CN116769053B - 重组AaLS-BPP融合肽、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明于生物技术领域，公开了重组AaLS‑BPP融合肽、制备方法及应用。本发明通过基因工程的方法使AaLS和法氏囊活性肽BPP（MTLTG）通过柔性连接肽Linker基因串联而成，对融合肽AaLS‑BPP进行表达，并通过自组装形成稳定的纳米颗粒。将纯化后的融合肽AaLS‑BPP作为免疫增强剂按一定剂量添加进灭活疫苗中，增强机体对抗原产生的细胞免疫反应和体液免疫反应，提高对鸡群的保护率，同时降低疫苗对机体的局部炎症反应以及生长性能的影响。

Description

重组AaLS-BPP融合肽、制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及重组AaLS-BPP融合肽、制备方法及应用。

背景技术

来源于超嗜热菌Aquifex aeolicus的Lumazine合酶(AaLS)由60个相同的亚基组成，具有球形和空心二十面体衣壳结构，能形成一种自组装蛋白质纳米颗粒(Kim et al2022；Zhang et al 2001)。这些组装体的颗粒性质和重复的亚基组织能够作为抗原递呈的展示平台(Lamontagne et al 2022)，并产生高于单体蛋白支架产生的抗体水平(LadensteinMorgunova 2020)。抗原展示在自组装纳米颗粒上可以刺激强烈的免疫反应，在一些临床研究中，超嗜热菌Aquifex aeolicus(AaLS)已被用作纳米颗粒免疫原的支架。

AaLS的N端暴露在纳米颗粒表面，因此可以用作抗原展示。AaLS的C端也可暴露在纳米颗粒表面，可用于连接或显示纯化标签(Ba Reun Kim et al 2022)。针对不同的抗原展示，需要对AaLS蛋白支架颗粒进行改造，例如Aebischer等人利用LS建立了一个持久且适应性强的自组装多聚蛋白支架颗粒(LS-MPSP),将SpyTag/SpyCatcher介导的插入式显示技术应用于LS-MPSP的预组装颗粒上，以展示两种模型抗原，结果表明纳米颗粒提高了免疫原性和疫苗效力(Aebischer et al 2021)。因此，本发明中为利用AaLS蛋白支架颗粒展示法氏囊多肽以及提高表达量，对AaLS蛋白支架进行了氨基酸突变，并在合适位置增加His标签以便于纯化。

法氏囊是独属于禽类的体液中枢免疫器官，对于T、B细胞的诱导分化和成熟具有重要作用(Cai et al 2022)。法氏囊五肽BPP(MTLTG)来源于法氏囊的活性肽能有效刺激T、B细胞分化和增强抗体的产生(Feng et al 2010)。张秀根等将人工合成囊素与新城疫弱毒疫苗联合应用免疫鸡，能够使血清中新城疫母源抗体维持较高水平和较长时间，对诱导产生抗体有促进作用。

由于法氏囊多肽只能从鸡的法氏囊组织中提取，制备难度大，杂蛋白含量高，难以批量纯化和应用。而化学合成的法氏囊活性肽成本高，仅适用于实验室研究，无法投入实际生产应用。因此采用基因工程的方法进行研究具有非常重大的意义。

针对上述问题，本发明使AaLS和法氏囊多肽BPP通过柔性连接肽Linker基因串联而成，对融合肽AaLS-BPP进行表达，并通过自组装形成稳定的纳米颗粒。将纯化后的融合肽AaLS-BPP作为按一定剂量添加进灭活疫苗中，增强机体对抗原产生的细胞免疫反应和体液免疫反应，提高对鸡群的保护率。进一步降低佐剂以及抗原对机体的局部炎症反应以及生长性能的影响。

发明内容

本发明的目的在于提供了重组AaLS-BPP融合肽，所述融合肽的氨基酸序列为SEQID NO.2所示。

本发明的的另一个目的在于提供了重组AaLS-BPP融合肽的微生物制备方法，方法简单，蛋白表达量高。

本发明的最后一个目的在于提供了重组AaLS-BPP融合肽在制备免疫增强剂中的应用。为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

重组AaLS-BPP融合肽，所述融合肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，编码融合肽的多核苷酸之一为SEQ ID NO.1所示。

重组融合肽的制备方法，包括：

1)针对重组AaLS-BPP融合肽基因，设计引物F1：5’-GatgaccctgaccggcAGCAGCAGCGGGTCCGGA-3’和F2：5’-TgccggtcagggtcatCATCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGT-3’，F3：5’-CatgaccctgaccggcGGATCGGGCTCTCATCACCA-3’，和F4：5’-CgccggtcagggtcatGCCTCCTCCTGAGCCTCCA-3’，然后进行SOE-PCR扩增；回收SEQ ID NO.1所示多核苷酸产物；

(2)将SEQ ID NO.1所示多核苷酸和质粒载体pET28a进行酶切连接，获得的质粒命名为pET28a-AaLS-BPP；重组质粒pET28a-AaLS-BPP转化进入感受态大肠杆菌BL21(DE3)，所述的感受态大肠杆菌BL21(DE3)来自于唯地生物，货号为EC1002。

本发明的保护范围还包括：

重组AaLS-BPP融合肽或者编码该融合肽的基因在制备免疫增强剂中的应用。

以上所述的应用中，优选的，所述的免疫增强剂的应用对象为家禽。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.申请人针对原始AaLS蛋白质，对AaLS骨架进行定点突变改造，提高BPP多肽的表达量。

2.在AaLS骨架两侧的表达位点，均插入多肽，提高骨架质粒的稳定性，同时提高多肽的表达量。

3.成功制备出表达重组AaLS-BPP融合肽的大肠杆菌工程菌。

4.表达出的重组AaLS-BPP融合肽能够自组装形成稳定的纳米颗粒。

5.AaLS-BPP融合肽添加进禽大肠杆菌灭活疫苗中能促进免疫鸡只体内IgG抗体水平升高，显著诱导Th2型(IL-4)细胞因子的产生，对于Th1型细胞因子(IL-2、IL-12、IFN-γ)的诱导作用不显著，重组AaLS-BPP融合肽添加进入禽三联灭活疫苗能够显著提高免疫鸡各病毒抗体效价，Th1型和Th2型细胞因子分泌水平以及外周血淋巴细胞增殖能力。

附图说明

图1为重组AaLS-BPP融合肽的表达与纯化示意图；

其中A：泳道1：未诱导蛋白表达情况；泳道2：诱导全菌蛋白表达情况；泳道3：诱导上清中的AaLS-BPP蛋白，大小约21kDa；泳道4：诱导包涵体中蛋白表达情况。

B：AaLS-BPP纯化后蛋白质免疫印记结果，泳道1为AaLS-BPP。

图2为AaLS-BPP纳米颗粒纯化后的负染EM图像。

图3为不同处理组的疫苗免疫21天后细胞因子水平及抗体水平示意图；

其中：A Th1型(IL-2、IL-12、干扰素-γ)和Th2型(IL-4)细胞因子水平；B：免疫21天后各组IgG抗体水平；C：外周血淋巴细胞增殖情况。

图4免疫21天后各组增重情况示意图。

图5二免7天后细胞因子检测结果示意图；

其中：a：IL-2分泌水平；b：IL-4分泌水平；c：IL-12分泌水平；d：IFN-γ分泌水平。图6外周血淋巴细胞增殖能力检测示意图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

AaLS骨架承载蛋白的筛选和优化：

申请人对多组具有免疫增强的活性肽与AaLS骨架结合，发现法氏囊活性肽BSP和BPP(SEQ ID NO.6所示，由SEQ ID NO.5编码)能够表达；

进一步的，申请人发现，AaLS骨架中的两个抗原表位，插入相同的法氏囊活性肽可表达，插入不同的法氏囊活性肽，无法顺利表达；两个抗原表位，同时插入相同法氏囊活性肽较之于只插入一侧，表达量更高更稳定；

为了进一步提高AaLS-BPP融合蛋白的表达量，申请人将AaLS蛋白(WP_010880027.1，SEQ I D NO.8所示，由SEQ ID NO.7所示的多核苷酸编码)的第34、94、108位氨基酸进行突变，发现与未突变相比，蛋白表达量未有明显提升；将AaLS蛋白(WP010880027.1)的第28、79、91位氨基酸进行突变，突变后的AaLS蛋白为SEQ ID NO.4所示(编码其的多核苷酸为SEQ ID NO.3所示)，突变后，BPP蛋白表达量有明显提升，是未突变的表达量的2.34倍。

突变后，获得的重组AaLS-BPP融合肽的序列为SEQ ID NO.2所示。

实施例2：

AaLS-BPP的表达与纯化

为使法氏囊多肽BPP顺利表达以及提高表达量，对AaLS蛋白骨架第28、79、91位氨基酸进行突变，并在Linker基因序列与AaLS骨架N端之间增加一组6×His标签。

(1)重组AaLS-BPP融合肽基因重叠延伸PCR扩增

根据大肠杆菌偏嗜密码子设计重组AaLS-BPP融合肽基因，并针对该融合肽基因设计引物F1：5’-GatgaccctgaccggcAGCAGCAGCGGGTCCGGA-3’和F2：5’-TgccggtcagggtcatCATCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGT-3’，F3：5’-CatgaccctgaccggcGGATCGGGCTCTCATCACCA-3’，和F4：5’-CgccggtcagggtcatGCCTCCTCCTGAGCCTCCA-3’，然后进行SOE-PCR扩增；将PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳鉴定后,切下目的条带进行回收,回收产物中片段大小为612bp的为重组AaLS-BPP融合肽基因。

(2)携带重组AaLS-BPP融合肽基因的工程菌的构建

将重组AaLS-BPP融合肽基因和质粒载体pET28a进行酶切连接，连接产物转化E.coli DH5α并提取质粒进行鉴定，正确质粒命名为pET28a-AaLS-BPP；重组质粒pET28a-AaLS-BPP转化进入感受态大肠杆菌BL21(DE3)(唯地生物，EC1002)中，与其他品牌感受肽相比唯地生物所提供的BL21(DE3)感受态可用于各种多肽、蛋白表达文库的构建，具有较高的转化效率。筛选阳性克隆即为表达重组AaLS-BPP融合肽的工程菌。

(3)重组AaLS-BPP融合肽蛋白表达

将已验证的感受态大肠杆菌接种于含50mg/L卡那霉素的Luria-Bertani(LB)1.0L培养基中37℃培养。在OD600 nm吸光密度为0.5～0.6的条件下，用400μM IPTG诱导细胞表达蛋白，37℃诱导7小时。收集细胞，20mM Tris-HCl(pH＝8.6)重悬，高压破碎，离心(12000×g，30min)取上清。

(4)重组AaLS-BPP融合肽蛋白纯化

采用镍柱亲和层析纯化蛋白，即可获得单一的重组AaLS-BPP融合肽。操作步骤如下：

上样前，使用10CV的Binding Buffer以5mL/min的流速平衡镍柱；再以1mL/min的流速通过衡流泵加载到平衡后的Ni柱上，以梯度的Elution Buffer/Binding Buffer混合液洗脱Ni柱(经预实验确定为500mM咪唑)，流速为5mL/min，并监测OD280值，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液，经SDS-PAGE检测后确定目的蛋白所在；以10CV的Elution Buffer彻底洗脱Ni柱除去残余的柱结合蛋白而后用5-10CV的20％乙醇平衡Ni柱，取下Ni柱,于室温下保存。

纯化后的目的蛋白可以进一步浓缩透析以获得单一高浓度重组AaLS-BPP融合肽，并采用Bradford蛋白质定量试剂盒(TIANGEN，北京，中国)对所得蛋白的浓度进行测定，经换算每1L培养基表达28.4mg重组AaLS-BPP融合蛋白，SEQ ID NO.2所示。

蛋白质免疫印记结显示，AaLS-BPP能够在上清中稳定表达(图1中A)分别以单一蛋白质带的形式在21kDa和23kDa之间迁移(图1中B)。用透射电子显微镜证实了AaLS-BPP为球状和中空结构(图2)。这些结果表明，BPP成功与AaLS融合，并且可以自组装。

综上，法氏囊活性肽BPP构建于AaLS蛋白骨架上，形成融合蛋白后，能够稳定通过大肠杆菌表达系统进行表达，并借助His标签进一步纯化，从而得到稳定单一的目的蛋白，该方法对于法氏囊肽BPP的扩大生产及应用具有重要意义。

实施例3：

重组AaLS-BPP融合肽在禽大肠杆菌病灭活疫苗中的免疫增强作用

(1)疫苗的制备

用上述表达纯化后的AaLS-BPP融合肽与O78型禽致病性大肠杆菌灭活抗原(Vac)作为水相按照合适的体积比与油相HMT13佐剂采用低剪切搅拌器1000转/每分钟乳化15分钟后，经检测剂型为水包油包水，性质稳定，黏度合适即为成品苗(AaLS-BPP+Vac)，储存于4℃。

化学合成的法氏囊肽BPP(擎科生物，武汉)也通过该方法进行疫苗制备并储存(BPP+Vac)。

(2)免疫保护试验

免疫前对每羽鸡佩戴脚标，称重。每组免疫14日龄SPF鸡10羽，0.3ml/羽

实验一共分为4组：

PBS对照组：PBS作为水相与HMT13佐剂乳化，使用时，0.3ml/羽。

Vaccine组(禽致病性大肠杆菌灭活疫苗免疫组)：该疫苗在使用时，疫苗中的O78型禽致病性大肠杆菌灭活抗原为1.5×10⁹CFU/羽。

BPP+Vac组：该疫苗在使用时，疫苗中的BPP为100μg/羽，Vac(即O78型禽致病性大肠杆菌灭活抗原)为1.5×10⁹CFU/羽。

AaLS-BPP+Vac组：该疫苗在使用时，疫苗中的AaLS-BPP为100μg/羽，Vac(即O78型禽致病性大肠杆菌灭活抗原)为1.5×10⁹CFU/羽。

免疫21天后翅下静脉采血分离血清，采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验检测Th1型(IL-2、IL-12、干扰素-γ)和Th2型(IL-4)细胞因子的产生以及对淋巴细胞增殖的影响。免疫21天后翅下静脉采血分离血清通过间接ELISA检测IgG抗体水平。

免疫21天称重检查吸收情况，并通过胸部肌肉注射菌液攻毒(禽致病性大肠杆菌O78型菌株)2×10¹⁰CFU/羽，计算保护率，保护率＝未死亡鸡羽数/该组总试验鸡羽数。

结果显示，免疫21天后，注射部位吸收良好，增重正常，对鸡群生长无抑制作用(表1)。

免疫21天后，与对照组相比AaLS-BPP添加组能明显促进免疫鸡只体内IgG抗体水平升高(图3中B)。AaLS-BPP能显著诱导Th2型(IL-4)细胞因子的产生，对于Th1型细胞因子(IL-2、IL-12、IFN-γ)的诱导作用不显著(图3中A)。为了研究对淋巴细胞增殖的影响，免疫21天后从鸡体中采血，分离外周血淋巴细胞，制成淋巴细胞单细胞悬液，以ConA作为阳性对照，结果显示，AaLS-BPP免疫组显著提高了外周血淋巴细胞增殖能力(图3中C)。

免疫21天后进行攻毒(毒株是O78型禽致病性大肠杆菌，2.0×10¹⁰CFU/羽)，结果显示：添加有AaLS-BPP融合肽的免疫组对鸡只的保护率100％，显著高于PBS(0/10)和疫苗免疫对照组(6/10)保护率(表1)，并且在法氏囊活性肽BPP和AaLS骨架形成AaLS-BPP融合肽后，其保护效果、抗体水平及诱导细胞因子的产生都更加优于疫苗和化学合成法氏囊活性肽BPP免疫组。这些结果证实AaLS-BPP融合肽在鸡免疫中具有免疫调节活性。

表1免疫21天后禽大肠杆菌病灭活疫苗和不同免疫增强剂组保护效果

分组	黏度/cP	吸收情况	增重/g	保护率
					PBS	/	吸收完全	202.73±24.5	0/10
Vaccine	51.0	吸收良好	207.46±25.6	6/10
					BPP+Vac	54.5	吸收良好	201.49±21.89	7/10
AaLS-BPP+Vac	55.1	吸收良好	212.89±22.7	10/10

综上，重组AaLS-BPP融合肽按合适比例添加进入禽大肠杆菌病疫苗水相并和油相HMT13配制成疫苗，免疫试验鸡后，与各对照组相比，能够显著提高细胞免疫和体液免疫水平，提高保护率，进一步说明AaLS-BPP融合肽在鸡免疫中具有免疫调节活性，作为免疫增强剂具有广阔的应用前景。

实施例4：

重组AaLS-BPP融合肽在鸡新城疫-禽流感(H9亚型)-腺病毒(Ⅰ群，4型)三联灭活疫苗中的免疫增强作用

(1)疫苗的制备

用纯化后的AaLS-BPP与鸡新城疫-禽流感(H9亚型)-腺病毒(Ⅰ群，4型)灭活抗原作为水相按照合适的体积比与油相HMT13佐剂采用低剪切搅拌器1000转/每分钟乳化15分钟后即为成品苗(AaLS-BPP+Vac)，储存于4℃。

化学合成的法氏囊肽BPP(擎科生物，武汉)也通过该方法进行疫苗制备并储存(BPP+Vac)。

(2)免疫保护试验

免疫前对每羽鸡佩戴脚标，称重。每组免疫7日龄SPF鸡10羽，0.3ml/羽。

免疫程序为：7日龄进行一免，一免21天后进行第二次免疫。

实验分为4组：

PBS对照组：PBS作为水相与HMT13佐剂乳化，使用时，0.3ml/羽

Vaccine组(禽三联灭活疫苗免疫组)：该疫苗在使用时，疫苗中的鸡新城疫灭活抗原为10⁸EID₅₀/羽份、禽流感(H9亚型)灭活抗原为10⁶EID₅₀/羽份、腺病毒(Ⅰ群，4型)rFiber2重组蛋白为30μg/羽份。

BPP+Vac组：该疫苗在使用时，疫苗中的BPP为100μg/羽，Vac中的鸡新城疫灭活抗原为10⁸EID₅₀/羽份、禽流感(H9亚型)灭活抗原为10⁶EID₅₀/羽份、腺病毒(Ⅰ群，4型)rFiber2重组蛋白为30μg/羽份。

AaLS-BPP+Vac组：该疫苗在使用时，疫苗中的AaLS-BPP为100μg/羽，Vac中的鸡新城疫灭活抗原为10⁸EID₅₀/羽份、禽流感(H9亚型)灭活抗原为10⁶EID₅₀/羽份、腺病毒(Ⅰ群，4型)rFiber2重组蛋白为30μg/羽份。

第二次免疫14天后，对所有试验鸡进行攻毒，新城疫病毒(CVCC AV1611株，10⁵ELD₅₀)肌肉注射0.2ml病毒液，禽流感病毒(H9亚型，CVCC AV1554)静脉注射0.2ml(2×10⁶ELD₅₀)病毒液，腺病毒(1群，4型，CVCC AV211株)肌肉注射病毒液0.2ml(2×10⁵TCID₅₀)。

第一次免疫21天后翅下静脉采血分离血清测定新城疫病毒、禽流感病毒HI抗体效价以及通过ELISA检测禽腺病毒病的抗水平。第二次免疫7天后翅下静脉采血分离血清，采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验检测Th1型(IL-2、IL-12、干扰素-γ)和Th2型(IL-4)细胞因子的产生以及对淋巴细胞增殖的影响。

结果显示，第一次免疫21天后，注射部位吸收良好，增重正常(图4)。与疫苗免疫组相比AaLS-BPP融合肽添加组均能明显促进免疫鸡只新城疫和禽流感HI抗体效价以及腺病毒抗体水平升高，添加有化学合成法氏囊肽BPP免疫组产生的抗体水平低于融合肽免疫组(表2)。二免7天后细胞因子检测结果显示(图5)，AaLS-BPP显著调节Th1型(IL-2、IL-12、干扰素-γ)和Th2型(IL-4)细胞因子产生，AaLS-BPP免疫组显著提高了外周血淋巴细胞增殖能力(图6)。

二免14天后，对所有试验鸡进行攻毒，新城疫病毒攻毒后，对照组试验鸡全部死亡，疫苗免疫组(5/10)保护率50％、化学合成法氏囊肽BPP免疫组(7/10)对试验鸡保护率均70％，AaLS-BPP融合肽免疫组均未死亡保护率100％(表2左部)。

禽流感病毒攻毒后，PBS对照组病毒分离均为阳性，保护率为0％，疫苗免疫组病毒分离6/10阴性，化学合成法氏囊肽BPP免疫组分别7/10病毒分离阴性，保护率为70％；AaLS-BPP融合肽免疫组，试验鸡禽流感病毒分离均为阴性，保护率100％(表2中部)。

腺病毒(1群，4型)攻毒后，AaLS-BPP融合肽免疫组试验鸡死亡1只保护率90％，显著高于各对照组保护率(表2右部)。说明AaLS-BPP融合肽添加进禽三联灭活疫苗免疫后可使鸡群具有良好的免疫效力，具有成为免疫增强剂的潜力。

表2禽三联灭活疫苗免疫后抗体水平及保护效率

综上，重组AaLS-BPP融合肽按合适比例添加进入禽三联灭活疫苗水相中并和油相HMT13配制成疫苗，免疫试验鸡后，与各对照组相比，能够显著提高免疫鸡各病毒抗体效价，Th1型和Th2型细胞因子分泌水平以及外周血淋巴细胞增殖能力。对免疫鸡能达到不低于90％的保护率，显著高于其他对照组保护水平，进一步说明AaLS-BPP融合肽在鸡免疫中具有免疫调节活性，作为免疫增强剂具有广阔的应用前景。

Claims (5)

1. 一种人工合成的重组AaLS-BPP融合肽，所述融合肽为SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述的融合肽的多核苷酸。

3. 根据权利要求2所述的多核苷酸，为SEQ ID NO.1所示。

4.权利要求1所述的融合肽的制备方法，包括：

1）针对重组AaLS-BPP融合肽基因，设计引物F1：5’- GatgaccctgaccggcAGCAGCAGCGGGTCCGGA-3’和F2：5’- TgccggtcagggtcatCATCCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGT-3’，F3：5’-CatgaccctgaccggcGGATCGGGCTCTCATCACCA-3’，和F4：5’- CgccggtcagggtcatGCCTCCTCCTGAGCCTCCA-3’，然后进行SOE-PCR扩增；回收SEQ ID NO.1所示多核苷酸产物；

（2）将SEQ ID NO.1所示多核苷酸和质粒载体pET28a进行酶切连接，获得的质粒命名为pET28a-AaLS-BPP；重组质粒pET28a-AaLS-BPP转化进入感受态大肠杆菌BL21(DE3)，所述的感受态大肠杆菌BL21(DE3)来自于唯地生物，货号为EC1002。

5. 重组AaLS-BPP融合肽或者编码该融合肽的基因在制备鸡的免疫增强剂中的应用，所述的融合肽为SEQ ID NO.2所示。