ES2898235T3 - Secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de adenovirus de simio, vectores que las contienen, y sus usos - Google Patents

Secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de adenovirus de simio, vectores que las contienen, y sus usos Download PDF

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Abstract

Un polinucleótido que comprende: (i) un polinucleótido que codifica una proteína hexón adenoviral que tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 22; (ii) un polinucleótido que codifica una proteína de fibra adenoviral que tiene la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:16; y (iii) un polinucleótido que codifica una proteína pentón adenoviral que tiene la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:28.

Description

DESCRIPCIÓN
Secuencias de aminoácidos y de ácidos nucleicos de adenovirus de simio, vectores que las contienen, y sus usos
La presente invención se refiere a novedosas cepas de adenovirus con seroprevalencia mejorada. En un aspecto, la presente descripción se refiere a polipéptidos aislados de proteínas de la cápside adenoviral, tales como proteína hexón, pentón y de fibra y fragmentos de la misma y polinucleótidos que codifican la misma. También se proporciona un vector que comprende el polinucleótido aislado según la invención y adenovirus que comprenden los polinucleótidos o polipéptidos aislados según la invención y una composición farmacéutica que comprende dicho vector, adenovirus, polipéptido y/o polinucleótido.
Antecedentes de la invención
Los adenovirus (Ads) comprenden una gran familia de virus de ADN bicatenario que se encuentran en anfibios, aves y mamíferos que tienen una estructura de la cápside icosaédrica no envuelta (Straus, Adenovirus infections in humans; The Adenoviruses, 451-498, 1984; Hierholzer et al., J. Infect. Dis., 158: 804-813, 1988; Schnurr y Dondero, Intervirology., 36: 79-83, 1993; Jong et al., J. Clin. Microbiol., 37: 3940-3945: 1999). En contraste con los retrovirus, los adenovirus pueden transducir numerosos tipos de células de varias especies de mamíferos, incluyendo las células que se dividen y las que no se dividen, sin integrarse en el genoma de la célula huésped.
En términos generales, el ADN adenoviral es normalmente muy estable y permanece episomal (p. ej., extracromosómico), a menos que se haya producido transformación o tumorigénesis. Además, los vectores adenovirales se pueden propagar con altos rendimientos en sistemas de producción bien definidos que son fácilmente susceptibles de producción a escala farmacéutica de composiciones de grado clínico. Estas características y su genética molecular bien caracterizada hacen que los vectores adenovirales recombinantes sean buenos candidatos para su uso como vehículos de vacuna. La producción de vectores adenovirales recombinantes puede basarse en el uso de una línea celular de empaquetamiento que es capaz de complementar las funciones de los productos génicos adenovirales que han sido delecionados o modificados por ingeniería genética para que sean no funcionales.
Actualmente, dos serotipos de adenovirus del subgrupo C humano bien caracterizados (es decir, hAd2 y hAd5) se utilizan ampliamente como fuentes de la cadena principal viral para la mayoría de los vectores adenovirales que se utilizan para terapia génica. Los vectores adenovirales humanos defectuosos de replicación también se han sometido a ensayo como vehículos de vacuna para la entrega de una variedad de inmunógenos derivados a partir de una variedad de agentes infecciosos. Los estudios llevados a cabo en animales experimentales (p. ej., roedores, caninos y primates no humanos) indican que los vectores adenovirales humanos defectuosos de replicación recombinantes que transportan transgenes que codifican inmunógenos, así como otros antígenos, provocan respuestas inmunitarias tanto humorales como mediadas por células contra el producto transgénico. Hablando en términos generales, los investigadores han notificado el éxito del uso de vectores adenovirales humanos como vehículos de vacunas en sistemas experimentales no humanos mediante el uso de protocolos de inmunización que utilizan altas dosis de vectores adenovirales recombinantes que se predice que provocarán respuestas inmunitarias; o mediante el uso de protocolos de inmunización que emplean la administración secuencial de vectores adenovirales que se derivan de diferentes serotipos pero que llevan el mismo producto transgénico que las inmunizaciones de refuerzo (Mastrangeli, et al., Human Gene Therapy, 7: 79-87 (1996).
Los vectores virales basados en adenovirus humano tipo 5 (Ad5) se han desarrollado para diferentes terapias génicas y aplicaciones de vacunas. Aunque los vectores basados en Ad5 son extremadamente eficientes en modelos animales, la presencia de una inmunidad preexistente en humanos contra el virus de tipo silvestre Ad5 se ha demostrado en ensayos clínicos para reducir la eficacia de la transducción de genes. En particular, se demostró una clara reducción de la eficacia de la inmunización en sujetos con títulos de anticuerpos neutralizantes de más de 200 participantes en un ensayo clínico de vacuna basado en vectores Ad5. La caracterización más extensa de una vacuna vectorizada Ad5 se obtuvo en el ensayo STEP de vacuna contra el VIH realizada por Merck (Moore JP et al., Science. 9 de mayo de 2008; 320(5877):753-5). El estudio de la vacuna se basó en la co-inyección de 3 vectores Ad5 que expresan diferentes antígenos de VIH como prueba de estudio conceptual en sujetos con alto riesgo de infección por VIH. Sorprendentemente, los datos revelaron un aumento de la tasa de infección por VIH en sujetos vacunados con inmunidad preexistente anti-Ad5 en lugar de un efecto protector. Aunque el mecanismo de esta observación paradójica aún no está claro, los resultados plantearon preguntas adicionales sobre la seguridad y la eficiencia de los vectores basados en adenovirus de origen humano para la aplicación de vacunas en sujetos sanos. Tomados en conjunto, todos los resultados obtenidos hasta el momento en diferentes ensayos clínicos de vacunas y terapias génicas, tales como los ensayos con vectores Ad5, aumentaron la necesidad de un adenovirus caracterizado por una inmunidad preexistente muy baja o ausente en humanos.
El documento WO 2005/071093 describe vectores adenovirales recombinantes con replicación defectuosa derivados de adenovirus de chimpancé y métodos para generar adenovirus recombinantes en líneas celulares que expresan E1 humanas.
El documento WO 2009/073104 describe un vector recombinante que comprende secuencias de adenovirus de simio SAdV-39, -25.2, -26, -30, -37 y -38 y un gen heterólogo bajo el control de secuencias reguladoras. También se describe una línea celular que expresa los genes SAdV-39, -25.2, -26, -30, -37 y -383 de adenovirus de simio. Se proporcionan métodos para usar los vectores y las líneas celulares.
El documento WO 03/046124 describe un vector recombinante que comprende secuencias de adenovirus de simio y un gen heterólogo bajo el control de secuencias reguladoras. También se describe una línea celular que expresa genes de adenovirus de simio. Se proporcionan métodos para usar los vectores y las líneas celulares.
Steven F. Farina et al .: "Replication-defective vector based on a chimpanzee adenovirus" (Vector de replicación defectuosa basado en un adenovirus de chimpancé) Journal of Virology 75.23 (2001): 11603-11613 describe un adenovirus previamente aislado de un ganglio linfático mesentérico de un chimpancé.
Soumitra Roy et al.: "Partial protection against H5N1 influenza in mice with a single dose of a chimpanzee adenovirus vector expressing nucleoprotein." (Protección parcial contra influenza H5N1 en ratones con una sola dosis de un vector de adenovirus de chimpancé que expresa nucleoproteína). Vaccine 25.39-40 (2007): 6845-6851 investiga el desarrollo de vectores adenovirales basados en serotipos no humanos tales como el adenovirus de simio adenovirus de chimpancé 24 (AdC7).
N. Tatsis y col. "Chimpanzee-origin adenovirus vectors as vaccine carriers" (Vectores de adenovirus de origen chimpancé como portadores de vacunas). Gene Therapy 13.5 (2006): 421-429 describe que se están desarrollando vacunas basadas en vectores adenovirales de replicación defectuosa para agentes infecciosos y antígenos asociados a tumores.
Daniela Peruzzi y col. "A novel chimpanzee serotype-based adenoviral vector as delivery tool for cancer vaccines." (Un nuevo vector adenoviral basado en el serotipo de chimpancé como herramienta de administración de vacunas contra el cáncer). Vaccine 27.9 (2009): 1293-1300 describe que es necesario utilizar serotipos de Ad alternativos poco comunes. En este estudio, se diseñó un Ad recombinante con deleción E1-E3 basado en el serotipo 3 de chimpancé (ChAd3) para expresar la proteína del antígeno carcinoembrionario humano (CEA) o dominios extracelulares/transmembrana neu de rata (ECD.TM). Los vectores ChAd3 se probaron en ratones transgénicos CEA (CEA.Tg) y BALB/NeuT, que muestran tolerancia inmunológica a estos antígenos. ChAd3 es capaz de inducir una respuesta inmunitaria equiparable a la de los vectores basados en el serotipo hAd5, rompiendo así la tolerancia a los antígenos asociados a tumores (TAA) y logrando efectos antitumorales.
Kimberly McCoy y col. "Effect of preexisting immunity to adenovirus human serotype 5 antigens on the immune responses of nonhuman primates to vaccine regimens based on human-or chimpanzee-derived adenovirus vectors." (Efecto de la inmunidad preexistente a los antígenos del serotipo 5 humano de adenovirus sobre las respuestas inmunitarias de primates no humanos a regímenes de vacuna basados en vectores de adenovirus derivados de seres humanos o chimpancés). Journal of Virology 81.12 (2007): 6594-6604 describe un régimen de refuerzo con dos vectores de adenovirus (Ad) con replicación defectuosa serológicamente distintos derivados de los serotipos de chimpancé C68 y C1 que expresan Gag, Pol, gp140 y Nef del tipo de virus de inmunodeficiencia humana 1 con un régimen en el que se administraron dos veces vectores Ad de replicación defectuosa del serotipo humano 5 (AdHu5). Soumitra Roy y col. "Complete nucleotide sequences and genome organization of four chimpanzee adenoviruses." (Secuencias de nucleótidos completas y organización del genoma de cuatro adenovirus de chimpancé). Virology 324.2 (2004): 361-372 describe las secuencias de nucleótidos completas para cuatro adenovirus: adenovirus de simio 21, 22, 23 y 24.
El documento WO 2009/146902 describe péptidos de unión a CD81 de la glicoproteína E2 del virus de la hepatitis C (VHC), que carecen de o están mutados dentro de los 27 aminoácidos amino terminales de la glicoproteína de la envoltura E2 madura, o una variante de la misma que conserva la capacidad de unirse a CD81.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona el polinucleótido de la reivindicación 1, el vector de la reivindicación 4, el adenovirus recombinante de la reivindicación 6, la composición de la reivindicación 12, y la célula de la reivindicación 13. Las reivindicaciones dependientes describen características preferidas pero opcionales.
En un primer aspecto, la presente invención proporciona un polinucleótido que comprende (i) un polinucleótido que codifica una proteína de fibra adenoviral que tiene la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:16; (ii) un polinucleótido que codifica la proteína hexón adenoviral que tiene la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:22; y (iii) un polinucleótido que codifica una proteína pentón adenoviral que tiene la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:28.
Asimismo se describe y especifica un polinucleótido aislado que codifica una proteína de fibra adenoviral o un derivado funcional de la misma y que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NOs: 14-19, 50 y 53;
(b) un polinucleótido que codifica el derivado funcional de un polipéptido según cualquiera de las SEQ ID NOs: 14-19, 50 y 53, en donde dicho derivado funcional comprende la deleción, inserción y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos; y
(c) un polinucleótido que codifica un derivado funcional que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 14-19, 50 y 53.
Asimismo se describe y especifica un polinucleótido aislado que codifica una proteína hexón adenoviral o un derivado funcional de la misma y que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NOs: 20-25, 51 y 54;
(b) un polinucleótido que codifica el derivado funcional de un polipéptido según cualquiera de las SEQ ID NOs: 20-25, 51 y 54, en donde dicho derivado funcional comprende la deleción, inserción y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos; y
(c) un polinucleótido que codifica un derivado funcional que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 20-15, 51 y 54.
Asimismo se describe y especifica un polinucleótido aislado que codifica una proteína pentón adenoviral o un derivado funcional de la misma y que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NOs: 26-31, 52 y 55;
(b) un polinucleótido que codifica el derivado funcional de un polipéptido según cualquiera de las SEQ ID NOs: 26-31, 52 y 55, en donde dicho derivado funcional comprende la deleción, inserción y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos; y
(c) un polinucleótido que codifica un derivado funcional que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 26-31, 52 y 55.
La descripción también se refiere a un polinucleótido que comprende al menos uno de los polinucleótidos aislados como se ha expuesto anteriormente. Asimismo se describe un polipéptido de la cápside adenoviral aislado codificado por el polinucleótido según la invención o un derivado funcional del mismo.
En un aspecto adicional, la invención proporciona un vector que comprende el polinucleótido aislado según la invención.
También se proporciona un adenovirus recombinante, preferiblemente un adenovirus incompetente para la replicación, que comprende un polinucleótido según la invención y/o el polipéptido de la cápside adenoviral codificado por el polinucleótido según la invención.
Un aspecto adicional de la invención es una composición que comprende un adyuvante y al menos uno de los siguientes (i) a (iv):
(i) un polipéptido de la cápside adenoviral codificado por el polinucleótido según la invención;
(ii) un polinucleótido según la invención;
(iii) un vector según la invención;
(iv) un adenovirus recombinante según la invención;
y, opcionalmente, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
La invención se refiere además a una célula que comprende al menos uno de los siguientes:
(i) un polipéptido de la cápside adenoviral codificado por el polinucleótido según la invención;
(ii) un polinucleótido según la invención;
(iii) un vector según la invención;
(iv) un adenovirus recombinante según la invención.
Descripción detallada de la invención
Antes de que la presente invención se describa en detalle a continuación, queda entendido que esta invención no está limitada a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos en la presente memoria ya que estos pueden variar. También debe entenderse que la terminología empleada en esta memoria tiene el fin de describir solamente realizaciones particulares, y no tiene por objeto limitar el alcance de la presente invención que estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas. A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos empleados en esta memoria tienen los mismos significados que entiende comúnmente un experto en la técnica.
Preferiblemente, los términos empleados en esta memoria se definen como se describe en "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", Leuenberger, H.G.W, Nagel, B. y Klbl, H. eds. (1995), Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basilea, Suiza) y como se describe en "Pharmaceutical Substances: Syntheses, Patents, Applications" de Axel Kleemann y Jurgen Engel, Thieme Medical Publishing, 1999; el "Merck Index: An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals", editado por Susan Budavari et al., CRC Press, 1996, y la Farmacopea de los Estados Unidos-25/Formulario nacional-20, publicado por la Convención Farmacológica de los Estados Unidos, Inc., Rockville Md., 2001.
A lo largo de esta memoria descriptiva y las siguientes reivindicaciones, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que el término "comprender" y las variaciones tales como "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de una característica, número entero o etapa o grupo de características, números enteros o etapas establecidos, pero no la exclusión de cualquier otra característica, número entero o etapa o grupo de números enteros o etapas. En los siguientes pasajes, se definen diferentes aspectos de la invención con más detalle. Cada aspecto así definido se puede combinar con cualquier otro aspecto o aspectos a menos que se indique claramente lo contrario. En particular, cualquier característica indicada como preferida o ventajosa se puede combinar con cualquier otra característica o características indicadas como preferidas o ventajosas.
Varios documentos se citan a lo largo del texto de esta memoria descriptiva, (incluyendo patentes, solicitudes de patente, publicaciones científicas, especificaciones del fabricante, instrucciones, etc.). Nada en la presente memoria debe interpretarse como una admisión de que la invención no tiene derecho a preceder dicha descripción en virtud de la invención anterior.
A continuación, se proporcionan algunas definiciones de los términos frecuentemente utilizados en esta memoria descriptiva. Estos términos, en cada instancia de su uso, en el resto de la memoria descriptiva tendrán el significado definido y los significados preferidos, respectivamente.
En términos generales, el genoma adenoviral está bien caracterizado. Existe una conservación general en la organización global del genoma adenoviral con respecto a los marcos de lectura abiertos específicos que se posicionan de forma similar, p. ej., la ubicación de los genes E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4, L1, l2, L3, L4 y L5 de cada virus. Cada extremidad del genoma adenoviral comprende una secuencia conocida como repetición terminal invertida (RTIs), que es necesaria para la replicación viral. El virus también comprende una proteasa codificada por virus, que es necesaria para procesar algunas de las proteínas estructurales requeridas para producir viriones infecciosos. La estructura del genoma adenoviral se describe sobre la base del orden en el que los genes virales se expresan después de la transducción de la célula huésped. Más específicamente, los genes virales se denominan como genes tempranos (Tem) o tardíos (Tar) en función de si la transcripción ocurre antes o después del comienzo de la replicación del ADN. En la fase temprana de transducción, los genes E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4 de adenovirus se expresan para preparar la célula huésped para la replicación viral. Durante la fase tardía de la infección, se activa la expresión de los genes tardíos L1-L5, que codifican los componentes estructurales de las partículas del virus.
La siguiente Tabla 1 proporciona una perspectiva general de las secuencias a las que se hace referencia en la presente memoria:
Tabla 1
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Como se emplea en esta memoria, el término "aislado" se refiere a una molécula que está esencialmente libre de otras moléculas con las que está asociada de forma natural. Por consiguiente, una molécula aislada está libre de otras moléculas que podrían encontrarse o ponerse en contacto en un animal vivo en la naturaleza, es decir, fuera de un entorno experimental.
Como se emplea en esta memoria, el término "proteína", "péptido", "polipéptido", "péptidos" y "polipéptidos" se utiliza indistintamente en todas partes. Estos términos se refieren a tanto péptidos de origen natural, p. ej., proteínas de origen natural como a péptidos sintetizados que pueden incluir aminoácidos de origen natural o no natural. Los péptidos también se pueden modificar químicamente modificando una cadena lateral o un extremo amino o carboxi terminal libre de un aminoácido de origen natural o no natural. Esta modificación química incluye la adición de unidades químicas adicionales así como la modificación de grupos funcionales en cadenas laterales de los aminoácidos, tales como glicosilación. Un péptido es un polímero que preferiblemente tiene al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o al menos 100 aminoácidos, lo más preferiblemente al menos 8 o al menos 30 aminoácidos. Dado que los polipéptidos y proteínas descritos en la presente memoria se derivan de adenovirus, se prefiere que la masa molecular de un polipéptido aislado o proteína como se emplea en esta memoria no exceda los 200 kDa.
El término "vector", como se emplea en esta memoria, incluye cualquier vector conocido por el experto en la técnica que incluye vectores plasmídicos, vectores cósmidos, vectores fagos, tales como fago lambda, vectores virales, tales como vectores adenovirus (Ad) (p. ej., Ad5, Ad11, Ad26, Ad35, Ad49, ChAd3, ChAd4, ChAd5, ChAd7, ChAd8, ChAd9, ChAd10, ChAd11, ChAd16, ChAd17, ChAd19, ChAd20, ChAd22, ChAd24, ChAd26, ChAd30, ChAd31, ChAd37, ChAd38, chAd44, ChAd63 y ChAd82 no replicantes, o vectores Ad4 y Ad7 competentes para la replicación conocidos a partir de la técnica anterior, p. ej. documento WO 2005/071093 A2), vectores de virus adenoasociados (AAV) (p. ej., AAV tipo 5), vectores de alfavirus (p. ej., virus de encefalitis equina venezolana (EEV), virus Sindbis (SIN), virus del bosque Semliki (VBS) y quimeras EEV-SIN), vectores del virus del herpes, vectores del virus del sarampión, vectores del virus de la viruela (p. ej., virus vacuna, virus vacuna modificado Ankara (VVMA), NYVAC (derivado de la cepa Copenhagen de vacuna) y vectores avipox: vectores canarypox (ALVAC) y fowlpox (FPV), y vectores del virus de la estomatitis vesicular, partículas similares a virus o esporas bacterianas. Un vector también incluye vectores de expresión, vectores de clonación y vectores que son útiles para generar adenovirus recombinantes en células huésped.
La expresión "casete de expresión" se refiere a una molécula de ácido nucleico que comprende al menos una secuencia de ácido nucleico que se va a expresar, junto con sus secuencias de control de la transcripción y traducción. Cambiar el casete de expresión hará que el vector en el que se incorpora dirija la expresión de una secuencia o combinación de secuencias diferente. Debido a que los sitios de restricción están preferiblemente modificados por ingeniería genética para estar presentes en los extremos 5' y 3', el casete puede insertarse, eliminarse o reemplazarse fácilmente con otro casete. Preferiblemente, un casete de expresión incluye elementos reguladores cis para la expresión eficiente de un gen dado, tal como un promotor, sitio de iniciación y/o sitio de poliadenilación, como se describe adicionalmente a continuación.
El término "anticuerpo" se refiere a anticuerpos tanto monoclonales como policlonales, es decir, cualquier proteína inmunoglobulina o porción de la misma que es capaz de unirse a un antígeno o hapteno. Las porciones de unión a antígeno se pueden producir por técnicas de ADN recombinante o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno pueden incluir Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb y variantes de región determinante de la complementariedad (RDC), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, diacuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de un anticuerpo que es suficiente para conferir un antígeno específico que se une al polipéptido.
La administración de un inmunógeno/antígeno para inducir/generar una respuesta inmunitaria en un mamífero en el contexto de la presente invención se denomina "cebado", y la administración de un inmunógeno/antígeno para potenciar una respuesta inmunitaria contra dicho inmunógeno/antígeno, p. ej., un patógeno particular (tal como un virión o un virus patógeno, un antígeno de una bacteria patógena o un antígeno de un tumor), en un mamífero se denomina "refuerzo". La expresión "iniciación-refuerzo heterólogo" significa que son diferentes el vector para inducir/generar una respuesta inmunitaria (cebado) en un mamífero y el vector para potenciar la respuesta inmunitaria (refuerzo) en un mamífero. "Iniciación-refuerzo heterólogo" es útil si un sujeto, p. ej., paciente, ha desarrollado anticuerpos contra un primer vector y se requiere un refuerzo. De este modo, en iniciación-refuerzo heterólogo se pueden utilizar dos adenovirus diferentes, p. ej., para vacunación y/o terapia génica. En este contexto, un primer y un segundo adenovirus son suficientemente diferentes, si la respuesta de anticuerpos inducida durante el cebado por el primer adenovirus no evita que más del 70 % o preferiblemente más del 80 % de las partículas del segundo adenovirus administradas para refuerzo entren en el núcleo de las células del animal que ha sido sometido a cebado y refuerzo.
La expresión adenovirus (AdV) recombinante "competente para la replicación" se refiere a un adenovirus que puede replicarse en una célula huésped en ausencia de cualquier proteína auxiliar recombinante comprendida en la célula.
Preferiblemente, un adenovirus competente para la replicación comprende los siguientes genes tempranos esenciales intactos o funcionales: E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4. Los adenovirus de tipo silvestre aislados de un animal particular serán competentes para la replicación en ese animal.
La expresión AdV recombinante "defectuoso de replicación" se refiere a un adenovirus que se ha interpretado que es incapaz de replicación porque se ha modificado por ingeniería genética para que comprenda al menos una deleción funcional, es decir, una deleción que altera la función de un gen sin eliminarlo por completo, p. ej., introducción de codones de terminación artificiales, deleción o mutación de sitios activos o dominios de interacción, mutación o deleción de una secuencia reguladora de un gen, etc., o una eliminación completa de un gen que codifica un producto génico que es esencial para la replicación viral, tal como uno o más de los genes adenovirales seleccionados de E1, E2, E3 y E4. Los vectores adenovirales de chimpancé recombinantes de la invención son preferiblemente defectuosos de replicación.
El término "identidad" o "idéntico" en el contexto de secuencias de polinucleótidos, polipéptidos o proteínas se refiere al número de residuos en las dos secuencias que son idénticas cuando se alinean para una correspondencia máxima. Específicamente, el porcentaje de identidad de secuencia de dos secuencias, ya sea secuencias de ácido nucleico o de aminoácido, es el número de coincidencias exactas entre dos secuencias alineadas divididas por la longitud de la secuencia más corta y multiplicadas por 100. Las herramientas de alineamiento que pueden utilizarse para alinear dos secuencias son bien conocidas por los expertos en la técnica y pueden, por ejemplo, obtenerse en la red, p. ej., ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw) o Align (http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html). Los alineamientos entre dos secuencias se pueden llevar a cabo utilizando configuraciones convencionales, para Align EMBOSS:needle preferiblemente: Matriz: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5. Los expertos en la técnica entienden que puede ser necesario introducir huecos en cualquier secuencia para producir un alineamiento satisfactorio. El "mejor alineamiento de secuencia" entre dos polipéptidos se define como el alineamiento que produce el mayor número de residuos idénticos alineados.
Adenovirus
Un adenovirus (Ad) es un virus icosaédrico sin envoltura que se ha identificado en varios huéspedes de mamíferos y aves. Los adenovirus humanos (hAds) pertenecen al género Mastadenovirus que incluye todos los Ads de origen humano y numerosos Ads de origen animal conocidos (p. ej., bovino, porcino, canino, murino, equino, simio y ovino). Los adenovirus humanos se dividen generalmente en seis subgrupos (A-F) basados en una serie de criterios biológicos, químicos, inmunológicos y estructurales que incluyen propiedades de hemaglutinación de eritrocitos de rata y mono Rhesus, homología de ADN, patrones de escisión de enzimas de restricción, contenido o porcentaje G+C y oncogenicidad (Straus, 1984, en The Adenoviruses, ed. H. Ginsberg, págs. 451-498, Nueva York: Plenus Press, y Horwitz, 1990; en Virology, eds. B. N. Fields y D. M. Knipe, págs. 1679-1721).
El virión adenoviral tiene una simetría icosaédrica y, dependiendo del serotipo, un diámetro de 60-90 nm. La cápside icosaédrica comprende tres proteínas principales, proteína de base hexona (II), de base pentona (III) y de fibra nudosa (IV) (W.C. Russel, J. Gen. Virol., 81: 2573-2604 (2000)). Un aspecto de la inmunidad preexistente que se observa en humanos es la inmunidad humoral, que puede dar como resultado la producción y la persistencia de anticuerpos que son específicos para las proteínas adenovirales. La respuesta humoral provocada por adenovirus se dirige principalmente contra las tres proteínas estructurales principales: hexón, pentón y fibra.
Hasta la fecha, 51 serotipos de adenovirus humanos distintos han sido reconocidos y agrupados en subgrupos en función de sus propiedades de hemaglutinación y sus criterios biofísicos y bioquímicos. Los informes publicados han establecido que los títulos que comprenden los anticuerpos contra serotipos múltiples son comunes (Dambrosio, E. (1982) J. Hyg. (Londres) 89: 209-219) y que una porción sustancial de los títulos tiene actividad neutralizante.
Como se menciona, los adenovirus recombinantes son útiles en terapia génica y como vacunas. Los vectores virales basados en adenovirus de chimpancé representan una alternativa al uso de vectores Ad derivados de humanos para el desarrollo de vacunas genéticas (Farina SF, J. Virol. diciembre de 2001; 75(23):11603-13.; Fattori E, Gene Ther. julio de 2006; 13(14):1088-96). Los adenovirus aislados de chimpancés están estrechamente relacionados con adenovirus aislados de humanos como se demuestra por su eficiente propagación en células de origen humano. Sin embargo, dado que los adenovirus de humanos y de chimpancés son parientes cercanos, se puede esperar una reactividad serológica cruzada entre las dos especies de virus.
Esta presunción ha sido confirmada cuando los adenovirus de chimpancé fueron aislados y caracterizados. No obstante, los aislados de adenovirus de chimpancés mostraron una reactividad cruzada reducida con los serotipos comunes de epítopos de adenovirus humanos. Así, un adenovirus de chimpancé (también abreviado en la presente memoria como "ChAd" para adenovirus de chimpancé común y "PanAd" para adenovirus de chimpancé bonobo) proporciona una base para reducir los efectos adversos asociados con la inmunidad preexistente en humanos respecto a los serotipos comunes de adenovirus humanos. Sin embargo, un título de neutralización bajo a intermedio contra adenovirus de chimpancé aislados se detecta hasta ahora en subconjuntos de sueros humanos y, por consiguiente, todos los serotipos conocidos de adenovirus de chimpancé todavía están neutralizados por suero sanguíneo humano hasta cierto punto.
La presente descripción comprende el hallazgo inesperado de que podrían aislarse nuevas cepas de adenovirus de chimpancé, concretamente ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147 aisladas del chimpancé común (Pan troglodytes) y PanAd1, PanAd2 y PanAd3 aisladas de bonobos (Pan paniscus). Todas estas cepas novedosas no muestran seroprevalencia medible en humanos, es decir, estas cepas de adenovirus representan una excepción entre los adenovirus de chimpancé descritos hasta ahora en que todos los sueros humanos sometidos a ensayo son completamente negativos en cuanto a la presencia de anticuerpos neutralizantes. En este contexto, un anticuerpo neutralizante se refiere a un anticuerpo que se une a un epítopo del adenovirus y evita que se produzca una infección productiva en una célula huésped o evita la transducción de una célula diana con un vector incompetente para la replicación que expresa un transgén, p. ej., el ADN de adenovirus es capaz de introducirse en una célula huésped. Aunque se observaron anticuerpos neutralizantes para todos los adenovirus derivados de chimpancé de la técnica anterior, los nuevos tipos de adenovirus ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2 y PanAd3 se caracterizan por una ausencia completa de anticuerpos neutralizantes preexistentes en humanos dirigidos contra estos tipos de adenovirus. De este modo, estos adenovirus proporcionan una herramienta médica valiosa que puede, p. ej., ser utilizada para inmunización y/o terapia génica.
Como se detalla a continuación, la invención proporciona, en un aspecto, nuevas secuencias de proteínas de la cápside de adenovirus que representan los epítopos de adenovirus más expuestos a la superficie, a saber, proteína hexón, pentón y de fibra. Como ya se ha mencionado, ningún anticuerpo neutralizante específico está comprometido para los virus según la invención en sueros sanguíneos humanos. De este modo, una ventaja de las nuevas secuencias de proteína hexón, pentón y de fibra de chimpancé anteriormente mencionadas es que las secuencias de estas proteínas se pueden utilizar para potenciar los adenovirus de la técnica anterior, que se han modificado por ingeniería genética para p. ej., fines médicos. Por ejemplo, las proteínas de la cápside o fragmentos funcionales de las mismas se pueden utilizar, p. ej., para reemplazar/sustituir una o más de las principales proteínas estructurales de la cápside o fragmentos funcionales de las mismas, respectivamente, de un adenovirus diferente, p. ej., un adenovirus de la técnica anterior, para obtener adenovirus recombinantes mejorados con seroprevalencia reducida en humanos. Al igual que los adenovirus novedosos de la invención pero también los adenovirus que se han modificado por ingeniería genética como se describe no encontrarán ninguna respuesta inmunitaria inhibidora significativa en seres humanos cuando se administren, se potenciará su eficacia de transducción e infectividad global. Por lo tanto, se espera que dichos adenovirus mejorados sean, p. ej., vacunas más eficaces ya que la entrada en las células huésped y la expresión del casete de antígeno no se verán obstaculizadas por ningún título significativo de anticuerpos neutralizantes. Además, como se muestra en los ejemplos, se provocó una respuesta inmunitaria potente contra gag del VIH incluso en ratones vacunados naives con un adenovirus recombinante que codifica gag de VIH que comprende proteínas hexón, pentón y de fibra del aislado ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2 o PanAd3. La respuesta inmunitaria provocada por los adenovirus gag de ChAd55, gag de ChAd73, gag de ChAd83, gag de ChAd146, gag de ChAd147, gag de PanAd1, gag de PanAd2 y gag de PanAd3 es comparable con la respuesta observada con los vectores más potentes desarrollados hasta ahora basados en gran medida en el vector Ad5 humano recombinante de la técnica anterior que expresa la proteína gag del VIH (véanse los datos de un ensayo ELIspot en las figuras 5A, 5B, 5C).
Como se mencionó anteriormente, la respuesta humoral provocada por un adenovirus se dirige principalmente contra las tres principales proteínas estructurales adenovirales: hexón, pentón y de fibra, todas las cuales comprenden secuencias polipeptídicas que forman parte de la cápside adenoviral y que se exponen al exterior de la partícula de virus (véase también: Madisch I, et al., J. Virol. diciembre de 2005; 79(24):15265-76; y también: Madisch I, et al., J. Virol. agosto de 2007; 81(15):8270-81; y Pichia-Gollon SL, et al., J. Virol. febrero de 2007; 81(4):1680-9).
Como se representa en el alineamiento de secuencias múltiples que se muestra en la figura 1, los nuevos aislados de adenovirus del grupo de PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146 y ChAd147 de la presente descripción comparten una secuencia de proteína hexón muy similar. En el alineamiento también se marcan las regiones hipervariables (RHVs) que se producen en bucles en la parte superior de la molécula hexón que se encuentran en el exterior del virión y cubren una gran cantidad de su superficie (véase Jophn J. Rux et. al, J. of Virology, septiembre de 2003, vol. 77, n.° 17). La relación de secuencia de las proteínas de la cápside fibra y pentón adicionales de los nuevos adenovirus de chimpancé se proporciona en las figuras 2 y 3, respectivamente. Se espera que las tres proteínas estructurales de la cápside contribuyan a la baja seroprevalencia y, por lo tanto, puedan utilizarse independientemente unas de otras o en combinación para suprimir la afinidad de un adenovirus por anticuerpos neutralizantes preexistentes, p. ej., para fabricar un adenovirus quimérico recombinante con seroprevalencia reducida.
Por consiguiente, la descripción proporciona un polinucleótido aislado que codifica una proteína de fibra adenoviral o un derivado funcional de la misma y que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NOs: 14-19, 50 y 53; es decir, SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 50 o 53;
(b) un polinucleótido que codifica el derivado funcional de un polipéptido según cualquiera de las SEQ ID NOs: 14-19, 50 y 53, es decir, SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 50 o 53; en donde dicho derivado funcional comprende la deleción, inserción y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos; y
(c) un polinucleótido que codifica un derivado funcional que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos un 99 %, más preferiblemente al menos un 85 % y los más preferiblemente al menos un 99 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 14-19, 50 y 53, es decir, SEQ ID NO: 14, 15, 16, 17, 18, 19, 50 o 53.
Por "proteína de fibra adenoviral" se entiende la proteína de fibra nudosa (IV) comprendida en un adenovirus. En un aspecto preferido, el polinucleótido aislado comprendido en el primer aspecto de la invención y los aspectos preferidos del mismo descritas a continuación codifica una proteína de fibra que tiene la misma función que la proteína de fibra o un fragmento de la misma en un virión de adenovirus infeccioso. De este modo, un adenovirus recombinante que comprende dicha fibra preferiblemente como una proteína de la cápside es capaz de introducirse en una célula huésped. Se puede determinar con facilidad si un adenovirus recombinante puede introducirse en una célula huésped. Por ejemplo, después de poner en contacto una célula huésped con el adenovirus, la célula huésped recombinante puede lavarse y lisarse y se puede determinar si se encuentra ARN y/o ADN adenoviral en la célula huésped utilizando, p. ej., una sonda de hibridación apropiada específica para a Rn y/o ADN adenoviral. Alternativamente o adicionalmente, la célula huésped después de haberse puesto en contacto con el adenovirus recombinante se puede lavar, lisar y sondar con anticuerpos específicos de adenovirus, p. ej., utilizando membrana Western. En otra alternativa adicional, se observa, p. ej., in vivo, si la célula huésped expresa un producto génico, por ejemplo, una proteína fluorescente tras la infección por un adenovirus recombinante que comprende un casete de expresión adecuado para expresar el producto génico en la célula huésped.
Se prefiere adicionalmente que la proteína de fibra tenga afinidad por una proteína pentón adenoviral, tal como para las SEQ ID NOs: 26-31, 52 y/o 55. El experto en la técnica es muy consciente de cómo someter a ensayo las afinidades proteína-proteína. Para determinar si una primera proteína es capaz de unirse a una segunda proteína, tal como una proteína pentón de un adenovirus derivado de chimpancé, se puede utilizar, por ejemplo, un ensayo genético de dos híbridos de levadura o un ensayo bioquímico tal como precipitación, un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un ensayo basado en la clasificación de células activadas por fluorescencia (CCAF) o un ensayo de resonancia del plasmón. Cuando se utilizan ensayos de la precipitación o resonancia del plasmón, es útil fusionar al menos una de las proteínas con una etiqueta de afinidad, tal como etiqueta HIS, etiqueta GST u otra, como es bien conocido en la técnica de la bioquímica. Una proteína de fibra adenoviral en su forma glicosilada es además capaz de trimerizar. Por consiguiente, también se prefiere que la proteína de fibra codificada por el polinucleótido según el primer aspecto de la invención sea capaz de glicosilarse y/o formar un trímero.
Como se emplea a lo largo de la presente solicitud, la expresión "derivado funcional" de una proteína o polipéptido se refiere generalmente a una versión modificada de la proteína o polipéptido, p. ej., uno o más aminoácidos de la proteína o polipéptido pueden delecionarse, insertarse, modificarse y/o sustituirse. El derivado es funcional, en caso de que, como se mencionó también anteriormente, un adenovirus quimérico que comprende el derivado funcional en su cápside sea capaz de infectar una célula huésped. Además, en el contexto de un "derivado funcional", una inserción se refiere a la inserción de uno o más aminoácidos en el polipéptido o proteína original. Se prefiere que un derivado funcional no comprenda más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100 cambios de aminoácidos (es decir, aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos). En otro aspecto, se prefiere que no más de 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 15 % o más de 20 % (lo más preferiblemente no más de 5 %) de todos los aminoácidos de la proteína o polipéptido se cambien (es decir, son aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos). Los aminoácidos de la proteína o polipéptido también se pueden modificar, p. ej., modificar químicamente. Por ejemplo, la cadena lateral o un extremo amino o carboxi terminal libre de un aminoácido de la proteína o polipéptido puede modificarse, p. ej., por glicosilación, amidación, fosforilación, ubiquitinación, etc. La modificación química también puede tener lugar in vivo, p. ej., en una célula huésped, como es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, un motivo de modificación química adecuado, p. ej., el motivo de la secuencia de glicosilación presente en la secuencia de aminoácidos de la proteína hará que la proteína sea glicosilada. Una sustitución en un derivado puede ser una sustitución conservadora o no conservadora, preferiblemente una sustitución conservadora. En algunos aspectos, una sustitución también incluye el intercambio de un aminoácido de origen natural con un aminoácido de origen no natural. Una sustitución conservadora comprende la sustitución de un aminoácido con otro aminoácido que tiene una propiedad química similar a la del aminoácido que se sustituye. Preferiblemente, la sustitución conservadora es una sustitución seleccionada del grupo que consiste en:
(i) una sustitución de un aminoácido básico con otro aminoácido básico diferente;
(ii) una sustitución de un aminoácido ácido con otro aminoácido ácido diferente;
(iii) una sustitución de un aminoácido aromático con otro aminoácido aromático diferente;
(iv) una sustitución de un aminoácido alifático no polar con otro aminoácido alifático no polar diferente; y
(v) una sustitución de un aminoácido polar no cargado con otro aminoácido polar no cargado diferente.
Un aminoácido básico se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en arginina, histidina y lisina. Un aminoácido ácido es preferiblemente aspartato o glutamato. Un aminoácido aromático se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en fenilalanina, tirosina y triptófano. Un aminoácido alifático no polar se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en glicina, alanina, valina, leucina, metionina e isoleucina. Un aminoácido polar no cargado se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en serina, treonina, cisteína, prolina, asparagina y glutamina. En contraste con una sustitución de aminoácidos conservadora, una sustitución de aminoácidos no conservadora es el intercambio de un aminoácido con cualquier aminoácido que no cae bajo las sustituciones conservadoras (i) a (v) anteriormente indicadas.
Si un derivado funcional comprende una deleción, entonces en el derivado se han eliminado uno o varios aminoácidos que están presentes en la secuencia de polipéptido o de proteína de referencia. La deleción puede, sin embargo, no ser tan extensa ya que el derivado comprende menos de 200 aminoácidos en total.
Los medios para determinar la identidad de secuencia ya se han descrito anteriormente. Además, la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias también puede determinarse utilizando el algoritmo matemático de Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU. 90: 5873-5877. Tal algoritmo también se incorpora en los programas BLASTN y BLASTP de Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410. Al utilizar BLASTN y BLASTP, se prefiere utilizar los parámetros predeterminados de estos programas.
Como se mencionó anteriormente, los dominios hipervariables de una proteína hexón adenoviral están expuestos en el exterior del adenovirus. Por lo tanto, estas regiones de la cápside adenoviral pueden reconocerse y unirse por anticuerpos neutralizantes. De este modo, un adenovirus con una cápside que comprende una proteína hexón derivado de uno de los nuevos aislados de adenovirus descritos en la presente memoria exhibirá una mejora, es decir, seroprevalencia menor en humanos. Por consiguiente, la descripción proporciona un polinucleótido aislado que codifica una proteína hexón adenoviral o un derivado funcional de la misma y que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NOs: 20-25, 51 y 54, es decir, SEQ ID NO: 20, 21,22, 23, 24, 25, 51 o 54;
(b) un polinucleótido que codifica el derivado funcional de un polipéptido según cualquiera de las SEQ ID NOs: 20-25, 51 y 54, es decir, SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 51 o 54 en donde dicho derivado funcional comprende la deleción, inserción y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos; y
(c) un polinucleótido que codifica un derivado funcional que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o al menos 99,95 %, más preferiblemente al menos 98 % y lo más preferiblemente al menos 99,95 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 20-25, 51 y 54, es decir, SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 51 o 54.
En un aspecto preferido, el polinucleótido aislado de la invención y los aspectos preferidos del mismo descritos a continuación codifican una proteína hexón que tiene la misma función que una proteína hexón o un fragmento funcional de la misma en un virión de adenovirus infeccioso. Por lo tanto, un adenovirus recombinante que comprende dicho hexón preferiblemente como una proteína de la cápside es capaz de introducirse en una célula huésped. Un método adecuado para generar derivados funcionales de una proteína hexón se describe en la patente de EE.UU. 5.922.315. En este método, al menos una región de bucle del hexón de adenovirus se cambia con al menos una región de bucle de otro serotipo de adenovirus. Por ejemplo, una región de bucle de una proteína hexón de la invención se puede utilizar para sustituir el bucle hexón correspondiente de un adenovirus de la técnica anterior para generar un adenovirus híbrido mejorado. Análogamente, también pueden generarse derivados de proteínas pentón y de fibra de la invención.
La descripción también proporciona un polinucleótido aislado que codifica una proteína pentón adenoviral o un derivado funcional de la misma y que se selecciona del grupo que consiste en:
(a) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos según cualquiera de las SEQ ID NOs: 26-31, 52 y 55, es decir, SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 52 o 55;
(b) un polinucleótido que codifica el derivado funcional de un polipéptido según cualquiera de las SEQ ID NOs: 26-31, 52 y 55, es decir, SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 52 o 55; en donde dicho derivado funcional comprende la deleción, inserción y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácidos; y
(c) un polinucleótido que codifica un derivado funcional que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos 99 %, más preferiblemente al menos 85 % y lo más preferiblemente al menos 99 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOs: 26-31, 52 y 55, es decir, SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 52 o 55.
Se prefiere que la proteína pentón tenga afinidad por una proteína de fibra adenoviral, tal como las SEQ ID NOs: 14­ 19, 50 y/o 53. El experto en la técnica es muy consciente de cómo someter a ensayo las afinidades proteínaproteína como se describió anteriormente. Por "proteína pentón adenoviral" se entiende la proteína de base pentón (III) comprendida en un adenovirus. Una proteína pentón adenoviral se caracteriza por que se localiza en las esquinas de la simetría icosaédrica de la cápside. Como se menciona, en un aspecto preferido del polinucleótido de la invención y los aspectos preferidos del mismo descritos en la presente memoria a continuación, el polinucleótido codifica polipéptidos, en donde un adenovirus recombinante que comprende dichos polipéptidos preferiblemente como proteína(s) de la cápside es capaz de infectar, es decir, introducirse en una célula huésped.
En la siguiente descripción, se especificarán detalles para cada uno de los nuevos aislados de adenovirus de chimpancé descritos en la presente memoria.
Adenovirus ChAd55
El polinucleótido aislado codifica una proteína de fibra adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 14 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos 99 %, más preferiblemente al menos 85 % y más preferiblemente al menos 99 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14.
El polinucleótido aislado codifica una proteína hexón adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 20 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o al menos 99,95 %, más preferiblemente al menos 98 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 20.
El polinucleótido aislado codifica una proteína pentón adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 26 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o al menos 99,95 %, más preferiblemente al menos 98 % y lo más preferiblemente al menos 99,9 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 26.
En un aspecto adicional, la descripción se refiere a un polinucleótido que comprende el primero, el segundo, el tercero, el primero y el segundo, el primero y el tercero, el segundo y el tercero o el primero, el segundo y el tercer aspecto. Se prefiere que el polinucleótido que comprende este o estos polinucleótidos comprenda otros genes adenovirales y segmentos de nucleótidos, que son adyacentes al gen hexón, pentón y/o de fibra en el genoma del adenovirus, p. ej., utilizando el genoma de Ad5 como referencia. Se prefiere que el polinucleótido también comprenda las secuencias requeridas para el empaquetamiento del polinucleótido en una partícula adenoviral.
Adenovirus ChAd73
El polinucleótido aislado codifica una proteína de fibra adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 15 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 98 %, 99 % o al menos 99,9 %, más preferiblemente al menos 99 % y lo más preferiblemente al menos 99,9 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.
El polinucleótido aislado codifica una proteína hexón adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 21 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o al menos 99,95 %, más preferiblemente al menos 98 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21.
El polinucleótido aislado codifica una proteína pentón adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 27 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o al menos 99,95 %, más preferiblemente al menos 98 % y lo más preferible al menos 99 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 27.
Se prefiere que un polinucleótido que comprende este o estos polinucleótidos comprenda otros genes adenovirales y segmentos de nucleótidos, que son adyacentes al gen hexón, pentón y/o de fibra en el genoma del adenovirus, p. ej., utilizando el genoma de Ad5 como referencia. Se prefiere que el polinucleótido también comprenda las secuencias requeridas para el empaquetamiento del polinucleótido en una partícula adenoviral.
Adenovirus ChAd83
Según el primer aspecto de la invención, el polinucleótido aislado codifica una proteína de fibra adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 16. También se describe un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 16.
El polinucleótido aislado de la invención también codifica una proteína hexón adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 22. También se describe un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o al menos 99,95 %, más preferiblemente al menos 98 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22.
El polinucleótido aislado codifica una proteína pentón adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 28. También se describe un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o al menos 99,95 %, más preferiblemente al menos 98 % y lo más preferible al menos 99 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 28.
En una de las realizaciones más preferidas, el polinucleótido de la invención consiste en o comprende un polinucleótido que es al menos 99 % o 100 % idéntico en la totalidad de su longitud a una secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 65 o a una secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 65 pero carece de cualquiera de las regiones genómicas E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y/o E4 de la SEQ ID NO: 65, lo más preferiblemente que carece de las regiones genómicas E1, E3 y E4 de la SEQ ID NO: 65. También se describe un polinucleótido que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% o 98% idéntico en toda su longitud a una secuencia que consiste en SEQ ID NO: 65 o a una secuencia que consiste en SEQ ID NO: 65 pero que carece de cualquiera de las regiones genómicas E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y/o E4 de SEQ ID NO: 65, más preferiblemente que carece de las regiones genómicas E1, E3 y E4 de SEQ ID NO: 65.
Se prefiere que el polinucleótido según la invención comprenda otros genes adenovirales y segmentos de nucleótidos, que son adyacentes al gen hexón, pentón y/o de fibra en el genoma del adenovirus, p. ej., utilizando el genoma de ChAd83 como se establece en la SEQ ID NO: 65. Se prefiere que el polinucleótido también comprenda las secuencias requeridas para el empaquetamiento del polinucleótido en una partícula adenoviral.
Adenovirus ChAd146
El polinucleótido aislado codifica una proteína de fibra adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 17 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 17.
El polinucleótido aislado codifica una proteína hexón adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 23 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o al menos 99,95 %, más preferiblemente al menos 98 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23.
El polinucleótido aislado codifica una proteína pentón adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 29 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o al menos 99,95 %, más preferiblemente al menos 98 % y lo más preferible al menos 99 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 29.
Se prefiere que el polinucleótido que comprende este o estos polinucleótidos comprenda otros genes adenovirales y segmentos de nucleótidos, que son adyacentes al gen hexón, pentón y/o de fibra en el genoma del adenovirus, p. ej., utilizando el genoma de Ad5 como referencia. Se prefiere que el polinucleótido también comprenda las secuencias requeridas para el empaquetamiento del polinucleótido en una partícula adenoviral.
Adenovirus ChAd147
El polinucleótido aislado codifica una proteína de fibra adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 18 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos eliminados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos 99 %, más preferiblemente al menos 85 % y lo más preferiblemente al menos 90 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 18.
El polinucleótido aislado codifica una proteína hexón adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 24 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o al menos 99,95 %, más preferiblemente al menos 98 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 24.
El polinucleótido aislado codifica una proteína pentón adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 30 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o al menos 99,95 %, más preferiblemente al menos 98 % y lo más preferiblemente al menos 99 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 30.
Se prefiere que el polinucleótido que comprende este o estos polinucleótidos comprenda otros genes adenovirales y segmentos de nucleótidos, que son adyacentes al gen hexón, pentón y/o de fibra en el genoma del adenovirus, p. ej., utilizando el genoma de Ad5 como referencia. Se prefiere que el polinucleótido también comprenda las secuencias requeridas para el empaquetamiento del polinucleótido en una partícula adenoviral.
Adenovirus PanAd1
El polinucleótido aislado codifica una proteína de fibra adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 19 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos 99 %, más preferiblemente al menos 85 % y lo más preferiblemente al menos 99 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19.
El polinucleótido aislado codifica una proteína hexón adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 25 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o al menos 99,95 %, más preferiblemente al menos 98 % y lo más preferiblemente al menos 99 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 25.
El polinucleótido aislado codifica una proteína pentón adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 31 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos 99 %, más preferiblemente al menos 85 % y lo más preferiblemente al menos 90 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 31.
En uno de los aspectos más preferidos de PanAd1, el polinucleótido consiste en o comprende un polinucleótido que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % idéntico y lo más preferiblemente al menos 99 % o 100 % idéntico en la totalidad de su longitud a una secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 13 o a una secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 13 pero carece de cualquiera de las regiones genómicas E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y/o E4 de la SEQ ID NO: 13, lo más preferiblemente que carece de las regiones genómicas E1, E3 y E4 de la SEQ ID NO: 13.
Se prefiere que el polinucleótido que comprende este o estos polinucleótidos comprenda otros genes adenovirales y segmentos de nucleótidos, que son adyacentes al gen hexón, pentón y/o de fibra en el genoma del adenovirus, p. ej., utilizando el genoma de PanAd1 como se establece en la SEQ ID NO: 13. Se prefiere que el polinucleótido también comprenda las secuencias requeridas para el empaquetamiento del polinucleótido en una partícula adenoviral.
Adenovirus PanAd2
El polinucleótido aislado codifica una proteína de fibra adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 50 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos 99 %, más preferiblemente al menos 85 % y lo más preferiblemente al menos 99 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 50.
El polinucleótido aislado codifica una proteína hexón adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID N°: 51 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o al menos 99,95 %, más preferiblemente al menos 98 % y lo más preferiblemente al menos 99 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 51.
El polinucleótido aislado codifica una proteína pentón adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 52 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos 99 %, más preferiblemente al menos 85 % y lo más preferiblemente al menos 90 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 52.
En uno de los aspectos más preferidos de PanAd2, el polinucleótido consiste en o comprende un polinucleótido que es al menos un 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % idéntico y lo más preferiblemente al menos 99 % o 100 % idéntico en la totalidad de su longitud a una secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 62 o a una secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 62 pero carece de cualquiera de las regiones genómicas E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y/o E4 de la SEQ ID NO: 62, lo más preferiblemente que carece de las regiones genómicas E1, E3 y E4 de la SEQ ID NO: 62.
Se prefiere que el polinucleótido que comprende este o estos polinucleótidos comprenda otros genes adenovirales y segmentos de nucleótidos, que son adyacentes al gen hexón, pentón y/o de fibra en el genoma del adenovirus, p. ej., utilizando el genoma de PanAd2 como se establece en la SEQ ID NO: 62. Se prefiere que el polinucleótido también comprenda las secuencias requeridas para el empaquetamiento del polinucleótido en una partícula adenoviral.
Adenovirus PanAd3
El polinucleótido aislado codifica una proteína de fibra adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 53 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos 99 %, más preferiblemente al menos 85 % y lo más preferiblemente al menos 99 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 53.
El polinucleótido aislado codifica una proteína hexón adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 54 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 %, 98 %, 99 %, 99,5 %, 99,9 % o al menos 99,95 %, más preferiblemente al menos 98 % y lo más preferiblemente al menos 99 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 54.
El polinucleótido aislado codifica una proteína pentón adenoviral con una secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO: 55 o un derivado funcional de la misma, en donde el derivado funcional (i) no comprende más de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 10 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos o (ii) tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o al menos 99 %, más preferiblemente al menos 85 % y lo más preferiblemente al menos 90 % idéntica en la totalidad de su longitud a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 55.
En uno de los aspectos más preferidos el polinucleótido consiste en o comprende un polinucleótido que es al menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% idéntico y lo más preferiblemente al menos 99 % o 100 % idéntico en la totalidad de su longitud a una secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 63 o a una secuencia que consiste en la SEQ ID NO: 63 pero carece de cualquiera de las regiones genómicas E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y/o E4 de la SEQ ID NO: 63, lo más preferiblemente que carece de las regiones genómicas E1, E3 y E4 de la SEQ ID NO: 63.
Se prefiere que el polinucleótido según la descripción comprenda otros genes adenovirales y segmentos de nucleótidos, que son adyacentes al gen hexón, pentón y/o de fibra en el genoma del adenovirus, p. ej., utilizando el genoma de PanAd1 como se establece en la s Eq ID NO: 63. Se prefiere que el polinucleótido también comprenda las secuencias requeridas para el empaquetamiento del polinucleótido en una partícula adenoviral.
En un adenovirus recombinante, una proteína de fibra, hexón y pentón según los respectivos aspectos preferidos descritos en la presente memoria, contribuye cada una individualmente a reducir la interacción de dicho adenovirus recombinante con anticuerpos neutralizantes humanos y/o de roedores. Por consiguiente, los polinucleótidos que codifican dicha proteína de fibra, hexón y/o pentón de la presente descripción son útiles para construir adenovirus recombinantes potenciados. Se prefiere que dichos polinucleótidos comprendidos en el polinucleótido descrito se seleccionen del mismo aislado de adenovirus, p. ej., los tres polinucleótidos que codifican la proteína de fibra, hexón y pentón o derivado funcional de la misma, respectivamente, proceden de uno de los siguientes adenovirus: ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2 o PanAd3. Además, se prefiere que cada "derivado funcional" no comprenda más de 10, más de 5 o más de 3 cambios de aminoácidos (es decir, aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos).
La Tabla 2 a continuación enumera varios ejemplos particularmente preferidos del polinucleótido descrito anteriormente. Se prefiere un polinucleótido seleccionado de los polinucleótidos A1 a AF1 mostrados en la Tabla 2, en donde el polinucleótido comprende tres polinucleótidos, cada uno de los cuales codifica respectivamente una proteína de fibra, hexón y pentón adenoviral o un derivado funcional de la misma. La Tabla 2 muestra a continuación la identidad de secuencia mínima (es decir, al menos la identidad de secuencia indicada) que cada una de dichas tres proteínas codificadas debe tener en la totalidad de su longitud para la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO que también se muestra en la Tabla 2:
Figure imgf000016_0001
Por ejemplo, el polinucleótido preferido A1 como se muestra en la Tabla 1 anterior comprende:
(i) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 85 % idéntica en la totalidad de su longitud a la SEQ ID NO: 14;
(ii) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 95 % idéntica en la totalidad de su longitud a la SEQ ID NO: 20; y
(iii) un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 98 % idéntica en la totalidad de su longitud a la SEQ ID NO: 26.
Como se mencionó anteriormente, lo más preferido es que dicho "derivado funcional" de un polinucleótido enumerado en la tabla 2 no comprenda más de 10 cambios de aminoácidos (es decir, aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos).
La Tabla 3 enumera a continuación otros ejemplos preferidos del polinucleótido descrito anteriormente. Se prefiere un polinucleótido seleccionado de los polinucleótidos A2 a J2 seleccionados de la Tabla 3, en donde el polinucleótido comprende tres polinucleótidos designados, "Polinucleótido 1", "Polinucleótido 2" y "Polinucleótido 3", en donde cada polinucleótido respectivo tiene al menos la identidad de secuencia indicada en la totalidad de su longitud al polinucleótido correspondiente según la SEQ ID NO mostrada en la Tabla 3:
Figure imgf000017_0001
Por lo tanto, como ejemplo, el aspecto preferido A2 ("A2 - ChAd55") de la Tabla 3 anterior es un polinucleótido que comprende:
(i) un polinucleótido que es al menos 98 % idéntico a la SEQ ID NO: 32 en la totalidad de su longitud;
(ii) un polinucleótido que es al menos 98 % idéntico a la SEQ ID NO: 38 en la totalidad de su longitud; y
(iii) un polinucleótido que es al menos 98 % idéntico a la SEQ ID NO: 44 en la totalidad de su longitud.
La Tabla 4 enumera a continuación una serie de ejemplos particularmente preferidos adicionales del polinucleótido representado anteriormente. Se prefiere un polinucleótido seleccionado de los polinucleótidos A3 a H3 mostrados en la Tabla 4, en donde el polinucleótido codifica una proteína de fibra, hexón y pentón adenoviral según la SEQ ID NO indicada o un derivado funcional de la misma, en donde las tres proteínas y/o los derivados funcionales codificados en total comprenden igual o menos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o más de 100, preferiblemente no más de 20 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos:
Figure imgf000017_0002
En otro ejemplo, el polinucleótido codifica una proteína de fibra y hexón adenoviral de la misma cepa según la SEQ ID NO respectiva como se muestra en la Tabla 4 o derivados funcionales de la misma. En un ejemplo adicional, el polinucleótido codifica una proteína de fibra y pentón adenoviral de la misma cepa según la SEQ ID NO respectiva como se muestra en la Tabla 4 o derivados funcionales de la misma. En un ejemplo adicional, el polinucleótido codifica una proteína hexón y pentón adenoviral de la misma cepa según la SEQ ID NO respectiva como se muestra en la Tabla 4 o derivados funcionales de la misma. En este contexto, dicho derivado funcional comprende en cada caso menos de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o menos de 10, lo más preferiblemente menos de 3 aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos.
En una descripción adicional, el polinucleótido consiste en o comprende un polinucleótido que es al menos 90 %, 91 %, 92 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 % o 100%, preferiblemente 98 % idéntico en la totalidad de su longitud a una secuencia que (i) consiste en una cualquiera de la SEQ ID NO: 13, 62, 63 o 65 o a (ii) una secuencia que consiste en una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 62 63 o 65 que carece de una o más de las regiones genómicas E1A, E1B, E2A, E2B, ORF1 de E3, ORF2 de E3, ORF3 de E3, ORF4 de E3, ORF5 de E3, ORF6 de E3, ORF7 de E3, ORF8 de E3, ORF9 de E3, ORF7 de E4, ORF6 de E4, ORF5 de E4, ORF4 de E4, ORF3 de E4, ORF2 de E4 y/u ORF1 de E4. De este modo, una o más regiones genómicas antes mencionadas no se considerarán preferiblemente en el alineamiento cuando se determina el porcentaje de identidad. En otro ejemplo preferido del polinucleótido aislado, el polinucleótido comprende o consiste en la SEQ ID NO: 13, 62, 63 o 65, en donde una o más de las regiones genómicas E1A, E1B, E2A, E2B, ORF1 de E3, ORF2 de E3, ORF3 de E3, ORF4 de E3, ORF5 de E3, ORF6 de E3, ORF7 de E3, ORF8 de E3, ORF9 de E3, ORF7 de E4, ORF6 de E4, ORF5 de E4, ORF4 de E4, ORF3 de E4, ORF2 de E4 y ORF1 de E4 se delecionan de la SEQ ID NO: 13, 62, 63 o 65, respectivamente, o sustituyen con un transgén o un casete de expresión que codifica una proteína heteróloga como se describe en la presente memoria. En un ejemplo más preferido, las regiones adenovirales E1, E3 y/o E4 se delecionan así como también se ejemplifican en el ejemplo 2. Los polinucleótidos preferidos anteriormente mencionados, que carecen de una o más de las regiones genómicas indicadas, pueden comprender además una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína heteróloga o un casete de expresión que comprende dicha secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína heteróloga. Dicha secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína heteróloga y dicho casete de expresión que comprende dicha secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína heteróloga se pueden insertar en, p. ej., las regiones delecionadas del polinucleótido de la invención como es bien conocido en la técnica y también se describen en los ejemplos a continuación. Dicha proteína heteróloga puede ser una molécula de entrega a una célula diana tal como se describe en la presente memoria, p. ej., un polinucleótido que codifica una proteína antigénica o un fragmento de la misma, preferiblemente una proteína antigénica o un fragmento de un patógeno tal como la proteína gag del VIH, un antígeno tumoral o una proteína del virus del herpes simple como se describe en los ejemplos. De este modo, en una realización preferida, el polinucleótido aislado según la invención comprende además un polinucleótido que codifica un antígeno seleccionado del grupo que consiste en un antígeno de virus, un antígeno de una bacteria patógena y un antígeno de un tumor. En una realización, dicha proteína heteróloga puede ser así un antígeno seleccionado del grupo que consiste en un antígeno de virus ARN, un antígeno de una bacteria patógena y un antígeno de un tumor. Un antígeno se refiere a cualquier proteína o péptido capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero. Un antígeno comprende preferiblemente al menos 8 aminoácidos y lo más preferiblemente comprende entre 8 y 12 aminoácidos. Por tanto, cuando se determina la identidad de secuencia, las regiones genómicas E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y/o E4 no se consideran preferiblemente en el alineamiento, es decir, el alineamiento se realiza utilizando una secuencia que consiste en la secuencia completa SEQ ID NO: 13, 62, 63 o 65, pero excluyendo las regiones genómicas E1A, E1B, E2A, E2B, E3, E4 y/o cualquier polinucleótido que codifique un polipéptido heterólogo o casete de expresión que comprenda dicho polinucleótido. Como también se menciona anteriormente, el polinucleótido según la invención y todas sus realizaciones preferidas codifican proteínas de la cápside hexón, pentón y de fibra funcionales, p. ej., las proteínas codificadas tienen la misma función que las proteínas de la cápside respectivas o fragmentos de las mismas en un virión de adenovirus infeccioso. De este modo, un adenovirus recombinante que comprende en su cápside dichas proteínas pentón, hexón y fibra recombinantes codificadas es capaz de introducirse en una célula huésped. Las proteínas de la cápside según la invención o codificadas por polinucleótidos de la invención no tienen seroprevalencia en humanos.
La descripción proporciona además una proteína aislada codificada por el polinucleótido según la invención, es decir, un polipéptido de la cápside adenoviral aislado codificado por el polinucleótido aislado o un derivado funcional del mismo. En este contexto, el "derivado funcional" en un aspecto comprende no más de 5, 10 o no más de 25 cambios de aminoácidos (es decir, aminoácidos delecionados, insertados, modificados y/o sustituidos).
La invención se refiere además a un vector que comprende un polinucleótido según la invención.
Preferiblemente, el vector no comprende un gen en una región genómica seleccionada entre el grupo de regiones genómicas que consiste en E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4, y/o comprende al menos un gen de una región genómica seleccionado del grupo de E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4, en donde dicho al menos un gen comprende una deleción y/o mutación que hace que el al menos un gen no sea funcional. Una posibilidad para hacer que uno de estos productos génicos sea no funcional es introducir uno o más codones de terminación artificiales (p. ej., TAA) en el marco de lectura abierto de estos genes. Los métodos para hacer que el virus sea defectuoso de replicación son bien conocidos en la técnica (véase, p. ej., Brody et al., 1994 Ann NY Acad. Sci., 716: 90-101).
En algunas realizaciones, el polinucleótido de la invención comprende un polinucleótido que codifica una proteína hexón; una proteína pentón y una proteína de fibra de la invención y además comprende polinucleótidos adenovirales adicionales. Por lo tanto, en un ejemplo preferido, el polinucleótido aislado según la descripción comprende al menos uno de los siguientes, como se define en las reivindicaciones:
(a) una repetición terminal invertida (RTI) en 5' adenoviral;
(b) una región E1a adenoviral, o un fragmento de la misma seleccionada entre las regiones 13S, 12S y 9S; (c) una región E1b adenoviral, o un fragmento de la misma seleccionada entre el grupo que consiste en las regiones pequeñas T, grandes T y IX;
(d) una región E2b adenoviral; o un fragmento de la misma seleccionada entre el grupo que consiste en las regiones pequeñas de pTP, polimerasa y IVa2;
(e) una región L1 adenoviral, o un fragmento de la misma, dicho fragmento codifica una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en la proteína de 28,1 kD, polimerasa, agnoproteína, proteína de 52/55 kDa y proteína IIIa;
(f) una región L2 adenoviral o una región L2 que comprende un polinucleótido que codifica la proteína pentón de la invención, proteína VII, V y Mu;
(g) una región L3 adenoviral o una región L3 que comprende un polinucleótido que codifica la proteína hexón de la invención, y que codifica una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en la proteína VI y endoproteasa;
(h) una región E2a adenoviral;
(i) una región L4 adenoviral, o un fragmento de la misma, dicho fragmento codifica una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en la proteína de 100 kD, el homólogo de 33 kD y la proteína VIII;
(j) una región E3 adenoviral, o un fragmento de la misma seleccionada del grupo que consiste en ORF1 de E3, ORF2 de E3, ORF3 de E3, ORF4 de E3, ORF5 de E3, ORF6 de E3, ORF7 de E3, ORF8 de E3 y ORF9 de E3; (k) una región L5 adenoviral o una región L5 que comprende un polinucleótido que codifica la proteína de fibra de la invención;
(l) una región E4 adenoviral, o un fragmento de la misma seleccionada del grupo que consiste en ORF7 de E4, ORF6 de E4, ORF5 de E4, ORF4 de E4, ORF3 de E4, ORF2 de E4 y ORF1 de E4; en particular ORF6 de dicha región E4;
y/o
(m) una RTI en 3' adenoviral.
En algunas realizaciones del polinucleótido mencionado anteriormente, puede ser deseable así como también se describió anteriormente que preferiblemente, el polinucleótido no comprenda un MLA de una región genómica como se especifica anteriormente (tal como, p. ej., región E3 y/o E4 como se define en el ejemplo 2) y/o comprenda un gen adenoviral que comprende una deleción y/o mutación que hace que el al menos un gen no sea funcional. En estas realizaciones preferidas, las regiones adenovirales adecuadas se modificarán para que no se incluyan el(los) gen(es) antes mencionado(s) o para que el(los) gen(es) seleccionado(s) no sea(n) funcional(es). Cualquier deleción de gen adenoviral hará espacio para insertar transgenes tales como un casete de minigén como se describe en la presente memoria. Además, las deleciones génicas pueden utilizarse para generar vectores adenovirales que son incapaces de replicarse sin el uso de una línea celular de empaquetamiento o un virus auxiliar como es bien conocido en la técnica. De este modo, el adenovirus recombinante final que comprende un polinucleótido como se especifica anteriormente que comprende una o más de las deleciones de genes/regiones especificadas o mutaciones de pérdida de función puede proporcionar un adenovirus recombinante más seguro para p. ej., terapia génica o vacunación.
En un ejemplo particularmente preferente, el polinucleótido de la descripción comprende al menos uno de los siguientes:
(a) la región de repetición terminal invertida en 5' (RTI) de una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 62, 63 o 65; (b) la región E1a del adenovirus de una cualquiera de la SEQ ID NO: 13, 62, 63 o 65, o un fragmento de la misma seleccionada entre las regiones 13S, 12S y 9S;
(c) la región E1b del adenovirus de una cualquiera de la SEQ ID NO: 13, 62, 63 o 65, o un fragmento de la misma seleccionada del grupo que consiste en las regiones pequeñas T, grandes T y IX;
(d) la región E2b del adenovirus de una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 62, 63 o 65; o un fragmento de la misma seleccionada del grupo que consiste en las regiones pequeñas de pTP, polimerasa y IVa2;
(e) la región L1 del adenovirus de una cualquiera de la SEQ ID NO: 13, 62, 63 o 65, o un fragmento de la misma, dicho fragmento codifica una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en la proteína de 28,1 kD, polimerasa, agnoproteína, proteína de 52/55 kDa, y proteína IIIa;
(f) la región L2 del adenovirus de una cualquiera de la SEQ ID NO: 13, 62, 63 o 65, o un fragmento de la misma, dicho fragmento codifica una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en la proteína pentón con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 31, 52 o 55, proteína VII, V y Mu;
(g) la región L3 del adenovirus de una cualquiera de la SEQ ID NO: 13, 62, 63 o 65, o un fragmento de la misma, dicho fragmento codifica una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en la proteína VI, proteína hexón con la secuencia de aminoácidos la SEQ ID NO: 25, 51 o 54 y endoproteasa;
(h) la región E2a del adenovirus de una cualquiera de la SEQ ID NO: 13, 62, 63 o 65;
(i) la región L4 del adenovirus de una cualquiera de la SEQ ID NO: 13, 62, 63 o 65, o un fragmento de la misma, dicho fragmento codifica una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en la proteína de 100 kD, el homólogo de 33 kD y la proteína VIII;
(j) la región E3 del adenovirus de una cualquiera de la SEQ ID NO: 13, 62, 63 o 65, o un fragmento de la misma seleccionada del grupo que consiste en ORF1 de E3, ORF2 de E3, ORF3 de E3, ORF4 de E3, ORF5 de E3, ORF6 de E3, ORF7 de E3, ORF8 de E3 y ORF9 de E3;
(k) la región L5 del adenovirus de una cualquiera de la SEQ ID NO: 13, 62, 63 o 65, o un fragmento de la misma, dicho fragmento codifica la proteína de fibra con la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 19, 50 o 53;
(l) la región E4 del adenovirus de una cualquiera de la SEQ ID NO: 13, 62, 63 o 65, o un fragmento de la misma seleccionada del grupo que consiste en ORF7 de E4, ORF6 de E4, ORF5 de E4, ORF4 de E4, ORF3 de E4, ORF2 de E4 y ORF1 de E4; u ORF6 de la región E4 de Ad5 (SEQ ID NO: 64);
y
(m) la RTI en 3' de una cualquiera de la SEQ ID NO: 13, 62, 63 o 65.
En una realización, el polinucleótido de la invención codifica además una o más, preferiblemente todas las siguientes proteínas adenovirales: proteína VI, proteína VIII, proteína IX, proteína IIIa y proteína IVa2. Preferiblemente, estas proteínas están codificadas a partir de los marcos de lectura abiertos respectivos de la secuencia genómica de PanAd1, PanAd2 o PanAd3 descrita en la presente memoria. Un experto en la técnica de adenovirus recombinantes conoce muy bien cómo determinar los marcos de lectura abiertos que codifican las proteínas adenovirales especificadas anteriormente. También es consciente de la estructura de los genomas adenovirales y puede mapear, sin excesiva carga, las regiones adenovirales individuales y los MLAs representados en la presente memoria, p. ej., cualquiera de los nuevos genomas adenovirales PanAd1, PanAd2 o PanAd3 de la descripción.
Con el fin de expresar un polinucleótido, preferiblemente un ADNc, que codifica una o más proteínas adenovirales de la descripción, se puede subclonar dicho polinucleótido en un vector de expresión que contiene un promotor fuerte para dirigir la transcripción, un terminador de la transcripción/traducción y un sitio de unión a ribosoma para la iniciación de la traducción. Los promotores bacterianos adecuados son bien conocidos en la técnica, p. ej., E. coli, Bacillus sp., y Salmonella, y los kits para tales sistemas de expresión están disponibles comercialmente. De forma similar, los sistemas de expresión eucariota para células de mamífero, levadura y células de insecto son bien conocidos en la técnica y también están disponibles comercialmente.
Además del promotor, el vector de expresión contiene normalmente una unidad de transcripción o casete de expresión que contiene todos los elementos adicionales requeridos para la expresión del ácido nucleico que codifica la proteína adenoviral en las células huésped. Un casete de expresión típico contiene así pues un promotor unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína/polipéptido adenoviral y las señales requeridas para la poliadenilación eficaz del transcrito, los sitios de unión al ribosoma y la terminación de la traducción. Los elementos adicionales del casete pueden incluir, por ejemplo potenciadores. Un casete de expresión también debe contener una región de terminación de la transcripción corriente abajo del gen estructural para proporcionar una terminación eficaz. La región de terminación se puede obtener a partir del mismo gen que la secuencia promotora o se puede obtener de diferentes genes.
El vector de expresión particular utilizado para transportar la información genética a la célula no es particularmente crítico. Puede utilizarse cualquiera de los vectores convencionales utilizados para la expresión en células eucariotas o procariotas. Los vectores de expresión bacteriana convencionales incluyen plásmidos, tales como plásmidos basados en pBR322, pSKF, pET23D y sistemas de expresión de fusión tales como GST y LacZ, pero hay muchos más conocidos en la técnica por el experto en la técnica que se pueden emplear de forma útil.
Los vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucariotas se utilizan normalmente en vectores de expresión eucariota, p. ej., vectores SV40, vectores del virus del papiloma y vectores derivados del virus de Epstein-Barr. Otros vectores eucariotas a modo de ejemplo incluyen pMSG, pAV009/A.sup.+, pMTO10/A.sup+, pMAMneo-5, baculovirus pDSVE, pcDNA3.1, pIRES y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección de, p. ej., el promotor inmediato temprano de HCMV, el promotor temprano SV40, el promotor tardío SV40, el promotor de metalotioneína, el promotor del virus tumoral mamario murino, el promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor polihedrina u otros promotores que se muestran eficaces para la expresión en células eucariotas.
Algunos sistemas de expresión tienen marcadores que proporcionan amplificación génica tal como timidina quinasa, higromicina B fosfotransferasa y dihidrofolato reductasa. Alternativamente, también son adecuados los sistemas de expresión de alto rendimiento que no implican la amplificación génica.
Los elementos que también pueden incluirse en vectores de expresión incluyen un replicón que funciona en E. coli, un gen que codifica la resistencia a fármacos para permitir la selección de bacterias que albergan plásmidos recombinantes y sitios de restricción únicos en regiones no esenciales del plásmido para permitir la inserción de secuencias eucariotas. El gen de resistencia a fármacos particular elegido no es crítico, cualquiera de los muchos genes de resistencia a fármacos conocidos en la técnica es adecuado. Las secuencias procariotas se eligen opcionalmente de modo que no interfieran con la replicación del ADN en células eucariotas, si es necesario.
Los métodos de transfección convencionales pueden utilizarse para producir líneas celulares de bacterias, mamíferos, levaduras o insectos. Se puede utilizar cualquiera de los procedimientos bien conocidos para introducir secuencias de polinucleótidos extraños en células huésped. Por ejemplo, kits de transfección basados en liposomas comercialmente disponibles tales como Lipofectamine™ (Invitrogen), kits de transfección basados en lípidos comercialmente disponibles tales como Fugene (Roche Diagnostics), transfección basada en polietilenglicol, precipitación con fosfato de calcio, pistola génica (biolística), electroporación, o infección viral y cualquiera de los otros métodos bien conocidos para introducir ADN genómico clonado, ADNc, ADN sintético u otro material genético extraño en una célula huésped. Sólo es necesario que el procedimiento de ingeniería genética particular utilizado sea capaz de introducir con éxito al menos un gen en la célula huésped capaz de expresar el receptor.
Una proteína adenoviral expresada puede purificarse opcionalmente utilizando técnicas convencionales. Por ejemplo, las células pueden lisarse mecánicamente o mediante choque osmótico antes de someterse a etapas de precipitación y cromatografía, cuya naturaleza y secuencia dependerán del material recombinante particular que se va a recuperar. Alternativamente, la proteína recombinante puede secretarse y recuperarse del medio de cultivo en el que las células recombinantes se han cultivado como se conoce en la técnica de la expresión de proteínas.
En una realización preferida, el vector de la invención es un vector plasmídico, p. ej., un vector de expresión. Un vector plasmídico según la invención también puede utilizarse para generar un adenovirus recombinante.
Por lo tanto, un aspecto adicional de la presente invención es un adenovirus recombinante, preferiblemente un adenovirus incompetente para la replicación, que comprende un polinucleótido aislado según la invención y/o el polipéptido de la cápside adenoviral codificado de esa manera. El adenovirus recombinante de la invención comprende una proteína hexón, una proteína de fibra y una proteína pentón de la presente invención, es decir, la combinación definida en las reivindicaciones. En un aspecto preferido, el adenovirus recombinante se caracteriza por que es capaz de infectar una célula humana, preferiblemente capaz de infectar una célula humana después de que dicho adenovirus se incubase durante una hora en un suero sanguíneo humano derivado de un ser humano que no había sido previamente expuesto a un adenovirus de chimpancé.
A medida que se proporciona la información de secuencia de la combinación de proteínas hexón, pentón y de fibra de la invención, dicho adenovirus recombinante se puede obtener, p. ej., construyendo un adenovirus recombinante que está compuesto de las proteínas adenovirales habituales pero que tiene una cápside que comprende la combinación del polipéptido de la cápside adenoviral aislado según la invención. Dicho adenovirus recombinante comprende una región L2, una región L3 y una región L5 que codifica respectivamente al menos la proteína pentón, hexón y de fibra de la invención.
Los métodos para la construcción de adenovirus recombinantes son bien conocidos en la técnica. Las técnicas útiles para la preparación de adenovirus recombinantes son, por ejemplo, revisadas en Graham y Prevec, 1991 en Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols, (Ed. Murray, EJ.), pág. 109; y Hitt et al., 1997 "Human Adenovirus Vectors for Gene Transfer into Mammalian Cells" Advances in Pharmacology 40: 137-206. Se describen métodos adicionales en el documento WO 2006/086284. Para la preparación de adenovirus deficientes para la replicación, uno o varios de los productos génicos de E1A, E1B, E2A, e2b , E3 y E4 pueden expresarse en una línea celular complementaria que se puede utilizar para la propagación y el rescate de adenovirus recombinantes que son incompetentes para la replicación, ya que carecen, p. ej., de uno de los productos genéticos antes mencionados. El uso de tales líneas celulares también se describe en las referencias especificadas anteriormente.
En una realización, los polinucleótidos de la invención (o vectores que comprenden dichos polinucleótidos de la invención como se describe en la presente memoria) se utilizan para producir partículas adenovirales recombinantes. Los adenovirus recombinantes se delecionan preferiblemente de forma funcional como se menciona anteriormente en una o más regiones adenovirales tales como p. ej., las regiones E1a o E1b, y opcionalmente llevando otras mutaciones, p. ej., mutaciones o deleciones sensibles a la temperatura en otros genes adenovirales.
En otras realizaciones, es deseable retener una región E1a y/o E1b intacta en los adenovirus recombinantes. Dicha región E1 intacta puede localizarse en su ubicación original en el genoma adenoviral o colocarse en el sitio de una deleción en el genoma adenoviral nativo (p. ej., en la región E3).
En la construcción de vectores de adenovirus para la entrega de un gen a un huésped, p. ej., célula humana (u otro mamífero), se puede emplear un intervalo de secuencias de ácidos nucleicos de adenovirus en los vectores de la invención. Por ejemplo, la totalidad o una porción del gen E3 temprano retrasado del adenovirus puede eliminarse de la secuencia de adenovirus que forma parte del virus recombinante. Se cree que la función de E3 de simio es irrelevante para la función y producción de la partícula de virus recombinante. En algunas realizaciones, los vectores de adenovirus también se pueden construir teniendo una deleción de al menos la región de ORF6 del gen E4, y más deseablemente debido a la redundancia en la función de esta región, la región E4 completa. Todavía otro vector de esta invención contiene una deleción en el gen E2a temprano retrasado. También se pueden realizar deleciones en cualquiera de los genes tardíos L1 a L5 del genoma del adenovirus de simio. De manera similar, las deleciones en los genes intermedios IX e IVa2 pueden ser útiles para algunos fines. Se pueden realizar otras deleciones en los otros genes de adenovirus estructurales o no estructurales. Las deleciones discutidas anteriormente se pueden utilizar individualmente, es decir, una secuencia de adenovirus para su uso en la presente invención puede contener deleciones en una única región. Alternativamente, las deleciones de genes enteros o porciones de los mismos eficaces para destruir su actividad biológica se pueden utilizar en cualquier combinación. Por ejemplo, en un vector a modo de ejemplo según la invención, la secuencia de adenovirus puede tener deleciones de la región E1 y E4, o de la región E1, E2a y E3, o de las regiones E1 y E3, o de las regiones E1, E2a y E4 con o sin deleción de e 3, y así sucesivamente. Como se discutió anteriormente, tales deleciones pueden utilizarse en combinación con otras mutaciones génicas adenovirales, tales como mutaciones sensibles a la temperatura, para lograr un resultado deseado.
Un vector adenoviral que carece de secuencias adenovirales esenciales (p. ej., una región seleccionada de E1a, E1b, E2a, E2b, ORF6 de E4, L1 o L4) puede cultivarse en presencia de los productos génicos adenovirales ausentes necesarios para la infectividad viral y la propagación de una partícula adenoviral. Estas funciones auxiliares pueden proporcionarse cultivando el vector adenoviral en presencia de una o más construcciones auxiliares (p. ej., un plásmido o virus) o una célula huésped de empaquetamiento (línea celular complementaria como también se describe anteriormente). Véanse, por ejemplo, los ejemplos incluidos en la presente memoria y las técnicas descritas para la preparación de un vector de adenovirus humano "mínimo" en la solicitud de patente internacional WO96/13597 publicada el 9 de mayo de 1996.
Los virus auxiliares útiles contienen secuencias de gen de adenovirus seleccionadas que complementan los genes respectivos que se delecionan en las realizaciones preferidas del vector de adenovirus de la invención y/o que no se expresan mediante la línea celular de empaquetamiento en la que se transfecta el vector. En un ejemplo, el virus auxiliar es defectuoso de replicación y contiene una variedad de genes de adenovirus además de las secuencias descritas anteriormente.
Los virus auxiliares también se pueden formar en conjugados de policatión como se describe en Wu et al., J. Biol. Chem., 264: 16985-16987 (1989); K. J. Fisher y J. M. Wilson, Biochem. J., 299: 49 (1 de abril de 1994). Un virus auxiliar puede contener opcionalmente un segundo minigén indicador. Una serie de tales genes indicadores son conocidos en la técnica. La presencia de un gen indicador en el virus auxiliar que es diferente del transgén en el vector de adenovirus permite que tanto el vector Ad como el virus auxiliar se controlen de forma independiente. Este segundo indicador puede utilizarse para facilitar la separación entre el virus recombinante resultante y el virus auxiliar tras la purificación.
Para generar adenovirus recombinantes (Ad) delecionados en cualquiera de los genes descritos en el contexto de las realizaciones preferidas de la presente memoria, la función de la región del gen delecionado, si es esencial para la replicación y la infectividad del virus, se suministra preferiblemente al virus recombinante por un virus auxiliar o línea celular, es decir, una línea celular de complementación o empaquetamiento. En muchas circunstancias, una línea celular que expresa E1 humano se puede utilizar para transcomplementar el vector utilizado para generar adenovirus recombinantes. Esto es particularmente ventajoso ya que, debido a la diversidad entre las secuencias de polinucleótidos de la invención y las secuencias E1 de adenovirus humano encontradas en las células de empaquetamiento actualmente disponibles, el uso de las células que contienen E1 humano actuales evitará la generación de adenovirus competentes para la replicación durante la replicación y el proceso de producción. Sin embargo, en ciertas circunstancias, será deseable utilizar una línea celular que exprese los productos génicos E1 para la producción de un adenovirus recombinante delecionado en E1.
Si se desea, se pueden utilizar las secuencias proporcionadas en la presente memoria para generar una célula de empaquetamiento o línea celular que exprese, como mínimo, el gen E1 de adenovirus de un adenovirus ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2 o PanAd3 bajo el control transcripcional de un promotor para la expresión en una línea celular madre seleccionada, tal como, p. ej., una célula HeLa. Los promotores inducibles o constitutivos pueden ser empleados para este fin. Se proporcionan ejemplos de promotores, p. ej., en los ejemplos descritos en la presente memoria. Dichas líneas celulares que expresan E1 son útiles en la generación de vectores delecionados en E1 de adenovirus recombinantes. Adicionalmente o alternativamente, la invención proporciona líneas celulares, que se definen en las reivindicaciones, que expresan uno o más productos génicos adenovirales, p. ej., E1a, E1b, E2a, y/o ORF6 de E4, preferiblemente ORF6 de la región E4 de Ad5 (véanse también los ejemplos a continuación), que pueden construirse utilizando esencialmente los mismos procedimientos para su uso en la generación de vectores adenovirales recombinantes. Dichas líneas celulares se pueden utilizar para transcomplementar vectores de adenovirus delecionados en genes esenciales que codifican esos productos, o para proporcionar funciones auxiliares necesarias para el empaquetamiento de un virus dependiente auxiliar (p. ej., virus adenoasociado).
Generalmente, cuando se entrega un vector de la invención que comprende, p. ej., un minigén por transfección, el vector se entrega en una cantidad de aproximadamente 0,1 pg a aproximadamente 100 pg de ADN, y preferiblemente de aproximadamente 10 a aproximadamente 50 pg de ADN a aproximadamente 1x104 células a aproximadamente 1x103 células, y preferiblemente de manera aproximada 105 células. Sin embargo, las cantidades relativas de ADN del vector a las células huésped pueden ajustarse, teniendo en cuenta factores tales como el vector seleccionado, el método de entrega y las células huésped seleccionadas. La introducción del vector en una célula huésped puede lograrse por cualquier medio conocido en la técnica o como se describe en la presente memoria, que incluye transfección e infección, p. ej., utilizando transfección o electroporación con CaPO4.
Para la construcción y el ensamblaje del adenovirus recombinante que contiene un minigén deseado, el vector puede transfectarse in vitro en un ejemplo en presencia de un virus auxiliar en la línea celular de empaquetamiento, permitiendo que se produzca la recombinación homóloga entre el auxiliar y las secuencias del vector, que permite que las secuencias de adenovirus-transgén en el vector se repliquen y empaqueten en cápsides de virión, dando como resultado las partículas de vector viral recombinante como es bien conocido en la técnica. Un adenovirus recombinante de la invención es útil, p. ej., en la transferencia de un transgén seleccionado a una célula huésped seleccionada.
En una realización preferida del adenovirus de la invención, el adenovirus tiene una seroprevalencia de menos del 5 % en sujetos humanos y preferiblemente sin seroprevalencia en sujetos humanos, lo más preferiblemente sin seroprevalencia en sujetos humanos que no hayan estado previamente en contacto con un adenovirus de chimpancé. En este contexto, se prefiere que los sujetos humanos pertenezcan a un grupo étnico seleccionado de europeos, pueblos indígenas de África, asiáticos, pueblos indígenas de América y pueblos indígenas de Oceanía. Los métodos de identificación del origen étnico de un sujeto humano están comprendidos en la técnica (véase, p. ej., documento WO2003/102236).
En el adenovirus recombinante según la invención, el ADN de adenovirus es capaz de introducirse en una célula diana de mamífero, es decir, es infeccioso. Un adenovirus recombinante infeccioso de la invención puede utilizarse como una vacuna y para terapia génica como también se describe a continuación. Por lo tanto, en otra realización, se prefiere que el adenovirus recombinante comprenda una molécula para la entrega a una célula diana. Preferiblemente, la célula diana es una célula de mamífero, p. ej., una célula de chimpancé, una célula de roedor o una célula humana. Por ejemplo, la molécula para la entrega a una célula diana puede ser un casete de expresión como se define en la presente memoria. Los métodos para introducir un casete de expresión en el genoma de un adenovirus son bien conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, las citas bibliográficas proporcionadas anteriormente). En un ejemplo, un adenovirus recombinante de la presente invención que comprende un casete de expresión, que codifica p. ej., un minigén o un antígeno, puede generarse reemplazando una región genómica del adenovirus seleccionado de E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4 con dicho casete de expresión. Las regiones genómicas E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4 de los adenovirus de la descripción pueden identificarse fácilmente mediante un alineamiento con genomas adenovirales conocidos y anotados tales como de Ad5 humano (véase: Birgitt Tauber y Thomas Dobner, Oncogene (2001) 20, págs. 7847-7854, y también: Andrew J. Davison, et al., "Genetic contení and evolution of adenoviruses", Journal of General Virology (2003), 84, págs. 2895-2908). Ejemplos no limitantes de cómo generar adenovirus modificados que comprenden una molécula para entrega a una célula diana también se proporcionan en los ejemplos 1 y 2 y en la figura 4 a continuación.
La molécula de entrega a una célula diana es preferiblemente un polinucleótido pero también puede ser un polipéptido o un compuesto químico pequeño, que preferiblemente tiene una actividad terapéutica o de diagnóstico. En una realización particularmente preferida, la molécula de entrega a una célula diana es un polinucleótido que comprende una secuencia de repetición terminal invertida (RTI) en 5' adenoviral, un gen, p. ej., s Eq ID NO: 1 y una RTI en 3'. Resultará evidente para el experto en la técnica que el tamaño molecular de la molécula tiene que elegirse de modo que la cápside pueda formarse alrededor y empaquetar la molécula, cuando se produzca el adenovirus recombinante, p. ej., en una línea celular de empaquetamiento. Por lo tanto, preferiblemente, el gen es un minigén que puede tener, p. ej., hasta 7.000 y como máximo hasta 8.000 pares de bases.
En una realización preferida, la molécula de entrega a una célula diana comprendida en el adenovirus recombinante según la invención es un polinucleótido que codifica una proteína antigénica o un fragmento de la misma. Una proteína antigénica o fragmento de la misma es capaz de provocar una respuesta inmunitaria en un mamífero y puede ser en una realización particularmente preferida la proteína gag del VIH como se muestra en los ejemplos y está codificada por un polinucleótido según la SEQ ID NO: 1.
Se han depositado adenovirus descritos en ECACC (European Collection of Cell Culture, Porton Down, Salisbury, SP4 OJG, R.U.) y tienen un número de depósito que consiste en 08110601 (ChAd83), 08110602 (ChAd73), 08110603 (ChAd55), 08110604 (ChAd147) y 08110605 (ChAd146). Los depósitos de las cepas adenovirales antes mencionadas (nombre latino: Mastadenovirus, Adenoviridae) tuvieron lugar el 6 de noviembre de 2008 por Okairos AG, Elisabethenstr. 3, 4051 Basilea, Suiza.
Preferiblemente, el adenovirus derivado de uno de los adenovirus depositados antes mencionados se ha alterado mediante la introducción de una deleción funcional, deleción o modificación en su genoma, p. ej., para obtener un adenovirus incompetente para la replicación y/o un adenovirus que es capaz de expresar un transgén en una célula huésped. Por ejemplo, uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en el gen E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4 pueden delecionarse, volverse no funcionales, y/o pueden reemplazarse con un casete de expresión como se especifica anteriormente. Adicionalmente, se pueden introducir uno o más genes de otro adenovirus, preferiblemente para un gen delecionado. Un experto en la técnica es muy consciente de cómo introducir estas alteraciones genómicas en las cepas depositadas. A este respecto, se han descrito anteriormente métodos de generación de adenovirus modificados que comprenden una molécula de entrega a una célula diana, que es una modificación preferida de las cepas depositadas.
En un aspecto adicional, se proporciona una composición que comprende un adyuvante inmunológico y al menos uno de los siguientes (i) a (iv):
(i) un polipéptido de cápside adenoviral codificado por el polinucleótido según la invención;
(ii) un polinucleótido aislado según la invención;
(iii) un vector según la invención;
(iv) un adenovirus recombinante según la invención;
y, opcionalmente, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
Una composición según la invención comprende un adyuvante que puede utilizarse como una vacuna, p. ej., para sujetos humanos. El adyuvante inmunológico al que también se hace referencia en breve como "adyuvante", acelera, prolonga y/o potencia la calidad y/o la potencia de una respuesta inmunitaria a un antígeno/inmunógeno, en comparación con la administración del antígeno solo, reduciendo así la cantidad de antígeno/inmunógeno necesaria en cualquier vacuna dada, y/o la frecuencia de inyección necesaria para generar una respuesta inmunitaria adecuada al antígeno/inmunógeno de interés.
Los ejemplos de adyuvantes que pueden utilizarse en el contexto de la composición según la presente invención son precipitados de tipo gel de hidróxido de aluminio (alumbre); AlPO4; alhidrogel; productos bacterianos de la membrana externa de bacterias Gram-negativas, en particular monofosforil lípido A (MFLA), lipopolisacáridos (LPS), dipéptidos de muramilo y sus derivados; adyuvante incompleto de Freund; liposomas, en particular liposomas neutros, liposomas que contienen la composición y opcionalmente citoquinas; copolímeros en bloque no iónicos; adyuvante ISCOMATRIX (Drane et al., 2007); ADN no metilado que comprende dinucleótidos CpG (motivo CpG), en particular ODN que contienen CpG con una cadena principal de fosforotioato (PTO) (ODN que contiene CpG con PTO) o con cadena principal de fosfodiéster (PO) (ODN que contienen CpG con PO); derivados de lipopéptidos sintéticos, en particular PairuCys; lipoarabinomanano; peptidoglicano; zimosano; proteínas de choque térmico (HSP), en particular HSP 70; ARNbc y sus derivados sintéticos, en particular Poli I:poli C; péptidos policatiónicos, en particular poli-L-arginina; taxol; fibronectina; flagelina; imidazoquinolina; citoquinas con actividad adyuvante, en particular GM-CSF, interleucina-(IL-) 2, IL-6, IL-7, IL-18, interferones tipo I y II, en particular interferón-gamma, TNF-alfa; 25-dihidroxivitamina D3 (calcitriol); y oligopéptidos sintéticos, en particular péptidos presentes en CHMII. Pueden utilizarse polímeros en bloque no iónicos que contienen polioxietileno (POE) y polioxipropileno (POP), tales como copolímeros en bloque de POE-POP-POE como adyuvante (Newman et al., 1998). Este tipo de adyuvante es particularmente útil para composiciones que comprenden ácidos nucleicos como principio activo.
Opcionalmente, pueden utilizarse diversos excipientes farmacéuticamente aceptables. Los excipientes farmacéuticamente aceptables preferidos se mencionan a continuación cuando se discuten los usos según la invención.
La activación de receptores específicos puede estimular una respuesta inmunitaria. Dichos receptores son conocidos por los expertos en la técnica y comprenden, por ejemplo, receptores de citoquinas, en particular receptores de citoquinas tipo I, receptores de citoquinas tipo II, receptores de TNF; y receptor de vitamina D que actúa como factor de transcripción; y los receptores tipo Toll 1 (TLR1), TLR-2, TLR 3, TLR4, TLR5, TLR-6, TLr 7 y TLR9. Los agonistas de dichos receptores tienen actividad adyuvante, es decir, son inmunoestimulantes. En una realización preferida, el adyuvante de la composición de la presente invención puede ser uno o más agonistas del receptor tipo Toll. En una realización más preferida, el adyuvante es un agonista del receptor tipo Toll 4. En una realización preferida particular, el adyuvante es un agonista del receptor tipo Toll 9, preferiblemente codificado por el nucleótido tccatgacgttcctgacgtt (SEQ ID NO: 2).
En un aspecto adicional, la invención proporciona una célula, preferiblemente una célula de no simio, que comprende al menos uno de los siguientes:
(i) un polipéptido de cápside adenoviral codificado por el polinucleótido según la invención;
(ii) un polinucleótido aislado según la invención;
(iii) un vector según la invención;
(iv) un adenovirus recombinante según la invención.
La célula se puede seleccionar de una célula bacteriana tal como una célula de E. coli, una célula de levadura tal como Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris, una célula vegetal, una célula de insecto, tal como células SF9 o Hi5, o una célula de mamífero. Los ejemplos preferidos de células de mamífero son células de ovario de hámster chino (CHO), células de riñón embrionario humano (HEK 293), células HELA, células de hepatoma humano (p. ej., Huh7.5), células de hepatoma humano Hep G2, células de hepatoma humano Hep 3B y similares.
Si la célula comprende un polinucleótido aislado según (i), este polinucleótido puede estar presente en la célula o bien (i) libremente dispersado como tal, o (ii) integrado en el genoma de la célula huésped o en el ADN mitocondrial.
En una realización preferida adicional, la célula es una célula huésped, preferiblemente una célula 293 o una célula PER.C6™, que expresa al menos un gen adenoviral seleccionado del grupo que consiste en E1a, E1b, E2a, E2b, E4, L1, L2, L3, L4 y L5.
También se proporciona el uso del polinucleótido aislado según la invención, del vector según la invención, del adenovirus recombinante según la invención y/o de la composición farmacéutica según la invención para su uso en terapia o profilaxis de una enfermedad.
Los vectores adenovirales han demostrado un gran potencial como vectores de vacuna. Los estudios pre-clínicos y clínicos han demostrado la viabilidad del diseño del vector, la expresión robusta del antígeno y la inmunidad protectora utilizando este sistema. Por lo tanto, en una realización preferida, la terapia o profilaxis es una vacunación, p. ej., para sujetos humanos. Se proporcionan instrucciones detalladas de cómo se utilizan los adenovirus y se preparan para la vacunación conforme a una amplia bibliografía comprendida en la técnica y conocida por el experto en la técnica.
Si el uso es una vacunación, se puede administrar un adenovirus recombinante de la invención en una dosis inmunológicamente y/o profilácticamente eficaz que es preferiblemente de 1x108 a 1x1011 partículas virales (es decir, 1x108, 5x108, 1x109, 5x109, 1x1010, 2,5x1010 o 5x1010 partículas). Además, para una vacunación que requiere un refuerzo, se prefiere aplicar una metodología de "iniciación-refuerzo heterólogo", como se definió anteriormente. Además, cuando se utiliza el polinucleótido aislado según la invención, el adenovirus recombinante según la invención y/o la composición farmacéutica según la invención en una vacuna, es preferido que la vacuna comprenda un adyuvante. Los ayudantes inmunológicos preferidos se han mencionado en la presente memoria y se pueden utilizar en dicha vacuna.
Un adenovirus recombinante preparado utilizando un polinucleótido según la invención se puede utilizar para transducir una célula huésped con un polinucleótido, p. ej., ADN. De este modo, un adenovirus deficiente para la replicación preferiblemente, aunque infeccioso, es decir, capaz de introducirse en una célula huésped, puede prepararse para expresar cualquier proteína o polipéptido personalizado en una célula huésped. Por lo tanto, en una realización preferida, la terapia que se cita es terapia génica. Si un polinucleótido aislado, un vector, un adenovirus recombinante y/o una composición farmacéutica según la invención se utiliza para terapia génica y se administra a un sujeto a tratar, se prefiere que se administre en una dosis suficientemente grande de manera que el tratamiento da como resultado una o más células del paciente que se está transfectando, es decir, transduciendo. Si un adenovirus recombinante y/o una composición farmacéutica según la invención se administra por cualquiera de los medios preferidos de administración descritos en la presente memoria, se prefiere que se administre una dosis eficaz que sea preferiblemente de 1x108 a 5x1011 partículas virales (es decir, 1x108, 5x108, 1x109, 5x109, 1x1010, 2,5x1010, 5x1010, 1x1011 o, lo más preferiblemente, 5x1011 partículas. En realizaciones preferidas, el polinucleótido preferiblemente heterólogo que está comprendido en el adenovirus recombinante de la invención es capaz de expresar una proteína o polipéptido en una célula huésped del sujeto, en donde la proteína o polipéptido comprende un péptido señal que efectúa la secreción de la proteína o polipéptido de dicha célula huésped. Por ejemplo, un paciente en necesidad de una cierta proteína puede tratarse utilizando un adenovirus de la presente invención que comprende un ADNc que codifica una forma secretable de esa proteína.
En una realización adicional, el polinucleótido aislado, el vector, el adenovirus y/o la composición farmacéutica según la invención (en adelante referidos como productos farmacéuticos según la invención) para uso según la invención se formulan para comprender además uno o más diluyentes, vehículos; excipientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo materiales de relleno, aglutinantes, lubricantes, deslizantes, disgregantes, adsorbentes; y/o conservantes.
El producto farmacéutico según la invención se puede administrar mediante diversas vías bien conocidas, que incluyen administración oral, rectal, intragástrica y parenteral, p. ej., vías de administración intravenosa, intramuscular, intranasal, intradérmica, subcutánea y similares. Se prefiere la administración parenteral, intramuscular e intravenosa. Preferiblemente, el producto farmacéutico según la invención se formula como jarabe, una solución de infusión o inyección, un comprimido, una cápsula, un comprimido oblongo, una pastilla, un liposoma, un supositorio, un emplasto, un apósito, una cápsula retardada, un polvo, o una formulación de liberación lenta.
Preferiblemente, el diluyente es agua, un tampón, una solución salina tamponada o una solución salina y el vehículo preferiblemente se selecciona del grupo que consiste en manteca de cacao y vitebesol.
Las formas farmacéuticas particulares preferidas para la administración del producto farmacéutico según la invención para su uso según la presente invención son formas adecuadas para su uso inyectable e incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Normalmente, dicha solución o dispersión incluirá un disolvente o medio de dispersión, que contiene, por ejemplo, soluciones acuosas tamponadas con agua, p. ej., tampones biocompatibles, etanol, poliol, tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, mezclas adecuadas de los mismos, tensioactivos o aceites vegetales.
Las soluciones de infusión o inyección se pueden lograr mediante cualquier serie de técnicas reconocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, la adición de conservantes, como agentes antibacterianos o antifúngicos, p. ej., parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico o timersal. Además, se pueden incorporar agentes isotónicos, tales como azúcares o sales, en particular cloruro de sodio en soluciones de infusión o inyección.
Los diluyentes preferidos en el contexto de la presente invención son agua, tampones fisiológicamente aceptables, soluciones salinas tamponadas fisiológicamente aceptables o soluciones salinas. Los vehículos preferidos son manteca de cacao y vitebesol. Los excipientes que se pueden utilizar con las diversas formas farmacéuticas del producto farmacéutico según la invención se pueden elegir del siguiente listado no limitativo:
a) aglutinantes tales como lactosa, manitol, sorbitol cristalino, fosfatos dibásicos, fosfatos de calcio, azúcares, celulosa microcristalina, carboximetilcelulosa, hidroxietilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares;
b) lubricantes tales como estearato de magnesio, talco, estearato de calcio, estearato de cinc, ácido esteárico, aceite vegetal hidrogenado, leucina, glicéridos y estearil fumaratos de sodio,
c) disgregantes tales como almidones, croscaramelosa, metilcelulosa de sodio, agar, bentonita, ácido algínico, carboximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares.
Se pueden encontrar otros excipientes adecuados en el Handbook of Pharmaceutical Excipients, publicado por la American Pharmaceutical Association.
Se prefieren ciertas cantidades del producto farmacéutico según la invención para la terapia o profilaxis de una enfermedad. Sin embargo, se entiende que dependiendo de la gravedad de la enfermedad, el tipo de la enfermedad, así como del paciente respectivo a tratar, p. ej., el estado de salud general del paciente, etc., se requieren diferentes dosis del producto farmacéutico según la invención para provocar un efecto terapéutico o profiláctico. La determinación de la dosis apropiada queda dentro del criterio del doctor tratante.
Si el producto farmacéutico según la invención se va a utilizar profilácticamente, se puede formular como una vacuna. En este caso, el producto farmacéutico según la invención se administra preferiblemente en las dosis preferidas anteriormente indicadas y particularmente preferidas. Preferiblemente, la administración de la vacuna se repite al menos dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o al menos 10 veces en el transcurso de un periodo de tiempo definido, hasta que el sujeto vacunado haya generado suficientes anticuerpos contra el producto farmacéutico según la invención de modo que el riesgo de desarrollar la enfermedad respectiva ha disminuido. El periodo de tiempo en este caso suele ser variable dependiendo de la antigenicidad de la vacuna. Preferiblemente, el periodo de tiempo no es más de cuatro semanas, tres meses, seis meses o tres años. Si un adenovirus según la descripción se utiliza con fines de vacunación, al menos uno de los dominios hipervariables de la proteína hexón puede reemplazarse con un epítopo inmunogénico del agente de enfermedad respectivo al que se dirige la vacunación. Las vacunas contienen normalmente uno o más adyuvantes como se especificó anteriormente. Un resumen detallado del uso de adenovirus para la vacunación y los métodos correspondientes se proporciona en: Bangari DS y Mittal SK (2006) Vaccine, 24(7), págs. 849-862; véase también: Zhou D, et al., Expert Opin Biol Ther. enero de 2006; 6(1):63-72; y: Folgori A, et al., Nat Med. febrero de 2006; 12(2):190-7; véase también: Draper SJ, et al., Nat Med. agosto de 2008; 14(8):819-21. Epub 27 de julio de 2008.
Breve descripción de las figuras
Fig. 1 Alineamiento de secuencias múltiples entre proteínas hexón de diversos aislados de adenovirus de la descripción utilizando Clustal-W con configuraciones predeterminadas. Se muestran proteínas hexón de dichos nuevos aislados de adenovirus de chimpancé (designados como PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146 y ChAd147). Los dominios hipervariables 1 a 7 se designan como "HVR 1-6" y "HVR 7", respectivamente.
Fig. 2 Alineamiento de secuencias múltiples entre proteínas de fibra de adenovirus ChAd55 y de nuevos aislados de adenovirus de chimpancé adicionales (designados como PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd73, ChAd83, ChAd146 y ChAd147), utilizando Clustal-W con configuraciones predeterminadas.
Fig. 3 Alineamiento de secuencias múltiples entre proteínas pentón de adenovirus ChAd55 y de nuevos aislados de adenovirus de chimpancé adicionales (designados como PanAd1, PanAd2, PanAd3, ChAd73, ChAd83, ChAd146 y ChAd147), utilizando Clustal-W con configuraciones predeterminadas.
Fig. 4 Diagrama de construcción de un vector de adenovirus defectuoso de replicación por recombinación homóloga con un genoma viral de tipo silvestre y el plásmido lanzadera correspondiente. Véase también el ejemplo 2.
Fig. 5 Respuesta inmunitaria mediada por células en ratones vacunados con adenovirus recombinantes que comprende un casete de expresión para la expresión de la proteína gag del VIH (SEQ ID NO: 1). Se comparó la potencia de vacunación de Ad5 humano recombinante y ChAd55 de chimpancé (Figura 5A), de adenovirus Ad5 humano recombinante y bonobo PanAd1, PanAd2 y PanAd3 (Fig. 5B) y de ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146 y ChAd147 recombinante (Fig. 5C). La respuesta inmunitaria se midió mediante el ensayo ELIspot de interferón-Y mediante la incubación de las células con un epítopo de gag del VIH CD8 mapeado en ratones Balb/C. Los resultados se notifican como células formadoras de mancha por 106 esplenocitos.
Fig. 6 La seroprevalencia de nuevos vectores de adenovirus se evaluó en un panel de sueros humanos de origen europeo. La seroprevalencia del adenovirus humano tipo 5 (Ad5) y de los adenovirus de chimpancé ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2, PanAd3 y CV-68 se evaluaron en paralelo en el mismo panel. Los datos se expresan como % de sujetos que muestran una inmunoprevalencia. Los anticuerpos neutralizantes sólo se detectaron contra adenovirus Ad5 y CV-68 pero no para ninguno de los nuevos adenovirus.
Fig. 7 La inmunización contra VHS de PanAd de ratones BALB/c se muestra en la FIG. 7A y la inmunización contra Ag de cáncer de PanAd de ratones BALB/c se muestra en la FIG. 7B.
Fig. 8 La inmunización contra gag de HIV de PanAd de Macaca fascicularis se muestra en un experimento de vacunación de cebado/refuerzo.
Ejemplos
Ejemplo 1: Aislamiento y caracterización de adenovirus
ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147 son un grupo de adenovirus de chimpancé obtenidos de animales sanos alojados en diferentes instalaciones de Europa y EE. UU. ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147 tienen la propiedad de no ser reactivos al suero humano. PanAd1, PanAd2 y PanAd3 son nuevos adenovirus aislados de bonobos sanos (Pan Paniscus) alojados en diferentes instalaciones de Europa y EE. UU. PanAd1, PanAd2 y PanAd3 tienen la propiedad de una reactividad no detectable a los sueros humanos.
Las reservas comunes de adenovirus de chimpancé y bonobo se clonaron infectando células 293 sembradas en placas de 96 pocillos, después del primer pase de amplificación. La clonación del virus se realizó por limitación de la dilución del lisado celular obtenido en el primer pase de la amplificación del virus. Se recogieron 5 clones aislados y se propagaron en serie. Después de 3-4 pases en serie de amplificación, se realizó una preparación a gran escala de adenovirus en células plantadas en 5 fábricas de células de dos capas (NUNC) (200 millones de células/fábrica de células). Se obtuvieron partículas virales purificadas del lisado celular mediante dos etapas de ultracentrifugación en gradientes de densidad de cloruro de cesio.
Se aisló ADN genómico de 3x1012 pp de preparación de virus purificado mediante digestión con proteinasa K (0,5 mg/ml) en SDS-TEN al 1 % (2 horas a 55 °C). Después de una extracción con fenol-cloroformo y precipitación con etanol, el ADN genómico se resuspendió en agua y se sometió a secuenciación genómica.
Se obtuvo una clasificación inicial de los nuevos aislados por análisis secuencial de la región hipervariable 7 (HVR7) del gen hexón. Para este fin, se diseñaron dos cebadores en las regiones altamente conservadas que flanquean HVR7: TGTCCTACCARCTCTTGCTTGA (SEQ ID NO: 3) y GTGGAARGGCACGTAGCG (SEQ ID NO: 4). La HVR7 se amplificó por PCR utilizando ADN viral purificado o lisado de 293 crudo como molde y luego se secuenció. Se obtuvo información más detallada sobre el aislado secuenciando las regiones hipervariables 1 a 6. La región de ADN que contenía HVR1-6 se amplificó mediante PCR utilizando los oligonucleótidos HVR1-6directo, CAYGATGTGACCACCGACCG (SEQ ID NO: 5) y HVR1-6inverso, GTGTTYCTGTCYTGCAAGTC (SEQ ID NO: 6). Con base al análisis de la secuencia de HVRs, los nuevos virus aislados se clasificaron en el subgrupo E (ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147) y el subgrupo C (PanAd1, PanAd2 y PanAd3) de la clasificación de virus Ad humano (Horowitz, MS (1990), Adenoviridae and their replication. In Virology B.N. Fields y D.M. Knipe, eds. (Raven Press, Nueva York) págs. 1679-1740).
Se obtuvo un árbol filogenético por alineamiento de secuencias de aminoácidos de hexón de adenovirus humano y de chimpancé. Los resultados son acordes con la clasificación inicial basada en el alineamiento de secuencias de nucleótidos limitado a HVR1-6 y 7 de hexón mediante el uso del programa Align X (Informax, Inc) que demuestra una estrecha relación filogenética de aislados ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147 con Ad4 humano (subgrupo E) mientras que el aislado de adenovirus de bonobo PanAd1, PanAd2 y PanAd3 están relacionados con Ad1, 2, 5, 6 humano (subgrupo C).
Ejemplo 2: Construcción de vectores
Los genomas del virus PanAd1, PanAd2 y PanAd3 y ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147 se clonaron en un vector plasmídico siguiendo la estrategia detallada a continuación. Todas las manipulaciones del genoma del vector se realizaron en E. coli siguiendo técnicas convencionales. Los sistemas vectoriales se desarrollaron al delecionar las regiones E1 y E3 de las cadenas principales de ChAd y PanAd. La región E1 se sustituyó con casetes de expresión basados en el promotor IE de CMV humano y la señal BGHpA que contienen genes de región no estructural de VHC (NE de VHC) y gag de VIH (SEQ ID NO: 1) para la evaluación de la potencia inmunológica en modelos animales. Además, se construyeron los vectores ChAd y PanAd que expresan el gen de la fosfatasa alcalina secretada (SEAP) para el ensayo de neutralización. Los vectores se propagaron en células 293 y se purificaron mediante gradientes de CsCl siguiendo protocolos convencionales.
La construcción de los vectores AE1 PanAdl, PanAd2 y PanAd3 se siguió por las etapas que se detallan a continuación.
I. Construcción del vector lanzadera de PanAd
El genoma PanAd1 se utilizó para construir un vector lanzadera para la clonación mediante recombinación homóloga de todo el genoma de PanAd1, PanAd2 y PanAd3. Brevemente, el vector lanzadera utilizado para clonar el adenovirus 1 de bonobo al que se hace referencia en la presente memoria como pBAd1RLD_EGFP se construyó de la siguiente manera:
El extremo izquierdo de PanAd1 (nt 1-450) se amplificó por PCR con los oligonucleótidos 5'-ATCTGGAATTCGTTTAAACCATCATCAATAATATACCTTATTTTG-3' (SEQ ID NO: 7) y 5'-TCAGGAACTAGTTCCGTATACCTATAATAATAAAACGGAGACTTTG-3' (SEQ ID NO: 8) digeridos con SpeI y EcoRI, y acto seguido ligado en un vector plásmido que ya contiene casete HCMV-EGFP-bgh polyA generando pBAd1-L. El extremo derecho de PanAd1 (nt 37362-37772) se amplificó luego mediante PCR con los oligonucleótidos 5'-TCCAGCGGCGCGCCAGACCCGAGTCTTACCAGGA-3' (SEQ ID NO: 9) y 5'-ATTCAGGATCCGAATTCGTTTAAACCATCATCAATAATATACCTTATTTTG-3' (SEQ ID NO: 10), y se clonó en pBAd1-L generando así el plásmido pBAd1-RL.
Un fragmento de ADN de PanAd1 (nt 3498-4039) que contenía la región codificante pIX se amplificó posteriormente por PCR con los oligonucleótidos 5'-TATTCTGCGATCGCTGAGGTGGGTGAGTGGGCG-3' (SEQ ID NO: 11) y 5'-TTACTGGCGCGCCTGCCTCGAGTAAACGGCATTTGCAGGAGAAG-3' (SEQ ID NO: 12), luego se clonó en pBAd1-RL obteniendo la lanzadera pBAd1RLD EGFP plasmídica. Los plásmidos lanzadera que contienen los casetes de expresión para la fosfatasa alcalina secretada (SEAP), gag del VIH, los genes de la región no estructural (NE) del VHC también se construyeron sustituyendo el gen EGFP en la lanzadera pBAd1RLD EGFP.
La región NE del HCV de gag del VIH, el casete de expresión SEAP y EGFP basado en el promotor de citomegalovirus humano (HCMV) y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (Bgh polyA) se construyeron como se describe en Emini et al., publicación internacional número WO 03/031588. El casete de ADN viral se diseñó para contener sitios de enzimas de restricción (PmeI) que están presentes solo al final de ambas RTI para permitir la liberación de ADN viral a partir del ADN plasmídico.
II. Construcción del vector PanAdl, PanAd2 y PanAd3 de AE1
Los vectores PanAd1, PanAd2 y PanAd3 se construyeron mediante recombinación homóloga en la cepa BJ5183 de E. coli. Las células BJ5183 se co-transformaron con ADN virales purificados de PanAd1, 2 y 3 y pBAd1RLD-EGFP o pBAd1RLD-Gag. La recombinación homóloga entre genes pIX, secuencias de ADN RTI derecha presentes en los extremos de pBAd1RLD-EGFP linealizado o pBAd1RLD-Gag y ADN genómicos virales permitieron su inserción en el vector plasmídico, delecionando al mismo tiempo la región E1 que se sustituyó con el casete de expresión. Esta estrategia permitió la construcción de los plásmidos preadeno pPanAd1, pPanAd2 y pPanAd3 que expresan EGFP o transgenes de gag de VIH. Los casetes de expresión de SEAP o NE VHC se clonaron a continuación en vectores pPanAd 1, 2 y 3 reemplazando los casetes de expresión EGFP o Gag.
III. Deleción de la región E3
Se introdujo una deleción de la región E3 en las cadenas principales de vectores PanAd1, PanAd2 y PanAd3 mediante el uso de una estrategia que implica varias etapas de clonación y recombinación homóloga en E. coli. La deleción de E3 de PanAd1 abarca desde el nucleótido 28636 hasta el nucleótido 32596 de la secuencia genómica de PanAd1 (SEQ ID NO: 13); la deleción de E3 de PanAd2 abarca desde el nucleótido 28653 hasta el nucleótido 32599 de la secuencia genómica de PanAd2 (SEQ ID NO: 62); la deleción de E3 de PanAd3 abarca desde el nucleótido 28684 hasta el nucleótido 32640 de la secuencia genómica de PanAd3 (SEQ ID NO: 63).
IV. Deleción de la región E4
La región E4 nativa de PanAd1, PanAd2 y PanAd3 se delecionó y se reemplazó con la secuencia de codificación por ORF6 de la región E4 de Ad5 (SEQ ID NO: 64). Las coordenadas de la deleción de E4 introducidas en las cadenas principales de PanAd 1, 2 y 3 son las siguientes:
la deleción de E4 de PanAd1 abarca desde el nucleótido 34690 hasta el 37369 (SEQ ID NO: 13);
la deleción de E4 de PanAd2 abarca desde los nucleótidos 34696 hasta 37400 (SEQ ID NO: 62);
la deleción de E4 de PanAd3 abarca desde el nucleótido 34690-37369 (SEQ ID NO: 63).
La región delecionada contiene todos los mlas de E4 de PanAd, mientras que el promotor nativo E4 y la señal de poliadenilación no se delecionaron.
El casete de expresión de la región NE de VHC y gag de VIH basado en el promotor de citomegalovirus humano (HCMV) y señal de poliadenilación de hormona de crecimiento bovina (Bgh polyA) se construyó como se describe en Emini et al., publicación internacional número WO 03/031588 e insertó en el vector que expresa EGFP AE1 de PanAd1, 2 y 3 mediante recombinación homóloga en la cepa BJ5183 de E. coli que explota las homologías entre las secuencias de ADN de HCMV y Bgh polyA.
V. Construcción y rescate del vector de expresión DE1 ChAd55
Construcción de vector lanzadera para la clonación de ChAd55
La lanzadera ChAd55 se construyó siguiendo la misma estrategia descrita anteriormente para los vectores PanAd que luego se utilizaron para la clonación de los genomas virales de ChAd55. Con este fin, el vector lanzadera pARS ChAd55 que contiene el extremo derecho así como el extremo izquierdo del genoma viral (extremo izquierdo de RTI al gen pIX con la región E1 delecionada y sustituida con el casete de expresión) se linealizó con la enzima de restricción AscI y se co-transformó en la cepa BJ5183 de E. coli con ADN viral purificado de ChAd55. La recombinación homóloga entre secuencias de ADN de genes pIX e RTI derecha presente en los extremos de pARS ChAd55 y ChAd55 linealizado, y ADN genómico viral purificado ChAd73, ChAd83, ChAd146 ChAd147 permitieron su inserción en el vector plasmídico al delecionar al mismo tiempo la región E1. Un diagrama de la estrategia de clonación del genoma del adenovirus 55 de chimpancé (ChAd55) se proporciona en la figura 4.
Se construyeron casetes de expresión basados en el promotor del citomegalovirus humano (HCMV) y la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (Bgh polyA) para expresar la fosfatasa alcalina secretada (SEAP), EGFP, gag del VIH, genes NE del VHC. Todos los casetes de expresión se insertaron en el único sitio SnaBI del vector pARS ChAd55 para ser transferidos mediante recombinación homóloga en los pre-plásmidos de adenovirus AE1.
Ejemplo 3: Experimentos de inmunización
La eficacia de los vectores ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2 y PanAd3 como vacuna recombinante potencial se evaluó en ratones con vectores que expresaban el transgén gag del VIH. La potencia vectorial de gag ChAd55 se comparó con gag Ad5 humano en experimentos de inmunización realizados en paralelo. A los grupos de 10 animales se le inyectaron en el cuádriceps una dosis del vector de 108 vp/ratón para gag Ad5 o gag ChAd55 (Fig. 5A). En un experimento distinto, a un grupo de 5 animales se le inyectó una dosis del vector de 108 vp/ratón para gag Ad5 o gag PanAd1, gag PanAd2 y gag PanAd3 (Fig. 5B). La potencia de gag ChAd73, gag ChAd83, gag ChAd146 y gag Chad147 también se determinó inmunizando grupos de 5 ratones con una dosis de vector de 108 vp/ratón en paralelo con gag ChAd55 (Fig. 5C). La respuesta inmunitaria provocada contra gag del VIH se midió mediante el ensayo Elispot de interferón-Y en esplenocitos. Los resultados de los experimentos de inmunización con ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147 y PanAd1, PanAd2 y PanAd3 en comparación con el vector gag Ad5 humano muestran que los nuevos adenovirus son al menos tan eficaces para provocar una respuesta inmunitaria específica como el adenovirus recombinante Ad5 de la técnica anterior.
Ejemplo 4: Estudios de neutralización
Se llevaron a cabo ensayos de neutralización con el fin de evaluar la prevalencia en sueros humanos de anticuerpos neutralizantes contra el adenovirus 55, 73, 83, 146, 147 de chimpancé común y el adenovirus de bonobo tipo 1, 2 y 3. El ensayo evaluó los efectos de la pre-incubación sérica sobre la capacidad de ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147, PanAd1, PanAd2 y PanAd3 que portan el gen de la fosfatasa alcalina secretada (SEAP) para transducir células 293 humanas. El título de neutralización se define como la dilución de suero que proporciona una reducción del 50 % de la actividad de SEAP observada en el control positivo con el virus en ausencia de suero. Cada muestra de suero se analizó a diversas diluciones (cinco incrementos de 4 veces comenzando a partir de una dilución 1/18 a 1:4608). Las muestras se pre-incubaron durante una hora a 37 °C y luego se añadieron a células 293 sembradas en placas de 96 pocillos (3x104 células/pocillo). Se analizó un grupo de sueros humanos para determinar la actividad de neutralización. En paralelo, el mismo panel se sometía a ensayo en vectores Ad5 y en SEAP Ad de chimpancé y bonobo. Los resultados se proporcionan en la Figura 6. Los resultados indican que la seroprevalencia en adenovirus de chimpancé es menor que el adenovirus Ad5 humano. Sin embargo, en general, la presencia de anticuerpos neutralizantes contra ChAds ya descritos (CV-68) puede detectarse en un subconjunto de sujetos. Por el contrario, todos los sueros humanos ensayados hasta ahora no neutralizaron ChAd55 y PanAd1, PanAd2 y PanAd3 incluso a un título muy bajo. Lo mismo se observó para ChAd73, ChAd83, ChAd146 y ChAd147. Por lo tanto, los nuevos aislados de adenovirus ChAd55, ChAd73, ChAd83, ChAd146, ChAd147 y PanAd1, PanAd2 y PanAd3 representan la solución ideal para el problema de la inmunidad Ad antihumana preexistente que limita la administración de vectores virales a base de serotipos Ad humanos comunes tales como Ad5.
Ejemplo 5: Eficacia de inmunización de vectores PanAd1 y 3 en comparación con vectores Ad5
La eficacia de los vectores PanAd1 y PanAd3 como posibles vacunas recombinantes se evaluó en ratones BALB/c con vectores que expresan el antígeno del virus del herpes simple (VHS) y con vectores que expresan un antígeno cancerígeno. La potencia del vector que expresa Ag de VHS que expresa PanAd1 y 3 y Ag cancerígeno se comparó con los vectores correspondientes basados en Ad5 humano.
Para evaluar la potencia antiviral, 9 grupos de ratones BALB/c fueron inyectados en el cuádriceps con dosis crecientes de los vectores comenzando desde 107 vp/ratón hasta 109 vp/ratón en paralelo con VHS PanAd1, VHS PanAd3 y VHS Ad5 (véase la Fig. 7A). La respuesta inmunitaria provocada contra el antígeno de VHS se midió mediante el ensayo Elispot de interferón-Y en esplenocitos de ratón incubados con un conjunto de péptidos que cubre la secuencia de aminoácidos completa del antígeno. Los resultados de los experimentos de inmunización con PanAd1, PanAd2 y PanAd3 en comparación con el vector Ad5 humano notificado en la Figura 7 demostraron que los nuevos adenovirus son más eficaces para provocar una respuesta inmunitaria específica que el adenovirus Ad5 recombinante de la técnica anterior en cada concentración ensayada. Esto se demuestra claramente por la mayor frecuencia de células T específicas de antígeno observadas en ratones inmunizados con vectores PanAd1 y PanAd3.
La eficacia para provocar la respuesta de células T antitumorales mediante vectores PanAd se evaluó inmunizando grupos de ratones BALB/c inyectando en los cuádriceps dosis crecientes de los vectores comenzando desde 107 vp/ratón hasta 109 vp/ratón. Dos grupos de ratones BALB/C fueron inyectados con el vector Ad5 que expresa el antígeno tumoral a 107 vp/ratón y 109 vp/ratón. En paralelo, se inmunizaron 3 grupos de ratones BALB/c con 107, 108, 109 vp de vectores PanAd1 o PanAd3 que portaban el mismo antígeno tumoral. La respuesta de las células T se midió mediante el ensayo Elispot de interferón-Y en esplenocitos utilizando un único péptido que representa un epítopo CD8 mapeado. Los resultados mostrados en la Figura 7B demostraron una mayor frecuencia de animales que respondieron a la dosis más baja de la vacuna, así como una mayor frecuencia de células T específicas de antígeno en los grupos de animales inmunizados con los vectores PanAd en comparación con aquellos inmunizados con vector Ad5.
Ejemplo 6: Inmunización de Macaca fascicularis con vectores PanAd
Se inmunizaron dos grupos de 3 macacos mediante inyección intramuscular de PanAd1 y PanAd3 purificados con CsCl en un régimen de cebado/refuerzo heterólogo. Cada animal en el grupo 1 recibió una dosis de 108 vp mientras que los animales en el grupo 2 recibieron una dosis de 1010 vp del vector que expresa gag de PanAd3 en el músculo deltoide en la semana 0. Todos los animales en ambos grupos se reforzaron con una dosis única de gag de PanAd1 de 1010 vp en la semana 13.
La CMI se midió en diferentes puntos temporales mediante el ensayo ELISPOT de IFN-y. Este ensayo mide las respuestas de los linfocitos T CD8+ y CD4+ específicos del antígeno del VIH. Los péptidos basados en la secuencia de aminoácidos de la proteína gag del VIH se prepararon para su uso en estos ensayos para medir respuestas inmunitarias en monos vacunados con vector de adenovirus. Los péptidos individuales se superponen a 20 mers, compensados por 10 aminoácidos.
El ensayo de ELISPOT de IFNy proporciona una determinación cuantitativa de respuestas de linfocitos T específicas de antígeno. Los LSP se diluyen en serie y se colocan en pocillos de microplaca recubiertos con anticuerpo IFN-y anti-rhesus (MD-1 U-Cytech). Se cultivan con un conjunto de péptidos de gag de VIH durante 20 horas, lo que da como resultado la reestimulación de las células precursoras y la secreción de IFN-y. Las células se eliminan por lavado, dejando el IFN secretado unido a los pocillos recubiertos de anticuerpo en áreas concentradas en donde estaban las células. El IFN capturado se detecta con anticuerpo IFN anti-rhesus biotinilado (detector Ab U-Cytech) seguido de estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina (Pharmingen 13043E). La adición de sustrato de fosfatasa alcalina insoluble da como resultado manchas oscuras en los pocillos en los sitios en donde se ubicaron las células, dejando una mancha para cada célula T que secreta IFN-y.
El número de manchas por pocillo está directamente relacionado con la frecuencia del precursor de células T específicas de antígeno. El interferón gamma se seleccionó como la citoquina visualizada en este ensayo (utilizando anticuerpos monoclonales anti-interferón gamma específicos) ya que es la citoquina más común y una de las más abundantes sintetizadas y secretadas por los linfocitos T activados. Para este ensayo, se determina el número de células formadoras de mancha (CFM) por millón de LSP para muestras en presencia y ausencia (control de medios) de antígenos peptídicos. Los datos de los macacos en LSP obtenidos en diferentes puntos temporales después de

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un polinucleótido que comprende:
(i) un polinucleótido que codifica una proteína hexón adenoviral que tiene la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 22;
(ii) un polinucleótido que codifica una proteína de fibra adenoviral que tiene la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:16; y
(iii) un polinucleótido que codifica una proteína pentón adenoviral que tiene la secuencia de aminoácidos según la SEQ ID NO:28.
2. El polinucleótido según la reivindicación 1, en donde el polinucleótido comprende además al menos uno de los siguientes polinucleótidos adenovirales adicionales:
(a) un extremo 5' adenoviral, preferiblemente una repetición terminal invertida en 5' adenoviral;
(b) una región E1a adenoviral, o un fragmento de la misma seleccionada de entre las regiones 13S, 12S y 9S; (c) una región E1b adenoviral, o un fragmento de la misma seleccionada de entre el grupo que consiste en las regiones pequeñas T, grandes T y IX;
(d) una región E2b adenoviral; o un fragmento de la misma seleccionada de entre el grupo que consiste en las pequeñas regiones pTP, polimerasa y IVa2;
(e) una región L1 adenoviral, o un fragmento de la misma, dicho fragmento codifica una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en la proteína de 28,1 kD, polimerasa, agnoproteína, proteína de 52/55 kDa y proteína Illa;
(f) una región L2 adenoviral, o un fragmento de la misma, dicho fragmento codifica una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en proteína VII, V y Mu;
(g) una región L3 adenoviral, o un fragmento de la misma, dicho fragmento codifica una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en la proteína VI y endoproteasa;
(h) una región E2a adenoviral:
(i) una región L4 adenoviral, o un fragmento de la misma, dicho fragmento codifica una proteína adenoviral seleccionada del grupo que consiste en la proteína de 100 kD, el homólogo de 33 kD y la proteína VIII;
(j) una región E3 adenoviral, o un fragmento de la misma seleccionado del grupo que consiste en ORF1 de E3, ORF2 de E3, ORF3 de E3, ORF4 de E3, ORF5 de E3, ORF6 de E3, ORF7 de E3, ORF8 de E3 y ORF9 de E3; (k) una región E4 adenoviral, o un fragmento de la misma seleccionada del grupo que consiste en ORF7 de E4, ORF6 de E4, ORF5 de E4, ORF4 de E4, ORF3 de E4, ORF2 de E4 y ORF1 de E4; y/o
(l) un extremo 3' adenoviral, preferentemente una repetición terminal invertida en 3' adenoviral.
3. El polinucleótido según la reivindicación 1, en donde el polinucleótido consiste en o comprende un polinucleótido que es al menos 90 % idéntico en toda su longitud a una secuencia que consiste esencialmente en SEQ ID NO: 65 o a una secuencia que consiste en SEQ ID NO: 65 pero carece de las regiones genómicas E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y/o E4 de SEQ ID NO: 65.
4. Un vector que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5. El vector según la reivindicación 4, en donde el vector no comprende un gen en una región genómica seleccionada del grupo de regiones genómicas que consiste en E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4, y/o comprende al menos un gen de una región genómica seleccionada del grupo de E1A, E1B, E2A, E2B, E3 y E4, en donde dicho al menos un gen comprende una deleción y/o mutación que hace que el al menos un gen no sea funcional.
6. Un adenovirus recombinante, preferiblemente un adenovirus incompetente para la replicación, que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y/o un polipéptido de la cápside adenoviral codificado por el polinucleótido de la reivindicación 1.
7. El adenovirus recombinante de la reivindicación 6, en el que el adenovirus recombinante comprende una molécula para el suministro a una célula diana.
8. El adenovirus recombinante de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, en el que el adenovirus tiene una seroprevalencia de menos del 5% en sujetos humanos y preferiblemente ninguna seroprevalencia en sujetos humanos.
9. El adenovirus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 6-8, en el que el adenovirus es capaz de infectar una célula de mamífero.
10. El adenovirus recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en el que la molécula para el suministro a una célula diana es un polinucleótido que codifica una proteína antigénica o un fragmento de la misma.
11. El adenovirus recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 6-10, en el que el adenovirus es un adenovirus que se ha depositado en la Colección Europea de Cultivo Celular (ECACC) con el número de depósito 08110601 (ChAd83).
12. Una composición que comprende un adyuvante y al menos uno de los siguientes (i) a (iv):
(i) el polipéptido de la cápside adenoviral codificado por el polinucleótido según la reivindicación 1;
(ii) el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3;
(iii) el vector según cualquiera de la reivindicación 4 o 5;
(iv) el adenovirus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11;
y, opcionalmente, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
13. Una célula que comprende al menos uno de los siguientes:
(i) el polipéptido de la cápside adenoviral codificado por el polinucleótido según la reivindicación 1;
(ii) el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3;
(iii) el vector según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5;
(iii) el adenovirus recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11; y
opcionalmente al menos un gen adenoviral seleccionado del grupo que consiste en E1a, E1b, E2a, E2b, E4, L1, L2, L3, L4 y L5.
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