CN107099496B - 融合表达鸡传染性法氏囊病毒vp2蛋白和沙门菌属外膜蛋白的重组乳酸菌菌株及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种融合表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白的重组乳酸菌菌株及其用途。本发明所述的重组乳酸菌菌株，含有经优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的基因序列以及编码沙门菌属外膜蛋白OMP的基因序列。实验证明该重组乳酸菌菌株其能够高效融合表达VP2蛋白和外膜蛋白OMP，且以可溶性形式存在于细胞质中。将本发明的重组乳酸菌菌株直接作为疫苗免疫鸡，实验结果表明：该重组乳酸菌菌株能有效诱导机体产生特异性的免疫应答，主要产生特异性中和抗体，使免疫鸡获得100％的抵抗高致病力vvIBDV致死性攻击的保护，并可清除体内残留的病毒，达到清除性免疫的目的。因此，本发明的提出为鸡传染性法氏囊病的防治提供了一种新的技术手段。

Description

融合表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白 的重组乳酸菌菌株及其用途
技术领域
本发明涉及一种重组乳酸菌菌株及其所融合表达的蛋白和用途，特别涉及一种融合表达鸡传染性法氏囊病毒病毒VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白OMP的重组乳酸菌菌株，还涉及该重组乳酸菌菌株及其所融合表达得到的鸡传染性法氏囊病毒病毒 VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白OMP的融合蛋白在预防鸡传染性法氏囊病以及沙门菌感染中的用途。本发明属于医学或兽医学技术领域。
背景技术
鸡传染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起的能够引起鸡体免疫抑制的重要的病毒病，严重危害着世界的养鸡业。传统疫苗在防治该病的历史中起到非常重要的作用，随着该病近年来呈现的新的变化-血清型变异株，超强毒株的出现，使得对该病的防治越来越棘手，传统疫苗的研制速度已经有些难于跟上该病的变化。快速的开发新型有效的能防治变异和超强毒株的新型疫苗的要求尤为迫切。重组乳酸菌活载体基因工程疫苗是完全食品级安全的、无任何生物安全隐患的新型活载体疫苗。不仅保留病毒抗原性，更不存在散毒的危险。该疫苗的开发和应用将为防治当前流行的鸡传染性法氏囊病提供有效的工具和手段，并可为防治禽类免疫抑制病提供有效的参考和经验。
乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一类在代谢性能、生理特征及形态上不完全相同的革兰氏阳性菌的统称，其总的特征是发酵碳水化合物时主要代谢产物是乳酸， G+，多数为不形成芽孢的对动物或植物具有益生特性的一类细菌。早期被人们用于食品发酵并取得了巨大的成功。随着对于益生乳酸菌的生理特性和分子遗传特性基础研究的深入，研究者们逐渐认识到乳酸菌作为递送异源抗原的活载体用于各种疾病的预防与治疗具有巨大的应用前景。特别是利用乳酸菌活载体疫苗不仅可以诱导机体产生系统性免疫应答，而且可以同时诱导机体的黏膜免疫应答。
伴随着分子生物学和基因工程技术的发展，出现了对于鸡传染性法氏囊病的一些新型的疫苗研究，其中主要有DNA疫苗、重组亚单位疫苗、基因工程活载体疫苗。其中活载体疫苗是指将致病微生物的主要抗原蛋白基因片段插入到表达载体中，然后将重组载体转到原核微生物或者细胞鸡真核微生物而得到的产物；或者是剔除致病微生非复制必须的毒力基因得到的基因缺失疫苗。目前主要是利用一些病毒载体(如：马立克病毒(MDV)、鸡痘病毒(FPV)、新城疫病毒(NDV)及禽腺病毒(ALV))表达IBDV的主要抗原蛋白VP2构建病毒活载体疫苗，其中Tsukamoto 等利用HVT作为载体构建的rHVTpec-VP2重组活载体疫苗，在免疫鸡后，分别取得了致死剂量vvIBDV的攻毒保护率100％；随后Bublot团队和Le Gros团队分别开发的rHVT-VP2活载体疫苗在1日龄免疫接种雏鸡后，也取得了良好的免疫效果。目前利用乳酸菌构建重组乳酸菌IBDV-VP2活载体疫苗的研究预期取得了初步的进展，但是效果并不是非常理想，还需要进一步的探索和研究。
本发明将重组乳酸菌菌株r-L.lactis-OMPH-VP2直接作为疫苗免疫鸡。将重组乳酸菌r-L.lactis-OMPH-VP2在15日龄进行一次SPF鸡免疫接种(1×1010CFU/羽)， 30日龄进行攻毒实验；实验结果显示：(1)注射免疫实验组攻毒保护率可达到100％，口服免疫实验组攻毒保护率可达到60％；(2)口服免疫组和注射免疫组的血清ELISA 抗体为阴性，但产生了较高的血清中和抗体(1:26到1:210)；(3)口服免疫组在首免一周后和二免一周后肠道黏膜sIgA抗体滴度相比于不免疫对照组明显升高，并且均差异性显著(P<0.05)。重组乳酸乳球菌r-L.Lactis-OMPH-VP2经注射和口服免疫后均可以诱导机体产生特异性的免疫应答。
在生产工艺上，本发明的重组乳酸菌菌株可以通过发酵培养高融合表达鸡传染性法氏囊病毒病毒VP2蛋白和内化蛋白OMP的重组乳酸菌，比起用SPF鸡法氏囊或细胞培养物制备的传统IBD疫苗，乳酸菌的培养简单、方便，所需培养基价格也低，重组乳酸菌无需融合表达产物的粗提即可直接使用，即直接使用重组菌作为疫苗，无需裂解或纯化，适合大规模生产。因此，重组乳酸菌活载体疫苗将具有更好的应用前景。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种由鸡传染性法氏囊病病毒VP2以及沙门菌属外膜蛋白OMP组成的融合蛋白及其编码核苷酸序列。
本发明的目的之二是提供一种含有经优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2 蛋白和沙门菌属外膜蛋白OMP融合蛋白的基因序列的重组乳酸菌菌株，该重组乳酸菌菌株可以作为疫苗直接使用。
本发明的目的之三是提供由所述的重组乳酸菌菌株以及由该菌株表达得到的融合蛋白在制备预防鸡传染性法氏囊病毒感染药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种融合表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白 OMP的重组乳酸菌菌株，含有经优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的基因序列以及编码沙门菌属外膜蛋白OMP的基因序列，所述的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的基因序列以及编码沙门菌属外膜蛋白OMP的基因序列通过连接序列连接。
其中，优选的，所述的经优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示，编码沙门菌属外膜蛋白OMP的基因序列如SEQ ID NO.5 所示。
其中，优选的，所述的连接序列如SEQ ID NO.7所示。
在本发明的具体实施中，所述的重组乳酸菌菌株命名为r-L.lactis-OMPH-VP2，分类命名为乳酸乳球菌乳酸亚种Lactococcus lactis subsp.lactis，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其保藏号是：CGMCC NO.13740，保藏时间为2017年3 月8日。
进一步的，本发明还提出了一种构建所述的重组乳酸菌菌株的方法，包括以下步骤：
(1)获得优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的基因序列以及编码沙门菌属外膜蛋白OMP的基因序列，所述的优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2 蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示，优化后的编码沙门菌属外膜蛋白OMP的基因序列如SEQ ID NO.5所示，将二者通过link序列进行连接，得到编码VP2和OMP 融合蛋白的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为 OptiVP2-OptiOMP；
(2)针对该融合基因OptiVP2-OptiOMP设计1对带有乳酸菌载体两侧重复序列的特异性引物，以OptiVP2-OptiOMP基因为模板，进行PCR扩增，得到的扩增产物与线性化的乳酸菌载体进行多片段的同源重组，构建得到重组质粒；
(3)将步骤(2)得到的重组质粒导入到乳酸菌感受态中，涂板，培养，挑取单克隆菌株进行鉴定，得到融合表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白OMP的重组乳酸菌菌株。
其中，优选的，所述的特异性引物由上游引物和下游引物组成，其核苷酸序列为：
上游引物：5’CACCATGGCTAATTTACAAGAGCT 3’(SEQ ID NO.7所示)
下游引物：5’TGGGGTACCTGCTCCAGCAATTTT 3’(SEQ ID NO.8所示)；
所述的乳酸菌载体为pNZ8149。
再进一步的，本发明还提出了一种鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白OMP的融合蛋白，其是由本发明所述的重组乳酸菌菌株经过诱导表达后得到，优选的，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
编码权利要求7所述的融合蛋白的核苷酸序列也在本发明的保护范围之内，优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
更进一步的，本发明还提出了所述的重组乳酸菌菌株、所述的融合蛋白及其编码序列在制备预防鸡传染性法氏囊病毒感染药物中的用途。优选的，所述的药物为疫苗，更优选的，所述的药物为口服疫苗或注射疫苗，更优选的，所述的鸡传染性法氏囊病毒为鸡传染性法氏囊病毒超强毒(vvIBDV)。
攻毒实验结果表明，当受到鸡传染性法氏囊病毒超强毒株HLJ0504攻击时，注射免疫r-L.lactis-OMPH-VP2实验组攻毒保护率可达到100％，口服 r-L.lactis-OMPH-VP2免疫实验组攻毒保护率可达到60％；说明本发明得到的重组乳酸乳球菌r-L.lactis-OMPH-VP2经注射和口服免疫后均可以诱导机体产生特异性的免疫应答，而注射免疫r-L.lactis-VP2实验组以及空菌对照实验组攻毒保护率均为0。
综上，本发明公开了一种新的可以融合表达的重组VP2蛋白和内化蛋白OMP 的重组乳酸菌菌株。将本发明重组乳酸菌制成疫苗，免疫鸡实验结果表明：本发明重组乳酸菌口服免疫或注射免疫均可以有效诱导机体产生特异性的免疫应答，注射免疫使免疫鸡获得100％的抵抗高致病力vvIBDV致死性攻击的保护，并可清除体内残留的病毒，达到清除性免疫的目的。
附图说明
图1为融合基因的PCR扩增；
图2重组质粒的酶切鉴定(NcoI和AvaII双酶切)；
图3为重组质粒图谱；
图4为乳酸菌融合表达的IBDV-VP2重组蛋白的Western blot检测结果，结果显示融合表达的IBDV-VP2重组蛋白以可溶性形式存在；
图5为重组乳酸菌融合表达的VP2蛋白与OMP的融合蛋白的黏附特性检测结果；
其中：A:阴性对照；B：VP2蛋白对照；C：融合蛋白VP2-OMP；
图6为攻毒保护实验动物存活曲线(注射免疫使免疫鸡获得100％的保护，全部存活)。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1重组乳酸菌的构建及鉴定
1、重组乳酸菌载体的构建
将编码鸡传染性法氏囊病毒病毒VP2蛋白与沙门菌属外膜蛋白(OMP)的基因分别按照乳酸菌密码子偏嗜表进行优化，优化后的基因命名分别为OptiVP2以及 OptiOMP，优化后的鸡传染性法氏囊病毒病毒VP2基因序列OptiVP2如SEQ ID NO： 3所示，所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，优化后的鸡沙门菌属外膜蛋白(OMP)的基因序列OptiOMP如SEQ ID NO：5所示，所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。将优化后的OptiVP2以及OptiOMP基因序列通过link序列(SEQ ID NO.7所示)进行连接，得到编码VP2-OMP融合蛋白的核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO：1所示，所编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
针对该融合基因设计1对带有pNZ8149载体两侧重复序列的特异性引物。将设计好的引物交给吉林库美生物有限公司合成。引物序列如下：
上游引物：5’CACCATGGCTAATTTACAAGAGCT 3’(SEQ ID NO.8所示)
下游引物：5’TGGGGTACCTGCTCCAGCAATTTT 3’(SEQ ID NO.9所示)
扩增的片段大小为1431bp，扩增结果见图1。将pNZ8149酶切纯化回收的线性化载体按照One Step Cloning Kit的说明书要求与载体进行多片段的同源重组，构建重组质粒。
2、重组质粒的提取及鉴定
采用电转化的方式将重组质粒导入到乳酸菌NZ3900感受态中。具体的步骤为：取出一支乳酸菌株NZ3900感受态细胞置于冰上融化，然后将同源重组得到连接产物吸出10μL加入感受态细胞中，轻轻吹均匀，在冰上静置5-10min，加入0.2mm 的电转杯中(提前在冰上预冷)，按照条件(2 000ν、25μF、200Ω)进行电转，电转完成后，迅速在电转杯中加入1mL的电转复苏液(提前在冰上预冷)进行复苏，吹吸混匀后吸出加入提前准备好的EP管(高压灭菌并在提前在冰上预冷)中，冰水浴5min，30℃孵育1h。取100μL在L-Elliker平板上涂板，将平板倒置，于 30℃过夜培养。第二天挑取单克隆菌株进行鉴定，证明质粒构建正确。质粒的鉴定结果见图2，质粒图谱见图3，将所得到的重组质粒命名为p8149-Opti-VP2-OMP。
3、重组乳酸菌的筛选和鉴定
挑取单克隆菌株培养，经过菌液PCR初步鉴定出1、2、5、7、9共五株疑似阳性克隆菌株；为进一步鉴定重组乳酸菌株的构建正确，通过测序，Blast序列比对，最终确定筛选出一株与预期设计的完全一致的阳性克隆，命名为 r-L.lactis-OMPH-VP2，分类命名为乳酸乳球菌乳酸亚种(Lactococcus lactis subsp. lactis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号是： CGMCC NO.13740。
4、重组乳酸菌的诱导表达及鉴定
将所述的重组乳酸菌菌株r-L.lactis-OMPH-VP2接种于Elliker-medium培养基中，加入0.5％乳糖，30℃，静止培养过夜，按照1：50传代培养，培养菌密度至 OD600为0.3-0.5时，加入nisin诱导培养，Nisin浓度为10ng/mL培养，静止诱导培养5至6小时后，分别得到重组菌株的培养上清、裂解上清和裂解沉淀；利用含有空载体菌株作为阴性对照，进行Western Blot检测，结果显示重组乳酸乳球菌 r-L.lactis-OMPH-VP2实现融合蛋白VP2-OMP(约53kD)的表达，并且是胞内可溶性表达，如图4所示。
实施例2本发明重组乳酸菌r-L.lactis-OMPH-VP2融合表达的VP2蛋白与 OMP的融合蛋白的黏附特性检测
将所述的重组乳酸菌菌株r-L.lactis-OMPH-VP2接种于Elliker-medium培养基中，加入0.5％乳糖，30℃静止培养过夜，按照1：50传代培养，培养菌密度至OD600为0.3-0.5时，加入nisin诱导培养，Nisin浓度为10ng/mL培养，静止诱导培养5 至6小时后，浓缩裂解后得到菌体裂解上清，其中含有表达得到的OMP和VP2蛋白的融合蛋白。
同时，将仅表达鸡传染性法氏囊病毒病毒VP2蛋白的重组乳酸菌r-L.lactis-VP2(制备方法与r-L.lactis-OMPH-VP2的制备相同，区别仅在于不含有OMP表达序列) 以及含有空载体的乳酸菌菌株按照上面相同的方法分别得到重组乳酸菌r-L.lactis- VP2菌体的裂解上清以及含有空载体的乳酸菌的裂解上清(作为阴性对照)。
在激光共聚焦小培养皿中用含有10％胎牛血清(FBS)的DMEN细胞培养基培养HT-29细胞，直到整体的细胞融合度达到60％～70％；弃掉培养基，用PBS清洗 3次，然后将r-L.lactis-OMPH-VP2菌体的裂解上清、r-L.lactis-VP2菌体的裂解上清、含有空载体的菌株的裂解上清各200μL和上皮细胞共孵育1h；弃掉上清液，用PBS 清洗3次；室温用无水乙醇固定1h后，清洗1次；加入鼠源VP2抗体(1:200稀释)， 37℃与细胞共孵育1h，然后清洗4次；用0.1％的Trion-X 100通透15分钟，PBS 清洗1次；用200μL的DAPI对细胞核染色15分钟，PBS清洗4次；用激光共聚焦显微镜进行观察，结果如图5所示，结果显示OMP和VP2蛋白的融合蛋白，显著提高了VP2蛋白对于上皮细胞的黏附能力，在细胞膜周围可见大量荧光，而单独表达的VP2蛋白和空菌裂解蛋白与上皮细胞的黏附作用很少，几乎见不到细胞膜周的荧光。结果说明本发明OMP蛋白肽可以显著提高VP2蛋白对上皮细胞的黏附能力，从而可以显著提高抗原递呈能力。
实施例3本发明重组乳酸菌的免疫原性的测定
取出保存于-80℃的实施例1所制备的重组乳酸乳球菌菌株 r-L.lactis-OMPH-VP2以及仅表达鸡传染性法氏囊病毒病毒VP2蛋白的重组乳酸菌 r-L.lactis-VP2(制备方法与r-L.lactis-OMPH-VP2的制备相同，区别仅在于不含有OMP表达序列)，分别在固体的L-Elliker培养基上进行划线，30℃培养，10h-12h 长出单菌落之后，用灭菌的枪头挑菌，接种于液体的L-Elliker培养基中，培养至对数期；按体积比1:100的比例进行转接液体L-Elliker培养基30℃静置培养12h-14h 后，再次按照体积比1:50的比例转接到液体L-Elliker培养基30℃静置培养约2h-3h，待OD600＝0.4～0.5，加入终浓度为5ng/mL的Nisin，30℃静止诱导培养4h-5h， 8000g离心2min，用PBS按照体积比1:10的比例浓缩重悬，菌体浓度约为1× 1010CFU/mL，用于后续的口服和皮下注射免疫。
将1日龄SPF雏鸡随机分4组，每组10只，r-L.lactis-OMPH-VP2免疫组分别为口服免疫1×1010CFU/mL重组乳酸乳球菌(500μL)，颈部皮下注射免疫1× 1010CFU/mL重组乳酸乳球菌r-L.lactis-OMPH-VP2(200μL)；r-L.lactis-VP2免疫组采用颈部皮下注射免疫1×1010CFU/mL重组乳酸乳球菌r-L.lactis-VP2(200μL)；空载体菌株免疫组作为对照组，采用颈部皮下注射免疫1×1010CFU/mL含有空载体的乳酸乳球菌(200μL)。各组在7日龄时进行首次免疫；14日龄进行二次免疫；同时在首免后和二免后一周采集血清，口服免疫组采集口咽拭子和泄殖腔拭子；30 日龄时，用1000个ELD50的HLJ0504超强毒株进行攻毒保护试验，攻毒后观察10 天左右，记录各组SPF鸡的发病情况及存活率。
实验结果显示：(1)注射免疫r-L.lactis-OMPH-VP2实验组攻毒保护率可达到100％，口服r-L.lactis-OMPH-VP2免疫实验组攻毒保护率可达到60％；(2)口服免疫r-L.lactis-OMPH-VP2组和注射免疫r-L.lactis-OMPH-VP2组的血清ELISA抗体为阴性，但产生了较高的血清中和抗体(1:26到1:210)；(3)口服免疫 r-L.lactis-OMPH-VP2组在首免一周后和二免一周后肠道黏膜sIgA抗体滴度相比于其他两组明显升高，并且均差异性显著(P<0.05)。重组乳酸乳球菌 r-L.lactis-OMPH-VP2经注射和口服免疫后均可以诱导机体产生特异性的免疫应答。注射组试验鸡法氏囊组织全部保护，实验组攻毒观察10日后囊指数大于0.7，全部保护。(4)而注射免疫r-L.lactis-VP2实验组攻毒保护率为0；(4)空菌对照实验组攻毒保护率为0；结果见图6。
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Claims (10)

1.一种融合表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白OMP的重组乳酸菌菌株，其特征在于：所述的重组乳酸菌菌株命名为r-L.lactis-OMPH-VP2，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号是：CGMCCNO.13740。
2.一种构建权利要求1所述的重组乳酸菌菌株的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)获得优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的基因序列以及编码沙门菌属外膜蛋白OMP的基因序列，所述的优化后的编码鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白的基因序列如SEQ ID NO.3所示，优化后的编码沙门菌属外膜蛋白OMP的基因序列如SEQ ID NO.5所示，将二者通过link序列进行连接，所述的link序列如SEQ ID NO.7所示，得到编码VP2和OMP融合蛋白的基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为OptiVP2-OptiOMP；
(2)针对该融合基因OptiVP2-OptiOMP设计1对带有乳酸菌载体两侧重复序列的特异性引物，以OptiVP2-OptiOMP基因为模板，进行PCR扩增，得到的扩增产物与线性化的乳酸菌载体pNZ8149进行多片段的同源重组，构建得到重组质粒；所述的特异性引物由上游引物和下游引物组成，其核苷酸序列为：
上游引物：5’CACCATGGCTAATTTACAAGAGCT 3’
下游引物：5’TGGGGTACCTGCTCCAGCAATTTT 3’；
(3)将步骤(2)得到的重组质粒导入到乳酸菌感受态中，涂板，培养，挑取单克隆菌株进行鉴定，得到融合表达鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白OMP的重组乳酸菌菌株。
3.权利要求1所述的重组乳酸菌菌株在制备预防鸡传染性法氏囊病毒感染药物中的用途。
4.如权利要求3所述的用途，其特征在于：所述的药物为疫苗。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的药物为口服疫苗或注射疫苗。
6.一种鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白和沙门菌属外膜蛋白OMP的融合蛋白，其特征在于是由权利要求1所述的重组乳酸菌菌株经过诱导表达后得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.编码权利要求6所述的融合蛋白的核苷酸序列，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
8.权利要求6所述的融合蛋白及其编码序列在制备预防鸡传染性法氏囊病毒感染药物中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的药物为疫苗。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于：所述的药物为口服疫苗或注射疫苗，所述的鸡传染性法氏囊病毒为鸡传染性法氏囊病毒超强毒。
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