CN107828788A

CN107828788A - 一种PRRSV感染相关的lncRNA及其siRNA在抑制病毒复制中的应用

Info

Publication number: CN107828788A
Application number: CN201711062600.0A
Authority: CN
Inventors: 张婧; 卢曾军; 刘在新; 孙普; 曹轶梅; 甘利鹏; 李冬
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2017-11-02
Filing date: 2017-11-02
Publication date: 2018-03-23
Anticipated expiration: 2037-11-02
Also published as: CN107828788B

Abstract

本发明涉及一种siRNA及其在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。所述siRNA可以敲低lncRNA TCONS_00179042在PAM细胞中的表达，从而有效抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒；所述lncRNA TCONS_00179042能够促进PRRSV病毒复制，为研究抗PRRSV病毒复制的药物提供了新的靶标lncRNA TCONS_00179042；为进一步开发新的抗病毒策略奠定了基础，也为PRRSV感染后宿主抗病毒机制研究提供了候选lncRNA。

Description

一种PRRSV感染相关的lncRNA及其siRNA在抑制病毒复制中的应用

技术领域

本发明涉及非编码RNA技术领域，具体涉及一种PRRSV感染相关长链非编码RNA(lncRNA)及其干扰RNA(siRNA)在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是严重危害我国养猪业的重要疫病，其致病病毒PRRSV是一种单股正链RNA病毒，主要感染肺泡巨噬细胞(PAM)、成熟单核细胞、小胶质细胞等抗原递呈细胞，造成母猪流产、死胎、木乃伊胎以及仔猪的呼吸道疾病。猪繁殖与呼吸综合征是病毒病，在未感染前可以注射弱毒疫苗或灭活疫苗进行预防，但是现有的疫苗的保护性免疫效果有限，对异源毒株的保护效果差，疫苗免疫不能消除持续带毒现象，弱毒疫苗免疫群体内流行毒株与疫苗毒株的基因重组现象比较普遍，为变异株的产生提供了条件。因此，针对PRRSV流行的复杂局面，需要发现新的抗病毒免疫或治疗策略，解决目前PRRS防控中存在的困难。PRRSV感染相关的长链非编码RNA(lncRNA)在病毒感染致病过程中发挥着重要的作用，lncRNA分子对病毒的复制可能有促进或抑制作用，对其结构与功能进行研究，将有可能发现新的抗病毒方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种siRNA及其在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。

本发明提供了一种lncRNATCONS_00179042的siRNA，其特征在于，所述siRNA的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

本发明还提供了所述的siRNA在敲低PAM细胞中lncRNATCONS_00179042表达中的应用。

优选的，所述siRNA对lncRNATCONS_00179042的敲低效率为45～55％。

本发明还提供了所述的siRNA在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用。

本发明还提供了所述的lncRNATCONS_00179042作为靶点在开发治疗和预防PRRSV的药物和疫苗中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一种lncRNA TCONS_00179042的siRNA，所述siRNA可以敲低lncRNATCONS_00179042在PAM细胞中的表达，从而有效抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒；所述lncRNATCONS_00179042能够促进PRRSV病毒复制，本发明提供的siRNA能够敲低lncRNATCONS_00179042的表达，为研究抗PRRSV病毒复制的药物提供了新的靶标lncRNATCONS_00179042；为进一步开发新的抗病毒策略奠定了基础，也为PRRSV感染后宿主抗病毒机制研究提供了候选lncRNA。

附图说明

图1为PAM细胞接种VR2332毒株24小时后实时荧光定量PCR测定lncRNATCONS_00179042表达量结果示意图；

图2为PAM细胞中siNC和si TCONS_00179042干扰小RNA对siTCONS_00179042的干扰效率示意图；

图3为PAM细胞中siNC和si TCONS_00179042干扰小RNA，对PRRSV的复制抑制作用示意图；

图4为lncRNATCONS_00179042琼脂糖凝胶电泳结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种lncRNATCONS_00179042的siRNA，所述siRNA的核苷酸序列如SeqIDNo.1所示，具体序列如下：

GCGCUUUCAGAACUGCAAU；

所述siRNA为人工合成序列，所述siRNA优选的委托生物公司合成。在本发明中所述siRNA可以特异的敲低肺泡巨噬细胞(PAM)中lncRNATCONS_00179042的表达；所述siRNA对lncRNATCONS_00179042的敲低效率优选的为45～55％，更优选的为50％。

在本发明中所述的lncRNATCONS_00179042的表达与病毒PRRSV复制相关，lncRNATCONS_00179042可以作为抑制病毒PRRSV复制的新靶标。在本发明中，所述siRNA通过敲低PAM细胞中lncRNATCONS_00179042的表达水平来抑制PAM中猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制。

具体的在本发明实施过程中siRNA敲低PAM细胞中lncRNATCONS_00179042表达的方法为：将siRNA和Lipofectamine 2000Reagent的混合液加入到PAM细胞中培养；培养结束后提取细胞总RNA，进行反转录，用实时荧光定量PCR检测TCONS_00179042表达水平。

在本发明中所述siRNA和Lipofectamine 2000Reagent的混合液的溶剂优选的为Opti-MEM培养基。所述混合液中siRNA的浓度优选的为150～250pmol/ml，更优选的为200pmol/ml；所述混合液中Lipofectamine 2000Reagent优选的为市售商品，所述的Lipofectamine 2000Reagent浓度优选的为8～12μl/ml，更优选的为10μl/ml。

在本发明中，所述培养前优选的还包括向PAM细胞中添加Opti-MEM培养基；在本发明中，所述PAM细胞优选的提前接种在六孔板中，所述Opti-MEM培养基的添加量优选的为每孔1.5ml；所述PAM细胞的密度优选的为40～60％，更优选的为50％。在本发明中所述培养的温度优选的为37℃恒温、培养环境优选的为5vol％CO₂；所述培养的时间优选的为22～26h，更优选的为24h。在本发明具体实施过程中优选的采用恒温培养箱来进行所述培养。

本发明在培养完成后，收集细胞，检测lncRNATCONS_00179042表达水平。在本发明中所述检测lncRNATCONS_00179042表达水平的方法优选的采用实时荧光定量PCR法。在本发明中所述实时荧光定量PCR采用宝生物工程(大连)有限公司的 Premix ExTaq^TMII(Tli RNaseH Plus)荧光定量PCR试剂盒，并根据说明书配置体系和设定程序。所述lncRNATCONS_00179042的PCR上游引物序列优选的如Seq ID No.3所示，下游引物优选的如Seq IDNo.4所示。

在本发明中，所述siRNA通过敲低PAM细胞中TCONS_00179042的表达水平来抑制PAM中猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制。所述siRNA抑制PAM中猪繁殖与呼吸综合征病毒具体的方法参见上述siRNA敲低PAM细胞中TCONS_00179042的表达水平的方法，先将siRNA转染PAM细胞，敲低TCONS_00179042的表达后，再用猪繁殖与呼吸综合征病毒感染PAM细胞，其他步骤与上述方法相同，在此不再赘述。在本发明中所述猪繁殖与呼吸综合征病毒感染后的PAM细胞的获取方法具体的为：将VR2332毒株接种于PAM细胞，接种毒株后加入含2％FBS的RPMI-1640培养基培养。在本发明中所述VR2332毒株为疫苗毒株，在本发明中所述VR2332毒株的MOI优选的为0.1。

在本发明中，采用实时荧光定量PCR测定PRRSV病毒ORF7的表达量。具体方法如下：收集细胞，用Qiagen RNeasyMini Kit提取细胞总RNA；利用宝生物工程(大连)有限公司的试剂盒(RR036A)反转录，然后用实时荧光定量PCR测定PRRSV病毒ORF7的表达量，以GAPDH为内参计算PRRSVORF7mRNA相对表达量。所述PRRSV ORF7的上游引物序列优选的如SeqIDNo.7所示，下游引物序列优选的如Seq ID No.8所示。所述GAPDH的PCR上游引物序列优选的如Seq ID No.5所示，下游引物优选的如Seq ID No.6所示。

下面结合具体实施例对本发明所述的siRNA及其在抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1 lncRNA TCONS_00179042的siRNA在抑制PAM细胞中lncRNATCONS_00179042表达中的应用

所述siRNA的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，具体序列如下：GCGCUUUCAGAACUGCAAU，所述siRNA为人工合成序列。所述lncRNATCONS_00179042的核苷酸序列如Seq ID No.2所示。

将100pmol siRNA加入250μl Opti-MEM培养基中混匀，并用5μlLipofectamine2000Reagent加入250μl Opti-MEM培养基中，室温放置5分钟后，将稀释好的siRNA溶液与Lipofectamine 2000Reagent用移液器反复吹打充分混匀，室温放置15分钟。用Opti-MEM培养基润洗预先接种在六孔板中的PAM细胞，细胞密度50％，接着将siRNA和Lipofectamine2000Reagent的混合液加入各细胞孔中，最后再补加1.5ml Opti-MEM培养基，轻轻摇晃。最终于37℃恒温、5％CO2的温箱培养中培养，24小时后收集细胞。用Qiagen RNeasyMini Kit试剂盒按照说明书操作，提取总RNA，进行反转录，用实时荧光定量PCR检测TCONS_00179042表达水平。结果如图1所示，TCONS_00179042在PAM细胞中的敲低效率为50％。

实施例2 PRRSV病毒在PAM中复制对lncRNATCONS_00179042表达量的影响

具体步骤如下：

1、猪肺泡巨噬细胞分离：选取3周龄的PRRSV阴性健康猪，处死后无菌分离肺脏，用无菌PBS缓冲液灌洗肺脏。将收集的灌洗液400g离心10分钟后弃去上清，加入30mLPBS重悬沉淀细胞，反复洗涤2次后收集沉淀细胞，用含10％FBS的RPMI-1640完全培养基重悬，调整细胞浓度达8×10⁵个细胞/cm²，加入到25cm²培养瓶中，于37℃温箱培养(或以2×10⁷个细胞/mL冻存)。贴壁细胞即为PAM，培养6小时左右，更换含10％FBS的新鲜RPMI-1640完全培养基。

2、病毒接种：将VR2332毒株以MOI为0.1接种于PAM细胞，同时设未接病毒Mock对照，接毒1小时后加入含2％FBS的RPMI-1640培养基至5mL。Mock接种采用未接毒的Marc-145细胞培养物，所有操作与接毒组相同。

3、总RNA提取，第一链cDNA合成及实时荧光定量PCR：接毒后24小时收集细胞，用Qiagen RNeasyMini Kit提取总RNA，具体步骤按照说明书操作。采用宝生物工程(大连)有限公司的PrimeScript^TMRT Master Mix(Perfect Real Time)反转录总RNA，每20μl体系加入1μg总RNA；反转录体系为：5×PrimeScript RTMasterMix(Perfect RealTime)，2μl；总RNA 500ng，补充无RNA酶水至10μl反转录应用的程序为37℃15分钟，85℃5秒；以反转录得到的cDNA为荧光定量PCR的模板；引物采用随机引物，引物稀释为10μM；采用宝生物工程(大连)有限公司的 Premix Ex Taq^TMII(Tli RNaseH Plus)荧光定量PCR试剂盒并根据说明书配置体系和和设定程序；具体体系如下：SYBRPremix Ex Taq II(Tli RNaseHPlus)(2×)，10μl；正向引物(10μM)，0.8μl；反向引物(10μM)，0.8μl；ROX Reference Dye(50×)，0.4μl；DNA模板2μl；灭菌蒸馏水6μl。PCR反应程序：95℃ 30s(1个循环)；95℃ 5s；60℃ 30s；72℃ 30s(40个循环)溶解曲线反应程序：95℃ 15s；60℃ 1h；95℃ 30s；60℃15s(1个循环)

根据荧光定量PCR实验的Ct值，以GAPDH为内参，用2^{^-△△Ct}公式计算出接毒组和对照组之间的TCONS_00179042分子表达变化倍数。结果如图2所示，RT-QPCR结果显示TCONS_00179042在VR2332感染的PAM细胞中下调表达。TCONS_00179042上下游引物序列分别见序列表SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4，GAPDH上下游引物序列见序列表SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6。

实施例3 siRNA在通过敲低TCONS_00179042抑制PRRSV复制中的应用。PAM细胞转染siTCONS_00179042和阴性对照siRNA后24小时，用MOI为0.1的VR2332接种细胞，24小时后收获病毒，弃上清后收集细胞，用Qiagen RNeasy Mini Kit提取总RNA；利用宝生物工程(大连)有限公司的试剂盒(RR036A)反转录，然后用实时荧光定量PCR测定PRRSV病毒ORF7的表达量，以GAPDH为内参计算PRRSV ORF7mRNA相对表达量。PRRSVORF7上下游引物序列分别见序列表SEQ ID No.7和SEQ ID No.8。阴性对照siRNA的序列如SEQ ID No.9所示，为：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’。结果如图3所示，siRNA敲低TCONS_00179042的PAM细胞中，PRRSV的复制水平下降。由此可见siRNA可应用于抑制PRRSV病毒在PAM细胞中的复制。

实施例4 LncRNATCONS_00179042的全长克隆

提取PAM细胞总RNA后采用宝生物工程(大连)有限公司的试剂盒(RR6210A)进行反转录。反应体系及条件均按照说明书操作，具体如下：Microtube中配制下列反应混合液。随机引物(50μM)1μl，dNTPMixture(10mM each)1μl，模板RNA 1μg，补充无RNA酶水至总体积为10μl。65℃保温5min后，冰上迅速冷却。在上述Microtube管中配制下列反转录反应液，总量为20μl。上述变性后反应液，10μl；5×PrimeScript II Buffer，4μl；RNase Inhibitor(40U/μl)，0.5μl(20U)；PrimeScript II RTase(200U/μl)，1μl(200U)；补充无RNA酶水至总体积为20μl。

采用随机引物进行反转录。根据拼接得到的序列设计全长克隆引物，所述全长克隆序列的正向引物序列如SEQ ID No.10所示，为GCGGCTAGCGAGGCTGCGATGCTGGGA，反向引物序列如SEQ ID No.11所示，为CCGGAATTCAGGAAAAGGTGTGGACCG。以反转录产物为模板进行PCR扩增，采用宝生物工程(大连)有限公司PrimeSTAR(R010)高保真聚合酶进行扩增，具体体系如下：5×PrimeSTARBuffer(Mg²⁺Plus)，10μl；dNTP Mixture(2.5mM each)，4μl；Primer1，10pmol；Primer2，10pmol；cDNA，2μl；PrimeSTAR HS DNAPolymerase(2.5U/μl)，0.5μl；补充灭菌水至50μl。反应条件为98℃10秒,55℃5秒,72℃1分钟,30个循环。扩增产物进行Sanger测序与二代测序得到的序列一致，其凝胶电泳图如图4所示。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种PRRSV感染相关的lncRNA及其siRNA在抑制病毒复制中的应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcgcuuucag aacugcaau 19

<210> 2

<211> 430

<212> DNA/RNA

<213> Sus scrofa

<400> 2

gaggctgcga tgctgggatg ctgagaagct actttcgcga caggttgggg atgccaacca 60

atgatactca tctgaaccaa agacgggggc gcccaagacc ccaaaggctc cctggcctgc 120

tggagcagaa ccaggcgtcc gccgtgcagg gcgagggttg tgatgatgcc agacgcgctt 180

tcagaactgc aatcccacac agatcgccgc cagctcgctg tgtgacctgg ggcgaatcac 240

ttaacctttc cgtgcctgag tcttccctcc cccgatcagc tggagggtgg cgcccctggg 300

tgtcccatca cgtaccccgg cgcagcccac ctcggacctg cccgcactcc cgccctctct 360

gaggctccaa gtccgcggag actctggcgc tgcgggtccc tttcctctcc cgcggtccac 420

accttttcct 430

<210> 3

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgatgctggg atgctgagaa 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cagttctgaa agcgcgtctg 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caagaaggtg gtgaagca 18

<210> 6

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagtggaaga gtgagtgtc 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cggcaaatga taaccacgc 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttctgccacc caacacgag 19

<210> 9

<211> 19

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 10

<211> 27

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcggctagcg aggctgcgat gctggga 27

<210> 11

<211> 27

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccggaattca ggaaaaggtg tggaccg 27

Claims

1.一种lncRNATCONS_00179042的siRNA，其特征在于，所述siRNA的核苷酸序列如SeqID No.1所示。

2.权利要1所述的siRNA在敲低PAM细胞中lncRNATCONS_00179042表达中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述siRNA对lncRNA TCONS_00179042的敲低效率为45～55％。

4.权利要求1所述的siRNA在制备抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒药物中的应用。

5.权利要求2或3中所述的lncRNATCONS_00179042作为靶点在制备治疗和/或预防PRRSV的药物和/或疫苗中的应用。