CN112220921B - 一种针对呼吸道合胞病毒感染的组合疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种针对呼吸道合胞病毒感染的组合疫苗。包括：第一组合物，其包含免疫有效剂量的人26型复制缺陷型腺病毒载体和药学上可以接受的载体，人26型复制缺陷型腺病毒载体包含编码呼吸道合胞病毒的抗原蛋白的核苷酸；第二组合物，包含免疫有效剂量的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体和药学上可以接受的载体，猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体包含编码呼吸道合胞病毒的抗原蛋白的核苷酸。第一组合物为初免组合物，第二组合物为加强组合物；或者，第一组合物为加强组合物，第二组合物为初免组合物。本发明的组合疫苗用于诱导针对呼吸道合胞病毒感染的保护性免疫，提供针对呼吸道合胞病毒感染的保护性免疫的组合物、疫苗和方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种针对呼吸道合胞病毒感染的组合疫苗。
背景技术
人呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus，RSV)在世界范围内广泛流行，易感人群主要是儿童、老年人和免疫力缺陷患者。对于婴幼儿和儿童而言，70％的婴幼儿会在一岁前感染RSV，几乎全部的婴幼儿会在2岁前感染RSV，RSV是导致5岁以下儿童肺炎最为重要的病原体。对老年人和免疫力缺陷患者而言，RSV是导致住院治疗和死亡的重要病原体。全球每年约有3310万儿童感染RSV，其中99％的死亡儿童来自发展中国家，由此可见，RSV给世界各国尤其是发展中国家带来沉重的经济和社会负担，但目前尚无可用于儿童的商业化RSV疫苗可用。
腺病毒载体因其复制滴度高，安全性好、能高效表达外源蛋白等特点，被广泛用作疫苗载体。与减毒活疫苗相似，腺病毒载体疫苗可以诱导产生黏膜免疫和细胞免疫，同时腺病毒载体还具有佐剂作用，因而可以诱导机体产生更强的免疫反应。但是人类广泛感染过Ad5，预先存在的对Ad5的免疫可限制rAd5疫苗的功效，人26型复制缺陷型重组腺病毒(rAd26)和猩猩63型复制缺陷型重组腺病毒(rChAd63)均具有规避Ad5预先存在的免疫的能力，且可在适于产生临床等级的疫苗的细胞系上生长至高滴度。
腺病毒载体疫苗免疫机体时，能够诱导机体产生针对腺病毒载体自身的免疫反应，严重的干扰了再次免疫，因而，采用不同来源腺病毒载体异源初免-加强能够有效规避同源免疫产生的腺病毒抗体对疫苗免疫效果的影响。
发明内容
本发明的实施例提供了一种针对呼吸道合胞病毒感染的组合疫苗，以克服现有技术的缺点。
为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案。
一种针对呼吸道合胞病毒感染的组合疫苗，包括：第一组合物和第二组合物。
所述第一组合物，其包含免疫有效剂量的人26型复制缺陷型腺病毒载体和药学上可以接受的载体，所述人26型复制缺陷型腺病毒载体包含编码呼吸道合胞病毒的抗原蛋白的核苷酸；
所述第二组合物，其包含免疫有效剂量的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体和药学上可以接受的载体，所述猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体包含编码呼吸道合胞病毒的抗原蛋白的核苷酸；
其中，所述第一组合物为初免组合物，所述第二组合物为加强组合物；或者，所述第一组合物为加强组合物，所述第二组合物为初免组合物。
优选地，所述第一组合物中的人26型复制缺陷型腺病毒载体包含编码呼吸道合胞病毒的融合前融合糖蛋白preF的核苷酸和/或黏附糖蛋白130-230aaG130-230的核苷酸。
优选地，所述第二组合物中的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体包含preF的核苷酸和/或G130-230的核苷酸。
优选地，所述第一组合物中的人26型复制缺陷型腺病毒载体包含编码具有SEQ IDNO:1的preF的核苷酸。
优选地，所述第一组合物中的人26型复制缺陷型腺病毒载体包含编码具有SEQ IDNO:2的G130-230的核苷酸。
优选地，所述第一组合物中的人26型复制缺陷型腺病毒载体包含编码具有SEQ IDNO:3的preF的核苷酸和G130-230的核苷酸。
优选地，所述第二组合物中的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体包含编码至少三种呼吸道合胞病毒的抗原蛋白的核酸。
优选地，所述第二组合物中的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体包含编码至少三种呼吸道合胞病毒的具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗原蛋白的核酸。
优选地，所述第一组合物中的人26型复制缺陷型腺病毒载体为rAd26，所述第二组合物中的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体为rChAd63。
优选地，所述组合疫苗用于产生针对呼吸道合胞病毒感染的保护性免疫，其中所述第一免疫物用于引发所述免疫应答，所述第二组合物用于加强所述免疫应答；或者，所述第二免疫物用于引发所述免疫应答，所述第一组合物用于加强所述免疫应答。
由上述本发明的实施例提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供了一种针对呼吸道合胞病毒感染的组合疫苗，用于诱导针对呼吸道合胞病毒感染的保护性免疫，提供针对呼吸道合胞病毒感染的保护性免疫的组合物、疫苗和方法。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的preF特异性IgG；
图2为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的postF特异性IgG；
图3为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的血清中和抗体；
图4为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的RSV F特异性CD8+T细胞免疫应答；
图5为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的preF特异性IgG；
图6为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的postF特异性IgG；
图7为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的G特异性IgG；
图8为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的血清中和抗体；
图9为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的RSV F特异性CD8+T细胞免疫应答。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。
本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，当我们称元件被“连接”或“耦接”到另一元件时，它可以直接连接或耦接到其他元件，或者也可以存在中间元件。此外，这里使用的“连接”或“耦接”可以包括无线连接或耦接。这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的任一单元和全部组合。
本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。
为便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以几个具体实施例为例做进一步的解释说明，且各个实施例并不构成对本发明实施例的限定。
本发明旨在探讨初免-加强免疫策略对呼吸道合胞病毒感染的保护性免疫，具体地为针对呼吸道合胞病毒感染的保护性免疫的组合物、疫苗和方法。
本发明中发现，复制缺陷型腺病毒载体疫苗的初免-加强组合产生针对呼吸道合胞病毒的有效免疫保护。因此，本发明实施例提供了一种针对呼吸道合胞病毒感染的组合疫苗，所述组合疫苗包含：第一组合物和第二组合物。
第一组合物，其包含免疫有效剂量的人26型复制缺陷型腺病毒载体和药学上可以接受的载体，所述人26型复制缺陷型腺病毒载体包含编码呼吸道合胞病毒的抗原蛋白的核苷酸；
第二组合物，其包含免疫有效剂量的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体和药学上可以接受的载体，所述猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体包含编码呼吸道合胞病毒的抗原蛋白的核苷酸；
在本发明的一种实施方式中，第一组合物为初免组合物，所述第二组合物为加强组合物；或者，所述第一组合物为加强组合物，所述第二组合物为初免组合物。
在本发明的一种实施方式中，第一组合物中的人26型复制缺陷型腺病毒载体包含：编码呼吸道合胞病毒的融合前融合糖蛋白(preF)的核苷酸和/或黏附糖蛋白130-230aa(G130-230)的核苷酸，其中，G130-230的核苷酸简称：preF2A3G。
第二组合物中的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体包含：preF的核苷酸和/或G130-230的核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，第一组合物中的人26型复制缺陷型腺病毒载体包含编码具有SEQ ID NO:1的preF的核苷酸；或者，包含编码具有SEQ ID NO:2的G130-230的核苷酸；或者，包含编码具有SEQ ID NO:3的preF的核苷酸和G130-230的核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，第二组合物中的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体包含编码至少三种呼吸道合胞病毒的抗原蛋白的核酸。特别的，包含编码至少三种呼吸道合胞病毒的具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3的抗原蛋白的核酸。
在本发明的一种实施方式中，第一组合物中的人26型复制缺陷型腺病毒载体为rAd26，第二组合物中的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体为rChAd63。
本发明实施例还提供了的一种在机体诱导针对呼吸道合胞病毒的免疫应答的方法，所述方法包括：
A.将包含免疫有效量的腺病毒载体的第一组合物施用于所述受试者，所述腺病毒载体包含编码呼吸道合胞病毒的抗原蛋白的核苷酸；以及
B.将包含免疫有效量的腺病毒载体的第二组合物施用于所述受试者，所述腺病毒载体包含编码呼吸道合胞病毒的抗原蛋白的核苷酸；
其中步骤(A)和步骤(B)以任意顺序进行。
实施例1、编码呼吸道合胞病毒的融合前融合糖蛋白(preF)的重组腺病毒初免-加强免疫
一、动物免疫
6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，分成6组，第0d，采集基础血清，第1d，第一次肌肉注射免疫。在免疫后第21d，第一次免疫后血。第28d，肌肉注射第二次免疫。第49d，第二次免疫后血。第56d，经滴鼻途径进行攻毒实验，攻毒的剂量为1×106pfu/50μl的wtRSV。
分组及处理如下：
第一组(G1组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rChAd63/empty病毒液(病毒量为1×1010vp)，二次免疫物为rChAd63/empty病毒液(病毒量为1×1010vp)；
第二组(G2组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rAd26/empty病毒液(病毒量为1×1010vp)，二次免疫物为rAd63/empty病毒液(病毒量为1×1010vp)；
第三组(G3组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rAd26/empty病毒液(病毒量为1×1010vp)，二次免疫物为rChAd26/empty病毒液(病毒量为1×1010vp)；
第四组(G4组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rChAd63/preF病毒液(病毒量为1×1010vp)，二次免疫物为rChAd63/preF病毒液(病毒量为1×1010vp)；
第五组(G5组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rAd26/preF病毒液(病毒量为1×1010vp)，二次免疫物为rAd63/preF病毒液(病毒量为1×1010vp)；
第六组(G6组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rAd26/preF病毒液(病毒量为1×1010vp)，二次免疫物为rChAd26/preF病毒液(病毒量为1×1010vp)；
二、免疫后小鼠血清IgG检测
待测溶液为：步骤一中免疫后第第49d采集小鼠静脉血，分离获得血清。
采用ELISA方法检测小鼠的血清抗体滴度。纯化RSV按2500pfu/孔包被酶标板、融合前F蛋白(preF)按450ng/孔包被酶标板，融合后F蛋白(postF)1200ng/孔包被酶标板，ELISA方法检测小鼠血清抗体IgG。
三、免疫后小鼠血清中和抗体
1、按照2.0×104细胞/孔的密度将HEp-2细胞接种到96孔板上，培养24h。
2、将免疫后小鼠血清于56℃，灭活30min，并用2％胎牛血清的DMEM培养液进行2倍稀释。不同稀释度的血清中，加入RSV-mGFP使终浓度为1000PFU/100μl，混合后于37℃孵育1h。
3、弃96孔板培养基，PBS洗涤1-2次后，将100μl混合液(含1000PFU的RSV-mGFP)加入到铺有单层HEp-2细胞的96孔板中，37℃培养48h。同时设立空白对照(无病毒、无血清或抗体)、阴性对照组(有RSV-mGFP，无血清)和阳性对照组(RSV多抗替代血清)，培养2d。
4、完成步骤9后，采用多功能酶标仪SpectraMax M5e检测每孔中绿色荧光蛋白的荧光强度(激发波长479nm、发射波长517nm，检测10s)。
5、实验组、阴性对照组、阳性对照组均分别减去空白对照组，利用SPSS建立建立实验组的线性回归方程，通过线性回归方程，计算出荧光强度减少50％的抗体滴度(IC50)。
四、免疫后小鼠细胞免疫效果分析
待测细胞为：步骤一中免疫后第49d小鼠脾细胞。
1、脱颈处死免疫后49d的小鼠，在超净台中无菌采集脾细胞。
2、利用ELISPOT的方法分析细胞免疫效果，计数RSV F蛋白H-2Kd限制性CTL表位刺激后分泌IFN-γ的脾淋巴细胞数量。
3、在超净台中，每孔加入200μl 1640培养基，室温静置5-10min后，弃1640培养基。
4、将细胞悬液加入各实验孔，100μl/well。阳性对照孔、阴性对照孔和实验孔加入细胞2×105cells/well，背景对照孔不加细胞。
5、每孔加入刺激物体积的均为10μl/well，阳性对照孔加入阳性刺激物工作液，阴性对照孔和背景对照孔加入1640无血清培养基，实验孔加入RSV F蛋白H-2Kd限制性CTL表位(KYKNAVTEL和TYMLTNSELL,纯度≥95％)(2×105细胞中各加0.5μg)，37℃，5％C02温箱孵育24-48h。
6、完成步骤5后，倒出孔内细胞及培养基，加入冰冷的去离子水，200μl/well，4℃冰箱放置10min，低渗裂解细胞。
7、倒出孔内液体，1x Washing buffer，200μl/well，洗涤5-7次，每次停留30-60s，并在吸水纸上扣干。
8、将稀释好的生物素标记的抗体工作液加入各实验孔，100μl/well，37℃孵育一小时。
9、完成步骤8后，到处孔内液体，1xWashing buffer，200μl/well，洗涤5-7次，每次停留30-60s，并吸水纸上扣干。
10、将稀释好的酶标亲和素工作液加入各实验孔，100μl/well，37℃孵育一小时。
11、倾倒孔内液体，1xWashing buffer，200μl/well，洗涤5-7次，每次停留30-60s，并在吸水纸上扣干；
12、将现配的AEC显色工作液加入各实验孔，100μl/well，室温静置15-45min。
13、待斑点生长到适合的大小之后，倾倒孔内液体，揭开板底座，以去离子水洗涤3-5遍，终止显色，将板置于室温阴凉处自然晾干，待彻底干燥后，用ELISPOT reader对96孔板进行成像，并ImmunoSpot image analyzer software v4.0分析读取斑点数。
实施例2、共表达呼吸道合胞病毒的融合前融合糖蛋白(preF)和黏附糖蛋白的重组腺病毒初免-加强免疫
一、动物免疫
6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，分成6组，第0d，采集基础血清，第1d，第一次肌肉注射免疫。在免疫后第21d，第一次免疫后血。第28d，肌肉注射第二次免疫。第49d，第二次免疫后血。第56d，经滴鼻途径进行攻毒实验，攻毒的剂量为1×106pfu/50μl的wtRSV。
分组及处理如下：
第一组(G1组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rChAd63/empty病毒液(病毒量为1×1010vp)，二次免疫物为rChAd63/empty病毒液(病毒量为1×1010vp)；
第二组(G2组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rAd26/empty病毒液(病毒量为1×1010vp)，二次免疫物为rAd63/empty病毒液(病毒量为1×1010vp)；
第三组(G3组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rAd26/empty病毒液(病毒量为1×1010vp)，二次免疫物为rChAd26/empty病毒液(病毒量为1×1010vp)；
第四组(G4组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rChAd63/preF2A3G病毒液(病毒量为1×1010vp)，二次免疫物为rChAd63/preF2A3G病毒液(病毒量为1×1010vp)；
第五组(G5组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rAd26/preF2A3G病毒液(病毒量为1×1010vp)，二次免疫物为rAd63/preF2A3G病毒液(病毒量为1×1010vp)；
第六组(G6组)：采用肌肉注射方式进行二次免疫，初次免疫物为rAd26/preF2A3G病毒液(病毒量为1×1010vp)，二次免疫物为rChAd26/preF2A3G病毒液(病毒量为1×1010vp)；
二、免疫后小鼠血清IgG检测
待测溶液为：步骤一中免疫后第第49d采集小鼠静脉血，分离获得血清。
采用ELISA方法检测小鼠的血清抗体滴度。纯化RSV按2500pfu/孔包被酶标板、融合前F蛋白(preF)按450ng/孔包被酶标板，融合后F蛋白(postF)1200ng/孔包被酶标板，G蛋白1600ng/孔包被酶标板ELISA方法检测小鼠血清抗体IgG。
三、免疫后小鼠血清中和抗体
1、按照2.0×104细胞/孔的密度将HEp-2细胞接种到96孔板上，培养24h。
2、将免疫后小鼠血清于56℃，灭活30min，并用2％胎牛血清的DMEM培养液进行2倍稀释。不同稀释度的血清中，加入RSV-mGFP使终浓度为1000PFU/100μl，混合后于37℃孵育1h。
3、弃96孔板培养基，PBS洗涤1-2次后，将100μl混合液(含1000PFU的RSV-mGFP)加入到铺有单层HEp-2细胞的96孔板中，37℃培养48h。同时设立空白对照(无病毒、无血清或抗体)、阴性对照组(有RSV-mGFP，无血清)和阳性对照组(RSV多抗替代血清)，培养2d。
4、完成步骤3后，采用多功能酶标仪SpectraMax M5e检测每孔中绿色荧光蛋白的荧光强度(激发波长479nm、发射波长517nm，检测10s)。
实验组、阴性对照组、阳性对照组均分别减去空白对照组，利用SPSS建立建立实验组的线性回归方程，通过线性回归方程，计算出荧光强度减少50％的抗体滴度(IC50)。
四、免疫后小鼠细胞免疫效果分析
待测细胞为：步骤一中免疫后第49d小鼠脾细胞。
1、脱颈处死免疫后49d的小鼠，在超净台中无菌采集脾细胞。
2、利用ELISPOT的方法分析细胞免疫效果，计数RSV F蛋白H-2Kd限制性CTL表位刺激后分泌IFN-γ的脾淋巴细胞数量。
3、在超净台中，每孔加入200μl 1640培养基，室温静置5-10min后，弃1640培养基。
4、将细胞悬液加入各实验孔，100μl/well。阳性对照孔、阴性对照孔和实验孔加入细胞2×105cells/well，背景对照孔不加细胞。
5、每孔加入刺激物体积的均为10μl/well，阳性对照孔加入阳性刺激物工作液，阴性对照孔和背景对照孔加入1640无血清培养基，实验孔加入RSV F蛋白H-2Kd限制性CTL表位(KYKNAVTEL和TYMLTNSELL,纯度≥95％)(2×105细胞中各加0.5μg)，37℃，5％C02温箱孵育24-48h。
6、完成步骤5后，倒出孔内细胞及培养基，加入冰冷的去离子水，200μl/well，4℃冰箱放置10min，低渗裂解细胞。
7、倒出孔内液体，1xWashing buffer，200μl/well，洗涤5-7次，每次停留30-60s，并在吸水纸上扣干。
8、将稀释好的生物素标记的抗体工作液加入各实验孔，100μl/well，37℃孵育一小时。
9、完成步骤8后，到处孔内液体，1xWashing buffer，200μl/well，洗涤5-7次，每次停留30-60s，并吸水纸上扣干。
10、将稀释好的酶标亲和素工作液加入各实验孔，100μl/well，37℃孵育一小时。
11、倾倒孔内液体，1xWashing buffer，200μl/well，洗涤5-7次，每次停留30-60s，并在吸水纸上扣干；
12、将现配的AEC显色工作液加入各实验孔，100μl/well，室温静置15-45min。
13、待斑点生长到适合的大小之后，倾倒孔内液体，揭开板底座，以去离子水洗涤3-5遍，终止显色，将板置于室温阴凉处自然晾干，待彻底干燥后，用ELISPOT reader对96孔板进行成像，并ImmunoSpot image analyzer software v4.0分析读取斑点数。
序列表
SEQ ID NO:1
融合前融合糖蛋白，A2株(核苷酸序列)：
ATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACCGCTGTGACCTTCTGCTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAATTCTACCAGAGCACCTGTAGCGCCGTGTCCAAGGGCTACCTGAGCGCCCTGCGGACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGAAAATCAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGATCAAGCTGATCAAGCAGGAACTGGACAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGAGCACCCCCGCCACCAACAACCAGGCTAGA__________GGC___________AGC_________GGA__________AGC__________GGA___________CGGTCCCTGGGCTTCCTGCTGGGCGTGGGCAGCGCCATTGCTAGCGGAGTGGCCGTGTCAAAGGTGCTGCACCTGGAAGGCGAAGTGAACAAGATCAAGTCCGCCCTGCTGAGCACCAACAAGGCCGTGGTGTCCCTGAGCAACGGCGTGTCCGTGCTGACCAGCAAGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCCCCAACATCGAGACAGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAAATCACCCGCGAGTTCAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACCCCCGTGTCCACCTACATGCTGACCAACAGCGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACTCCATCATGAGCATCATCAAAGAAGAGGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCCCTGTACGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCAGCCCCCTGTGCACCACCAACACCAAAGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCCGGACCGACCGGGGCTGGTACTGCGATAATGCCGGCAGCGTGTCATTCTTTCCACAAGCCGAGACATGCAAGGTGCAGAGCAACCGGGTGTTCTGCGACACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCTCCGAAGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCTAAGTACGACTGCAAGATCATGACCTCCAAGACCGACGTGTCCAGCTCCGTGATCACCTCCCTGGGCGCCATCGTGTCCTGCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACGTGTCCAACAAGGGGGTGGACACCGTGTCCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAACAGGAAGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCCCTGGTGTTCCCCAGCGACCAGTTCGACGCCAGCATCAGCCAGGTCAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATCAGAAAGAGCGACGAGCTGCTGCACAATGTGAATGCCGTGAAGTCCACCACCAATATCATGATCACCACAATCATCATCGTGATCATCGTCATCCTGCTGTCCCTGATCGCCGTGGGCCTGCTGCTGTACTGCAAGGCCCGGTCCACCCCTGTGACCCTGTCCAAGGACCAGCTGAGCGGCATCAACAATATCGCCTTCTCCAACTGA
SEQ ID NO:2
黏附糖蛋白，A2株(核苷酸序列)：
ATG gac gcc atg aag agg ggc ctg tgc tgc gtg ctg ctg ctg tgc ggc gccgtgttc gtg agc ccc agc ACC GTG AAA ACA AAG AAC ACC ACC
ACCACCCAGACCCAGCCCAGCAAGCCCACCACCAAGCAGCGGCAGAACAAGCCCCCCAACAAGCCCAACAACGACTTCCACTTCGAGGTGTTCAACTTCGTGCCCTGCAGCATCTGCAGCAACAACCCTACCTGCTGGGCCATCTGCAAGCGGAAGCCTAACAAGAAGCCCGGCAAGAAAACCACCACAAAGCCCACCAAGAAGCCTACCTTCAAG
ACCACAAAGAAGGACCTGAAGCCCCAGACCACCAAGCCCAAAGAGGTGCCCACCACTAAGCCCGGAGGCGGCGGATCCACAGTGAAAACTAAGAATACCACAACAACACAGACACAGCCTTCCAAGCCTACAACAAAACAGAGGCAGAACAAACCTCCTAACAAACCTAACAATGATTTTCACTTTGAAGTGTTCAATTTTGTGCCTTGCTCCATCTGCTCCAACAATCCAACATGTTGGGCTATCTGTAAACGCAAACCCAACAAGAAACCTGGGAAAAAGACCACCACCAAACCTACAAAGAAACCCACCTTTAAAACCACCAAGAAAGATCTGAAACCTCAGACAACAAAACCTAAAGAAGTGCCTACTACCAAGCCCGGAGGCGGCGGATCCACCGTGAAAACAAAAAACACAACAACAACTCAGACTCAGCCCTCTAAACCCACAACTAAGCAGAGACAGAACAAGCCTCCAAACAAGCCAAACAATGATTTCCATTTCGAAGTGTTTAACTTTGTGCCATGTTCTATCTGTTCTAACAATCCCACTTGTTGGGCCATCTGCAAAAGAAAGCCAAACAAAAAACCCGGCAAAAAGACAACAACTAAGCCTACCAAAAAGCCCACATTCAAAACTACCAAAAAGGATCTGAAGCCACAGACAACTAAGCCAAAAGAAGTGCCCACAACAAAACCC TGATAA
SEQ ID NO:3
融合前融合糖蛋白+黏附糖蛋白，A2株(核苷酸序列)：
ATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCACCATCCTGACCGCTGTGACCTTCTGCTTCGCCAGCGGCCAGAACATCACCGAGGAATTCTACCAGAGCACCTGTAGCGCCGTGTCCAAGGGCTACCTGAGCGCCCTGCGGACCGGCTGGTACACCAGCGTGATCACCATCGAGCTGAGCAACATCAAGAAAATCAAGTGCAACGGCACCGACGCCAAGATCAAGCTGATCAAGCAGGAACTGGACAAGTACAAGAACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGAGCACCCCCGCCACCAACAACCAGGCTAGAGGCAGCGGAAGCGGACGGTCCCTGGGCTTCCTGCTGGGCGTGGGCAGCGCCATTGCTAGCGGAGTGGCCGTGTCAAAGGTGCTGCACCTGGAAGGCGAAGTGAACAAGATCAAGTCCGCCCTGCTGAGCACCAACAAGGCCGTGGTGTCCCTGAGCAACGGCGTGTCCGTGCTGACCAGCAAGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCCCATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCCCCAACATCGAGACAGTGATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAAATCACCCGCGAGTTCAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACCCCCGTGTCCACCTACATGCTGACCAACAGCGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATGCCCATCACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAGATCGTGCGGCAGCAGAGCTACTCCATCATGAGCATCATCAAAGAAGAGGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCCCTGTACGGCGTGATCGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCAGCCCCCTGTGCACCACCAACACCAAAGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCCGGACCGACCGGGGCTGGTACTGCGATAATGCCGGCAGCGTGTCATTCTTTCCACAAGCCGAGACATGCAAGGTGCAGAGCAACCGGGTGTTCTGCGACACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCTCCGAAGTGAACCTGTGCAACGTGGACATCTTCAACCCTAAGTACGACTGCAAGATCATGACCTCCAAGACCGACGTGTCCAGCTCCGTGATCACCTCCCTGGGCGCCATCGTGTCCTGCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAAGAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACGTGTCCAACAAGGGGGTGGACACCGTGTCCGTGGGCAACACCCTGTACTACGTGAACAAACAGGAAGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGGCGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCCCTGGTGTTCCCCAGCGACCAGTTCGACGCCAGCATCAGCCAGGTCAACGAGAAGATCAACCAGAGCCTGGCCTTCATCAGAAAGAGCGACGAGCTGCTGCACAATGTGAATGCCGTGAAGTCCACCACCAATATCATGATCACCACAATCATCATCGTGATCATCGTCATCCTGCTGTCCCTGATCGCCGTGGGCCTGCTGCTGTACTGCAAGGCCCGGTCCACCCCTGTGACCCTGTCCAAGGACCAGCTGAGCGGCATCAACAATATCGCCTTCTCCAACGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCGGTACCGCCACCATGgacgccatgaagaggggcctgtgctgcgtgctgctgctgtgcggcgccgtgttcgtgagccccagcACCGTGAAAACAAAGAACACCACCACCACCCAGACCCAGCCCAGCAAGCCCACCACCAAGCAGCGGCAGAACAAGCCCCCCAACAAGCCCAACAACGACTTCCACTTCGAGGTGTTCAACTTCGTGCCCTGCAGCATCTGCAGCAACAACCCTACCTGCTGGGCCATCTGCAAGCGGAAGCCTAACAAGAAGCCCGGCAAGAAAACCACCACAAAGCCCACCAAGAAGCCTACCTTCAAGACCACAAAGAAGGACCTGAAGCCCCAGACCACCAAGCCCAAAGAGGTGCCCACCACTAAGCCCGGAGGCGGCGGATCCACAGTGAAAACTAAGAATACCACAACAACACAGACACAGCCTTCCAAGCCTACAACAAAACAGAGGCAGAACAAACCTCCTAACAAACCTAACAATGATTTTCACTTTGAAGTGTTCAATTTTGTGCCTTGCTCCATCTGCTCCAACAATCCAACATGTTGGGCTATCTGTAAACGCAAACCCAACAAGAAACCTGGGAAAAAGACCACCACCAAACCTACAAAGAAACCCACCTTTAAAACCACCAAGAAAGATCTGAAACCTCAGACAACAAAACCTAAAGAAGTGCCTACTACCAAGCCCGGAGGCGGCGGATCCACCGTGAAAACAAAAAACACAACAACAACTCAGACTCAGCCCTCTAAACCCACAACTAAGCAGAGACAGAACAAGCCTCCAAACAAGCCAAACAATGATTTCCATTTCGAAGTGTTTAACTTTGTGCCATGTTCTATCTGTTCTAACAATCCCACTTGTTGGGCCATCTGCAAAAGAAAGCCAAACAAAAAACCCGGCAAAAAGACAACAACTAAGCCTACCAAAAAGCCCACATTCAAAACTACCAAAAAGGATCTGAAGCCACAGACAACTAAGCCAAAAGAAGTGCCCACAACAAAACCCTGATAA
图1为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的preF特异性IgG；
图2为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的postF特异性IgG；
图3为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的血清中和抗体；
图4为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的RSV F特异性CD8+T细胞免疫应答；
图5为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的preF特异性IgG；
图6为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的postF特异性IgG；
图7为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的G特异性IgG；
图8为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的血清中和抗体；
图9为本发明实施例提供的一种重组腺病毒诱导BALB/c小鼠产生的RSV F特异性CD8+T细胞免疫应答。
综上所述，本发明实施例提供了一种针对呼吸道合胞病毒感染的组合疫苗，用于诱导针对呼吸道合胞病毒感染的保护性免疫，提供针对呼吸道合胞病毒感染的保护性免疫的组合物、疫苗和方法。能够规避同源免疫产生的腺病毒抗体对疫苗免疫效果的影响，增强疫苗免疫效果。
本领域普通技术人员可以理解：附图只是一个实施例的示意图，附图中的模块或流程并不一定是实施本发明所必须的。
本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于装置或系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述得比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。以上所描述的装置及系统实施例仅仅是示意性的，其中所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性劳动的情况下，即可以理解并实施。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京交通大学 北京智飞绿竹生物制药有限公司
<120> 一种针对呼吸道合胞病毒感染的组合疫苗
<130> 2020.12.11
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1659
<212> DNA
<213> Prefusion fusion glycoprotein
<400> 1
atggaactgc tgatcctgaa ggccaacgcc atcaccacca tcctgaccgc tgtgaccttc 60
tgcttcgcca gcggccagaa catcaccgag gaattctacc agagcacctg tagcgccgtg 120
tccaagggct acctgagcgc cctgcggacc ggctggtaca ccagcgtgat caccatcgag 180
ctgagcaaca tcaagaaaat caagtgcaac ggcaccgacg ccaagatcaa gctgatcaag 240
caggaactgg acaagtacaa gaacgccgtg accgagctgc agctgctgat gcagagcacc 300
cccgccacca acaaccaggc tagaggcagc ggaagcggac ggtccctggg cttcctgctg 360
ggcgtgggca gcgccattgc tagcggagtg gccgtgtcaa aggtgctgca cctggaaggc 420
gaagtgaaca agatcaagtc cgccctgctg agcaccaaca aggccgtggt gtccctgagc 480
aacggcgtgt ccgtgctgac cagcaaggtg ctggatctga agaactacat cgacaagcag 540
ctgctgccca tcgtgaacaa gcagagctgc agcatcccca acatcgagac agtgatcgag 600
ttccagcaga agaacaaccg gctgctggaa atcacccgcg agttcagcgt gaacgccggc 660
gtgaccaccc ccgtgtccac ctacatgctg accaacagcg agctgctgag cctgatcaac 720
gacatgccca tcaccaacga ccagaaaaag ctgatgagca acaacgtgca gatcgtgcgg 780
cagcagagct actccatcat gagcatcatc aaagaagagg tgctggccta cgtggtgcag 840
ctgcccctgt acggcgtgat cgacaccccc tgctggaagc tgcacaccag ccccctgtgc 900
accaccaaca ccaaagaggg cagcaacatc tgcctgaccc ggaccgaccg gggctggtac 960
tgcgataatg ccggcagcgt gtcattcttt ccacaagccg agacatgcaa ggtgcagagc 1020
aaccgggtgt tctgcgacac catgaacagc ctgaccctgc cctccgaagt gaacctgtgc 1080
aacgtggaca tcttcaaccc taagtacgac tgcaagatca tgacctccaa gaccgacgtg 1140
tccagctccg tgatcacctc cctgggcgcc atcgtgtcct gctacggcaa gaccaagtgc 1200
accgccagca acaagaaccg gggcatcatc aagaccttca gcaacggctg cgactacgtg 1260
tccaacaagg gggtggacac cgtgtccgtg ggcaacaccc tgtactacgt gaacaaacag 1320
gaaggcaaga gcctgtacgt gaagggcgag cccatcatca acttctacga ccccctggtg 1380
ttccccagcg accagttcga cgccagcatc agccaggtca acgagaagat caaccagagc 1440
ctggccttca tcagaaagag cgacgagctg ctgcacaatg tgaatgccgt gaagtccacc 1500
accaatatca tgatcaccac aatcatcatc gtgatcatcg tcatcctgct gtccctgatc 1560
gccgtgggcc tgctgctgta ctgcaaggcc cggtccaccc ctgtgaccct gtccaaggac 1620
cagctgagcg gcatcaacaa tatcgccttc tccaactga 1659
<210> 2
<211> 1014
<212> DNA
<213> The 130-230aa of attachment glycoprotein
<400> 2
atggacgcca tgaagagggg cctgtgctgc gtgctgctgc tgtgcggcgc cgtgttcgtg 60
agccccagca ccgtgaaaac aaagaacacc accaccaccc agacccagcc cagcaagccc 120
accaccaagc agcggcagaa caagcccccc aacaagccca acaacgactt ccacttcgag 180
gtgttcaact tcgtgccctg cagcatctgc agcaacaacc ctacctgctg ggccatctgc 240
aagcggaagc ctaacaagaa gcccggcaag aaaaccacca caaagcccac caagaagcct 300
accttcaaga ccacaaagaa ggacctgaag ccccagacca ccaagcccaa agaggtgccc 360
accactaagc ccggaggcgg cggatccaca gtgaaaacta agaataccac aacaacacag 420
acacagcctt ccaagcctac aacaaaacag aggcagaaca aacctcctaa caaacctaac 480
aatgattttc actttgaagt gttcaatttt gtgccttgct ccatctgctc caacaatcca 540
acatgttggg ctatctgtaa acgcaaaccc aacaagaaac ctgggaaaaa gaccaccacc 600
aaacctacaa agaaacccac ctttaaaacc accaagaaag atctgaaacc tcagacaaca 660
aaacctaaag aagtgcctac taccaagccc ggaggcggcg gatccaccgt gaaaacaaaa 720
aacacaacaa caactcagac tcagccctct aaacccacaa ctaagcagag acagaacaag 780
cctccaaaca agccaaacaa tgatttccat ttcgaagtgt ttaactttgt gccatgttct 840
atctgttcta acaatcccac ttgttgggcc atctgcaaaa gaaagccaaa caaaaaaccc 900
ggcaaaaaga caacaactaa gcctaccaaa aagcccacat tcaaaactac caaaaaggat 960
ctgaagccac agacaactaa gccaaaagaa gtgcccacaa caaaaccctg ataa 1014
<210> 3
<211> 2736
<212> DNA
<213> Prefusion fusion glycoprotein and attachment glycoprotein
<400> 3
atggaactgc tgatcctgaa ggccaacgcc atcaccacca tcctgaccgc tgtgaccttc 60
tgcttcgcca gcggccagaa catcaccgag gaattctacc agagcacctg tagcgccgtg 120
tccaagggct acctgagcgc cctgcggacc ggctggtaca ccagcgtgat caccatcgag 180
ctgagcaaca tcaagaaaat caagtgcaac ggcaccgacg ccaagatcaa gctgatcaag 240
caggaactgg acaagtacaa gaacgccgtg accgagctgc agctgctgat gcagagcacc 300
cccgccacca acaaccaggc tagaggcagc ggaagcggac ggtccctggg cttcctgctg 360
ggcgtgggca gcgccattgc tagcggagtg gccgtgtcaa aggtgctgca cctggaaggc 420
gaagtgaaca agatcaagtc cgccctgctg agcaccaaca aggccgtggt gtccctgagc 480
aacggcgtgt ccgtgctgac cagcaaggtg ctggatctga agaactacat cgacaagcag 540
ctgctgccca tcgtgaacaa gcagagctgc agcatcccca acatcgagac agtgatcgag 600
ttccagcaga agaacaaccg gctgctggaa atcacccgcg agttcagcgt gaacgccggc 660
gtgaccaccc ccgtgtccac ctacatgctg accaacagcg agctgctgag cctgatcaac 720
gacatgccca tcaccaacga ccagaaaaag ctgatgagca acaacgtgca gatcgtgcgg 780
cagcagagct actccatcat gagcatcatc aaagaagagg tgctggccta cgtggtgcag 840
ctgcccctgt acggcgtgat cgacaccccc tgctggaagc tgcacaccag ccccctgtgc 900
accaccaaca ccaaagaggg cagcaacatc tgcctgaccc ggaccgaccg gggctggtac 960
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accaatatca tgatcaccac aatcatcatc gtgatcatcg tcatcctgct gtccctgatc 1560
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cagctgagcg gcatcaacaa tatcgccttc tccaacgagg gccgcggcag cctgctgacc 1680
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acaaagaaca ccaccaccac ccagacccag cccagcaagc ccaccaccaa gcagcggcag 1860
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aagcccggca agaaaaccac cacaaagccc accaagaagc ctaccttcaa gaccacaaag 2040
aaggacctga agccccagac caccaagccc aaagaggtgc ccaccactaa gcccggaggc 2100
ggcggatcca cagtgaaaac taagaatacc acaacaacac agacacagcc ttccaagcct 2160
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gtgttcaatt ttgtgccttg ctccatctgc tccaacaatc caacatgttg ggctatctgt 2280
aaacgcaaac ccaacaagaa acctgggaaa aagaccacca ccaaacctac aaagaaaccc 2340
acctttaaaa ccaccaagaa agatctgaaa cctcagacaa caaaacctaa agaagtgcct 2400
actaccaagc ccggaggcgg cggatccacc gtgaaaacaa aaaacacaac aacaactcag 2460
actcagccct ctaaacccac aactaagcag agacagaaca agcctccaaa caagccaaac 2520
aatgatttcc atttcgaagt gtttaacttt gtgccatgtt ctatctgttc taacaatccc 2580
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aagcctacca aaaagcccac attcaaaact accaaaaagg atctgaagcc acagacaact 2700
aagccaaaag aagtgcccac aacaaaaccc tgataa 2736
Claims (3)
1.一种针对呼吸道合胞病毒感染的组合疫苗，其特征在于，包括：第一组合物和第二组合物；
所述第一组合物，其包含免疫有效剂量的人26型复制缺陷型腺病毒载体和药学上可以接受的载体，所述人26型复制缺陷型腺病毒载体包含编码呼吸道合胞病毒的抗原蛋白的核苷酸；
所述第二组合物，其包含免疫有效剂量的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体和药学上可以接受的载体，所述猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体包含编码呼吸道合胞病毒的抗原蛋白的核苷酸；
其中，所述第一组合物为初免组合物，所述第二组合物为加强组合物；或者，所述第一组合物为加强组合物，所述第二组合物为初免组合物；
所述第一组合物中的人26型复制缺陷型腺病毒载体包含编码呼吸道合胞病毒的融合前融合糖蛋白preF的核苷酸和黏附糖蛋白130-230aaG130-230的核苷酸；
所述第二组合物中的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体包含preF的核苷酸和G130-230的核苷酸；
所述第一组合物中的人26型复制缺陷型腺病毒载体包含SEQ ID NO:3编码的preF和G130-230的核苷酸；
所述第二组合物中的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体包含SEQ ID NO:3编码的preF和G130-230的核苷酸。
2.根据权利要求1所述的组合疫苗，其特征在于，所述第一组合物中的人26型复制缺陷型腺病毒载体为rAd26，所述第二组合物中的猩猩63型复制缺陷型腺病毒载体为rChAd63。
3.根据权利要求1或2所述的组合疫苗，其特征在于，所述组合疫苗用于产生针对呼吸道合胞病毒感染的保护性免疫，其中所述第一免疫物用于引发所述免疫应答，所述第二组合物用于加强所述免疫应答；或者，所述第二免疫物用于引发所述免疫应答，所述第一组合物用于加强所述免疫应答。
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