CN111748530B - 一种提高猪繁殖与呼吸综合征病毒体外培养感染量的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提供一种提高猪繁殖与呼吸综合征病毒体外培养感染量的方法及其应用，在MARC‑145细胞或PAMs体外培养PRRSV过程中添加胰蛋白酶或弹性蛋白酶，所述胰蛋白酶的浓度为100μg/mL～200μg/mL；弹性蛋白酶的浓度为0.5mg/mL～1mg/mL。与未加蛋白酶和添加其他蛋白酶处理组相比，添加有胰蛋白酶或弹性蛋白酶处理组PRRSV RNA含量、蛋白表达和病毒滴度明显升高。本发明提供的PRRSV感染细胞信息丰富了PRRSV增殖机制，为后续研究PRRSV致病机理提供了参考，本发明提供的方法可应用于PRRS疫苗生产。

Description

一种提高猪繁殖与呼吸综合征病毒体外培养感染量的方法及 其应用
技术领域
本发明涉及一种提高猪繁殖与呼吸综合征病毒体外培养感染量的方法及其应用，属于病毒学和细胞生物学领域。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus，PRRSV)感染引起的，以妊娠母猪发生严重繁殖障碍以及各年龄阶段猪发生呼吸系统疾病为主要特征的病毒性传染病。该病于1987年最早发生在美国，此后相继在各主要养猪国家发生，现已呈世界性分布。PRRS对全球尤其是我国养猪业危害巨大，严重制约了生猪产业健康发展。PRRSV是具有囊膜的单股正链RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arteriviridae)动脉炎病毒属(Porartevirus)。2006年，我国大面积爆发和流行了由高致病性PRRSV(highly pathogenicPRRSV，HP-PRRSV)引起的“高热综合征”，对国内养猪业造成了前所未有的打击。
目前，PRRS尚无特效药，免疫接种是主要的防治措施，目前商品化PRRS疫苗仍是传统的弱毒疫苗和灭活疫苗。就疫苗本身而言，高滴度的病毒是疫苗产生良好免疫效果的前提，而体外培养却难以获得高滴度的PRRSV，如靠大量培养，再通过浓缩的方法获得高滴度的PRRSV，不仅费时费力，而且成本较高。因此，如何在体外培养获得高滴度的PRRSV，已成为制约PRRS疫苗生产的瓶颈。猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages，PAMs)、非洲绿猴肾上皮细胞MARC-145等可对PRRSV进行体外培养，用于病毒灭活疫苗和弱毒疫苗生产。因此，为提高PRRSV体外培养感染量进行疫苗生产，仍需进一步探索、优化病毒体外培养方法。
发明内容
针对现有方法的不足，本发明的目的是提供一种提高PRRSV体外培养感染量的方法及其应用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种提高猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV体外培养感染量的方法，在MARC-145细胞或PAMs体外培养PRRSV过程中添加胰蛋白酶或弹性蛋白酶。
所述胰蛋白酶的浓度为100μg/mL～200μg/mL；弹性蛋白酶的浓度为0.5mg/mL～1mg/mL。
所述提高PRRSV体外培养感染量的方法，具体步骤为：
(1)将MARC-145细胞按5×104个/mL铺设24孔细胞培养板，每孔加入500μL的DMEM培养基，于37℃CO2培养箱中培养12h；
(2)更换新的DMEM培养基，以病毒感染复数为1的高致病性PRRSVHN07-1毒株于4℃孵育MARC-145细胞1h；弃细胞上清，用PBS缓冲液洗细胞三次，洗去未结合细胞的病毒粒子；
(3)向细胞培养板孔中分别加入无细胞毒性的胰蛋白酶或弹性蛋白酶，室温处理15min；弃细胞上清，用PBS缓冲液洗细胞三次，向细胞培养板孔中加入500μL的DMEM培养基，37℃培养12h或48h。
所述提高PRRSV体外培养感染量的方法，具体步骤为：
(1)将PAMs按2×105个/mL铺设24孔细胞培养板，每孔加入500μL的RPMI1640培养基，于37℃CO2培养箱中培养12h；
(2)更换新的RPMI 1640培养基，以病毒感染复数为1的高致病性PRRSV HN07-1毒株于4℃孵育PAMs 1h；弃细胞上清，用PBS缓冲液洗细胞三次，洗去未结合细胞的病毒粒子；
(3)向细胞培养板孔中分别加入无细胞毒性的胰蛋白酶或弹性蛋白酶，室温处理15min；弃细胞上清，用PBS缓冲液洗细胞三次，向细胞培养板孔中加入500μL的RPMI 1640培养基，37℃培养12h。
所述DMEM培养基含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。
所述RPMI 1640培养基含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。
所述提高PRRSV体外培养感染量的方法在提高病毒RNA含量中的应用。
所述提高PRRSV体外培养感染量的方法在提高病毒蛋白表达含量中的应用。
所述提高PRRSV体外培养感染量的方法在提高病毒滴度中的应用。
所述提高PRRSV体外培养感染量的方法在其疫苗生产中的应用。
本发明有益效果：
本发明综合利用病毒学和细胞生物学等技术，提供了一种提高PRRSV体外培养感染量的方法。首先对常见商品化蛋白酶的细胞毒性进行检测；通过荧光定量PCR(RT-PCR)对无细胞毒性的商品化蛋白酶进行筛选，鉴定出可以显著提高PRRSV体外培养RNA含量的蛋白酶；再分别通过免疫印迹法(IB)和病毒滴度实验(TCID50)进一步确定显著提高PRRSV体外培养病毒蛋白表达和滴度的蛋白酶。
利用本发明所述的方法能够显著提高病毒感染量，在MARC-145细胞或PAMs体外培养PRRSV过程中添加100μg/mL～200μg/mL胰蛋白酶或0.5mg/mL～1mg/mL弹性蛋白酶，与未加蛋白酶和添加其他蛋白酶处理组相比，添加有胰蛋白酶或弹性蛋白酶处理组PRRSV RNA含量、蛋白表达和病毒滴度明显升高。
本发明提供的PRRSV感染细胞信息丰富了PRRSV增殖机制，为后续研究PRRSV致病机理提供了参考，本发明提供的方法可应用于PRRS疫苗生产。
附图说明
图1是不同商品化蛋白酶对MARC-145细胞毒性；
图中，ns表示无显著差异，*表示p<0.05，**表示p<0.01；
图2是MARC-145细胞培养PRRSV RNA含量；
图中，ns表示无显著差异，**表示p<0.01；
图3是MARC-145细胞培养PRRSV病毒蛋白含量；
图中，β-微管蛋白(β-actin)为细胞内参；
图4是MARC-145细胞培养PRRSV病毒滴度；
图中，ns表示无显著差异，*表示p<0.05；
图5是MARC-145细胞培养PRRSV感染量的蛋白酶剂量依赖性；
图中，ns表示无显著差异，*表示p<0.05，**表示p<0.01；
图6是PAMs培养PRRSV RNA相对含量；
图中，ns表示无显著差异，*表示p<0.05，**表示p<0.01。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1.不同商品化蛋白酶对MARC-145细胞毒性鉴定
将MARC-145细胞按5×104个/mL铺设96孔细胞培养板，每孔加入100μL含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素(美国Gibco公司)的DMEM培养基(北京索莱宝科技有限公司，货号12100)，于37℃CO2培养箱中培养12h；去除原有细胞培养液，换为无血清DMEM培养基并分别向MARC-145细胞中加入不同浓度常见的商品化蛋白酶：嗜热菌蛋白酶(美国Sigma公司，货号P1512；10、50、100、150、200、250、300μg/mL)，中性蛋白酶(德国Roche公司，货号1276921；10、50、100、150、200、250、300μg/mL)，胶原蛋白酶(美国Sigma公司，货号C-5183；10、50、100、150、200、250、300μg/mL)，胰凝乳蛋白酶(美国Sigma公司，货号C-3142；0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5mg/mL)，木瓜蛋白酶(美国Worthington公司，货号53J6521；10、50、100、150、200、250、300μg/mL)，蛋白酶K(日本Wako公司，货号169-21041；1、2、4、8、10、15、20μg/mL)，胰蛋白酶(美国Sigma公司，货号T-8802；10、50、100、150、200、250、300μg/mL)，弹性蛋白酶(美国Sigma公司，货号E-0258；0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5mg/mL)，室温处理15min后，加入20μL美国Promega公司CellTiter 96 AQueous One Solution试剂(货号G3582)于37℃CO2培养箱中培养3-4h；按照操作说明进行细胞毒性鉴定。
结果如图1所示，与未加蛋白酶处理组(0)细胞活性相比(细胞活性为100％)，当处理组中：嗜热菌蛋白酶≤150μg/mL、分离蛋白酶≤100μg/mL、胶原蛋白酶≤150μg/mL、胰凝乳蛋白酶≤1mg/mL、木瓜蛋白酶≤150μg/mL、蛋白酶K≤8μg/mL、胰蛋白酶≤200μg/mL、弹性蛋白酶≤1mg/mL时，细胞活性无明显差异，即无细胞毒性，可用于后续实施例。
实施例2.不同商品化蛋白酶对MARC-145细胞培养PRRSV RNA含量影响
将MARC-145细胞按5×104个/mL铺设24孔细胞培养板，每孔加入500μL含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基，于37℃CO2培养箱中培养12h；更换新的DMEM培养基，以病毒感染复数(MOI)为1的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)HN07-1毒株(GenBank编号KX766378.1)于4℃孵育MARC-145细胞1h；弃细胞上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞三次，洗去未结合细胞的病毒粒子；向细胞培养板孔中分别加入无细胞毒性的150μg/mL嗜热菌蛋白酶、100μg/mL中性蛋白酶、150μg/mL胶原蛋白酶、1mg/mL胰凝乳蛋白酶、150μg/mL木瓜蛋白酶、8μg/mL蛋白酶K、200μg/mL胰蛋白酶、1mg/mL弹性蛋白酶，室温处理15min；弃细胞上清，用PBS洗细胞三次，细胞培养板孔中加入500μL DMEM培养基，37℃培养12h。收集细胞，弃细胞上清，用PBS洗细胞三次；使用RNA提取试剂TRIzol(美国ThermoFisher Scientific公司)提取PRRSV感染细胞的总RNA，使用PrimeScriptTM反转录试剂盒(大连TaKaRa公司)生成互补DNA(cDNA)作为RT-PCR模板；因PRRSV ORF7基因常被用于代表病毒总RNA含量，以本实验室保存的已知浓度pMD-18T-ORF7质粒作为标准，10倍倍比稀释作为模板做标准曲线，计算出PCR检测出的Ct值与模板拷贝数的关系；采用绝对RT-PCR对PRRSV ORF7 RNA含量进行测定，以代表感染细胞内的病毒RNA含量，拷贝数根据标准曲线计算得出；引物和反应体系见表1和表2，反应程序使用ABI荧光定量PCR仪自带Fast测序(美国Applied Biosystems公司)。
表1荧光定量PCR引物序列
表2荧光定量PCR反应体系
该实验独立进行三次，每次三个重复，实验数据以组平均值和标准差(SD)表示；统计学分析利用GraphPad软件双向方差分析(ANOVA)进行；ns为无显著差异，**p<0.01为有显著统计学差异。
结果如图2显示，与未加蛋白酶和添加其他蛋白酶处理组相比，添加有200μg/mL胰蛋白酶和1mg/mL弹性蛋白酶处理组PRRSV RNA含量明显升高(与未加蛋白酶处理组相比，胰蛋白酶处理组升高至2.3倍，弹性蛋白酶处理组升高至2.5倍)，说明胰蛋白酶和弹性蛋白酶能够提高MARC-145细胞培养PRRSV RNA含量。
实施例3.胰蛋白酶和弹性蛋白酶对MARC-145细胞培养PRRSV病毒蛋白表达影响
为了验证胰蛋白酶和弹性蛋白酶对MARC-145细胞培养PRRSV病毒蛋白表达影响，按实施例2培养MARC-145细胞；更换新的DMEM培养基，以病毒感染复数(MOI)为1的HP-PRRSVHN07-1毒株于4℃孵育MARC-145细胞1h；弃细胞上清，用PBS洗细胞三次，洗去未结合细胞的病毒粒子；向细胞培养板孔中分别加入150μg/mL胶原蛋白酶、200μg/mL胰蛋白酶、1mg/mL弹性蛋白酶，室温处理15min；弃细胞上清，用PBS洗细胞三次，细胞培养板孔中加入500μLDMEM培养基，37℃培养12h。去除细胞培养液，用细胞刮收集细胞后，以3000g的离心力离心5min；用PBS重悬后再离心，PBS清洗两次；弃掉PBS，加入100μL细胞裂解液(上海碧云天生物技术有限公司，货号P0013B)获取全细胞裂解液(whole cell lysate，WCL)；以13000g的离心力、4℃离心15min，获取WCL上清液；以相同含量β-微管蛋白(β-actin)为标准调节上样量；加入5×蛋白上样缓冲液，沸水煮样5min后短暂离心；分别配制15％分离胶、5％浓缩胶，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)；按15V(电压)、1h(转膜时间)条件转移蛋白样品至聚偏二氟乙烯膜(PVDF，美国Merck Millipore公司)；用含5％(v/v)脱脂奶的磷酸盐吐温-20缓冲液(PBST)封闭，37℃、30min；分别以本实验室制备的鼠抗HP-PRRSV核衣壳蛋白(N)和美国CST公司鼠抗β-微管蛋白(货号5125S)作为一抗，37℃孵育1h；PBST洗涤3次，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠抗体(英国Abcam公司，货号ab6789)作为二抗，37℃孵育30min；PBST洗涤3次，使用增强型化学发光试剂(苏州NCM公司，货号P0013B)分别对HP-PRRSV N蛋白和β-微管蛋白的蛋白水平进行IB显色。
结果如图3显示，在β-微管蛋白含量相同的条件下(条带粗细程度均一)，与未加蛋白酶和添加胶原蛋白酶处理组相比，添加有胰蛋白酶和弹性蛋白酶处理组PRRSV N蛋白含量明显升高(条带增粗，与未加蛋白酶处理组相比，胰蛋白酶处理组升高至5.0倍，弹性蛋白酶处理组升高至5.7倍)，说明胰蛋白酶和弹性蛋白酶能够提高MARC-145细胞培养PRRSV病毒蛋白含量，证实了胰蛋白酶和弹性蛋白酶能够提高MARC-145细胞培养PRRSV感染量。
实施例4.胰蛋白酶和弹性蛋白酶对MARC-145细胞培养PRRSV病毒滴度影响
为了进一步证实胰蛋白酶和弹性蛋白酶提高MARC-145细胞培养PRRSV感染量，按实施例2培养MARC-145细胞；更换新的DMEM培养基，以病毒感染复数(MOI)为1的HP-PRRSV毒株HN07-1于4℃孵育MARC-145细胞1h；弃细胞上清，用PBS洗细胞三次，洗去未结合细胞的病毒粒子；向细胞培养板孔中分别加入150μg/mL胶原蛋白酶、200μg/mL胰蛋白酶、1mg/mL弹性蛋白酶，室温处理15min；弃细胞上清，用PBS洗细胞三次，细胞培养板孔中加入500μL DMEM培养基，37℃培养48h进行病毒滴度实验(TCID50)。将未感染的MARC-145细胞稀释至5×104个/mL铺设96孔细胞培养板，每孔加入100μL DMEM培养基，置于37℃、5％CO2培养箱培养过夜；取上述感染48h的MARC-145细胞上清液进行10倍倍比稀释，接种已铺设96孔细胞培养板的MARC-145细胞，每孔接种100μL，每个稀释度做8个重复，另以DMEM培养基代替感染细胞上清液作对照；将96孔细胞培养板放于37℃、5％CO2培养箱培养；每24h观察一次细胞的生长状态，并记录细胞病变孔数，观察5-7d，直至细胞病变孔数不再增加；用Reed-Muench法计算病毒的TCID50；实验数据以组平均值和标准差(SD)表示，统计学分析利用GraphPad软件双向方差分析(ANOVA)进行，ns为无显著差异，*p<0.05为有统计学差异。
结果如图4所示，与未加蛋白酶和添加胶原蛋白酶处理组相比，添加有胰蛋白酶和弹性蛋白酶处理组PRRSV病毒滴度明显升高，说明胰蛋白酶和弹性蛋白酶能够提高MARC-145细胞培养PRRSV病毒滴度(与未加蛋白酶处理组相比，胰蛋白酶处理组提高至8.2倍，弹性蛋白酶处理组提高至9.8倍)，再次证实了胰蛋白酶和弹性蛋白酶能够提高MARC-145细胞培养PRRSV感染量。
实施例5.胰蛋白酶和弹性蛋白酶剂量对MARC-145细胞培养PRRSV感染量的影响
按实施例2培养MARC-145细胞；更换新的DMEM培养基，以病毒感染复数(MOI)为1的HP-PRRSV HN07-1毒株于4℃孵育MARC-145细胞1h；弃细胞上清，用PBS洗细胞三次，洗去未结合细胞的病毒粒子；细胞培养板孔中分别加入50、100、150μg/mL胶原蛋白酶，50、100、200μg/mL胰蛋白酶，0.25、0.5、1mg/mL弹性蛋白酶，室温处理15min；弃细胞上清，用PBS洗细胞三次，细胞培养板孔中加入500μL DMEM培养基，37℃培养12h或48h。按实施例2和4方法，分别对不同剂量胰蛋白酶和弹性蛋白酶对MARC-145细胞培养PRRSV RNA含量和病毒滴度进行检测。
结果如图5所示，与未加蛋白酶(0)和添加胶原蛋白酶处理组相比，添加有100μg/mL、200μg/mL胰蛋白酶和0.5mg/mL、1mg/mL弹性蛋白酶处理组PRRSV RNA含量和病毒滴度均明显升高，说明胰蛋白酶和弹性蛋白酶能够提高MARC-145细胞培养PRRSV RNA含量和病毒滴度(与未加蛋白酶处理组相比，胰蛋白酶处理组RNA含量分别提高至1.8倍、2.3倍，病毒滴度分别提高至4.1倍、8.2倍；弹性蛋白酶处理组RNA含量分别提高至1.7倍、2.5倍，病毒滴度分别提高至4.8倍、9.8倍)，证实了100μg/mL～200μg/mL胰蛋白酶和0.5mg/mL～1mg/mL弹性蛋白酶能够提高MARC-145细胞培养PRRSV感染量。
实施例6.胰蛋白酶和弹性蛋白酶对PAMs培养PRRSV RNA含量影响
PAMs为PRRSV感染猪体内主要的靶细胞。为验证胰蛋白酶和弹性蛋白酶是否也能提高PAMs培养PRRSV感染量，对蛋白酶处理后PRRSV RNA含量进行检测。
将PAMs按2×105个/mL铺设24孔细胞培养板，每孔加入500μL含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基(北京索莱宝科技有限公司，货号31800)，于37℃CO2培养箱中培养12h；更换新的RPMI 1640培养基，以MOI为1的HP-PRRSV HN07-1毒株于4℃孵育PAMs 1h；弃细胞上清，用PBS缓冲液洗细胞三次，洗去未结合细胞的病毒粒子；细胞培养板孔中分别加入150μg/mL胶原蛋白酶、200μg/mL胰蛋白酶、1mg/mL弹性蛋白酶，室温处理15min；弃细胞上清，用PBS洗细胞三次，细胞培养板孔中加入500μLRPMI 1640培养基，37℃培养12h。
收集上述细胞，用PBS洗细胞三次；使用RNA提取试剂TRIzol提取细胞总RNA，使用PrimeScriptTM反转录试剂盒生成cDNA作为RT-PCR模板；采用相对RT-PCR对PRRSV ORF7 RNA含量进行测定，以代表感染细胞的病毒RNA含量；以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为细胞内参，用GAPDH mRNA对病毒RNA进行标准化，并通过2-△△CT方法进行相对定量；引物和反应体系见表3和表4，反应程序使用ABI荧光定量PCR仪自带Fast测序。
表3相对荧光定量PCR引物序列
表4相对荧光定量PCR反应体系
该实验独立进行三次，每次三个重复，实验数据以组平均值和标准差(SD)表示。统计学分析利用GraphPad软件双向方差分析(ANOVA)进行。ns为无显著差异，*p<0.05为有统计学差异，**p<0.01为有显著统计学差异。
结果如图6显示，与未加蛋白酶和胶原蛋白酶处理组相比，添加有200μg/mL胰蛋白酶和1mg/mL弹性蛋白酶处理组PRRSV RNA相对含量明显升高(与未加蛋白酶处理组相比，胰蛋白酶处理组升高至1.4倍，弹性蛋白酶处理组升高至2.2倍)，说明胰蛋白酶和弹性蛋白酶能够提高PAMs培养PRRSV RNA含量，证实了胰蛋白酶和弹性蛋白酶能够提高PAMs培养PRRSV感染量。
序列表
<110> 河南省农业科学院
<120> 一种提高猪繁殖与呼吸综合征病毒体外培养感染量的方法及其应用
<130> PCR检测
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 1
aaaccagtcc agaggcaagg 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工合成()
<400> 2
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<210> 3
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<213> 人工合成()
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Claims (9)

1.一种提高猪繁殖与呼吸综合征病毒PRRSV体外培养感染量的方法，其特征在于，在MARC-145细胞或PAMs体外培养PRRSV过程中添加胰蛋白酶或弹性蛋白酶；
所述胰蛋白酶的浓度为100μg/mL～200μg/mL；弹性蛋白酶的浓度为0.5mg/mL～1mg/mL。
2.如权利要求1所述提高PRRSV体外培养感染量的方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)将MARC-145细胞按5×104个/mL铺设24孔细胞培养板，每孔加入500μL的DMEM培养基，于37℃CO 2培养箱中培养12h；
(2)更换新的DMEM培养基，以病毒感染复数为1的高致病性PRRSV HN07-1毒株于4℃孵育MARC-145细胞1h；弃细胞上清，用PBS缓冲液洗细胞三次，洗去未结合细胞的病毒粒子；
(3)向细胞培养板孔中分别加入无细胞毒性的胰蛋白酶或弹性蛋白酶，室温处理15min；弃细胞上清，用PBS缓冲液洗细胞三次，向细胞培养板孔中加入500μL的DMEM培养基，37℃培养12h或48h。
3.如权利要求1任一项所述提高PRRSV体外培养感染量的方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)将PAMs按2×105个/mL铺设24孔细胞培养板，每孔加入500μL的RPMI 1640培养基，于37℃CO2培养箱中培养12h；
(2)更换新的RPMI 1640培养基，以病毒感染复数为1的高致病性PRRSV HN07-1毒株于4℃孵育PAMs 1h；弃细胞上清，用PBS缓冲液洗细胞三次，洗去未结合细胞的病毒粒子；
(3)向细胞培养板孔中分别加入无细胞毒性的胰蛋白酶或弹性蛋白酶，室温处理15min；弃细胞上清，用PBS缓冲液洗细胞三次，向细胞培养板孔中加入500μL的RPMI 1640培养基，37℃培养12h。
4.如权利要求2所述提高PRRSV体外培养感染量的方法，其特征在于，所述DMEM培养基含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。
5.如权利要求3所述提高PRRSV体外培养感染量的方法，其特征在于，所述RPMI 1640培养基含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。
6.一种如权利要求1所述提高PRRSV体外培养感染量的方法在提高猪繁殖与呼吸综合征病毒RNA含量中的应用。
7.一种如权利要求1所述提高PRRSV体外培养感染量的方法在提高猪繁殖与呼吸综合征病毒蛋白表达含量中的应用。
8.一种如权利要求1所述提高PRRSV体外培养感染量的方法在提高猪繁殖与呼吸综合征病毒滴度中的应用。
9.一种如权利要求1所述提高PRRSV体外培养感染量的方法在猪繁殖与呼吸综合征疫苗生产中的应用。
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