JP7238000B2

JP7238000B2 - 安定化された可溶性融合前ｒｓｖｆポリペプチド

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Publication number: JP7238000B2
Application number: JP2021022968A
Authority: JP
Inventors: ランゲディク，ヨハンネス; ホレンシュタイン，ポリーナフルマノファ
Original assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2015-07-07
Filing date: 2021-02-17
Publication date: 2023-03-13
Anticipated expiration: 2036-07-07
Also published as: US11034731B2; JP2018527897A; WO2017005848A1; ZA201800094B; AU2016289496A1; HK1250938A1; EP3319634B1; CN107847581B; JP6840718B2; EA201890235A1; IL256567A; US20200095287A1; KR20180026734A; BR112017028449A2; US20210284698A1; CN107847581A; US10457708B2; EP3319634A1; EA035909B1; IL256567B

Description

本発明は医薬の分野に関する。本発明は、特に、組換え融合前ＲＳＶＦポリペプチド
、および例えば免疫原性組成物におけるその使用に関する。

１９５０年代に呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）が発見されると、このウイルスは、直
ちにヒトにおける上下気道感染症に関連した認定病原体になった。世界中で毎年６４００
万件のＲＳウイルス感染が発生し、その結果、１６０，０００人が死亡していると推定さ
れている（ＷＨＯＡｃｕｔｅＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＩｎｆｅｃｔｉｏｎｓＵｐ
ｄａｔｅＳｅｐｔｅｍｂｅｒ２００９）。最も重篤な疾患が生じるのは、特に、未熟
児、高齢者、および免疫無防備状態の個体である。２年未満の小児では、ＲＳＶは、最も
よく見られる呼吸器病原体であり、呼吸器感染症による入院の約５０％を占め、入院のピ
ークとなるのは２～４ヶ月齢である。ほとんどすべての小児が２歳までにＲＳＶに感染し
たことが報告されている。生涯にわたり繰り返し感染することは、自然免疫が効果を有さ
ないことに起因する。高齢者では、ＲＳＶ疾患の負担は、一般的なインフルエンザＡ感染
によって引き起こされるものと類似している。

ＲＳＶは、ニューモウイルス（ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｄａｅ）亜科に属するパラミクソ
ウイルスである。そのゲノムは、中和抗体の主要な抗原標的であるＲＳＶ糖タンパク質（
Ｇ）およびＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質として知られる膜タンパク質を含む種々のタンパ
ク質をコードする。Ｆ１タンパク質の融合媒介部分に対する抗体は、細胞のウイルス取り
込みを防止することができ、したがって、中和作用がある。

現在、ＲＳＶ感染に対するワクチンは入手することができないが、疾患による高い負担
のために要望されている。上述したように、ＲＳＶ融合糖タンパク質（ＲＳＶＦ）は、
ヒト血清中の中和抗体の主要な標的であることから、魅力的なワクチン抗原である。実際
、ＲＳＶＦに対する中和モノクローナル抗体（パリミズマブ）は、重い疾患を予防する
ことができ、幼児の予防に承認されている。

ＲＳＶＦは、不可逆性タンパク質が不安定な融合前コンフォメーションから安定した
融合後コンフォメーションにリフォールディングすることにより、ウイルスと宿主細胞膜
とを融合する。両方のコンフォメーションの構造は、ＲＳＶＦについても（ＭｃＬｅｌ
ｌａｎＪＳ，ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ３４２，５９２－５９８（２０１３）；Ｍ
ｃＬｅｌｌａｎＪＳ，ｅｔａｌ．ＮａｔＳｔｒｕｃｔＭｏｌＢｉｏｌ１７，
２４８－２５０（２０１０）；ＭｃＬｅｌｌａｎＪＳ，ｅｔａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ
３４０，１１１３－１１１７（２０１３）；ＳｗａｎｓｏｎＫＡ，ｅｔａｌ．Ｐｒｏ
ｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅ
ｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ１０８
，９６１９－９６２４（２０１１））、関連するパラミクソウイルスの融合蛋白質につい
ても決定されており、この複雑な融合装置のメカニズムを知る上での手掛かりとなってい
る。他のＩ型融合タンパク質のように、不活性な前駆体、ＲＳＶＦ０は、フーリン様プ
ロテアーゼによって細胞内成熟中に切断される必要がある。ＲＳＶＦは２つのフーリン
部位を有し、それにより３つのポリペプチド：Ｆ２、ｐ２７およびＦ１に分けられ、Ｆ１
はそのＮ末端に疎水性融合ペプチド（ＦＰ）を有する。融合前コンフォメーションから融
合後コンフォメーションにリフォールディングするために、ＦＰおよびヘプタッドリピー
トＡ（ＨＲＡ）を含むアミノ酸残基１３７～２１６のリフォールディング領域１（ＲＲ１
）は、へリックス、ループおよびストランドのアセンブリから長い連続へリックスに変形
する必要がある。ＲＲ１のＮ末端セグメントに位置するＦＰは、その後、ウイルス膜から
伸びて標的細胞の近位膜に入ることができる。次に、融合前ＦスパイクにおいてＣ末端ス
テムを形成し、かつヘプタッドリピートＢ（ＨＲＢ）を含むリフォールディング領域２（
ＲＲ２）は、ＲＳＶＦヘッドの他方の側に位置を変え、ＨＲＡコイルドコイルトリマー
をＨＲＢドメインと結合させて、６へリックスバンドルを形成する。６へリックスバンド
ルを完成するためのＲＲ１コイルドコイルの形成およびＲＲ２の移動は、リフォールディ
ングの過程で起こる最も劇的な構造変化である。

ヒトの血清中の大半の中和抗体は、融合前コンフォメーションに向けられるが、融合前
コンフォメーションは、その不安定さのために、溶液中およびビリオン表面のいずれでも
融合後コンフォメーションに早期にリフォールディングする傾向がある。高い発現レベル
を有し、かつ安定な融合前コンフォメーションを維持するＲＳＶＦタンパク質は、ＲＳ
Ｖに対するサブユニットワクチンまたはベクターワクチンにおいて使用する有望な候補と
なるであろう。

本発明は、安定な組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチ
ド、すなわち融合前コンフォメーションで安定化される組換えＲＳＶＦポリペプチドを
提供する。本発明のＲＳＶＦポリペプチドは、融合前コンフォメーションのＦタンパク
質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含む。特定の実施形態では、融合前ＲＳＶ
Ｆポリペプチドは可溶性のポリペプチドである。本発明はまた、本発明による融合前ＲＳ
ＶＦポリペプチドをコードする核酸分子およびそのような核酸分子を含むベクターを提
供する。

本発明はまた、ＲＳＶＦポリペプチド、核酸分子、および／またはベクターを含む組
成物、好ましくは免疫原性組成物、ならびにＲＳＶＦタンパク質に対する免疫応答を誘
導する際のその使用、具体的にはワクチンとしてのその使用に関する。本発明はまた、対
象に抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）免疫応答を誘導するための方法であって、有効量
の融合前ＲＳＶＦポリペプチド、前記ＲＳＶＦポリペプチドをコードする核酸分子、
および／または前記核酸分子を含むベクターを対象に投与することを含む方法に関する。
誘導される免疫応答は、好ましくは、ＲＳＶに対する中和抗体および／またはＲＳＶに対
する防御免疫を特徴とする。特定の態様では、本発明は、対象に抗呼吸器合胞体ウイルス
（ＲＳＶ）Ｆタンパク質中和抗体を誘導するための方法であって、融合前ＲＳＶＦポリ
ペプチド、前記ＲＳＶＦポリペプチドをコードする核酸分子、および／または前記核酸
分子を含むベクターを含む有効量の免疫原性組成物を対象に投与することを含む方法に関
する。

タンパク質Ｆ（Ａ２）ＫＮ６６ＥＩＩ７６ＶＬ２０３ＩＳ２１５Ｐの精製である。Ａ）陽イオン交換カラムからの溶出液のクロマトグラム。青色線は２８０ｎｍの吸光度であり、褐色線は伝導度である。矢印は１５％溶出段階で溶出された収集ピークを示す。タンパク質Ｆ（Ａ２）ＫＮ６６ＥＩＩ７６ＶＬ２０３ＩＳ２１５Ｐの精製である。Ｂ）陽イオン交換カラムからの溶出液のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過クロマトグラム。青色線は２８０ｎｍの吸光度であり、褐色線は伝導度である。矢印は収集ピークを示す。Ａ）還元条件下および非還元条件下でのＳＥＣクロマトグラムからのピークを含む、Ｆ（Ａ２）ＫＮ６６ＥＩＩ７６ＶＬ２０３ＩＳ２１５Ｐ（Ａ）およびＦ（Ａ２）Ｋ６６ＥＩ７６ＶＬ２０３ＩＳ２１５Ｐ（Ｂ）タンパク質試料のＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。減圧下試料のＦ１、Ｆ２画分および非減圧下試料のＦ１＋Ｆ２が示されている。Ｃ）Ｌ２０３Ｉを含むＦ（Ａ２）ＫＮ６６ＥＩＩ７６ＶＳ２１５ＰおよびＬ２０３Ｉを含まないＦ（Ａ２）ＫＮ６６ＥＩＩ７６ＶＳ２１５ＰＩ、ならびにＦ（Ａ２）Ｋ６６ＥＩ７６ＶＬ２０３ＩＳ２１５ＰのＮａｔｉｖｅＰＡＧＥ。ネイティブマーカーは相対的電気泳動移動度を示すが、タンパク質の分子量の決定に使用することはできない。２４２～４８０ｋＤａのバンドの位置は、三量体ＲＳＶＦタンパク質の位置に対応する（矢印で示す）。ゲルはクマシーブリリアントブルーで染色されている。Ｌｅｕ２０３のＩｌｅへの置換の追加により、Ｓ２１５Ｐ置換を有する準安定融合前Ｆタンパク質における融合前Ｆの安定性が増大する。細胞培養上清中の融合前ＲＳＶＦ濃度を、採取日（トランスフェクションの７２時間後＝第１日）と、４℃で５日間の保存後および１５日間の保存後とに試験した。Ｌ２０３Ｉを含むタンパク質の温度安定性である。精製したタンパク質試料の溶融温度（Ｔｍ）をＤＳＦにより測定した。Ｌ２０３Ｉ変異を含む精製Ｆタンパク質の還元（Ｒ）および非還元（ＮＲ）条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析である。減圧下試料のＦ１、Ｆ２画分および非減圧下試料のＦ１＋Ｆ２が示されている。ゲルはクマシーブリリアントブルーで染色した。Ｌ２０３Ｉ変異を含む精製Ｆタンパク質のＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析である：Ａ：Ｆ（Ａ２）－ＫＮ６６ＥＩ－Ｉ７６Ｖ－Ｉ２０３Ｌ－Ｓ２１５Ｐ－Ｄ４８６Ｎ；Ｂ：Ｆ（Ａ２）－Ｋ６６Ｅ－Ｉ７６Ｖ－Ｉ２０３Ｌ－Ｓ２１５Ｐ－Ｄ４８６Ｎ。

呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合タンパク質（Ｆ）は、ウイルス感染に必要とさ
れる宿主細胞膜とウイルス膜との融合に関与する。ＲＳＶＦｍＲＮＡは、Ｆ０と称さ
れる５７４個のアミノ酸からなる前駆体タンパク質に翻訳され、それはＮ末端に、小胞体
内のシグナルペプチダーゼで除去されるシグナルペプチド配列（例えば、配列番号１３で
表わされるアミノ酸残基１～２６）を含む。Ｆ０は、細胞プロテアーゼ（特に、フーリン
またはフーリン様）により２つの部位（アミノ酸残基１０９／１１０間および１３６／１
３７間）で切断され、アミノ酸残基１１０～１３６を含む短いグリコシル化介在配列（ｐ
２７領域とも呼ばれる）が除去され、Ｆ１およびＦ２と称される２つのドメインまたはサ
ブユニットが生成される。Ｆ１ドメイン（アミノ酸残基１３７～５７４）は、そのＮ末端
に疎水性融合ペプチドを有し、Ｃ末端に膜貫通（ＴＭ）（アミノ酸残基５３０～５５０）
領域および細胞質領域（アミノ酸残基５５１～５７４）を有する。Ｆ２ドメイン（アミノ
酸残基２７～１０９）は、２つのジスルフィド架橋によりＦ１に共有結合する。Ｆ１－Ｆ
２ヘテロ二量体は、ビリオン中でホモ三量体として集合している。

ＲＳＶ感染に対するワクチンは、現在入手可能ではないが所望されている。ワクチン製
造に有望な１つのアプローチは、精製されたＲＳＶＦタンパク質に基づくサブユニット
ワクチンである。しかしながら、このアプローチの場合、精製されたＲＳＶＦタンパク
質は、ＲＳＶＦタンパク質の融合前状態のコンフォメーションに類似したコンフォメー
ションにあり、経時的に安定であり、かつ十分な量で製造できることが望ましい。加えて
、可溶性のサブユニットベースのワクチンの場合、ＲＳＶＦタンパク質を膜貫通（ＴＭ
）領域および細胞質領域の欠失により短縮して、可溶性分泌型Ｆタンパク質（ｓＦ）を生
成させる必要がある。ＴＭ領域は膜アンカリングおよび三量体形成を担うため、アンカー
なしの可溶性Ｆタンパク質は、完全長タンパク質よりもかなり不安定であり、融合後最終
状態に容易にリフォールディングすることになる。したがって、高い発現レベルおよび高
い安定性を示す安定な融合前コンフォメーションの可溶性Ｆタンパク質を得るために、融
合前コンフォメーションを安定化する必要がある。また、完全長（膜結合した）ＲＳＶ
Ｆタンパク質は準安定であるため、融合前コンフォメーションの安定化も弱毒化生ワクチ
ンまたはベクターワクチンへのアプローチに望ましい。

融合前コンフォメーションにあるＦ１およびＦ２サブユニットに切断される可溶性ＲＳ
ＶＦの安定化のために、フィブリチンに基づく三量化ドメインを可溶性ＲＳＶ－ＦＣ
末端のＣ末端に融合させた（ＭｃＬｅｌｌａｎｅｔａｌ．，ＮａｔｕｒｅＳｔｒｕ
ｃｔ．Ｂｉｏｌ．１７：２－２４８－２５０（２０１０）；ＭｃＬｅｌｌａｎｅｔａ
ｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ３４０（６１３６）：１１１３－７（２０１３））。このフィブ
リチンドメイン、すなわち「フォルドン」はＴ４フィブリチンに由来し、以前は人工の天
然三量化ドメインとして記載されている（Ｌｅｔａｒｏｖｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙＭｏｓｃｏｗ６４：８１７－８２３（１９９３）；Ｓ－Ｇｕｔｈｅｅ
ｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３７：９０５－９１５．（２００４））。しかし
、三量化ドメインにより安定な融合前ＲＳＶ－Ｆタンパク質は得られない。さらに、これ
らの努力により、ヒトで試験するのに適した候補を未だ得るに至っていない。

最近、本発明者らは、ＲＳＶ融合前Ｆコンフォメーションを安定化することができるい
くつかの変異の組み合わせを記載した（国際公開第２０１４／１７４０１８号パンフレッ
トおよび国際公開第２０１４／２０２５７０号パンフレット）。したがって、６７位のア
ミノ酸残基の変異および／または２１５位のアミノ酸残基の変異、好ましくは６７位のア
ミノ酸残基Ｎ／ＴのＩへの変異、および／または２１５位のアミノ酸残基ＳのＰへの変異
を含む、安定な融合前ＲＳＶＦポリペプチドが記載されている。さらに、短縮されたＦ
１ドメイン、ならびに野生型ＲＳＶＦタンパク質のＲＳＶＦ１および／もしくはＦ２
ドメインと比較して、Ｆ１および／もしくはＦ２ドメイン中に少なくとも１つの安定化変
異を含む可溶性融合前ＲＳＶＦポリペプチドであって、前記短縮されたＦ１ドメインに
結合された異種三量化ドメインを含む可溶性融合前ＲＳＶＦポリペプチドが記載されて
いる。またさらに、融合前ＲＳＶＦポリペプチドであって、少なくとも１つのさらなる
変異を含み、前記変異が以下からなる群から選択される、融合前ＲＳＶＦポリペプチド
が記載されている：
（ａ）４６位のアミノ酸残基の変異；
（ｂ）７７位のアミノ酸残基の変異；
（ｃ）８０位のアミノ酸残基の変異；
（ｄ）９２位のアミノ酸残基の変異；
（ｅ）１７５位のアミノ酸残基の変異；
（ｆ）１８４位のアミノ酸残基の変異；
（ｇ）１８５位のアミノ酸残基の変異；
（ｈ）２０１位のアミノ酸残基の変異；
（ｉ）２０９位のアミノ酸残基の変異；
（ｊ）４２１位のアミノ酸残基の変異；
（ｋ）４２６位のアミノ酸残基の変異；
（ｌ）４６５位のアミノ酸残基の変異；
（ｍ）４８６位のアミノ酸残基の変異；
（ｎ）４８７位のアミノ酸残基の変異；および
（ｏ）５０８位のアミノ酸残基の変異。

少なくとも１つのさらなる変異は、好ましくは、以下からなる群から選択される：
（ａ）４６位のアミノ酸残基ＳのＧへの変異；
（ｂ）７７位のアミノ酸残基ＫのＥへの変異；
（ｃ）８０位のアミノ酸残基ＫのＥへの変異；
（ｄ）９２位のアミノ酸残基ＥのＤへの変異；
（ｅ）１７５位のアミノ酸残基ＮのＰへの変異；
（ｆ）１８４位のアミノ酸残基ＧのＮへの変異；
（ｇ）１８５位のアミノ酸残基ＶのＮへの変異；
（ｈ）２０１位のアミノ酸残基ＫのＱへの変異；
（ｉ）２０９位のアミノ酸残基ＫのＱへの変異；
（ｊ）４２１位のアミノ酸残基ＫのＮへの変異；
（ｋ）４２６位のアミノ酸残基ＮのＳへの変異；
（ｌ）４６５位のアミノ酸残基ＫのＥまたはＱへの変異；
（ｍ）４８６位のアミノ酸残基ＤのＮへの変異；
（ｎ）４８７位のアミノ酸残基ＥのＱ、Ｎ、またはＩへの変異；および
（ｏ）５０８位のアミノ酸残基ＫのＥへの変異。

これらの変異の１つのみ（特に、Ｓ２１５Ｐの変異）が適用される場合、準安定状態の
タンパク質が得られ、それは代替置換の安定化効果の評価に使用できるであろう。

本発明では、２０３位のアミノ酸残基ＬのＩへの変異により、融合前コンフォメーショ
ンにあるタンパク質がさらに安定化されることがわかった。

したがって、本発明は、２０３位のアミノ酸残基ＬのＩへの変異を含む組換え融合前Ｆ
ポリペプチドを提供する。

本発明は、特に、組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチ
ドであって、野生型ＲＳＶＦタンパク質中のＲＳＶＦ１および／またはＦ２ドメイン
と比較して、少なくとも１つの、好ましくは少なくとも２つの安定化変異をＦ１および／
またはＦ２ドメイン中に含み、その安定化変異の少なくとも１つは、２０３位のアミノ酸
残基ＬのＩへの変異である、組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポ
リペプチドを提供する。

本発明は、２１５位のアミノ酸ＳのＰへの変異（Ｓ２１５Ｐ）および２０３位のアミノ
酸残基ＬのＩへの変異を含む組換え融合前Ｆポリペプチドをさらに提供する。

したがって、本発明は、安定な組換え融合前ＲＳＶＦポリペプチド、すなわち融合前
コンフォメーションで安定化される組換えＲＳＶＦポリペプチドを提供する新規な安定
化変異を提供する。本発明の安定な融合前ＲＳＶＦポリペプチドは、融合前コンフォメ
ーションで存在する、すなわち、それらは、融合前コンフォメーションＦタンパク質に特
異的な少なくとも１つのエピトープを含む（示す）。融合前コンフォメーションＦタンパ
ク質に特異的なエピトープは、融合後コンフォメーションでは現れないエピトープである
。いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、ＲＳＶＦタンパク質
の融合前コンフォメーションは、天然ＲＳＶビリオンで発現するＲＳＶＦタンパク質の
ものと同じエピトープを含有することができ、したがって、予防的中和抗体を誘発する利
点を備え得ると考えられる。

特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１領域、配列
番号２の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３領域、および配列番号４の軽鎖Ｃ
ＤＲ１領域、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３領域を含
む融合前特異的モノクローナル抗体（以下、ＣＲ９５０１と称する）、ならびに／または
配列番号７の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号９の重鎖ＣＤ
Ｒ３領域、および配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ２領域、
および配列番号１２の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体（ＣＲ９
５０２と称する）によって認識される少なくとも１つのエピトープを含む。ＣＲ９５０１
およびＣＲ９５０２は、それぞれ抗体５８Ｃ５および３０Ｄ８の重鎖および軽鎖可変領域
を含み、したがって、それらの抗体の結合特異性を有するが、それらの抗体は、融合後コ
ンフォメーションではなく、融合前コンフォメーションのＲＳＶＦタンパク質に特異的
に結合することが以前より示されている（国際公開第２０１２／００６５９６号パンフレ
ットを参照）。

特定の実施形態では、組換え融合前ＲＳＶＦポリペプチドは、上記の少なくとも１つ
の融合前特異的モノクローナル抗体によって認識される少なくとも１つのエピトープを含
み、かつ三量体である。特定の実施形態では、本発明による安定な融合前ＲＳＶＦポリ
ペプチドは、短縮されたＦ１ドメインを含む。

ＲＳＶは、２つの抗原性サブグループ：ＡおよびＢを有する単一血清型として存在する
ことが知られている。２つのグループのプロセシングされた成熟Ｆタンパク質のアミノ酸
配列は約９３％同一である。本出願の全体にわたって使用されるように、アミノ酸位置は
、Ａ２株由来のＲＳＶＦタンパク質の配列（配列番号１３）を参照して付与される。し
たがって、本発明で使用される場合、「ＲＳＶＦタンパク質の「ｘ」位のアミノ酸」と
いう表現は、配列番号１３からなるＲＳＶＡ２株のＲＳＶＦタンパク質の「ｘ」位に
あるアミノ酸に対応するアミノ酸を意味する。本出願の全体にわたって使用される番号方
式では、１は未成熟Ｆ０タンパク質（配列番号１３）のＮ末端アミノ酸を指すことに留意
されたい。Ａ２株と異なるＲＳＶ株が使用される場合、Ｆタンパク質のアミノ酸位置の番
号付与は、配列番号１のＡ２株のＦタンパク質の番号付与に準拠し、配列番号１３のＦタ
ンパク質を有する他のＲＳＶ株の配列を、必要に応じてギャップを挿入してアライメント
することにより行われる。配列アライメントは、当該技術分野でよく知られた方法、例え
ばＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｂｉｏｅｄｉｔ、またはＣＬＣＷｏｒｋｂｅｎｃｈを使用して行
うことができる。

本発明によるアミノ酸は、２０種の天然アミノ酸（もしくは「標準」アミノ酸）、また
は例えばＤ－アミノ酸（キラル中心を有するアミノ酸のＤ－エナンチオマー）などのそれ
らの変異体のいずれであってもよく、または例えばノルロイシンなどのタンパク質中に天
然には見出されない、いずれの変異体であってもよい。標準アミノ酸は、それらの特性に
基づいて、いくつかのグループに分類することができる。重要な因子としては、電荷、親
水性または疎水性、サイズ、および官能基がある。これらの特性は、タンパク質構造およ
びタンパク質－タンパク質間相互作用にとって重要である。アミノ酸の中には、他のシス
テイン残基とジスルフィド共有結合（またはジスルフィド架橋）を形成することができる
システイン、ポリペプチド骨格のターンを誘導するプロリン、および他のアミノ酸よりも
フレキシブルなグリシンなど、特別な特性を有するものがある。表１は、標準アミノ酸の
略語および特性を示す。

タンパク質に対する変異は、ルーチン的な分子生物学手順により行い得ることが当業者
に認識される。本発明による突然変異は、好ましくは、これらの変異を含まないＲＳＶ
Ｆポリペプチドと比較して、融合前ＲＳＶＦポリペプチドの発現レベルの増大および／
または安定性の増大をもたらす。

特定の実施形態では、融合前ＲＳＶＦポリペプチドは可溶性である。

したがって、特定の実施形態では、融合前ＲＳＶＦポリペプチドは、短縮されたＦ１
ドメインを含み、ポリペプチドはＦ１および／Ｆ２ドメイン中に、野生型ＲＳＶＦタン
パク質のＲＳＶＦ１および／Ｆ２ドメインと比較して少なくとも１つの安定化変異を含
む。特定の実施形態では、可溶性融合前ＲＳＶＦポリペプチドは、前記短縮されたＦ１
ドメインに連結した異種三量化ドメインをさらに含む。本発明によれば、短縮されたＦ１
ドメインのＣ末端アミノ酸残基への異種三量化ドメインの連結ならびに安定化突然変異に
より、高発現を示しかつ融合前特異的抗体に結合するＲＳＶＦポリペプチドが提供され
ることが示され、これは、このポリペプチドが融合前コンフォメーションにあることを示
している。加えて、ＲＳＶＦポリペプチドは、融合前コンフォメーションで安定化され
る、すなわち、ポリペプチドのプロセシング後でも、それらは融合前特異的抗体ＣＲ９５
０１および／またはＣＲ９５０２に結合し、融合前特異的エピトープが保持されることを
示す。

特定の実施形態では、融合前ＲＳＶＦポリペプチドは、少なくとも３つの突然変異（
野生型のＲＶＦタンパク質に対して）を含む。

特定の実施形態では、融合前ＲＳＶＦポリペプチドは、
（ａ）４６位のアミノ酸残基の変異；
（ｂ）６７位のアミノ酸残基の変異；
（ｃ）８３位のアミノ酸残基の変異；
（ｄ）９２位のアミノ酸残基の変異；
（ｅ）１８４位のアミノ酸残基の変異；
（ｆ）２０７位のアミノ酸残基の変異；
（ｇ）４８６位のアミノ酸残基の変異；および
（ｈ）４８７位のアミノ酸残基の変異
からなる群から選択される、少なくとも１つのさらなる突然変異を含む。

特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる変異は、
（ａ）４６位のアミノ酸残基ＳのＧへの変異；
（ｂ）６７位のアミノ酸残基Ｎ／ＴのＩへの変異；
（ｃ）８３位のアミノ酸残基ＬのＭへの変異；
（ｄ）９２位のアミノ酸残基ＥのＤへの変異；
（ｅ）１８４位のアミノ酸残基ＧのＮへの変異；
（ｆ）２０７位のアミノ酸残基ＶのＩへの変異；
（ｇ）４８６位のアミノ酸残基ＤのＮへの変異；および
（ｈ）４８７位のアミノ酸残基ＥのＱ、Ｎ、またはＩへの変異
からなる群から選択される。

特定の実施形態では、ポリペプチドは少なくとも２つの変異を含む。

特定の実施形態では、ポリペプチドは少なくとも３つの変異を含む。

特定の実施形態では、ポリペプチドは少なくとも４つ、５つ、または６つの変異を含む
。

特定の他の実施形態では、異種三量化ドメインは、アミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧ
ＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号１４）を含む。

上記のように、特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは短縮されたＦ１ドメイン
を含む。本明細書で使用される場合、「短縮された」Ｆ１ドメインは、完全長Ｆ１ドメイ
ンでないＦ１ドメインを指す、すなわち、Ｎ末端またはＣ末端において、１つまたは複数
のアミノ酸残基が欠失している。本発明によれば、少なくとも膜貫通ドメインおよび細胞
質側末端は、可溶性細胞外ドメインとしての発現を可能にするために欠失されている。

特定の他の実施形態では、三量化ドメインは、ＲＳＶＦ１ドメインのアミノ酸残基５
１３に連結されている。特定の実施形態では、三量化ドメインは、配列番号１４を含み、
ＲＳＶＦ１ドメインのアミノ酸残基５１３に連結されている。

特定の実施形態では、Ｆ１ドメインおよび／またはＦドメインは、ＲＳＶＡ株由来で
ある。特定の実施形態では、Ｆ１および／またはＦ２ドメインは、配列番号１３からなる
ＲＳＶＡ２株由来である。

特定の実施形態では、Ｆ１ドメインおよび／またはＦドメインは、ＲＳＶＢ株由来で
ある。特定の実施形態では、Ｆ１および／またはＦ２ドメインは、配列番号１５からなる
ＲＳＶＢ株由来である。

特定の実施形態では、Ｆ１ドメインおよび／またはＦドメインは、ＲＳＶＣＬ５７－
ｖ２４４株由来である。特定の実施形態では、Ｆ１および／またはＦ２ドメインは、配列
番号２２からなるＲＳＶＣＬ５７－ｖ２４４株由来である。

特定の実施形態では、Ｆ１およびＦ２ドメインは、同じＲＳＶ株由来である。特定の実
施形態では、融合前ＲＳＶＦポリペプチドは、キメラポリペプチドである、すなわち、
異なるＲＳＶ株由来のＦ１およびＦ２ドメインを含む。

特定の実施形態では、融合前ＲＳＶＦポリペプチドは、配列番号２０、配列番号２１
、配列番号２３および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。

特定の実施形態では、本発明の融合前ＲＳＶＦポリペプチドの発現レベルは、野生型
ＲＳＶＦポリペプチドと比較して増大している。特定の実施形態では、発現レベルは少
なくとも５倍、好ましくは１０倍まで増大している。特定の実施形態では、発現レベルは
１０倍超増大している。

本発明による融合前ＲＳＶＦポリペプチドは安定である、すなわち、例えば精製、凍
結融解サイクル、および／または保存など、ポリペプチドの処理時に融合後コンフォメー
ションに容易に変化しない。

特定の実施形態では、本発明による融合前ＲＳＶＦポリペプチドは、突然変異のない
ＲＳＶＦポリペプチドと比較して、４℃での保存時の安定性が増大している。特定の実
施形態では、ポリペプチドは、４℃での保存時に少なくとも３０日間、好ましくは少なく
とも６０日間、好ましくは少なくとも６ヶ月間、より一層好ましくは少なくとも１年間安
定である。「保存時に安定」とは、例えば、実施例７または９に記載の方法を用いて測定
すると、溶液（例えば、培地）中でのポリペプチドの保存時、４℃で少なくとも３０日間
、融合前特異的抗体（例えば、ＣＲ９５０１）に特異的な少なくとも１つのエピトープを
ポリペプチドが依然として示すことを意味する。特定の実施形態では、ポリペプチドは、
融合前ＲＳＶＦポリペプチドの４℃での保存時に少なくとも６ヶ月間、好ましくは少な
くとも１年間、少なくとも１つの融合前特異的エピトープを示す。

特定の実施形態では、本発明による融合前ＲＳＶＦポリペプチドは、前記変異のない
ＲＳＶＦタンパク質と比較して、熱に曝されたときの安定性が増大している。特定の実
施形態では、融合前ＲＥＶＦポリペプチドは、５５℃の温度で、好ましくは５８℃の温
度で、より好ましくは６０℃の温度で少なくとも３０分間にわたり熱に安定である。「熱
に安定」とは、例えば、実施例６に記載の方法による測定で、ポリペプチドが、少なくと
も３０分間、高温（すなわち、５５℃以上の温度）に曝された後も依然として少なくとも
１つの融合前特異的エピトープを示すことを意味する。

特定の実施形態では、ポリペプチドは、適切な製剤緩衝剤中で１～６回の凍結融解サイ
クルに供された後に少なくとも１つの融合前特異的エピトープを示す。

本出願の全体にわたって使用される場合、当該技術分野での慣例として、ヌクレオチド
配列は、５’から３’の方向で提示され、アミノ酸配列は、Ｎ末端からＣ末端の方向で提
示される。

特定の実施形態では、本発明によるコード化ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸
１～２６に対応する、シグナル配列またはシグナルペプチドとも呼ばれるリーダー配列を
さらに含む。これは、分泌経路に向かうことが運命付けられている新しく合成されたタン
パク質の大部分のＮ末端に存在する短い（一般に、５～３０アミノ酸長）ペプチドである
。特定の実施形態では、本発明によるポリペプチドはリーダー配列を含まない。

特定の実施形態では、ポリペプチドはＨＩＳタグを含む。Ｈｉｓタグまたはポリヒスチ
ジンタグは、多くの場合、タンパク質のＮ末端またはＣ末端にある、少なくとも５個のヒ
スチジン（Ｈ）残基からなる、タンパク質中のアミノ酸モチーフであり、一般には精製目
的のために使用される。

本発明は、本発明によるＲＳＶＦポリペプチドをコードする核酸分子をさらに提供す
る。

好ましい実施形態では、本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子は、哺乳動物
細胞、好ましくはヒト細胞における発現用にコドン最適化される。コドンの最適化方法は
知られており、これまでに記載がなされている（例えば、国際公開第９６／０９３７８号
パンフレット）。野生型配列と比べて少なくとも１つの好ましくないコドンがより好まし
いコドンで置換される場合、配列がコドン最適化されると考えられる。本明細書では、好
ましくないコドンとは、生物において同じアミノ酸をコードする別のコドンと比べて使用
される頻度が低いコドンであり、より好ましいコドンとは、生物において好ましくないコ
ドンと比べてより高頻度に使用されるコドンである。特定の生物におけるコドン使用の頻
度は、コドン頻度表、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏ
ｄｏｎにおいて見出すことができる。好ましくは、２つ以上の好ましくないコドン、好ま
しくは、ほとんどまたはすべての好ましくないコドンがより好ましいコドンに置き換えら
れる。好ましくは、生物で最も高頻度に使用されるコドンがコドン最適化配列において使
用される。好ましいコドンに置き換えると、概して発現が高くなる。

多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸分子が、遺伝暗号の縮重の結果として同じポ
リペプチドをコードし得ることが当業者に理解されるであろう。当業者は、ポリペプチド
が発現されることになる任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するように、核酸分子
によりコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を、ルーチン
的な手法を用いて行い得ることも理解される。したがって、特に指定されない限り、「ア
ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、相互の縮重バージョンであり、同じアミ
ノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質およびＲＮＡをコー
ドするヌクレオチド配列はイントロンを含んでも含まなくてもよい。

核酸配列は、通常の分子生物学技術を用いてクローン化され得るか、またはＤＮＡ合成
により新規に作製され得、それは、ＤＮＡ合成および／または分子クローニングの分野の
事業を有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔｓ、Ｉｎｖｉ
ｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）により、通常の方法を用いて実施され得る。

本発明はまた、上記の核酸分子を含むベクターを提供する。したがって、特定の実施形
態では、本発明による核酸分子はベクターの一部である。このようなベクターは、当業者
によく知られた方法により容易に操作することができ、例えば、原核細胞および／または
真核細胞において複製できるように設計することができる。加えて、多くのベクターは、
真核細胞の形質転換に使用することができ、そのような細胞のゲノムに全体としてまたは
部分的に組み込まれ、その結果、そのゲノムに所望の核酸を含む安定な宿主細胞が得られ
る。使用されるベクターは、ＤＮＡのクローニングに適し、かつ目的の核酸の転写に使用
することができる任意のベクターとすることができる。本発明による好適なベクターは、
例えば、アデノベクター、アルファウイルス、パラミクソウイルス、ワクシニアウイルス
、ヘルペスウイルス、レトロウイルスベクターなどである。当業者は好適な発現ベクター
を選択し、機能的方法で本発明の核酸配列を挿入することができる。

融合前ＲＳＶＦポリペプチドをコードする核酸分子を含む宿主細胞も本発明の一部を
形成する。融合前ＲＳＶＦポリペプチドは、宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスタ
ー卵巣（ＣＨＯ）細胞、腫瘍細胞株、ＢＨＫ細胞、ヒト細胞株、例えばＨＥＫ２９３細胞
、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、もしくは酵母、真菌、昆虫細胞など、またはトランスジェニック動
物もしくはトランスジェニック植物における分子の発現を含む組換えＤＮＡ技術によって
生成することができる。特定の実施形態では、細胞は多細胞生物由来であり、特定の実施
形態では、細胞は脊椎動物または無脊椎動物起源である。特定の実施形態では、細胞は哺
乳動物細胞である。特定の実施形態では、細胞はヒト細胞である。一般に、宿主細胞にお
ける、本発明の融合前ＲＳＶＦポリペプチドなどの組換えタンパク質の生成は、発現可
能形式でそのポリペプチドをコードする異種核酸分子の宿主細胞への導入、核酸分子の発
現に資する条件下での細胞の培養、および前記細胞におけるポリペプチド発現を可能にす
ることを含む。発現可能形式でタンパク質をコードする核酸分子は、発現カセットの形態
であってもよく、通常、エンハンサー、プロモーター、ポリアデニル化シグナルなど、核
酸の発現をもたらし得る配列を必要とする。当業者は、宿主細胞内での遺伝子の発現を得
るのに様々なプロモーターが使用可能であることを認識する。プロモーターは構成的であ
っても調節的であってもよく、ウイルス、原核生物、もしくは真核生物の供給源を含む種
々の供給源から入手すること、または人為的に設計することが可能である。

細胞培養培地は種々のベンダーから入手可能であり、好適な培地は、宿主細胞が、目的
のタンパク質、ここでは融合前ＲＳＶＦポリペプチドを発現するようにルーチン的に選
択することができる。好適な培地は血清を含有しても含有しなくてもよい。

「異種核酸分子」（本明細書では「導入遺伝子」とも呼ばれる）は、宿主細胞に天然に
は存在しない核酸分子である。それは、例えば、標準の分子生物学手法によりベクターに
導入される。導入遺伝子は、一般に、発現制御配列と作動可能に連結される。これは、例
えば、導入遺伝子をコードする核酸をプロモーターの制御下に置くことで実施され得る。
さらなる調節配列を加えることもできる。多くのプロモーターは、導入遺伝子の発現のた
めに使用することができ、当業者に知られており、例えば、これらは、ウイルス、哺乳動
物、合成のプロモーターなどを含むことができる。真核生物細胞内での発現を得るのに適
したプロモーターの非限定な例として、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，３８５，８
３９号明細書）、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、例えばＣＭＶ最初期遺伝子エンハン
サー／プロモーターからのｎｔ．－７３５～＋９５を含むものが挙げられる。ポリアデニ
ル化シグナル、例えばウシ成長ホルモンのポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５
８号明細書）を導入遺伝子の後に存在させることができる。あるいは、いくつかの広く使
用されている発現ベクター、例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡおよびｐＥＦベ
クター系列、ＢＤＳｃｉｅｎｃｅｓからのｐＭＳＣＶおよびｐＴＫ－Ｈｙｇ、Ｓｔｒａ
ｔａｇｅｎｅからのｐＣＭＶ－Ｓｃｒｉｐｔなどが当該技術分野で商用供給源から入手可
能であり、これらは、目的のタンパク質を組換えにより発現させるために、または好適な
プロモーターおよび／もしくは転写ターミネーター配列、ポリＡ配列などを得るために使
用することができる。

細胞培養は、付着細胞培養、例えば培養容器の表面またはマイクロキャリアに付着した
細胞の培養および懸濁培養など、任意のタイプの細胞培養であってよい。多くの大規模懸
濁培養は、操作およびスケールアップが最も簡単であるため、バッチまたはフェドバッチ
工程として操作される。最近では、灌流原理に基づく連続工程がより一般的になりつつあ
り、また好適でもある。好適な培地も当業者によく知られており、一般に、商用供給源か
ら大量に得ること、または標準プロトコルに従って注文生産することが可能である。培養
は、例えば、バッチ、フェドバッチ、連続系などを用いて、シャーレ、ローラーボトルま
たはバイオリアクター内で実施し得る。細胞の好適な培養条件は知られている（例えば、
ＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅａｎｄ
Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）およびＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕ
ｌｔｕｒｅｏｆａｎｉｍａｌｃｅｌｌｓ：Ａｍａｎｕａｌｏｆｂａｓｉｃ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ－ＬｉｓｓＩｎｃ．
，２０００，ＩＳＢＮ０－４７１－３４８８９－９）を参照）。

本発明は、上記のような融合前ＲＳＶＦポリペプチドおよび／または核酸分子、およ
び／またはベクターを含む組成物をさらに提供する。したがって、本発明は、ＲＳＶＦ
タンパク質の融合前コンフォメーションには存在するが、融合後コンフォメーションには
存在しないエピトープを示す融合前ＲＳＶＦポリペプチドを含む組成物を提供する。本
発明はまた、このような融合前ＲＳＶＦポリペプチドをコードする核酸分子および／ま
たはベクターを含む組成物を提供する。本発明は、上記のような融合前ＲＳＶＦポリペ
プチドおよび／または核酸分子および／またはベクターを含む免疫原性組成物をさらに提
供する。本発明はまた、ＲＳＶＦタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導するための
、本発明による安定化された融合前ＲＳＶＦポリペプチド、核酸分子、および／または
ベクターを提供する。さらに、ＲＳＶＦタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する
ための方法であって、本発明による融合前ＲＳＶＦポリペプチドおよび／または核酸分
子および／またはベクターを対象に投与することを含む方法を提供する。また、ＲＳＶ
Ｆタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する際に使用するための、本発明による融合
前ＲＳＶＦポリペプチドおよび／または核酸分子および／またはベクターを提供する。
さらに、ＲＳＶＦタンパク質に対する免疫応答を対象に誘導する際に使用する薬剤を製
造するための、本発明による融合前ＲＳＶＦポリペプチドおよび／または核酸分子およ
び／またはベクターを提供する。

本発明の融合前ＲＳＶＦポリペプチド、核酸分子、またはベクターは、ＲＳＶ感染の
防止（予防）および／または処置に使用することができる。特定の実施形態では、防止お
よび／または処置は、ＲＳＶに感染しやすい患者群を標的にすることができる。そのよう
な患者群としては、以下に限定されるものではないが、例えば、高齢者（例えば、５０歳
以上、６０歳以上、および好ましくは６５歳以上）、若齢者（例えば、５歳以下、１歳以
下）、入院患者、および抗ウイルス性化合物で処置されたが、不十分な抗ウイルス応答を
示した患者が挙げられる。

本発明による融合前ＲＳＶＦポリペプチド、核酸分子、および／またはベクターは、
例えば、ＲＳＶを原因とする疾患もしくは病態のスタンドアロンの処置および／または予
防に、あるいは（既存または将来の）ワクチン、抗ウイルス剤および／またはモノクロー
ナル抗体など、他の予防処置および／または治療処置と組み合わせて使用することができ
る。

本発明は、本発明による融合前ＲＳＶＦポリペプチド、核酸分子、および／またはベ
クターを利用して、対象のＲＳＶ感染を防止および／または処置するための方法をさらに
提供する。特定の実施形態では、対象のＲＳＶ感染を防止および／または処置するための
方法は、上記のような融合前ＲＳＶＦポリペプチド、核酸分子、および／またはベクタ
ーの有効量を、それを必要とする対象に投与することを含む。治療有効量は、ＲＳＶによ
る感染から生じる疾患または病態を防止、寛解、および／または処置するのに効果のある
ポリペプチド、核酸分子、またはベクターの量を指す。防止は、ＲＳＶの伝播の阻害もし
くは低減、またはＲＳＶによる感染に関連した症状の１つもしくは複数の発症、進展、も
しくは進行を阻害もしくは低減することを包含する。本明細書で使用される寛解は、目に
見えるもしくは認知できる疾患の症状、ウイルス血症、またはインフルエンザ感染の他の
任意の計測可能な徴候の低減を指す。

ヒトなどの対象に投与するために、本発明は、本明細書に記載する融合前ＲＳＶＦポ
リペプチド、核酸分子、および／またはベクターと、薬学的に許容される担体または賦形
剤とを含む医薬組成物を使用することができる。この場合、「薬学的に許容される」とい
う用語は、担体または賦形剤が、使用する用量および濃度で、それらを投与する対象に望
ましくないまたは有害な効果を引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容
される担体および賦形剤は、当該技術分野でよく知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．
Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏｍｐａｎｙ［１９
９０］；ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＦｏｒｍｕｌａｔｉｏｎＤｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔｏｆＰｅｐｔｉｄｅｓａｎｄＰｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒａ
ｎｄＬ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；
およびＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｘｃｉｐｉｅｎｔｓ
，３ｒｄｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ
Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照）。ＲＳＶＦポリペプチドまたは核酸分子は、凍結乾燥
製剤を利用することも可能であり得るが、無菌溶液として製剤化し、投与することが好ま
しい。滅菌溶液は、滅菌濾過または当該技術分野でそれ自体知られている他の方法によっ
て調製される。その後、溶液は凍結乾燥または医薬投与容器に充填される。一般に、溶液
のｐＨは、ｐＨ３．０～９．５、例えば、ｐＨ５．０～７．５である。ＲＳＶＦポリペ
プチドは、通常、薬学的に許容される好適な緩衝剤を含む溶液中に存在し、組成物はまた
塩を含有してもよい。任意選択により、アルブミンなどの安定剤が含まれる。特定の実施
形態では、洗浄剤が添加される。特定の実施形態では、ＲＳＶＦポリペプチドは注射剤
に製剤化することができる。

特定の実施形態では、本発明による組成物は、１種または複数のアジュバントをさらに
含む。当該技術分野では、適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに高めるアジュ
バントが知られている。「アジュバント」および「免疫刺激剤」という用語は、本明細書
では同義的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１種または複数の物質と定義される。
これに関連して、アジュバントは、本発明のＲＳＶＦポリペプチドに対する免疫応答を
増強するために使用される。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウムおよ
び／またはリン酸アルミニウムなどのアルミニウム塩；油－エマルジョン組成物（または
水中油型組成物）、例えば、ＭＦ５９などのスクアレン－水エマルジョン（例えば、国際
公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照）；サポニン製剤、例えばＱＳ２１および
免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）など（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書
；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレ
ット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２
６２０号パンフレットを参照）；細菌または微生物の派生物（これらの例には、モノホス
ホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３－Ｏ－脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧ－モチー
フ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰ－リボシル化細菌毒素またはその変異体、例えば大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴなどがある）；真核生
物のタンパク質（例えば、抗体もしくはそのフラグメント（例えば、抗原自体またはＣＤ
１ａ、ＣＤ３、ＣＤ７、ＣＤ８０に向けられたもの）および受容体へのリガンド（例えば
、ＣＤ４０Ｌ、ＧＭＣＳＦ、ＧＣＳＦなど）（これらは受容細胞と相互作用すると同時に
免疫応答を刺激する））が挙げられる。特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば
、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウムアルミニウム、またはそれ
らの組み合わせの形態のアルミニウムを、１用量当たり０．０５～５ｍｇ、例えば０．０
７５～１．０ｍｇの濃度のアルミニウム含有量で、アジュバントとして含んでいる。

融合前ＲＳＶＦポリペプチドはまた、例えばポリマー、リポソーム、ビロソーム、ウ
イルス様粒子などのナノ粒子と組み合わせて、またはそれにコンジュゲートさせて投与す
ることができる。融合前Ｆポリペプチドは、アジュバンドを含む、または含まないナノ粒
子と組み合わせるか、その中に封入するか、またはそれにコンジュゲートさせることがで
きる。リポソーム内への封入は、例えば米国特許第４，２３５，８７７号明細書に記載さ
れている。高分子へのコンジュゲーションは、例えば米国特許第４，３７２，９４５号明
細書または米国特許第４，４７４，７５７号明細書に開示されている。

その他の実施形態では、組成物はアジュバントを含まない。

特定の実施形態では、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチンを
作製する方法であって、本発明による組成物を準備する工程、およびそれを薬学的に許容
される組成物中に製剤化する工程を含む方法を提供する。「ワクチン」という用語は、特
定の病原体または疾患に対して対象にある程度の免疫を誘導するのに効果的な活性成分を
含有する薬剤または組成物を指し、これにより、病原体による感染に関連する症状または
疾患の重症度、期間、または他の徴候が少なくとも低減（最大で完全消失）する。本発明
では、ワクチンは、有効量の融合前ＲＳＶＦポリペプチド、および／または融合前ＲＳ
ＶＦポリペプチドをコードする核酸分子、および／または前記核酸分子を含むベクター
を含み、これにより、ＲＳＶのＦタンパク質に対する免疫応答がもたらされる。これは、
入院に至る重篤な下気道疾患を防止し、対象のＲＳＶ感染および複製による肺炎および細
気管支炎などの合併症の頻度を低減する方法を提供する。本発明による「ワクチン」とい
う用語は、それが医薬組成物であり、したがって、通常、薬学的に許容される希釈剤、担
体、または賦形剤を含むことを意味する。それは、さらなる活性成分を含んでも含まなく
てもよい。特定の実施形態では、それは、例えばＲＳＶの他のタンパク質および／または
他の感染因子に対する免疫応答を誘導する他の成分をさらに含む組合せワクチンであって
もよい。さらなる活性成分の投与は、例えば、別個の投与によって行われても、本発明の
ワクチンとさらなる活性成分の併用製剤を投与することによって行われてもよい。

組成物は、対象、例えばヒト対象に投与することができる。単回投与のための組成物中
のＲＳＶＦポリペプチドの総用量は、例えば約０．０１μｇ～約１０ｍｇ、例えば１μ
ｇ～１ｍｇ、例えば１０μｇ～１００μｇとすることができる。推奨用量の決定は実験に
より行われ、当業者にはルーチン的である。

本発明による組成物の投与は、標準投与経路を使用して実施することができる。非限定
的実施形態としては、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、または例えば鼻腔内
、口腔内などの粘膜投与などの非経口投与が挙げられる。一実施形態では、組成物は筋肉
内注射により投与される。当業者は、ワクチン中の抗原に対する免疫応答を誘導するため
に、例えばワクチンなどの組成物を投与する様々な可能性を認識している。

本明細書で使用する対象は、好ましくは哺乳動物、例えば、マウス、コットンラットな
どのげっ歯類、または非ヒト霊長類、またはヒトである。対象は、好ましくは、ヒト対象
である。

ポリペプチド、核酸分子、ベクター、および／または組成物はまた、初回免疫としてま
たは追加免疫として、同種または異種初回免疫－追加免疫レジメンで投与することができ
る。追加免疫ワクチン接種を実施する場合、通常、そのような追加免疫ワクチン接種は、
最初に対象に組成物を投与した後（このような場合には「初回ワクチン接種」と呼ばれる
）、１週～１年、好ましくは２週～４ヶ月のある時点で同じ対象に投与される。特定の実
施形態では、投与は初回免疫投与および少なくとも１回の追加免疫投与を含む。

加えて、本発明のポリペプチドは、例えば、本発明のポリペプチドに結合可能な抗体が
個体の血清中にあるか否かを確定することにより、個体の免疫状態を検査するための診断
ツールとして使用することができる。したがって、本発明はまた、患者のＲＳＶ感染の存
在を検出するためのｉｎｖｉｔｒｏ診断方法であって、ａ）前記患者から得られた生体
試料を本発明によるポリペプチドと接触させる工程と、ｂ）抗体－ポリペプチド複合体の
存在を検出する工程とを含む方法に関する。

本発明は、ＲＳＶＦポリペプチドの融合前コンフォメーションを安定化させる方法で
あって、野生型ＲＳＶＦ１および／またはＦ２ドメインと比較して、ＲＳＶＦ１および
／またはＦ２ドメイン中に少なくとも１つの変異を導入することを含み、その少なくとも
１つの変異は、ＲＳＶ先端部の３重へリックス（アルファヘリックス１、４および５）に
おける変異によるアルファへリックス４の可動または移動を止める方法をさらに提供する
。特定の実施形態では、アルファ４中の少なくとも１つの変異は、２０３位のアミノ酸残
基ＬｅｕのＩｌｅへの変異である。

このような方法によって得ることができ、かつ／または得られる安定化された融合前Ｒ
ＳＶＦポリペプチドも上記のようなその使用と共に本発明の一部を形成する。

実施例１
ＲＶＳＦ融合前コンフォメーションの不安定な先端部を安定化させるために、安定化
Ｓ２１５Ｐ変異およびＣ－末端フィブリチンモチーフを有する、準安定ＲＳＶＦ変異体
にアルファ４のＬｅｕ２０３Ｉｌｅ置換を導入した。

ＲＳＶＦタンパク質の発現および精製
２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）細胞内で組換え
タンパク質を発現させた。製造業者の説明書に従い、２９３Ｆｅｃｔｉｎ（ＬｉｆｅＴ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、細胞に一過性にトランスフェクトし、３７℃、１０
％ＣＯ２の振盪インキュベーター中で培養した。トランスフェクションから５日目に、Ｆ
タンパク質を含む培養上清を採取した。除菌ろ過した上清を使用時まで４℃で保存した。
陽イオン交換クロマトグラフィーに次いでサイズ排除クロマトグラフィーを使用する２工
程プロトコルにより組換えポリペプチドを精製した（図１）。イオン交換工程のために、
培養上清を２容量の５０ｍＭＮａＯＡｃ、ｐＨ５．０で希釈し、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ
ＣａｐｔｏＳカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に毎分５ｍｌで通した。次いで
、カラムを、１０カラム容量（ＣＶ）の２０ｍＭＮａＯＡｃ、５０ｍＭＮａＣｌ、０
．０１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５で洗浄し、１５％段階溶離の５０ｍＭＮａ
ＯＡｃ、１ＭＮａＣｌ、０．０１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ５で溶出した。溶
出液を濃縮し、ランニングバッファーとして４０ｍＭトリス、１５０ｍＭＮａＣｌ、０
．０１％（ｖ／ｖ）ｔｗｅｅｎ２０およびｐＨ７．４を使用してＳｕｐｅｒｄｅｘ２００
カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）によりタンパク質をさらに精製した。精製したタ
ンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびＮａｔｉｖｅＰＡＧＥにより分析した（図２）。タ
ンパク質はクマシーブリリアントブルーで染色して、ゲル上に可視化した。ＳＤＳ－ＰＡ
ＧＥの主バンドは、還元化試料では、ＲＳＶＦタンパク質のＦ１およびＦ２ドメインに
対応し、非還元化試料では、主バンドはジスルフィド結合で連結しているＦ１＋Ｆ２ドメ
インのサイズに対応する。ＮａｔｉｖｅＰａｇｅでは、タンパク質の電気泳動移動度は
、ＲＳＶＦ三量体の１つに対応する。精製したタンパク質の融合前コンフォメーション
を、ＣＲ９５０１抗体に結合させることにより確認した（データは示さず）。精製した融
合前三量体ＲＳＶＦタンパク質は、次の分析まで４Ｃで保存した。

安定性試験
融合前タンパク質の融合後コンフォメーションへの自然転換能を保存安定性試験により
評価した。粗製の細胞培養上清試料を４℃で保存し、上述の定量分析法により、Ｏｃｔｅ
ｔ装置を使用して試料のＦタンパク質濃度を測定した。測定は、上清採取日（第１日）、
および示した保存期間後に行った。ＣＲ９５０１は、融合前Ｆコンフォメーションのみを
認識するモノクローナル抗体であり（国際公開第２０１２／００６５９６号パンフレット
）、融合前ＲＳＶＦタンパク質濃度の測定に使用した。

精製したタンパク質の温度安定性を示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）により決定した。精
製した融合前Ｆタンパク質を９６ウェル光学ｑＰＣＲプレート内でＳＹＰＲＯ橙色蛍光染
料（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＳ６６５０）と混合した。染料とタンパク質
の最適濃度を実験により決定した（データは示さず）。タンパク質の希釈はすべてＰＢＳ
により行い、減算参照用として染料のみを含有する陰性対照試料を使用した。測定はｑＰ
ＣＲ装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓＶｉｉＡ７）により、次のパラメ
ータを使用して行った：２５～９５℃は毎秒０．０１５℃の速度で昇温。データは連続的
に取得した。ＧｒａｐｈＰａｄＰＲＩＳＭソフトウェア（バージョン５．０４）を使用
して、溶融曲線の１次導関数をプロットした。導関数曲線の最小点で溶融温度を算出した
。

図３に示すように、Ｓ２１５Ｐ置換でのみ安定化させた準安定Ｆ変異体は、４℃で５日
間の保存後、融合前に特異的なＭａｂＣＲ９５０１へのほぼすべての結合を喪失してい
た。対照的に、ｌＬ２０３Ｉ置換を追加すると、この準安定ＲＳＶＦ変異体の安定性が
劇的に増大した。採取日のＣＲ９５０１結合の全結合はより多く、４℃で１５日間の保存
後でＣＲ９５０１結合のごく僅かな低下が観察された。Ｌｅｕ２０３のＩｌｅへの置換を
追加することにより、Ｓ２１５Ｐの単一置換のみを含有する準安定融合前Ｆタンパク質と
比べて、融合前Ｆ安定性の貯蔵安定性が増大する。ＤＳＦ実験によれば、Ｌ２０３Ｉ置換
の追加により、Ｎ６７ＩおよびＳ２１５Ｐ置換を含有する変異体（５７．０℃）と比べて
、熱安定性も増大（５９．５℃）した（図４）。

コンストラクトの、発現レベル、保存安定性、およびＲＳＶ－Ｆの融合前コンフォメー
ションに特異的なＣＲ９５０１抗体との抗体結合について試験した。重鎖および軽鎖の可
変領域のアミノ酸配列、ならびにこの抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を以下
に示す。ＣＲ９５０１は、国際公開第２０１２／００６５９６号パンフレット中の５８Ｃ
５と呼ばれる抗体の結合領域を含む。

実施例２
本発明によれば、Ｌｅｕ２０３Ｉｌｅ置換と他の安定化変異との組み合わせにより、非
常に安定なＲＳＶＦタンパク質が得られることが示された。

ＲＳＶＦタンパク質の発現、精製および特徴付け
組換えタンパク質を発現させ、上記のように精製した。精製したタンパク質をＳＤＳ－
ＰＡＧＥにより分析した（図５）。タンパク質はゲル上で、還元試料ではＲＳＶＦタン
パク質のＦ１およびＦ２ドメインに対応するバンドのみが、および非還元試料では互いに
結合したＦ１＋Ｆ２ドメインに対応するバンドのみが観察され、純粋であった。精製した
試料のＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析（図６）では、試料中に存在する唯一のタンパク質種が、グ
リコシル化ＲＳＶＦ三量体の予測された分子量に対応する約１７０ｋＤａの分子量を有
することが示された。ＳＥＣ－ＭＡＬＳは、ＴＳＫＧ３０００ＳＷＸＬカラム（Ｔｏｓ
ｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用し、ＡｇｉｌｅｎｔＨＰＬＣシステムによりを行
った。ＭＡＬＳ測定は、ＭｉｎｉＤＡＷＮＴｒｅｏｓインライン検出器（Ｗｙａｔｔ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して行った。タンパク質濃度は、２８０ｎｍのＵＶモニタ
ーおよび６６０ｎｍの屈折率検出器（ＯｐｔｉｌａｂＴｒＥＸ、ＷｙａｔｔＴｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ）を使用してモニターした。次の順序で検出器の垂直性を調べた：ＵＶ、Ｍ
ＡＬＳ、ＲＩ。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ実験では、ＭＡＬＳバッファー（１７．３ｇＮａ２Ｈ
ＰＯ４＊２Ｈ２Ｏ／Ｌ、７．３ｇＮａＨ２ＰＯ４＊Ｈ２Ｏ／Ｌ、２．９ｇＮａＣｌ
／Ｌ、ｐＨ７）および流量１ｍｌ／ｍｉｎを用いた。屈折率検出器および０．１４１ｍｌ
／ｇの屈折率増分（ｄｎ／ｄｃ）値を使用し、Ａｓｔｒａソフトウェア６．１（Ｗｙａｔ
ｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によりデータを分析した。屈折率結果のピークの最大値を使
用して分子量を決定し、吸光係数で補正したＵＶ－信号の全ピーク面積％を使用して全ピ
ーク面積を決定する。

安定性試験
実施例１で記載したように、精製したタンパク質の温度安定性を示差走査蛍光定量法（
ＤＳＦ）により決定した。図４に示すように、Ｌ２０３Ｉ置換をＳ２１５ＰおよびＤ４８
６Ｎと組み合わせた場合、Ｎ６７Ｉの有無にかかわらず、タンパク質の熱安定性はそれぞ
れ約６７℃および約７０℃に増大する。

本発明は次の実施態様を含む。
［１］
組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチドであって、野生型ＲＳＶＦタンパク質中のＲＳＶＦ１および／またはＦ２ドメインと比較して、少なくとも２つの安定化変異をＦ１および／またはＦ２ドメイン中に含み、前記安定化変異の少なくとも１つは、２０３位のアミノ酸残基ＬのＩへの変異である、組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチド。
［２］
２１５位のアミノ酸残基Ｓの変異、好ましくは、前記２１５位のアミノ酸残基ＳのＰへの変異をさらに含む、上記［１］に記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド。
［３］
融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含み、前記少なくとも１つのエピトープは、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３領域、および配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体、ならびに／または配列番号７の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号９の重鎖ＣＤＲ３領域、および配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号６７の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体によって認識される、上記［１］または［２］に記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド。
［４］
三量体である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド。
［５］
短縮されたＦ１ドメインを含み、前記短縮されたＦ１ドメインに連結された異種三量化ドメインを含む、上記［１］～［４］のいずれかに記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド。
［６］
前記異種三量化ドメインは、アミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号１４）を含む、上記［５］に記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド。
［７］
前記三量化ドメインは、前記ＲＳＶＦタンパク質のアミノ酸残基５１３に連結されている、上記［５］または［６］に記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド。
［８］
少なくとも１つのさらなる変異を含み、前記変異は、
（ａ）４６位のアミノ酸残基の変異；
（ｂ）６７位のアミノ酸残基の変異；
（ｃ）８３位のアミノ酸残基の変異；
（ｄ）９２位のアミノ酸残基の変異；
（ｅ）１８４位のアミノ酸残基の変異；
（ｆ）２０７位のアミノ酸残基の変異；
（ｇ）４８６位のアミノ酸残基の変異；および
（ｈ）４８７位のアミノ酸残基の変異
からなる群から選択される、上記［１］～［７］のいずれかに記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド。
［９］
前記少なくとも１つのさらなる変異は、
（ａ）前記４６位のアミノ酸残基ＳのＧへの変異；
（ｂ）前記６７位のアミノ酸残基Ｎ／ＴのＩへの変異；
（ｃ）前記８３位のアミノ酸残基ＬのＭへの変異；
（ｄ）前記９２位のアミノ酸残基ＥのＤへの変異；
（ｅ）前記１８４位のアミノ酸残基ＧのＮへの変異；
（ｆ）前記２０７位のアミノ酸残基ＶのＩへの変異；
（ｇ）前記４８６位のアミノ酸残基ＤのＮへの変異；および
（ｈ）前記４８７位のアミノ酸残基ＥのＱ、Ｎ、またはＩへの変異
からなる群から選択される、上記［８］に記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド。
［１０］
前記Ｆ１ドメインおよび／または前記Ｆ２ドメインは、ＲＳＶＡ株由来である、上記［１］～［９］のいずれかに記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド。
［１１］
前記Ｆ１ドメインおよび／または前記Ｆ２ドメインは、ＲＳＶＢ株由来である、上記［１］～［１０］のいずれかに記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド。
［１２］
配列番号２０、配列番号２１、配列番号２３および配列番号２４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、上記［１］～［１１］のいずれかに記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド。
［１３］
上記［１］～［１２］のいずれかに記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチドをコードする核酸分子。
［１４］
哺乳動物細胞における発現用にコドン最適化されている、上記［１３］に記載の核酸分子。
［１５］
上記［１３］または［１４］に記載の核酸分子を含むベクター。
［１６］
上記［１］～［１２］のいずれかに記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド、上記［１３］もしくは［１４］に記載の核酸分子、および／または上記［１５］に記載のベクターを含む組成物。
［１７］
ＲＳＶＦタンパク質に対する免疫応答の誘導に使用するための、上記［１］～［１２］のいずれかに記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド、上記［１３］もしくは［１４］に記載の核酸分子、および／または上記［１５］に記載のベクター。
［１８］
ワクチンとして使用するための、上記［１］～［１２］のいずれかに記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド、上記［１３］もしくは［１４］に記載の核酸分子、および／または上記［１５］に記載のベクター。
［１９］
ＲＳＶ感染の予防および／または処置に使用するための、上記［１］～［１２］のいずれかに記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド、上記［１３］もしくは［１４］に記載の核酸分子、および／または上記［１５］に記載のベクター。

融合前ＲＳＶＦコンストラクトのいくつかのアミノ酸配列を以下に示す。本明細書に
記載の異なるコンストラクトにおけるアミノ酸の番号付与は、野生型配列（２つの修飾（
Ｋ６６ＥおよびＩ７６Ｖ）を含む配列番号１３）に基づいていることに留意されたい。

配列
ＲＳＶＦタンパク質Ａ２完全長配列（配列番号１３）

ＲＳＶＦタンパク質Ｂ１完全長配列（配列番号１５）

配列番号１４（フィブリチン）
ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ
ＦＡ２、Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６Ｖ、Ｓ２１５Ｐ（配列番号２０）

ＦＡ２、Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６Ｖ、Ｌ２０３Ｉ、Ｓ２１５Ｐ（配列番号２１）

ＦＡ２、Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６Ｖ、Ｌ２０３Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｄ４８６Ｎ（配列番号２３）

ＦＡ２、Ｋ６６Ｅ、Ｎ６７Ｉ、Ｉ７６Ｖ、Ｌ２０３Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｄ４８６Ｎ（配列番
号２４）

ＲＳＶＦタンパク質ＣＬ５７－ｖ２２４完全長配列（配列番号２２）

ＣＲ９５０１重鎖（配列番号１６）：

ＣＲ９５０１軽鎖（配列番号１７）：

ＣＲ９５０２重鎖（配列番号１８）：

ＣＲ９５０２軽鎖（配列番号１９）：

Claims

組換え融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）融合（Ｆ）ポリペプチドであって、
ＲＳＶＦ１ドメインおよびＦ２ドメインを含み、
前記Ｆ１ドメインおよび／またはＦ２ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸残基１３７～５７４およびアミノ酸残基２７～１０９において２つの安定化変異を含むアミノ酸配列を含み、
前記安定化変異は、２０３位のアミノ酸残基ＬのＩへの変異および２１５位のアミノ酸残基ＳのＰへの変異である、
前記融合前ＲＳＶＦポリペプチド（アミノ酸位置は配列番号１３のアミノ酸配列を参照して付与される）。
融合前コンフォメーションＦタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含み、前記少なくとも１つのエピトープは、配列番号１の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号２の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号３の重鎖ＣＤＲ３領域、および配列番号４の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号５の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号６の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体、ならびに／または配列番号７の重鎖ＣＤＲ１領域、配列番号８の重鎖ＣＤＲ２領域、配列番号９の重鎖ＣＤＲ３領域、および配列番号１０の軽鎖ＣＤＲ１領域、配列番号６７の軽鎖ＣＤＲ２領域、および配列番号１１の軽鎖ＣＤＲ３領域を含む融合前特異的モノクローナル抗体によって認識される、請求項１に記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド。
三量体ポリペプチドを形成する、請求項１又は２に記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド。
前記ＲＳＶＦ１ドメインが、アミノ酸残基１３７～５１３を含む短縮されたＦ１ドメイン及び前記短縮されたＦ１ドメインに連結された異種三量化ドメインを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド。
前記異種三量化ドメインは、アミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号１４）を含む、請求項４に記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド。
前記三量化ドメインは、前記短縮されたＦ１ドメインのアミノ酸残基５１３（アミノ酸位置は配列番号１３のアミノ酸配列を参照して付与される）に連結されている、請求項４または５に記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド。
４８６位（アミノ酸位置は配列番号１３のアミノ酸配列を参照して付与される）のアミノ酸残基ＤのＮへの変異をさらに含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド。
請求項１～７のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチドをコードする核酸分子。
哺乳動物細胞における発現用にコドン最適化されている、請求項８に記載の核酸分子。
請求項８または９に記載の核酸分子を含むベクター。
請求項１～７のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド、請求項８もしくは９に記載の核酸分子、および／または請求項１０に記載のベクターを含む組成物。
ＲＳＶＦタンパク質に対する免疫応答の誘導に使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド、請求項８もしくは９に記載の核酸分子、および／または請求項１０に記載のベクター。
ワクチンとして使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド、請求項８もしくは９に記載の核酸分子、および／または請求項１０に記載のベクター。
ＲＳＶ感染の予防および／または処置に使用するための、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合前ＲＳＶＦポリペプチド、請求項８もしくは９に記載の核酸分子、および／または請求項１０に記載のベクター。