CN110840908B

CN110840908B - lncRNA NONSUST0067151在抑制乙脑病毒增殖中的应用

Info

Publication number: CN110840908B
Application number: CN201910989522.1A
Authority: CN
Inventors: 周晓龙; 杜程涛; 汪涵; 杨松柏; 李向臣; 赵阿勇
Original assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Current assignee: Zhejiang A&F University ZAFU
Priority date: 2019-10-17
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2039-10-17
Also published as: CN110840908A

Abstract

lncRNA NONSUST006715.1在抑制乙脑病毒增殖中的应用，属于生物技术领域。本申请公开了lncRNA NONSUST006715.1在抑制乙脑病毒增殖中的应用。本发明提出了一种具有抑制JEV增殖功能的宿主lncRNA，对于防治乙脑病具有重要意义。

Description

lncRNA NONSUST0067151在抑制乙脑病毒增殖中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及lncRNA NONSUST006715.1在抑制乙脑病毒增殖中的应用。

背景技术

流行性乙型脑炎是由乙脑病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的蚊媒性人畜共患病，主要在亚洲和环太平洋各国发生。猪是JEV最主要的自然增殖和越冬宿主，在“猪-蚊-人”传播中扮演着十分重要的角色，在我国感染猪群的JEV主要是以I和III基因型的形式存在。对于养猪业来说，目前流行性乙脑病毒仍是影响猪繁殖力的重要因素之一，猪不分品种和性别均易感，以每年的7～9月份发生感染较多，感染率高，发病率20%～30%。由于感染JEV会导致妊娠母猪流产，产出死胎、弱胎和木乃伊胎；染病公猪发生睾丸炎、睾丸缩小、变硬甚至丧失产精功能，最终失去配种繁殖的能力而被淘汰；仔猪也会因JEV引发的脑炎病死，从而影响猪群数量的扩大，造成巨大的经济损失，因此严重影响养猪业的发展。由于大量使用疫苗和传统兽药在一定程度上对机体的抗病力和环境产生不利影响，所以寻求抗病毒的分子试剂对于防治JEV具有非常重要的理论和实践意义。

JEV是一种急性传染病毒，属于黄病毒科黄病毒属。病毒基因组为单股正链RNA，全长11 kb，自5′至3′依次为结构蛋白C、E、M及非结构蛋白NS1～NS5，病毒RNA在宿主细胞的胞浆内直接作为mRNA翻译出结构蛋白和非结构蛋白，并在胞浆粗面内质网装配成熟，最终出芽释放。目前关于JEV入侵宿主细胞的分子机制已有了较系统的研究。在小鼠和大鼠神经元细胞中，科学家研究发现JEV进入细胞主要依赖于发动蛋白（dynamin）和膜穴样凹陷介导的胞吞作用，但在C6/36、Vero、PK15等细胞中JEV的入侵是网格状蛋白依赖的。Yang等研究发现网格状蛋白介导的胞吞途径在JEV入侵PK15细胞过程中发挥关键作用。Zhou等研究发现在BHK21细胞中网格状蛋白介导了JEV颗粒内吞进入细胞的过程，之后经囊泡Rab5蛋白传递运输至循环囊泡Rab11，最后将病毒传递给溶酶体，该研究首次报道了JEV感染BHK21细胞经过囊泡运输至溶酶体的分子细节。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度大于200核苷酸的非编码RNA，起初被认为是基因组转录的“噪音”，不具有生物学功能。近些年国内外学者对lncRNA的关注度日益增高，研究表明，lncRNA在转录水平调控、染色体修饰、表观遗传调控和核内运输等生命活动中发挥重要作用。lncRNA作为一种功能多样性的非编码RNA近些年也在抗病育种相关研究中受到广泛关注。越来越多的证据表明，病毒感染后宿主lncRNA的转录也随之发生较大变化，多项研究都证明lncRNA可在病毒感染引起的宿主反应和天然免疫等过程中发挥重要作用。

本发明在JEV病毒感染猪PK15细胞后通过lncRNA和mRNA转录组测序和lncRNA相关实验，筛选到一条可以显著抑制乙脑病毒增殖的猪lncRNA NONSUST006715.1，以期进一步通过CRISPR-dCas9-VPR等转录激活技术在动物体内持续表达抗病毒基因来培养抗病毒猪新品系。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种lncRNANONSUST006715.1在抑制乙脑病毒增殖中的应用的技术方案。

本发明通过以下技术方案实现：

所述的lncRNA NONSUST006715.1在抑制乙脑病毒增殖中的应用。

所述的lncRNA NONSUST006715.1在制备抑制乙脑病毒增殖药物中的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明提出了一种具有抑制JEV增殖功能的宿主lncRNA，对于防治乙脑病具有重要意义。

附图说明

图1 为差异表达lncRNA和mRNA转录本的分析。 A，差异表达的lncRNA和mRNA转录本统计。B，差异表达的lncRNA火山图。C，差异表达的lncRNA聚类分析。D，差异表达的mRNA聚类分析。

图2 为反义核酸AOS敲减lncRNA NONSUST006715.1的荧光定量RCR结果。A，荧光定量PCR检测不同的反义核酸转染后目的lncRNA表达水平差异。B,荧光定量PCR检测ASO1转染后不同时间目的lncRNA的敲减效果。

图3为免疫荧光和western blot实验检测JEV病毒蛋白表达水平的结果，A敲减lncRNA NONSUST006715.1对乙脑病毒结构蛋白E的影响，B 敲减lncRNA NONSUST006715.1对乙脑病毒非结构蛋白NS3的影响。

图4为荧光定量PCR 检测lncRNA NONSUST006715.1表达水平和western blot实验检测JEV病毒非结构蛋白NS3的结果。A不同抑制剂处理后荧光定量PCR 检测lncRNANONSUST006715.1表达水平， B 不同抑制剂处理后western blot实验检测JEV病毒非结构蛋白NS3的表达水平。

具体实施方式

下面结合具体实例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例

1 细胞培养

本实施例使用BHK21和PK15等细胞系进行相关实验研究。用DMEM F12 (GIBCO) 培养基培养， 10% FCS及100 μg/ml双抗，其他细胞系均用DMEM basic (GIBCO) 培养基10%FBS及100 μg/ml双抗置于37 ℃、5% CO₂的二氧化碳细胞培养箱中进行培养。

2 实时定量PCR

使用Primer Premier 5.0对NONCODE数据库获取的lncRNA的转录本序列设计扩增引物，以猪的GAPDH基因作为内参基因。引物信息见表1。通过TRIZOL法提取总RNA，利用反转录试剂盒反转录为cDNA。用所设计的lncRNA扩增引物进行lncRNA的实时荧光定量PCR反应。反应体系20 μL：SYBR Premix 10 μL,上、下游引物各0.4 μL,Rox 0.4 μL,模板2 μL，ddH₂O6.8 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，40个循环。熔解曲线分析：95 ℃ 5 s，然后以0.5 ℃/5 s的速度从65 ℃升到95 ℃。最终采用2-ΔΔCt方法，计算lncRNA不同感染时间的表达情况。

表1

3 免疫荧光

将培养在盖玻片上的细胞在PBS中清洗3次，然后加入含4 %多聚甲醛的PBS中室温固定30 min或4℃过夜；用PBS清洗3次，洗去多余的多聚甲醛，每次5 min，100%甲醇- 20℃处理10 min，PBS洗2遍后，每次5 min，然后用含有（0.3% tritonx-100，1% BSA）的PBS封闭1-2 h，用封闭液稀释一抗，然后取适量滴在细胞上，然后贴上比盖玻片略小的封口膜防止干涸，放入湿盒中4℃孵育过夜，然后PBS洗3次每次5 min，用相应的二抗孵育45 min-1 h，PBS洗3次每次5 min，DAPI染色15 min检测DNA，将盖玻片细胞面盖向Vectashield液滴中。然后用荧光显微镜或共聚焦显微镜拍照。

4 蛋白质免疫印记

将细胞用预冷的PBS洗2-3遍后，加入RIPA裂解液（含1 mM PMSF）然后将细胞收集置于1.5 ml的EP管中冰上裂解30 min，每5 min漩涡震荡15 s 以使细胞充分裂解，最后 4℃，12000 rpm离心10 min，收集上清，吸取10 µl通过BCA法测定蛋白浓度，其余蛋白溶液分装于PCR管中并置于-20℃保存。聚丙烯酰胺胶的配制：根据需要按比例配制分离胶，加入TEMED后小心摇动凝胶溶液混匀避免产生气泡，用移液枪将凝胶混合溶液缓慢地注入两层玻璃中，再在液面上小心注入1 ml dd H2O，使分离胶面齐平，也有利于识别分离胶凝固程度，静置0.5 h以上。待看到清晰的分界线除去分离胶上面多余水，根据需要按比例配制浓缩胶，待混匀溶液后。凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不要在齿尖处留有气泡，静置1 h左右以保证浓缩胶完全聚合。上样样品准备：根据蛋白浓度计算各组上样体积，然后加入Loading Buffer混匀，沸水处理10 min使蛋白变性，冰上静置5 min。电泳：分别在两端加入不同体积的蛋白Marker以利于识别样品顺序上样完成后，进行60 V恒压电泳，待溴酚蓝跑出浓缩胶后更换至100 V的恒压电泳，待所需条带都明显分离开便可结束电泳。将裁减好的滤纸和PVDF膜浸泡于转印缓冲液中，去除留于膜上的气泡。按照正极→负极（3层滤纸-NC膜-蛋白胶-3层滤纸）的顺序放于转印槽中，于含有20%甲醇的转印液中100 V恒压转印90min。转印完成后，根据两端蛋白Marker用铅笔在目的条带附近划线，用剪刀剪下需要的条带， TBST液洗涤NC膜3次，每次10 min，放入含有1% BSA的TBST封闭液内，室温封闭2 h左右。封闭后勿洗，用封闭液配一抗稀释液，将封闭完成的NC膜转入预先制好孵育袋中，加入适量的一抗稀释液，4度孵育过夜，用TBST洗涤膜3次，每次10 min。洗涤过的NC膜转入新的孵育袋，加入适量二抗，室温摇床孵育1 h。TBST洗涤3次，每次10 min，待显色。配制ECL显色液：在避光条件下按A液：B液=1：1的比例配制ECL显色液。将ECL显色液滴在膜表面上，避光放置5 min后在凝胶成像系统中观察、拍照。

实验结果

1 病毒感染后lncRNA转录组测序

乙脑病毒感染猪PK-15细胞36 h后，通过lncRNA转录组测序发现452个lncRNA转录本表达显著上调，404个lncRNA转录本表达显著下调；通过mRNA转录组测序发现2253个mRNA转录本表达显著上调，1912个mRNA转录本表达显著下调（图1 A）。通过│log2FC│≥1和P-value<0.05两个条件筛选差异表达的lncRNA和mRNA，log2FC是差异表达倍数再取以2为底的对数，log2FC≥1即为上调的差异基因，log2FC≥-1为下调的差异基因基因（图1B）。对差异表达的lncRNA和mRNA做聚类分析，具有相同或相似表达行为的基因将被聚到一起。聚类分析结果表明JEV处理和Mock组可以有效的区分开，而互为重复的样品则聚到一起；本实验聚类分析反映出对照组和实验组样品的基因表达模式差异较大，而重复之间的样品中基因的表达模式相似或相近（图1C和D）。

2 反义核酸技术敲减lncRNA NONSUST006715.1

通过文献检索和生物信息学分析筛选了4个可能与病毒感染相关的lncRNA A(ID:NONSUSG008652.1)、lncRNA B（ID：NONSUSG003879.1）、lncRNA C（ID：NONSUSG012753.1）、lncRNA D（ID：NONSUSG010004.1）。利用荧光定量PCR技术检测病毒感染后的4个lncRNA表达水平变化。发现JEV病毒感染后12 h，lncRNA A、B、C、D无显著变化；JEV病毒感染后24 h，筛选的四个lncRNA 均呈现显著性变化，其中lncRNA A、B、C显著升高，lncRNA D显著下降；JEV病毒感染后36 h， lncRNA A、B、C、D进一步地呈现显著性升高或下降几乎达到峰值。我们进一步通过反义核酸（ASO）技术敲减lncRNA B（ID：NONSUSG003879.1）的转录本NONSUST006715.1,发现反义核酸ASO1转染PK-15细胞24 h后相对于其他两条反义核酸链可以更好的敲减lncRNA。

3 lncRNASUST006715.1敲减后增强JEV感染PK15细胞后病毒的增殖。

利用反义核酸敲减lncRNA NONSUST006715.1，通过免疫荧光检测JEV病毒结构蛋白E的表达情况，发现lncRNA NONSUST006715.1表达的抑制会促进JEV病毒结构蛋白E的表达，western blot实验检测JEV病毒非结构蛋白NS3表达水平，结果与免疫荧光结果一致lncRNA NONSUST006715.1的敲减会促进JEV病毒的增殖，如图3所示。通过抑制剂实验发现抑制剂ZK811752可以促进lncRNA NONSUST006715.1表达的上调，抑制JEV病毒非结构蛋白NS3的表达，如图4所示。综上结果，lncRNA NONSUST006715.1具有抑制JEV病毒的增殖的功能。

Claims

1.lncRNA NONSUST006715.1在制备抑制乙脑病毒增殖药物中的应用。