中过表达USP1促进PRRSV感染PAM-Tang细胞的实验结果，过表达PAM-Tang细胞中的USP1蛋白促进PRRSV-BJ4病毒N蛋白的表达；
图19为实验例中3×Flag-CMV-Nsp1β真核表达质粒构建表达结果；A：Nsp1β目的序列的扩增；B：Western blot结果显示Nsp1β真核表达质粒成功表达；
图20为实验例中Nsp1β主要结合的泛素类型的实验结果，其中3×Flag-CMV-Nsp1β与PRK-HA-WT-Ubi，PRK-HA-K48O-Ubi，PRK-HA-K63O-Ubi都有相互作用，Co-IP结果显示Nsp1β主要是K48泛素化类型的修饰；
图21为实验例中ML323抑制Nsp1β的表达并促进其K48修饰。
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，以上对实验例中使用的附图作简单地介绍。应当理解，上述附图仅示出了本发明的某些实验例，因此不应被看作是对权利保护范围的限制。对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、采取的技术方案和达到的技术效果更容易理解，下面结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细、完整和清楚地说明。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者产品制造商建议的条件进行。实施例实验例中使用的试剂、仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售途径购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例中USP1-UAF1抑制剂ML323在制备抗PRRSV感染药物中的应用。具体的，抗PRRSV感染药物包含有效量的ML323。
实施例2
本实施例的药物组合物，包含有效量的USP1-UAF1抑制剂ML323和药学上可接受的辅料。所述药物组合物可以制备成散剂，方便饲喂猪只，适量使用。
实验例
一、材料
细胞系：MARC-145(非洲绿猴胚胎肾细胞)、PAM-Tang(猪肺巨噬细胞)和HEK293T(人胚胎肾上皮细胞衍生细胞系)。
病毒：猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV-BJ4)和猪繁殖与呼吸综合征重组荧光病毒(PRRSV-GFP)。
质粒：Chlo-3×Flag-CMV-USP1-14、SUS-3×Flag-CMV-USP1-14由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，以及3×Flag-CMV-14、PRK-HA、PRK-HA-WT-Ubi、PRK-HA-K48O-Ubi、PRK-HA-K63O-Ubi质粒。
感受态细胞：E.coli Top10感受态细胞购自北京鼎国昌盛公司。
细胞培养耗材：MARC-145、HEK293T传代培养基为含有10％的胎牛血清(FetalBovine Serum，FBS)的DMEM。PAM-Tang传代培养基为含有10％FBS的1640。MARC-145细胞维持培养基为含有2％FBS的DMEM。PAM-Tang细胞维持培养基为含有2％FBS的1640，以上均购自美国Thermo公司。
主要试剂：15％、12.5％、10％、7.5％凝胶快速制备试剂盒均购自上海雅酶生物科技有限公司。ML323购自MCE。DNA Marker均购自北京全式金生物。蛋白Marker购自SMOBIO。Monoclonal Anti-HA-Peroxidase antibody produced in mouse、单克隆抗-
Figure BDA0003057195160000041
M2-过氧化物酶(HRP)小鼠抗体，二甲亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司。T4 DNA连接酶，EcoR 1-HF内切酶，Xba I内切酶购自NEW ENGLAND Biolabs。USP1单克隆抗体，UAF1(WDR48)单克隆抗体均购自proteintech。线性聚乙烯亚胺(PEI)购自上海YEASEN。HiScript II Q RTSuperMix for qPCR(+gDNA wiper)购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。SsoAdvancedUniversal
Figure BDA0003057195160000051
Green Supermix购自英国BIO-RAD。Takara Primer STAR Max DNAPolymerase购自日本TAKARA。
细胞维持培养基：吸取1mL FBS加入到49mL DMEM培养基中，配制成2％FBS的DMEM；吸取1mL FBS加入到49mL 1640培养基中，配制成2％FBS的1640。
细胞冻存液：FBS：DMSO按照9:1的比例配制得到。
M2洗脱Buffer：取100mL玻璃烧杯，加入0.5mL的1M Tris-HCl、0.5mL的NP-40，0.1mL的5M NaCl，0.6mL的0.5M EDTA，0.6mL的0.5M EGTA，定容至100mL。
2×SDS Loading：取1L玻璃烧杯，加入60.57g Tris，20g SDS，100mL甘油，0.1g溴酚蓝，定容至500mL；使用时加入β-巯基乙醇(每50mL加入1mL，现用现配)。
PEI：取1L玻璃烧杯，将1g PEI 25000粉末加入900mL超纯水，边搅拌边滴加盐酸(12mol/L)调节pH，直至pH＜2.0，至完全溶解，整个过程保持pH＜2.0。边搅拌边滴加入NaOH(10mol/L)调节pH，直至pH至6.9-7.1。将溶液转入量筒，定容至1L。使用0.22μm滤器过滤除菌，得到1mg/mL的储存液。
PBS：分别称量NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4·12H2O 14.4g，KH2PO4 2.4g于1L烧杯中，加入800mL的去离子水，混合溶解；调节pH至7.0-7.2，定容至1L；湿热灭菌，室温保存。使用时按水：10×PBS＝9:1稀释，即1×PBS。
TBS/TBST：称量NaCl 88g，取1M Tris-HCl(PH＝8.0)200mL于1L烧杯中，加去离子水定容至1L，室温保存。使用时按水：10×TBS＝9:1稀释，每1L 1×TBS中加3mL 25％Tween-20，即1×TBST。
二、实验方法
A、E.coli Top10感受态的制备
CaCl2法制备E.coli Top10感受态细胞需全程无菌，具体操作如下：
(1)取Top10甘油菌，划线接种于无抗生素的LB固体平板培养基，37℃过夜培养；
(2)挑取单个菌落接种于含2mL LB的玻璃试管中，37℃220rpm培养过夜；
(3)次日将2mL菌液接种于250mL锥形瓶中，添加100mL LB液体培养基，37℃220rpm培养1.5-2h；
(4)定时监测菌液的OD600值(培养1小时后每半小时测定一次)；
(5)当OD600值达到0.4时，从摇床中取出摇瓶，置于冰上冷却15min；
(6)冰浴后的菌液转移至50mL离心管中，4℃4000g离心10min，弃上清；
(7)按每5mL菌液加入1mL已灭菌预冷的100mM CaCl2，吹打重悬菌体；
(8)冰浴30min后，4℃4000g离心10min，弃上清；
(9)每50mL菌液(锥形瓶培养的原菌液)加入1mL已灭菌预冷的15％甘油、100mMCaCl2，吹打重悬菌体；
(10)按50μL等份分装至1.5-2mL离心管中，于-80℃保存(如需要，可在液氮中速冻后保存于-80℃)。
B、引物设计与合成
1、siRNA引物设计：通过NCBI数据库查询非洲绿猴UAF1基因组序列(GeneBank：NW_023666063.1)，以及猪UAF1基因序列(GeneBank：NC_010455.5)，根据非洲绿猴UAF1基因和猪UAF1基因序列分别设计两条siRNA，siRNA引物序列见表1，SEQ ID NO:1-8。通过NCBI数据库查询非洲绿猴USP1基因组序列(GeneBank：NW_023666033.1)，以及猪USP1基因序列(GeneBank：NC_010448.4)，根据非洲绿猴USP1基因和猪USP1基因序列分别设计三条siRNA，siRNA引物序列见表2，SEQ ID NO:9-20。
表1 siRNA引物序列表
Figure BDA0003057195160000061
表2 siRNA引物序列表
Figure BDA0003057195160000062
2、Q-PCR扩增引物设计
通过NCBI数据库查询所要检测的基因mRNA序列，利用Primer7.0软件设计Q-PCR引物，见表3，SEQ ID NO:21-34。
表3 Q-PCR引物序表
Figure BDA0003057195160000063
C、CCK-8检测细胞毒性：
将MARC-145细胞以1×104个/孔接种于96孔板，当细胞密度达到80％时进行CCK-8检测。具体操作如下：当细胞密度达到80％时，弃去原培养基，用10％FBS的DMEM按0μM，1μM，3μM，10μM，20μM，30μM稀释化合物，每孔100μL，每个浓度重复18个孔。分别于6h，12h，24h，36h，48h，72h加入10μL的CCK-8检测试剂，放置于37℃二氧化碳培养箱反应2h。每个时间点各浓度重复检测3个样本，使用全波长酶标仪于450nm处检测吸光值。
D、真核表达质粒的构建
1、Nsp1β表达质粒PCR扩增引物设计
PRRSV-BJ4 Nsp1β基因PCR扩增引物序列见表4，SEQ ID NO:35-36(斜体为酶切位点，加粗为同源臂)。
表4 PCR扩增引物序列表
Figure BDA0003057195160000071
2、Nsp1β目的片段扩增
分别将引物加入适量的去离子水溶解为终浓度100μM，然后分别取上下游引物各20μL，加入160μL的去离子水稀释至20μM，命名为p-PRRSV-BJ4-Nsp1β-Flag-F/R混合引物。PCR扩增体系为(30μL)：H2O 8μL，PRRSV-BJ4-cDNA 5μL，p-PRRSV-BJ4-Nsp1β-Flag-F/R混合引物2μL，PrimerSTAR Max DNA Polymerase 15μL。
PCR扩增程序为：98℃3min；98℃30s，60℃30s，72℃1min 30s，35cycle；72℃10min，4℃hold。
3、载体质粒酶切与回收
质粒酶切体系为(50μL)：H2O 39μL，3×Flag-CMV-14质粒(1μg/μL)2μL，10×NEBBuffer 2 5μL，Xba I 2μL，EcoR I 2μL。
胶回收酶切产物：37℃酶切2h后，吸取12μL 6×DNA Loading Buffer加入酶切产物中，电泳完毕后在紫外灯下切取目的DNA片段并用胶回收试剂盒回收，存放于-20℃冰箱。
4、重组质粒的连接、转化及鉴定
目的片段与载体连接：将酶切的载体与目的片段通过同源重组试剂盒进行连接，连接体系为(20μL)：双酶切的载体胶回收片段6μL，胶回收的目的片段6μL，5×CE IIBuffer4μL，Exnase II 2μL，ddH2O 2μL；反应程序为：37℃30min，4℃Hold。
连接产物转化至E.coli Top10感受态细胞，涂板，在37℃培养箱过夜培养，每个平板挑取4个单菌落进行扩大培养并进行测序。
5、中提重组质粒并鉴定表达
将测序正确的菌液吸出200μL加入到300mL的含有100μg/mL Amp的液体LB培养基中，于37℃220rpm培养15h左右，之后利用质粒中提试剂盒提取，并定容到1μg/μL。
将HEK293T细胞按照1×106个/孔接种于12孔板中，共需要5个孔。待细胞密度达到70％进行转染。实验设计为3×Flag-CMV-14(空载)，p-PRRSV-BJ4-Nsp1β-Flag。PEI转染体系为：A液，质粒2μL，Opti-MEM 50μL；B液，PEI 4μL，Opti-MEM 50μL。
将B液配好螺旋轻柔吹打混匀，室温静置5min，同时配A液螺旋轻柔吹打混匀，5min后将A液螺旋加入B液中，螺旋轻柔吹打混匀，室温静置20min，静置结束后将混合液轻轻滴加到细胞培养基中，轻轻晃动12孔板，于37℃二氧化碳培养箱培养24h，之后进行WesternBlot检测鉴定质粒的表达情况。
E、流式检测：
将细胞以2.5×104个/孔接种于24孔板，具体操作步骤如下：细胞样品处理结束后，于48h弃去培养基，用PBS洗涤2遍，胰酶润洗1遍，37℃二氧化碳培养箱中消化5-6min后加入500μL 10％FBS的DMEM终止消化，将消化的细胞吹散至单个细胞后，转移至EP管中进行流式检测。以没有感染PRRSV-GFP的MARC-145细胞的为空白对照，数据利用Flowjo软件分析。
F、PPRSV TCID50测定：
1、病毒的扩增和收取
将MARC-145细胞按照1×105个/孔接种于12孔板，具体操作步骤如下：
(1)化合物预处理：当细胞密度达到40％时，弃去原培养基，用ML323按0μM，1μM，3μM，10μM各浓度预处理细胞4h；
(2)病毒接种：4h后弃去培养基，PBS清洗1遍后，以MOI＝10感染PRRSV-BJ4；
(3)换液：细胞感染PRRSV-BJ4 2h后弃去原培养基，PBS清洗2遍后加入维持培养基后继续培养48h；
(4)病毒收集：于-80℃反复冻融两次，融化的病毒于5000rpm离心5min，吸取上清液进行TCID50测定，或暂时保存于-80℃冰箱。
2、病毒TCID50的测定
MARC-145细胞以1×104个/孔接种于96孔板，当细胞密度达到80％时进行TCID50测定，方法如下：
(1)病毒液用纯的DMEM以10倍体积倍比稀释10-1-10-10倍后，加入细胞在37℃孵育1h；
(2)弃去病毒液，细胞换为2％FBS的DMEM维持培养基在37℃、5％CO2的环境下培养；
(3)每隔12h观察细胞病变情况，连续观察5天并记录每个稀释比例的病变孔数，通过Reed-Muench方法计算出TCID50。
G、Western Blot检测：
1、细胞总蛋白的收取
以12孔板的细胞收取蛋白为例，方法如下：
(1)弃去孔中原培养基，每孔加入100μL 2×SDS蛋白Loading Buffer，移液枪扎上枪头，沿着顺时针方向搅拌1-2min，待液体由粘稠变得顺滑，将其转移至1.5mL EP管中；
(2)95℃，敷育30min；
(3)30min后将样品取出离心震荡混匀，可于-20℃冰箱存放或进行下一步实验。
2、电泳及转膜
(1)SDS-PAGE凝胶电泳：向电泳槽中加入电泳缓冲液，于加样孔中加入10μL样品，电压120V待样品进入分离胶后调至160V，继续电泳40min；
(2)转膜：电泳结束后，电压110V，75min后将蛋白转移到PVDF膜上；
(3)封闭：PVDF膜浸入含5％脱脂奶粉的TBST中，室温封闭30min；
(4)洗膜：将5％脱脂奶粉的TBST回收-20℃冻存，TBS清洗1遍；
(5)孵育一抗：然后用含有2％脱脂奶粉的TBST稀释的单克隆抗体(1:1000稀释)，与PVDF膜室温40rpm孵育1h；
(6)洗膜：将2％脱脂奶粉的TBST稀释的单克隆抗体回收-20℃冻存，室温60rpm，TBST洗4次，5min每次，TBS洗2次，5min每次；
(7)孵育二抗：配置含有2％脱脂奶粉的TBST稀释的HRP标记的二抗(1:5000稀释)，与PVDF膜室温40rpm孵育1h；
(8)洗膜：将2％脱脂奶粉的TBST稀释的HRP标记的二抗回收-20℃冻存，室温60rpm，TBST洗4次，5min每次，TBS洗2次，5min每次；
(9)显影。
H、Q-PCR检测：
1、提取细胞总RNA
以12孔板的细胞收取RNA为例，方法如下：
(1)弃去原培养基，吸取500μL RNAiso Plus加入细胞中，裂解2min，用移液枪吹打20次，转移至新的进口1.5mL EP管中；
(2)每管加入100μL氯仿剧烈震荡10s，静置5min；
(3)12000rpm 4℃离心15min，用移液器缓慢地吸取200μL上层到提前标记的1.5mLEP管中，然后加入等体积的异丙醇，上下轻柔颠倒混匀沉淀，冰上静置10min；
(4)12000rpm 4℃离心15min后弃去上清，加入1mL 70％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀；
(5)12000rpm 4℃离心10min后弃去上清；
(6)加入的100μL DEPC水，室温溶解10min；
(7)震荡混匀，测定浓度定容至1μg/μL，进行反转录。
2、反转录合成cDNA
将提取的RNA进行反转录，具体的操作为：反应体系(20μL)：RNase-free H2O 11μL，5×Hiscript qRTSuper MIX 4μL，Total RNA 5μL；反应程序：50℃15min，85℃5s，4℃Hold；反应结束后，cDNA放置-80℃冰箱保存。
3、Q-PCR检测分析
Q-PCR扩增体系(11μL)：SYBR Green mix 5μL，上/下游引物(10μM)各0.5μL，cDNA5μL。
I、MARC-145-siRNA与PAM-Tang-siRNA细胞系构建与检测：
将MARC-145或PAM-Tang细胞按照1×106个/孔接种于6孔板中，在二氧化碳培养箱中培养12-18h，待细胞密度达到70％进行siRNA转染。实验设计分别为Negative Control(NC)、siRNA1、siRNA2、siRNA3。Lipofectamine 2000转染体系为：取3μL siRNA，取6μLLipofectamine 2000，加入到200μL Opti-MEM中，轻轻混匀，室温静置20min，静置结束后将混合液轻轻滴加到细胞培养基中，轻轻晃动6孔板，于37℃二氧化碳培养箱培养8-10h，之后弃去原培养基，换成10％FBS的DMEM继续培养36-48h，然后取一部分进行WB、Q-PCR检测鉴定siRNA的干扰效率，另外一部分细胞感染PRRSV-BJ4或者感染PRRSV-GFP，进行下一步验证。
J、Co-IP检测：
(1)细胞样品制备：转染方法同质粒鉴定方法，在二氧化碳培养箱中培养24h后进行收样；
(2)取出细胞，弃去培养基，PBS洗涤一次，加入1mL的PBS，用细胞刮刮下细胞，收集至1.5mL的EP管中；
(3)于4℃离心机1000g离心5min，弃上清，加入1mL的NP-40裂解液，用1mL枪头吹打20次，冰上静置裂解10min；
(4)超声破碎，超声5s间歇5s，共计超声3次；
(5)4℃离心机，12000g离心10min，小心的将上清转移至新的1.5mL的EP管中；
(6)取出50μL加入50μL的2×SDS Loading到新的1.5mL的EP管中，孵育器95℃变性10min，此管标记为Input；
(7)另取新的1.5mL的EP管，取900μL上清加入10μL的Flag beads，4℃翻转结合3h，取出后4℃9000g离心1min，小心的弃去上清；
(8)加入1mL的M2洗脱Buffer，颠倒混匀20次后，4℃离心机9000g离心30s，用真空泵小心吸去上清；此步骤重复操作3次；
(9)4℃离心机，9000g离心1min，用移液枪小心的弃干净上清，加入100μL的2×SDSLoading，95℃孵育器变性30min，此管标记为IP；
(10)将样品进行SDS PAGE凝胶电泳检测。
K、数据处理：
利用t-test对Q-PCR结果进行分析检验，根据t-test检验结果：P>0.05ns为两组数据差异不显著，P<0.05*为两组数据差异显著；P<0.001**为两组数据差极显著；P<0.0001***为两组数据差异非常显著；P<0.000 09****为两组数据差异极其显著。
三、实验结果与分析
1、抑制PRRSV-GFP小分子化合物的筛选
以PRRSV-GFP为模式病毒，将MARC-145细胞以1×105个/孔接种于12孔板中，先经化合物预处理4h后，以MOI＝10的PRRSV-GFP感染细胞1h，后换上细胞维持液，于48h收样进行流式检测，结果见图1，P>0.05ns，P<0.05*，P<0.0001***，P<0.00009****。
从图1可以看出，ML323以浓度依赖显著的抑制病毒的GFP荧光强度。
2、USP1抑制剂ML323对MARC-145细胞毒性的影响
通过CCK-8检测不同浓度的ML323对MARC-145细胞增殖活性的影响，结果见图2，P>0.05ns，P<0.001**，P<0.0001***。
从图2可以看出，在72h之内化合物ML323在1μM、3μM、10μM、20μM浓度下对MARC-145细胞的增殖均无影响。
3、ML323抑制PRRSV感染细胞具有浓度依赖性
(1)ML323抑制PRRSV感染MARC-145细胞具有浓度依赖性
通过Western Blot，Q-PCR检测，流式检测，TCID50测定等实验测定ML323抑制PRRSV在MARC-145细胞中的感染情况。取ML323在0μM、1μM、3μM、10μM浓度预处理MARC-145细胞4h，后弃去原培养基，PBS洗一遍，以MOI＝10的PRRSV病毒液稀释液，37℃二氧化碳培养箱吸附1h后换为维持培养基，于48h进行收样检测，结果见图3，P>0.05ns，P<0.05*，P<0.001**，P<0.0001***，P<0.00009****。
从图3可以看出，Western Blot结果显示ML323抑制细胞USP1、UAF1蛋白水平的表达，同时抑制PRRSV-BJ4病毒N蛋白的表达，并且随着化合物浓度的增加，抑制效果也逐渐显著；Q-PCR检测结果表明，随着化合物浓度的增加可以抑制USP1、UAF1的mRNA表达水平，同时抑制PRRSV-BJ4病毒ORF7的mRNA表达；TCID50测定表明随着化合物浓度的增加，有效的抑制了PRRSV-BJ4子代病毒粒子的形成；流式检测为：在48h利用荧光显微镜拍照观察细胞中GFP荧光强度，同时用流式细胞仪检测细胞中GFP荧光强度，检测结果表明MARC-145细胞中GFP荧光强度随着化合物浓度的增加显著降低，表明化合物ML323可以显著的抑制PRRSV-GFP在MARC-145细胞中增殖。
(2)ML323抑制PRRSV感染PAM-Tang细胞具有浓度依赖性
同上，检测ML323抑制PRRSV在PAM-Tang细胞中的感染情况，结果见图4，P>0.05ns，P<0.0001***，P<0.00009****。
从图4可以看出，Q-PCR检测结果表明，随着化合物浓度的增加抑制了USP1、UAF1的mRNA表达水平，同时抑制PRRSV-BJ4病毒ORF7的mRNA表达。
4、ML323抑制PRRSV感染细胞具有时间依赖性
(1)ML323抑制PRRSV感染MARC-145细胞具有时间依赖性
在化合物10μM浓度的处理条件下，通过Q-PCR测定ML323处理不同时间点对PRRSV感染细胞的情况，结果见图5，P>0.05ns，P<0.05*，P<0.001**，P<0.0001***。
从图5可以看出，ML323处理不同时间点均可抑制USP1、UAF1的mRNA表达水平，同时抑制PRRSV-BJ4病毒ORF7的mRNA表达。
(2)ML323抑制PRRSV感染PAM-Tang细胞具有时间依赖性
同上，通过Q-PCR检测ML323在浓度10μM处理条件下，对PRRSV在PAM-Tang细胞中的影响，结果见图6，P>0.05ns，P<0.05*，P<0.001**，P<0.0001***。
从图6可以看粗，随着化合物处理时间的延长逐渐加剧了抑制PRRSV-BJ4病毒ORF7的mRNA表达。
5、UAF1siRNA细胞系的构建以及对PRRSV感染细胞的影响
(1)MARC-145-UAF1siRNA细胞系的构建
为检测UAF1在PRRSV感染中的作用，设计两条针对UAF1的小干扰RNA(引物见表1)，瞬时转染MARC-145细胞48h后，通过Western Blot和Q-PCR检测siRNA的干扰效率，结果见图7，P>0.05ns，P<0.0001***，P<0.00009****。
从图7可以看出，设计的两条siRNA在蛋白水平和mRNA水平都有干扰作用，其中UAF1siRNA1的干扰效率更为显著。
(2)MARC-145-UAF1siRNA细胞系对PRRSV感染的影响
以上确定MARC-145-UAF1siRNA1的干扰效率后，将siRNA转染至MARC-145细胞，48h后感染PRRSV于37℃二氧化碳培养箱中吸附1h，后换上维持培养基于48h进行WesternBlot，Q-PCR检测，流式检测，TCID50测定等实验，结果见图8，P>0.05ns，P<0.05*，P<0.0001***，P<0.00009****。
从图8可以看出，Western Blot结果表明干扰UAF1的蛋白表达后，可以抑制PRRSV-BJ4病毒N蛋白的表达；Q-PCR检测结果表明干扰UAF1的mRNA表达后，PRRSV-BJ4病毒ORF7的mRNA表达也显著下调；TCID50测定表明瞬时转染siUAF1到MARC-145细胞后，有效的抑制了PRRSV-BJ4子代病毒粒子的形成；流式检测为：瞬时转染UAF1siRNA后，通过荧光显微镜拍照观察细胞中GFP荧光强度和用流式细胞仪检测细胞中GFP荧光强度，检测结果表明MARC-145-UAF1siRNA1细胞中GFP荧光强度显著低于对照组，表明干扰UAF1可以显著的抑制PRRSV-GFP在MARC-145细胞中的增殖。
(3)PAM-Tang-UAF1siRNA细胞系的构建
针对PAM-Tang细胞构建两条UAF1的小干扰RNA(引物见表1)，实验操作同MARC-145细胞一样，瞬时转染PAM-Tang细胞48h后通过Western Blot和Q-PCR检测siRNA的干扰效率，结果见图9，P>0.05ns，P<0.001**，P<0.0001***。
从图9可以看出，设计的两条siRNA在蛋白水平和mRNA都有干扰作用，其中UAF1siRNA2的干扰效率更显著。
(4)PAM-Tang-UAF1siRNA细胞系对PRRSV感染的影响
以上确定PAM-Tang-UAF1siRNA2的干扰效率后，瞬时转染UAF1siRNA2到PAM-Tang细胞中，48h后感染PRRSV在37℃二氧化碳培养箱中吸附1h，之后换上维持培养基于48h后进行检测，主要通过Western Blot，Q-PCR检测，结果见图10，P>0.05ns，P<0.00009****。
从图10可以看出，Western Blot结果表明干扰PAM-Tang细胞UAF1蛋白的表达后，抑制了PRRSV-BJ4病毒N蛋白的表达；Q-PCR检测结果表明干扰PAM-Tang细胞UAF1的mRNA表达后，抑制了PRRSV-BJ4病毒ORF7的mRNA表达。
6、USP1siRNA细胞系的构建以及对PRRSV感染细胞的影响
(1)MARC-145-USP1siRNA细胞系的构建
为检测USP1在PRRSV感染中的作用，设计三条针对USP1的小干扰RNA(引物见表2)，瞬时转染MARC-145细胞48h后通过Western Blot和Q-PCR检测siRNA的干扰效率，结果见图11，P>0.05ns，P<0.00009****。
从图11可以看出，设计的三条siRNA在蛋白水平和mRNA都有干扰作用，其中USP1siRNA3的干扰效率更加明显。
(2)MARC-145-USP1siRNA细胞系对PRRSV感染的影响
以上确定MARC-145-USP1siRNA3的干扰效率后，构建MARC-145-USP1siRNA细胞系后，感染PRRSV-BJ4于二氧化碳培养箱吸附1h，后换上维持培养基于48h进行Western Blot检测，Q-PCR检测和TCID50测定，结果见图12，P>0.05ns，P<0.05*，P<0.00009****。
从图12可以看出，Western Blot结果表明干扰MARC-145细胞USP1蛋白的表达后，可以显著抑制PRRSV-BJ4病毒N蛋白的表达；Q-PCR检测结果表明干扰MARC-145细胞USP1的mRNA表达后，PRRSV-BJ4 ORF7的mRNA水平也显著下调；TCID50测定表明瞬时转染USP1siRNA到MARC-145细胞后，有效的抑制了PRRSV-BJ4子代病毒粒子的形成。
(3)PAM-Tang-USP1siRNA细胞系的构建
针对PAM-Tang细胞构建三条针对USP1的小干扰RNA(引物见表2)，实验操作同MARC-145细胞一样，瞬时转染PAM-Tang细胞48h后通过Western Blot和Q-PCR检测siRNA的干扰效率，结果见图13，P>0.05ns，P<0.05*，P<0.0001***。
从图13可以看出，设计的三条siRNA在蛋白水平和mRNA都有干扰作用，其中USP1siRNA1的干扰效率更加显著。
(4)PAM-Tang-USP1siRNA细胞系对PRRSV感染的影响
以上确定PAM-Tang-USP1siRNA1的干扰效率后，构建PAM-Tang-USP1siRNA细胞，感染病毒操作同MARC-145-USP1siRNA细胞系对PRRSV感染的影响，进行Western Blot检测，Q-PCR检测，结果见图14，P>0.05ns，P<0.00009****。
从图14可以看出，Western Blot结果表明干扰PAM-Tang细胞USP1蛋白的表达后，同样显著抑制PRRSV-BJ4病毒N蛋白的表达；Q-PCR检测结果也表明干扰PAM-Tang细胞USP1的mRNA表达后，也显著下调PRRSV-BJ4病毒ORF7的mRNA水平。
7、过表达USP1细胞系的构建以及对PRRSV感染细胞的影响
(1)MARC-145过表达USP1细胞系的构建
为检测USP1在PRRSV感染中的作用，构建猴源的USP1过表达质粒，瞬时转染MARC-145细胞24h后通过Western Blot检测USP1过表达效率，结果见图15。
从图15可以看出，分别瞬时转染1μg、2μg的Chlo-3×Flag-CMV-USP1-14质粒后，用Flag单克隆抗体孵育，在110kDa处有特异性条带，同时孵育USP1抗体，可以看出过表达USP1后蛋白表达水平上调。表明过表达质粒构建表达成功，USP1过表达细胞系构建成功。
(2)在MARC-145细胞中过表达USP1对PRRSV感染的影响
瞬时转染2μg的Chlo-3×Flag-CMV-USP1-14质粒到MARC-145细胞24h后，感染PRRSV在37℃二氧化碳培养箱中吸附1h，之后换上维持培养基于48h进行检测，主要通过Western Blot，流式检测，TCID50测定等实验，结果见图16，P>0.05ns，P<0.05*，P<0.0001***。
从图16可以看出，Western Blot结果表明过表达MARC-145细胞中的USP1蛋白表达后，促进了PRRSV-BJ4病毒N蛋白的表达；TCID50测定表明过表达USP1到MARC-145细胞后，有效的促进了PRRSV-BJ4子代病毒粒子的形成；流式检测为：过表达USP1后利用荧光显微镜拍照观察细胞中GFP荧光强度，同时用流式细胞仪检测细胞中GFP荧光强度，检测结果表明MARC-145细胞中GFP荧光显著增多，说明过表达USP1可以显著的促进PRRSV在MARC-145细胞中的增殖。
(3)PAM-Tang过表达USP1细胞系的构建
同上，构建猪源的USP1过表达质粒，之后通过Western Blot检测USP1过表达效率，结果见图17。
从图17可以看出，猪源过表达质粒构建表达成功，USP1过表达细胞系构建成功。
(4)在PAM-Tang细胞中过表达USP1对PRRSV感染的影响
瞬时转染2μg的SUS-3×Flag-CMV-USP1-14质粒至PAM-Tang细胞中，感染PRRSV-BJ4于细胞培养箱中吸附1h，换上维持培养基48h后进行检测，主要通过Western Blot检测，结果见图18。
从图18可以看出，Western Blot结果表明PAM-Tang细胞USP1蛋白过表达后，促进了PRRSV-BJ4 N蛋白的表达。
8、ML323对PRRSV非结构蛋白Nsp1β的影响
(1)3×Flag-CMV-Nsp1β真核表达质粒的构建与鉴定
为探寻USP1在PRRSV感染细胞过程中的调节靶点，分别构建14个PRRSV-BJ4非结构蛋白的真核表达质粒，并进行表达鉴定。经鉴定发现ML323可以调节Nsp1β的表达。
琼脂糖凝胶电泳结果显示在687bp处有核酸条带，与预期的目的片段大小一致。将测序正确的质粒进行中提，同时瞬时转染HEK293T细胞，收取蛋白进行质粒表达鉴定，结果见图19，DNA Marker：2000bp。
从图19可以看出，Western blot结果显示Flag单克隆抗体敷育后于29kDa处有特异性条带，表明真核表达质粒3×Flag-CMV-Nsp1β构建并表达成功。
(2)Nsp1β蛋白主要结合的泛素类型
将3×Flag-CMV-Nsp1β质粒分别与PRK-HA(空载)、PRK-HA-WT-Ubi、PRK-HA-K48O-Ubi、PRK-HA-K63O-Ubi质粒共同转染KEK297T细胞，在37℃二氧化碳培养箱培养24h，Co-IP检测Nsp1β蛋白主要结合的泛素类型，结果见图20。
从图20可以看出，Nsp1β主要是K48泛素化类型的修饰。
(3)ML323对Nsp1β泛素化修饰的影响
3×Flag-CMV-Nsp1β质粒分别与PRK-HA-空载、PRK-HA-K48O-Ubi质粒共同转染KEK297T细胞8h后，一组用10μM的ML323处理，另外一组用DMSO处理做对照组，于24h后进行Co-IP检测，结果见图21。
从图21可以看出，ML323处理后Nsp1β的蛋白表达少于对照组，并且相比于对照组ML323处理后加剧了Nsp1β的K48泛素化修饰。
通过以上实验结果可以看出，本发明先在化合物库中筛选出ML323，分别在不同浓度和不同时间的处理条件下，通过Western blot、Q-PCR、流式检测、TCID50等方法，验证ML323对PRRSV在细胞感染中的作用，再分别针对USP1和UAF1设计siRNA且成功构建siUAF1、siUSP1的MARC-145细胞系和PAM-Tang细胞系，在此基础上感染PRRSV，验证下调USP1、UAF1的表达后对病毒感染的影响，同时构建USP1过表达细胞系，验证上调USP1的表达对PRRSV在细胞中增殖的影响；Co-IP实验发现PRRSV-BJ4非结构蛋白Nsp1β主要是K48泛素化类型修饰，用ML323处理后能够影响Nsp1β蛋白的泛素化。
本发明为PRRSV在感染细胞过程中泛素化修饰过程提供数据支撑，并为PRRS的防治以及控制PRRSV的感染提供了新的思路。ML323作为USP1-UAF1复合体的特异性抑制剂，同时又有抗病毒作用，可以作为新的廉价的小分子治疗药物。
序列表
<110> 河南农业大学
<120> USP1-UAF1抑制剂在制备药物中的应用，药物组合物
<141> 2021-05-10
<160> 36
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<213> Artificial Sequence
<400> 15
ggauuucaca gauucucaat t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
uugagaaucu gugaaaucct t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
gcaguuuaca guccuuaaut t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
auuaaggacu guaaacugct t 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
ggauuugaau cuccaggaat t 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
uuccuggaga uucaaaucct t 21
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
acacaactca tgcttgtgga tt 22
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
actggcacac tgatgtcctg ctg 23
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
gggtgagact gagtcgatgc 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
cggacttgga gcatgtcact 20
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
cgtggacatc cgtaaagac 19
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
ggaaggtgga cagcgaggc 19
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
tgggactgaa taatctcggc a 21
<210> 28
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
tcttctttgc aatttccatt tccct 25
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
gggtgagact gagtcgatgc 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
cggacttgga gcatgtcact 20
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
ctgaacccca aagccaaccg t 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
ttctccttga tgtcccgcac g 21
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
agatcatcgc ccaacaaaac 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
gacacaattg ccgctcacta 20
<210> 35
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
tgcggccgcg aattcggagc aactcacgtg ttgacc 36
<210> 36
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
ccgggatcct ctagagtacc acttgtgact gccaaa 36

Claims (5)

1.USP1-UAF1抑制剂在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述抗病毒药物为抗PRRSV感染药物；所述USP1-UAF1抑制剂为siRNA。
2.USP1-UAF1抑制剂在制备抗病毒药物中的应用，其特征在于：所述抗病毒药物为抗PRRSV感染药物；所述USP1-UAF1抑制剂为ML323。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述ML323抑制PRRSV在细胞中的感染或增殖。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述ML323抑制细胞USP1、UAF1蛋白的表达，降低USP1、UAF1 mRNA的表达水平。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述ML323抑制PRRSV N蛋白的表达，抑制PRRSV ORF7 mRNA的表达，抑制PRRSV子代病毒粒子的形成。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080167229A1 (en) * 2006-06-20 2008-07-10 Dana-Farber Cancer Institute Inhibitors of USP1 deubiquitinating enzyme complex
US20150344443A1 (en) * 2012-12-28 2015-12-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Inhibitors of the usp1/uaf1 deubiquitinase complex and uses thereof
CN110101705A (zh) * 2019-05-07 2019-08-09 河南农业大学 Bet家族蛋白抑制剂的抗病毒用途
CN111265521A (zh) * 2020-03-31 2020-06-12 吉林大学 小分子化合物sjb2-043作为抑制马立克氏病毒药物的新用途

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080167229A1 (en) * 2006-06-20 2008-07-10 Dana-Farber Cancer Institute Inhibitors of USP1 deubiquitinating enzyme complex
US20150344443A1 (en) * 2012-12-28 2015-12-03 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Inhibitors of the usp1/uaf1 deubiquitinase complex and uses thereof
CN110101705A (zh) * 2019-05-07 2019-08-09 河南农业大学 Bet家族蛋白抑制剂的抗病毒用途
CN111265521A (zh) * 2020-03-31 2020-06-12 吉林大学 小分子化合物sjb2-043作为抑制马立克氏病毒药物的新用途

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
TBK1在抗病毒固有免疫中的作用及其调控机制;赵伟 等;《中山大学学报（医学版）》;20200131;第41卷(第1期);第1-6页 *
The ubiquitin proteasome system is necessary for efficient proliferation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus;Pang Y et al;《Veterinary Microbiology》;20201208;第253卷;第108947页 *
USP1-UAF1 deubiquitinase complex stabilizes TBK1 and enhances antiviral responses;Yu Z et al;《The Journal of Experimental Medicine》;20171231;第214卷(第12期);第3553-3563页 *
泛素特异性蛋白酶在抗病毒感染免疫中的作用研究进展;朱惠惠 等;《浙江大学学报(医学版)》;20150930(第05期);第578-583页 *
自噬相关去泛素化酶及其小分子抑制剂的研究进展;朱凤 等;《生物化学与生物物理进展》;20201231;第47卷(第3期);第210-223页 *

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