CN116121277A - 编码新型冠状病毒的结构蛋白的核酸分子及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种编码新型冠状病毒的结构蛋白的核酸分子及其应用，涉及基因工程技术领域。本发明公开的核酸分子其碱基序列如SEQ IDNO.2‑4中的任意一者所示。本发明提供的核酸分子经过密码子优化，能够更高效地表达新型冠状病毒的结构蛋白，为新型冠状病毒疫苗的开发奠定了基础。

Description

编码新型冠状病毒的结构蛋白的核酸分子及其应用
本分案申请是基于申请号为2020116290457，申请日为2020年12月31日，发明名称为“编码新型冠状病毒的结构蛋白的核酸分子以及新型冠状病毒疫苗”的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及编码新型冠状病毒的结构蛋白的核酸分子及其应用。
背景技术
2019新型冠状病毒于2020年1月12日被世界卫生组织正式命名为2019-nCoV，其基因组序列也被相关科学家分析出来并发布于NCBI。但目前新型冠状病毒野生型的E(smallenvelope)，M(membrane)，N(nucleocapsid)和S(Spike)等四种结构蛋白的基因序列在真核细胞中的蛋白表达量十分低，使得疫苗生产变的更加困难。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种编码新型冠状病毒的结构蛋白的核酸分子及其应用。本发明提供的核酸分子经过密码子优化，能够更高效地表达新型冠状病毒的结构蛋白，该核酸分子可用于制备结构蛋白、新型冠状病毒样颗粒以及相关疫苗。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供一种编码新型冠状病毒的结构蛋白的核酸分子，其碱基序列如SEQ ID NO.1-4中的任意一者所示。
其中，SEQ ID NO.1编码E蛋白，SEQ ID NO.2编码M蛋白，SEQ IDNO.3编码N蛋白，SEQ ID NO.4编码S蛋白。
本发明通过对野生型E蛋白，M蛋白，N蛋白和S蛋白的四种基因的核苷酸序列分别进行密码子优化，优化后得到的核酸分子序列能够在真核生物细胞中高效表达；利用本发明提供的核酸分子，能够快速、大量地制备新型冠状病毒的E蛋白、M蛋白、N蛋白和S蛋白4种结构蛋白，为新型冠状病毒的疫苗生产奠定了基础。
另一方面，本发明提供一种载体，其含有如上所述的核酸分子。
在可选的实施方案中，所述载体为PCI或pCDNA3.1(+)。
在可选的实施方案中，所述核酸分子位于所述载体的KpnI和NotI酶切位点之间。
需要说明的是，本领域技术人员可以根据需要，选择合适的载体，无论何种载体，只要其含有本发明上述的核酸分子即属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供一种重组细胞，其含有如上所述的核酸分子，或者含有如上所述的载体。
另一方面，本发明提供一种新型冠状病毒的结构蛋白的制备方法，其包括：将如上所述的载体转染宿主细胞进行表达，从培养产物中提取分离得到所述结构蛋白。
在可选的实施方案中，所述宿主细胞为真核生物细胞。
进一步地，在可选的实施方案中，所述真核生物细胞选自HEK293T细胞。
本发明的宿主细胞包括但不限于HEK293T细胞，其他类型被转染后也能够产生上述结构蛋白的细胞也属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供如上所述的核酸分子以及如上所述的载体在制备新型冠状病毒样颗粒或新型冠状病毒疫苗中的应用。
病毒样颗粒(VLPs)是不含病毒核酸的空壳结构，在形态结构上与天然的病毒颗粒相似，由于其不含有病毒完整的遗传物质，因此不具有感染性，但具有和新冠病毒相似的免疫原性，可以作为高效的疫苗，其中有些已作为疫苗成功应用于临床。但由于新型冠状病毒野生型的E(small envelope)，M(membrane)，N(nucleocapsid)和S(Spike)基因在真核细胞系中的表达量很低，导致VLPs包装效率很低。本发明通过利用上述优化后的E(smallenvelope)，M(membrane)，N(nucleocapsid)和S(Spike)核酸分子序列重组表达质粒进行VLPs的病毒包装，可大幅度提高其产量，也为新型冠状病毒的疫苗研发提供了另一条途径。
本发明提供的核酸分子能够高效地表达新型冠状病毒的结构蛋白，基于此，这些核酸分子可以用于制备新型冠状病毒样颗粒，且采用本发明所提供的核酸分子制备新型冠状病毒样颗粒，具有更高的产量，优化的蛋白组合有更高的免疫原性，同时该新型冠状病毒样颗粒能够刺激机体产生针对新型冠状病毒的抗体，因此，本发明提供的新型冠状病毒样颗粒可以作为新型冠状病毒疫苗。
在可选的实施方案中，所述新型冠状病毒样颗粒含有E蛋白、M蛋白、N蛋白和S蛋白中的至少一种。
在可选的实施方案中，所述新型冠状病毒样颗粒含有E蛋白、M蛋白、N蛋白和S蛋白。
另一方面，本发明提供一种新型冠状病毒样颗粒，其由如上所述的应用得到。
本发明所提供的新型冠状病毒样颗粒结构稳定，具有抗原性，用该新型冠状病毒样颗粒能够刺激机体产生免疫反应，该新型冠状病毒样颗粒具有作为疫苗的潜力。
另一方面，本发明提供一种针对新型冠状病毒的疫苗，其包括作为活性成分的如上所述的新型冠状病毒样颗粒。
方案1.一种编码新型冠状病毒的结构蛋白的核酸分子，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.1-4中的任意一者所示。
方案2.一种载体，其特征在于，其含有方案1所述的核酸分子。
方案3.根据方案2所述的载体，其特征在于，所述载体为PCI或pCDNA3.1(+)；优选地，所述核酸分子位于所述载体的KpnI和NotI酶切位点之间。
方案4.一种重组细胞，其特征在于，其含有方案1所述的核酸分子，或者含有方案2或3所述的载体。
方案5.一种新型冠状病毒的结构蛋白的制备方法，其特征在于，其包括：将方案2或3所述的载体转染宿主细胞进行表达，从培养产物中提取分离得到所述结构蛋白。
方案6.根据方案5所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为真核生物细胞；优选地，所述真核生物细胞选自HEK293T细胞。
方案7.如方案1所述的核酸分子、方案2或3所述的载体在制备新型冠状病毒样颗粒或新型冠状病毒疫苗中的应用。
方案8.根据方案7所述的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒样颗粒含有E蛋白、M蛋白、N蛋白和S蛋白中的至少一种；
优选的，所述新型冠状病毒样颗粒含有E蛋白、M蛋白、N蛋白和S蛋白。
方案9.一种新型冠状病毒样颗粒，其特征在于，其由方案7或8所述的应用得到。
方案10.一种针对新型冠状病毒的疫苗，其特征在于，其包括作为活性成分的如方案9所述的新型冠状病毒样颗粒。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为E,M,N,S四种基因优化前后在不同表达时间点的蛋白表达量，wtE，wtM，wtN，wtS为野生型的四种结构蛋白序列，coE，coM，coN，coS为优化后的四种结构蛋白序列。
图2为采用优化前后的E,M,N,S四种基因生产的VLPs产量对比。
图3为将四种优化后的序列任意替换成相应的野生型所生产的VLPs产量对比。
图4为不同方式注射不同剂量的VLPs的小鼠经攻毒后小鼠体内所含的RNA拷贝数；图中横坐标上，1-实验组1；2-实验组2；3-实验组3；4-实验组4。
图5为本发明优化后的coE序列与优化后的coE-JR序列的蛋白表达对比。
图6为质粒载体PCI和pCDNA3.1(+)的质粒图谱。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
通过NCBI查找野生型新型冠状病毒的E基因，M基因，N基因和S基因的序列，并分析其密码子偏好性，GC含量以及CPG岛等参数，依据人源密码子偏好性等参数分别对四个基因进行密码子优化，优化后和野生型的序列如下：
优化的E基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；野生型E基因的核苷酸序列如SEQID NO.5所示；
优化的M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；野生型M基因的核苷酸序列如SEQID NO.6所示；
优化的N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；野生型N基因的核苷酸序列如SEQID NO.7所示；
优化的S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；野生型S基因的核苷酸序列如SEQID NO.8所示。
实施例2
采用基因合成获得上述目的基因，并将其重新克隆至表达载体PCI(载体图谱见图6)上，本发明分别取2μg目的基因与载体，使用Kpn I和Not I两个限制性内切酶于37℃，3-4h进行酶切，胶回收获取目的基因和载体，将目的基因与载体按照摩尔质量3：1，并利用T4连接酶于16℃3-4h进行连接，再将其转化至DH5α菌株中，挑单克隆并提取质粒，最终通过酶切鉴定以及Sanger测序法对其进行鉴定。然后将重组表达质粒PCI-coE，PCI-coM，PCI-coN和PCI-coS以及野生型PCI-wtE，PCI-wtM，PCI-wtN和PCI-wtS通过磷酸钙转染分别转染至HEK293T细胞并进行瞬时表达，37℃，5％CO2环境中培养8h，换新鲜的DMEM(含10％FBS,1％双抗)，37℃，5％CO2继续培养至并24h，48h，72h收集细胞，并使用RIPA(强)裂解液提取总蛋白，BCA法对总蛋白进行定量，并结合SDS-PAGE电泳和Western blot等方法对优化的基因进行蛋白表达功能的验证，发现优化后的E(small envelope)，M(membrane)，N(nucleocapsid)和S(Spike)四种基因的蛋白表达量均高于野生型的E(small envelope)，M(membrane)，N(nucleocapsid)和S(Spike)基因(见图1)。
从图1可以看出，与野生型基因序列相比较，本发明实施例提供的优化后E基因，M基因，N基因和S基因序列(图1中分别对应是coE、coM、coN、coS)能够在真核生物细胞如HEK293T细胞中高效表达，约为野生型基因序列蛋白表达量的2-20倍。同时发现由于E蛋白的表达对细胞有一定毒性，因此转染E质粒的细胞在72h时存活率较低，导致72h时coE蛋白表达不高。
实施例3
VLPs的制备
VLPs采用磷酸钙转染法将四种重组表达质粒PCI-coE，PCI-coM，PCI-coN，PCI-coS或四种野生型质粒PCI-wtE，PCI-wtM，PCI-wtN，PCI-wtS按照质量比1：1：1：1的比例共转染至HEK293T细胞中，37℃，5％ CO2环境中培养8h，换新鲜的DMEM(含10％ FBS,1％双抗)，37℃，5％ CO2继续培养至48h，收集上清，5000rpm，4℃环境下离心15min，取上清，再经0.45μM滤膜过滤，25000rpm，4℃环境下超速离心2h 30min，弃上清，使用PBS将沉淀溶解，最终使VLPs浓缩200倍，再通过银染和western blot等方法对优化(coVLPs)和野生型(wtVLPs)的VLPs产量进行对比，发现使用优化后的E(small envelope)，M(membrane)，N(nucleocapsid)和S(Spike)四种基因所包装VLPs产量远高于野生型的E(smallenvelope)，M(membrane)，N(nucleocapsid)和S(Spike)基因所包装的VLPs(见图2)。
本实施例也利用M、N和E蛋白按照质量比1：1：1的比例采用相同的转染和纯化策略也可制备相应的病毒样颗粒(NEM)，在其他的实施例中，根据不同目的，不同的结构蛋白组合也可生产出所需的由不同蛋白组成的病毒样颗粒。
为进一步确认优化后的E(small envelope)，M(membrane)，N(nucleocapsid)和S(Spike)四种基因中E基因的优化对VLPs的包装具有较大的影响，本发明采用磷酸钙转染法将包装VLPs的四种重组质粒PCI-coE，PCI-coM，PCI-coN和PCI-coS逐一换成野生型质粒PCI-wtE，PCI-wtM，PCI-wtN和PCI-wtS，即wtE-VLPs(PCI-wtE，PCI-coM，PCI-coN和PCI-coS)，wtM-VLPs(PCI-coE，PCI-wtM，PCI-coN和PCI-coS)，wtN-VLPs(PCI-coE，PCI-coM，PCI-wtN和PCI-coS)，wtS-VLPs(PCI-coE，PCI-coM，PCI-coN和PCI-wtS)，按照质量比1：1：1：1的比例共转染至HEK293T细胞中，37℃，5％ CO2环境中培养8h，换新鲜的DMEM(含10％ FBS,1％双抗)，37℃，5％ CO2继续培养至48h，收集上清，按照上述同样的方法，最终使VLPs浓缩200倍。通过SDS-PAGE电泳和western blot等方法对优化(coVLPs)，野生型(wtVLPs)，以及逐一替换成野生型(wtE-VLPs，wtM-VLPs，wtN-VLPs，wtS-VLPs)的VLPs产量进行对比，结果显示将优化后的E改变成野生型的E后，对VLPs的包装产量的影响很大(见图3)。说明优化后E基因序列对VLPs的包装产量具有更为明显的提高作用。
从图2可以看出，与磷酸钙共转染四个野生型质粒所制备的VLPs产量(图2中对应wt)相比较，采用本发明实施例提供的四种质粒在真核生物细胞如HEK293T细胞所制备的VLPs产量(图2中对应co)中更高，约为野生型VLPs产量的2-10倍。
实施例3
VLPs作为疫苗的应用
小鼠免疫程序
1.试验原材料及动物
(1)抗原：由不同蛋白组成的新冠VLPs病毒样颗粒，由实施例2产生分别是SNEM和NEM。
(2)佐剂：铝佐剂，浓度12.74mg/mL。
2.试验步骤：
使用腹腔(i.p)注射或肌肉注射(i.m)两种方式将实施例2所生产的VLPs与铝佐剂混合，分别按照不同的剂量注射至雌性hACE2-KI/NIFDC小鼠模型体内进行三次免疫，间隔时间分别7天(第一次与第二次之间)和21天(第二次与第三次之间)。动物分为四个实验组：
实验组1：i.m SNEM 6μg(一次免疫)+i.m SNEM 6μg(二次免疫)+i.m SNEM 12μg(三次免疫)(n＝3)；
实验组2：i.m SNEM 3μg(一次免疫)+i.m SNEM 3μg(二次免疫)+i.m SNEM 12μg(三次免疫)(n＝3)；
实验组3：i.m NEM 3μg(一次免疫)+i.m NEM 3μg(二次免疫)+i.mNEM 12μg(三次免疫)(n＝2)；
实验组4：i.p SNEM 3μg(一次免疫)+i.p SNEM 3μg(二次免疫)+i.pSNEM 12μg(三次免疫)(n＝2)。
免疫后42天，小鼠通过滴鼻方式将SARS-CoV-2引入至小鼠体内，对其进行攻毒实验，攻毒5天后，用RT-qPCR方法检测小鼠肺组织中SARS-CoV-2的病毒载量，发现腹腔注射VLPs(实验组4)可以达到抑制新冠病毒感染的效果，其中一只小鼠比实验组1及实验组3中的小鼠降低2个Log10左右，约100倍(图4中对应4)；同时肌肉注射两次3μg和1次12μg VLPs的实验组2也可以达到抑制新冠病毒感染的效果，其中一只小鼠可以比实验组1及实验组3中的小鼠降低2个Log10左右，约100倍(图4中对应2)。由于不含有S的VLP实验组3的保护效果不佳(图4中对应3)，说明含S蛋白的VLPs能够更好刺激小鼠体内产生针对新型冠状病毒的抗体。
对比例1
为进一步确定优化E(small envelope)对于VLPs的包装至关重要，通过比较其他E基因序列与本发明的优化后E基因(coE-LY)的蛋白表达功能，发现在两种载体PCI和pCDNA3.1(+)(质粒图谱见图6)上，本发明实施例提供的E基因的蛋白表达量均更高，约为coE-JR的2-4倍(见图5)，coE-JR的具体基因序列(SEQ ID NO.9)如下：
atgtacagcttcgtgagcgaggagaccggcacactgattgtgaactccgtgctgctcttcctggccttcgtggtgttcctgctcgtgacactcgccattctgaccgccctcagactgtgcgcctactgctgcaacattgtgaacgtgtccctggtgaagccatctttctacgtgtactccagagtgaagaacctcaacagctctagggtgcccgacctcctggtgtga。
此外，本发明实施例1提供的E基因序列(SEQ ID NO.1)、M基因序列(SEQ IDNO.2)、N基因(SEQ ID NO.3)序列、S基因(SEQ ID NO.4)的表达水平也各自优于对于其他密码子优化序列，例如其他E基因序列(SEQ ID NO.10)、其他M基因序列(SEQ ID NO.11)、其他N基因序列(SEQ ID NO.12)、其他S基因序列(SEQ ID NO.13)。
综上，本发明实施例通过使用密码子优化新型冠状病毒的E(small envelope)，M(membrane)，N(nucleocapsid)和S(Spike)四种基因，均获得了能够高效表达这四种蛋白的基因序列(coE,coM,coN,coS，见图1)，可提高这四种蛋白在真核细胞中的表达产量，并使用其包装VLPs，大幅度增高VLPs产量。密码子优化后的E(small envelope)，M(membrane)，N(nucleocapsid)和S(Spike)序列具有以下优势：(1)优化后的E(small envelope)，M(membrane)，N(nucleocapsid)和S(Spike)的蛋白表达量高，可更高效地纯化出这四种结构蛋白，以供科学研究使用及疫苗研究；(2)根据人的密码子偏好性对新冠病毒的E(smallenvelope)，M(membrane)，N(nucleocapsid)和S(Spike)基因进行密码子优化，最大程度上保证了蛋白的产量及活性，为疫苗的开发奠定了基础；(3)使用优化后的四种基因的重组质粒包装VLPs，使其产量增高，为疫苗研发提供了更大的可能性；(4)小鼠注射经密码子优化后基因所包装的VLPs，刺激机体产生免疫反应，可有效遏制新冠病毒的感染，其可以作为新型冠状病毒的疫苗。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种编码新型冠状病毒的结构蛋白的核酸分子，其特征在于，其碱基序列如SEQ IDNO.2-4中的任意一者所示。
2.一种载体，其特征在于，其含有权利要求1所述的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体为PCI或pCDNA3.1(+)。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述核酸分子位于所述载体的KpnI和NotI酶切位点之间。
5.一种重组宿主细胞，其特征在于，其含有权利要求1所述的核酸分子，或者含有权利要求2-4任一项所述的载体。
6.一种新型冠状病毒的结构蛋白的制备方法，其特征在于，其包括：将权利要求2-4任一项所述的载体转染宿主细胞进行表达，从培养产物中提取分离得到所述结构蛋白。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为真核生物细胞。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述真核生物细胞选自HEK293T细胞。
9.权利要求1所述的核酸分子、权利要求2-4任一项所述的载体在制备新型冠状病毒样颗粒或新型冠状病毒疫苗中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述新型冠状病毒样颗粒含有M蛋白、N蛋白和S蛋白中的至少一种。
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