JP7362819B2 - 安定化された可溶性融合前rsv fタンパク質 - Google Patents
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Description
および、例えばワクチンとしてのその使用に関する。
と考えられている気道の伝染性が高い小児病原体である。2歳未満の小児では、RSVは
呼吸器感染症による入院の約50%を占め、入院のピークは月齢2~4ヶ月で生じる。ほ
とんどすべての小児が2歳までにRSV感染を経験し、生涯にわたる反復感染は自然免疫
の低さに起因すると報告されている。高齢者では、RSV疾患の負担は、一般的なインフ
ルエンザA感染によって引き起こされるものと類似している。
のエンベロープウイルスのように、宿主細胞膜とウイルス膜の融合を必要とする。RSV
の場合、保存的な融合タンパク質(RSV Fタンパク質)が、ウイルスと宿主細胞の細
胞膜を融合させる。パラミクソウイルス研究に基づく現行のモデルでは、RSV Fタン
パク質は、最初に、「融合前」コンフォメーションにフォールディングする。準安定な構
造が、安定化する中和抗体Fabフラグメントとの複合体で最近解明された(McLel
lan et al.,Science 340(6136):1113-7,2013
)。細胞侵入中に、融合前コンフォメーションは、リフォールディングし、その「融合後
」コンフォメーションにコンフォメーション変化する(McLellan,J.Viro
l 85(15):7788-96,2010;Swanson,PNAS 108(2
3):9619-24,2011)。したがって、RSV Fタンパク質は、準安定な形
態(融合前コンフォメーション)に最初フォールディングすることにより、不可逆的なタ
ンパク質リフォールディングと膜並置を連結することによる膜融合を駆動する準安定なタ
ンパク質であり、これは、その後、よりエネルギーの低いコンフォメーションへの不連続
的/段階的なコンフォメーション変化を起こす。これらの観察は、融合前および融合後の
RSV Fタンパク質が抗原的に異なることを示唆する(Calder,L.J.et
al.Virology 271,122-131(2000))。RSV-Fの電子顕
微鏡から、融合前と融合後のF三量体との間に大きな構造的差異が存在することが明らか
であり、これは結晶学によって最近確認されており(McLellan J.S.et
al.Science 340(6136):1113-7(2013)およびMcLe
llan J.S.et al.Science 342(6158):592-8(2
013))、RSV陽性個体の血清中の中和抗体のほとんどが融合前Fに結合しているこ
とが示された(Ngwuta et.al.,Science Translation
al Medicine,7(309):309ra162,1-9)。
タンパク質に基づくワクチン候補は、例えば安定性、純度、再現性、および効力に関する
問題のために失敗している。上記の指摘のように、結晶構造から、融合前状態と融合後状
態との間にコンフォメーションの大きな変化があることが明らかになっている。再配列の
規模から、RSV-Fの融合後コンフォメーションに対する抗体の一部しか、ウイルス表
面上で融合前スパイクの生得コンフォメーションと交差反応できないことが示唆された。
したがって、RSVに対するワクチンを作製する努力が、RSV Fタンパク質の融合前
形態を含有するワクチンの開発に集中している(例えば、国際公開第201011497
45号パンフレット、国際公開第2010/1149743号パンフレット、国際公開第
2009/1079796号パンフレット、国際公開第2012/158613号パンフ
レットを参照)。しかしながら、これらの努力によっても、ヒトで試験するための候補と
して使用することができる安定な融合前RSV Fタンパク質を得るまでに至っていない
。
ンフォメーション状態のRSV Fタンパク質を含むワクチンおよび方法が依然として要
望されている。本発明は、RSVに対するそのようなワクチンおよび安全で効果的にワク
チン接種するための方法を提供することを目的とする。
すなわち、融合前コンフォメーションで安定化された可溶性形態(すなわち、膜に結合し
ていない)組換えRSV Fタンパク質を提供するものであり、このRSV Fタンパク
質は、配列番号1、配列番号2および配列番号3からなる群から選択されるアミノ酸配列
またはその断片を含む。
のFタンパク質に特異的な少なくとも1つのエピトープを含み、その少なくとも1つのエ
ピトープは、配列番号4の重鎖CDR1領域、配列番号5重鎖CDR2領域、配列番号6
の重鎖CDR3領域および配列番号7の軽鎖CDR1領域、配列番号8の軽鎖CDR2領
域、および配列番号9の軽鎖CDR3領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体、なら
びに/または配列番号10の重鎖CDR1領域、配列番号11の重鎖CDR2領域、配列
番号12の重鎖CDR3領域および配列番号13の軽鎖CDR1領域、配列番号14の軽
鎖CDR2領域、および配列番号15の軽鎖CDR3領域を含む融合前特異的モノクロー
ナル抗体によって認識される。
核酸分子、およびそのような核酸分子を含むベクターを提供する。
しくは免疫原性組成物、前記RSV融合前Fタンパク質をコードする核酸分子、およびR
SV Fタンパク質に対する免疫応答の誘導におけるその使用、特にワクチンとしてのそ
の使用に関する。本発明はまた、対象に抗呼吸器合胞体ウイルス(RSV)免疫応答を誘
導するための方法であって、有効量の融合前RSV Fタンパク質、前記RSV Fタン
パク質をコードする核酸分子、および/または前記核酸分子を含むベクターを対象に投与
することを含む方法に関する。好ましくは、誘導される免疫応答は、RSVに対する中和
抗体および/またはRSVに対する防御免疫を特徴とする。特定の態様では、本発明は、
対象に抗呼吸器合胞体ウイルス(RSV)Fタンパク質中和抗体を誘導するための方法で
あって、融合前RSV Fタンパク質、前記RSV Fタンパク質をコードする核酸分子
、および/または前記核酸分子を含むベクターを含む有効量の免疫原性組成物を対象に投
与することを含む方法に関する。
の融合に関与し、感染に必要とされる。RSV F mRNAはF0と呼ばれる574の
アミノ酸前駆体タンパク質に翻訳され、これは小胞体中のシグナルペプチダーゼによって
除去されるN末端の26アミノ酸からなるシグナルペプチド配列を含む。F0は、トラン
スゴルジにおいて、細胞フーリン様プロテアーゼにより2つの部位(アミノ酸残基109
/110間および136/137間)で切断され、アミノ酸残基110~136を含む短
いグリコシル化介在配列(p27領域とも呼ばれる)が除去され、F1およびF2と称さ
れる2つのドメインまたはサブユニットが生成される。F1ドメイン(アミノ酸残基13
7~574)は、そのN末端に疎水性融合ペプチドを有し、C末端に膜貫通(TM)(ア
ミノ酸残基530~550)領域および細胞質領域(アミノ酸残基551~574)を有
する。F2ドメイン(アミノ酸残基27~109)は、2つのジスルフィド架橋によりF
1に共有結合する。F1-F2ヘテロ二量体は、ビリオン中でホモ三量体として集合して
いる。
ワクチン製造に有望な1つのアプローチは、精製されたRSV Fタンパク質に基づくサ
ブユニットワクチンである。しかしながら、このアプローチの場合、精製されたRSV
Fタンパク質は、RSV Fタンパク質の融合前状態のコンフォメーションに類似したコ
ンフォメーションにあり、経時的に安定であり、かつ十分な量で製造できることが望まし
い。加えて、サブユニットベースのワクチンの場合、RSV Fタンパク質を、膜貫通(
TM)領域および細胞質領域の欠失により短縮して、可溶性分泌型Fタンパク質(sF)
を生成させる必要がある。TM領域は膜アンカリングおよび三量体形成を担うため、アン
カーなしの可溶性Fタンパク質は、完全長タンパク質よりもかなり不安定であり、融合後
最終状態に容易にリフォールディングするであろう。したがって、高い発現レベルおよび
高い安定性を示す安定な融合前コンフォメーションの可溶性Fタンパク質を得るために、
融合前コンフォメーションを安定化する必要がある。
に国際公開第2014/174018号パンフレットおよび国際公開第2014/202
570号パンフレットに記載されている。本発明によるRSV Fタンパク質は、2つの
さらなる変異と組み合わせて、先に記載された変異の特有かつ特異的なサブセットを含む
。本発明によれば、本発明の変異のこの特有の組み合わせが、RSV Fタンパク質発現
レベルを増加させ、かつ融合前コンフォメーションの安定をもたらすことが示された。
合前コンフォメーションで安定化された可溶性RSV Fタンパク質、またはその断片を
提供する。本発明によるRSV Fタンパク質は、配列番号1、配列番号2および配列番
号3からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
、ヘテロ三量体化ドメインと共に特有の変異の組み合わせを導入した。本発明の安定な融
合前RSV Fタンパク質は、融合前コンフォメーションで存在する、すなわち、それら
は、融合前コンフォメーションFタンパク質に特異的な少なくとも1つのエピトープを含
む(示す)。融合前コンフォメーションFタンパク質に特異的なエピトープは、融合後コ
ンフォメーションでは現れないエピトープである。いかなる特定の理論にも拘束されるこ
とを望むものではないが、RSV Fタンパク質の融合前コンフォメーションは、天然R
SVビリオンで発現するRSV Fタンパク質のものと同じエピトープを含有することが
でき、したがって、予防的中和抗体を誘発する利点を備え得ると考えられる。
号4の重鎖CDR1領域、配列番号5の重鎖CDR2領域、配列番号6の重鎖CDR3領
域および配列番号7の軽鎖CDR1領域、配列番号8の軽鎖CDR2領域、および配列番
号9の軽鎖CDR3領域(以下、CR9501という)を含む融合前特異的モノクローナ
ル抗体、ならびに/または配列番号10の重鎖CDR1領域、配列番号11の重鎖CDR
2領域、配列番号12の重鎖CDR3領域および配列番号13の軽鎖CDR1領域、配列
番号14の軽鎖CDR2領域、および配列番号15の軽鎖CDR3領域(CR9502と
いう)を含む融合前特異的モノクローナル抗体により認識される、少なくとも1つのエピ
トープを含む。CR9501およびCR9502は、それぞれ抗体58C5および30D
8の重鎖および軽鎖可変領域を含み、したがって、それらの抗体の結合特異性を有するが
、それらの抗体は、融合後コンフォメーションではなく、融合前コンフォメーションのR
SV Fタンパク質に特異的に結合することが以前より示されている(国際公開第201
2/006596号パンフレットに開示されているように)。
配列は、5’から3’の方向で提示され、アミノ酸配列は、N末端からC末端の方向で提
示される。
アミノ末端(例えば、シグナル配列を切断することにより)およびカルボキシ末端欠失の
いずれかまたは両方から生じ得る。この断片は、Fタンパク質の免疫学的に活性な断片、
すなわち、対象に免疫応答を生じさせる部分を含むように選択され得る。これは、当業者
にはすべてルーチン的である、インシリコ、インビトロ、および/またはインビボの方法
を使用して容易に決定することができる。
は配列番号3のアミノ酸1~26に対応する、リーダー配列またはシグナルペプチドとも
呼ばれるシグナル配列を含む。シグナル配列は、通常、分泌経路に向かう、新たに合成さ
れた大部分のタンパク質のN末端に存在する短い(例えば、5~30アミノ酸長)アミノ
酸配列であり、一般に、シグナルペプチダーゼによって切断されて、遊離のシグナルペプ
チドと成熟タンパク質を生成する。
る核酸分子を提供する。
哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞における発現用にコドン最適化されている。コドン最
適化の方法は既知であり、これまでに記述されている(例えば、国際公開第96/093
78号パンフレット)。野生型配列と比べて少なくとも1つの好ましくないコドンがより
好ましいコドンで置換される場合に、配列はコドン最適化されると考えられる。本明細書
では、好ましくないコドンとは、生物において、同じアミノ酸をコードする別のコドンと
比べて使用される頻度が低いコドンであり、より好ましいコドンとは、生物において、好
ましくないコドンと比べて使用される頻度が高いコドンである。特定の生物におけるコド
ン使用の頻度は、コドン頻度表、例えば、http://www.kazusa.or.
jp/codonに見出すことができる。好ましくは、2つ以上の好ましくないコドン、
好ましくは、ほとんどまたはすべての好ましくないコドンが、より好ましいコドンに置き
換えられる。好ましくは、生物で最も高頻度に使用されるコドンがコドン最適化配列に使
用される。好ましいコドンに置き換えられると、概して発現が高くなる。
じタンパク質をコードし得ることは当業者に理解されるであろう。また、当業者が慣例の
技術を使用して、タンパク質を発現させることになる任意の特定の宿主生物のコドン使用
を反映するように、核酸分子がコードするタンパク質配列に影響を及ぼさないヌクレオチ
ド置換を行い得ることも、理解される。したがって、特に指定しない限り、「アミノ酸配
列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列
をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびRNAをコードするヌ
クレオチド配列はイントロンを含んでも含まなくてもよい。
A合成により新規に作製することができ、それは、DNA合成および/または分子クロー
ニングの分野の事業を有するサービス会社(例えば、GeneArt、GenScrip
ts、Invitrogen、Eurofins)により、慣例の手順を使用して行われ
得る。
む。
では、本発明による核酸分子はベクターの一部である。このようなベクターは、当業者に
よく知られた方法により容易に操作することができ、例えば、原核細胞および/または真
核細胞において複製できるように設計することができる。加えて、多くのベクターは、真
核細胞の形質転換に使用することができ、そのような細胞のゲノムに全体としてまたは部
分的に組み込まれ、その結果、そのゲノムに所望の核酸を含む安定な宿主細胞が得られる
。使用されるベクターは、DNAのクローニングに適し、目的の核酸の転写に使用するこ
とができるものであれば、いかなるベクターでもよい。当業者は、好適な発現ベクターを
選択し、本発明の核酸配列を機能的に挿入することができる。
を形成する。融合前RSV Fタンパク質は、宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスタ
ー卵巣(CHO)細胞、腫瘍細胞株、BHK細胞、ヒト細胞株、例えばHEK293細胞
、PER.C6細胞、もしくは酵母、真菌、昆虫細胞など、またはトランスジェニック動
物もしくはトランスジェニック植物における分子の発現を含む組換えDNA技術によって
生成することができる。ある実施形態では、細胞は多細胞生物由来であり、ある実施形態
では、細胞は脊椎動物または無脊椎動物起源である。ある実施形態では、細胞は哺乳動物
細胞である。ある実施形態では、細胞はヒト細胞である。一般に、宿主細胞における、本
発明の融合前RSV Fタンパク質などの組換えタンパク質の生成は、発現可能形式でそ
のタンパク質をコードする異種核酸分子の宿主細胞への導入、核酸分子の発現に資する条
件下での細胞の培養、および前記細胞におけるタンパク質発現を可能にすることを含む。
発現可能形式でタンパク質をコードする核酸分子は、発現カセットの形態であってもよく
、通常、エンハンサー、プロモーター、ポリアデニル化シグナルなど、核酸の発現をもた
らすことができる配列を必要とする。当業者は、宿主細胞内での遺伝子の発現を得るのに
様々なプロモーターが使用可能であることを認識している。プロモーターは構成的であっ
ても調節的であってもよく、ウイルス、原核生物、もしくは真核生物の供給源を含む種々
の供給源から入手すること、または人為的に設計することが可能である。
タンパク質、ここでは融合前RSV Fタンパク質を発現するようにルーチン的に選択す
ることができる。好適な培地は血清を含有しても含有しなくてもよい。
在しない核酸分子である。それは、例えば、標準の分子生物学技術によりベクターに導入
される。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列と作動可能に連結される。これは、例えば
、導入遺伝子をコードする核酸をプロモーターの制御下に置くことで実施され得る。さら
なる調節配列を加えることもできる。導入遺伝子の発現のために多くのプロモーターが使
用可能であり、それらは当業者に知られており、例えば、それらは、ウイルス、哺乳動物
、合成のプロモーターなどを含んでもよい。真核細胞内での発現を得るのに好適なプロモ
ーターの非限定的な例としては、CMVプロモーター(米国特許第5,385,839号
明細書)、例えばCMV最初期プロモーター、例えばCMV最初期遺伝子エンハンサー/
プロモーターからのnt.-735~+95を含むものが挙げられる。ポリアデニル化シ
グナル、例えばウシ成長ホルモンのポリAシグナル(米国特許第5,122,458号明
細書)を導入遺伝子の後に存在させることができる。あるいは、いくつかの広く使用され
ている発現ベクターが当該技術分野および商用供給源から入手可能であり、例えば、In
vitrogenのpcDNAおよびpEFベクター系列、BD Sciencesのp
MSCVおよびpTK-Hyg、StratageneのpCMV-Scriptなどが
あり、これらは、目的のタンパク質を組換えにより発現させるために、または好適なプロ
モーターおよび/もしくは転写ターミネーター配列、ポリA配列などを得るために使用す
ることができる。
細胞、および懸濁培養など、任意のタイプの細胞培養であってよい。大抵の大規模懸濁培
養は、操作およびスケールアップが最も簡単であるため、バッチ法または流加法として操
作される。最近では、灌流原理に基づく連続法がより一般的になりつつあり、また好適で
もある。好適な培養培地も当業者に周知であり、一般に、商用供給源から大量に得ること
、または標準プロトコルにしたがって注文生産することが可能である。培養は、例えば、
バッチ、流加、連続システムなどを使用して、シャーレ、ローラーボトルまたはバイオリ
アクター内で行うことができる。細胞を培養する好適な条件は知られている(例えば、T
issue Culture,Academic Press,Kruse and P
aterson,editors(1973),およびR.I.Freshney,Cu
lture of animal cells:A manual of basic
technique, fourth edition (Wiley-Liss In
c.,2000,ISBN 0-471-34889-9)を参照)。
たはベクターを含む組成物をさらに提供する。したがって、本発明は、RSV Fタンパ
ク質の融合前コンフォメーションには存在するが、融合後コンフォメーションには存在し
ないエピトープを示す融合前RSV Fタンパク質またはその断片を含む組成物を提供す
る。本発明はまた、そのような融合前RSV Fタンパク質またはその断片をコードする
核酸分子および/またはベクターを含む組成物を提供する。組成物は、好ましくは、上記
の融合前RSV Fタンパク質および/または核酸分子および/またはベクターを含む免
疫原性組成物である。本発明はまた、RSV Fタンパク質に対する免疫応答を対象に誘
導するための、安定化された融合前RSV Fタンパク質または本発明の前記RSV F
タンパク質をコードする核酸分子の使用を提供する。さらに、RSV Fタンパク質に対
する免疫応答を対象に誘導するための方法であって、本発明による融合前RSV Fタン
パク質および/または核酸分子および/またはベクターを対象に投与することを含む方法
を提供する。また、RSV Fタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する際に使用す
るための、本発明による融合前RSV Fタンパク質、核酸分子および/またはベクター
を提供する。さらに、RSV Fタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する際に使用
する薬剤を製造するための、本発明による融合前RSV Fタンパク質および/または核
酸分子および/またはベクターを提供する。
止(予防)および/または治療に使用することができる。ある実施形態では、防止および
/または治療は、RSV感染に罹りやすい患者群を標的にすることができる。そのような
患者群としては、以下に限定されるものではないが、例えば、高齢者(例えば、50歳以
上、60歳以上、および好ましくは65歳以上)、若齢者(例えば、5歳以下、1歳以下
)、入院患者、および抗ウイルス性化合物で治療されたが、十分な抗ウイルス応答を示さ
なかった患者が挙げられる。
えば、RSVを原因とする疾患もしくは病態の単独の治療および/または予防に、あるい
は(既存または将来の)ワクチン、抗ウイルス剤および/またはモノクローナル抗体など
、他の予防的治療および/または療法的治療と組み合わせて使用することができる。
ターを利用して、対象のRSV感染を防止および/または治療するための方法をさらに提
供する。ある特定の実施形態では、対象のRSV感染を防止および/または治療するため
の方法は、上記のような融合前RSV Fタンパク質、核酸分子、および/またはベクタ
ーの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。治療有効量は、RSVによ
る感染から生じる疾患または病態を防止、寛解および/または治療するのに効果のあるタ
ンパク質、核酸分子、またはベクターの量を指す。防止は、RSVの伝播の阻害もしくは
低減、またはRSVによる感染に関連した症状の1つもしくは複数の発症、進展、もしく
は進行を阻害もしくは低減することを包含する。本明細書で使用される寛解は、目に見え
る、もしくは認知できる疾患の症状、ウイルス血症、またはインフルエンザ感染の他の任
意の計測可能な徴候の低減を指し得る。
ンパク質、核酸分子、および/またはベクターと、薬学的に許容される担体または賦形剤
とを含む医薬組成物を使用することができる。この場合、「薬学的に許容される」という
用語は、担体もしくは賦形剤が、使用する用量および濃度で、それらを投与する対象に望
ましくない、または有害な効果を引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許
容される担体および賦形剤は、当該技術分野でよく知られている(Remington’
s Pharmaceutical Sciences,18th edition,A
.R.Gennaro,Ed.,Mack Publishing Company[1
990];Pharmaceutical Formulation Developm
ent of Peptides and Proteins,S.Frokjaer
and L.Hovgaard,Eds.,Taylor & Francis[200
0];およびHandbook of Pharmaceutical Excipie
nts,3rd edition,A.Kibbe,Ed.,Pharmaceutic
al Press[2000]を参照)。RSV Fタンパク質または核酸分子は、凍結
乾燥製剤を利用することも可能であり得るが、滅菌溶液として製剤化し、投与することが
好ましい。滅菌溶液は、滅菌濾過または当該技術分野でそれ自体知られている他の方法に
よって調製される。その後、溶液は凍結乾燥されるか、または医薬投与容器に充填される
。溶液のpHは一般に、pH3.0~9.5、例えばpH5.0~7.5の範囲である。
RSV Fタンパク質は、通常、薬学的に許容される好適な緩衝剤を含む溶液中に存在し
、組成物はまた塩を含有してもよい。任意選択により、アルブミンなどの安定剤が含まれ
得る。ある実施形態では、洗浄剤が添加される。ある実施形態では、RSV Fタンパク
質は注射剤に製剤化することができる。
含む。適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに高めるアジュバントは当該技術分
野で知られている。「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では
同義的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす1種または複数種の物質と定義される。こ
れに関連して、アジュバントは、本発明のRSV Fタンパク質に対する免疫応答を増強
するために使用される。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよび/
またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩;油-エマルジョン組成物(または水中
油型組成物)、例えば、MF59などのスクアレン-水エマルション(例えば、国際公開
第90/14837号パンフレットを参照);サポニン製剤、例えばQS21および免疫
刺激複合体(ISCOMS)など(例えば、米国特許第5,057,540号明細書;国
際公開第90/03184号パンフレット、国際公開第96/11711号パンフレット
、国際公開第2004/004762号パンフレット、国際公開第2005/00262
0号パンフレットを参照);細菌または微生物の派生物(これらの例には、モノホスホリ
ルリピドA(MPL)、3-O-脱アシル化MPL(3dMPL)、CpG-モチーフ含
有オリゴヌクレオチド、ADP-リボシル化細菌毒素またはその変異体、例えば大腸菌(
E.coli)易熱性エンテロトキシンLT、コレラ毒素CTなどがある);真核生物の
タンパク質(例えば、抗体もしくはその断片(例えば、抗原自体またはCD1a、CD3
、CD7、CD80に向けられたもの)および受容体へのリガンド(例えば、CD40L
、GMCSF、GCSFなど)(これらは受容細胞と相互作用すると、免疫応答を刺激す
る))が挙げられる。ある実施形態では、本発明の組成物は、例えば、水酸化アルミニウ
ム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウムアルミニウム、またはそれらの組み合わせの形
態のアルミニウムを、1用量当たり0.05~5mg、例えば0.075~1.0mgの
アルミニウム含有量の濃度で、アジュバントとして含む。
ルス様粒子または自己集合性タンパク質粒子などのナノ粒子と組み合わせて、またはそれ
にコンジュゲートさせて投与することができる。融合前Fタンパク質は、アジュバンドを
含む、または含まないナノ粒子と組み合わせるか、その中に封入するか、またはそれにコ
ンジュゲートさせることができる。リポソーム内への封入は、例えば米国特許第4,23
5,877号明細書に記載されている。高分子へのコンジュゲーションは、例えば米国特
許第4,372,945号明細書または米国特許第4,474,757号明細書に開示さ
れている。
製する方法であって、本発明による組成物を準備する工程、およびそれを薬学的に許容さ
れる組成物中に製剤化する工程を含む方法を提供する。「ワクチン」という用語は、ある
特定の病原体または疾患に対して対象にある程度の免疫を誘導するのに有効な活性成分を
含有する薬剤または組成物を指し、これにより、その病原体または疾患による感染に関連
する症状の重症度、期間、または他の徴候が少なくとも低減(最大で完全消失)する。本
発明では、ワクチンは、有効量の融合前RSV Fタンパク質、および/または融合前R
SV Fタンパク質をコードする核酸分子、および/または前記核酸分子を含むベクター
を含み、これにより、RSVのFタンパク質に対する免疫応答がもたらされる。これは、
入院に至る重篤な下気道疾患を防止し、対象のRSV感染および複製による肺炎および細
気管支炎などの合併症の頻度を低減する方法を提供する。本発明による「ワクチン」とい
う用語は、それが医薬組成物であり、したがって、通常、薬学的に許容される希釈剤、担
体、または賦形剤を含むことを意味する。それは、さらなる活性成分を含んでも含まなく
てもよい。ある実施形態では、それは、例えばRSVの他のタンパク質および/または他
の感染因子に対する免疫応答を誘導する他の成分をさらに含む組み合わせワクチンであっ
てもよい。さらなる活性成分の投与は、例えば、別個の投与によって行われても、本発明
のワクチンとさらなる活性成分の組み合わせ製剤を投与することによって行われてもよい
。
のRSV Fタンパク質の総用量は、例えば約0.01μg~約10mg、例えば1μg
~1mg、例えば10μg~100μgとすることができる。推奨用量の決定は実験によ
り行われ、当業者にはルーチン的である。
定的実施形態としては、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、または例えば鼻腔
内、口腔内などの粘膜投与などの非経口投与が挙げられる。一実施形態では、組成物は筋
肉内注射により投与される。当業者は、ワクチン中の抗原に対する免疫応答を誘導するた
めに、例えばワクチンなどの組成物を投与する様々な可能性を認識している。
どのげっ歯類、または非ヒト霊長類、またはヒトである。対象は、好ましくは、ヒト対象
である。
は追加免疫として、同種または異種初回免疫-追加免疫レジメンで投与することができる
。追加免疫ワクチン接種を実施する場合、通常、そのような追加免疫ワクチン接種は、最
初に対象に組成物を投与した後(このような場合には「初回ワクチン接種」と呼ばれる)
、1週~1年、好ましくは2週~4ヶ月のある時点で同じ対象に投与される。ある実施形
態では、投与は初回免疫投与および少なくとも1回の追加免疫投与を含む。
の血清中にあるか否かを確定することにより、個体の免疫状態を検査するための診断ツー
ルとして使用することができる。したがって、本発明はまた、患者のRSV感染の存在を
検出するためのインビトロ診断方法であって、a)前記患者から得られた生体試料を本発
明によるタンパク質と接触させる工程と、b)抗体-タンパク質複合体の存在を検出する
工程とを含む方法に関する。
いくつかの融合前RSV Fタンパク質変異体を生成し、これを図1に模式的に示す。
すべての候補は、RSV A2 F1ドメインのアミノ酸残基495に連結した、フィブ
リチン三量体化ドメイン(フォルドン)(GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWV
LLSTFL;配列番号20)を含む。
ジョン)では、N67I置換は発現レベルおよび安定性の両方に対して最大の効果を有し
たが、完全に安定な融合前Fタンパク質は67および215の置換が組み合わされた場合
にのみ得られ、20倍の発現レベルの増加を生じた(図2)。第三のアミノ酸置換を追加
しても、発現レベルも4℃における保存安定性で測定される安定性も改善されなかった。
しかしながら、RSV Fタンパク質を精製し、さらにキャラクタリゼーションを行うと
、追加の第3の置換は、より厳密な温度安定性試験による(示差走査蛍光測定アッセイ-
DSFによる)測定で、融合前Fタンパク質を有意に安定化させることが判明した(図3
)。
4/202570号パンフレット)RSV Fタンパク質変異体の親配列として使用され
たA2株は、頂点K66およびI76)に2つの特有かつ稀な変異を蓄積した細胞株適合
実験室株であるため、これらの2つの残基を天然の臨床分離株(K66E、I76V)に
マッチするように変異させることを決定した。配列を天然のウイルス分離株により近づけ
るために、K66EおよびI76V変異が、新たなプロセシングされたタンパク質設計に
含まれた。選択された安定化変異体でK66E+I76V置換を試験し、これらのアミノ
酸置換がタンパク質発現に対しても安定性に対しても負の影響を有しないことを示した。
タンパク質は、細胞培養上清中で2週間を超えて安定であることが示された。Fタンパク
質の発現レベルに負の影響がないどころか、N67I、S215P、K66EおよびI7
6V変異を有するRSV F蛋白質は、N67IおよびS215Pのみを有する蛋白質よ
りも高レベルで発現した(図4)。
RQMと命名)ならびにN67I、S215P、K66E、I76VおよびD486N(
プロセシングされた五重変異体をPRPMと命名)を有するプロセシングされたRSV
Fタンパク質を精製し、さらにキャラクタリゼーションを行った。
異のスクリーニングを行った。これらの細胞は単純なトランスフェクションプロトコルに
適合しており、高レベルでタンパク質を発現するので、研究室で使用するのに便利である
。大規模のGMPタンパク質産生では、CHO細胞はしばしば選択される細胞系である。
したがって、いくつかの好ましいFタンパク質設計の発現および安定性は、浮遊CHO細
胞(FreeStyle CHO-S)で試験した。CHO-S細胞はトランスフェクト
するのが困難であり、したがって、全体的な発現レベルは、HEK細胞よりも低いと予想
された。したがって、分析の間、本発明者らはタンパク質の相対的発現およびそれらの安
定性に焦点を当てた。
66E、I76V、N67IおよびS215Pの置換を含んだ。上記のように、後者の2
つは、融合前コンフォメーションのタンパク質を安定化するために必要であり;前者の2
つは天然の分離株により近い配列とするために含めた(前節の記載のように)。これらの
タンパク質は、追加の変異E161P、D486NおよびE487Qによって異なった。
これらは、高い発現レベル、貯蔵安定性、および抗原性に対する影響の低さから選択され
た。すべてのタンパク質が、CHO細胞で発現し、同等の貯蔵安定性を有した。細胞培養
上清中、4℃で2週間の保存した際、融合前コンフォメーションのRSV Fタンパク質
は安定であった(図5)。また、CHO細胞培養上清中のRSV Fタンパク質のpH5
での安定性を試験した。図6に示すように、タンパク質試料を異なる温度で7日間インキ
ュベートした後も分解は検出されなかった。
安定であった。さらに、タンパク質の温度安定性を試験した。細胞培養上清を熱処理し、
試料中の融合前タンパク質の量を、CR9501抗体を用いたELISAで測定した(図
7)。
であった。K498R変異の追加は、最小量の修飾を有するタンパク質(PRQM)と比
較して利点を有さないようであった。E161P変異を有する変異体は、最も高い発現レ
ベルを有した(データは示さず)。しかし、このアミノ酸置換の欠点は、残基161がタ
ンパク質の表面に位置し、かつCR9501抗体に対するエピトープの縁に位置すること
であった。
前タンパク質として、PRPM(フィブリチンのフォルドン三量体化ドメインならびに変
異N67I、S215P、K66E、I76VおよびD486Nを有するRSV Fタン
パク質、配列番号1)およびPRQM(フィブリチンのフォルドン三量体化ドメインなら
びにN67I、S215P、K66EおよびI76Vを有するRSV Fタンパク質、配
列番号2)、ならびにPRQM+S46GまたはPRPM+S46G変異体はすべて、前
融合コンフォメーションで安定化され、高いTmを有することが示された(表1)。S4
6G置換を有する後者の変異体は、有意に高い発現レベルを有する。
性および防御
同種RSV-A2チャレンジコットンラットモデルにおいて、アジュバントの存在下ま
たは非存在下での組換えPRPMタンパク質の免疫原性および予防の有効性を決定する実
験を行った。0日目および28日目に、2用量のPRPM(5および0.5μg)を、ア
ジュバント非添加、または100μgAdjuphosをアジュバントとして添加して、
動物にi.m.により免疫を付与した。49日目に動物に105(pfu)のRSV A
2でチャレンジした。チャレンジの5日後に動物を屠殺し、肺および鼻で力価を測定した
。
アジュバントを添加したPRPMによる免疫化は、鼻で無効であった1匹の動物を除い
て、肺および鼻で完全な防御を誘導した。5および0.5μgのアジュバント非添加PR
PMを接種された動物のほとんどは、肺および鼻で無効を示し、アジュバント添加タンパ
ク質およびアジュバント非添加タンパク質を接種された群の間に有意差があった(図8)
。アジュバント化タンパク質は、非アジュバント化タンパク質と比較して、免疫から49
日後に有意に高いVNA力価を誘導した(図9)。
配列番号1:PRPM
配列番号2 PRQM
配列番号3 PRPM+S46G
CR9501重鎖(配列番号16):
CR9501軽鎖(配列番号17):
CR9502重鎖(配列番号18):
CR9502軽鎖(配列番号19):
PRPM(配列番号20)をコードするヌクレオチド配列:
PRQM(配列番号21)をコードするヌクレオチド配列:
PRPM+S46G(配列番号22)をコードするヌクレオチド配列:
Claims (2)
- RSV感染の予防に使用するための、組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス(RSV)融合(F)タンパク質を含む組成物であって、RSV Fタンパク質が、配列番号1のシグナルペプチド(アミノ酸1~26)及びp27領域(アミノ酸110~136)が除去された配列番号1のアミノ酸配列を含む、組成物。
- 組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス(RSV)融合(F)タンパク質をコードする核酸分子を含む、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞であって、組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス(RSV)融合(F)タンパク質が、配列番号1のアミノ酸配列を含む、CHO細胞。
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