KR20180026734A

KR20180026734A - 안정화된 가용성 융합-전 rsv f 폴리펩티드

Info

Publication number: KR20180026734A
Application number: KR1020187002769A
Authority: KR
Inventors: 요하네스 랑게디크; 폴리나 푸르만노바 홀렌스테인
Original assignee: 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이.
Priority date: 2015-07-07
Filing date: 2016-07-07
Publication date: 2018-03-13
Also published as: US20210284698A1; WO2017005848A1; AU2016289496A1; JP7238000B2; AU2016289496B2; JP2021074020A; HK1250938A1; US20200095287A1; EA035909B1; IL256567B; IL256567A; BR112017028449A2; ZA201800094B; EP3319634A1; US10457708B2; CN107847581A; JP6840718B2; JP2018527897A; CN107847581B; US20180194808A1

Abstract

본 발명은 안정한 융합-전 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncitial virus, RSV) F 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 포함하는 면역원성 조성물 및 RSV 감염의 예방 및/또는 치료를 위한 이의 용도를 제공한다.

Description

안정화된 가용성 융합-전 RSV F 폴리펩티드

본 발명은 의학 분야에 관한 것이다. 본 발명은 특히 재조합 융합-전 RSV F 폴리펩티드 및, 예를 들어 면역원성 조성물에서의 이의 용도에 관한 것이다.

1950년대에 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 발견 이후, 이 바이러스는 곧 인간에서 하부 및 상부 호흡기도 감염과 연관된 병원균으로 인식되었다. 전 세계적으로, 매년 6,400만 건의 RSV 감염이 발생하고 있으며, 160,000명이 사망하는 것으로 추정된다(2009년 9월 WHO 급성 호흡기 감염 최신정보). 가장 중증의 질환은 특히 미숙아, 노인 및 면역손상된 개체에서 일어난다. 2세 미만의 아동에서, RSV는 가장 흔한 호흡기 병원균으로서, 호흡기 감염으로 인한 입원의 대략 50%를 차지하며, 2 내지 4개월령에서 입원이 정점에 이른다. 거의 모든 아동이 2세까지 RSV에 감염된 적이 있는 것으로 보고된 바 있다. 일생 동안 반복 감염은 비효과적인 자연 면역에 기인한다. 노인에서, RSV 질환 부담은 비-유행성 인플루엔자 A 감염에 의해 야기되는 것과 유사하다.

RSV는 폐렴바이러스과(pneumoviridae)의 아과(subfamily)에 속하는 파라믹소바이러스이다. 이의 게놈은 중화 항체에 대한 주요 항원 표적인 RSV 당단백질(G) 및 RSV 융합(F) 단백질로 알려진 멤브레인 단백질을 포함하는 다양한 단백질을 암호화한다. F1 단백질의 융합-매개 부분에 대한 항체는 세포에서 바이러스 섭취를 방해하여 중화 효과를 가질 수 있다.

RSV 감염에 대한 백신은 현재 이용 가능하지 않지만 높은 질환 부담으로 인해 요망된다. RSV 융합 당단백질(RSV F)은 매력적인 백신 항원인데, 위에 명시된 바와 같이 인간 혈청에서 중화 항체의 주요 표적이기 때문이다. 사실, RSV F에 대한 중화 단클론 항체(팔리비주맙)은 중증 질환을 예방할 수 있고 유아에서 예방 목적으로 승인되었다.

RSV F는 불안정한 융합-전 형태로부터 안정한 융합-후 형태로 비가역적 단백질 재접힘에 의해 바이러스와 숙주-세포 멤브레인을 융합한다. 두 형태의 구조 모두가 RSV F(McLellan JS, et al. Science 342, 592-598 (2013); McLellan JS, et al. Nat Struct Mol Biol 17, 248-250 (2010); McLellan JS, et al. Science 340, 1113-1117 (2013); Swanson KA, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108, 9619-9624 (2011)) 뿐만 아니라, 관련된 파라믹소바이러스로부터의 융합 단백질에서도 결정되어, 이 복잡한 융합 기구의 기전에 대한 이해를 제공한다. 다른 유형 I 융합 단백질과 마찬가지로, 비활성 전구체 RSV F₀는 세포내 성숙 중에 퓨린(furin)-유사 프로테아제에 의한 절단을 필요로 한다. RSV F는 두 개의 퓨린 부위를 포함하여, 이는 3개의 폴리펩티드: F2, p27 및 F1을 유도하는데, 후자는 N-말단에 소수성 융합 펩티드(FP)를 포함한다. 융합-전 형태로부터 융합-후 형태로 재접힘을 위해서는, FP 및 7가 반복 A(heptad repeat A, HRA)를 포함하는 잔기 137 내지 216 사이의 재접힘 영역 1(RR1)이 나선, 루프 및 가닥의 조립체로부터 긴 연속적 나선으로 변환되어야 한다. RR1의 N-말단 분절에 위치한 FP가 다음에 바이러스 멤브레인으로부터 연장되고 표적 세포의 근위 멤브레인으로 삽입될 수 있다. 다음에, 융합-전 F 스파이크에서 C-말단 줄기를 형성하고 7가 반복 B(HRB)를 포함하는 재접힘 영역 2(RR2)는 RSV F 헤드의 다른 쪽으로 이동하고 HRA 이중 코일(coiled-coil) 삼합체를 HRB 도메인에 결합시켜 6-나선 다발을 형성한다. 6-나선 다발을 완성하기 위한 RR1 이중 코일의 형성 및 RR2의 이동은 재접힘 과정 중에 일어나는 가장 극적인 구조적 변화이다.

인간 혈청에서 대부분의 중화 항체는 융합-전 형태에 대하여 지시되지만, 그 불안정성으로 인해 융합-전 형태는 용액 및 비리온의 표면 둘 다에서 융합-후 형태로 일찍 재접힘되는 경향을 갖는다. 둘 다 높은 발현 수준을 갖고 안정한 융합-전 형태를 유지하는 RSV F 단백질은 RSV에 대한 서브유닛 또는 벡터-기반 백신에서의 사용을 위한 유망한 후보가 될 것이다.

본 발명은 안정한 재조합 융합-전 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 융합(F) 폴리펩티드, 즉 융합-전 형태에서 안정화된 재조합 RSV F 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명의 RSV F 폴리펩티드는 융합-전 형태 F 단백질에 특이적인 적어도 하나의 에피토프를 포함한다. 특정 구현예에서, 융합-전 RSV F 폴리펩티드는 가용성 폴리펩티드이다. 본 발명은 또한, 본 발명에 따른 융합-전 RSV F 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한 RSV F 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 조성물, 바람직하게는 면역원성 조성물, 그리고 RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 있어서의 이의 용도, 특히 백신으로서의 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 유효량의 융합-전 RSV F 폴리펩티드, 상기 RSV F 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 및/또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 대상에 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 항-호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 면역 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 유도된 면역 반응은 RSV에 대한 중화 항체 및/또는 RSV에 대한 보호적 면역을 특징으로 한다. 특정 양태에서 본 발명은, 융합-전 RSV F 폴리펩티드, 상기 RSV F 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 및/또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 면역원성 조성물의 유효량을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 항-호흡기 세포융합 바이러스(RSV) F 단백질 중화 항체를 유도하는 방법에 관한 것이다.

도 1. 단백질 F(A2) KN66EI I76V L203I S215P의 정제. a) 양이온-교환 컬럼으로부터의 용출의 크로마토그램. 청색 자취는 280 nm에서의 흡광도이고, 갈색 자취는 전도도이다. 화살표는 15% 용출 단계에서 용출된 수집된 피크를 나타낸다. b) 이온-교환 컬럼으로부터의 용출액의 Superdex200 겔 여과 크로마토그램. 청색 자취는 280 nm에서의 흡광도이고, 갈색 자취는 전도도이다. 화살표는 수집된 피크를 나타낸다.
도 2. a) 환원 및 비-환원 조건 하에서 SEC 크로마토그램으로부터의 피크를 포함하는 F(A2) KN66EI I76V L203I S215P(a) 및 F(A2) K66E I76V L203I S215P(b) 단백질 샘플의 SDS-PAGE 분석. 환원 샘플에서 F1, F2 단편 및 비-환원 샘플에서 F1+F2가 표시된다. c) L203I 존재 및 비존재시 F(A2) KN66EI I76V S215P 및 F(A2) K66E I76V L203I S215P의 네이티브PAGE(NativePAGE). 네이티브 표지는 단백질의 상대적 전기영동 이동성을 나타내지만 단백질 분자량의 결정을 위해 사용될 수 없다. 242와 480 kDa 사이의 밴드 위치는 삼합체 RSV F 단백질의 위치에 상응한다(화살표로 표시). 겔은 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색된다.
도 3. Leu 203의 Ile으로의 추가 치환은 S215P 치환이 있는 준안정 융합-전 F 단백질에서 융합-전 F 안정성을 증가시킨다. 세포 배양 상등액에서 융합-전 RSV F 농도를 수확일(형질감염 72시간 후 = 제1일) 및 4℃에서 5 및 15일 저장 후 시험하였다.
도 4. L203I가 있는 단백질의 온도 안정성. 녹는 온도(Tm)는 정제된 단백질 샘플에서 DSF에 의해 결정되었다.
도 5: 환원(R) 및 비-환원(NR) 조건 하에서 L203I 돌연변이를 포함하는 정제된 F 단백질의 SDS-PAGE 분석. 환원 샘플에서 F1, F2 단편 및 비-환원 샘플에서 F1+F2가 표시된다. 겔은 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie Brilliant Blue)로 염색되었다.
도 6: L203I 돌연변이를 포함하는 정제된 F 단백질의 SEC-MALS 분석: A: F(A2)-KN66EI-I76V-I203L-S215P-D486N; B: F(A2)-K66E-I76V-I203L-S215P-D486N.

호흡기 세포융합 바이러스(RSV)의 융합 단백질(F)은, 바이러스 감염에 요구되는 숙주 세포 멤브레인과 바이러스 멤브레인의 융합에 연루된다. RSV F mRNA는 F0로 지정된 574 아미노산 전구체 단백질로 번역되고, 이는 소포체에서 신호 펩티드 분해효소에 의해 제거되는 N-말단에서의 신호 펩티드 서열(예를 들어, 서열번호: 13의 아미노산 잔기 1 내지 26)을 포함한다. F0은 세포 프로테아제(특히 퓨린, 또는 퓨린-유사)에 의해 2 부위(아미노산 잔기 109/110과 136/137 사이)에서 절단되어, (p27 영역으로도 불리는, 아미노산 잔기 110 내지 136을 포함하는, 짧은 글리코실화된 개재 서열을 제거하고, F1 및 F2로 지정된 2 도메인 또는 서브유닛을 생성한다. F1 도메인(아미노산 잔기 137 내지 574)은 이의 N-말단에 소수성 융합 펩티드를 포함하고 C-말단은 막관통(TM)(아미노산 잔기 530 내지 550) 및 세포질 영역(아미노산 잔기 551 내지 574)을 포함한다. F2 도메인(아미노산 잔기 27 내지 109)은 두 개의 이황화 가교에 의해 F1에 공유적으로 연결된다. F1-F2 헤테로이합체는 비리온에서 호모삼합체로서 조립된다.

RSV 감염에 대한 백신은 현재 이용할 수 없지만 요망된다. 백신을 생산하기 위한 하나의 가능한 접근법은 정제된 RSV F 단백질을 기반으로 하는 서브유닛 백신이다. 그러나, 이 접근법에서는 정제된 RSV F 단백질이 RSV F 단백질의 융합-전 상태의 형태와 유사한 형태이고, 시간 경과에 따라 안정적이고, 충분한 양으로 생산될 수 있는 것이 바람직하다. 또한, 가용성 서브유닛-기반 백신의 경우, RSV F 단백질은 가용성의 분비된 F 단백질(sF)을 생성하도록 막관통(TM) 및 세포질 영역의 결실에 의해 절단될 필요가 있다. TM 영역은 멤브레인 고정 및 삼합체화를 담당하기 때문에, 비고정된 가용성 F 단백질은 전체-길이 단백질보다 상당히 더 불안정하고 융합-후 최종-상태로 용이하게 재접힘될 것이다. 높은 발현 수준 및 높은 안정성을 보이는 안정한 융합-전 형태의 가용성 F 단백질을 얻기 위해서는, 융합-전 형태가 이에 따라 안정화될 필요가 있다. 또한, 전체 길이(멤브레인-결합된) RSV F 단백질은 준안정성이므로, 융합-전 형태의 안정화가 임의의 생 약독화 또는 벡터 기반의 백신 접근법에서 또한 요망된다.

F1 및 F2 서브유닛으로 절단되는 가용성 RSV F의 융합-전 형태에서의 안정화를 위해, 피브리틴-기반의 삼합체화 도메인이 가용성 RSV-F C-말단 단부의 C-말단에 융합되었다(McLellan et al., Nature Struct. Biol.17: 2-248-250 (2010); McLellan et al., Science 340(6136):1113-7 (2013)). 이 피브리틴 도메인 또는 '폴드온(Foldon)'은 T4 피브리틴으로부터 유래되고 인공적인 천연 삼합체화 도메인으로서 앞서 기술되었다(Letarov et al., Biochemistry Moscow 64: 817-823 (1993); S-Guthe et al., J. Mol. Biol. 337: 905-915. (2004)). 그러나, 삼합체화 도메인은 안정한 융합-전 RSV-F 단백질을 초래하지 않는다. 더욱이, 이들 노력은 아직 인간에서의 시험에 적절한 후보를 야기하지 못하였다.

최근, 본 발명자들은 RSV 융합-전 F 형태를 안정화시킬 수 있는 몇 가지 돌연변이의 조합을 기술하였다(WO2014/174018 및 WO2014/202570). 이에 따라, 안정한 융합-전 RSVF 폴리펩티드는 위치 67에서의 아미노산 잔기의 돌연변이 및/또는 위치 215에서의 아미노산 잔기의 돌연변이, 바람직하게는 위치 67에서의 아미노산 잔기 N/T의 I로의 돌연변이, 및/또는 위치 215에서의 아미노산 잔기 S의 P로의 돌연변이를 포함하는 것으로 기술되었다. 또한, 가용성 융합-전 RSV F 폴리펩티드는, 야생형 RSV F 단백질에서의 RSV F1 및/또는 F2 도메인과 비교하여, F1 및/또는 F2 도메인에서의 적어도 하나의 안정화 돌연변이, 그리고 절단된 F1 도메인을 포함하는 것으로 기술되었는데, 여기에서 폴리펩티드는 상기 절단된 F1 도메인에 연결된 이종 삼합체화 도메인을 포함한다. 또한, 추가의 융합-전 RSV F 폴리펩티드가 기술되었는데, 여기에서 폴리펩티드는 적어도 하나의 추가 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다:

(a) 위치 46에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(b) 위치 77에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(c) 위치 80에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(d) 위치 92에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(e) 위치 175에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(f) 위치 184에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(g) 위치 185에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(h) 위치 201에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(i) 위치 209에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(j) 위치 421에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(k) 위치 426에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(l) 위치 465에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(m) 위치 486에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(n) 위치 487에서의 아미노산 잔기의 돌연변이; 및

(o) 위치 508에서의 아미노산 잔기의 돌연변이.

바람직하게는, 적어도 하나의 추가 돌연변이는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다:

(a) 위치 46에서의 아미노산 잔기 S의 G로의 돌연변이;

(b) 위치 77에서의 아미노산 잔기 K의 E로의 돌연변이;

(c) 위치 80에서의 아미노산 잔기 K의 E로의 돌연변이;

(d) 위치 92에서의 아미노산 잔기 E의 D로의 돌연변이;

(e) 위치 175에서의 아미노산 잔기 N의 P로의 돌연변이;

(f) 위치 184에서의 아미노산 잔기 G의 N으로의 돌연변이;

(g) 위치 185에서의 아미노산 잔기 V의 N으로의 돌연변이;

(h) 위치 201에서의 아미노산 잔기 K의 Q로의 돌연변이;

(i) 위치 209에서의 아미노산 잔기 K의 Q로의 돌연변이;

(j) 위치 421에서의 아미노산 잔기 K의 N으로의 돌연변이;

(k) 위치 426에서의 아미노산 잔기 N의 S로의 돌연변이;

(l) 위치 465에서의 아미노산 잔기 K의 E 또는 Q로의 돌연변이;

(m) 위치 486에서의 아미노산 잔기 D의 N으로의 돌연변이;

(n) 위치 487에서의 아미노산 잔기 E의 Q, N 또는 I로의 돌연변이; 및

(o) 위치 508에서의 아미노산 잔기 K의 E로의 돌연변이.

이들 돌연변이 중 단 하나만이 적용되는 경우(특히 돌연변이 S215P), 대안적인 치환의 안정화 효과의 평가를 위해 사용될 수 있는 준안정성 단백질이 얻어졌다.

본 발명에 따라 위치 203에서의 아미노산 잔기 L의 I로의 돌연변이가 융합-전 형태에서의 단백질을 추가로 안정화시키는 것이 발견되었다.

이에 따라, 본 발명은 위치 203에서의 아미노산 잔기 L의 I로의 돌연변이를 포함하는 재조합 융합-전 F 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 특히 재조합 융합-전 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 융합(F) 폴리펩티드를 제공하는데, 여기에서 폴리펩티드는 야생형 RSV F 단백질에서의 RSV F1 및/또는 F2 도메인과 비교하여, F1 및/또는 F2 도메인에서 적어도 하나의, 바람직하게는 적어도 두 개의 안정화 돌연변이를 포함하고, 여기에서 적어도 하나의 안정화 돌연변이는 위치 203에서의 아미노산 잔기 L의 I로의 돌연변이이다.

본 발명은 추가로, 위치 215에서의 아미노산 S의 P로의 돌연변이(S215P) 및 위치 203에서의 아미노산 잔기 L의 I로의 돌연변이를 포함하는 재조합 융합-전 F 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명은 이에 따라 재조합 안정성 융합-전 RSV F 폴리펩티드, 즉 융합-전 형태에서 안정화된 RSV F 폴리펩티드를 제공하기 위한 신규의 안정화 돌연변이를 제공한다. 본 발명의 안정한 융합-전 RSV F 폴리펩티드는 융합-전 형태로, 즉 이들은 융합-전 형태 F 단백질에 특이적인 적어도 하나의 에피토프를 포함한다(나타낸다). 융합-전 형태 F 단백질에 특이적인 에피토프는 융합-후 형태에서는 제시되지 않는 에피토프이다. 임의의 특정 이론에 구애받지 않고, RSV F 단백질의 융합-전 형태는 천연의 RSV 비리온에서 발현되는 RSV F 단백질에서와 동일한 에피토프를 포함할 수 있고, 따라서 보호적 중화 항체를 이끌어내기 위한 이점을 제공할 수 있는 것으로 여겨진다.

특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는, 서열번호: 1의 중쇄 CDR1 영역, 서열번호: 2의 중쇄 CDR2 영역, 서열번호: 3의 중쇄 CDR3 영역 및 서열번호: 4의 경쇄 CDR1 영역, 서열번호: 5의 경쇄 CDR2 영역, 및 서열번호: 6의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 융합-전 특이적 단클론 항체(이하 CR9501로서 언급됨) 및/또는 서열번호: 7의 중쇄 CDR1 영역, 서열번호: 8의 중쇄 CDR2 영역, 서열번호: 9의 중쇄 CDR3 영역 및 서열번호: 10의 경쇄 CDR1 영역, 서열번호: 11의 경쇄 CDR2 영역, 및 서열번호: 12의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 융합-전 특이적 단클론 항체(CR9502로서 언급됨)에 의해 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함한다. CR9501 및 CR9502는 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 따라서 각각 항체 58C5 및 30D8의 결합 특이성을 포함하는데, 이는 앞서 이의 융합-전 형태의 RSV F 단백질에 특이적으로 결합하지만 융합-후 형태에는 그렇지 않은 것을 보여주었다(WO2012/006596 참조).

특정 구현예에서, 재조합 융합-전 RSV F 폴리펩티드는 위에 기술된 바와 같이 적어도 하나의 융합-전 특이적 단클론 항체에 의해 인식되는 적어도 하나의 에피토프를 포함하고 삼합체이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 안정한 융합-전 RSV F 폴리펩티드는 가용성이고 절단된 F1 도메인을 포함한다.

RSV는 두 개의 항원 서브그룹: A 및 B를 갖는 단일 항원형으로서 존재하는 것으로 알려져 있다. 두 그룹의 성숙한 처리된 F 단백질의 아미노산 서열은 약 93% 동일하다. 본 출원 전체에서 사용되는 바와 같이, 아미노산 위치는 A2 균주로부터의 RSV F 단백질의 서열(서열번호: 13)과 관련하여 주어진다. 본 발명에서 사용되는 표현 "RSV F 단백질의 위치 "x"에서의 아미노산"은 이에 따라 서열번호: 13의 RSV A2 균주의 RSV F 단백질에서 위치 "x"에서의 아미노산에 상응하는 아미노산을 의미한다. 본 출원 전체에서 사용되는 넘버링 시스템에서 1은 미성숙 F0 단백질(서열번호: 13)의 N-말단 아미노산을 의미하는 것임이 주목된다. A2 균주 이외의 RSV 균주가 사용될 때, F 단백질의 아미노산 위치는, 필요시 갭이 삽입된 서열번호: 13의 F 단백질에 다른 RSV 균주의 서열을 정렬하는 것에 의해, 서열번호: 1의 A2 균주의 F 단백질의 넘버링을 참고하여 넘버링된다. 서열 정렬은 해당 분야에 잘 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 CLUSTALW, Bioedit 또는 CLC Workbench에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에 따른 아미노산은 천연적으로 존재하는 임의의 20개(또는 '표준' 아미노산) 또는, 예를 들어 D-아미노산(키랄 중심을 갖는 아미노산의 D-거울상이성질체)과 같은 이의 변이체, 또는, 예를 들어 노르류신과 같은, 단백질에서 천연적으로 발견되지 않는 임의의 변이체일 수 있다. 표준 아미노산은 이들의 특성을 기반으로 몇 개의 군으로 분류될 수 있다. 중요한 인자는 전하, 친수성 또는 소수성, 크기 및 기능기이다. 이들 특성은 단백질 구조 및 단백질-단백질 상호작용에 중요하다. 다른 시스테인 잔기와 공유적 이황화 결합(또는 이황화 가교)를 형성할 수 있는 시스테인, 폴리펩티드 골격의 방향전환을 유도하는 프롤린, 그리고 다른 아미노산보다 더 유연한 글리신과 같이, 일부 아미노산은 특별한 특성을 갖는다. 표 1은 표준 아미노산의 약어 및 특성을 보여준다.

일상적인 분자 생물학 절차에 의해 단백질에 돌연변이가 만들어질 수 있음은 당업자에 의해 인정될 것이다. 본 발명에 따른 돌연변이는 바람직하게는, 이들 돌연변이(들)를 포함하지 않는 RSV F 폴리펩티드와 비교하여, 융합-전 RSV F 폴리펩티드의 발현 수준 증가 및/또는 안정화 증가를 초래한다.

특정 구현예에서, 융합-전 RSV F 폴리펩티드는 가용성이다.

따라서, 특정 구현예에서, 융합-전 RSV F 폴리펩티드는 절단된 F1 도메인을 포함하는데, 여기에서 폴리펩티드는, 야생형 RSV F 단백질에서의 RSV F1 및/또는 F2 도메인과 비교하여 F1 및/또는 F2 도메인에서 적어도 하나의 안정화 돌연변이를 포함한다. 특정 구현예에서, 가용성 융합-전 RSV F 폴리펩티드는 상기 절단된 F1 도메인에 연결되는 이종 삼합체화 도메인을 추가로 포함한다. 본 발명에 따르면, 안정화 돌연변이(들)와 조합하여, 이종 삼합체화 도메인을 절단된 F1 도메인의 C-말단 아미노산 잔기에 연결하는 것에 의해, 높은 발현을 보여주고 융합-전-특이적 항체에 결합하여 폴리펩티드가 융합-전 형태인 것을 나타내는 RSV F 폴리펩티드가 제공된다. 또한, RSV F 폴리펩티드는 융합-전 형태에서 안정화되어, 즉 폴리펩티드의 처리 후에도 이들은 여전히 융합-전 특이적 항체 CR9501 및/또는 CR9502에 결합하여, 융합-전 특이적 에피토프가 유지되는 것을 나타낸다.

특정 구현예에서, 융합-전 RSV F 폴리펩티드는 (야생형 RV F 단백질과 비교하여) 적어도 3개의 돌연변이를 포함한다.

특정 구현예에서, 융합-전 RSV F 폴리펩티드는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 돌연변이를 포함한다:

(a) 위치 46에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(b) 위치 67에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(c) 위치 83에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(d) 위치 92에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(e) 위치 184에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(f) 위치 207에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;

(g) 위치 486에서의 아미노산 잔기의 돌연변이; 및

(h) 위치 487에서의 아미노산 잔기의 돌연변이.

특정 구현예에서, 적어도 하나의 추가 돌연변이는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택된다:

(a) 위치 46에서의 아미노산 잔기 S의 G로의 돌연변이;

(b) 위치 67에서의 아미노산 잔기 N/T의 I로의 돌연변이;

(c) 위치 83에서의 아미노산 잔기 L의 M으로의 돌연변이;

(d) 위치 92에서의 아미노산 잔기 E의 D로의 돌연변이;

(e) 위치 184에서의 아미노산 잔기 G의 N으로의 돌연변이;

(f) 위치 207에서의 아미노산 잔기 V의 I로의 돌연변이:

(g) 위치 486에서의 아미노산 잔기 D의 N으로의 돌연변이; 및

(h) 위치 487에서의 아미노산 잔기 E의 Q, N 또는 I로의 돌연변이.

특정 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 2개의 돌연변이를 포함한다.

특정 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 3개의 돌연변이를 포함한다.

특정 구현예에서, 폴리펩티드는 적어도 4, 5 또는 6개의 돌연변이를 포함한다.

특정의 다른 구현예에서, 이종 삼합체화 도메인은 아미노산 서열 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(서열번호: 14)을 포함한다.

위에 기술된 바와 같이, 특정 구현예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 절단된 F1 도메인을 포함한다. 본원에서 사용되는 "절단된" F1 도메인은 전체 길이 F1 도메인이 아닌 F1 도메인을 말하는데, 즉 여기에서는 N-말단 또는 C-말단에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실되었다. 본 발명에 따르면, 적어도 막관통 도메인 및 세포질 꼬리가 결실되어 가용성 엑토도메인으로서의 발현이 허용된다.

특정의 다른 구현예에서, 삼합체화 도메인은 RSV F1 도메인의 아미노산 잔기 513에 연결된다. 특정 구현예에서, 삼합체화 도메인은 서열번호: 14를 포함하고 RSV F1 도메인의 아미노산 잔기 513에 연결된다.

특정 구현예에서, F1 도메인 및/또는 F 도메인은 RSV A 균주로부터 유래된다. 특정의 다른 구현예에서 F1 및/또는 F2 도메인은 서열번호: 13의 RSV A2 균주로부터 유래된다.

특정 구현예에서, F1 도메인 및/또는 F 도메인은 RSV B 균주로부터 유래된다. 특정 구현예에서 F1 및/또는 F2 도메인은 서열번호: 15의 RSV B 균주로부터 유래된다.

특정 구현예에서, F1 도메인 및/또는 F 도메인은 RSV CL57-v244 균주로부터 유래된다. 특정 구현예에서 F1 및/또는 F2 도메인은 서열번호: 22의 RSV CL57-v244 균주로부터 유래된다.

특정 구현예에서, F1 및 F2 도메인은 동일한 RSV 균주로부터 유래된다. 특정 구현예에서, 융합-전 RSV F 폴리펩티드는 키메라 폴리펩티드, 즉 상이한 RSV 균주로부터 유래되는 F1 및 F2 도메인을 포함하는 것이다.

특정 구현예에서, 융합-전 RSV F 폴리펩티드는 서열번호: 20, 서열번호: 21, 서열번호: 23 및 서열번호: 24로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다.

특정 구현예에서, 본 발명의 융합-전 RSV F 폴리펩티드의 발현의 수준은 야생형 RSV F 폴리펩티드와 비교하여 증가된다. 특정 구현예에서 발현의 수준은 적어도 5배, 바람직하게는 10배까지 증가된다. 특정 구현예에서, 발현의 수준은 10배보다 많이 증가된다.

본 발명에 따른 융합-전 RSV F 폴리펩티드는 안정적, 즉, 예를 들어 정제, 동결-해동 주기, 및/또는 저장 등과 같은 폴리펩티드의 처리시 융합-후 형태로 쉽게 변하지 않는다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 융합-전 RSV F 폴리펩티드는 돌연변이(들)가 없는 RSV F 폴리펩티드와 비교하여, 4℃에서 저장시 증가된 안정성을 갖는다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 4℃에서 저장시 적어도 30일, 바람직하게는 적어도 60일, 바람직하게는 적어도 6개월, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 1년 동안 안정하다. "저장시 안정한"은, 예를 들어 실시예 7 또는 9에서 기술하는 방법을 사용하여 결정되는 바와 같이, 용액(예를 들어 배양 배지) 중에 4℃에서 적어도 30일 동안 폴리펩티드의 저장시, 폴리펩티드가 융합-전 특이적 항체(예를 들어, CR9501)에 대하여 특이적인 적어도 하나의 에피토프를 여전히 보여주는 것을 의미한다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드는 4℃에서 융합-전 RSV F 폴리펩티드의 저장시 적어도 6개월 동안, 바람직하게는 적어도 1년 동안 적어도 하나의 융합-전 특이적 에피토프를 보여준다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 융합-전 RSV F 폴리펩티드는, 상기 돌연변이(들)가 없는 RSV F 폴리펩티드와 비교하여, 열을 받을 때 증가된 안정성을 갖는다. 특정 구현예에서, 융합-전 REV F 폴리펩티드는 55℃의 온도에서, 바람직하게는 58℃에서, 더욱 바람직하게는 60℃에서 적어도 30분 동안 열 안정성이다. "열 안정성"은, 예를 들어 실시예 6에서 기술하는 방법을 사용하여 결정되는 바와 같이, 폴리펩티드가 적어도 30분 동안 증가된 온도(즉, 55℃ 이상의 온도)로 처리된 후 적어도 하나의 융합-전 특이적 에피토프를 여전히 보여주는 것을 의미한다.

특정 구현예에서, 폴리펩티드는 적절한 제형 완충액에서 1 내지 6 동결-해동 주기로 처리된 후 적어도 하나의 융합-전 특이적 에피토프를 보여준다.

본 출원 전체에서 사용되는 뉴클레오티드 서열은, 해당 분야에서의 관습대로, 5'에서 3' 방향으로, 그리고 아미노산 서열은 N-말단에서 C-말단으로 제공된다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 암호화된 폴리펩티드는 서열번호: 13의 아미노산 1 내지 26에 상응하는, 신호 서열 또는 신호 펩티드로도 불리는 리더 서열을 추가로 포함한다. 이것은 분비 경로를 향하도록 예정된, 대부분의 새로 합성된 단백질의 N-말단에 존재하는 짧은(전형적으로 5 내지 30 아미노산 길이) 펩티드이다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드는 리더 서열을 포함하지 않는다.

특정 구현예에서, 폴리펩티드는 HIS-태그를 포함한다. His-태그 또는 폴리히스티딘-태그는, 일반적으로 정제 목적을 위해 사용되는, 종종 단백질의 N- 또는 C-말단에서의 적어도 5 히스티딘(H) 잔기로 구성되는 단백질에서의 아미노산 모티프이다.

본 발명은 추가로 본 발명에 따른 RSV F 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.

바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자는 포유류 세포, 바람직하게는 인간 세포에서의 발현을 위해 코돈-최적화된다. 코돈-최적화 방법은 알려져 있고 이전에 기술되었다(예를 들어, WO 96/09378). 야생형 서열과 비교하여 적어도 하나의 비-우선적 코돈이 더 우선적인 코돈으로 대체될 경우 서열은 코돈-최적화된 것으로 간주된다. 본원에서, 비-우선적 코돈은 동일한 아미노산을 암호화하는 다른 코돈보다 유기체에서 덜 빈번하게 사용되는 코돈이고, 또한 더 우선적인 코돈은 비-우선적 코돈보다 유기체에서 더 빈번하게 사용되는 코돈이다. 특정 유기체에서 코돈 사용의 빈도는, http://www.kazusa.or.jp/codon에서와 같이, 코돈 빈도 표에서 발견될 수 있다. 바람직하게는 하나보다 많은 비-우선적 코돈, 바람직하게는 대부분의 또는 모든 비-우선적 코돈이 보다 우선적인 코돈으로 대체된다. 바람직하게는 유기체에서 가장 빈번하게 사용되는 코돈이 코돈-최적화된 서열에 사용된다. 우선적 코돈에 의한 교체는 일반적으로 더 높은 발현을 유도한다.

유전자 코드의 축중(degeneracy)의 결과로 많은 상이한 폴리뉴클레오티드 및 핵산 분자가 동일한 폴리펩티드를 암호화할 수 있다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다. 당업자는 일상적인 기법을 사용하여, 폴리펩티드가 발현되는 임의의 특정 숙주 유기체의 코돈 사용을 반영하도록 핵산 분자에 의해 암호화되는 폴리펩티드 서열에 영향을 주지 않는 뉴클레오티드 치환을 만들 수 있다는 것이, 또한 이해될 것이다. 따라서, 달리 명시되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은 상호 축중 형태인, 그리고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. RNA 및 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 인트론을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

핵산 서열은 일상적인 분자 생물학 기법을 사용하여 클로닝되거나, DNA 합성에 의해 새로 생성될 수 있는데, 이는 DNA 합성 및/또는 분자 클로닝 분야의 사업을 하는 용역 회사(예를 들어, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins)에 의해 일상적인 절차를 사용하여 수행될 수 있다.

본 발명은 또한 위에 기술되는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 이에 따라 벡터의 일부이다. 이러한 벡터는 해당 분야의 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 용이하게 조작될 수 있고, 예를 들어 원핵 및/또는 진핵 세포에서 복제될 수 있도록 설계될 수 있다. 또한, 많은 벡터가 진핵 세포의 형질전환을 위해 사용될 수 있고 이러한 세포의 게놈으로 전체 또는 일부가 통합되어, 이의 게놈에 원하는 핵산을 포함하는 안정한 숙주 세포를 야기할 것이다. 사용되는 벡터는 DNA 클로닝에 적절하고 관심 핵산의 전사에 사용될 수 있는 임의의 벡터일 수 있다. 본 발명에 따른 적절한 벡터는, 예를 들어 아데노벡터, 알파바이러스, 파라믹소바이러스, 백시니아 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 벡터 등이다. 해당 분야의 당업자는 적절한 발현 벡터를 선택하고, 기능적 방식으로 본 발명의 핵산 서열을 삽입할 수 있다.

융합-전 RSV F 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 숙주 세포도 본 발명의 일부를 형성한다. 융합-전 RSV F 폴리펩티드는 숙주 세포, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 종양 세포주, BHK 세포, 인간 세포주, 예를 들어 HEK293 세포, PER.C6 세포, 또는 효모, 진균, 곤충 세포 등, 또는 유전자이식 동물 또는 식물에서 분자의 발현을 포함하는 재조합 DNA 기술을 통해 생산될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포는 다세포 기관으로부터 유래되고, 특정 구현예에서 이들은 척추동물 또는 무척추동물 기원이다. 특정 구현예에서, 세포는 포유류 세포이다. 특정 구현예에서, 세포는 인간 세포이다. 일반적으로, 숙주 세포에서 본 발명의 융합-전 RSV F 폴리펩티드와 같은 재조합 단백질의 생산은, 발현 가능한 형태로 폴리펩티드를 암호화하는 이종 핵산 분자를 숙주 세포로 도입하고, 핵산 분자의 발현을 조장하는 조건 하에 세포를 배양하고 상기 세포에서 폴리펩티드가 발현되도록 하는 것을 포함한다. 발현 가능한 형태로 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 발현 카세트의 형태일 수 있고, 보통 인핸서(들), 프로모터, 폴리아데닐화 신호 등과 같은 핵산의 발현을 유발할 수 있는 서열을 필요로 한다. 해당 분야의 당업자는 다양한 프로모터가 숙주 세포에서 유전자의 발현을 얻기 위해 사용될 수 있음을 알고 있다. 프로모터는 구성요소이거나 조절될 수 있고, 바이러스, 원핵 또는 진핵 공급원을 포함하는 다양한 공급원으로부터 얻어지거나 인공적으로 설계될 수 있다.

세포 배양 배지는 다양한 판매자로부터 입수 가능하고, 적절한 배지는 관심 단백질, 여기에서는 융합-전 RSV F 폴리펩티드를 숙주 세포에서 발현시키도록 일상적으로 선택될 수 있다. 적절한 배지는 혈청을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

"이종 핵산 분자"(본원에서 '이식유전자'로도 언급됨)는 숙주 세포에 천연적으로 존재하지 않는 핵산 분자이다. 이것은, 예를 들어 표준 생물학적 기법에 의해 벡터에 도입된다. 이식유전자는 일반적으로 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결된다. 이것은, 예를 들어 이식유전자(들)를 암호화하는 핵산을 프로모터의 조절 하에 위치시킴으로써 수행될 수 있다. 추가의 조절 서열이 부가될 수 있다. 많은 프로모터가 이식유전자(들)의 발현을 위해 사용될 수 있고, 당업자에게 알려져 있으며, 예를 들어 이들은 바이러스, 포유류, 합성 프로모터 등을 포함할 수 있다. 진핵 세포에서 발현을 얻기 위해 적절한 프로모터의 비-제한적 예는 CMV-프로모터(US 5,385,839), 예를 들어 CMV 전초기 유전자 인핸서/프로모터로부터 nt. -735 내지 +95를 포함하는, 예를 들어 CMV 전초기 프로모터이다. 폴리아데닐화 신호, 예를 들어 소 성장 호르몬 폴리A 신호(US 5,122,458)가 이식유전자(들) 뒤에 존재할 수 있다. 대안적으로, 몇 가지 널리 사용되는 발현 벡터가 해당 분야에서, 그리고 상업적 공급원으로부터, 예를 들어 Invitrogen의 pcDNA 및 pEF 벡터 시리즈, BD Sciences로부터의 pMSCV 및 pTK-Hyg, Stratagene으로부터의 pCMV-Script 등이 입수 가능한데, 이들은 관심 단백질을 재조합으로 발현하거나, 적절한 프로모터 및/또는 전사 종결 서열, 폴리A 서열 등을 얻기 위해 사용될 수 있다.

세포 배양은, 부착 세포 배양, 예를 들어 배양 용기의 표면 또는 마이크로캐리어에 부착된 세포뿐 아니라, 현탁 배양을 포함하는 임의 유형의 세포 배양일 수 있다. 대부분의 대-규모 현탁 배양은 배치 또는 유가식(fed-batch) 공정으로 작동되는데, 이들이 작동 및 규모 확대가 가장 간단하기 때문이다. 최근에는, 관류 원리를 기반으로 하는 연속 공정이 더 보편화되고 있고 적절하기도 하다. 적절한 배양 배지는 또한 당업자에게 잘 알려져 있고 일반적으로 상업적 공급원으로부터 대량으로, 또는 표준 프로토콜에 따라 주문-제작으로 얻을 수 있다. 배양은, 예를 들어 접시, 회전 병 또는 생물반응기에서 배치, 유가식, 연속 시스템 등을 사용하여 수행될 수 있다. 세포 배양을 위한 적절한 조건은 알려져 있다(예를 들어, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973), 및 R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9) 참조).

본 발명은 추가로, 위에 기술된 바와 같이, 융합-전 RSV F 폴리펩티드 및/또는 핵산 분자, 및/또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 따라서, 본 발명은 RSV F 단백질의 융합-전 형태에 존재하지만 융합-후 형태에 부재인 에피토프를 보이는 융합-전 RSV F 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한 이러한 융합-전 RSV F 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 추가로, 위에 기술되는 바와 같이, 융합-전 RSV F 폴리펩티드, 및/또는 핵산 분자, 및/또는 벡터를 포함하는 면역원성 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 대상에서 RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하기 위한, 본 발명에 따른 안정화된 융합-전 RSV F 폴리펩티드, 핵산 분자, 및/또는 벡터의 용도를 제공한다. 본 발명에 따른 융합-전 RSV F 폴리펩티드, 및/또는 핵산 분자, 및/또는 벡터를 대상에 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 방법이 추가로 제공된다. 대상에서 RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한, 본 발명에 따른 융합-전 RSV F 폴리펩티드, 핵산 분자, 및/또는 벡터가 또한 제공된다. 대상에서 RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 사용하기 위한 약제의 제조를 위한, 본 발명에 따른 융합-전 RSV F 폴리펩티드, 및/또는 핵산 분자, 및/또는 벡터의 용도가 추가로 제공된다.

본 발명의 융합-전 RSV F 폴리펩티드, 핵산 분자, 또는 벡터는 RSV 감염의 방지(예방) 및/또는 치료를 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 방지 및/또는 치료는 RSV 감염에 취약한 환자군을 표적으로 할 수 있다. 이러한 환자군은, 예를 들어 노인(예를 들어, 50세 이상, 60세 이상, 바람직하게는 65세 이상), 어린이(예를 들어, 5세 이하, 1세 이하), 입원 환자 및 항바이러스 화합물 치료를 받았으나 부적절한 항바이러스 반응을 나타낸 환자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 융합-전 RSV F 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 벡터는, 예를 들어 RSV에 의해 야기되는 질환 또는 병태의 독립 치료 및/또는 예방에, 또는 (기존 또는 향후) 백신, 항바이러스제 및/또는 단클론 항체와 같은 다른 예방적 및/또는 치료적 처치와 조합하여 사용될 수 있다.

본 발명은 추가로, 본 발명에 따른 융합-전 RSV F 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 벡터를 이용하여 대상에서 RSV 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 특정 구현예에서, 대상에서 RSV 감염을 예방 및/또는 치료하는 방법은, 위에 기술되는 바와 같이, 유효량의 융합-전 RSV F 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 벡터를 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함한다. 치료적으로 유효한 양은 RSV에 의한 감염으로부터 야기되는 질환 또는 병태를 예방, 완화 및/또는 치료하는 데 유효한 폴리펩티드, 핵산 분자 또는 벡터의 양을 말한다. 예방은 RSV의 확산을 억제 또는 감소, 또는 RSV에 의한 감염과 관련되는 하나 이상의 증상의 개시, 발생 또는 진행을 억제 또는 감소시키는 것을 포괄한다. 본원에서 사용되는 완화는 인플루엔자 감염의 가시적 또는 인지할 수 있는 질환 증상, 바이러스 혈증, 또는 임의의 다른 측정 가능한 징후의 감소를 의미할 수 있다.

인간과 같은 대상에 투여하기 위해, 본 발명은 본원에 기술되는 것과 같은 융합-전 RSV F 폴리펩티드, 핵산 분자 및/또는 벡터, 그리고 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 이용할 수 있다. 본 맥락에서, 용어 "약제학적으로 허용 가능한"은 담체 또는 부형제가 이용되는 투여량 및 농도에서 이들이 투여되는 대상에 임의의 원치 않거나 유해한 효과를 야기하지 않을 것을 의미한다. 이러한 약제학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제는 해당 분야에 잘 알려져 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000] 참조). RSV F 폴리펩티드, 또는 핵산 분자는, 비록 동결건조 제제를 이용하는 것도 가능할 수 있지만, 바람직하게는 멸균 용액으로 제형화되고 투여된다. 멸균 용액은 멸균 여과에 의하거나 해당 분야에 그 자체로 알려진 다른 방법에 의해 제조된다. 이어서, 용액은 동결건조되거나 약제학적 투약 용기로 충전된다. 용액의 pH는 일반적으로 pH 3.0 내지 9.5, 예를 들어 pH 5.0 내지 7.5의 범위이다. RSV F 폴리펩티드는 전형적으로 약제학적으로 허용 가능한 적절한 완충액을 갖는 용액에 존재하고, 조성물은 또한 염을 포함할 수 있다. 선택적으로, 알부민과 같은 안정화제가 존재할 수 있다. 특정 구현예에서는, 세제가 첨가된다. 특정 구현예에서, RSV F 폴리펩티드는 주사 가능한 제제로 제형화될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 조성물은 하나 이상의 애주번트를 추가로 포함한다. 애주번트는 적용되는 항원 결정기에 대한 면역 반응을 더욱 증가시키는 것으로 해당 분야에 알려져 있다. 용어 "애주번트" 및 "면역 자극제"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 면역계의 자극을 야기하는 하나 이상의 물질로서 정의된다. 이러한 맥락에서, 애주번트는 본 발명의 RSV F 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증진시키기 위해 사용된다. 적절한 애주번트의 예로는 수산화알루미늄 및/또는 인산알루미늄과 같은 알루미늄염; MF59와 같은 스쿠알렌-물 유제를 포함하는 오일-유제 조성물(또는 수중유 조성물)(예를 들어, WO 90/14837 참조); 예를 들어 QS21 및 면역자극 복합체(ISCOMS)와 같은 사포닌 제형(예를 들어, US 5,057,540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620 참조); 박테리아 또는 미생물 유도체, 이의 예로 모노포스포릴 리피드 A(MPL), 3-O-탈아실화 MPL(3dMPL), CpG-모티프 함유 올리고뉴클레오티드, ADP-리보실화 박테리아 독소 또는 이의 돌연변이체, 예를 들어 대장균(E. coli) 열 불안정 장독소 LT, 콜레라 독소 CT 등; 진핵 단백질(예를 들어, 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 항원 자체 또는 CD1a, CD3, CD7, CD80에 대하여 지시되는) 및, 수용체 세포와의 상호작용시 면역 반응을 자극하는 수용체에 대한 리간드(예를 들어, CD40L, GMCSF, GCSF 등)를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 애주번트로서 알루미늄을, 예를 들어 수산화알루미늄, 인산알루미늄, 인산알루미늄칼륨, 또는 이의 조합의 형태로, 용량 당 알루미늄 함량 0.05 내지 5 mg, 예를 들어, 0.075 내지 1.0 mg의 농도로 포함한다.

융합-전 RSV F 폴리펩티드는 또한, 예를 들어 폴리머, 리포솜, 바이로솜, 바이러스-유사 입자와 같은 나노입자와 조합하거나 이에 접합하여 투여될 수 있다. 융합-전 F 폴리펩티드는 애주번트와 함께 또는 애주번트 없이 나노입자와 조합하거나, 이에 캡시드화되거나, 이와 접합될 수 있다. 리포솜 내의 캡슐화는, 예를 들어 US 4,235,877에 기술된다. 거대분자에 대한 접합은, 예를 들어 US 4,372,945 또는 US 4,474,757에 개시된다.

다른 구현예에서, 조성물은 애주번트를 포함하지 않는다.

특정 구현예에서 본 발명은, 본 발명에 따른 조성물을 제공하고 이를 약제학적으로 허용 가능한 조성물로 제형화하는 것을 포함하는, 호흡기 세포융합 바이러스(RSV)에 대한 백신을 제조하는 방법을 제공한다. 용어 "백신"은 특정 병원균 또는 질환에 대하여 대상에서 특정한 정도의 면역성을 유도하는 데 효과적인 활성 성분을 포함하는 물질 또는 조성물을 말하는데, 이는 질환 또는 병원균에 의한 감염과 관련된 증상의 중증도, 지속 기간 또는 다른 징후의 적어도 (완전한 부재까지) 감소를 야기할 것이다. 본 발명에서 백신은, RSV의 F 단백질에 대한 면역 반응을 야기하는, 유효량의 융합-전 RSV F 폴리펩티드 및/또는 융합-전 RSV F 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자, 및/또는 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함한다. 이것은 입원으로 이어지는 중증의 하부 호흡기도 질환을 예방하는 방법 및 대상에서 RSV 감염 및 복제에 기인하는 폐렴 및 세기관지염과 같은 합병증의 빈도에 있어서의 저하를 제공한다. 본 발명에 따른 "백신"이라는 용어는 이것이 약제학적 조성물이고, 따라서 전형적으로 약제학적으로 허용 가능한 희석제, 담체 또는 부형제를 포함함을 내포한다. 백신은 추가의 활성 성분을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 특정 구현예에서 백신은, 예를 들어 RSV의 다른 단백질 및/또는 다른 감염성 물질에 대한 면역 반응을 유도하는 다른 성분을 추가로 포함하는 조합 백신일 수 있다. 추가의 활성 성분의 투여는, 예를 들어 개별 투여에 의해 또는 본 발명의 백신과 추가의 활성 성분의 조합 제품을 투여하는 것에 의해 행하여질 수 있다.

조성물은 대상, 예를 들어 인간 대상에 투여될 수 있다. 단일 투여를 위한 조성물에서 RSV F 폴리펩티드의 총 용량은, 예를 들어 약 0.01 ㎍ 내지 약 10 mg, 예를 들어 1 ㎍ 내지 1 mg, 예를 들어 10 ㎍ 내지 100 ㎍일 수 있다. 권고 용량의 결정은 실험에 의해 수행될 것이며 해당 분야의 당업자에게 일상적인 것이다.

본 발명에 따른 조성물의 투여는 표준 투여 경로를 사용하여 수행될 수 있다. 비-제한적 구현예는 비경구 투여, 예를 들어 피부내, 근육내, 피하, 경피, 또는 점막 투여, 예를 들어 비강내, 경구 투여 등을 포함한다. 일 구현예에서 조성물은 근육내 주사에 의해 투여된다. 당업자는 백신에서 항원(들)에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 조성물, 예를 들어 백신을 투여하기 위한 다양한 가능성을 알고 있다.

본원에서 사용되는 대상은 바람직하게는 포유류, 예를 들어 설치류, 예를 들어 마우스, 코튼 랫 또는 비-인간-영장류, 또는 인간이다. 바람직하게는, 대상은 인간 대상이다.

폴리펩티드, 핵산 분자, 벡터, 및/또는 조성물은 또한 동종 또는 이종 프라임-부스트 요법에서 프라임으로서, 또는 부스트로서 투여될 수 있다. 부스팅 백신접종이 수행될 경우, 전형적으로, 이러한 부스팅 백신접종은 조성물을 대상에 최초로 투여한 후(이러한 경우 '프라이밍 백신접종'으로서 언급됨) 1주 내지 1년 사이, 바람직하게는 2주 내지 4개월 사이의 시간에 동일한 대상에 투여될 것이다. 특정 구현예에서, 투여는 프라임 및 적어도 1회의 부스터 투여를 포함한다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드는, 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체가 개체의 혈청에 존재하는지 여부를 설정하는 것에 의해, 이러한 개체의 면역 상태를 시험하기 위한 진단 기구로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한, 환자에서 RSV 감염의 존재를 검출하기 위한 시험관내 진단 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 a) 상기 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 폴리펩티드와 접촉시키고; 그리고 b) 항체-폴리펩티드 복합체의 존재를 검출하는 단계를 포함한다.

본 발명은 추가로, 야생형 RSV F1 및/또는 F2 도메인과 비교하여, RSV F1 및/또는 F2 도메인에서 적어도 하나의 돌연변이를 도입하는 것을 포함하는, RSV F 폴리펩티드의 융합-전 형태를 안정화시키기 위한 방법을 제공하는데, 여기에서 적어도 하나의 돌연변이는 RSV 정단(apex)에서 3중 나선(알파 나선 1, 4 및 5)에서의 돌연변이에 의해 알파 나선 4를 회전(hinging) 또는 이동으로부터 고정시킨다. 특정 구현예에서, 알파 4에서의 적어도 하나의 돌연변이는 위치 203에서 아미노산 잔기 Leu의 Ile로의 돌연변이이다.

이러한 방법에 의해 얻을 수 있고/있거나 얻어지는 안정화된 융합-전 RSV F 폴리펩티드뿐만 아니라, 위에 기술된 이의 용도 또한 본 발명의 일부를 형성한다.

실시예

실시예 1

RSV F의 융합-전 형태의 불안정한 정단(apex)을 안정화시키기 위해, 알파4에서 Leu203Ile 치환이 안정화 S215P 돌연변이 및 C-말단 피브리틴 모티프를 갖는 준안정성 RSV F 변이체에 도입되었다.

RSV F 단백질의 발현 및 정제.

재조합 단백질을 293 자유형(Freestyle) 세포(Life Technologies)에서 발현시켰다. 세포를 제조자의 지침에 따라 일시적으로 293Fectin(Life Technologies)을 사용하여 형질감염시키고 진탕 인큐베이터 중 37℃ 및 10% CO₂에서 배양하였다. F 단백질을 함유하는 배양 상등액을 형질감염 후 제5일에 수확하였다. 멸균-여과한 상등액을 사용시까지 4℃에 저장하였다. 재조합 폴리펩티드를 양-이온 크로마토그래피에 이어서 크기-배제 크로마토그래피를 적용한 2-단계 프로토콜에 의해 정제하였다(도 1). 이온-교환 단계를 위해 배양 상등액을 2 용적의 50 mM NaOAc pH 5.0으로 희석하고 5 mL HiTrap Capto S(GE Healthcare) 컬럼에 분당 5 mL로 통과시켰다. 이어서 컬럼을 10 컬럼 용적(CV)의 20 mM NaOAc, 50 mM NaCl, 0.01%(v/v) 트윈20, pH 5로 세척하고 15% 단계 용출의 50 mM NaOAc, 1 M NaCl, 0.01%(v/v) 트윈20, pH 5로 용출시켰다. 용출액을 농축하고 단백질을 Superdex200 컬럼(GE Healthcare)에서 40 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.01%(v/v) 트윈20, 및 pH 7.4를 작동 완충액으로 사용하여 추가 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE 및 네이티브 PAGE로 분석하였다(도 2). 단백질을 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 겔 상에 가시화시켰다. SDS-PAGE에서의 주요 밴드는 환원된 샘플에서 RSV F 단백질의 F1 및 F2 도메인에 상응하는 것이고; 비-환원된 샘플에서 주요 밴드는 이황화 결합으로 함께 연결된 F1+F2 도메인의 크기에 상응한다. 네이티브 페이지에서 단백질의 전기영동 이동성은 RSV F 삼합체 중 하나에 상응한다. 정제된 단백질의 융합-전 형태는 CR9501 항체에 대한 결합에 의해 확인되었다(데이터 미도시). 정제된 융합-전 삼합체 RSV F 단백질은 추가 분석시까지 4℃에 저장하였다.

안정성 연구.

자발적으로 융합-후 형태로 전환하는 융합-전 단백질의 능력을 저장 안정성 분석에서 평가하였다. 조 세포 배양 상등액 샘플을 4℃에 저장하고 샘플에서 F 단백질의 농도를 위에 기술된 정량 분석에 의해 Octet 기기에서 측정하였다. 측정은 상등액 수확일(제1일) 및 지시된 시기 동안 저장 후에 수행하였다. CR9501은 융합-전 F 형태만을 인식하는 단클론 항체이고(WO2012/006596) 융합전 RSV F 단백질 농도를 측정하기 위해 사용되었다.

정제된 단백질의 온도 안정성을 시차 주사 형광분석(DSF)에 의해 측정하였다. 정제된 융합-전 F 단백질을 96-웰 광학 qPCR 플레이트에서 SYPRO 등색 형광 염료(Life Technologies S6650)와 혼합하였다. 최적 염료 및 단백질 농도를 실험적으로 결정하였다(데이터 미도시). 모든 단백질 희석은 PBS에서 수행하였고, 염료만을 함유하는 음성 대조 샘플을 기준 감산으로 사용하였다. 측정은 qPCR 기기(Applied Biosystems ViiA 7)에서 다음 파라미터를 사용하여 수행하였다: 온도 램프 25~95℃ 초당 0.015℃ 속도. 데이터를 연속적으로 수집하였다. 첫 번째 유도체의 녹는 곡선을 GraphPad PRISM 소프트웨어(버전 5.04)를 사용하여 표시하였다. 녹는 온도는 유도체 곡선의 최소 지점에서 계산하였다.

도 3에 나타낸 바와 같이, S215P 치환으로만 안정화된 준안정성 F 변이체는 4℃에서 5일 동안 저장 후 융합-전-특이적 Mab CR9501에 대한 거의 모든 결합을 소실하였다. 대조적으로, 추가의 L203I 치환은 이 준안정성 RSV F 변이체의 안정성을 극적으로 증가시켰다. 수확일에서 CR9501 결합의 전체 결합은 더 높았고 4℃에서 15일의 저장 후 CR9501 결합에서 단지 약간의 저하가 관찰되었다. Leu 203의 Ile로의 추가 치환은 단일 S215P 치환만을 포함하는 준안정성 융합-전 F 단백질과 비교하여 융합-전 F 안정성 저장 안정성을 증가시킨다. 추가의 L203I 치환은 또한, DSF 실험에 따라 N67I 및 S215P 치환을 포함하는 변이체(57.0℃)와 비교하여, 열 안정성(59.5℃)을 증가시켰다(도 4).

구성체를 발현 수준, 저장 안정성 및, RSV-F의 융합-전 형태에 특이적인 항체 CR9501와의 항체 결합에 대하여 시험하였다. 이 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 그리고 중쇄 및 경쇄 CDR의 아미노산 서열은 아래에 제시된다. CR9501은 WO2012/006596에서 58C5로서 언급되는 항체의 결합 영역을 포함한다.

실시예 2

본 발명에 따르면, Leu203Ile 치환과 다른 안정화 돌연변이의 조합은 매우 안정한 RSV F 단백질을 야기하는 것을 보여주었다.

RSV F 단백질의 발현, 정제 및 특성화.

재조합 단백질을 위에 기술한 바와 같이 발현시키고 정제하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE에서 분석하였다(도 5). 단백질은 환원된 샘플에서 RSV F 단백질의 F1 및 F2 도메인 및 비-환원 샘플에서 함께 연결된 F1+F2 도메인에 상응하는 밴드만이 겔에서 관찰되어 순수하였다. 정제된 샘플의 SEC-MALS 분석(도 6)은 샘플에 존재하는 단백질 종만이 글리코실화된 RSV F 삼합체의 예상된 분자량에 상응하는 약 170 kDa의 분자량을 갖는 것을 보여주었다. SEC-MALS는 Agilent HPLC 시스템에서 TSK G3000SWXL 컬럼(Tosoh Bioscience)을 사용하여 수행되었다. MALS 측정은 MiniDAWN Treos 인-라인 검출기(Wyatt Technology)를 사용하여 수행되었다. 단백질 농도는 280 nm에서 UV 모니터 및 660 nm에서 굴절률 검출기(Optilab TrEX, Wyatt Technology)를 사용하여 모니터링되었다. 검출기는 다음 순서로 연결되었다: UV, MALS, RI. SEC-MALS 실험은 MALS 완충액(17,3 gr Na₂HPO4 * 2 H₂O/L, 7.3 gr NaH₂PO4 * H₂O/L, 2.9 gr NaCl/L, pH 7) 및 유속 1 mL/분을 이용하였다. 데이터는 Astra 소프트웨어 6.1(Wyatt Technology)을 사용하여 굴절률 검출기 및 굴절률 증가(dn/dc) 값 0.141 mL/g을 사용하여 분석하였다. 분자량은 굴절률 결과의 최대 피크를 사용하여 결정되고, 총 피크 면적은 흡광 계수로 보정된 UV-신호의 총 피크 면적%를 사용하여 결정된다.

안정성 연구.

실시예 1에 기술한 바와 같이, 정제된 단백질의 온도 안정성을 시차 주사 형광분석(DSF)에 의해 측정하였다. 도 4에 나타낸 바와 같이, L203I 치환이 N67I와 함께 또는 없이 S215P, D486N과 조합될 때 단백질의 열 안정성은 각각 약 67 및 약 70℃로 증가한다.

몇 개의 융합-전 RSV F 구성체의 아미노산 서열이 아래 제시된다. 본원에 기술되는 상이한 구성체에서 아미노산 넘버링은 야행형 서열(서열번호: 13에 두 변형(K66E 및 I76V)을 기반으로 하는 것임이 주목된다.

서열

RSV F 단백질 A2 전체 길이 서열(서열번호: 13)

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN

RSV F 단백질 B1 전체 길이 서열(서열번호: 15)

MELLIHRLSAIFLTLAINALYLTSSQNITEEFYQSTCSAVSRGYFSALRTGWYTSVITIELSNIKETKCNGTDTKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQNTPAANNRARREAPQYMNYTINTTKNLNVSISKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKNALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYINNQLLPIVNQQSCRISNIETVIEFQQKNSRLLEINREFSVNAGVTTPLSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSSNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPIYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNIKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQADTCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVSLCNTDIFNSKYDCKIMTSKTDISSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKLEGKNLYVKGEPIINYYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRRSDELLHNVNTGKSTTNIMITTIIIVIIVVLLSLIAIGLLLYCKAKNTPVTLSKDQLSGINNIAFSK

서열번호: 14( 피브리틴 )

GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL

FA2, K66E , I76V , S215P (서열번호: 20)

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL

FA2, K66E , I76V , L203I , S215P (서열번호: 21)

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQILPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL

FA2, K66E , I76V , L203I , S215P , D486N (서열번호: 23)

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQILPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL

FA2, K66E , N67I , I76V , L203I , S215P , D486N (서열번호: 24)

MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKEIKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQILPIVNKQSCSIPNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSNEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLSAIGGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL

RSV F 단백질 CL57-v224 전체 길이 서열(서열번호: 22)

MELPILKTNAITTILAAVTLCFASSQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPAANNRARRELPRFMNYTLNNTKNNNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGIAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNIDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNVGKSTTNIMITTIIIVIIVILLLLIAVGLFLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN

CR9501 중쇄 (서열번호: 16):

QVQLVQSGPGLVKPSQTLALTCNVSGASINSDNYYWTWIRQRPGGGLEWIGHISYTGNTYYTPSLKSRLSMSLETSQSQFSLRLTSVTAADSAVYFCAACGAYVLISNCGWFDSWGQGTQVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSC

CR9501 경쇄 (서열번호: 17):

EIVMTQSPSSLSASIGDRVTITCQASQDISTYLNWYQQKPGQAPRLLIYGASNLETGVPSRFTGSGYGTDFSVTISSLQPEDIATYYCQQYQYLPYTFAPGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

CR9502 중쇄 (서열번호: 18):

EVQLLQSGAELKKPGASVKISCKTSGFTFSGHTIAWVRQAPGQGLEWMGWVSTNNGNTEYAQKIQGRVTMTMDTSTSTVYMELRSLTSDDTAVYFCAREWLVMGGFAFDHWGQGTLLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSC

CR9502 경쇄 (서열번호: 19):

QSVLTQASSVSVAPGQTARITCGANNIGSQNVHWYQQKPGQAPVLVVYDDRDRPSGIPDRFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSRDQAVIFGGGTKLTVLGQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTIAPTECS

SEQUENCE LISTING <110> Jansen Vaccines and Prevention B.V. <120> Stabilized soluble pre-fusion RSV F polypeptides <130> 0259 WO 00 ORD <160> 24 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR9501 HCDR1 <400> 1 Gly Ala Ser Ile Asn Ser Asp Asn Tyr Tyr Trp Thr 1 5 10 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR9501 HCDR2 <400> 2 His Ile Ser Tyr Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR9501 HCDR3 <400> 3 Cys Gly Ala Tyr Val Leu Ile Ser Asn Cys Gly Trp Phe Asp Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR9501 LCDR1 <400> 4 Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR9501 LCDR2 <400> 5 Gly Ala Ser Asn Leu Glu Thr 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CR9501 LCDR3 <400> 6 Gln Gln Tyr Gln Tyr Leu Pro Tyr 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Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu His Asn Val Asn Val Gly Lys Ser Thr Thr Asn Ile Met Ile Thr 515 520 525 Thr Ile Ile Ile Val Ile Ile Val Ile Leu Leu Leu Leu Ile Ala Val 530 535 540 Gly Leu Phe Leu Tyr Cys Lys Ala Arg Ser Thr Pro Val Thr Leu Ser 545 550 555 560 Lys Asp Gln Leu Ser Gly Ile Asn Asn Ile Ala Phe Ser Asn 565 570 <210> 23 <211> 544 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FA2, K66E, I76V, L203I, S215P, D486N <400> 23 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Ile Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Pro Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asn Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln 515 520 525 Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 530 535 540 <210> 24 <211> 544 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> FA2, K66E, N67I, I76V, L203I, S215P, D486N <400> 24 Met Glu Leu Leu Ile Leu Lys Ala Asn Ala Ile Thr Thr Ile Leu Thr 1 5 10 15 Ala Val Thr Phe Cys Phe Ala Ser Gly Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe 20 25 30 Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu 35 40 45 Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile 50 55 60 Lys Glu Ile Lys Cys Asn Gly Thr Asp Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys 65 70 75 80 Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu 85 90 95 Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro 100 105 110 Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr 115 120 125 Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val 130 135 140 Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu 145 150 155 160 Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys 165 170 175 Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val 180 185 190 Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Ile Leu Pro Ile Val Asn 195 200 205 Lys Gln Ser Cys Ser Ile Pro Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln 210 215 220 Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn 225 230 235 240 Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu 245 250 255 Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys 260 265 270 Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile 275 280 285 Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro 290 295 300 Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro 305 310 315 320 Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg 325 330 335 Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe 340 345 350 Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp 355 360 365 Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val 370 375 380 Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr 385 390 395 400 Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys 405 410 415 Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile 420 425 430 Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp 435 440 445 Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly 450 455 460 Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro 465 470 475 480 Leu Val Phe Pro Ser Asn Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn 485 490 495 Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu 500 505 510 Leu Ser Ala Ile Gly Gly Tyr Ile Pro Glu Ala Pro Arg Asp Gly Gln 515 520 525 Ala Tyr Val Arg Lys Asp Gly Glu Trp Val Leu Leu Ser Thr Phe Leu 530 535 540

Claims

재조합 융합-전 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 융합(F) 폴리펩티드에 있어서, 폴리펩티드는 야생형 RSV F 단백질에서의 RSV F1 및/또는 F2 도메인과 비교하여, F1 및/또는 F2 도메인에서 적어도 두 개의 안정화 돌연변이를 포함하고, 적어도 하나의 안정화 돌연변이는 위치 203에서의 아미노산 잔기 L의 I로의 돌연변이인 융합-전 RSV F 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 폴리펩티드는 추가로 위치 215에서의 아미노산 잔기 S의 돌연변이, 바람직하게는 위치 215에서의 아미노산 잔기 S의 P로의 돌연변이를 포함하는 융합-전 RSV F 폴리펩티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 폴리펩티드는 융합-전 형태 F 단백질에 특이적인 적어도 하나의 에피토프를 포함하는데, 여기에서 적어도 하나의 에피토프는 서열번호: 1의 중쇄 CDR1 영역, 서열번호: 2의 중쇄 CDR2 영역, 서열번호: 3의 중쇄 CDR3 영역 및 서열번호: 4의 경쇄 CDR1 영역, 서열번호: 5의 경쇄 CDR2 영역, 및 서열번호: 6의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 융합-전 특이적 단클론 항체 및/또는 서열번호: 7의 중쇄 CDR1 영역, 서열번호: 8의 중쇄 CDR2 영역, 서열번호: 9의 중쇄 CDR3 영역 및 서열번호: 10의 경쇄 CDR1 영역, 서열번호: 67의 경쇄 CDR2 영역, 및 서열번호: 11의 경쇄 CDR3 영역을 포함하는 융합-전 특이적 단클론 항체에 의해 인식되는 융합-전 RSV F 폴리펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 삼합체인 융합-전 RSV F 폴리펩티드.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 절단된 F1 도메인을 포함하고, 폴리펩티드는 상기 절단된 F1 도메인에 연결되는 이종 삼합체화 도메인을 포함하는 융합-전 RSV F 폴리펩티드.
제5항에 있어서, 이종 삼합체화 도메인은 아미노산 서열 GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(서열번호: 14)을 포함하는 융합-전 RSV F 폴리펩티드.
제5항 또는 제6항에 있어서, 삼합체화 도메인은 RSV F 단백질의 아미노산 잔기 513에 연결되는 융합-전 RSV F 폴리펩티드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 적어도 하나의 추가 돌연변이를 포함하는데, 상기 돌연변이는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 융합-전 RSV F 폴리펩티드:
(a) 위치 46에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;
(b) 위치 67에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;
(c) 위치 83에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;
(d) 위치 92에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;
(e) 위치 184에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;
(f) 위치 207에서의 아미노산 잔기의 돌연변이;
(g) 위치 486에서의 아미노산 잔기의 돌연변이; 및
(h) 위치 487에서의 아미노산 잔기의 돌연변이.
제8항에 있어서, 적어도 하나의 추가 돌연변이는 다음으로 구성되는 군으로부터 선택되는 융합-전 RSV F 폴리펩티드:
(a) 위치 46에서의 아미노산 잔기 S의 G로의 돌연변이;
(b) 위치 67에서의 아미노산 잔기 N/T의 I로의 돌연변이;
(c) 위치 83에서의 아미노산 잔기 L의 M으로의 돌연변이;
(d) 위치 92에서의 아미노산 잔기 E의 D로의 돌연변이;
(e) 위치 184에서의 아미노산 잔기 G의 N으로의 돌연변이;
(f) 위치 207에서의 아미노산 잔기 V의 I로의 돌연변이:
(g) 위치 486에서의 아미노산 잔기 D의 N으로의 돌연변이; 및
(h) 위치 487에서의 아미노산 잔기 E의 Q, N 또는 I로의 돌연변이.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, F1 도메인 및/또는 F2 도메인은 RSV A 균주로부터 유래되는 융합-전 RSV F 폴리펩티드.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, F1 도메인 및/또는 F2 도메인은 RSV B 균주로부터 유래되는 융합-전 RSV F 폴리펩티드.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리펩티드는 서열번호: 20, 서열번호: 21, 서열번호: 23 및 서열번호: 24로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 융합-전 RSV F 폴리펩티드.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 융합-전 RSV F 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 분자.
제13항에 있어서, 핵산 분자는 포유류 세포에서 발현을 위해 코돈-최적화된 핵산 분자.
제13항 또는 제14항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 융합-전 RSV F 폴리펩티드, 제13항 또는 제14항에 따른 핵산 분자 및/또는 제15항에 따른 벡터를 포함하는 조성물.
RSV F 단백질에 대한 면역 반응을 유도하는 데 있어서의 사용을 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 융합-전 RSV F 폴리펩티드, 제13항 또는 제14항에 따른 핵산 분자, 및/또는 제15항에 따른 벡터.
백신으로서의 사용을 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 융합-전 RSV F 폴리펩티드, 제13항 또는 제14항에 따른 핵산 분자, 및/또는 제15항에 따른 벡터.
RSV 감염의 예방 및/또는 치료에서의 사용을 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 융합-전 RSV F 폴리펩티드, 제13항 또는 제14항에 따른 핵산 분자, 및/또는 제15항에 따른 벡터.