TR201902513T4 - Stabilize edilmiş çözünebilir prefüzyon RSV F polipeptitleri. - Google Patents

Abstract

Mevcut buluş, stabil pre-füzyon solonum sinsitiyal virüsleri (RSV) F polipeptitleri, bu bahsedilen polipeptitleri içeren immünojenik bileşimleri ve bunların RSV enfeksiyonunu önleme ve/veya tedavisinde kullanımını sağlamaktadır.

Description

TARIFNAME STABILIZE EDILMIS ÇÖZÜNEBILIR PREFÜZYON RSV F POLIPEPTITLERI Mevcut bulus, tip alani ile ilgilidir. Özellikle bulus, rekombinant prefüzyon RSV F polipeptitleri ve örnegin immünojenik bilesimlerde bunlarin kullanimlari ile ilgilidir.

Bulusun Alt Yapisi Solunum sinsitiyal virüsü (RSV), Paramiksovirüsler, cins Pneumovirus familyasindaki, zarfli, bölünmemis, negatif sarmalli bir RNA virüsüdür. Dünya genelinde her yil 64 milyon RSV enfeksiyonunun 160.000 ölümle sonuçlandigi tahmin edilmektedir (WHO Akut Solunum Enfeksiyonlari Güncellemesi Eylül 2009). En agir hastalik özellikle prematüre bebeklerde, yaslilarda ve bagisiklik sistemi zayiflamis bireylerde görülür. 2 yasindan küçük çocuklarda, RSV, en sik görülen solunum yolu patojeni olup, solunum yolu enfeksiyonlari nedeniyle hastaneye yatislarin yaklasik %50'sini olusturur ve 2-4 aylikken hastaneye yatmada pik görülmektedir. Hemen hemen tüm çocuklarin iki yasina kadar RSV ile enfekte oldugu bildirilmistir. Ömür boyu tekrarlanan enfeksiyon, etkisiz dogal bagisikliga baglanir. Yaslilarda RSV hastaligi yükü, mortalite ve morbidite düzeyi, pandemik olmayan influenza A enfeksiyonlarinin neden oldugu hastalarda sadece Ikinci siradadir.

Bir konakçi hücreyi enfekte etmek için, RSV, influenza virüsü ve HIV gibi diger zarfli virüsler gibi, viral membranin bir konakçi hücre membrani ile füzyonunu gerektirir. RSV için korunmus füzyon proteini (RSV F proteini) viral ve konakçi hücre hücresel membranlarini kaynastirir. Mevcut modellerde, paramiksovirüs çalismalarina dayanarak, RSV F proteini baslangiçta bir "pre-füzyon" konformasyona katlanir. Hücre girisi sirasinda, pre-füzyon konformasyon yeniden katlanir ve "post-füzyon" konformasyonundaki konformasyonel degisikliklere ugrar. Bu nedenle, RSV F proteini, baslangiçta daha düsük bir enerji konformasyonuna (post--füzyon konformasyon) ayrik/kademeli bir konformasyonel degisiklige ugrayan metastabil bir forma katlanarak (pre-füzyon konformasyon) katlanarak, membran jukstapozsitonuna yeniden katlanan geri dönüsümsüz proteini birlestirerek membran füzyonunu tahrik eden bir metastabil proteindir.

RSV-F'nin elektron mikroskopisinden, pre-füzyon ve post-füzyon F trimeri arasinda yakin zamanda kristalografi ile dogrulanmis olan büyük yapisal farkliliklarin mevcut proteininin antijenik olarak farkli oldugunu göstermektedir (Calder, L. J. et al., Virology RSV enfeksiyonuna karsi bir asi mevcut degildir, ancak arzu edilmektedir. RSV F proteinine dayali asi adaylari, örnegin kararlilik, saflik, tekrarlanabilirlik ve etkililik problemleri nedeniyle basarisiz olmustur. Yukarida belirtildigi gibi, kristal yapilar pre- füzyon ve post-füzyon durumlar arasinda büyük bir konformasyonel degisiklik ortaya çikarmistir. Yeniden düzenlemenin büyüklügü, RSV-F'nin post-füzyon konformasyonuna yönlendirilen antikorlarin sadece bir bölümünün, virüs yüzeyindeki pre-füzyon spaykin dogal konformasyonu ile çapraz reaksiyona girebilecegini göstermistir. Buna göre, RSV`ye karsi bir asi üretme çabalari, RSV F proteininin pre- füzyon formlarini içeren asilarin gelistirilmesine odaklanmistir (bakiniz örnegin, birlikte, bu çabalar insanlarda test için aday olarak kullanilabilecek kararli pre-füzyon RSV F polipeptitleri vermemistir.

Bulusun Kisa Açiklamasi Mevcut bulus, stabil, rekombinant, pre-füzyon solunum sinsitiyal virüs (RSV) füzyon (F) polipeptitleri, diger bir deyisle istemlerde tanimlandigi gibi pre-füzyon konformasyonunda stabilize edilmis rekombinant RSV F polipeptitleri saglar. Bulusun RSV F polipeptitleri, pre-füzyon konformasyon F proteinine spesifik en az bir epitop içerir. Bazi uygulamalarda, pre-füzyon RSV F polipeptitleri, çözünürdür. Bazi uygulamalarda, polipeptitler membrana baglidir. Bulus ayrica, bulusa göre pre-füzyon RSV F polipeptitlerini kodlayan nükleik asit molekülleri ve bu nükleik asit moleküllerini içeren vektörler saglar.

Bulus ayrica, bir RSV F polipeptidi, bir nükleik asit molekülü ve/veya bir vektör içeren bilesimler, tercihen immünojenik bilesimler ve bunlarin, özellikle bunlarin bir asi olarak kullanildigi, RSV F proteinine karsi bir immün yanitin uyarilmasinda kullanimi ile de ilgilidir. Tercihen, indüklenen immün yanitin karakterize edici özelligi, RSV'ye karsi antikorlari nötralize etmesi ve/veya RSV'ye karsi koruyucu immünitedir.

Sekillerin kisa açiklamasi jel filtrasyon kromatogrami. Oklar standart proteinin (1-Tiroglobulin 669 kDa, 2-Ferritin Indirgeyici kosullar altinda SEC kromatogramindan pik içeren pre-füzyon F proteininin SDS-PAGE analizi.

SEKIL 2: Izolösin fermuar (S) F43 ile pre-füzyon yapiyi eksprese eden hücrelerden 1) süpernatant içeren numunelerle yüklü NativePAGE'nin Western blot'u; 2) post-füzyon RSV F proteinini esasen trimerik (üst bant) eksprese eden hücrelerden süpernatant; ve 3) saflastirilmis trimerik pre-füzyon A2_F24 N67I.

SEKIL 3: Mutasyona ugramis noktalarin, mutasyona ugramamis A2_F24'e göre ekspresyon seviyeleri.

SEKIL 4, CR9501 baglanmasinin %50'sinin kayboldugu sicakligi belirleyen, Örnek 6 (A)'da tarif edilen yöntemin sonuçlarini göstermektedir; (B) pre-füzyon spesifik CR9501'in %50 baglanma kaybi ile degerlendirildiginde, pre-füzyon F (A2_F24 N67I+8215P) ve modifiye edilmemis ektodomen stabilitesinin bir karsilastirmasini göstermektedir.

SEKIL 5: Pre-füzyona spesifik antikor CR9501'in pre-füzyon yapilara depolanma zamanina bagli baglanma kaybini gösteren oktet ölçümler; A) A2_F24 (SEO ID NO: A2_F24 E92D.

SEKIL 6: pre-füzyon spesifik monoklonal antikor CR9501'in pre-füzyon yapilara baglanma zamanina bagli baglanma kaybini gösteren oktet ölçümler; A) A2_F24 SEKIL 7: Tablo 14'e göre immünojenler ve dozlarla, O. ve 4. haftalarda bir birincil destegin ardindan 6. haftadaki farelerin VNA titreleri.

SEKIL 8: Tablo 15'e göre immünojenler ve dozlarla, O. ve 4. haftalarda bir birincil destegin ardindan 7. haftadaki pamuk siçanlarinin VNA titreleri.

SEKIL 9: Akciger ve burun viral yükü, i.n. RSV challenge.

Bulusun Detayli Açiklamasi Solunum sinsitiyal virüsü (RSV) füzyon proteini (F). virüs için viral membranin enfeksiyon için gerekli olan bir konak hücre membrani ile füzyonunda rol oynar. RSV F mRNA, endoplazmik retikulumdaki bir sinyal peptidaz tarafindan uzaklastirilan N- terminusunda bir sinyal peptidi dizisi içeren (örnegin, SEQ ID NO: 1'in amino asit kalintilari 1-26) 574 amino asit öncü protein FO'ya çevrilir. F0, kisa bir glikosile edilmis müdahale edici diziyi çikararak (ayrica, 110 ila 136 amino asit kalintilarini içeren bir p27 bölgesine de atifta bulunulur ve F1 ve F2 olarak belirtilen iki domen veya alt birim üreterek, trans-Golgi'deki hücresel proteazlarla (özellikle furin) iki alana (amino asit 574), N-terminusunda bir hidrofobik füzyon peptidi içerir ve C-terminus. transmembrani (TM) (amino asit kalintilari 530-550) ve sitoplazmik bölgeyi (amino asit kalintilari 551- 574) içerir. F2 domeni (amino asit kalintilari 27-109) kovalent olarak iki disülfür köprüsü ile F1 ile baglanir. F1-F2 heterodimerler, homotrimerler halinde viryon içinde birlestirilir.

RSV enfeksiyonuna karsi bir asi hali hazirda mevcut degildir, fakat arzu edilmektedir.

Bir asi üretmek için potansiyel bir yaklasim, saflastirilmis RSV F proteinine dayanan bir alt birim asidir. Bununla birlikte, bu yaklasim için saflastirilmis RSV F proteininin. RSV F proteininin pre-füzyon durumunun konformasyonuna benzeyen, zaman içinde stabil olan ve yeterli miktarlarda üretilebilen bir konformasyonda olmasi arzu edilir. Ek olarak, alt birim bazli bir asi için, RSV F proteininin çözünür salgilanan bir F proteini (SF) olusturmak için transmembran (TM) ve sitoplazmik bölgenin delesyonu ile tepesinin kesilmesi gerekir. TM bölgesi, membran baglama ve trimerizasyondan sorumlu oldugu için, baglantisiz çözünür F proteini, tam uzunluktaki proteinden önemli ölçüde daha kararsizdir ve post-füzyon uç-fazda kolayca katlanacaktir. Yüksek ekspresyon seviyeleri ve yüksek stabilite gösteren stabil pre-füzyon konformasyonda çözünür F proteini elde etmek için, pre-füzyon konformasyonun stabilize edilmesi gerekir.

Pre-füzyon konformasyondaki baska bir paramiksovirüs F proteininin stabilizasyonu, parainfluenza tip 5 (PIV5) için basariyla gerçeklestirilmistir. Yin et al. (Nature 439: 38- 44 (2006)), PIV-5 F proteininin pre-füzyon yapisini F1 ve F2'ye islemeyi bloke eden Fo'daki furin bölünme alaninin mutasyonu ile stabilize etmistir. Ayrica, transmembran (TM) ve sitoplazmik d0men, iyi bilinen bir helisel trimerizasyon domeni ile degistirilmistir: GCN4pII. Bu d0men, bir trimerik helisel kivrimli spiral yapisi olusturur ve dogal dimerik helisel kivrimli spiral peptit GCN4'ün bir modifikasyonudur (O'Shea et al., her bir a ve d pozisyonunda Izolösin kalintilari ile süsbstitüe edildigi GCN4-pil peptidinin, bir üçlü sarmalli paralel alfa-helisel kivrimli spirali olusturdugu gösterilmistir.

Pre-füzyon konformasyonda RSV F'nin stabilizasyonu için ayni strateji denenmistir, örnegin, furin bölünme alaninin mutasyonu ve RSV-F ektodomeninin bir GCN4pII fibritin domeni veya 'Foldon', T4 fibritinden türetilir ve daha önce yapay bir dogal trimerizasyon domeni olarak tarif edilmistir (Letarov et al., Biochemistry Moscow 64: . Bununla birlikte, bu çabalar stabil pre-füzyon RSV-F proteini ile sonuçlanmadi. Dahasi, bu çabalar henüz insanlarda test edilmeye uygun adaylarla sonuçlanmadi.

Mevcut bulus simdi, rekombinant stabil pre-füzyon RSV F polipeptitleri, diger bir deyisle istemlerde tanimlandigi gibi pre-füzyon konformasyonda stabilize edilmis RSV F polipeptitleri saglamaktadir. Mevcut bulusa yol açan arastirmada, sözü edilen stabil çözünür pre-füzyon RSV F polipeptitlerini elde etmek için birkaç modifikasyon adimi eklenmis ve/veya birlestirilmistir. Bulusun stabil pre-füzyon RSV F polipeptitleri pre- füzyon konformasyonundadir, diger bir deyisle bunlar pre-füzyon konformasyon F proteinine spesifik en az bir epitopu içerir (gösterir). Pre-füzyon konformasyona spesifik bir epitop F proteini, post-füzyon konformasyonda sunulmayan bir epitoptur. Herhangi bir özel teoriye bagli kalmak arzu edilmeksizin, RSV F proteininin pre-füzyon konformasyonunun, dogal RSV viryonlarinda eksprese edilen RSV F proteini ile ayni olan epitoplar içerebilecegine ve bu nedenle koruyucu nötrlestirici antikorlari meydana getirmek için avantajlar saglayabilecegine inanilmaktadir.

Bulusun polipeptitleri, SEQ ID NO: 54'ün bir agir zincir CDR1 bölgesi, SEO ID NO: 55'in bir agir zincir CDR2 bölgesi, SEQ ID NO: 56'nin bir agir zincir CDR3 bölgesi ve SEO ID NO: 62'nin bir hafif zincir CDR1 bölgesi, SEQ ID NO: 63'ün bir hafif zincir CDR2 bölgesi ve SEO ID NO: 64'ün bir hafif zincir CDR3 bölgesini (bundan böyle CR9501) içeren ve/veya bir pre-füzyon spesifik monoklonal antikoru SEQ ID NO: 58'in bir agir zincir CDR1 bölgesi, SEQ lD NO: 59'un bir agir zincir CDR2 bölgesi, SEQ ID NO: 60'in bir agir zincir CDR3 bölgesi ve SEO ID NO: 66'nin bir hafif zincir CDR1 bölgesi, SEQ ID NO: 67'nin bir hafif zincir CDR2 bölgesi ve SEO ID NO: 68'in bir hafif zincir CDR3 bölgesini (CR9502 olarak adlandirilir) içeren bir pre-füzyon spesifik monoklonal antikoru ile taninan en az bir epitop içerir. CR9501 ve CR9502, agir ve hafif zincir degisken bölgelerini ve bu nedenle sirasiyla 58C5 ve 30D8 antikorlarinin baglanma spesifitelerini içerir, bunlar daha önce pre-füzyon konformasyonunda spesifik olarak RSV F proteinine baglandiklarini ve post-füzyon konformasyonuna Bazi uygulamalarda rekombinant pre-füzyon RSV F polipeptitleri, yukarida tarif edildigi gibi en az bir pre-füzyon spesifik monoklonal antikor tarafindan taninan ve trimerik olan en az bir epitop içerir.

Bulusa uygun stabil pre-füzyon RSV F polipeptitleri, 67. pozisyonda N veya T amino asit kalintisinin mutasyonunu ve/veya 215. pozisyondaki amino asit kalintisi S'nin mutasyonunu içerir.

Bazi uygulamalarda bulusa göre stabil pre-füzyon RSV F polipeptitleri, bir F1 domeni bahsedilen F1 domeni, bahsedilen F2 domeni ile baglar, burada polipeptitler ayrica 67. pozisyonda N veya T amino asit kalintisi mutasyonunu ve/veya 215. pozisyonda amino asit kalintisi S mutasyonunu içerir.

Bazi uygulamalarda bulusa göre stabil pre-füzyon RSV F polipeptitleri, tepesi kesilmis bir F1 domeni ve bir F2 domeni ve 1 ila 10 amino asit kalintisi içeren bir baglama dizisini içerir, bahsedilen tepesi kesilmis F1 domenini bahsedilen F2 domenine baglar, burada polipeptitler ayrica 67. pozisyonda N veya T amino asit kalintisi mutasyonunu ve/veya 215. pozisyonda S amino asit kalintisi mutasyonunu içerir.

Dolayisiyla, bulusun polipeptitleri, dogal sus bir RSV F proteinindeki RSV F1 ve/veya F2 domeni ile karsilastirildiginda F1 ve/veya F2 domenindaki en az bir stabilize edici mutasyon içerir.

Bulusa göre, pre-füzyon RSV F polipeptitleri, 67. pozisyondaki (N/TGTI) amino asit kalintisi N veya T'nin l ve/veya 215. pozisyondaki amino asit kalintisi S'nin P (8215P) içindeki mutasyonunu içerir.

RSV'nin iki antijenik alt gruba sahip tek bir serotip olarak var oldugu bilinmektedir: A ve B. Iki grubun matür islenmis F proteinlerinin amino asit dizileri yaklasik %93 oraninda özdestir. Mevcut basvuru boyunca kullanildigi gibi, amino asit pozisyonlari, A2 susundan (SEQ ID NO: 1) RSV F proteininin dizisine göre verilmistir. Mevcut bulusta kullanildigi üzere, "RSV F proteininin "x" pozisyonundaki amino asit ifadesi, bu sekilde, SEO ID NO: 1lin RSV A2 susunun RSV F proteininde "x" pozisyonundaki amino aside karsilik gelen amino asit anlamina gelir. Mevcut basvuru boyunca kullanilan numaralandirma sisteminde 1, bir immatür FO proteininin N-terminal amino asidini (SEO lD NO: 1) ifade eder. A2 susundan baska bir RSV susu kullanildiginda, F proteininin amino asit pozisyonlari, diger RSV susu dizilerini SEQ ID NO: 1'in F proteini ile hizalayarak gerektigi gibi bosluklarin insersiyonu ile, SEQ ID NO: 1'in A2 susunun F proteininin numaralanmasina referansla numaralandirilmalidir. Dizi hizalamalari teknikte iyi bilinen yöntemler kullanilarak, örnegin, CLUSTALW, Bioedit veya CLC Workbench kullanilarak yapilabilir.

Bulusa göre olan bir amino asit, dogal olarak olusan yirmi (veya "standart" amino asit) herhangi biri veya bunlarin varyantlari, örnegin D-amino asitler (kiral merkezli amino asitlerin D-enantiyomerleri) veya proteinler içerisinde dogal olarak bulunmayan varyantlar, örnegin, norlösinden herhangi biri olabilir. Standart amino asitler özelliklerine göre birkaç gruba ayrilabilir. Önemli faktörler yük, hidrofiliklik veya hidrofobiklik, büyüklük ve fonksiyonel gruplardir. Bu özellikler protein yapisi ve protein- protein etkilesimleri için önemlidir. Bazi amino asitler, diger sistein kalintilarina kovalent disülfit baglari (veya disülfit köprüleri) olusturabilen sistein, polipeptit omurgasinin dönüslerini indükleyen prolin ve diger amino asitlerden daha esnek olan glisin gibi özel özelliklere sahiptir. Tablo 11, standart amino asitlerin kisaltmalarini ve özelliklerini göstermektedir.

Uzman kisiler tarafindan, mutasyonlarin rutin moleküler biyoloji prosedürleri ile proteine yapilabilecegi takdir edilecektir. Bulusa göre mutasyonlar tercihen, bu mutasyonu(mutasyonlari) içermeyen RSV F polipeptitleri ile karsilastirildiginda, pre- füzyon RSV F polipeptitlerinin artan ekspresyon seviyeleri ve/veya artan stabilizasyonuyla sonuçlanir.

Bazi uygulamalarda, pre-füzyon RSV F polipeptitleri çözülebilir.

Bazi uygulamalarda, pre-füzyon RSV F polipeptitleri ayrica bahsedilen tepesi kesilmis F1 domenine bagli bir heterolog trimerizasyon domeni de içerir. Bulusa göre, istege bagli olarak F1 ve F2 domenini baglayan bir baglama dizisi ile birlestirilen, heterolog bir trimerizasyon domeninin tepesi kesilmis bir F1 domeninin C-terminal amino asit kalintisina baglanmasi ile ve stabilize edici mutasyon(lar) ile, yüksek ekspresyon gösteren ve pre-füzyon spesifik antikorlara baglanan RSV F polipeptitlerinin saglandigi gösterilmistir, bu da, polipeptitlerin pre-füzyon konformasyonunda oldugunu göstermektedir. Ek olarak, RSV F polipeptitleri pre-füzyon konformasyonda stabilize edilir, diger bir deyisle polipeptitlerin islenmesinden sonra bile pre-füzyon spesifik antikorlari CR9501 ve/veya CR9502'ye baglanir, pre-füzyon spesifik epitopun korundugunu gösterir.

Baska uygulamalarda, pre-füzyon RSV F polipeptitleri, asagidakilerden olusan gruptan seçilen bir veya daha fazla baska mutasyon (dogal sus RSV F proteinine kiyasla) içerir: a) 46. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; b) 77. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; c) 80. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; d) 92. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; e) 175. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; f) 184. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; g) 185. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; h) 201. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; (i) 209. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; (j) 421. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; (k) 426. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; (I) 465. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; (m) 486. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; (n) 487. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; ve 0 508. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu.

Tercih edilen uygulamalarda bir veya daha fazla baska mutasyon, asagidakilerden olusan gruptan seçilir: (a) 46. pozisyonda S amino asit kalintisinin G (S46G)'ye bir mutasyonu; (b) 77. pozisyonda K amino asit kalintisinin E (K77E)'ye bir mutasyonu; (o) 80. pozisyonda K amino asit kalintisinin E (K80E)'ye bir mutasyonu; (d) 92. pozisyonda E amino asit kalintisinin D (E92D)`ye bir mutasyonu; (e) 175. pozisyonda N amino asit kalintisinin P (N175P)'ye bir mutasyonu; (f) 184. pozisyonda G amino asit kalintisinin N (G184N),ye bir mutasyonu; (g) 185. pozisyonda V amino asit kalintisinin N (V185N)'ye bir mutasyonu; (h) 201. pozisyonda K amino asit kalintisinin Q (K201Q)'ya bir mutasyonu; (i) 209 pozisyonunda K amino asit kalintisinin Q (K209Q)'ya bir mutasyonu; (j) 421 pozisyonundaki K amino asit kalintisinin N (K421N)`ye bir mutasyonu; (k) 426. pozisyonda N amino asit kalintisinin S (N4268)”ye bir mutasyonu; (I) 465. pozisyonda K amino asit kalintisinin E veya Q (K465Q)'ya bir mutasyonu; (m) 486. pozisyonunda D amino asit kalintisinin N (D486N)'ye bir mutasyonu; (n) 487. pozisyonunda E amino asit kalintisinin Q, N veya I (E487Q/N/I),ya bir mutasyonu; ve (o) 508. pozisyonda K amino asit kalintisinin E (K508E)`ye bir mutasyonu.

Yine amino asit kalintilarinin pozisyonlari için SEQ ID NO: 1'e referans verildigine dikkat çekilmistir. Uzman bir kisi, diger RSV suslarinin F proteinlerindeki karsilik gelen amino asit kalintilarini belirleyebilecektir.

Bazi uygulamalarda pre-füzyon RSV F polipeptitleri, (dogal-sus bir RV F proteinine kiyasla) en az iki mutasyon içerir. Tercih edilen uygulamalarda, en az iki mutasyon. 67. pozisyondaki amino asit N veya T'nin I (N/T67I)'ya bir mutasyonu ve 215. pozisyondaki amino asit S'nin P (S215P)'ye bir mutasyonudur.

Bazi uygulamalarda pre-füzyon RSV F polipeptitleri, asagidakilerden olusan gruptan seçilen en az bir baska mutasyon içerir: (a) 46. pozisyonda S amino asit kalintisinin G'ye bir mutasyonu; (b) 77. pozisyonda K amino asit kalintisinin E`ye bir mutasyonu; (c) 80. pozisyonda K amino asit kalintisinin E'ye bir mutasyonu; (d) 92. pozisyonda E amino asit kalintisinin D'ye bir mutasyonu; (e) 175. pozisyonda N amino asit kalintisinin P'ye bir mutasyonu; f) 184. pozisyonda G amino asit kalintisinin N'ye bir mutasyonu; g) 185. pozisyonda V amino asit kalintisinin N'ye bir mutasyonu; (h) 201. pozisyonda K amino asit kalintisinin Q'ya bir mutasyonu; 209 pozisyonunda K amino asit kalintisinin Q'ya bir mutasyonu; (k) 426. pozisyonda N amino asit kalintisinin S'ye bir mutasyonu; 421 pozisyonundaki K amino asit kalintisinin N'ye bir mutasyonu; (l) 465. pozisyonda K amino asit kalintisinin E veya Q”ya bir mutasyonu; (m) 486. pozisyonunda D amino asit kalintisinin N'ye bir mutasyonu; (n) 487. pozisyonunda E amino asit kalintisinin Q, N veya I`ya bir mutasyonu; ve (o) 508. pozisyonda K veya R amino asit kalintisinin E'ye bir mutasyonu.

Bazi uygulamalarda, polipeptitler en az üç mutasyon içerir.

Bazi uygulamalarda heterolog trimerizasyon domeni, EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA amino asit dizisini içerir (SEQ lD NO: 3). Diger bazi uygulamalarda heterolog trimerizasyon domeni, GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL amino asit dizisini içerir (SEQ ID NO: Yukarida tarif edildigi gibi, bazi uygulamalarda, bulusun polipeptitleri tepesi kesilmis bir F1 domeni içerir. Bu tarifnamede kullanildigi haliyle, "tepesi kesilmis" bir F1 domeni, tam uzunlukta bir F1 domeni olmayan bir F1 domeni anlamina gelir, diger bir deyisle, burada N-terminal veya C-terminal olarak bir veya daha fazla amino asit kalintisi silinmistir. Bulusa göre, en azindan transmembran domeni ve sitoplazmik kuyruk, bir çözünür ektodomen olarak ekspresyona izin vermek için silinmistir.

Diger bazi uygulamalarda F1 domeni, RSV F proteininin amino asit kalintisi 495'ten sonra (SEQ ID NO: 1'e referansla) tepesi kesilir, diger bir deyisle amino asit kalintisi Diger bazi uygulamalarda, F1 domeni, RSV F proteininin 513 amino asit kalintisindan 525 veya 525'den sonra tepesi kesilir.

Bazi uygulamalarda, trimerizasyon domeni, RSV F1 domeninin amino asit kalintisi 495'e baglanir. Bazi uygulamalarda, trimerizasyon domeni, SEQ ID NO: 4'ü içermektedir ve RSV F1 domeninin amino asit kalintisi 495'e baglanmaktadir.

Diger bazi uygulamalarda, trimerizasyon domeni, RSV F1 domeninin amino asit kalintisi 513'e baglanir. Bazi uygulamalarda, trimerizasyon domeni, SEO ID NO: 3'ü içermektedir ve RSV F1 domeninin amino asit kalintisi 5113'e baglanmaktadir.

Bazi uygulamalarda, istege bagli olarak tepesi kesilen F1 domeni ve F2 domeni bir baglama dizisi ile baglanir, burada F2 domeninin C-terminal amino asidini (istege bagli olarak tepesi kesilmis) F1 domenini N-terminal amino asidine baglar. Bazi uygulamalarda, baglama dizisi (veya baglayici) 1-10 amino asit kalintisi, tercihen 2-9 amino asit kalintisi, tercihen 3-8 amino asit kalintisi, tercihen 4-7 amino asit kalintisi, daha çok tercihen baglayici 5 veya 6 amino asit kalintisi içerir. Teknikte, pre-füzyon RVS F polipeptitlerinin konformasyonunu bozmadan, bulusa göre kullanilabilecek sayisiz konformasyonel olarak nötr baglayicilar bilinmektedir. Tercih edilen uygulamalarda, baglayici GSGSG amino asit dizisini içerir (SEO ID NO: 5).

Bazi uygulamalarda F1 domeni ve/veya F2 domeni, bir RSV A susundandir. Bazi uygulamalarda F1 ve/veya F2 domeni, SEQ ID NO: 1'in RSV A2 susundandir.

Bazi uygulamalarda F1 domeni ve/veya F2 domeni, bir RSV A susundandir, SEQ ID NO: 69'un RSVA susundandir.

Bazi uygulamalarda F1 domeni ve/veya F domeni, bir RSV B susundandir. Bazi uygulamalarda F1 ve/veya F2 domeni, SEQ ID NO: 2'nin RSV B susundandir.

Bazi uygulamalarda F1 ve F2 domeni, ayni RSV susundandir. Bazi uygulamalarda, pre-füzyon RSV F polipeptitleri kimerik polipeptitlerdir, diger bir deyisle farkli RSV suslarindan gelen F1 ve F2 domenlerini içerir.

Bazi uygulamalarda bulusa ait pre-füzyon RSV F polipeptitlerinin ekspresyon seviyesi, mutasyon(lar) olmadan dogal-sus bir RSV F polipeptit ektodomen (diger bir deyisle, transmembran ve sitoplazmik bölge olmadan) ile karsilastirildiginda, artar. Bazi uygulamalarda, ekspresyOn seviyesi en az 5 kat, tercihen 10 kat artar. Bazi uygulamalarda, ekspresyon seviyesi 10 kattan daha fazla artar.

Bulusa göre pre-füzyon RSV F polipeptitleri stabildir, diger bir deyisle, örnegin polipeptitlerin islenmesi üzerine saflastirma, donma-çözülme döngüleri ve/veya depolama vb. gibi post-füzyon konformasyonunda kolayca degismez..

Bazi uygulamalarda, bulusa ait pre-füzyon RSV F polipeptitleri, mutasyon(lar) olmadan bir RSV F polipeptidine kiyasla 4°C'Iik bir depolamada arttirilmis bir stabiliteye sahiptir.

Bazi uygulamalarda polipeptitler, 4°C'de en az 30 gün, tercihen en az 60 gün, tercihen en az 6 ay, daha da tercihen en az 1 yil depolanirlar. “Depolamada stabil" ile, polipeptitlerin, örnegin Örnek 7 veya 9'de tarif edildigi gibi bir yöntem kullanilarak belirlendigi gibi polipeptidin çözeltide (örnegin kültür ortami) 4°C'de en az 30 gün depolanmasi üzerine, bir pre-füzyon spesifik antikor için spesifik olan en az bir epitopu gösterdigi ifade edilmektedir. Bazi uygulamalarda polipeptitler, pre-füzyon RSV F polipeptitlerin 4°C'de depolanmasindan sonra en az 6 ay boyunca, tercihen en az 1 yil boyunca en az bir pre-füzyon spesifik epitopu gösterir.

Bazi uygulamalarda, bulusa ait pre-füzyon RSV F polipeptitleri, bahsedilen mutasyon(lar) olmadan RSV F polipeptitlerine kiyasla, isiya maruz kaldiklarinda artan bir stabiliteye sahiptir. Bazi uygulamalarda pre-füzyon REV F polipeptitleri, 55°C'Iik, tercihen 58°C'Iik, daha tercihen 60°C'Iik bir sicaklikta en az 30 dakika isiya dayaniklidir. “Isi stabil" ile yine de, en az 30 dakika boyunca arttirilmis bir sicakliga (diger bir deyisle 55°C veya daha yüksek bir sicaklik) maruz birakildiktan sonra, örnegin Örnek 6'da tarif edilen bir yöntem kullanilarak belirlendigi gibi en az bir pre- füzyon spesifik epitopu gösterilir.

Bazi uygulamalarda, polipeptitler, uygun bir formülasyon tamponunda 1 ila 6 donma- çözülme döngüsüne tabi tutulduktan sonra en az bir pre-füzyon spesifik epitopu gösterir.

Tercih edilen bazi uygulamalarda bulusa ait pre-füzyon RSV F polipeptidi, SEQ ID NO: 21-52 ve 71-89'dan olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisi içerir. Bazi uygulamalarda bulusa ait pre-füzyon RSV F polipeptidi, SEQ ID NO: 21-52 ve 71- 89'dan olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisi içerir.

Mevcut basvuru boyunca kullanildiginda, nükleotid dizileri, 5 'ila 3' yönünden ve N- terminusundan C terminusuna kadar amino asit dizileri temin edilir.

Bazi uygulamalarda, bulusa göre kodlanmis polipeptitler ayrica SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 veya SEQ ID NO: 69'un 1-26 amino asitlerine karsilik gelen sinyal dizisi veya sinyal peptidi olarak da adlandirilan bir lider diziyi içerir. Bu, salgi yolagina dogru olan yeni sentezlenmis proteinlerin çogunlugunun N-terminusunda bulunan kisa (tipik olarak -30 amino asit uzunlugunda) bir peptittir. Bazi uygulamalarda, bulusa ait polipeptitler bir lider dizi içermez.

Bazi uygulamalarda, polipeptitler bir HIS-Etiket içerir. Bir His-Etiket veya polihistidin etiketi, genellikle saflastirma amaciyla kullanilan proteinin N- veya C-terminusunda, en az bes histidin (H) kalintisindan olusan proteinlerdeki bir amino asit motifidir.

Bazi uygulamalarda, polipeptitler bir HIS-Etiket içermez. Bulusa göre, sasirtici bir sekilde, HIS-etiket silindiginde, ekspresyon seviyesinin ve stabilitenin, bir HIS-etiketli polipeptitlere kiyasla arttigi gösterilmistir.

Mevcut bulus ayrica, bulusa ait RSV F polipeptitlerini kodlayan nükleik asit molekülleri Tercih edilen uygulamalarda, bulusa ait polipeptitleri kodlayan nükleik asit molekülleri, memeli hücrelerinde, tercihen insan hücrelerinde ekspresyon için kodon optimizedir.

Kodon optimizasyon yöntemleri bilinmektedir ve daha önce tarif edilmistir (örnegin, WO 96/09378). Bir dogal sus dizisine kiyasla en az bir tane tercih edilmeyen kodonun daha çok tercih edilen bir kodori ile degistirilmesi durumunda, bir dizinin kodon-optimize edilmis oldugu kabul edilir. Burada, tercih edilmeyen bir kodon, bir organizmada, ayni amino asidi kodlayan baska bir kodondan daha az kullanilan bir kodondur ve daha fazla tercih edilen bir kodon, bir organizmada tercih edilmeyen kodondan daha sik kullanilan bir kodondur. Spesifik bir organizma için kodon kullanim sikligi, http://www.kazusa.or.jp/codon gibi kodon frekans tablolarinda bulunabilir. Tercihen birden fazla tercih edilmeyen kodon, tercihen tercih edilmeyen kodonlarin çogu veya tamami, daha fazla tercih edilen kodonlar ile degistirilir. Tercihen, bir organizmada en sik kullanilan kodonlar kodon-optimize bir dizide kullanilir. Tercih edilen kodonlarla degistirme genellikle daha yüksek ekspresyona neden olur.

Uzman bir kisi tarafindan, çok sayida farkli polinükleotid ve nükleik asit molekülünün, genetik kodun dejenere olmasi sonucu ayni polipeptidi kodlayabildigi anlasilacaktir.

Ayrica uzman kisilerin, rutin teknikler kullanarak, içinde polipeptitlerin eksprese edilecegi herhangi bir özel konakçi organizmanin kodon kullanimini yansitacak sekilde nükleik asit molekülleri tarafindan kodlanan polipeptit dizisini etkilemeyen nükleotid sübstitüsyonlari yapabilecegi anlasilmaktadir. Bu nedenle, aksi belirtilmedikçe, "bir amino asit dizisini kodlayan bir nükleotid dizisi", birbirlerinin dejenere edilmis versiyonlari olan ve ayni amino asit dizisini kodlayan tüm nükleotid dizilerini içerir.

Proteinleri ve RNA'yi kodlayan nükleotid dizileri, intronlari içerebilir veya içermeyebilir.

Nükleik asit dizileri, rutin moleküler biyoloji teknikleri kullanilarak klonlanabilir veya DNA sentezi ile de novo üretilebilir, bunlar DNA sentezi ve/veya moleküler klonlama sahasinda faaliyet gösteren hizmet sirketleri tarafindan rutin prosedürler kullanilarak gerçeklestirilebilir (örnegin, GeneArt, GenScripts, Invitrogen, Eurofins).

Bulus ayrica yukarida tarif edildigi gibi bir nükleik asit molekülü içeren vektörler saglar.

Bazi uygulamalarda, bulusa ait bir nükleik asit molekülü bir vektörün bölümüdür. Bu tür vektörler, teknikte uzman kisilerce iyi bilinen yöntemlerle kolayca manipüle edilebilir ve örnegin prokaryotik ve/veya ökaryotik hücrelerde replikasyon yapabilmek için tasarlanabilir. Ek olarak, ökaryotik hücrelerin transformasyonu için birçok vektör kullanilabilir ve bunlarin genomunda arzu edilen nükleik asidi içeren stabil konakçi hücrelere yol açan bu tür hücrelerin genomuna tamamen veya kismen entegre olur.

Kullanilan vektör, DNA'yi klonlamak için uygun olan ve ilgili bir nükleik asidin transkripsiyonu için kullanilabilen herhangi bir vektör olabilir. Bulusa göre uygun vektörler arasinda örnegin adenovektörler, örnegin, Ad26 veya Ad35, alfavirüs, paramiksovirüs, vaksinya virüsü, herpes virüsü, retroviral vektörler vb. yer alir. Teknikte uzman kisi uygun ekspresyon vektörlerini seçme ve bulusa göre olan nükleik asit dizilerini islevsel bir sekilde ekleme yetenegine sahiptir.

Pre-füzyon RSV F polipeptitlerini kodlayan nükleik asit moleküllerini içeren konakçi hücreler de bulusun bir bölümünü olusturur. Pre-füzyon RSV F polipeptitleri, moleküllerin konakçi hücrelerde ekspresyonunu içeren rekombinant DNA teknolojisi vasitasiyla üretilebilir, örnegin Çin hamsteri yumurtalik (CHO) hücreleri, tümör hücre çizgileri, BHK hücreleri, HEK293 hücreleri, PER.C6 hücreleri veya maya, mantarlar, böcek hücreleri ve benzerleri veya transgenik hayvanlar veya bitkiler gibi insan hücre hatlari. Bazi uygulamalarda, hücreler çok hücreli bir organizmadandir, bazi uygulamalarda omurgali veya omurgasiz kökenlidir. Bazi uygulamalarda, hücreler memeli hücreleridir. Bazi uygulamalarda, hücreler insan hücreleridir. Genel olarak, bulusa ait bir pre-füzyon RSV F polipeptitleri gibi bir rekombinant proteinlerin, bir konakçi hücrede üretimi, polipeptidi kodlayan heterolog bir nükleik asit molekülünün, konakçi hücreye eksprese edilebilir biçimde dahil edilmesini, nükleik asit molekülünün ekspresyonuna elverisli kosullar altinda kültürlenmesini ve polipeptidin bahsedilen hücrede ekspresyonuna izin verilmesini içerir. Eksprese edilebilir formatta bir proteini kodlayan nükleik asit molekülü, bir ekspresyon kaseti formunda olabilir ve genellikle, arttirici(lar), promotör, poliadenilasyon sinyali ve benzerleri gibi nükleik asidin ekspresyonunu gerçeklestirebilen diziler gerektirir. Bu alanda uzman kisi, konakçi hücrelerde bir genin ekspresyonunu elde etmek için çesitli promotörlerin kullanilabilecegini bilir. Promotörler, konstitütif veya düzenleyici olabilir ve virüsler, prokaryotik veya ökaryotik kaynaklar dahil çesitli kaynaklardan elde edilebilir veya yapay olarak tasarlanabilir.

Hücre kültür ortami, çesitli saticilardan temin edilebilir ve uygun ortam ilgilenilen proteini, burada pre-füzyon RSV F polipeptitlerini eksprese etmek amaciyla bir konakçi hücre için rutin olarak seçilebilir. Uygun ortam serum içerebilir veya içermeyebilir.

Bir "heterolog nükleik asit molekülü" (ayrica burada "transgen" olarak da anilir), konakçi hücrede dogal olarak bulunmayan bir nükleik asit molekülüdür. Örnegin standart moleküler biyoloji teknikleriyle bir vektöre dahil edilir. Bir transgen genellikle ekspresyon kontrol dizilerine islevsel olarak baglanir. Bu, örnegin, transgen(ler)i kodlayan nükleik asidi, bir promotör kontrolü altina alarak yapilabilir. Diger düzenleyici diziler eklenebilir. Birçok promotör, bir transgen(ler)in ekspresyonu için kullanilabilir ve bu konuda uzman kisilerce bilinmektedir, örnegin bunlar viral, memeli, sentetik promotörler ve benzerlerini içerebilir. Ökaryotik hücrelerde ekspresyon elde etmek için uygun bir promotörün sinirlayici olmayan bir örnegi, bir CMV promotörüdür (US ,385,839); örnegin, CMV acil erken promotör, örnegin CMV acil erken gen arttirici/promotöründen nt. -735 ila +95 içerir. Bir poliadenilasyon sinyali, örnegin sigir büyüme hormonu poIiA sinyali (US 5,122,458), transgen(ler)in arkasinda bulunabilir.

Alternatif olarak, yaygin olarak kullanilan birkaç ekspresyon vektörü, teknikte ve ticari kaynaklardan, örnegin ilgili proteini rekombinant olarak eksprese etmek veya uygun promotörler ve/veya transkripsiyon sonlandirici dizileri, poIiA dizileri ve benzerlerini elde etmek için kullanilabilecek Invitrogen'den pcDNA ve pEF vektör serileri, BD Sciences'dan pMSCV ve pTK-Hyg, Stratagene'den pCMV-Script, vb. olabilir.

Hücre kültürü, yapisik hücre kültürü de dahil olmak üzere herhangi bir tür hücre kültürü olabilir, örnegin, bir kültür kabinin yüzeyine veya mikro tasiyicilara, ayrica süspansiyon kültürüne bagli hücreler. Çogu büyük ölçekli süspansiyon kültürü, parti veya beslemeli parti prosesleri olarak çalistirilir, çünkü bunlar isletilmesi ve ölçeklendirilmesi en kolay olanlaridir. Günümüzde perfüzyon prensiplerine dayali sürekli prosesler daha yaygin hale gelmektedir ve ayni zamanda uygundur. Uygun kültür ortami ayni zamanda uzman kisilerce iyi bilinmektedir ve genellikle ticari kaynaklardan büyük miktarlarda elde edilebilir veya standart protokollere göre özel yapilabilir. Kültür, örnegin tabaklarda, rulo siselerde veya biyoreaktörlerde, parti, beslemeli parti, sürekli sistemler ve benzerleri kullanilarak yapilabilir. Kültür hücreleri için uygun kosullar bilinmektedir (bakiniz örnegin, Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Paterson, editors (1973) ve R.l. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, fourth edition (Wiley-Liss Inc., .

Bulus ayrica, yukarida tarif edildigi gibi bir pre-füzyon RSV F polipeptidi ve/veya bir nükleik asit molekülü ve/veya bir vektör içeren bilesimler saglanmaktadir. Bu nedenle bulus, RSV F proteininin bir pre-füzyon konformasyonunda mevcut olan ancak post- füzyon konformasyonunda mevcut olmayan bir epitop gösteren bir pre-füzyon RSV F polipeptidi içeren bilesimler saglanmaktadir. Bulus ayrica, bu türlü bir pre-füzyon RSV F polipeptidini kodlayan bir nükleik asit molekülü ve/veya bir vektör içeren bilesimler saglanmaktadir. Bulus ayrica yukarida açiklandigi gibi bir pre-füzyon RSV F polipeptidi ve/veya bir nükleik asit molekülü ve/veya bir vektör içeren immünojenik bilesimler sunar. Bulus ayrica, bir denekte RSV F proteinine karsi bir immün yanitini indüklemek için bulusa göre bir stabilize edilmis pre-füzyon RSV F polipeptidi, bir nükleik asit molekülü ve/veya bir vektörün kullanimini saglanmaktadir. Ayni zamanda, bir denekte RSV F proteinine karsi bir immün yanitin indüklenmesinde kullanim için bulusa göre pre-füzyon RSV F polipeptitleri, nükleik asit molekülleri ve/veya vektörleri saglanmaktadir. Ayrica, pre-füzyon RSV F polipeptitlerinin ve/veya nükleik asit moleküllerinin ve/veya vektörlerin, bir denekte RSV F proteinine karsi bir immün yanitinin indüklenmesinde kullanim için bir ilacin imalatinda kullanilmasi saglanmaktadir.

Pre-füzyon RSV F polipeptitleri, nükleik asit molekülleri veya bulusa ait vektörler, RSV enfeksiyonlarinin önlenmesi (profilaksi) ve/veya tedavisi için kullanilabilir. Bazi uygulamalarda, önleme ve/veya tedavi, RSV enfeksiyonuna duyarli hasta gruplarinda hedeflenebilir. Bu hasta gruplari arasinda, bunlarla sinirli olmamak üzere, örnegin yasli yasinda, 5 1 yasinda), hastanede yatan hastalar ve antiviral bir bilesik ile tedavi edilmis, ancak yetersiz bir antiviral yanit göstermis hastalar yer alir.

Pre-füzyon RSV F polipeptitleri, nükleik asit molekülleri ve/veya bulusa göre vektörler örnegin, RSV'nin neden oldugu bir hastaligin veya durumun tek basina tedavisinde ve/veya profilaksisinde veya (mevcut veya gelecekteki) asilar, antiviral ajanlar ve/veya monoklonal antikorlar gibi diger profilaktik ve/veya terapötik tedaviler ile kombinasyon halinde kullanilabilir.

Terapötik olarak etkili bir miktar, RSV ile enfeksiyondan kaynaklanan bir hastaligi veya durumu önlemek, iyilestirmek ve/veya tedavi etmek için etkili olan bir polipeptit, nükleik asit molekülü veya vektörü anlamina gelir. Önleme, RSV'nin yayilmasini inhibe etmeyi veya azaltmayi veya RSV ile enfeksiyon ile iliskili semptomlarin bir veya daha fazlasinin baslangicini, gelismesini veya ilerlemesini inhibe etmeyi veya azaltmayi kapsar. Burada kullanildigi gibi iyilestirme, görünür veya algilanabilir hastalik semptomlarinin, vireminin veya influenza enfeksiyonunun ölçülebilir herhangi bir manifestasyonunun azaltilmasini ifade edebilir.

Insanlar gibi deneklere tatbik etmek için, bulus, bir pre-füzyon RSV F polipeptidi, bir nükleik asit molekülü ve/veya burada tarif edilen bir vektör ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici veya eksipiyan içeren farmasötik bilesimler kullanabilir. Mevcut baglamda, "farmasötik olarak kabul edilebilir" terimi, kullanilan dozajlarda ve konsantrasyonlarda, tasiyici veya eksipiyanin, uygulandiklari deneklerde istenmeyen veya zararli etkilere neden olmayacagi anlamina gelir. Bu farmasötik olarak kabul edilebilir tasiyicilar ve eksipiyanlar teknikte iyi bilinmektedir (bakiniz Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, AR Gennaro, Ed., Mack Publishing Company and L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; ve Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd edition, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]). RSV F polipeptitleri veya nükleik asit molekülleri, tercihen liyofilize edilmis preparatlarin kullanilmasi mümkün olsa da, steril bir çözelti halinde formüle edilir ve uygulanir. Steril çözeltiler, steril filtreleme veya bu konuda teknikte bilinen diger yöntemlerle hazirlanir. Çözeltiler daha sonra liyofilize edilir veya farmasötik dozaj kaplarina doldurulur. Çözeltinin pH degeri genellikle pH 3.0 ila 9.5 arasindadir, örnegin pH 5.0 ila 7.5. RSV F polipeptitleri tipik olarak uygun farmasötik olarak kabul edilebilir bir tampon içeren bir çözeltidedir ve bilesim ayrica bir tuz içerebilir. Istege bagli olarak albümin gibi stabilize edici ajan mevcut olabilir. Bazi uygulamalarda, deterjan eklenir. Bazi uygulamalarda RSV F polipeptitleri, enjekte edilebilir bir preparat halinde formüle edilebilir.

Bazi uygulamalarda, bulusa ait bir bilesim ayrica bir veya daha fazla adjuvan içerir.

Adjuvanlarin, uygulanan bir antijenik determinanta immün yanitini daha da arttirdigi bilinmektedir. "Adjuvan" ve "immün uyarici" terimleri, burada birbirinin yerine kullanilir ve immün sisteminin uyarilmasina neden olan bir veya daha fazla madde olarak tanimlanmaktadir. Bu baglamda, bir adjuvan, bulusun RSV F polipeptitlerine karsi bir immün yanitin arttirilmasi için kullanilir. Uygun adjuvanlarin örnekleri arasinda alüminyum hidroksit ve/veya alüminyum fosfat gibi alüminyum tuzlari; MF59 gibi skualen-su emülsiyonlari dahil olmak üzere yag emülsiyon bilesimleri (veya su içinde Kompleksler (ISCOMS) gibi saponin formülasyonlari (bakiniz örnegin, US 5,057,540; monofosforil lipit A (MPL), 3-O-deasile MPL (3dMPL), oligonükleotitler içeren CpG- motif, ADP-ribosillestirici bakteriyel toksinler veya bunlarin mutantlari gibi bakteriyel veya mikrobiyal türevler, örnegin E. coli isiya dayanikli enterotoksin LT gibi kolera toksin CT ve benzerleri; ökaryotik proteinler (örnegin antikorlari veya bunlarin fragmanlari (örnegin, antijenin kendisine veya CD1a, CD3, CD?, CD80'e yönelik) ve alici hücrelerle etkilesime girdiginde immün yanitini uyaran reseptörler ve Iigandlar (örnegin CD40L, GMCSF, GCSF, vb.) bulunur. Bazi uygulamalarda, bulusun konsantrasyonlari, örnegin, alüminyum hidroksit, alüminyum fosfat, alüminyum potasyum fosfat veya bunlarin kombinasyonlari halinde bir adjuvan olarak alüminyum Pre-füzyon RSV F polipeptitleri ayrica örnegin, polimerler, lipozomlar, virozomlar, virüs benzeri parçaciklar gibi nanopartikülleri ile kombinasyon halinde veya konjüge olarak uygulanabilir. Pre-füzyon F polipeptitleri, adjuvan ile veya adjuvan olmadan nanopartiküller ile kombine edilebilir, enkapsüle edilebilir veya konjüge edilebilir.

Lipozomlar içinde enkapsülasyon, örnegin, US 4,235,877'de açiklanmaktadir. açiklanmaktadir.

Diger uygulamalarda, bilesimler adjuvan içermez.

Bazi uygulamalarda bulus, solunum sinsitiyal virüse (RSV) karsi bir asi yapmak için yöntemler sunar, bulusa göre bir bilesim saglanmasi ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir bilesim halinde formüle edilmesini içerir. "Asi" terimi, belirli bir patojene veya hastaliga karsi bir denekte belirli bir immünite derecesini indüklemek için etkili bir aktif bilesen içeren bir ajani veya bilesimi belirtir, bu, patojen veya hastalik tarafindan enfeksiyonla iliskili semptomlarin siddeti, süresi veya diger manifestasyonlarinin en azindan azalmasina (tamamen yokluguna kadar) yol açar. Mevcut bulusta asi, RSV'nin F proteinine karsi immün yanitina neden olan etkili bir miktarda bir pre-füzyon RSV F polipeptidini ve/veya bir pre-füzyon RSV F polipeptidini kodlayan bir nükleik asit molekülünü ve/veya bahsedilen nükleik asit molekülünü içeren bir vektörü içerir. Bu, hastaneye yatisa yol açan siddetli alt solunum yolu hastaliginin önlenmesi ve RSV enfeksiyonu ve bir denekte replikasyon nedeniyle pnömoni ve bronsiyolit gibi komplikasyonlarin sikliginin azaltilmasi için bir yöntem saglanmaktadir. Bulusa göre olarak kabul edilebilir bir seyreltici, tasiyici veya eksipiyan içerir. Baska aktif içerik maddeleri içerebilir veya içermeyebilir. Bazi uygulamalarda, örnegin diger RSV proteinlerine karsi ve/veya diger bulasici ajanlara karsi bir immün yanitini indükleyen baska bilesenler de içeren bir kombinasyon asi olabilir. Diger aktif bilesenlerin uygulanmasi, örnegin ayri uygulamalarla veya bulusa ait asilarin ve diger aktif bilesenlerin kombinasyon ürünlerinin uygulanmasiyla yapilabilir.

Bilesimler bir denege, örnegin bir insan denege uygulanabilir. Tek bir uygulama için bir bilesimdeki RSV F polipeptitlerinin toplam dozu, örnegin yaklasik 0.01 pg ila yaklasik mg, örnegin, 1 pg - 1 mg, ömegin 10 ug - 100 ug olabilir. Önerilen dozun belirlenmesi deney yoluyla gerçeklestirilecektir ve teknikte uzman kisiler için rutindir.

Bulusa göre olan bilesimlerin uygulamasi standart uygulama yollari kullanilarak gerçeklestirilebilir. Sinirlayici olmayan uygulamalar, intradermal, intramüsküler, subkütan, transkütan veya mukozal uygulama gibi parenteral uygulamayi, örnegin intranazal, oral ve benzerlerini içerir. Bir uygulamada, bir bilesim intramüsküler enjeksiyonla uygulanir. Teknikte uzman kisi, bir bilesimi, örnegin asidaki antijen(ler)e karsi bir immün tepkisi saglamak için bir asiyi uygulamak için çesitli olasiliklari bilir.

Burada kullanilan bir denek tercihen bir memelidir, örnegin bir kemirgen, örnegin bir fare, bir pamuk siçani veya insan olmayan bir primat veya bir insandir. Tercihen, denek bir insan denektir.

Polipeptitler, nükleik asit molekülleri, vektörler ve/veya bilesimler, ayni zamanda bir homolog veya heterolog birincil destek rejiminde birincil veya destek olarak da uygulanabilir. Eger bir destekleme asilama yapilirsa, tipik olarak, böyle bir destekleme asilama, bileseni denege ilk kez uyguladiktan sonra (bu tür durumlarda 'birincil asilama' olarak adlandirilir) ayni denege bir hafta ile bir yil, tercihen iki hafta ile dört ay arasinda bir sürede uygulanir. Bazi uygulamalarda, uygulama bir birincil ve en az bir destekleyici uygulama içerir.

Ek olarak, bulusun polipeptitleri, örnegin bir bireyin immün durumunu test etmek için, örnegin bulusun polipeptidine baglanabilen bu tür bir bireyin serumunda antikor olup olmadigini tespit ederek teshis araci olarak kullanilabilir. Bu nedenle bulus ayrica, bir hastada bir RSV enfeksiyonunun varliginin tespit edilmesi için bir in vitro diagnostik yöntemle de ilgilidir, bahsedilen yöntem bu adimlari içerir 8) bahsedilen hastadan elde edilen bir biyolojik numunenin, bulusa göre bir polipeptit ile temas ettirilmesi; ve b) antikor-polipeptit komplekslerinin varliginin tespit edilmesi. Örnekler Stabil pre-füzyon RSV F polipeptitlerinin - baglayicilar ve trimerizasyon domenlerinin preparasyonu Mevcut bulusa yol açan arastirmada, çözünür pre-füzyon F proteininin (sF) atabilize edilmis varyantlari yeniden katlamayi baslatan iki ana bölge stabilize edilerek tasarlandi. Birinci strateji, füzyon peptidini konumunda tutmak ve F1-F2 domenlerini kisa bir döngü ile sabitleyerek ve birlestirerek kafa bölgesinden salinmasini önlemekti.

Füzyon peptidinin salinimi, F1'in N-terminusu ila F2'nin C-terminusu arasinda bir kovalent baglantinin yeniden kurulmasiyla önlenebilir. Bu örnekte gösterildigi gibi, birkaç farkli baglayici denenmistir. F1 ve F2 arasina, özellikle GSGSG amino asit olmustur. Bu baglayici, bir 3D yapisinin yayinlandigi parainfluenza tip 5'in F dizisi ile dizi hizalamasina dayanarak RSV-F tip A2 için olusturulan bir 3D homoloji modelinde ölçülen mesafelere dayanarak tasarlandi (Yin et al., 2006). .. 1:. . . _._ . _ _ ._ . ..

HRSV tip A ve B'nin F dizisi ile pre-füzyon RSV-F'nin homoloji modelini olusturmak için kullanilan PIV5 (üst dizi) arasinda hizalama Diger stabil olmayan bölge, pre-füzyon F proteininde trimerik helisel kök bölgesini olusturan ikinci heptad tekrar (HRB) bölgesidir. Çözünür F proteininde transmembran domeninin (TM) delesyonu, farkli heterolog trimerizasyon domenlerinin eklenmesiyle dengelenen bu bölgeyi daha da destabilize eder. Tamamen islenmis matür RSV-F ektodomen C-terminal olarak farkli trimerizasyon domenlerine ve farkli pozisyonlarda kaynasmistir (diger bir deyisle, F1 domeninin farkli amino asit kalintilarinda tepesi kesilmistir).

RSV A2 veya Bi suslari bazinda çesitli yapilar yapildi. Farkli trimerizasyon domenleri, farkli pozisyonlarda tepesi kesilen RSV F1 domenine baglandi. Test edilen trimerizasyon domenleri, Fibritin motifini (amino asit dizisi: GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 4) içeren) ve daha uzun, N- terminal uzatilmis Fibritin domeni olan “Fibritin uzunlugunda” motifi içerir, bu da dogal helisel bölgelerini içerir (amino asit dizisi: SSLQGDVQALQEAGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 6) içerir) ve HRV bölgesinin varsayilan heptad tekrari ile çerçevedeki (kayitli) RSV F1 domenine eklenmistir.

Yapilan diger yapilar, heptad ideal helisel trimerik kivrimli spiraller veya Izolösin içermekte olup, amino asit dizisi: IEAIEKK (SEQ. ID NO: 7) içermektedir. Bulusa göre amino asit dizisini içeren Izolösin Fermuar (L) olarak adlandirilan, farkli IZ domenleri kullanilmistir: (I) EKKIEAIEKKIEAIEKKIEAIEAIEKKIEA (SEQ ID NO: 8) ve amino asit dizisi EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (SEQ ID NO: 3) içeren Izolösin Fermuar (8).

Bu IZ domenleri yapi olarak GCN4 ile karsilastirilabilir, ancak, IZ domenler dogal diziler degildir, fakat optimal trimerizasyon domenleri olarak ve bu nedenle daha stabil olacak sekilde tasarlanmistir.

Diger bilinen trimerizasyon domenleri ile baska yapilar yapilmistir: EDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEA (SEQ ID NO: 9) Optimize GCN4" EDKVEELLSKIYHIENRIARIEKLVGEA (SEQ ID NO: 10) Matrilin -1 (uzun versiyon) EEDPCECKSIVKFQTKVEELINTLQQKLEAVAKRIEALENKII (SEQ ID Matrillin- 1 sadece fermuar domenini içeren kisa versiyon: EELINTLQQKLEAVAKRIEALENKIl (SEQ ID NO: 12) Asagidaki yapilar, yapilmistir: Yapi F18, F1 domeninin amino asit kalintisi 513'e bagli Fibritin trimerizasyon domenin, (SEQ ID NO: 4) içermektedir.

Yapi F19, F1 domeninin amino asit kalintisi 499'a bagli Fibritin trimerizasyon domenini (SEQ ID NO: 4) içermektedir.

Yapi F20, F1 domeninin amino asit kalintisi 516'ya bagli ve heptad pozisyonlarinin hidrofobik yapisini optimize etmek ve IZ domeni ile çerçeve içi füzyonunu kolaylastirmak için HRB'de ilave modifikasyonlar içeren Yapi F21 ayni zamanda Izolösin Fermuar (L) domenini (SEO ID NO: 8) de içerir, ancak F1 domeninin amino asit kalintisi 501'e baglanir ve HRB bölgesinde ilave modifikasyonlar içermez.

Yapi F22, F1 domeninin amino asit kalintisi 495'e bagli ve HRB'de ilave modifikasyonlar içeren Izolösin Fermuar (L) domenini (SEO ID NO: 8) içermektedir.

Yapi F23, amino asit kalintisi 495'e bagli Izolösin Fermuar (S) bölgesini (SEO ID NO: 3) içermektedir.

Yapi F46 ayrica Izolösin Fermuar (S) domenini (SEO ID NO: 3) de içermektedir, ancak daha uzun bir RSV-F ektodomen ile baglidir, diger bir deyisle F1 domeni amino asit kalintisi 513'ten sonra tepesi kesilmistir. Bütün yapilar bir HIS- etiket içermektedir.

Yapilar, ekspresyon seviyeleri, depolama stabilitesi ve antikor CR9501 ile baglanma açisindan test edildi. Agir ve hafif zincir degisken bölgelerinin ve bu antikorun agir ve hafif zincir CDR'Ierinin amino asit dizileri asagida verilmistir. CR9501, Yapilar, Gene Art'ta (Life Technologies, Carlsbad, CA) sentezlendi ve kodori optimizasyonu yapildi. Yapilar, pCDNA2004'e klonlandi veya alana yönelik mutajenez ve PCR içeren sahada yaygin olarak bilinen standart yöntemler ile üretildi ve dizildi.

Kullanilan ekspresyon platformu 293Freestyle hücreleridir (Life Technologies).

Hücreler, üreticinin talimatlarina göre 293Fectin (Life Technologies) kullanilarak geçici olarak transfekte edildi ve 5 gün boyunca 37°C'de ve %10 COz'de kültürlendi. Kültür süpernatanti toplandi ve hücreleri ve hücresel artiklari uzaklastirmak için 300 9'de 5 dakika boyunca hasat edildi. Egrilmis süpernatant daha sonra bir 0.22 um vakum filtresi kullanilarak steril olarak filtre edildi ve kullanima kadar 4°C'de depolandi. . günden itibaren süpernatantlar, RSV F antikoru Motavizumab'in (CR9503 olarak adlandirilir) agir ve hafif zincir degisken bölgelerini içeren monoklonal antikor CR9503 kullanilarak western blot tarafindan F proteini ekspresyonu için degerlendirildi. Pre- füzyon RSV F protein yapilarinin yaklasik ekspresyon seviyeleri, CR9503, bir anti- insan IR-boya konjuge sekonder antikor (Li-Cor, Lincoln, NE) veya bir HRP konjuge fare anti-insan IgG (Jackson ImmunoResearCh, West Grove, PA) kullanilarak degerlendirildi. Protein miktarlari daha sonra, seyreltilmis bir seri saflastirilmis RSV standart proteini kullanarak, gözle veya Odyssey CLx kizilötesi görüntüleme sistemi kullanilarak hesaplandi. Alternatif olarak, Süpernatantlardaki protein konsantrasyonunu ölçmek için Kantitatif Oktet (BioLayer lnterferometry) kullanilmistir. Yapi stabilitesini degerlendirmek ve eklenen trimerizasyon motiflerinin pozitif veya negatif stabilize edici etkilerini tanimlamak için, CR9501'i baglayabilen yapilar, CR9501 epitopunun stabilitesini test etmek için 45-65°C arasindaki bir sicaklikta 30 dakika islemden geçirildi. Bu prosedür Örnek 8'de ayrintili olarak açiklanmaktadir. Sonuçlar Tablo 1'de özetlenmistir.

Tablo 1. Farkli trimerizasyon motifleri ile RSV F yapilarinin ekspresyonu ve stabilitesi RSV Açiklama Stabilite* Proteini Trimerizasyon Modifikasyonlar Sonlanma Ekspresyon motifi Noktasi (uglml) Stabil F18 Fibritin Yok 513 2 degil F19 Fibritin Yok 499 O ND Izolösin Izolösin F21 fermuari (L) Yok 501 O ND Izolösin Izolösin F23 fermuari (8) Yok 495 0.3 1 stabil Izolösin Eksprese F46 fermuari (8) Yok 513 edilmesi ND * Stabilite, Örnek 7'de tarif edildigi gibi belirlenir; ND: belirlenmemistir. 1 Örnek 1'de açiklandigi gibi ekspresyon seviyesi Western Blot tarafindan belirlendi.

Tablo 1'de görülebilecegi gibi, eksprese edilen yapilar sadece Fibritin varyanti (F18) ve F23'tür. F18, trimerik olmasina ve ekspresyon göstermesine ragmen. 4°C'de depolandiginda stabil degildi. Aksine, F23, 4°C'de stabildi, pre-füzyon spesifik antikorlara baglanmakta, ancak monomerik görünüyordu. Bu nedenle, hem stabilite hem de trimerizasyonu optimize etmek için hem F18 hem de F23 varyantlari kullanilmistir.

Daha sonra, F1'in N-terminusundaki füzyon peptidinin F2 domeninin C-terminusuna füzyon ile sabitlendigi birkaç yapi yapilmistir. Tüm yapilar bir His-etiket içeriyordu.

Her iki furin bölünme alaninin mutasyona ugradigi ve p27 peptitini (diger bir deyisle F12, F15.1 ve F1?) içeren çözünür bir F proteini ile sonuçlanan yapilar da dahil olmak üzere çesitli yapilar yapilmistir. Diger yapilarda, öncü FO'dan bölünen 27 kalinti bölgesi (P27 döngüsü), alternatif bir kapali döngü veya baglama dizisi ile degistirildi: RSV-F bölgesini, basariyla üretilmis ve kristalize edilmis prefüzyon F proteini (F25) olan PIV- 5F'yi 'homolog' bölgesi ile degistirerek veya bölgeyi F2 ve F1 (F24) terminalini köprüleyen minimal (GS)n döngüsüyle degistirerek veya bölgeyi merkezi konservasyon RSV-G (F26) ile bölgesi degistirerek. PIV-5'e ve in sili'co ölçümlerine dayanan RSV- F'nin homoloji modellemesi, kalintilar 108 ve 136 arasindaki minimum 5 amino asit kalintisi döngüsünün seçimiyle sonuçlandi. Bir baglayici olarak Gly (G) ve Ser (S) kalintilari seçildi, bunlar esnek ve polardir ve uyum saglama sansi yüksektir (F24). Ek olarak, F137, S'ye mutasyona ugradi çünkü döngünün neden oldugu lokal modifikasyonlar hidrofobik F'nin yerini alabilir ve stabil olmayan durumlara neden olabilir. Bu asagida gösterilmistir. Ayrica R106, Q'ya mutasyona ugrar ve 27 kalinti (109-135) GSGSG ile degistirilir.

= "QR-'H::REAPQYMNYTINTTIQILNVSISKKRKRî-l; F r=" Tablo 2'de gösterildigi gibi, tüm varyantlar, dogal sus RSV F yapisina kiyasla, diger bir deyisle bahsedilen baglayici olmadan (F11) benzer bir yapiya kiyasla çok daha yüksek bir ekspresyon (44 ug/ml), sergileyen kisa GSGSG döngüsüne (F24) sahip varyant haricinde, hiç ekspresyon göstermedi veya çok düsük ekspresyon gösterdi. Bununla birlikte, trimerik olan F24, bir C-terminali Fibritin trimerizasyon motifine sahip diger bütün varyantlar gibi depolandiginda stabil degildi. Tüm varyantlar bir HIS-etiket içeriyordu.

Tablo 2. Farkli F1-F2 baglayicilari ile RSV F yapilarinin ekspresyonu ve stabilitesi RSV Varya Açiklama Stabilit Pr°t9i "t Trimerizas F1, F2 Modifikasyo Sonlandir Ekspresy e* ni yon motifi baglayici nlar ma on noktasi (uglml) F11 B1 Yok Yok Yok 513 2.5 stabil stabil F18 B1 Fibritin Yok Yok 513 2 degil Furin alani stabil Furin alani Furin alani F1?' A2 Fibritin p27 KO 513 0 ND Q_GSGS stabil F24 B1 Fibritin G_S Yok 513 44 degil F25 B1 Fibritin PIV Yok 513 0 ND F26 B1 Fibritin G CR Yok 513 0 ND * Stabilite, Örnek 7'de tarif edildigi gibi belirlenir. Ekspresyon seviyesi Örnek 1'de tarif edildigi gibi belirlenir.

Daha sonra, en uygun modifikasyonlar, optimal pre-füzyon F polipeptitlerini bulmak için birlestirildi. GSGSG döngüsü, F1'in C-terminali tepe kesilmesi ve fibritin (SEQ ID NO: eklenmesiyle varyantlardan olusan kombinasyonlar yapilir (bakiniz Tablo 3).

Tablo 3. Tablo 1 ve 2'ye göre optimizasyon kombinasyonlari ile RSV F yapilarinin ekspresyonu ve stabilitesi.

RSV Varyant Terminasyon Açiklama Stabilite Proteini noktasi CR9501 epitop) ND, belirlenmemistir Trimerizasyon Izolösin fermuari (S) Fibritin Fibritin Fibritin Izolösin fermuari (S) Izolösin fermuari (S) Izolösin fermuari (S) Izolösin fermuari (8) F1, F2 baglayici * Depolama stabilitesi Örnek 7'de tarif edildigi gibi belirlenir. * Isi stabilitesi Örnek 8'de tarif edildigi gibi belirlenir. Ekspresyon seviyesi Western blotlama ile belirlenmistir (Örnek 1'de tarif edilmistir).

Depolama Stabil Stabil Stabil degil Stabil Stabil Stabil Stabil Stabil Stabil degil Stabil Stabil GSGSG-döngüsünün eklenmesi, fonksiyonel yapilarin ekspresyonunu ve ayrica proteinin isi stabilitesini her zaman arttirdi. GSGSG-döngüsünün tepesi kesilmis F ve izolösin fermuar (S) motifi (F43, F47) ile birlestirilmesi, 4 °C'de saklandiginda iyi ekspresyon, isi stabilitesi ve iyi stabilite gösterdi. Ancak, bu degiskenler hala monomerikti. Izolösin fermuar (S) trimerizasyon motifi, 495 pozisyonunda C-terminal olarak F tepesi kesik olan bir F varyanti ile daha yüksek ekspresyon sergilemistir (F43 ile F56 ve F23 ile F46 karsilastirma). Buna karsilik, Fibritin trimerizasyon domeni olan varyantlar için, 513 pozisyonunda bir tepe kesilmesi. hiçbir ekspresyon göstermeyen 495 pozisyonundaki tepe kesilmesine kiyasla yüksek ekspresyon sergiledi (F24 ile F44 karsilastirma).

HIS-etiket, trimerlerin dogal katlanmasini engelleyebildigi için, Fibritin ve izolösin fermuar (S) varyanti için HIS-etiket olmadan çesitler yapildi (Tablo 4).

Tablo 4. HIS-etiket olan ve olmayan RSV F yapilarinin ekspresyonu ve stabilitesi RSV Vary Trimeriza F1,F2 Termina Ekspre Trimeriza Isi Depol Etike Prot ant syon baglayici syon syon syon % (°C ama tler eini motifi noktasi ug/ml ) Q_GSG Trimerik stabil His- F24 B1 Fibritin SG_S 51 degil etiket Q_GSG %100 stabil Yok F24- B1 Fibritin SG_S ND degil izolösin %0 His- F47 A2 (S) SG_S 495 5 ) 52 stabil izolösin %2-5 Yok fermuari Q_GSG (Odyssey A2_F Q_GSG Trimerik 48, stabil Yok 24 A2 Fibritin SG_S 513 75 degil * Depolama stabilitesi Örnek 7'de tarif edildigi gibi belirlenir. Isi stabilitesi Örnek 8'de tarif edildigi gibi belirlenir; ND: belirlenmemistir.

Dikkat çekici bir sekilde, HIS-etiketinin delesyonu F47'de ekspresyonu arttirdi. Dahasi, F4? için trimerik içerigi biraz arttirdi ve F24 için sadece ekspresyon Seviyesini orta derecede arttirdi.

Daha sonra, birkaç alternatif trimerizasyon domeni ve tepe kesilmesi GSGSG-döngü stabilize F varyanti (F47) ile kombinasyon halinde test edildi (bakiniz Tablo 5). Tüm degiskenler bir GSGSG döngüsüne sahiptir ve bir HIS-etiket içerir.

Tablo 5. Alternatif trimerizasyon domenine sahip RSV F varyantlarinin ekspresyonu ve stabilitesi.

RSV Vary Açiklama Trimerizas Antikor Proteini ant yon % baglama Trimerizas Modifikasy Sonlan Ekspres CR95 CR95 yon motifi onlar ma yon 01 03 noktasi (ug/ml) Izolösin fermuari F47 A2 (8) Yok 495 5 0% + + Izolösin fermuari Matrillin hekzamerl Matrillin Matrillin Mat3 A2 kisa Yok 495 1,5 ND - - opt GCN GCN4II A2 optimize Yok 516 0 ND - - Antikor baglanmasi, hasat gününde baglanma olarak RSV Vary Açiklama Trimerizas Antikor Proteini ant yon % baglama Trimerizas Modifikasy Sonlan Ekspres CR95 CR95 yon motifi onlar ma yon 01 03 noktasi (ug/ml) tanimlanir (Örnek 7'de tarif edildigi gibi; + baglanma anlamina gelir; - baglanma olmadigi anlamina gelir.

Ekspresyon seviyesi, Örnek 1'de tarif edildigi gibi belirlenir.

ND: belirlenmemistir Hem N-terminal fermuar domenini hem de potansiyel olarak sistein kalintilarini içeren C-terminal bölümünü içeren sadece matrilin 1 domeninin (Dames-SA et al., Nat. Struc.

Biol., 5 (8), 1998) inter trimerik disülfit köprülerinin, F47'den daha yüksek ekspresyon seviyelerini mümkün kildigi bulundu (Tablo 5, Matrillin uzun). Ayrica, Matrillin uzun trimerizasyon motifine sahip varyant, trimerik F proteinlerini gösterir. Bununla birlikte, ürün pre-füzyon spesifik Mab CR9501'e baglanmadi ve ayrica Matrillin 1 trimerizasyon domenini trimerik dogal F proteini üretimi için uygun olmayan hale getiren heksamerik türler gösterdi. Matrillin bazli veya GCN4II bazli fermuar motiflerinin hiçbiri, F47'ye göre daha fazla ekspresyon veya stabilite göstermedi (Tablo 5, Matrillin kisa, GCN4II optimize edilmis). Yine, 495'teki tepe kesilmesi, daha yüksek ekspresyon seviyelerine neden olur. Optimize edilmis bir tetikleyici dizi içeren bir GCN4 motifinin eklenmesi, hiçbir ekspresyon göstermedi.

GCN4 II, parainfluenza tip 5'in pre-füzyon trimerini stabilize etmek Için basariyla RSV pre-füzyon Finin stabilizasyonu için digerleri tarafindan denenmistir (örnegin gibi). GCN4|I trimerizasyon domeni degerlendirildi ve Izolösin Fermuar (S) domenini (SEQ ID NO: 3) veya Fibritin (SEO ID NO: 4) domenini içeren yapilar ile karsilastirildi (Tablo 6'de gösterilen sonuçlar). Bu varyantlar ayni zamanda baska modifikasyonlar, diger bir deyisle tek bir Lizin ve L512K mutasyonuna dayanan kisa bir baglayici ile de karsilastirildi. Tüm varyantlar bir HIS-etiket içeriyordu.

Tablo 6. GCN4II, L512K ve p27 replasmanli RSV F varyantlarinin ekspresyonu ve RSV Vary Prote ant F18 B1 F24 B1 F43 B1 F42 B1 stabilitesi (F1 ve F2 arasindaki tek amino asit baglayici (K)) Trimeriza Fibritin Fibritin Izolösin fermuari Izolösin fermuari F1, F2 baglayici Açiklama Modifikasy Sonlandi Ekspres Isi 8502T L512K L512K L512K L512K L512K Noktasi Depolama stabilitesi Örnek 7'de tarif edildigi gibi Stabilite Depola N stabil D degil stabil 51 degil 53 stabil 54 stabil 54 stabil RSV Vary Açiklama Stabilite Pmte am Trimeriza F1,F2 Modifikasy Sonlandi Ekspres Isi Depola ini syon baglayici onlar rma yon (° ma* motifi Noktasi (uglml) C) belirlenir; Ekspresyon seviyeleri Örnek 1'de tarif edildigi gibi belirlenir; Isi stabilitesi Örnek 8'de tarif edildigi gibi belirlenir; ND: belirlenmemistir.

F1 ve F2 arasindaki kisa baglanti GSGSG döngüsüyle karsilastirilabilir görünmektedir. dizisi veya RSV B1 F dizisi) hiçbirinde herhangi bir F proteini ekspresyonu ile sonuçlanmaz.

Bulusa göre, bu iki tip modifikasyonun dahil edilmesinin, diger bir deyisle bir baglama dizisinin ve heterolog trimerizasyon domeninin dahil edilmesinin, stabil trimerik pre- füzyon F proteininin ekspresyonunu saglamak için yeterli olmadigi gösterilmistir.

Stabilize edilen iki ana stabilize olmayan bölgenin yani sira, diger bir deyisle, yukarida tarif edildigi gibi HRB ve füzyon peptiti disinda, pre-füzyon F proteinindeki diger bölgeler de post-füzyon F'ye dramatik yeniden katlanmaya katkida bulunur ve/veya bunlara uyum saglanmaktadir ve dizide yer alan daha fazla pozisyon, pre-füzyon F proteininin yeniden katlanmasini durdurmak için optimize edilebilir. Bu nedenle, HRA ve HRB domeninde ve pre-füzyon F'de bu bölgelere temas eden tüm domenlerde farkli amino asit kalintilari, asagidaki Örneklerde tarif edildigi gibi pre-füzyon yapi stabilitesini arttirmak için mutasyona tabi tutulmustur.

Stabil pre-füzyon RSV F polipeptitlerinin preparasyonu - stabilize edici mutasyonlar Trimerik içerik (F47 yapisi için) ve depolama stabilitesi (F24 yapisi için) optimal olmadigindan, ekspresyon seviyelerini, stabiliteyi ve dogal trimerik yapiyi arttirmak için nokta mutasyonlarini içeren baska varyantlar yapildi. Sonuçlar Tablo 7 ve 8'de gösterilmistir.

Tablo 7. F47'nin ekspresyonu ve stabilitesi - varyantlar RSV Proteini Ekspresyon (ug/ml) Trimerizasyon % Isi (°C) F47- 10 %2-5 53 F47- + K465E 6 %2.4 ND F47-+ K176M 13 %5 ND ND: belirlenmemistir; Ekpresyon seviyesi, Örnek 1'de tarif edildigi gibi belirlenir. Isi stabilitesi Örnek 8'de tarif edildigi gibi belirlenir.

Dogal sus dizisine göre mutasyonlarin isimlendirilmesi (SEQ ID NO: 1).

Tüm yapilar F47-: tip A2, Izolösin Fermuar (S) motifi (SEO ID NO: 3), GSGSG baglayici; sonlandirma noktasi vartanylardir.

Tablo 7'de gösterildigi gibi, birçok mutasyon F47- ekspresyonunu arttirmistir, ancak sadece F47_S46G varyanti ayrica yüksek ekspresyonun yani sira daha yüksek seviyede trimerler göstermistir.

Tablo 8, F24 varyantlarinin ekspresyon ve stabilitesinin sonuçlarini göstermektedir.

Tüm varyantlar, fibritin motifli GSGSG baglayici ile RSV tip A2 idi; sonlandirma noktasi 513, HIS-etiket bulunmamaktadir.

Tablo 8. A2_F24- (SEQ ID NO: 19) varyantlarinin ekspresyonu ve stabilitesi Ekspresyon Depolama RSV Proteini (ug/ml) Uç nokta Birlesme fazi A2_F24 5,3 69 ND A2_F24 K498E 1,7 ND ND A2_F24 E487K 7,1 ND ND A2_F24 D479N 5,2 ND ND A2_F24 E472Q 1,9 ND ND A2_F24 E472K 0,9 ND ND RSV Proteini A2_F24 E463K A2_F24 E463Q A2_F24 G4308 A2_F24 N428R A2_F24 N426$ A2_F24 K421 N A2_F24 E328K A2_F24 T3118 A2_F24I309V A2_F24 D269V A2_F24 8215P* A2_F24 K2090 A2_F24 V207P A2_F24I206P A2_F24 L204P A2_F24 L203P A2_F24 QZO2P A2_F24 K201Q A2_F24 D194P A2_F24 L193P A2_F24 V192P A2_F24 V185N A2_F24 GV184EG A2_F24 G184N Ekspresyon Depolama Uç nokta Birlesme fazi 99 Stabil Ekspresyon Depolama RSV Proteini (ug/ml) Uç nokta Birlesme fazi A2_F24 A177P 2,0 ND ND A2_F24 K176E 0,7 ND ND A2_F24 S169P 0,5 ND ND A2_F24 K168P 0,1 ND ND A2_F24 V157P 0,2 ND ND A2_F24 K85E 1,1 ND ND A2_F24 K77E 22,4 ND ND A2_F24l57V ND ND *isaretli yapilar trimerizasyon için test edildi ve hepsinin trimerik oldugu bulundu Ekspresyon seviyesi Örnek 1'de tarif edildigi gibi belirlenir. Uç nokta stabilitesi, 1. güne göre 4 °C'de 5 günlük depolamadan sonra pre-füzyon antikor baglanmasinin (CR9501) yüzdesi olarak gösterilir; Birlesme faz stabilitesi, Örnek 9'de tarif edildigi gibi belirlenir.

Birçok mutasyon A2_F24- ekspresyonunu arttirdi. Çogu mutasyon için, F47- alt yapisinda (Tablo 7) ve A2_F24- alt yapisinda (Tablo 8) gelismis ekspresyon arasinda belirgin bir korelasyon vardi. N67I, A2_F24 alt yapisinda F ekspresyonu üzerinde daha olumlu etkiye sahipti. Ekspresyondaki en önemli artis, tek nokta mutasyonlari ile elde kullanildigi ilk taramada (Örnek 7), en yüksek ekspresyona sahip varyantlar, depolama N67I). Bu mutasyonlarin gerçekten de pre-füzyon konformasyonunu stabilize edip etmedigini degerlendirmek için kültür süpernatantlari, kantitatif western sonuçlarina dayanarak 5 ve 10 ug/ml'ye seyreltildi ve bunlar, 4 “C'de 33 güne kadar saklandi. Tek noktali mutantlar olarak sadece N67l ve 8215P zamana göre tamamen stabildir (bakiniz Örnek 9).

Daha sonra, pre-füzyon konformasyonun yüksek ekspresyonu ve iyi stabilitesi gösteren birçok mutasyon, stabilizasyonlarin katki maddesi olup olmadigini veya olasi bir sinerjistik etkiye sahip olup olmadigini degerlendirmek için kombine edildi (Tablo 9).

Tablo 9. Iki ek mutasyonla A2_F24 varyantlarinin ekspresyonu ve stabilitesi.

RSV Proteini Ekspresyon (ug/ml) stabilite* Depolama stabilitesi, örnek 9'da gösterilen birlesme fazi analizini belirtir.

Ekspresyon seviyesi Örnek 1'de tarif edildigi gibi belirlenir.

Tüm varyantlar F24- varyantlaridir: A2 tipi, fibritin motifi, GSGSG baglayici; sonlandirma noktasi 513, tüm Mab'lere baglanma, HIS-etiket bulunmaz (SEQ ID NO: Önceden tanimlanmis nokta mutasyonlari birlestirildiginde, özellikle en güçlü olarak N67I içeren kombinasyonlarla ekspresyon seviyeleri açisindan çok ilginç sinerjistik etkiler gözlendi. Hem N67I hem de 8215P'nin dahil edildigi çift mutantlarin tümü, 4°C'de 30 günden fazla depolanmadan sonra stabildi (Örnek 9). Çarpici sekilde, N67l mutasyonunun, çift mutantlara dahil edildiginde pre-füzyon F ekspresyon seviyeleri üzerinde en güçlü etkiye sahip oldugu bulundu. Daha sonra, 8215P mutasyonlari ile kombinasyonlar makul bir ekspresyonla sonuçlandi. N67I'in 8215P ile kombinasyonlari, çok yüksek bir ekspresyon seviyesine yol açtigindan ve her iki nokta mutasyonunun depolandiginda sabit kalmasi nedeniyle seçildi. Ek olarak, hem N67I hem de 8215P'nin, tek mutasyonlar olarak stabil olmadiklari gözlenmistir, bu da, bu iki mutasyonun bulundugu bölgenin, proteinin, post-füzyon konformasyona geçiste yasadigi konformasyon degisimi için önemli oldugunu göstermektedir.

Bu nedenle, bulusa göre, en azindan bazi mutasyonlarin artmis ekspresyon seviyelerine ve artmis pre-füzyon RSV proteininin stabilizasyonuna yol açtigi gösterilmistir. Bu fenomenlerin baglantili olmasi beklenir. Bu Örnekte açiklanan mutasyonlarin tümü, pre-füzyon F polipeptitlerin üretiminin artmasina neden olmustur.

Bu polipeptitlerin sadece bir bölümü uzun depolamada sabit kalmistir (bakiniz Örnek 9). Kullanilan stabilite analizi, bir pre-füzyon F proteininin üstündeki pre-füzyon spesifik CR9501 epitopunun bir baglama analizinde kaybina dayanir ve tüm proteinin stabilitesine olan bütün katkilari ölçecek kadar hassas olmayabilir. Bu nedenle, sadece arttirilmis ekspresyonun gözlemlendigi mutasyon (büyük bir olasilikla stabilize eden), yüksek stabilite ve yüksek ekspresyon seviyelerine sahip bir pre-füzyon F yapisi elde etmek için diger stabilize edici mutasyonlarla kombine edilebilecek potansiyel mutasyonlard ir.

Daha sonra, tek mutasyonlar gibi N67I-S215P çift mutasyonunun, tek mutantlar olarak kullanilan kritere göre stabil olmadigi kabul edilen nokta mutasyonlari stabilize edip edemedigi dogrulandi. Ekstra mutasyonlar, Tablo 8'e göre uygun ekspresyon seviyeleri ve stabiliteye göre seçildi. Üçlü mutant RSV-F varyantlari yapildi ve ekspresyon seviyeleri ve stabilite için test edildi (Tablo 10).

Tablo 10. F24_N67I + S215P varyantlarinin bir ek mutasyonla ekpresyonu ve stabilitesi RSV Proteini Ekspresyon (ug/ml) stabilite* baglayici; sonlandirma noktasi 513, tüm Mab'lere baglanma, HIS-etiket içermeyen (SEO ID NO: 21) varyantlardir. * stabilite, örnek 9'da gösterilen birlesme fazi analizini ifade eder. + 5 gün sonra < %10 CR9501 baglanma kaybi anlamina gelir; ++, 5 gün sonra < %5 CR9501 baglanma kaybi anlamina gelir; +++ 5 gün sonra %0 CR9501 baglanma kaybi anlamina gelir.

Yine, ekspresyon seviyeleri üzerinde ilave bir etki gözlendi. Beklendigi gibi, D479N ve E487R üçlü mutantlar biraz daha düsük seviyelerde eksprese olur, çünkü tek mutantlar ayrica seçilen mutasyonlarin en düsükleri arasindadir (Tablo 8). N67I + 8215P mutasyonunun stabilize edici etkisinden dolayi, tek mutantlar olarak stabil olmayan olan ek mutasyonlar, A2_F24 N67I + 8215P alt yapiya eklendiklerinde stabil pre- füzyon F varyantlarina yol açmistir. Bazi çok açiklayici örnekler, tek mutantlar (Tablo 8) olarak yüksek ekspresyon ancak düsük stabilite sergileyen ancak A2_F24 N67I+S215P alt yapisina eklendiginde daha yüksek ekspresyon sergileyen ve daha stabil olan ilave V185N, G184N veya E487N içeren üçlü mutantlardir.

Stabilize edici mutasyonlar ayrica diger suslardan RSV-F proteinini ve ayrica islenmis F varyantinda stabilize eder.

Pre-füzyon konformasyonun yüksek ekspresyonu ve iyi stabilitesini gösteren birçok mutasyon, diger suslarin RSV F proteinlerine (SEQ ID NO: 69 ve 70) uygulandi ve modifikasyonlarin RSV prefüzyon F'yi stabilize etmek için evrensel bir çözüm olup olmadigini degerlendirmek için furin bölünme alani mutasyonlari olmaksizin bir RSV A2 F varyantina uygulandi (F18: SEQ lD NO 71) (Tablo 11).

Tablo 11. Ek mutasyon ve B1 susundan (SEQ ID.NO: 2) F ve A tipi CL57-v224 (SEQ RSV proteini Seq Relatif* ekspresyon 5 gün sonra A2_F18 N67I, S215P, RSV proteini Seq Relatif* ekspresyon 5 gün sonra A2_F18 N67I, 8215P, A2_F18 N67I, 821 SP, A2_F18 N67I, 821 SP, A2_F18 N67I, 8215P, A2_F18 N67I, 8215P, A2_F18 N67I, 8215P, A2_F18 N67I, 8215P, A2_F18 N67l, 8215P, A2_F18 N67I, 8215P, döngüsü 75 0.615 98.4 Protein ekspresyonu (geçici olarak transfekte edi/mis hücrelerin süpernatanindaki konsantrasyon), Kantitatif Oktet metodu ile ölçü/dü. ekSpresyonuna normal/estirilmisti'r.

RSV proteini Seq Relatif* ekspresyon 5 gün sonra ** Stabilite- 4C de depolandiktan sonra ölçülen % protein konsantrasyonu, örnegin hasat gününe göre 5 gün boyunca eksprese edi/ir. Konsantrasyonlar, CR9501 antikoru kullanilarak Kantitatif Oktet metodu ile ölçü/dü. NA - veri mevcut degil.' CR9501 baglanma tespit edi/medi. Önceden tanimlanmis nokta mutasyonlari A2_F18'de (SEO ID NO. 71) dahil edildiginde, stabilite ve ekspresyon seviyeleri, F1 ve F2 arasinda kisa bir döngü içeren tek Zincirli F24 (SEQ ID NO. 21) varyantina kiyasla çok benzerdi. Yine, N67I veya çift mutasyon N67I, S215P içeren varyantlara mutasyonlar eklendiginde, daha yüksek ekspresyon ve stabilite gösteren sinerjizm gözlendi. Çift nokta mutasyonu N67I, 8215P, sadece A2 susunun pre-füzyon F'sini stabilize etmekle kalmamis, ayni zamanda B1 ve CL57-v224 susunun pre-füzyonunu da stabilize etmistir (Tablo 11).

Stabilize edici mutasyonlar ayrica tam uzunlukta RSV-F proteinini de stabilize Ektodomenine karsilik gelen RSV-F'nin çözünür versiyonunda pre-füzyon konformasyonun yüksek ekspresyonunu ve iyi stabilitesini gösteren birçok mutasyon, tam uzunluktaki RSV-F proteinine uygulanmistir. Mutasyonlar, tam uzunlukta RSV-F ile furin bölünme bölgesi mutasyonlari ile veya olmaksizin dahil edilmistir. Bu varyantlara hiçbir trimerizasyon domeni kaynastirilmamistir (Tablo 12).

Tablo 12. Tam uzunluktaki A2_F18 ve A2_F24 varyantlarinin ek mutasyonlarla ekspresyonu ve stabilitesi.

RSV F protein Özellikler varyanti* Amino asit sübstitüsyonlari SE F1, F2 Ekspresy Isi- Q baglayici on, stabilitesi No artisi** Yok (F A2 dogal sus, tam uzunlukta) 1 yok 1 - Amino asit sübstitüsyonlari 8215P N67I, K465Q N67I, S46G N67I, E92D N67I, K80E N67I, G184N N67I, V185N N67I, E487Q N67I, 8215P,V185N N67I, 8215P,K508E N67I, 8215P,K8OE N67I, 8215P,K465Q N67I, S215P N67I, 8215P, G184N N67I, 8215P, E92D N67I, 8215P, S46G N67I, 8215P, D486N N67l, 8215P, E487Q RSV F protein varyanti* F1, F2 baglayici Özellikler Ekspresy Isi- on, stabilitesi 1.4 N.D. 1.4 N.D. 1.4 N.D. 1.4 N.D. 0.2 N.D. 1.4 N.D. 2.3 MB. 1.5 N.D. 1.4 N.D. 2.5 N.D. 2.7 N.D. 3.0 N.D. 3.1 N.D. 2.9 N.D. 2.4 ++ 7.6 ++ 6.8 N.D. 5_9 +++ 6.2 N.D.

Amino asit sübstitüsyonlari N67I, S215P N67I, 8215P, G184N N67I, 8215P, E92D N67I, S21 SP, S46G N67I, 8215P, D486N N67I, 8215P, E487Q RSV F protein varyanti* Q baglayici 81 Q_GSGSG 83 Q_GSGSG 89 Q_GSGSG 87 Q_GSGSG 85 Q_GSGSG Özellikler Ekspresy stabilitesi RSV F protein Özellikler varyanti* Amino asit sübstitüsyonlari SE F1, F2 Ekspresy Isi- Q baglayici on, stabilitesi No artisi** Ekspresyon seviyesi FACS kullanilarak belirlendi. N.D. - beiir/enmemistir. * tüm varyantiar, RSV A2 F protein dizisine dayanmaktadir. ** dogal sus protein ile karsilastirildiginda, 9503'te MFI katlama artisi. stabilitesi degerlendidldi. *** stabilite okuma için açiklama - 46 °C (örnegin dogal sus) sonrasinda pre-füzyon spesifik Mab CR9501 baglanmasina baglanmada azalma + 46 °C sonrasi hafif CR9501 baglanma azalmasi ancak dogal sus ile ayni derecede degildir.

++ CR9501 baglanmasinda 60 °C'ye kadar degisiklik olmaz, 60 °C'de CR9501 baglanmasinda bir miktar azalma +++ CR9501 baglanmasinda 60 °C'de degisiklik yok Önceden tanimlanmis stabilize edici nokta mutasyonlari ayrica tam uzunluktaki F proteininde stabilize edici idi. Ekspresyon seviyesindeki artis daha az belirgindi ancak ayni egilimi gösterdi. Bu, mutasyonlarin dahil edildigi farkli alt yapidan kaynaklanmis olabilir, ancak ayni zamanda, yüzey proteinlerinin geri dönüsümü nedeniyle farkli kantifikasyon yönteminden (FACS - Western blot'a karsi) ve biyolojik maksimum ekspresyondan da kaynaklanabilir. Baglama dizisinin (veya kisa döngü) dahil edilmesi, ekspresyon ve stabiliteyi arttirdi ve nokta mutasyonlari da ayni sekilde davrandi. Nokta mutasyonlari kisa döngü ile sinerjistik degildi veya çok az sinerjistikti (çözünür protein için buldugumuza benzer sekilde (Tablo 9-11). 67. pozisyondaki nokta mutasyonu, ekspresyon seviyesi ve stabilite üzerinde pozitif bir etkiye sahip oldugundan, tüm amino asit sübstitüsyonlari, en optimalinin seçilip seçilmedigini veya bu pozisyonlarin gelistirilip gelistirilemeyecegini incelemek için bu pozisyon için test edilmistir. (Tablo 13) Tablo 13. A2_F24 alt yapisinda 67. pozisyon için ekspresyon ve stabilitenin tam sübstitüsyon analizi.

Amino asit Relatif 4 gün sonra 10 gün sonra sübstitüsyonu Ekspresyon* stabilite **, % stabilite **, % N67G 0.853 NA NA N67K 0.487 NA NA N67Q 0.955 NA NA N67R 0.523 NA NA Amino asit Relatif 4 gün sonra 10 gün sonra sübstitüsyonu Ekspresyon* stabilite **, % stabilite **, % * Relatif ek3presyon - protein konsantrasyonu, CR9503 ant/koru kullanilarak Kantitatif Oktet yöntemi ile ölçülmüs ve A2_F24 konsantrasyonuna göre eksprese edilmistir (SEO lD # 19) ** Stabilite - 4C'de saklandiktan sonra ölçülen % protein konsantrasyonu, örnegin hasat gününe göre 5 ve 10 gün boyunca eksprese edilir.

Konsantrasyonlar, CR9501 antikoru kullanilarak Kantitatif Oktet yöntemi ile ölçü/dü. NA - veri mevcut degil: CR9501 baglanma tespit edilmedi.

Tablo 13'te gösterildigi gibi, esasen hidrofobik kalintilar ve özellikle 67. pozisyondaki ile, Leu ve Met ekspresyonu ve stabiliteyi arttirabilmislerdir. ile, ekspresyonu ve stabiliteyi en çok artiran kalintidir. Kalintilar Glu ve Gln, en küçük kalinti Gly ve pozitif yüklü artiklar Arg ve Lys, prefüzyon konformasyonunda 67. pozisyonda en çok stabiliteyi bozan etkiye sahipti.

Bulusa göre, RSV F proteininin pre-füzyon konformasyonunu stabilize eden amino asit mutasyonlari, farkli sekillerde konformasyonu stabilize eden farkli kategoriler halinde gruplandirilabilir. Pre-füzyon F stabilizasyonu için stratejiler, PIV5 kristal yapisina dayanan RSV-F homoloji modeline (Yin et al., 2006) ve sayfa 27'deki hizalamaya dayanmaktad ir.

Amino asit kalintilari 67 ve 215: 67 ve 215. pozisyonlardaki amino asit kalintilari, hem pre-füzyon modeli hem de post- füzyon kristal yapisinin 3D yapisinda çok yakindir. Kalintilar, HRA bölgesinin uzun uzatilmis kivrimli spiral genisletilmis helisel trimere yeniden katlandigi menteseyi OIuSturan DIII bölgesinin tepesindeki korunmus disülfit köprüsüne yakindir. Bu bölgedeki mutasyonlar mentese fonksiyonunu etkileyecektir ve bu nedenle dahil edilen mutasyonlar, mentese fonksiyonunun tikanmasi ile pre-füzyon konformasyonu stabilize A_mino asit kalint_ilari 77. 80 77 ve 80. pozisyonlardaki amino asit kalintilari, post-füzyon konformasyonun uzun sarmal spiral yapisina yeniden katlanan F1'in N-terminusundaki Dlll'deki sekonder yapilar toplulugu ile yakin temas halinde bulunan F2'nin C-terminusundaki uzun helisin (76-98 arasindaki kalintilar) içinde yer alir. Bu iki bölgenin pre-füzyon ve post-füzyon yeniden katlanmasi sirasinda ayrilmasi gerektiginden, bu bölgedeki bu ayrilmayi önleyen amino asitler pre-füzyon konformasyonu stabilize edecektir. Bu iki bölgenin yeniden katlanma sirasinda ayrilmasi gerektiginden, kalintilarin bir bölümü etkilesimi güçlendirmek için optimize edilebilir. Gözlenen bir repulsiyon örnegi, pozitif yüklü Ly380 arasindaydi. LysBO'in negatif yüklü Glu kalintisina mutasyonu, pre-füzyon F ekspresyonunu arttirdi. Post-füzyon konformasyona sirali geçis nedeniyle, bu mutasyonlar, bu stabilizasyondan tam olarak yararlanmak için Tablo 10'da gösterildigi gibi N67I ve 8215P gibi diger stabilize edici mutasyonlarla kombine edilebilir.

Amino asit kalintisi 92 92. pozisyonlardaki amino asit kalintisi da, post-füzyon konformasyonun uzun sarmal spiral yapisina yeniden katlanan F1'in N-terminusundaki DIII'deki sekonder yapilar toplulugu ile yakin temas halinde bulunan F2'nin C-terminusundaki uzun helisin (76-98 arasindaki kalintilar) içinde yer alir. Bu sarmal HRA bölgesinden ayrildiginda, Synagis bölgesine çekilir ve negatif olarak yüklenen Glu92, post-füzyon konformasyonunda pozitif yüklü Ar9282'ye çok yakin hareket eder. Bu çekimi azaltan mutasyonlar pre- füzyon konformasyonunu stabilize edecektir. Glu92'nin korunmus bir Asp kalintisina mutasyonu, Ar9282'ye ulasamadigindan çekmeyi azaltacaktir.

Amino asit kalintilari 486, 487 Pre-füzyon konformasyonunda HRB'nin tepesindeki 486, 487 ve 489 amino asit kalintilari, Glu487'nin negatif yüklü bir yama Mutasyonunu Asn veya Ile ile artan pre- füzyon F ekspresyonuna olusturur. Asp486'nin Asn veya Gln ve/veya Glu489'un Asn, nedeniyle, bu mutasyonlardan tam olarak yarar elde etmek için N67I ve S215P gibi örnegin Tablo 10'da gösterildigi gibi örnegin, D486N ile birlestirilebilir.

Amino asit kalintilari 175. 184, 185 Pre-füzyondan post-füzyon konformasyona yeniden katlanmak için, kalinti 175 ve 193 arasindaki bölgenin bir döngü-beta haripin,den bir helise dönüsmesi gerekir.

Bu bölge en çarpici yapisal geçisi göstermektedir. Bu bölgenin bir bölümü aslinda en yüksek alfa helis tahminine sahiptir. Pre-füzyon modeldeki fiili helisel yapilar asagida gri vurgularla gösterilmistir. Tüm bu bölge, post-füzyon konformasyona yeniden katlandiginda büyük bir helise dönüsür. Alt siradaki kalintilar, Agadir'e (http://agadir.crg.es/) dayanarak en yüksek helis tahmini ile gri renkte vurgulanir. Bu karsilastirmadan, pre-füzyon konformasyonda bir beta-saç tokasinda tutulan C-terminal bölümünün (kalinti 187-202) bir alfa-helis olusturma egiliminin yüksek oldugu açiktir.

.LEE ;FAII-SK '1.31 LECîEI-'IIT I Z“.IîFi LL I'FTNKAWSLSNGVSVLTSKVID LtIIIY I [IKQL 2.2 TT 7?` _ .`:" RSV-F'nin 150 - 212 kalintilarinin dizisi yukarida gösterilmistir. Ikinci satirda, üst satirin ikincil yapilari, PlV-5 3D homoloji modeline dayanarak h (helis için) ve s (sarmallar için) ile belirtilir. Helisler gri gölgelendirme ile vurgulanir. Alt çizgi, dizilerin helis egrisine dayanarak helislerin gri tonlarda oldugu ayni dizilimdir.

Bu nedenle, bu dönüsü stabilize etmek ve tek bir mutasyon olarak ekspresyon seviyesini arttiran bir helis içine yeniden katlanmayi önlemek için, pre-füzyon konformasyonunu stabilize ettigini ve proteinin daha iyi islenmesini sagladigini gösteren bir Prolin pozisyon 175'e dahil edilmistir. Saç tokasinda dönüs (kalintilar 184, 185) için Brookhaven veri tabani, yeniden katlanmayan stabil bir proteinden yapisal olarak homolog bir saç tokasi aradi. Protein Kinaz A'da (pdb kodu 3FHI) bir saç tokasi döngüsü ile yüksek bir yapisal homoloji kesfedilmistir. Asagida gösterilen hizalamaya göre, bu dönüsü dengelemek ve yeniden katlanmasini önlemek için 184 Gly veya 185Val kalintilari Asn ile degistirildi.

VVSLSNGVSVLTS KV HRAb1b2 178-192 Bu mutasyonlar, Tablo 10'da gösterildigi gibi bu stabilizasyondan tam olarak yararlanmak için N67I ve S215P gibi diger stabilize edici mutasyonlarla birlestirilebilir.

Amino asit kalintilari 421, 426 ve 46 421 ve 426. pozisyonlardaki amino asit kalintilari, Dll bölgesinde bir halka halindedir.

Kalinti S46, Dl'den Dlll'ye geçen bir zincir üzerindedir. 426. pozisyondaki amino asit kalintisi serin içinde mutasyona ugradi ve 46. pozisyondaki amino asit kalintisi glisin içinde mutasyona ugradi. Bu mutasyonlar stabiliteyi ve pre-füzyon ekspresyon seviyelerini arttirdi.

Amino asit kalintisi 465 Amino asit kalintisi Lys465, büyük bir konformasyonel degisimden geçen baska bir bölgede bulunur. Lys465, DII bölgesinin tepesini HRB'ye baglayan bir çapraz döngü üzerinde bulunur. HRB bölgesi asagidan yukariya dogru hareket ettiginden ve alti helis demetini yapmak için HRA ile komplekslestiginden, çapraz geçis döngüsü de asagidan yukariya dogru yer degistirir. Bu nedenle bu döngü DII'nin ayrilmasini ve baska bir ortamda yeniden konumlandirilmasini saglamak için metastabil olmalidir. Çapraz geçis döngüsü üzerindeki Lys465, DII bölgesindeki Lys445'e yakindir. Lys465'in Gln veya Glu'ya mutasyonu, repulsiyonu nötralize eder ve stabilite ve pre-füzyon F ekspresyon seviyelerini arttirir.

Pre-füzyon F proteininin ekspresyonu Rekombinant pre-füzyon RSV F proteinini kodlayan ekspresyon plazmitleri, alana yönelik mutajenez ve PCR içeren, teknikte yaygin olarak bilinen standart yöntemlerle üretildi. Kullanilan ekspresyon platformu 293Freestyle hücreleridir (Life Technologies, Renfreshire, BK). Hücreler, üreticinin talimatlarina göre 293Fectin (Life Technologies) kullanilarak geçici olarak transfekte edildi ve 5 gün boyunca 37 °C ve %10 COz'de çalkalama inkübasyon makinesi içinde kültürlendi. Kültür süpernatani hasat edildi ve hücreleri ve hücresel kalintilari uzaklastirmak için 300 9'de 5 dakika boyunca egildi.

Egilmis süpernatan daha sonra bir 0.22 um vakum filtresi kullanilarak steril olarak filtre edildi ve kullanima kadar 4 °C'de saklandi.

Pre-füzyon RSV F proteininin saflastirilmasi Rek0mbinant polipeptitler, baslangiç saflastirma için bir katyon degisim kolonu ve ardindan artik kirletici maddeleri uzaklastirmak için parlatma asamasi için bir superdex200 kolonu uygulayan 2 adimli bir saflastirma protokolü ile saflastirilmistir.

Baslangiç iyon degistirme adimi için kültür süpernatani, 2 hacim 50 mM NaOAc pH 5.0 ile seyreltildi ve dakikada 5 ml'de 5 mI'Iik bir HiTrap Capto S kolonundan geçirildi. Daha sonra kolon, 10 kolon hacminde (CV) 20 mM NaOAc, 50 mM NaCI, %001 (v/v) ile elüte edildi. Eluat bir döndürme yogunlastiricisi kullanilarak konsantre edildi ve kullanilarak bir superdex200 kolonu kullanilarak saflastirildi. Sekil 1A'da, jel filtrasyon kolonundan kromatogram gösterilmistir ve dominant pik, pre-füzyon RSV F proteinini içerir. Bu piki içeren fraksiyonlar tekrar havuzlandi ve protein konsantrasyonu, OD280 kullanilarak belirlendi ve kullanilana kadar 4 °C'de depolandi. Sekil 'lB'de, nihai protein preparatinin azaltilmis bir SDS-PAGE analizi gösterilmektedir ve görüldügü gibi saflik >%95'tir. Bantin özdesligi western blotlama ve protein F'ye spesifik antikorlar (gösterilmemistir) kullanilarak dogrulandi.

NativePAGE Bulusa göre pre-füzyon F polipeptitlerinin multimerik durumunun baslangiç tespiti için, geçici olarak transfekte edilmis hücrelerden kültür süpernatanlari, bir NativePAGE Bis- Tris jel sisteminde (Life Technologies) analiz edildi. Daha sonra jeller, üreticinin talimatlarina (Life Technologies) göre iBlot teknolojisi kullanilarak blotlanmistir. Bir RSV F proteinine spesifik antikor CR9503 (asagida Tablo 17'de verilen diziler), pre-füzyon RSV F proteininin tespiti için primer prob olarak kullanildi ve bunu takiben bir HRP konjuge fare anti-insan IgG'si (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA) veya bir Odyssey CLx kizilötesi görüntüleme sistemi kullanilarak gelistirildi. Sekil 2, monomer F47-, (serit 1), post-füzyon ve primer olarak trimerik RSV F proteininden (serit 2) ve saflastirilmis pre-füzyon RSV F proteininden (serit 3) gelen süpernatanlarin NativePAGE analizini gösterir; post-füzyon RSV F protein preparatinda sadece trimerik türler mevcut oldugunu gösterir, çünkü post-füzyon trimer bandina benzer sekilde göç etmektedir. Bu, jel filtrasyon kolonundan elüsyon hacmi ile de desteklenir (Sekil 1A).

Kantitatif Western blotlama Pre-füzyon RSV F protein yapilarinin kantifikasyonu için, kantitatif Western blotlama kullanilmistir. Kültür süpernatanlarinin dilüsyonlari %4-12 (w/v) Bis-Tris NuPAGE jellerinde (Life Technology) azaltilmis ve iBlot teknolojisi (Life Technology) kullanilarak blotlanmistir. Blotlar, CR9503 (yukarida tarif edildigi gibi) ile problandi ve bir konjuge fare anti-insan IgG'si (Jackson lmmunoResearch, West Grove, PA) veya bir lmmunochemicals, Gilbertsville, PA) ile gelistirildi. Protein miktarlari daha sonra, saflastirilmis RSV standart proteininin bir seyreltme serisi ve Odyssey CLX kizilötesi görüntüleme sistemi veya göz ile tahmin edilmistir. Sekil 3'te, A2_F24 (SEQ ID NO: 19) yapisina göre genel ekspresyon seviyeleri açisindan etkileri görülebilmektedir. Tek mutasyonlarin ekspresyon seviyesini 5 kata kadar arttirdigi gösterilmistir. Bu mutasyonlarin bazilarinin çift mutantlari üretildiginde, sinerjik etkiler gözlenebildi ve bazi durumlarda A2_F24 üzerinde 11 kat daha fazla artan bir ekspresyon gözlendi.

Uç nokta stabilite testi Bulusa göre eksprese edilen polipeptitlerin pre-füzyon konformasyonunun dogrulanmasi, pre-füzyon spesifik CR9501 veya CR9502 veya konformasyona spesifik olmayan Motavizumabin agir ve hafif zincir degisken bölgelerini içeren CR9503 antikorlari kullanilarak BioLayer Interferometri (Octet) teknolojisi kullanilarak yapildi.

Antikorlar standart protokollerle biyotinlendi ve Streptavidin biyosensörleri (ForteBio, Portsmouth, BK) üzerinde immobilize edildi. Prosedür asagidaki gibidir. Sensörlerin 60 saniye boyunca kinetik tamponda (ForteBio) dengelenmesinden sonra Tipss. arzu edilen antikorun 5 pg/ml'si ile PBS'ye aktarildi. Yükleme 2503 için yapildi. Daha sonra kinetik tamponda 2003 için baska bir dengeleme adimi dahil edildi. Son olarak uçlar, pre-füzyon RSV F polipeptitlerini ve 12003 kaydedilmesinden sonra baglanma yaniti (nm) içeren ekspresyon kültürü süpernatanina aktarildi. Bu faz ayni zamanda birlesme fazi olarak da adlandirilir. Bu, hasattan hemen sonra (1. gün) ve 5 gün sonra (5. gün) yapildi ve CR9501 baglanmasindaki fark, pre-füzyon konformasyonu stabilize edebilen mutasyonlari tanimlamak için bir tarama araci olarak kullanildi. 5. günde %20'den az baglanma kaybi gözlenirse yapi stabil ve %20'den fazla baglanma kaybi gözlenirse stabil olmayan kabul edildi. Stabil yapilar daha sonra gerekirse daha siki bir stabilite testine tabi tutulabilir. Veri analizi ForteBio Data Analysis 6.4 yazilimi (ForteBio) kullanilarak yapilmistir.

RSV F polipeptitlerine dahil edilen özelliklerin stabilize edici potansiyeli, isi stresi ile tahmin edildi. Bu amaçla, geçici olarak transfekte edilmis hücrelerden veya saflastirilmis proteinden elde edilen kültür süpernatani, bir dizi sicaklik kullanilarak isitildi. Örnekler daha sonra isiyla uyarlanmis konformasyonel degisikliklerin önlenmesi için buz üzerinde sogutuldu ve Örnek 7'de tarif edildigi gibi sekizli teknoloji platformunda CR9501 antikoru kullanilarak problandi. Farkli sicakliklarda birlesme fazi sonunda elde edilen yanitlar, farkli sicakliklarda bir sicaklik fonksiyonu olarak çizildi ve Prism yazilimi kullanilarak dogrusal olmayan regresyon ile uyum saglandi. Bu, antikor baglanma seviyesinin maksimumun %50 oldugu ve bu pre-füzyon isi stabilitesi açisindan farkli yapilari karsilastirmak için kullanilabilecek bir sicaklik tahmini ile sonuçlanmistir. Sekil 4'te modifiye edilmemis ektodomen (SEQ ID NO: 13) ve A2_F24 N67I + karsilastirilmistir. Sicakliga bagli stresin, modifiye edilmemis ektodomen ile karsilastirildiginda A2_F24 N67I + S215P yapisi (SEO lD NO: 21) üzerinde daha az bir etkiye sahip oldugu görülebilir. Bu nedenle, bulusa ait polipeptitlere dahil edilen stabilize edici motiflerin, diger bir deyisle trimerizasyon bölgesinin, F1-F2-baglayicinin ve 2 nokta mutasyonlarinin daha stabil bir pre-füzyon F proteinine yol açtigi sonucuna varilabilir.

Birlesme fazi stabilite testi Çesitli nokta mutasyonlarinin stabilitesini degerlendirmek için oktet baglanma analizinde daha önce tarif edilen uç nokta stabilite analizinin bir varyasyonu (Örnek 7) gelistirilmistir. Birlesme fazi analizi, bazi nokta mutantlarinin çok yüksek ekspresyon seviyeleri nedeniyle gerçeklestirildi, çünkü bu daha siki bir analizdir ve ekspresyon seviyesi yanliligini tamamen önler. CR9501 antikoru da kullanildi, ancak birlesme fazinin sonunda baglanma yanitini seçmek yerine, son nokta analizinin potansiyel konsantrasyon yanliligini azaltmak için bütün birlesme egrisi kullanildi. Bu, belirtilen A2_F24 nokta mutantlarini kullanarak deneyin tüm birlesme fazindaki veri noktalari kullanilarak yapildi. Veriler, çip üzerindeki bagli antikor miktari için telafi edildi. Ölçümler 1, 5 ve 33. günlerde yapildi ve üç gündeki egrilerin sekilleri karsilastirildi.

Eger ayni egriler elde edilmisse, yapi stabil olarak kabul edildi ve eger degilse stabil degildi. Sekil 5'te, dört farkli varyantin analizi görülebilir. Stabil olmayan protein pre- tanimlanabilirken, stabil pre-füzyon yapilar (N67I) böyle bir düsüs göstermedi. E92D mutasyonunun, ara stabiliteye sahip olan ikisi arasinda bir gruba düstügü görülmüstür, çünkü egri seklinde sadece küçük degisiklikler gözlenmistir. Sekil 6'de seçilen nokta mutasyonlari çift mutantlar yapmak için birlestirildi ve bunlar analiz edildi.

Görülebilecegi gibi, farkli mutasyonlar stabilite ve stabilite indüksiyonu açisindan farkli fenotipler sergilemistir. Polipeptitler, tek basina veya kombinasyon halinde K4650 veya S46G mutasyonlarini içerdiginde, üçünün tümü, diger bir deyisle iki tek ve çift mutant, stabil degildir ve füzyon spesifik antikor baglanmasi zamanla kaybolur. 8466 mutasyonu, daha önce tek bir mutasyon olarak bir ara stabiliteye sahip oldugu gösterilen E92D ile birlestirildiginde, E920 mutasyonunun stabil olmayan protein yapilarini düzeltemedigini gösteren sekilde stabilitede bir degisiklik gözlenmedi. N67I mutasyonu, S46G veya E92D mutasyonu ile kombine edildiginde, sonuç tamamen stabil bir yapidir. Bu, S215P mutasyonu, stabil olmayan bir pre-füzyon yapilarini stabilize etmek için bu iki mutasyonun benzersiz potansiyelini gösteren E92D mutasyonu ile birlestirildiginde de görülebilir.

Kantitatif Oktet Hücre kültürü süpernatanlarinda pre-füzyon RSV F proteininin konsantrasyonunu ölçmek için kantitatif Oktet bazli yöntem kullanildi. CR9501 ve CR9503 antikorlari standart protokollerle biyotinlendi ve Streptavidin biyosensörleri (ForteBio, Portsmouth, BK) üzerinde immobilize edildi. Daha sonra, kaplanmis biyosensörler sahte hücre kültürü süpernataninda bloke edildi. Kantitatif deney su sekilde yapildi: sicaklik 3OC, çalkalama hizi 1000 rpm, test süresi 300 saniye. Proteinin hücre kültürü süpernatantindaki konsantrasyonu standart egri kullanilarak hesaplandi. Standart egri, sahte hücre kültürü süpemataninda seyreltilmis A2_F24_N67I + proteini kullanilarak her kaplanmis antikor için hazirlandi. Ölçüm, süpernatan hasadi gününde (1. gün) ve süpernatanin 4C'de 5 gün veya daha uzun süre depolanmasindan sonra yapildi. CR9501 ile belirlenen konsantrasyondaki fark, pre-füzyon konformasyonu stabilize edebilen mutasyonlari tanimlamak için bir tarama araci olarak kullanildi. 5. günde ölçülen konsantrasyonun %20'sinden daha az oranda bir düsüs gözlenirse, bir yapinin stabil oldugu kabul edildi. Veri analizi, ForteBio Data Analysis 6.4 yazilimi (ForteBio) kullanilarak yapildi.

FACS analizi ve isi stabilitesi Rekombinant tam uzunlukta RSV F proteinini kodlayan ekspresyon plazmitleri, alana yönelik mutajenez ve PCR içeren, teknikte yaygin olarak bilinen standart yöntemlerle üretildi. HEK293-T hücreleri, üreticinin talimatlarina göre 293Fectin (Life Technologies) kullanilarak geçici olarak transfekte edildi ve 48 saat 37 °C'de ve %10 COz'de kültürlendi. Hücre, FACS tamponu (5 mM EDTA, PBS içinde %1 FBS) kullanilarak hücre kültürü tabaklarindan ayrildi, yikandi ve ayni tampon içinde yeniden süspanse edildi. Hücreler, yüzey RSV F proteini için biyotinlenmis CR9501 veya CR9503 antikorlari, ardindan APC etiketli streptavidin ile blotlandi. Canli ve ölü hücreler arasindaki ayirim için, boyama prosedürünün sonunda, hücre süspansiyonuna Propidyum iyodid ilave edildi. Hücreler. teknolojide uzman kisilerce iyi bilinen standart yöntemlere göre FACS Canto (BD Biosciences) üzerinde analiz edildi. Veri analizi FIowJo 9.0 yazilimi (Tree Star Inc.) kullanilarak yapildi. Ortalama floresan yogunlugu (MFI) canli APC-pozitif hücrelerin popülasyonu için hesaplandi.

Tam uzunlukta membran-bagli RSV F'ye dahil edilen özelliklerin stabilize edici potansiyeli, isi stresi ile tahmin edildi. Transfeksiyondan 48 saat sonra hücreler, yukarida tarif edildigi gibi hücre kültürü kaplarindan ayrildi ve hücre süspansiyonu, bir yukarida tarif edildigi gibi FASC ile blotlandi ve analiz edildi. MFI, canli APC pozitif hücrelerin popülasyonu için hesaplandi. APC pozitif hücrelerin yüzdesi canli hücre popülasyonu için hesaplandi. CR9503 ile blotlama, artan sicakliklarda isi sokuna maruz kalan numunelerde benzer MFl ve %APC-pozitif hücrelere yol açti. CR9501 ile blotlama, stabil olmayan proteinlerle transfekte edilmis hücre örneklerinde azalmistir.

CR9501 baglanma kaybi, hücre yüzeyinde pre-füzyon RSV F proteini kaybini göstermistir.

Prefüzyon F immünojenisitesinin preklinik degerlendirmesi Stabilize edilmis bir pre-füzyon RSV F'nin (A immünojenisitesini degerlendirmek için, Tablo 14'e göre fareleri hafta 0 ve hafta 4'te bir birincil destek rejiminde 0.5 veya 5 ug ile immünize ettik. Sekil 7'de gösterildigi gibi, pre-füzyon F ile immünize edilmis fareler, post-füzyon RSV F ile immünize edilmis farelerden daha yüksek VNA titreleri gösterdi.

Tablo 14. Immünizasyon semasi Grup Preparat Doz Adjuvan N 1 Post-füzyon F 0.5 ug - 9 2 Post-füzyon F 5 ug - 9 3 Pre-füzyon F 0.5 pg - 9 4 Pre-füzyon F 5 ug - 9 Post-füzyon F 0.5 pg Poli(I:C) 9 6 Pre-füzyon F 9 Grup Preparat Doz Adjuvan N 8 FI-RSV 1/75 - 8 9 PBS - 3 Daha sonra, pamuk siçanlari post-füzyon veya pre-füzyon konformasyonunda iki farkli RSV-F dozu ile asilanmistir (Tablo 15). Hayvanlar 0 ve 4. haftalarda i.m. asilandi. Sekil 8, challenge gününde yüksek nötralize edici antikor titrelerini göstermektedir (hafta7).

Tablo 15. Immünojenisite degerlendirmesi için gruplar, immünojen ve doz ve pamuk siçanlarinda etkinligi.

Grup Preparat Doz Adjuvan 1 Post-füzyon F 0.5 ug - 2 Post-füzyon F 5 ug - 3 Pre-füzyon F 0.5 ug - 4 Pre-füzyon F 5 ug - 9 Pre-füzyon F 0.5 ug Poli IC Pre-füzyon F 5 ug Poli IC 11 Pre-füzyon F 0.5 ug Adju Phos 13 Ad26.RSV.FA2 10^8 - 14 PBS - - Challenge uygulandiktan bes gün sonra akciger ve burun viral yükü ölçülmüstür (bakiniz Sekil 9). Gösterildigi gibi. bulusa göre pre-füzyon F polipeptitleri, akcigerdeki ve hatta burun içindeki viral yükü azaltan güçlü bir koruyucu immün yanit uyandirabilir.

Tablo 16. Standart amino asitler, kisaltmalar ve özellikleri Amino Asit 3- 1- Yari zincir Yan zincir yükü (pH harfli harfli polaritesi 7.4) alanin Ala A polar olmayan Nötr Amino Asit asparagin aspartik asit glutamik glutamin histidin izolösin metiyonin fenilalanin prolin treonin triptofan tirosin Tablo 17. Antikor dizileri harfli harfli Yan zincir polaritesi polar olmayan polar olmayan polar olmayan polar olmayan polar olmayan polar olmayan polar olmayan polar olmayan polar olmayan Yan zincir yükü (pH Pozitif Negatif Negatif Pozitif(%10) Nötr(%90) Pozitif Amino GASINSDNYYWT HISYTGNTYYTPSLKS CGAYVLISNCGWFDS CR9501 asitler (SEO ID NO:54) (SEQ ID NO:55) (SEQ ID NO:56) Ab VH CDR1 VH CDR2 VH CDR3 1-125 asitler CR9502 1-121 GFTFSGHTIA WVSTNNGNTEYAQKI EWLVMGGFAFDH Ab VL CDR1 VL CDR2 VL CDR3 asitler CR9501 1-107 QASQDISTYLN GASNLET (SEO ID QQYQYLPYT (SEQ lD (SEO ID NO: 62) NO:63) NO:64) asitler CR9502 1-110 GANNIGSQNVH DDRDRPS (SEQ ID QVWDSSRDQAVI Pre-füzyon RSV F yapilarinin birkaçinin amino asit dizisi asagida verilmistir. Burada tarif edilen farkli yapilarda bulunan amino asit numaralandirmasinin, dogal sus diziye (SEQ ID NO: 1) dayandigi not edilmelidir, bu, pre-füzyon yapilarin 1. pozisyondan 108. pozisyonuna kadar olan bütün amino asitlerin, dogal sus dizisinin 1-108 amino asit pozisyonlarina karsilik geldigi anlamina gelir, burada amino asitlerin 138 pozisyonundan sona kadar numaralandirilmasi 22 amino asit kaydirilir, diger bir deyisle dogal sus dizide L tüm pre-füzyon yapilarda L116'ya karsilik gelir. Bu, pre-füzyon yapilarda bir delesyon yapilmis olmasindan kaynaklanmaktadir, diger bir deyisle GSGSG baglayicisinin insersiyonu, F1'deki fiili numaralandirma yapilar arasinda ayni degildir. Böylece, bulusa göre spesifik mutasyonlara göre kullanilan numaralandirma, örnegin 8215P, amino asitin dogal sus dizisindeki pozisyonuna karsilik gelir.

Claims (1)

1. ISTEMLER Bir rekombinant pre-füzyon solunum sinsitiyal virüsü (RSV) Füzyon (F) polipeptidi olup, özelligi pre-füzyon konformasyon F proteinine spesifik en az bir epitop içermesi, burada en az bir epitop bir pre-füzyon spesifik monoklonal antikor tarafindan taninir, SEO ID NO: 54'ün bir agir zincir CDR1 bölgesini, SEO ID NO: 55'in bir agir zincir CDR2 bölgesini, SEO ID NO: 56'nin bir agir zincir CDR3 bölgesini ve SEO ID NO: 62'nin bir hafif zincir CDR1 bölgesini, SEO ID NO: 63'ün bir hafif zincir CDR2 bölgesini ve SEO ID NO: 64'ün bir hafif zincir CDR3 bölgesini ve/veya bir pre-füzyon spesifik monoklonal antikoru içermesi, SEO ID NO: 58'in bir agir zincir CDR1 bölgesini, SEO ID NO: 59'un bir agir zincir CDR2 bölgesini, SEO ID NO: 60'in bir agir zincir CDR3 bölgesini ve SEO ID NO: 66'nin bir hafif zincir CDR1 bölgesini, SEO ID NO: 67'nin bir hafif zincir CDR2 bölgesini ve SEO ID NO: 68'in bir hafif zincir CDR3 bölgesini içermesidir, burada polipeptit, 67. pozisyonda N/T amino asit kalintisinin I'da bir mutasyonunu ve/veya 215. pozisyonda S amino asit kalintisinin P'de bir mutasyonunu içerir, burada amino asit pozisyonlari, A2 susundan (SEO ID NO: 1) RSV F proteininin dizisine referansla verilmistir. Istem 1'e göre pre-füzyon RSV F polipeptidi olup, özelligi polipeptidin bir F1 domeni ve bir F2 domeni ve 1 ila 10 amino asit kalintisi içeren bir baglanma dizisini içermesidir, bahsedilen F1 domeninin F2 domenine baglanir. Istem 1 veya 2'ye göre pre-füzyon RSV F polipeptidi olup, özelligi tepesi kesilmis bir F1 domeni ve bir F2 domeni ve 1 ila 10 amino asit kalintisi içeren bir baglama dizisini içermesidir, bahsedilen F1 domeninin bahsedilen F2 domenine baglanir. Istem 3'e göre pre-füzyon RSV F polipeptidi olup, özelligi polipeptidin, bahsedilen tepesi kesilmis F1 domenine bagli bir heterolog trimerizasyon domeni içermesidir. Istemler 1-4“ten herhangi birine göre pre-füzyon RSV F polipeptidi olup, özelligi polipeptidin, en az bir baska mutasyon içermesidir, burada bahsedilen mutasyon, asagidakilerden olusan gruptan seçilir: (a) 46. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; (b) 77. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; (c) 80. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; (d) 92. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; (e) 175. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; (f) 184. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; (g) 185. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; (h) 201. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; (i) 209. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; (j) 421. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; k) 426. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; (m) 486. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; ( 487. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu; ve 0) 508. pozisyonda amino asit kalintisinin bir mutasyonu. . istem 5'e göre pre-füzyon RSV F polipeptidi olup, özelligi en az bir baska mutasyonun asagidakilerden olusan gruptan seçilmesidir: (a) 46. pozisyonda S amino asit kalintisinin G'ye bir mutasyonu; (b) 77. pozisyonda K amino asit kalintisinin E'ye bir mutasyonu; (c) 80. pozisyonda K amino asit kalintisinin E'ye bir mutasyonu; (d) 92. pozisyonda E amino asit kalintisinin D'ye bir mutasyonu; (e) 175. pozisyonda N amino asit kalintisinin P'ye bir mutasyonu; (f) 184. pozisyonda G amino asit kalintisinin N'ye bir mutasyonu; (g) 185. pozisyonda V amino asit kalintisinin N'ye bir mutasyonu; (h) 201. pozisyonda K amino asit kalintisinin @ya bir mutasyonu; (i) 209 pozisyonunda K amino asit kalintisinin @ya bir mutasyonu; (j) 421 pozisyonundaki K amino asit kalintisinin N'ye bir mutasyonu; (k) 426. pozisyonda N amino asit kalintisinin S`ye bir mutasyonu; (I) 465. pozisyonda K amino asit kalintisinin E veya Qiya bir mutasyonu; (m) 486. pozisyonunda D amino asit kalintisinin N'ye bir mutasyonu; (n) 487. pozisyonunda E amino asit kalintisinin Q. N veya I'ya bir mutasyonu; (o) 508. pozisyonda K amino asit kalintisinin Etye bir mutasyonu. Önceki istemler 1-6'dan herhangi birine göre pre-füzyon RSV F polipeptidi olup, özelligi polipeptidin, 67. pozisyonda N/T amino asit kalintisinin l`da bir mutasyonunu ve 215. pozisyonda S amino asit kalintisinin P'de bir mutasyonunu içermesidir. Önceki istemler 4-7'den herhangi birine göre pre-füzyon RSV F polipeptidi olup, özelligi heterolog trimerizasyon domeninin EKKIEAIEKKIEAIEKKIEA (SEO ID NO: 3) amino asit dizisini içermesidir. Istem 8'e göre pre-füzyon RSV F polipeptidi olup, özelligi trimerizasyon domeninin RSV F proteininin amino asit kalintisi 495'e baglanmasidir. IstemIer 4-7'den herhangi birine göre pre-füzyon RSV F polipeptidi olup, özelligi heterolog trimerizasyon domeninin GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO: 4) amino asit dizisini içermesidir. istem 10'a göre pre-füzyon RSV F polipeptidi olup, özelligi trimerizasyon domeninin RSV F proteininin amino asit kalintisi 513'e baglanmasidir. Önceki istemlerden herhangi birine göre pre-füzyon RSV F polipeptidi olup, özelligi polipeptidin 55°C'de, tercihen 58°C'de, daha tercihen 60°C'de en az 30 dakika boyunca stabil olmasidir. Önceki istemlerden herhangi birine göre pre-füzyon RSV F polipeptidi olup. özelligi polipeptidin 4 °C'de en az 30 gün, tercihen en az 60 gün, tercihen en az 6 ay, hatta daha da tercihen en az 1 yil boyunca depolandiktan sonra stabil olmasidir. Önceki istemlerden herhangi birine göre pre-füzyon RSV F polipeptidi olup, özelligi polipeptidin, SEO ID NO: 21 - SEQ ID NO: 52 ve 71-89'dan olusan gruptan seçilen bir amino asit dizisi içermesidir. 15. Önceki istemler 1-14'ten herhangi birine göre pre-füzyon RSV F polipeptidini kodlayan nükleik asit molekülüdür. 16. istem 15'e göre bir nükleik asit molekülü içeren vektördür. 17. Istemler 1-14'ten herhangi birine göre pre-füzyon RSV F polipeptidi, istem 15'e göre bir nükleik asit molekülü ve/veya istem 16'ya göre bir vektör içeren bilesimdir. 18. Istemler 1-14'ten herhangi birine göre pre-füzyon RSV F polipeptidi, istem 15'e göre bir nükleik asit molekülü velveya istem 16'ya göre bir vektör olup, özelligi RSV F proteinine karsi bir immün yanitin uyarilmasinda kullanim için olmasidir.