CN103446581B - 一种制备副猪嗜血杆菌病菌影疫苗的方法及其产品和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种制备副猪嗜血杆菌病菌影疫苗的方法及其产品和应用。本发明将突变的噬菌体裂解E基因Eprom（SEQ ID NO：1所示）与pBV220连接后得到高效裂解质粒载体pBV-Eprom。将pBV-Eprom转化到副猪嗜血杆菌中在37℃下进行增殖，然后于42℃下诱导Eprom基因表达，收集终末表达产物得到副猪嗜血杆菌菌影。其中，Eprom是通过将噬菌体裂解基因E的启动子区进行突变获得的，Eprom使得培养菌的温度从现有的28℃变成37℃，而且具有更高的裂解效率、更高的起始诱导浓度和规模化生产能力，发酵罐培养裂解效率高达99.99995%。本发明的副猪嗜血杆菌病菌影疫苗具有良好的安全性和免疫保护效力，可以刺激机体产生高滴度的抗体，且能够对不同血清型的副猪嗜血杆菌强毒株的攻击提供良好的交叉免疫保护。

Description

一种制备副猪嗜血杆菌病菌影疫苗的方法及其产品和应用

技术领域

本发明涉及一种制备副猪嗜血杆菌病菌影疫苗的方法及其产品和应用，尤其涉及一种利用突变的噬菌体裂解基因E制备副猪嗜血杆菌病菌影疫苗的方法及由该方法获得的副猪嗜血杆菌病菌影疫苗，及其在制备防治副猪嗜血杆菌感染药物中的应用，本发明属于基因工程疫苗领域。

背景技术

细菌菌影（Bacterial ghost）是一种没有细胞浆和核酸的空细菌体。将PhiX174噬菌体E裂解基因在细菌中表达，该基因编码蛋白在细菌细胞膜和胞壁上可形成穿膜隧道，在渗透压的作用下使菌体破裂，细菌胞内细胞浆和核酸成分通过此隧道被排出，形成一种空的细菌外壳，即为“细菌菌影”。细菌菌影是由内膜(cytoplasmicmembrane)，胞浆间隙(periplasmic space)和外膜(outer membrane)组成，因此细胞壁在很大程度上被完整保存下来。在有些菌株的外膜上还有一层S-layer，也成为细菌菌影的成分之一。细菌菌影本身可作为一种很好的疫苗，因为这种形式保留了和活菌一样的细菌胞膜结构和相关抗原蛋白，而外膜含有天然的免疫细胞通过模式识别受体识别的高度保守结构PAMP(pathogen-associated molecular patterns)，例如脂多糖，肽聚糖，CPG，OmpA，菌毛等，能有效地被DC和巨噬细胞所吞噬。目前，菌影通过静脉、皮下、气体等途径免疫已经在小鼠、兔子、猪等动物模型中取得了良好的免疫保护效果。霍乱菌菌影（VCG）经皮下注射小鼠诱导血清产生高水平的抗霍乱特异性IgG抗体。同时显示，针对VCG的抗体足以保护新生小鼠免遭霍乱弧菌的感染。另外，细菌菌影还可以用作一种极好的递送系统，通过在细菌裂解之前对细菌进行外膜的人工改造，将外来抗原，核酸或药物等其它成分锚定于胞膜的内、外侧，或充于胞浆周质。这样制备的重组菌影拥有完好的，天然的细菌外膜结构，能同时激发体液和细胞免疫应答。其菌毛等表面黏附结构，又使之能靶向黏附在特异性的组织，如胃肠道和呼吸道的黏膜表面，进而较易被机体吞噬细胞，如PP结（Peyer’s Patches）的M细胞所识别捕获，故而可有效递送疫苗抗原至黏膜表面和诱发相关黏膜免疫应答。Eko等人将沙眼衣原体（C.trachomatis）抗原在霍乱菌的内膜表达，然后裂解制备的重组菌影(VCG)有效地激发了生殖道黏膜的Th1型免疫应答，现在正在着手进入临床实验。与传统的原核系统表达蛋白相比，重组细菌菌影有几大优势：(1)重组蛋白被整合在一个具有高度免疫原性的环境中；(2)对蛋白的大小要求范围宽泛，但蛋白的分子量最好在2000到200,000Da之间；(3)重组蛋白被直接表达后整合到细菌的膜上，裂解后就能直接用于免疫动物，而不必要象以前制备免疫原时要先分离纯化重组蛋白；(4)整合在细胞壁的重组蛋白是以天然的构象，所以保持了它原有的活性形式。而一般基因重组的蛋白通过原核系统大都以包涵体的形式表达，只能通过变性、复性的方法在一定程度上恢复蛋白活性。(5)菌影的制备相对简单，可用发酵技术获得，而不需进行复杂的纯化工作；可以冻干的形式贮存于室温。

裂解基因E的表达可在λpL/pR-cI857或在lacPO-lacIq启动阻遏系统的转录控制下完成。一些含有不同抗性标记、复制起始区和基因E表达控制的特异性裂解质粒已经被构建出来。λpR启动子和温敏阻遏物cI857在30℃以下能抑制基因E的表达，高于30℃会导致阻遏物cI857热灭活而诱导E基因表达。为了制备菌影，细菌须在28℃条件下生长到对数生长期，然后升温到42℃诱导其裂解。

E蛋白介导的裂解已经成功地应用于各种大肠杆菌菌株、鼠伤寒沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、肺炎克雷伯氏杆菌、支气管败血博德特氏杆菌、幽门螺旋杆菌、霍乱弧菌、流感嗜血杆菌、溶血巴氏杆菌、多杀巴氏杆菌、绿脓杆菌、恶臭假单胞菌等。范围如此之大说明了只要E基因裂解盒被引入到适当的载体中，E蛋白介导的裂解可能会在每个革兰氏阴性菌中发生。

目前，国内外现有的制备细菌菌影的裂解质粒载体系统都是在上述28℃条件下培养增殖细菌，然后再升温到42℃诱导E基因的表达制备细菌的菌影。但是，大多数细菌的最佳生长温度都是37℃，28℃条件下培养使得很多细菌的生长速度大大下降，而且不利于天然表面抗原的形成，影响疫苗的免疫原性和保护效果。本发明将E基因的启动区突变后不但使得初始培养温度从28℃提高到37℃，克服了菌影制备速度慢和免疫原性差的缺陷，而且裂解效率也提高了1～2个数量级。更为关键的是，基于突变后的E基因Eprom构建的裂解载体pBV-Eprom能够利用发酵罐大量地制备副猪嗜血杆菌的菌影，使规模化生产成为可能，而该方面并未见相关的研究报道。

发明内容

本发明的目的之一在于克服现有技术的不足，提供一种新的用于制备副猪嗜血杆菌病菌影疫苗的方法。

本发明的目的之二是提供通过本发明方法制备得到的副猪嗜血杆菌病菌影疫苗。

本发明的目的之三是提供所述的副猪嗜血杆菌病菌影疫苗在制备防治副猪嗜血杆菌感染药物中的应用。

本发明上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明利用基因突变技术，对PhiX174噬菌体裂解基因E以及上游的调控基因进行随机突变，使启动子区发生基因突变，突变后的Eprom基因能使E基因的CI857抑制子在更高的温度抑制E基因的转录，从而使得培养温度从现有的裂解质粒载体的28℃变成突变后的37℃，而且具有更高的裂解效率和规模化生产能力。

本发明的一种突变的噬菌体裂解基因E，命名为Eprom，其核苷酸序列为SEQ IDNO：1所示。

将本发明突变的噬菌体裂解基因E与原核表达载体相连接后，即得到裂解载体；作为一种优选的实施方案，例如，可以将序列SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列与pBV220载体相连接，可得到一种高效裂解载体pBV-Eprom；经检测，pBV-Eprom的裂解效率可高达99.99995%。

因此，本发明提出了一种通过利用该突变的噬菌体裂解基因E制备副猪嗜血杆菌病菌影疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）构建含有噬菌体裂解基因E的裂解载体，其中所述的噬菌体裂解基因E为突变的噬菌体裂解基因E，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

（2）将该裂解载体转化到副猪嗜血杆菌中，得到含有裂解载体的副猪嗜血杆菌转化子；

（3）将该副猪嗜血杆菌转化子进行增殖培养；

（4）诱导该突变的噬菌体裂解基因E的表达，收集形成的菌影，得到副猪嗜血杆菌病菌影疫苗。

在本发明中，优选的，所述的裂解载体是通过将SEQ ID NO：1所示的序列克隆入pBV220载体中得到的。

在本发明中，优选的，步骤（3）中该副猪嗜血杆菌转化子在37℃进行增殖培养。

在本发明中，优选的，步骤（4）中在42℃温度条件下诱导该突变的噬菌体裂解基因E的表达。

在本发明中，优选的，步骤（4）中当副猪嗜血杆菌转化子浓度为OD₆₀₀等于0.8时开始升温诱导突变的噬菌体裂解基因E的表达。

进一步的，本发明还提出了由以上任何一项所述的方法制备得到的副猪嗜血杆菌病菌影疫苗。及

所述的副猪嗜血杆菌病菌影疫苗在制备防治副猪嗜血杆菌感染药物中的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果在于：

1、本发明通过试验发现，突变后的Eprom基因可以使E基因的CI857抑制子在更高的温度抑制E基因的转录，从而使得培养温度从现有的裂解质粒载体的28℃变成突变后的37℃，而且具有更高的裂解效率（高达99.99995%，比突变前高1～2个数量级）、更高的起始诱导浓度（从突变前的OD₆₀₀0.4变为突变后的OD₆₀₀0.8）和规模化生产能力，因此可以利用发酵罐批量制备副猪嗜血杆菌病菌影疫苗。

2、安全性试验结果表明，本发明所制备的副猪嗜血杆菌病菌影疫苗具有良好的安全性，接种后的猪只无任何不良反应。

3、免疫保护试验结果表明，接种本发明副猪嗜血杆菌病菌影疫苗后，可显著刺激免疫猪产生高滴度的抗体，并能有效保护各免疫猪抵抗不同血清型副猪嗜血杆菌强毒株的攻击，说明本发明的副猪嗜血杆菌病菌影疫苗具有良好的交叉免疫保护效果。

附图说明

图1为突变的噬菌体裂解基因E（Eprom）的构建示意图；

图2为发酵罐规模化制备副猪嗜血杆菌菌影的裂解曲线；

图3为副猪嗜血杆菌菌影的透射电镜观察结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验材料

菌株及质粒

大肠杆菌TG1感受态细胞购于弘博生物技术有限公司，噬菌体PhiX174购于Promega（北京）生物技术有限公司。质粒pBV220的构建过程可按照以下文献构建：张智清，姚立红，侯云德，含PrPl启动子的原核高效表达载体的组建及其应用，病毒学报，1990，6（2），111－116。

副猪嗜血杆菌CVCC3361株（氨苄青霉素敏感株）购买自中国兽药监察所。

实施例1突变的噬菌体裂解基因的克隆

根据GenBank中噬菌体PhiX174裂解基因E的编码序列设计引物:

Lysis E-U：5'-AGGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3'（SEQ ID NO.2）Lysis E-L：5'-AGGGGATCCGAGCTCTCACTCCTTCCG-3'（SEQ ID NO.3）

上、下游引物5'端分别引入了限制性酶切位点EcoR I和BamH I，由哈尔滨博仕合成。以噬菌体PhiX174双链DNA为模板扩增裂解基因E：PCR扩增反应体系为50μL，其中MgSO₄2mM，上、下游引物各1μM，dNTP200μM，10x Taq buffer，Taq^TMDNA聚合酶2U（TaKaRa），模板DNA10ng。PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃30s，59℃30s，72℃30s，30个循环，72℃5min。PCR扩增后的E基因经凝胶电泳后用胶回收试剂盒回收，然后用DNA酶对E基因进行酶切，回收10-50bp的DNA片段。取1μl回收后的DNA进行PCR扩增，PCR扩增反应体系为50μL：10x Taq buffer，Taq^TMDNA聚合酶2U（TaKaRa），模板DNA10ng。PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃30s，42℃30s，72℃30s，30个循环，72℃5min。电泳结果为小于276bp的smear。

以特异性的引物Lysis E-U和Lysis E-L对上述PCR产物进行特异性扩增。PCR扩增反应体系为50μL，其中MgSO42mM，上、下游引物各1μM，dNTP200μM，10x Taq buffer，Taq^TMDNA聚合酶2U（TaKaRa），模板1μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃30s，59℃30s，72℃30s，30个循环，72℃5min。获得含有突变的噬菌体裂解基因E的扩增产物，用胶回收试剂盒回收。突变的噬菌体裂解基因E的扩增过程见附图1。

实施例2裂解质粒载体pBV-Eprom的构建及培养条件的筛选

将实施例1所克隆的裂解基因E纯化后用EcoR I/BamH I双酶切，用T4DNA连接酶（TaKaRa）与经EcoR I和BamH I双酶切消化的pBV220载体相连接，16℃过夜连接并热激转化入大肠杆菌TG1感受态细胞，经菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行增菌并利用碱裂解法小量提取质粒，得到裂解载体。

选取20个含裂解载体的大肠杆菌TG1的菌落，分别接种在5mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB中，37℃过夜震荡培养（220r/min），然后转接1-2mL于50mL含50μg/mL氨苄青霉素的LB中，37℃震荡培养至OD₆₀₀达0.4左右。此时将温度迅速升高到42℃培养以诱导E基因表达，继续培养4-5小时，肉眼观察裂解效率。可以观察到不同的试验结果，有的试管在37℃过夜培养时即呈现裂解现象，菌液较稀薄，并可见少量细菌碎片，转接后37℃培养也呈现裂解现象，OD₆₀₀值无法达到0.4；有的试管37℃过夜培养裂解效果不明显，但转接后继续37℃培养却呈现明显的裂解现象，也无法使OD₆₀₀值达到0.4；只有1个试管得到了想要的结果，即37℃过夜培养和转接后继续37℃培养均未呈现出裂解现象，OD₆₀₀达0.4时温度升高到42℃并诱导4-5小时后却呈现出明显的裂解现象，菌液澄清透明并可见大量的菌体碎片。将37℃培养裂解的菌液和不裂解的菌液分别进行质粒提取和突变E基因的序列测定，分析比较不同培养条件下裂解质粒中突变E基因的变异情况，并获得了在37℃条件下培养不裂解的质粒载体。对该质粒载体进行测序发现，裂解基因E的启动子区发生了突变，突变后的E基因命名为Eprom，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，含有Eprom的裂解载体命名为pBV-Eprom。

实施例3含裂解载体pBV-Eprom的重组副猪嗜血杆菌的构建

1、构建含有SEQ ID NO：1所示的突变的噬菌体裂解基因E的裂解载体；

（1）合成SEQ ID NO：1所示的突变的噬菌体裂解基因E的序列；

（2）设计引物:

Lysis E-U：5'-AGGGAATTCATGGTACGCTGGACTTTGTGG-3'（SEQ ID NO.2）Lysis E-L：5'-AGGGGATCCGAGCTCTCACTCCTTCCG-3'（SEQ ID NO.3）

以特异性的引物Lysis E-U和Lysis E-L对上述合成的突变的噬菌体裂解基因E的序列进行特异性扩增。PCR扩增反应体系为50μL，其中MgSO₄2mM，上、下游引物各1μM，dNTP200μM，10x Taq buffer，Taq^TMDNA聚合酶2U（TaKaRa），模板1μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min，94℃30s，59℃30s，72℃30s，30个循环，72℃5min。获得突变的噬菌体裂解基因E的扩增产物，用胶回收试剂盒回收。

（3）将纯化后的突变的噬菌体裂解基因E的扩增产物用EcoR I/BamH I双酶切，用T4DNA连接酶（TaKaRa）与经EcoR I和BamH I双酶切消化的pBV220载体相连接，16℃过夜连接并热激转化入大肠杆菌TG1感受态细胞，经菌落PCR鉴定为阳性的克隆进行增菌并利用碱裂解法小量提取质粒，经测序鉴定无误后，得到裂解载体pBV-Eprom。

对于pBV-Eprom的构建属于本领域的常规操作，以上方法只是其中一种可以实现本发明的方法，本领域技术人员还可有多种选择。例如，本领域的技术人员完全可以按照实施例1和实施例2的方法构建得到裂解载体pBV-Eprom。即使得到的载体序列与本发明的不同，也可以通过定点突变的方法得到与本案记载的Eprom序列完全相同的载体，而在此过程中不需要付出任何的创造性劳动。

2、将裂解质粒载体pBV-Eprom及突变前的pBV-E（裂解基因选择未突变的E基因，其余构建过程与pBV-Eprom相同）分别电击转化到副猪嗜血杆菌（氨苄青霉素敏感株）CVCC3361株中，电穿孔仪（Micro-pulser，Bio-Rad，USA）的电击参数为:12.5kV/cm、200Ω、25μf、5.2ms。阳性转化子通过菌落PCR进行鉴定。选取含裂解质粒载体pBV-Eprom以及pBV-E的副猪嗜血杆菌CVCC3361株阳性转化子菌落，分别接种在5mL含50μg/mL氨苄青霉素的TSB（含10μg/mL NAD）中，均放置于28℃和37℃过夜震荡培养（220rpm），然后转接1-2mL于50mL含50μg/mL氨苄青霉素的TSB（含10μg/mL NAD）中，继续28℃和37℃震荡培养至OD₆₀₀值达到0.4左右。将培养物迅速调高到42℃培养以诱导Eprom和E基因的表达，继续培养4-5小时，肉眼观察裂解效果。试验结果与大肠杆菌裂解结果类似，转化pBV-E的副猪嗜血杆菌CVCC3361株可以在28℃培养和42℃诱导条件下裂解获得副猪嗜血杆菌的菌影；但在37℃培养时即出现裂解现象，无法使OD₆₀₀值达到0.4，而转化pBV-Eprom的副猪嗜血杆菌CVCC3361株在28℃和37℃培养时都不出现裂解现象，只有升温到42℃才出现裂解现象。

实施例4裂解质粒载体pBV-Eprom裂解效果与副猪嗜血杆菌OD值的关系

选取实施例3中构建的含裂解质粒载体pBV-Eprom的副猪嗜血杆菌CVCC3361株阳性转化子菌落，接种在5mL含50μg/mL氨苄青霉素的TSB（含10μg/mL NAD）中，37℃过夜震荡培养（220rpm），然后转接1-2mL于50mL含50μg/mL氨苄青霉素的TSB（含10μg/mL NAD）中，37℃震荡培养至OD₆₀₀值达到0.4、0.6、0.8和1.0左右。取出100μL培养物备用，将剩余培养物迅速调高到42℃培养以诱导Eprom的表达，继续培养4-5小时。取诱导前后的培养物各100μl适当稀释后涂TSA琼脂平板（含10μg/mL NAD）进行活菌CFU检测。观察发现，在不同OD₆₀₀值的情况下，Eprom基因具有很高的裂解效果，即使在OD₆₀₀值为0.8的情况下开始诱导，也表现出很高的裂解效果（99.99995%，比突变前高1～2个数量级），菌液清澈透明并可见明显的细胞碎片。结果表明，突变后的裂解质粒载体pBV-Eprom的裂解效率并不受细菌OD值的影响，即使在OD值高达0.8时开始诱导也仍然能够进行有效的裂解，远远高于国外报道的细菌OD值须维持在0.4的水平，为大规模制备细菌菌影和工业化生产奠定了现实的基础。

实施例5发酵罐大量制备副猪嗜血杆菌菌影

将含有裂解质粒载体pBV-Eprom的副猪嗜血杆菌CVCC3361株接种到5mL含50μg/mL氨苄青霉素的TSB（含10μg/mL NAD）中，37℃震荡培养12小时左右（220rpm），然后转接1-2mL于100mL含50μg/mL氨苄青霉素的TSB（含10μg/mLNAD）中，37℃过夜震荡培养。次日，将所有100mL培养物转接到含10000mLTSB培养基（含50μg/mL氨苄青霉素和10μg/mL NAD）的发酵罐中，37℃震荡培养（220rpm）。发酵罐设置参数为pH7.14-7.18；pO240%，Airflow1.35L/min。当OD₆₀₀达0.8时迅速升温到42℃条件下继续震荡培养4-5小时。从开始诱导时每隔30分钟取1mL样品测OD₆₀₀值，用于绘制裂解曲线。结果表明，升温诱导后OD₆₀₀值有短暂的升高，至1小时时达到顶峰0.985，之后迅速下降，并在诱导3小时时达到最低值0.304，之后一直维持这一水平。发酵罐规模化制备副猪嗜血杆菌菌影的裂解曲线见附图2。另外，取诱导前后的培养物各100μl适当稀释后涂TSA琼脂平板（含10μg/mL NAD）进行活菌CFU检测。裂解效率检测结果显示，培养物从诱导前的5x10⁸CFU/ml下降到诱导后的2.3x10³CFU/ml，裂解效率高达99.99995%。结果表明，突变后的裂解质粒载体pBV-Eprom可以利用发酵罐大规模的制备副猪嗜血杆菌的菌影，完全满足实现工业化生产的要求。

实施例6副猪嗜血杆菌病菌影疫苗的制备

将实施例5中收获的副猪嗜血杆菌菌影用PBS洗涤3次，冻干保存，并对冻干后的菌影进行活菌CFU检测。没有活菌残留的副猪嗜血杆菌菌影可以直接用作副猪嗜血杆菌病菌影疫苗。

将本实施例中制备的副猪嗜血杆菌菌影用PBS适量稀释后，以2.5%的戊二醛固定菌影，置4℃条件下固定2小时，PBS洗涤3次，离心后经四氧化锇再固定、乙醇逐级脱水、包埋剂包埋等步骤处理后进行透射电镜观察。电镜观察结果见附图3。

试验例1副猪嗜血杆菌病菌影疫苗的安全性试验

1.副猪嗜血杆菌病菌影疫苗对仔猪的安全性试验

选取15头4-6周龄的副猪嗜血杆菌血清阴性的健康仔猪，随即分为3组，每组5头。3个实验组分别肌肉注射1mL不同浓度的实施例6制备的副猪嗜血杆菌病菌影疫苗，分别为5x10¹⁰CFU/mL、5x10⁹CFU/mL和5x10⁸CFU/mL。接种后每天观察试验猪的食欲、精神状态、体温等；接种后14天剖杀所有试验猪，取心、肝、脾、肺、肾等各脏器进行病理组织学观察。试验结果见表1。

表1副猪嗜血杆菌病菌影疫苗对仔猪的安全性试验

接种剂量	精神状态	食欲	体温	脏器病理变化
					5x1010CFU	正常	正常	正常	正常
5x109CFU	正常	正常	正常	正常
					5x108CFU	正常	正常	正常	正常

试验结果表明，3个实验组仔猪在接种不同剂量的副猪嗜血杆菌病菌影疫苗后，均未表现出任何临床症状，精神状态、食欲良好，体温正常，心、肝、脾、肺、肾等脏器外观正常，病理组织学检查显示无任何病变。该试验结果表明副猪嗜血杆菌病菌影疫苗对4-6周龄的仔猪是安全的。

2.副猪嗜血杆菌病菌影疫苗对怀孕母猪的安全性试验

选取9头产前1个月的副猪嗜血杆菌血清阴性的怀孕母猪，随即分为3组，每组3头。3个实验组分别肌肉注射1mL不同浓度的实施例6制备的副猪嗜血杆菌病菌影疫苗，分别为5x10¹⁰CFU/mL、5x10⁹CFU/mL和5x10⁸CFU/mL。接种后每天观察试验猪的食欲、精神状态、体温等，以及有无流产、畸胎、死胎、弱胎等产仔情况。试验结果见表2。

表2副猪嗜血杆菌病菌影疫苗对怀孕母猪的安全性试验

接种剂量	精神状态	食欲	体温	产仔情况
					5x1010CFU	正常	正常	正常	正常
5x109CFU	正常	正常	正常	正常
					5x108CFU	正常	正常	正常	正常

试验结果表明，3个实验组怀孕母猪在接种不同剂量的副猪嗜血杆菌病菌影疫苗后，均未表现出任何临床症状，精神状态、食欲良好，体温正常，均未出现流产、畸胎、死胎、弱胎等不良现象。该试验结果表明本发明的副猪嗜血杆菌病菌影疫苗对怀孕母猪是安全的。

试验例2副猪嗜血杆菌病菌影疫苗的免疫效力对比试验

试验分组：

选取24头4-6周龄的副猪嗜血杆菌血清阴性的健康仔猪，随即分为4组，每组6头。设3个实验组和1个对照组，实验1组免疫本发明实施例6制备的副猪嗜血杆菌病菌影疫苗（37℃培养和42℃诱导）、实验2组免疫实施例3制备的副猪嗜血杆菌病菌影疫苗（28℃培养和42℃诱导）、实验3组免疫灭活疫苗、对照组只注射PBS。

试验方法：

3个实验组和对照组每头猪分别经颈部肌肉注射途径免疫，3个实验组免疫剂量为5x10¹⁰CFU/mL。首免后3周进行二次加强免疫，免疫途径和剂量同前。免疫前、首免后一周、二周、三周和二次免疫后一周颈静脉采血制备血清测全菌体抗体效价。二免后10天分别用5型和13型副猪嗜血杆菌的强毒株以气管途径攻毒，攻毒剂量为1mL，含活菌数5x10⁸CFU。每组每个血清型菌株各攻3头猪。攻毒后每天观察试验猪的食欲、精神状态、体温等，以及是否出现咳喘、跛行以及死亡等临床症状；攻毒后14天剖杀所有未死亡的试验猪，取心、肝、脾、肺、肾等各脏器进行病理组织学观察。

试验结果：

抗体检测结果表明，实验1组（37℃培养和42℃诱导获得的副猪嗜血杆菌菌影免疫组）刺激机体产生了效价最高的抗体，从一免一周、二周、三周到二免后一周，抗体水平始终高于实验2组（28℃培养和42℃诱导获得的副猪嗜血杆菌菌影免疫组）、实验3组（灭活苗免疫组）和对照组。攻毒后实验1组亦表现出了最佳的保护效果，该组所有免疫猪均未出现任何临床症状，食欲、精神状体正常，体温无升高，试验猪全部健活，剖杀后无任何眼观病理变化；实验2组和实验3组保护效果要大大好于对照组，但与实验1组相比要逊色。个别猪有食欲下降、精神萎靡、咳喘以及跛行等临床症状，各有2头猪死于不同血清型的攻毒，剖杀猪亦有中等程度的病变。试验结果表明，37℃培养和42℃诱导获得的副猪嗜血杆菌菌影具有最佳的免疫原性和免疫保护效果。试验结果分别见表2和表3。

表2不同试验组免疫仔猪后抗体产生情况(OD₄₉₀)

表3不同试验组免疫保护效力比较

实验结果表明，本发明的副猪嗜血杆菌病菌影疫苗具有良好的安全性和免疫保护效力，可以刺激机体产生高滴度的抗体，且能够对不同血清型的副猪嗜血杆菌强毒株的攻击提供良好的交叉免疫保护。

Claims (4)

1.一种制备副猪嗜血杆菌病菌影疫苗的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)构建含有噬菌体裂解基因E的裂解载体，其中所述的噬菌体裂解基因E为突变的噬菌体裂解基因E，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)将该裂解载体转化到副猪嗜血杆菌中，得到含有裂解载体的副猪嗜血杆菌转化子；

(3)将该副猪嗜血杆菌转化子在37℃进行增殖培养；

(4)诱导该突变的噬菌体裂解基因E的表达，收集形成的菌影，得到副猪嗜血杆菌病菌影疫苗。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的裂解载体是通过将SEQ IDNO：1所示的序列克隆入pBV220载体中得到的。

3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中在42℃温度条件下诱导该突变的噬菌体裂解基因E的表达。

4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中当副猪嗜血杆菌转化子浓度为OD₆₀₀等于0.8时开始升温诱导突变的噬菌体裂解基因E的表达。