CN112933066B - 抑制剂kn-93抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染的方法及应用 - Google Patents

抑制剂kn-93抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN‑93抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染的方法及应用，所述抑制剂KN‑93可用于制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的抗病毒药物。本发明在MARC‑145细胞或PAMs体外感染PRRSV过程中添加浓度为50μmol/L的KN‑93，与未加KN‑93处理组相比，添加有KN‑93处理组PRRSV的RNA含量和病毒滴度明显降低，可用于抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的体外感染。

Description

抑制剂KN-93抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染的方法及应用
技术领域
本发明涉及一种钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN-93抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染中的应用，属于细胞生物学、病毒学技术领域。
背景技术
猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)，俗称“猪蓝耳病”，是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRS virus，PRRSV)感染引起的猪传染疫病，以母猪发热、厌食、早期流产、死胎、木乃伊胎、产弱仔等繁殖障碍及各年龄阶段猪呼吸道疾病为主要特征。同时，PRRSV感染后可引起免疫抑制，进而导致猪继发多种病原的感染。PRRS对全球尤其是我国生猪产业造成了巨大的经济损失。
PRRSV是具有囊膜的单股正链RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)动脉炎病毒科(Arteriviridae)动脉炎病毒属(Porartevirus)，主要感染猪肺泡巨噬细胞(porcinealveolar macrophages，PAMs)、非洲绿猴肾上皮细胞MARC-145等。目前，临床上尚无抗PRRSV感染特效药，PRRS防控主要使用灭活疫苗和弱毒疫苗进行免疫，其中弱毒疫苗在临床上使用较多。然而，灭活疫苗具有如下缺陷：(1)需要大剂量接种或应用浓缩抗原，免疫期短，常需强化接种；(2)不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；(3)产生完全免疫力需要2-3周，不利于紧急预防接种与降低疫苗费用；(4)存在灭活不彻底和散毒的可能；弱毒疫苗存在毒力返强、重组、潜在感染的危险及无交叉保护力等。这些均阻碍了对PRRS的有效防控和传播，因此亟需研发PRRSV抗病毒药物。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN-93抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染的方法及应用。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN-93在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染中的应用。
所述的抑制剂KN-93在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染的RNA含量中的应用。
所述的抑制剂KN-93在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染的病毒滴度中的应用。
所述的抑制剂KN-93在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的抗病毒药物中的应用。
所述抑制剂KN-93的浓度为50μmol/L。
一种钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN-93抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染的方法，具体步骤为：
(1)将MARC-145细胞按2.5×105个/mL铺设24孔细胞培养板，每孔加入500μL DMEM培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养12h；
(2)更换新的DMEM培养基，以病毒感染复数为1的PRRSV-2BJ-4毒株于37℃孵育MARC-145细胞3h；弃细胞上清，用PBS缓冲液洗细胞三次，洗去未侵入细胞的病毒粒子；
(3)向细胞培养板孔中加入含50μmol/LKN-93的500μLDMEM培养基，于37℃继续培养9h或45h。
所述DMEM培养基含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。
一种钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN-93抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染的方法，具体步骤为：
(1)将CRL2843-CD163细胞按2.5×105个/mL铺设24孔细胞培养板，每孔加入500μLRPMI 1640培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养12h；
(2)更换新的RPMI 1640培养基，以病毒感染复数为1的PRRSV-2BJ-4毒株于37℃孵育CRL2843-CD163细胞3h；弃细胞上清，用PBS缓冲液洗细胞三次，洗去未侵入细胞的病毒粒子；
(3)向细胞培养板孔中加入含50μmol/LKN-93的500μLRPMI 1640培养基，37℃继续培养9h。
所述RPMI 1640培养基含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。
本发明有益效果：
本发明综合利用细胞生物学和病毒学等技术，发现了钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN-93具有抑制PRRSV体外感染的作用。首先对商品化钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN-93的细胞毒性进行检测，并通过荧光定量PCR(RT-qPCR)、病毒滴度实验(TCID50)等对无细胞毒性的KN-93进行抑制PRRSV体外感染效果的鉴定，发现其可以显著抑制PRRSV体外感染过程中RNA含量和病毒滴度。
利用本发明所述的方法能够显著抑制PRRSV体外感染量，在MARC-145细胞或PAMs细胞系CRL2843-CD163感染PRRSV过程中添加50μmol/L KN-93，与未加抑制剂处理组相比，添加有KN-93处理组PRRSV RNA含量和病毒滴度明显降低。
本发明提供的钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN-93还可应用于制备抗PRRSV感染的抗病毒药物的研发。
附图说明
图1是KN-93对MARC-145细胞毒性的柱状图；
图2是MARC-145细胞感染PRRSV RNA相对含量的柱状图；
图3是MARC-145细胞感染PRRSV病毒滴度的柱状图；
图4是CRL2843-CD163细胞感染PRRSV RNA相对含量的柱状图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1.KN-93对MARC-145细胞毒性鉴定
将MARC-145细胞按2.5×105个/mL铺设96孔细胞培养板，每孔加入100μL含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素(美国Gibco公司)的DMEM培养基(北京索莱宝科技有限公司，货号12100)，于37℃、5％CO2培养箱中培养12h；去除原有细胞培养液，换为含不同浓度KN-93(英国Abcam公司，货号ab120980；0、10、20、50μmol/L)的DMEM培养基于37℃孵育48h后，加入20μL美国Promega公司CellTiter 96AQueous One Solution试剂(货号G3582)于37℃、5％CO2培养箱中培养2h；按照操作说明进行细胞毒性鉴定。统计学分析利用GraphPad软件非配对、双尾Student t检验进行；ns为无显著差异。
结果如图1所示，与未加KN-93处理组(0μmol/L)细胞活性(细胞活性为100％)相比，加入10、20、50μmol/L KN-93对细胞活性无明显影响(ns)，即无细胞毒性，可用于后续实施例。
实施例2.KN-93对MARC-145细胞感染PRRSV RNA含量影响
将MARC-145细胞按2.5×105个/mL铺设24孔细胞培养板，每孔加入500μL含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养12h；更换新的DMEM培养基，以病毒感染复数(MOI)为1的PRRSV-2BJ-4毒株(GenBank编号AF331831)于37℃感染MARC-145细胞3h；弃细胞上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞三次，洗去未侵入细胞的病毒粒子；向细胞培养板孔中加入含50μmol/L KN-93的500μLDMEM培养基，于37℃继续培养9h。收集细胞，弃细胞上清，用PBS洗细胞三次；使用RNA提取试剂TRIzol(美国Thermo Fisher Scientific公司)提取PRRSV感染细胞的总RNA，使用PrimeScriptTM反转录试剂盒(大连TaKaRa公司)生成互补DNA(cDNA)作为RT-qPCR模板；采用相对RT-qPCR对PRRSV ORF7 RNA含量进行测定，以代表感染细胞的病毒RNA含量；以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为细胞内参，用GAPDH mRNA对病毒RNA进行标准化，并通过2-ΔΔCT方法进行相对定量；引物和反应体系见表1、表2和表3，反应程序使用ABI荧光定量PCR仪自带Fast程序(美国Applied Biosystems公司)。
表1相对荧光定量PCR引物序列
引物名称 序列(5’-3’)
PRRSV-ORF7正向引物 AAACCAGTCCAGAGGCAAGG(SEQ ID NO.1)
PRRSV-ORF7反向引物 GCAAACTAAACTCCACAGTGTAA(SEQ ID NO.2)
GAPDH正向引物 CCTTCCGTGTCCCTACTGCCAAC(SEQ ID NO.3)
GAPDH反向引物 GACGCCTGCTTCACCACCTTCT(SEQ ID NO.4)
表2相对荧光定量PCR反应体系(1)
Figure BDA0002954609800000041
表3相对荧光定量PCR反应体系(2)
Figure BDA0002954609800000042
该实验独立进行三次，每次三个重复，实验数据以组平均值和标准差(SD)表示；统计学分析利用GraphPad软件非配对、双尾Student t检验进行；**p<0.01为具有显著统计学差异。
结果如图2显示，与未加KN-93(0μmol/L)处理组相比，添加有50μmol/L KN-93处理组PRRSV RNA含量明显降低(降低了约60％)，说明KN-93能够降低MARC-145细胞感染PRRSVRNA含量。
实施例3.KN-93对MARC-145细胞感染PRRSV病毒滴度影响
为了进一步证实KN-93抑制MARC-145细胞感染PRRSV感染量，按实施例2培养MARC-145细胞；更换新的DMEM培养基，以病毒感染复数(MOI)为1的PRRSV-2BJ-4毒株于37℃感染MARC-145细胞3h；弃细胞上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞三次，洗去未侵入细胞的病毒粒子；向细胞培养板孔中加入含50μmol/L KN-93的500μLDMEM培养基，于37℃继续培养45h进行病毒滴度实验(TCID50)：将未感染的MARC-145细胞稀释至2.5×105个/mL铺设96孔细胞培养板，每孔加入100μLDMEM培养基，置于37℃、5％CO2培养箱培养过夜；取上述感染48h的MARC-145细胞上清液进行10倍倍比稀释，接种已铺设96孔细胞培养板的MARC-145细胞，每孔接种100μL，每个稀释度做8个重复，另以DMEM培养基代替感染细胞上清液作对照；将96孔细胞培养板放于37℃、5％CO2培养箱培养；每24h观察一次细胞的生长状态，并记录细胞病变孔数，观察5-7d，直至细胞病变孔数不再增加；用Reed-Muench法计算病毒的TCID50；实验数据以组平均值和标准差(SD)表示，统计学分析利用GraphPad软件非配对、双尾Student t检验进行；***p<0.001为具有极显著统计学差异。
结果如图3所示，与未加KN-93(0μmol/L)处理组相比，添加有50μmol/L KN-93处理组PRRSV病毒滴度明显降低(降低的病毒滴度>3log10TCID50/mL，即1000倍)，说明KN-93能够显著降低MARC-145细胞感染PRRSV病毒滴度，再次证实了KN-93能够降低MARC-145细胞感染PRRSV感染量。
实施例4.KN-93对PAMs感染PRRSV RNA含量影响
PAMs为PRRSV感染猪体内主要的靶细胞。为验证KN-93是否也能降低PAMs培养PRRSV感染量，对KN-93处理后PRRSV RNA含量进行检测。
将PAMs细胞系CRL2843-CD163按2.5×105个/mL铺设24孔细胞培养板，每孔加入500μL含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI 1640培养基(北京索莱宝科技有限公司，货号31800)，于37℃、5％CO2培养箱中培养12h；更换新的RPMI1640培养基，以MOI为1的PRRSV-2BJ-4毒株于37℃感染CRL2843-CD163细胞3h；弃细胞上清，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞三次，洗去未侵入细胞的病毒粒子；向细胞培养板孔中加入含50μmol/L KN-93的500μL RPMI 1640培养基，于37℃继续培养9h。收集细胞，弃细胞上清，用PBS洗细胞三次；使用RNA提取试剂TRIzol(美国Thermo Fisher Scientific公司)提取PRRSV感染细胞的总RNA，使用PrimeScriptTM反转录试剂盒(大连TaKaRa公司)生成互补DNA(cDNA)作为RT-qPCR模板；采用相对RT-qPCR对PRRSV ORF7RNA含量进行测定，以代表感染细胞的病毒RNA含量；以3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为细胞内参，用GAPDH mRNA对病毒RNA进行标准化，并通过2-ΔΔCT方法进行相对定量；引物和反应体系见表1、表2和表3，反应程序使用ABI荧光定量PCR仪自带Fast程序(美国Applied Biosystems公司)。
该实验独立进行三次，每次三个重复，实验数据以组平均值和标准差(SD)表示；统计学分析利用GraphPad软件非配对、双尾Student t检验进行；****,p＜0.0001，为具有极显著统计学差异。
结果如图4显示，与未加KN-93(0μmol/L)处理组相比，添加有50μmol/LKN-93处理组PRRSV RNA含量明显降低(降低了约90％)，说明KN-93能够降低PAMs感染PRRSV RNA含量。
序列表
<110> 河南省农业科学院
<120> 抑制剂KN-93抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染的方法及应用
<130> PCR扩增
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
aaaccagtcc agaggcaagg 20
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gcaaactaaa ctccacagtg taa 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ccttccgtgt ccctactgcc aac 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
gacgcctgct tcaccacctt ct 22

Claims (8)

1.一种钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN-93在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的抑制剂KN-93在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的RNA含量的药物中的应用。
3.如权利要求1所述的抑制剂KN-93在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒感染的病毒滴度的药物中的应用。
4.如权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，抑制剂KN-93的浓度为50μmol/L。
5.一种钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN-93抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染的方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)将MARC-145细胞按2.5×105个/mL铺设24孔细胞培养板，每孔加入500μL DMEM培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养12h；
(2)更换新的DMEM培养基，以病毒感染复数为1的PRRSV-2BJ-4毒株于37℃孵育MARC-145细胞3h；弃细胞上清，用PBS缓冲液洗细胞三次，洗去未侵入细胞的病毒粒子；
(3)向细胞培养板孔中加入含50μmol/L KN-93的500μL DMEM培养基，于37℃继续培养9h或45h。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述DMEM培养基含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。
7.一种钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂KN-93抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒体外感染的方法，其特征在于，具体步骤为：
(1)将CRL2843-CD163细胞按2.5×105个/mL铺设24孔细胞培养板，每孔加入500μLRPMI1640培养基，于37℃、5％CO2培养箱中培养12h；
(2)更换新的RPMI 1640培养基，以病毒感染复数为1的PRRSV-2BJ-4毒株于37℃孵育CRL2843-CD163细胞3h；弃细胞上清，用PBS缓冲液洗细胞三次，洗去未侵入细胞的病毒粒子；
(3)向细胞培养板孔中加入含50μmol/LKN-93的500μL RPMI 1640培养基，37℃继续培养9h。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述RPMI 1640培养基含10％(v/v)热灭活胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素。
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