CN110551721B - 一种抑制血清四型禽腺病毒复制的长链非编码rna及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抑制4型禽腺病毒（FAdV‑4）复制的长链非编码RNA及其应用。所述lncRNA为lncRNA‑LYGL；所述lncRNA‑LYGL的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。敲低试验表明，当敲低鸡肝癌细胞（LMH细胞）中本发明所述的lncRNA‑LYGL后，FAdV‑4的复制水平较未敲低LMH细胞中的lncRNA‑LYGL的对照组有显著的升高，即本发明中所提供的lncRNA‑LYGL具有抑制FAdV‑4病毒复制的作用。本发明中所提供的lncRNA‑LYGL序列，合成以后可用于进一步制备出具有抑制FAdV‑4病毒复制的药物，用于心包积液综合症的预防或治疗。

Description

一种抑制血清四型禽腺病毒复制的长链非编码RNA及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种抑制4型禽腺病毒（FAdV-4）复制的长链非编码RNA及其应用。
背景技术
禽腺病毒（Fowl adenovirus, FAdV）是一种全世界范围内流行的家禽和野禽常见的传染病病原。I亚群禽腺病毒分为A、B、C、D、E 5个种，12个血清型，其中8b型禽腺病毒（Fowl avianadenovirus serotype 8b, FAdV-8b）主要引起包涵体肝炎（Inclusion bodyhepatitis, IBH），4型禽腺病毒（Fowl avianadenovirus serotype 4, FAdV-4）主要是以鸡包涵体肝炎和心包内出现淡黄色透明液体为主要临床症状的鸡急性传染病，临床上又称为“鸡心包积水综合症（Hydropericardium- hepatitis syndrome, HHS）”。该病发病急，传播速度快，主要引起4~8周龄肉鸡感染，死亡率可达30%~70% 。该病最早于巴基斯坦的安卡拉被报道，由此又称为“安卡拉病”。2006年该病第一次在中国被报道（张希兵，2006），自2014年秋季后，我国HHS的病例逐渐增加，尤其是在山东省的肉杂鸡（817肉鸡）、柴鸡、商品蛋鸡等鸡群迅速蔓延。2015年6月之后，该病在中国大面积的爆发流行，给养禽业造成了巨大的经济损失， 成为危害养禽业的重要传染病之一。
长链非编码RNA（Long non-coding RNA, lncRNA）是一类不具有蛋白质编码潜能的转录本，属于非编码RNA（Noncoding RNA, ncRNA）中重要的一类。lncRNA是长度大于200bp的ncRNA，这是lncRNA区别于其他ncRNA的一个主要特征，已经发现的lncRNA数量在20000到100000之间。与mRNA相似，lncRNA的转录是由RNA依赖的RNA聚合酶II或者RNA聚合酶Ⅲ介导的，常含有5’端帽子和3’端polyA尾，加工成熟的lncRNA可定位在细胞核或细胞质中。近年来的研究表明，虽然lncRNA不具有编码蛋白质的功能，但是LncRNA参与了各种不同的生物学过程并在其中发挥着重要作用。
病毒已经进化出多种策略逃避抗病毒免疫系统并提高复制效率，病毒的这些策略中有一些是通过诱导细胞的lncRNA分子发挥作用。同样，细胞也可以表达多种抵抗病毒感染的lncRNA。越来越多的研究表明，lncRNA在宿主抗病毒反应中起到至关重要的作用，是病毒感染期间宿主免疫反应的关键调节因子。目前仍然没有宿主lncRNA抑制FAdV-4繁殖的研究进展。因此研究一种具有抑制FAdV-4病毒复制功能的宿主lncRNA，对于防治鸡心包积水综合症具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的研究空白等问题，本发明的目的在于提供一种能有效抑制FAdV-4病毒复制的lncRNA。
本发明另一目的在于提供所述上述抑制FAdV-4病毒复制的lncRNA在制备预防或治疗FAdV-4药物中的应用。
为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种抑制FAdV-4病毒复制的长链非编码RNA（lncRNA），所述lncRNA为lncRNA-LYGL；所述lncRNA-LYGL的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
进一步的，所述lncRNA-LYGL采用以下方法获得：按照Ambion公司的FirstChoiceRLM-RACE kit说明书要求，通过5’ RACE获取lncRNA-LYGL的5’全长，3’RACE获取lncRNA-LYGL的3’全长，获得完整的lncRNA-LYGL序列。
进一步的，当进行敲低lncRNA-LYGL时，用于敲低lncRNA-LYGL的siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
本发明还提供了一种上述长链非编码RNAlncRNA-LYGL的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1） 样品选取1 μg总RNA采用反转录试剂盒对各组的总RNA进行反转录，每20 μl体系中加入1 μg总RNA；反转录程序为：37℃、15min，85℃、10s；
（2） 将得到的cDNA作为荧光定量PCR模板，荧光定量PCR的上游引物如SEQ ID NO.3所示；荧光定量PCR的下游引物如SEQ ID NO. 4所示，采用SYBR-Green荧光定量试剂盒进行荧光定量检测。
本发明还提供了一种所述的长链非编码RNAlncRNA-LYGL在制备抗FAdV-4病毒药物中的应用。
进一步的，所述应用为用于心包积液综合症的预防或治疗药物。
本发明的有益效果为：
（1）敲低试验表明，当敲低鸡肝癌细胞（LMH细胞）中本发明所述的lncRNA-LYGL后，FAdV-4的复制水平较未敲低LMH细胞中的lncRNA-LYGL的对照组有显著的升高，即本发明中所提供的lncRNA-LYGL具有抑制FAdV-4病毒复制的作用。
（2）本发明中所提供的lncRNA-LYGL序列，合成以后可用于进一步制备出具有抑制FAdV-4病毒复制的药物，用于心包积液综合症的预防或治疗。
附图说明
图1为FAdV-4感染组与空白对照组中lncRNA-LYGL表达量的高通量测序结果；
图2为荧光定量PCR验证lncRNA-LYGL的差异表达；
图3为荧光定量PCR检测靶向lncRNA-LYGL的siRNA在LMH细胞中的敲低效率，阴性对照siRNA，内参为β-actin；
图4为荧光定量PCR检测LMH细胞中lncRNA-LYGL敲低与阴性对照组相比FAdV-4的复制水平，内参为β-actin。
具体实施方式
下面结合具体实例进一步对本发明的技术方案进行清楚、详细地描述。本次所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行替换或修改，但这些替换和修改均落入本发明的保护范围内。
实施例1
一种抑制FAdV-4病毒复制的lncRNA-lncRNA-LYGL，其中lncRNA-LYGL的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
lncRNA-LYGL 获取方法为：按照Ambion公司的FirstChoice RLM-RACE kit说明书要求，通过5’ RACE获取lncRNA-LYGL的5’全长，3’RACE获取lncRNA-LYGL的3’全长，获得完整的lncRNA-LYGL序列。
在本发明中，当鸡感染FAdV-4后，鸡体内lncRNA-LYGL的表达量显著上升；利用siRNA技术敲低lncRNA-LYGL后发现，在同样感染了FAdV-4的鸡体内，病毒的表达量显著高于未敲低lncRNA-LYGL的鸡，即lncRNA-LYGL能够抑制FAdV-4病毒的复制。
本发明中用于敲低lncRNA-LYGL的siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
效果实施例
（一）本发明采用高通量测序方法对FAdV-4感染组与空白对照组中lncRNA-LYGL表达量进行检测。
FAdV-4 SDJN0105毒株由本实验室保存，取60日龄的SPF鸡，将FAdV-4 SDJN0105毒株以肌肉注射的方式感染SPF鸡（106 TCID50/bird, 0.2 mL），空白对照组的SPF鸡注射相同剂量的无菌PBS。SPF鸡感染48小时后无菌取出肝脏，采用Trizol提取法（Trizol提取试剂购自Thermo Fisher Scientific公司）提取样品的总RNA。
通过NanoDrop ND-1000浓度测定，每样品选取1~2 μg总RNA进行RNA测序文库的构建，具体流程如下，总RNA样品经oligo dT富集（rRNA去除）处理后再选用KAPA StrandedRNA-Seq Library Prep Kit （Illumina）构建文库，文库构建流程中双链cDNA合成使用dUTP方法结合后续高保真PCR聚合酶作用，使得最终生成的RNA测序文库具有链特异性。构建好的文库通过Agilent 2100 Bioanalyzer 鉴定文库质量，并用qPCR方法进行文库定量。混合好的不同样品文库使用Illumina HiSeq 4000测序仪进行测序，包括NaOH碱变性单链生成，Illumina flow cell原位扩增，150双端循环测序步骤。
利用Solexa pipeline version 1.8（Off-Line Base Caller software,version 1.8）软件进行图像处理和碱基识别。FastQC软件对去街头后的reads进行测序质量评估（采用cutadapt去3’和5’接头）。通过Hisat2软件比对到参考基因组。使用StringTie软件参考官方数据库注释信息进行转录丰度估计。使用R软件Ballgown进行基因水平和转录本水平的FPKM计算，并分别计算基因水平和转录本水平表达差异情况，筛选出组间差异表达基因。FPKM是每百万fragments中来自某一基因每千碱基长度的fragments数目。
检测结果：图1为FAdV-4感染组与Mock组相比lncRNA-LYGL的FPKM值差异倍数。差异表达分析结果如图1所示，本发明提供的抑制FAdV-4病毒的lncRNA-LYGL在病毒感染后表达量有显著升高（与对照组相比上调110倍），表明FAdV-4感染与lncRNA-LYGL之间存在一定的相关性，当FAdV-4感染机体后lncRNA-LYGL相应的升高，可在抗FAdV-4病毒免疫反应中发挥作用。
（二）本发明采用实时荧光定量PCR（RT-PCR）对lncRNA-LYGL在被FAdV-4病毒感染后的表达水平进行检测。
按照上述步骤制备感染组与Mock组的总RNA。
每样品选取1 μg总RNA采用反转录试剂盒PrimeScriptTM RT Master Mix（大连宝生物工程有限公司）对各组的总RNA进行反转录，每20 μl体系中加入1 μg总RNA；反转录程序为：37℃、15min，85℃、10s。
将得到的cDNA作为荧光定量PCR模板，荧光定量PCR的上游引物为：5’-TTTAATGCAGGTTGACAAACGG-3’；荧光定量PCR的下游引物为：5’-ATGTCTGTGCCTTGTTTTATGTG-3’。采用SYBR-Green荧光定量试剂盒进行荧光定量检测，反应体系和反应程序按照说明书进行。
RT-PCR检测结果如图2所示，感染组中lncRNA-LYGL的表达量为对照组的24倍，图示数据为三次独立实验的平均值。本次试验表明，FAdV-4感染SPF鸡后，本发明中所述的lncRNA表达量显著升高。
（三）为了验证lncRNA-LYGL在FAdV-4病毒复制中具有抑制作用，本发明采用siRNA技术敲低lncRNA-LYGL的表达。
1、用于敲低lncRNA-LYGL在鸡肝癌细胞（LMH）中表达的siRNA序列为：5’-CATGGGACAGTGAAGAGCACATAAA-3’，取120 μl DEPC水溶解siRNA，制成浓度为20 μM的siRNA溶液。
2、取250 μl 的Opti-MEN培养基和5 μl 的siRNA溶液混合，得到混合液A；取250 μl 的Opti-MEN培养基和5 μl 的Lipofectamine-2000 Reagent混合，静置5 min，得到混合液B。将A和B混合成混合液C，孵育15 min。
3、用Opti-MEN培养基清洗预先铺在六孔板中的LMH细胞，当LMH细胞密度达到50%左右时，将孵育后的混合液C加入各孔中，再加入1.5 ml Opti-MEN培养基。37℃、5%CO2条件下培养24 h，收集细胞。同时设置阴性对照组。
4、提取各孔中收集的细胞总RNA，反转录后用实时荧光定量PCR检测LMH细胞中lncRNA-LYGL的表达水平。
5、取步骤3收集的LMH细胞，将FAdV-4病毒液按照100 TCID50接种到细胞中，空白对照孔不接病毒。37℃、5%CO2条件下培养24 h，弃去培养基，收集细胞。用实时荧光定量PCR检测FAdV-4病毒的表达量，以β-actin为内参计算FAdV-4 Hexon基因mRNA的相对表达量。其中，FAdV-4病毒的荧光定量PCR上下游引物分别为：上游引物：5’-GTCTATACCAACACGAGCACC-3’；下游引物：5’-TTTTGTACCCGTCGCAGAG-3’。
检测结果：如图3所示，以阴性对照组中lncRNA-LYGL的表达量为1，lncRNA-LYGL敲低组中lncRNA-LYGL的相对于阴性对照组的表达量为0.46，图示为三次独立试验的平均值。
检测结果：如图4所示，FAdV-4毒株感染后，lncRNA-LYGL敲低组与对照组相比，FAdV-4的复制水平有显著升高，表明lncRNA-LYGL具有抑制FAdV-4病毒复制的功能，图示为三次独立试验的平均值。
核苷酸序列表
<110>山东省农业科学院家禽研究所
<120>一种抑制血清四型禽腺病毒复制的长链非编码RNA及其应用
<160>4
<210>1
<211>1342
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>1
ATAACACACG CACATCTCAA GCAAATGCCC AGAGACAGTG GGGAGTCATC CTGCAGCAAA 60
CATGTCAGGC TGTTCTAATT TCTATGGGAA CATAGCAAAT GTTGAAACAA CTGGTGCATC 120
ACAGAGAACT GCGAAGCCGG AAGGTCTGAG CTATGCAGGA GTTGCGGCTT CAGAGAAGAT 180
TGCTGAAAGA GATTTGAAGA ATATGGACAA ATATAAAGAA ACTATTACAA AAGTGGCCAA 240
CAGCAAGTGC ATTCCACCAT CTTTGGTTGC TGCTGTTATC TCTCGAGAGT CACACGCTGG 300
GACGGCACTG AAGGATGGCT GGGGTGACCA CGGTAATGCA TTTGGTTTAA TGCAGGTTGA 360
CAAACGGTAC CATAAACCTC ATGGGGCATG GGACAGTGAA GAGCACATAA AACAAGGCAC 420
AGACATTTTG TGTCAGTCAA TAACCGATAT TCAGAAAAAA TTCCCAACAT GGAGTAAGGA 480
ACAGCAGCTC AAAGGTGGTA TTTCAGCCTA TAATGCAGGA ACAAGAAATG TCCGGACCTA 540
TGAAGGAATG GATGTTGGCA CAACACACGA CGACTATGCC AACGATGTGG TTGCAAGAGC 600
CAAGTTCTTT CAGAGAAATG GATACTGAGA AGGATATGAG TGATTATACA ATACTTACAG 660
CAAATACTTT TACATTACCA AAATTGCAAA TCGTTAGTCA GTAGGTGATT TTGTTACCAA 720
TTTTGTACTG CTGTTAGACA CATGCACTGA TTAATAAAAT CTAAAGTTGC CCCTGTTAAA 780
CAGCATTATG ACTCTTCCCT GCAGCAATAA ATTGCTGTCT GAGAAACAAC AAGCAGAGAT 840
GAAAACTGCT TGAATCTTTT TGTGAAGTGA AAAAAAATGG CAAAAGATAG GTTACAGATT 900
GGGTTATTAG CTATCTTTTA TTTATTCTTT TTCACCTTAG CAGAGCAAAT CACTGAAGGC 960
AAACACGAGT ATTTGCAATA TACTGTATAC TTATATGTAT ACAAAAGTAC TGAATACTTC 1020
TCATCTACTA CAAGAGTGTA TCTCAGTGTG TCACTCCCTC TTAGATTTAT TGCTCTATTA 1080
TCAAACACAT ACCTAAGCAT TTGGAGAGCC TTAGCTTCAG AGCTGTTGGT TTGAATCAGC 1140
CATTTCAAGA CAAAGAGGAG AAAAGAAAGA AGTTTAGAGT AGTAGAGTAG ACTAAAAGTA 1200
GTAGTAGAGT AGACTAAAAG GAAAATAGCA AGCGTATCAC TAGGAGCTAC AAAAGATAAT 1260
GAATACTGTG GGAGTTTTTC AACCATGCAT TTTTATAGCT ATATTACAGA TATTTTACAT 1320
CTGTCAATTA AAATATCCTT AG 1342
<210>2
<211>25
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>2
CATGGGACAG TGAAGAGCAC ATAAA 25
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>3
TTTAATGCAG GTTGACAAAC GG 22
<210>4
<211>23
<212>DNA
<213>人工合成
<220>
<223>
<400>4
ATGTCTGTGC CTTGTTTTAT GTG 23

Claims (4)

1.一种抑制FAdV-4病毒复制的长链非编码RNA，其特征在于，所述lncRNA为lncRNA-LYGL；所述lncRNA-LYGL的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一种如权利要求1所述的长链非编码RNAlncRNA-LYGL的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）样品选取1 μg总RNA采用反转录试剂盒对各组的总RNA进行反转录，每20 μl体系中加入1 μg总RNA；反转录程序为：37℃、15min，85℃、10s；
（2）将得到的cDNA作为荧光定量PCR模板，荧光定量PCR的上游引物如SEQ ID NO. 3所示；荧光定量PCR的下游引物如SEQ ID NO. 4所示，采用SYBR-Green荧光定量试剂盒进行荧光定量检测。
3.一种如权利要求1所述的长链非编码RNAlncRNA-LYGL在制备抗FAdV-4病毒药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为用于鸡心包积液综合症的预防或治疗的药物。
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