CN108348595A - 活重组麻疹-m2病毒-其在诱发针对流感病毒的免疫力中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种活性成分，其是表达甲型流感病毒抗原的减毒活重组麻疹病毒，并涉及其在诱发免疫力的应用，特别是针对甲型流感病毒的保护性免疫和有利的广谱保护性免疫。特别地，甲型流感病毒选自流行的季节性病毒和/或在人群中循环的流行病毒，并且有利地包括大流行性病毒例如H1N1v。

Description

活重组麻疹-M2病毒-其在诱发针对流感病毒的免疫力中的 应用

本发明涉及针对甲型流感病毒的免疫性领域。在这方面，本发明提供了源自流感病毒的载体化抗原，其引发针对甲型流感病毒的免疫应答。本发明因此涉及一种活性成分，其是表达甲型流感病毒抗原的减毒活重组麻疹病毒，以及涉及其在诱发免疫力中的应用，特别是针对甲型流感病毒的保护性免疫和有利的广谱保护性免疫。

流感是由流感病毒引起的，在季节性流行期间，流感病毒通常会感染世界各地的人，导致大量受感染的人类宿主的严重疾病或死亡。除了季节性流行之外，流感病毒还可能成为可能导致大流行病的新型菌株。

流感病毒分类为甲型流感、乙型流感和丙型流感，甲型流感病毒株被认为是导致季节性疾病和大流行性流感爆发的主要病原体。甲型流感病毒通过参考表面抗原来分类，该表面抗原是已经鉴定了18个亚型的血凝素抗原(HA)和定义了11个亚型的神经氨酸酶抗原(NA)。因此，定义一种病毒株为A/HxNy，其中“x”限定HA的亚型，“Y”限定NA 抗原的亚型。已知这些表面抗原构成免疫应答的靶标。在各种亚型中，A/H1N1和A/H3N2 分别是自1918年和1968年以来在人群中循环的病毒亚型；由此认为它们衍生出适合设计季节性疫苗的抗原，因此它们的HA和NA抗原相应地包含在针对季节性流感的疫苗组合物中。然而，由于HA和NA抗原在宿主免疫系统的选择性压力下在病毒株中不断进化，故利用这些抗原的疫苗必须每年重新设计并更新。HA和NA经历两种类型的抗原进化。第一种类型是抗原漂移，其对应于随着时间累积的点突变并导致抗原性不同的病毒。第二种类型是抗原转变(antigenicshift)，感染人类的甲型流感病毒的突然和主要改变，导致新的血凝素和/或新的血凝素和神经氨酸酶蛋白。转变是由于在人群中引入新的甲型流感病毒亚型或带有血凝素或血凝素/神经氨酸酶组合的病毒所导致的，其与人体中的同一亚型是如此不同以致大多数人对新病毒没有免疫力。这种“转变”发生在2009年，一种新的H1N1病毒株(称为H1N1pdm或H1N1v)出现并迅速传播，引起大流行性疾病并最终替代季节性 H1N1。

因此，仍然有必要提出替代疫苗的候选，其可避免与甲型流感病毒抗原的高度变异相关的缺点，并且，还能够提供针对较广范围的甲型流感病毒株，特别是流行性甲型流感病毒株和大流行性甲型流感病毒株的保护。然而，在制定和公开的策略中遇到了困难，即使这样的策略旨在在不同流感病毒株中靶向保守流感抗原基序，特别是核蛋白(NP)，基质(M1和M2)蛋白质或HA糖蛋白中的保守基序。

基于M2的流感疫苗由于其保守的氨基酸序列，而被提出作为诱发针对流感病毒的免疫应答的有希望的靶标。特别是已经公开了使用蛋白质的胞外域(M2e)的各种候选疫苗。然而，尚未证实使用M2或M2e抗原的各种尝试诱发抗体或T细胞应答，该应答要足够强且持久以有效且广泛地保护人类对抗流感病毒，不论是针对季节性病毒还是大流行性病毒，并且这些结果与在感染期间观察到的该抗原的弱免疫力相关(Deng L.等，2015)。

M2蛋白的M2e胞外域也是各种研究的主题，试图确定其在设计疫苗中的优势(interest)，因为M2e似乎在任何亚型的人类流行性病毒株中均高度保守，并且似乎不参与影响免疫竞争的漂移/转变现象(例如，用HA抗原所观察到的)，从而当定义能够诱发长效应答的广谱甲型流感疫苗时，使得这种M2e抗原成为诱发针对流感病毒感染的保护性应答的有吸引力的抗原。然而，该结构域在感染和常规疫苗接种过程中也仅具有最小的免疫原性，这可能是由于病毒体中M2的丰度低。然而，已经观察到，当用第一病毒感染引发的哺乳动物宿主用包含异源亚型的流感病毒再感染而增强时，B细胞库能够产生特异性抗-M2e抗体应答(Deng L.等，2015)。

因此，发明人已经推定M2抗原，特别是含有M2e结构域的M2抗原部分的优势需要进一步思考以改善其潜力，并可能需要开发适当的载体分子或系统。

为了开发针对可用于儿童(特别是幼儿或婴儿)或成年人群的季节性或新出现的或大流行性流感病毒的疫苗，发明人设计了基于通过麻疹病毒载体表达M2流感抗原(或其合适的部分)的策略，其中特别是麻疹病毒选自活的减毒麻疹病毒如疫苗麻疹病毒。

因此，本发明提出了一种用于载体化包含M2衍生抗原的流感抗原的新方法，其中该方法受益于载体性质和可能的载体免疫性质并且显示出提高的免疫原性。因此，它们提供了一种重组的减毒活麻疹病毒，其能够在人类个体中诱发免疫应答，该应答针对甲型流感病毒感染引起的疾病将是有效的和持久的。

本发明涉及麻疹病毒作为载体表达甲型流感病毒免疫原或表位的应用，其中所述免疫原或表位包括来源于M2蛋白的多肽(包括M2蛋白)，特别是M2蛋白的胞外域，其中所述M2蛋白有利地是由来自甲型流感病毒株的多个M2蛋白的氨基酸序列衍生的共有氨基酸序列表达的蛋白质。

因此，本发明涉及至少表达第一抗原的重组麻疹病毒(MV)，其中，第一抗原包含或由如下构成：(i)M2抗原，其氨基酸序列是共有氨基酸序列，所述共有氨基酸序列代表包括循环的季节性人类病毒和任选的一种或多种大流行性人类病毒在内的多种甲型流感病毒亚型的选集中的M2序列，和/或包括动物病毒，特别是地方性动物病毒和任选的据报道已感染人类对象并被认为有大流行风险的动物病毒在内的多种甲型流感病毒亚型的选集中的M2序列，(ii)包含(i)的所述M2抗原的胞外域的部分或由所述胞外域构成的部分(基于M2e的抗原)。

根据本发明制备的重组麻疹病毒来源于麻疹病毒，其有利地是活的减毒麻疹病毒，例如被认可为疫苗株的病毒。麻疹病毒的疫苗株可以通过测定来自临床样品或病毒分离株的基因型而与野生型病毒区分开来。(参见用于通过RT-PCR或病毒分离实验室工具检测麻疹RNA的样本-疾病控制和预防中心。)

因此，适合于实施本发明的麻疹病毒可以是已知为减毒活疫苗株的施瓦茨(Schwarz)菌株(来自于安内特巴斯德-法国或来自于葛兰素史克制药有限公司-澳大利亚)或显示具有与施瓦茨菌株相同的核苷酸序列的莫拉特纳(Moraten) 菌株、或AIK-C菌株、萨格勒布(Zagreb)菌株(埃德蒙斯顿(Edmonston)系的疫苗株)、或TD97菌株、CAM70菌株、列宁格勒-16(Leningrad-16)菌株、上海-191菌株、长春-47 菌株(来源于不同的野生型分离物)(Bankamp B.等，2011)。在一个特定实施方案中，使用施瓦茨菌株或莫拉特纳菌株。

在本发明的一个具体实施方案中，重组麻疹病毒是从对应于病毒株的全长反基因链RNA的cDNA中开始获得的并且是由减毒活MV株(特别是根据在WO 04/000876 (通过引用并入)中完全公开的方法的施瓦茨或莫拉特纳菌株)的病毒颗粒克隆的，而且重组病毒是根据WO04/000876申请中公开的用于拯救麻疹病毒颗粒的方法拯救的，由制备编码病毒的全长反基因链(+)RNA的cDNA开始。关于MV cDNA的制备和克隆的MV 施瓦茨菌株的拯救，也参照Combredet C等(2003)进行。相同的拯救方法也可用于上述引用的使用病毒RNA的分子克隆的其他菌株。根据本发明的重组麻疹病毒可以在维洛 (Vero)细胞上生长。重组MV可以呈现用于液体制剂中。实施例部分在这方面也提供了关于制备重组麻疹病毒颗粒的相关指示。

根据本发明的“共有序列”，特别地，共有氨基酸序列是分别作为以下构思或选择方法之一结果的氨基酸序列的序列：

a)它来源于(即，被定义)鉴定所选病毒株(特别是甲型流感病毒株)的确定的蛋白质的多个序列的比对，并且其中每个残基，特别是每个氨基酸残基，是在已知或特别是公布的已经分离的病毒株中出现的不同选择序列中的比对位点上最频繁的一个残基。因此，在所有选择序列中的给定位点处所共有的残基存在于所述位点的共有序列中，并且当选择序列中的给定位点处的残基是可变时，最经常被发现的残基保留在这个位点处的共有序列中。当所考虑的残基在为定义共有序列所选择的所有序列中不同时，该残基的识别(identity)可以选择对应于在相关的时间段或在对健康的影响方面最主要的病毒序列中的残基，或

b)它是(i)特定的流感病毒、特别是甲型流感病毒的序列，其被选择是因为其能够引发足够宽的免疫应答来形成针对其他病毒(包括来自不同亚型或谱系的病毒)的保护，或(ii)它是特定病毒簇的序列，该簇不显示序列多样性并且针对该簇寻求免疫应答，这样的簇被大流行病毒阐明。

相应地，根据本发明的共有序列是代表性序列，是对其进行构建步骤的结果或是基于现有病毒序列；特别但不一定地，其是一组测定的实际序列的理论代表性序列。或者，共有序列是实际病毒的序列，然而其基本上通过足够数量的病毒在至少一个谱系或亚型或簇中共享，并且因此，共有序列在至少感兴趣的蛋白质/抗原(如甲型流感病毒的M2或M2e 或NP或M1多肽)的氨基酸残基序列中没有显示出分歧(即，在所关注的组内所考虑的序列的比较显示出小于10％的差异)，以为免疫原性产物的定义提供相关性，以期设计疫苗。根据本发明使用共有序列来表达作为核酸分子或多肽的分子。

当在本公开中提及共有序列时，根据本领域技术人员的理解，除了以不同的方式指定或技术上不适宜之外，这些替代方案中的每一个都可以被设想。在本发明的一个具体实施方案中，共有序列是如a)中获得的序列。

根据本发明的“M2抗原”是甲型流感病毒的结构四聚体III型跨膜蛋白，并且在人甲型流感病毒亚型中高度保守。M2蛋白在病毒感染细胞的表面大量表达。在感染了甲型流感病毒后，在恢复期个体的血清中发现针对M2的抗体。M2蛋白含有97个氨基酸并且由源自流感基因片段7的剪接mRNA表达，流感基因片段7也编码基质M1。M2主要作为具有离子通道活性的病毒孔蛋白(viroporin)。根据本发明，M2抗原的氨基酸序列是天然病毒序列或者是来自本文公开的各种病毒的共有序列。

根据本发明的M2抗原(指定M2e)的“胞外域”是位于M2蛋白的N-末端部分 (以M2蛋白的残基2开始)上的甲型流感病毒中M2蛋白的外部结构域。该结构域为23 个氨基酸长度(其中9个残基也存在于M1蛋白中，是最保守的残基)。

在本发明的具体实施方案中，M2蛋白的共有序列用于定义M2e抗原。在一个实施方案中，M2抗原的共有序列(特别适用于设计M2e抗原)包括来自于季节性A/H1N1 和A/H3N2病毒亚型和任选的A/H9N2的这些多肽的序列比对。在另一个实施方案中，共有序列通过将来自这些菌株的抗原序列一起与来自2009年发现的大流行性病毒株 pdmH1N1(也指H1N1v)的相应序列进行比对而获得。在另一个实施方案中，M2抗原的共有序列(特别适用于设计M2e抗原)也包括来自于禽类A/H5N1、A/H9N2和A/H7N9 病毒亚型的这些多肽的序列比对。在另一个实施方案中，M2抗原的共有序列(特别适用于设计M2e抗原)也包括来自于禽类A/H5N1、A/H9N2和A/H7N9病毒亚型的这些多肽的序列比对，并进一步包括来自于在人类中检测到的H5N6和H10N8病毒亚型的这些多肽的序列比对。在另一个实施方案中，共有序列通过将来自这些菌株(特别是根据上述各种组)的抗原序列一起与来自大流行性病毒株pdmH1N1(也指H1N1v)的相应序列进行比对而获得。在另一个实施方案中，比对可以进一步包括作为流行性毒株或大流行性毒株新出现的甲型流感毒株的相应序列，或者据报道已感染人类对象并被认为构成大流行风险的流感动物菌株的相应序列。在一个具体的实施方案中，M2或M2e共有氨基酸序列是人类或禽类共有序列。

根据本发明的抗原的“部分”是由抗原片段构成(consists in a fragment ofthe antigen)的分子，其中该片段的氨基酸序列相应地比抗原的氨基酸序列短，并含有抗原全长序列的一段连续残基。这种部分的氨基酸序列具有抗原序列的至少6个连续氨基酸残基，并且有利地包含或由抗原B和/或T细胞表位中的一个或多个表位组成。它可能少于或等于25个氨基酸残基长。

在本发明的一个实施方案中，用于设计M2抗原的共有序列的甲型流感病毒包括源自不同病毒谱系或不同病毒亚型或不同病毒簇的季节性病毒。任选地，这些病毒进一步包括大流行毒株或据报道已感染人类对象并被认为构成大流行风险的动物菌株。在一种病毒谱系中，可以使用一种或多种病毒作为参考。在甲型流感病毒谱系中，特别考虑了以下几点：自1977年重新出现的人类H1N1谱系，自1968年出现的人类H3N2谱系，自2009 年最近出现的人类H1N1v谱系，以及可能在人群中出现并构成大流行风险(WHO)的禽类H5N1、H9N2或H7N9病毒的谱系。其他动物病毒亚型，包括禽类H2和H9病毒以及猪H1和H3病毒也可能构成大流行的威胁，从而被特别考虑。流感病毒及其多肽的序列可以在数据库如NCBI中获得，其中一旦新的病毒或分离物被鉴定就更新。因此用于设计 M2抗原或其M2e部分的共有序列的病毒的选择，可考虑随时间变化谱系中的菌株多样性或给定亚型内菌株的总体多样性。如果进行比对来获得共有序列，则在各种亚型或各种谱系或各种簇的抗原的氨基酸序列之间进行比对之前，可以在每个亚型或谱系内进行比对步骤(在一个簇内未观察到显著分歧，特别是小于3％或不大于2％的差异)以设计反映病毒各亚型或谱系的菌株多样性的共有序列。在实施例部分，提供了为设计共有序列而进行的步骤的说明，所提出的方法可以类似地应用于其他选择的病毒谱系，而不是表征H1N1、 H3N2和大流行H1N1v的那些。

发明人已经观察到，表达流感M2抗原或基于M2e的抗原的本发明的重组麻疹病毒，在对麻疹病毒感染敏感的小鼠中诱发针对流感抗原的抗体应答，所述应答比被同型流感病毒株自然感染后观察到的应答更强。另外，发明人已经证实，可以通过加强施用表达流感M2抗原或基于M2e的抗原的重组麻疹病毒来增加应答。

令人惊奇的是，发明人另外证实，用本发明的重组麻疹病毒免疫的小鼠(限于 CMHH2b)产生针对甲型流感病毒的M2e或M2抗原的免疫应答，尽管已知这些小鼠具有限制性单体型，其如以往所见，在使用包含编码M2抗原的DNA的组合物或含有来源于 M2e序列的合成肽的组合物(该组合物旨在诱导针对M2抗原的免疫应答)时，该单体型几乎不会诱发应答(Misplon等，2010；Wolf等，2011)。重组麻疹病毒通过其有助于克服免疫宿主未能在适当的CMH环境中识别甲型流感病毒抗原表位的能力而参与观察到的现象中，其提供针对MV的T辅助应答，其证明适合于帮助引发宿主对所述甲型流感病毒抗原的应答。

在一个实施方案中，本发明涉及如本文公开的重组麻疹病毒，其中M2抗原具有共有氨基酸序列，其来源于包含A/H1N1和A/H3N2季节性菌株和A/H1N1大流行变体菌株的病毒的M2序列。在另一个实施方案中，本文公开的重组麻疹病毒是这样的，即 M2抗原具有共有氨基酸序列，其来源于包含A/H5N1、A/H9N2和A/H7N9禽类毒株和任选的A/H1N1大流行变体菌株的病毒的M2序列。使用源自许多季节性病毒和大流行变体菌株的M2抗原或其包含M2的胞外域的部分作为第一抗原，可以提供针对甲型流感的通用疫苗类型的广谱疫苗。

在本发明的一个实施方案中，重组麻疹病毒表达其氨基酸序列是SEQ ID No.21的M2胞外域(M2e)。

在另一个实施方案中，重组麻疹病毒表达包含上述序列的基于M2e的抗原。具体而言，这种基于M2e的抗原是具有SEQ ID No.19的序列的M2抗原。

如此定义的M2的胞外域的序列是共有序列。在被定义为共有序列之后，M2e 结构域可以被包含在基于M2e的抗原中，该抗原是被修饰的关于M2e结构域的抗原。这种修饰可以通过添加末端氨基酸残基，特别是1、2、3、4或5个附加的氨基酸残基来实现，所述氨基酸残基是或不是实际M2蛋白中包括的氨基酸，例如在共有序列中或在实际序列中，即在鉴定的病毒或病毒菌株的抗原序列中天然构架M2e结构域的残基。M2抗原通过如下方式可替代地或进一步被修饰以产生基于M2e的抗原：添加接头序列例如富含甘氨酸的序列，例如提供柔韧性的SGGSGG序列(SEQ ID No.38)，或者添加间隔序列(例如富含甘氨酸的GGG型序列或有2至6个连续丙氨酸残基的富含丙氨酸的序列)。基于 M2e的抗原还可以包括，包含或由M2e结构域的多个复制或这样的M2e结构域(包含上述公开的特定修饰，所述特定修饰包括添加末端氨基酸残基和/或接头或间隔序列)的多个复制组成的抗原。基于M2e的抗原因此可以是通过多个M2E结构域的组合的嵌合抗原。

根据本发明的这些实施方案，重组麻疹病毒包含插入其基因组中的编码甲型流感病毒的M2共有抗原或编码M2e共有结构域的多核苷酸。优选地，该多核苷酸被插入到克隆到对应于麻疹病毒的全长反基因链RNA的cDNA的基因间区的附加转录单元(ATU) 中。在实施例部分中特别说明适用于表达M2抗原或基于M2e的抗原的核酸构建体。具体而言，可将编码如本文所公开的流感病毒特征性的一种或多种多肽的转基因，导入如命名为如下的质粒中提供的ATU1、ATU2或ATU3中：具有SEQ ID No.14序列的 pTM-MVSchw-ATU1，或具有序列SEQID No.15的pTM-MVSchw-ATU2，或具有序列SEQ ID No.16的pTM-MVSchw-ATU3，其中它们将取代编码eGFP的序列。在一个具体实施方案中，转基因被插入到ATU2(麻疹基因组的P和M基因之间)中或甚至上游如ATU1中，以基于麻疹基因组的表达梯度增加流感病毒多肽的表达。根据优选的实施方案，将基于 M2e的抗原，特别是包含本文所公开的M2e的多个复制的抗原或这样的基于M2e的抗原 (例如其中N是麻疹抗原的N-M2e)的融合物插入到所述ATU3或所述ATU2中。当制备双重组麻疹病毒时，如麻疹病毒和上面公开的基于M2e的抗原和另外的流感病毒抗原(如 M1或NP)重组，后者的核苷酸序列可以插入到ATU2中，并且可以将基于M2e的抗原序列插入到另一ATU中，特别是ATU3或ATU1中。

在本发明的一个实施方案中，本发明的重组麻疹病毒的基因组包含编码M2抗原胞外域的多核苷酸的多个复制。

特征“编码M2e结构域的多核苷酸的多个复制”是指MV载体基因组中存在多于一个的编码该结构域的多核苷酸的复制，因此能够在如此形成的基于M2e的嵌合抗原中表达“编码M2e结构域的多个复制”。具体而言，相同M2e结构域或不同M2e结构域的2、 3、4或5个或更多个复制被包含在一个嵌合抗原内。与M2或M2e的确定的共有序列相比，当它们具有在一个或多于一个的位点处具有不同氨基酸残基的序列时，认为域是有区别的。当差异位点(thediverging positions)不超过比较序列(与共有序列和确定氨基酸残基数目的共有序列相比的差异序列)中的氨基酸残基数量的10％(90％同一性)或优选不超过5％ (95％同一性)时，域可能是不同的但仍然相似。不同的M2e结构域可以是有差异的共有序列的那些，或者可以来源于不同的簇、不同的谱系或不同的亚型。M2e结构域的多个复制可以直接与相邻复制融合或者通过接头(在作为实施例提供的构建体中示出了特定的接头，并且如SEQ IDNo.38所示)与相邻复制分离。如本文所公开的，M2e抗原的多个复制可通过接头或间隔区序列连接。由本发明的重组麻疹病毒表达的M2抗原或基于M2e的抗原的多个复制，可能有利于由流感病毒抗原丰度的增加引起更强和更广泛的免疫应答和 /或更有利于暴露于宿主的免疫系统。M2e结构域的多个复制的实施例可以有利地由本发明的活重组麻疹病毒表达，活重组麻疹病毒由嵌合多肽组成，所述嵌合多肽包含或由A/H1N1 和A/H3N2谱系的M2e的共有序列(SEQ ID No.21)和A/H1N1v大流行菌株的M2e的共有序列(SEQ ID No.32)构成。各种M2e的这些序列显示4个氨基酸残基的差异(17％)。作为M2e结构域的序列的替代组合，A/H1N1和A/H3N2谱系的共有序列可以与A/H5N1 的M2e结构域的序列相关联(SLLTEVETPTRNEWECRCSD SSD SEQ ID No.40)。这些序列在3个氨基酸残基位点是不同的(13％)。M2e结构域的多个复制构成根据本发明的包含M2e的抗原(或基于M2e的抗原)。

在本发明的一个具体实施方案中，当由重组麻疹病毒表达时，M2抗原或含有 M2e的抗原(基于M2e的抗原)由载体分子携带，特别是融合到载体蛋白质的末端(N- 或C-末端)。可以选择这种载体分子，因为其在产生并在免疫的宿主中复制时，其有助于通过重组麻疹病毒呈递M2抗原或包含M2e的抗原。它可以附加地或任选地包含涉及引发针对甲型流感病毒的免疫应答的免疫原性分子，包括流感病毒的NP蛋白或所述蛋白的共有序列，例如具有SEQ ID No.31序列的NPflu蛋白。

因此，本发明尤其涉及重组麻疹病毒，其中在其基因组中，编码M2抗原的胞外域的多核苷酸或编码M2抗原的多胞外域的多核苷酸之一(包括当这种胞外域被包含在基于M2e的抗原中时)与编码载体蛋白(任选的是免疫原性载体蛋白)的多核苷酸遗传融合。遗传融合有利地在编码载体蛋白的DNA的末端进行。因此，当在本文中公开参考M2e 结构域的特征时，该特征或者严格意义上适用于M2e结构域，或者适用于包含在更复杂序列(例如本文公开的用于基于M2e的抗原的那些)中的M2e。

在本发明的一个具体实施方案中，载体分子是麻疹病毒的蛋白质，特别是该病毒的结构蛋白质。在一个有利的实施方案中，蛋白质是麻疹病毒的核蛋白(N)，尤其是用于拯救本发明的重组麻疹病毒颗粒的菌株(例如施瓦兹菌株)的N蛋白。在另一个有利的实施方案中，蛋白质是本文引用的流感病毒菌株之一的核蛋白(NP)，包括流感病毒的NP 蛋白或所述蛋白的共有序列，例如具有SEQ ID No.31序列的NPflu蛋白。或者可以是其变体，例如该蛋白的一部分，特别是免疫原性部分，特别是其氨基酸序列是SEQ ID No.31 的蛋白的免疫原性部分。优选地，编码流感病毒的M2或基于M2e的抗原的多核苷酸和编码载体蛋白的多核苷酸(如果有的话)总体上满足“六的规则”或适于满足所述规则。根据本发明，由载体携带的基于M2e的抗原的例子是具有SEQ ID No.25序列的NPflu-M2e或 NPflu-3xM2e。

在本发明的具体实施方案中，重组麻疹病毒表达麻疹N蛋白与M2e结构域的一个或多个复制的融合物。作为一个例子，N与M2e结构域的3个复制(融合在N的C 端或N端部分)的融合被表达。

在一个具体实施方案中，M2抗原或基于M2e的抗原与N蛋白的C末端融合或与包含Ncore结构域的N蛋白的一部分的C末端融合。MV N蛋白与M2抗原或基于 M2e的抗原之间的融合蛋白的例子，如SEQ ID No.28(N_MV-M2e融合蛋白)和SEQ ID No.29 (N_MV-3xM2e融合蛋白)所示。在这些具体的实施方案中，N_MV和M2e抗原被接头分开，并且当融合蛋白中包含多个M2e肽时，它们也被接头序列分开。

优选地，融合蛋白导致表达MV的附加N蛋白，而不导致融合蛋白取代天然N 蛋白。因此，除表达天然N蛋白之外，还表达包含MV N蛋白的融合蛋白。

在一个具体实施方案中，为了表达由载体-M2e或载体-nxM2e融合物组成的嵌合抗原(其中“n”代表M2e复制的数目)，将编码所述融合物的多核苷酸插入载体中提供的 ATU(多克隆位点盒的附加转录单元)中的MV载体的cDNA中，位于MV的P和M基因之间的基因间区域的位点，或位于H和L基因之间的位点。这使得重组病毒能够表达天然的和融合的嵌合N-M2e或N-nxM2e蛋白。因此，在由重组麻疹病毒产生的RNP(核糖核蛋白)中，嵌合N-M2e或N-nxM2e蛋白显示在RNP上。实施例部分说明了在载体骨架中包含ATU的构建体。具体来说，用于衍生适于表达活重组麻疹病毒的本发明构建体的转移载体可以是以下质粒中的一种：具有序列SEQ ID No.14的pTM-MVSchw-ATU1或具有序列SEQ ID No.15的pTM-MVSchw-ATU2或具有序列SEQ ID No.16的 pTM-MVSchw-ATU3。所有这些质粒含有可能缺失的编码eGFP标记物的序列。

在本发明的另一个实施方案中，作为麻疹病毒蛋白的一种选择，其中载体蛋白是甲型流感病毒的抗原，特别是核蛋白NP或其免疫原性部分。

作为源自流感病毒的载体或来自流感病毒蛋白质的共有序列的载体的例子，核蛋白(NP蛋白)适于提供流感病毒的T表位，流感病毒的该表位将会在接受本发明的重组麻疹病毒后被甲型流感病毒感染的宿主中被加强，并且其存在会因此引起或提高免疫反应。

如果寻求载体的免疫原性，则载体可以是蛋白质的免疫原性部分而不是整个蛋白质。本领域技术人员能够通过对蛋白质片段进行的简单测试来确定蛋白质的免疫原性部分，从而确定片段是否引发抗体应答或细胞应答。蛋白质的免疫原性部分可尤其由蛋白质的截短蛋白质或缺失变体组成，例如由天然蛋白质的整个蛋白质长度的超过50％或特别是90％以上或95％以上组成的片段。

甲型流感病毒的NP蛋白可以是共有序列的表达产物，其中共有序列以与M2 抗原的共有序列相同的方式设计。它也可以是特定病毒株的实际(即天然)序列。甲型流感病毒的NP蛋白是具有498个氨基酸残基的核衣壳蛋白。根据本发明，NP蛋白是全长蛋白或适合作为载体并任选作为免疫原的部分。根据本发明的适合使用的NP蛋白的例子对应于由序列SEQ ID No.30的多核苷酸编码的SEQ ID No.31的序列。在一个具体的实施方案中，NP蛋白被用于具有M2e结构域的3个复制的融合蛋白，如由SEQ ID No.24组成的转基因编码的序列为SEQ ID No.25的蛋白所示。

如上所述，重组麻疹病毒表达甲型流感病毒的至少第一抗原。相应地，在本发明的其他实施方案中，其中这样的实施方案还可以包括上述任何特征或者它们的组合，重组麻疹病毒可以表达附加的抗原(其中术语抗原可与蛋白质或多肽互换使用并且包括天然蛋白质的免疫原性部分)，包括可以由共有氨基酸序列或实际菌株或分离株的序列表达的附加甲型流感抗原(例如NP或M1抗原)。可供选择地或另外地，重组麻疹病毒可以表达其他病毒的抗原，包括除了M2抗原的共有序列的设计中所用的那些之外的其它流感类型或亚型，例如乙型流感病毒的抗原，特别是M2抗原。当存在多于一种另外的抗原时，这种不同的抗原可以被指定为第二抗原或另外的抗原。根据本发明，当提到M2抗原或包含 M2e结构域的抗原(基于M2e的抗原)时，主要参考具有共有氨基酸序列的抗原。类似地，甲型流感病毒的所述另外的抗原可以任选的是使用与本文定义的和在实施例部分中说明的步骤类似的步骤构建的共有序列。

如上所述，独立于载体分子，重组麻疹病毒可以表达甲型流感病毒的另外的抗原。可以选择这样的另外的抗原，是因为他们具有引发，尤其是引发或加强宿主中的免疫应答的能力或参与其他抗原引发的应答的能力。它们可以被表达为共有序列抗原，该共有序列抗原具有如本文对M2蛋白共有序列所解释的那样定义的共有序列，特别是使用与参与设计M2蛋白的共有序列的那些相同的流感病毒的抗原序列的比对。

因此，本发明涉及活的重组麻疹病毒，其也表达甲型流感病毒的一种或多种另外的抗原或一种或多种其氨基酸序列是共有序列的另外的抗原，其中共有序列代表来自各种甲型流感病毒亚型的选集的确定的病毒抗原的序列，其中所述选集包括循环的季节性人类病毒和任选的大流行性人类病毒和/或据报道已感染人类并被认为构成大流行性风险的动物病毒。

在构建另外的抗原的甲型流感病毒的合适蛋白质中，M1(基质蛋白)、NP和/ 或NA(神经氨酸酶)蛋白或其免疫原性部分是优选的。特别地，M1和NP蛋白可能是合适的，因为它们是高度保守的并且是流感病毒感染的个体中细胞应答的靶标。M1蛋白也可以促进来自细胞的流感VLP的萌芽。NA蛋白也可以是合适的，因为它是已知的免疫原，并且因为它可以增强从细胞中释放病毒颗粒或流感VLP的萌芽。NA蛋白也比血凝素蛋白 (HA)更不易受到抗原漂移的影响。因此有趣的是，其可能完成M2蛋白或基于M2e的蛋白诱导广阔的免疫应答。因此，表达M2抗原或基于M2e的抗原和特定亚型的NA抗原的重组麻疹病毒可以提供半通用疫苗，其能够诱导针对甲型流感相应亚型的广泛覆盖范围。

在本发明的一个具体实施方案中，重组麻疹病毒表达另一抗原，其是具有SEQ IDNo.23序列的M1蛋白，SEQ ID No.23序列是由序列为SEQ ID NO.22的多核苷酸和/或具有SEQ ID No.31序列的NP蛋白编码的共有序列。

在本发明的一个实施方案中，由重组麻疹病毒表达的甲型流感抗原是M1和 M2或M1和基于M2e的蛋白，或是作为M1-M2融合蛋白、作为M2-M1融合蛋白，或是作为基于M1-M2e的融合蛋白，作为基于M2e的M1融合蛋白。这些融合蛋白可以使用公开为SEQ ID No.17、SEQID No.18(对于M2)或SEQ ID No.20(对于M2e)和SEQ ID No.22 (对于M1)的多核苷酸来设计。为了由重组MV的基因组表达，编码所述融合蛋白的多核苷酸有利地在MV的P基因和M基因之间的位点处插入到ATU2中。在另一个实施方案中，将由重组MV表达的甲型流感病毒的抗原(例如M2(或基于M2e的抗原)和M1，或M2(或基于M2e的抗原)和NP，或甚至三种抗原M1、M2(或基于M2e的抗原)和 NP)插入不同的ATU中。例如，如果使用甲型流感M2(或基于M2e的抗原)、NP和M1，则一个由插入到位于MV的N基因之前的ATU中的多核苷酸表达，一个由插入到位于P 和M基因之间的ATU中的多核苷酸表达，第三个由插入到位于MV的H基因和L基因之间的ATU中的多核苷酸表达。任选的，流感的M1和NP蛋白可以表达为融合蛋白。使用多种甲型流感病毒抗原能够通过诱导体液和细胞应答来提高保护作用。

另一方面，如本文所定义，本发明涉及为了拯救重组麻疹病毒所需的核酸构建体。这些构建体包含核酸构建体，核酸构建体包含一个cDNA或由一个cDNA构成(consist in acDNA)，该cDNA的核苷酸序列包含：(i)编码MV的全长反基因链RNA的序列的核苷酸序列(即对应于RNA，除了将U核苷酸变成T)，其中一个或多个附加转录单元(ATU) 已经被插入在N基因的上游(ATU1)、和/或在P基因和M基因之间的基因间区域(ATU2)、和/或在MV的H基因和L基因之间(ATU3)了，以及(ii)可操作地连接到所述ATU(框内)的异源核苷酸序列，该异源核苷酸序列包含编码甲型流感病毒的一种或多种抗原的开放阅读框，其如本文定义的、特别是在实施例中所述的并且参考序列表的序列。为了克隆到ATU中，编码甲型流感病毒抗原的氨基酸序列(如果存在载体的话)的多核苷酸可以在侧翼加入限制性位点。

在一个具体实施方案中，如果需要或合适的话，核酸分子是这样的，使得编码 A型流感病毒共有序列的多核苷酸可以包括修饰，例如编辑修饰以除去核酸两条链上的 MV编辑(A₅G₃)-和核心基因末端(A₄CKT)-样序列。另外的修饰可能涉及顺式-作用序列基序，如内部TATA-盒、chi-位点、核糖体进入位点、ARE、INS和CRS序列元素，或重复序列、RNA二级结构和剪接供体和受体位点。

在一个实施方案中，可以对核酸构建体进行密码子优化以提高在哺乳动物细胞、特别是人类细胞中的表达。可以对编码甲型流感病毒抗原的序列进行密码子优化，或者可以对编码甲型流感病毒抗原的序列以及对其载体蛋白(如果合适的话)都进行密码子优化。密码子优化是本领域技术人员已知的并且在本文提供的实施例中进行说明。

编码可能与载体连接的甲型流感病毒抗原的多核苷酸，可根据本领域技术人员可用的技术制备，例如通过化学合成制备。

本发明的核酸包括编码麻疹病毒和其他抗原，特别是甲型流感病毒抗原的全长反基因链(+)RNA的cDNA(包括载体的任选序列)，可有利地满足已知发生在天然MV 基因组序列中的、并且已知能够回收高产量的活重组麻疹病毒的“六的规则”。因此，该核酸在每条链上应具有六的倍数的核苷酸。或者，重组病毒基因组的构建体不能满足六的规则，并且可能在修复与遵守六项规则相关的错误之后，重组病毒在拯救中的产量被改变。

在核酸构建体中，本发明尤其涉及适用于拯救本发明的重组麻疹病毒的载体 (转移载体)。当载体提供编码全长麻疹病毒反基因链(+)RNA的功能性多核苷酸和编码甲型流感抗原的核酸构建体时，载体被认为适合于拯救，并且载体因此能够在用于转化细胞、特别是哺乳动物细胞、特别是人类细胞时提供病毒颗粒及其蛋白质的基因组，选择用于拯救，其中所述细胞表达用于反式补充所必需的麻疹病毒蛋白，特别是当细胞与提供 MV的P、N和L蛋白的序列的载体反式互补时。在Combredet C.等(2003)和WO 04/000876 中已经充分公开了这样的构建体。

因此，本发明涉及一种转移载体，特别是在质粒载体中的转移载体，其适合于拯救如本文所定义的重组麻疹病毒，该重组麻疹病毒包含如本文所定义的编码一种或多种抗原的多核苷酸，作为可操作地连接在载体骨架中、克隆到编码麻疹病毒全长反基因链 RNA的cDNA中的插入物。

适用于表达根据本发明的重组麻疹病毒的特定转移载体是一种重组质粒，其携带cDNA，该cDNA的核苷酸序列包含：(i)编码MV的全长反基因链RNA的序列的核苷酸序列，其中一个或多个附加转录单元(ATU)已经插入到N基因的上游和/或基因间区域，以及(ii)在所述ATU中插入的异源多核苷酸，所述异源多核苷酸的序列包含编码本文所定义的一种或多种抗原的开放阅读框。这些载体有利地来源于命名为具有序列SEQ ID No.14的pTM-MVSchw-ATU1，或具有序列SEQ ID No.15的pTM-MVSchw-ATU2，或具有序列SEQ ID No.16的pTM-MVSchw-ATU3的质粒，其中编码eGFP的序列将被编码流感病毒蛋白的插入序列和任选的不同来源的载体蛋白所替代。

在一个特定的方面，转移载体是来源于pBluescript质粒的pTM质粒，其选自下组：

-pTM-MVSchw-ATU1或pTM-MVSchw-ATU2或pTM-MVSchw-ATU3，其中编码M2 抗原的序列插入到ATU1或ATU2或ATU3中，

-pTM-MVSchw-ATU3，其中将编码MV病毒的核蛋白的C末端和编码M2蛋白的一个或多个胞外域(M2e)的序列的融合序列插入ATU3中；

-具有序列SEQ ID No.1的pTM-MV-ATU1-M2raw、具有序列SEQ ID No.3的 pTM-MV-ATU2-M2raw、具有序列SEQ ID No.2的pTM-MV-ATU1-M2opt、具有序列SEQ ID No.4的pTM-MV-ATU2-M2opt、具有序列SEQ ID No.8的pTM-MV-ATU3-M2opt，

-具有序列SEQ ID No.5的pTM-MV-ATU3-N-1xM2e、具有序列SEQ ID No.6的 pTM-MV-ATU3-N-3xM2e(N是麻疹病毒N蛋白)，

-具有序列SEQ ID No.9的pTM-MV-M1&M2，

-具有序列SEQ ID No.10的pTM-MV-NPflu&M2和具有序列SEQ ID No.11的 pTM-MV-ATU2-NPflu，其是pTM-MV-NPflu&M2的亲本构建体，

-具有序列SEQ ID No.13的pTM-MV-ATU2-NPflu-3xM2e，

-具有序列SEQ ID No.7的pTM-MV-ATU2-M1opt，

-具有序列SEQ ID No.12的pTM-MV-ATU2-N-3xM2e，其中N是麻疹病毒核蛋白。

本发明还涉及由插入物构成的多核苷酸(the polynucleotides consisting inthe inserts)，插入物包含在所述质粒的麻疹病毒基因组中，如所提供的序列中所示。特别地，本发明涉及序列如下的多核苷酸：

-用于M2raw合成基因的SEQ ID No.17，其中编码M2的序列是编码共有蛋白的序列，用于M2opt合成基因的SEQ ID No.18，其中序列被优化，特别是相对于原始序列被密码子优化，

-用于编码共有M2e多肽的序列的SEQ ID No.20，所述序列被优化，

-用于编码M1共有蛋白的优化序列的SEQ ID No.22，

-用于编码NPflu-3xM2e融合蛋白的融合多核苷酸的SEQ ID No.24，

-用于编码N-1xM2e融合蛋白的融合多核苷酸的SEQ ID No.26，其中N来自麻疹病毒，并且其中接头连接N和M2e序列，

-用于编码N-3xM2e融合蛋白的融合多核苷酸的SEQ ID No.27，其中接头连接N和 M2e序列并连接多个M2e序列，

-用于编码共有NPflu蛋白的合成基因的SEQ ID No.30，

-编码任何多肽的多核苷酸，所述多肽的序列由选自以下组中的序列组成：SEQ IDNo.19、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ IDNo.31、SEQ ID No.32和SEQ ID No.40。

本发明还涉及本文所述的转移载体的应用，用于制备本发明所定义的重组麻疹病毒。

因此，本发明还涉及用于组装感染性重组麻疹病毒颗粒和任选的甲型流感VLP 的拯救系统，其包含用载体(特别是质粒载体)转化、特别是转染的细胞，优选哺乳动物细胞或细胞系，其中，载体适合表达聚合酶例如T7聚合酶、以及表达麻疹病毒的N、P 和L蛋白，其中所述细胞进一步用本发明的载体转染。

具体而言，用于拯救的细胞选自于2006年6月14日保藏在CNCM(法国巴黎) 的编号为I-3618的293-T7-NP细胞系或者于2006年8月4日保藏在CNCM(法国巴黎) 的编号为I-3662的293-Tnls7-NP。

为了制备本发明的重组麻疹病毒，作为插入物克隆到转移载体中的cDNA，可以在纯化来自病毒颗粒(特别是来自活减毒菌株或疫苗株例如施瓦兹菌株的颗粒)中的麻疹病毒的基因组RNA的步骤之后获得。

本发明还涉及免疫原性组合物，其包含根据本文公开的任何实施方案的本文定义的本发明的重组麻疹病毒，适合向宿主施用的药物赋形剂和任选的免疫应答的佐剂。

除了本发明的重组麻疹病毒之外，免疫原性组合物可以包含在重组麻疹病毒拯救和生产过程中形成的流感病毒样颗粒(VLP)。本发明还涉及所述流感病毒样颗粒(VLP) 及其作为活性成分在引发针对甲型流感病毒的免疫应答或提高由本发明的活重组麻疹病毒引发的应答中的应用。免疫原性组合物可以是，可以包含或可以来源于产生本发明的重组麻疹病毒的细胞的上清液或裂解物。

根据本发明的免疫原性组合物可以使用另外的物质例如盐、保存物质(preservation substances)、缓冲液、质地剂(texture agents)来配制。

免疫应答可以是抗体应答和/或包括T细胞应答的细胞应答。因此引发的应答是保护性的、有利地提供广泛和长期的保护。

本发明还涉及如本文所定义的重组麻疹病毒，其用作活性成分以引发免疫应答，用于预防性保护针对由人类宿主中的甲型流感病毒感染引起的病症或疾病。

具体而言，本发明涉及如本文所定义的重组麻疹病毒，其用作活性成分以引发针对由甲型流感病毒感染引起的病症的预防性保护的免疫应答，其中甲型流感病毒是 A/H1N1、A/H3N2、A/H5N1或A/H7N9或A/H9N2或H1N1v病毒之一。

本发明还涉及如本文所定义的重组麻疹病毒，其用作活性成分以引发免疫应答，用于在人类宿主、特别是儿童中预防流感。

在一个具体的实施方案中，本发明涉及如本文所定义的重组麻疹病毒，任选地与流感VLP组合，用于引发针对甲型流感病毒的抗体，和/或用于引发针对人类宿主中甲型流感病毒感染的细胞应答。

在本发明的一个实施方案中，重组麻疹病毒任选地与流感VLP组合，用于保护、特别是用于预防性保护针对由人类宿主中的甲型流感病毒感染引起的病症或疾病。

本发明还涉及一种方法，用于防止流感的发作或由人类宿主中的甲型流感病毒感染引起的病症的发作，所述方法包括向所述人类宿主、特别是向儿童施用一次或多次剂量的包含本文定义的重组麻疹病毒的组合物，任选的在初次-加强施用方案中。

根据本发明的一个具体方面，将免疫原性组合物配制成用于向儿童施用。

本发明的免疫原性组合物的施用可以通过已知的施用途径进行，包括全身或外周施用。

本发明还涉及根据本文所述任一实施方案的重组麻疹病毒的应用，任选地与流感VLP组合以制备活性成分，活性成分在人类宿主的多价疫苗中，例如合并麻疹、腮腺炎、风疹和流感多价疫苗或麻疹、腮腺炎、风疹、水痘和流感多价疫苗中，用于预防甲型流感病毒感染或用于预防甲型流感病毒感染的后果(outcome)。

根据这种活性成分制备的具体实施方案，本发明的重组麻疹病毒还被用作预防麻疹病毒感染或预防麻疹病毒感染所造成后果的活性成分。

本发明还涉及转化的细胞，特别是用载体特别是质粒载体转染的细胞，其适于进行本发明的重组麻疹病毒的拯救，并且包含表达聚合酶例如T7聚合酶的核苷酸序列，以及表达麻疹病毒的N、P和L蛋白的核苷酸序列，其中所述细胞在能够产生重组麻疹病毒的条件下进一步用本文所定义的转移载体转染。

本发明还涉及从如此定义的用于拯救的细胞中，或从用于扩增拯救的病毒的细胞如维洛细胞中回收的产物。因此，本发明特别涉及这样的细胞的上清液或由表达本发明的拯救的重组麻疹病毒的细胞制备的裂解物。这些产物，特别是用于生产本发明的重组麻疹病毒的细胞的上清液或裂解物，可以用于制备本发明的免疫原性组合物的活性成分。

附加特征可以从下面的实施例和附图中得到。

附图说明

图1：表达全长跨膜M2蛋白的MV-M2重组病毒的表征。

A.pTM-MVSchw-ATU2载体的示意图，其含有施瓦兹MV cDNA、具有绿色荧光蛋白 (eGFP)基因作为P和M基因之间的另外的转录单元(ATU)(ATU2)。将编码全长M2 共有蛋白的野生型(M2raw)和密码子优化的(M2opt)合成基因插入到ATU的BsiWI和 BssHII位点之间的pTM-MVSchw-ATU2中，代替eGFP基因。M2raw和M2opt基因也都被插入到pTM-MVSchw-ATU1中，作为N基因上游的附加ATU(未显示)。

MV基因表示为：N(核蛋白)、P(磷蛋白)和V/C(辅助蛋白)、M(基质)、F(融合)、H(血凝素)、L(聚合酶)。T7：T7 RNA聚合酶启动子。hhR：锤头状核酶。T7t： T7 RNA聚合酶终止子。丁型肝炎病毒(HDV)核酶。

B.重组MV-M2病毒的生长动力学。维洛NK细胞用MOI为0.1的亲本MVSchw或重组MV-ATU2-M2raw或MV-ATU2-M2opt病毒感染。在指定的时间点收集细胞，并如材料和方法中所述测定细胞相关的病毒滴度。

C.MV-M2感染的维洛NK细胞的合胞体中，M2多肽的免疫荧光染色。用所示病毒感染30-36小时后固定细胞，并用小鼠单克隆抗-M2抗体(14C2)和AF555缀合的抗小鼠 IgG抗体染色。放大倍率：40倍。

D.和E.M2多肽表达的蛋白质印迹法分析(Western blot analysis)。在用所示的MV-M2或亲本MVSchw病毒感染的维洛-NK细胞的裂解物中，使用小鼠单克隆抗-M2抗体(14C2) 检测M2。在测定之前，MV感染细胞的裂解物被稀释成1/4(D)或1/10(E)。由被MOI 为5的A/Scotland/20/74(SCOT)或A/PuertoRico/8/34(PR8)流感病毒感染的MDCK细胞制备的裂解物用作阳性对照。指示分子量标记的位置(以kDa为单位)。D.如所示，测定MV-M2raw和MV-M2opt的两种病毒克隆(1、2)。E.如所示，在感染后24或36小时收获裂解物。

图2：表达N-M2e融合蛋白的MV-NM2e重组病毒的表征。

A.pTM-MVSchw-ATU3载体的示意图，其含有施瓦兹MV cDNA、具有绿色荧光蛋白 (eGFP)基因作为H和L基因之间的ATU(ATU3)。编码融合至M2胞外域共有序列 (N-1xM2e)的一个复制或融合至M2e(N-3xM2e)的三个串联复制的MVN蛋白的基因，插入ATU的BsiWI和BssHII位点之间的pTM-MVSchw-ATU3中，代替eGFP基因。

MV基因如图1所示。

B.在MV-NM2e感染的维洛NK细胞的合胞体中的免疫荧光染色。用指定的病毒感染30-36小时后固定细胞，并用小鼠单克隆抗-M2抗体(14C2)和AF555缀合的抗小鼠IgG 抗体染色，并用兔多克隆抗MV-N和AF488缀合的抗兔IgG抗体染色。显示单色和合并的图像。放大倍率：20倍。

C.和D.N-M2e融合多肽表达的蛋白质印迹法分析。在用所示MV-NM2e或亲本 MVSchw病毒感染的维洛-NK细胞的裂解物中，使用小鼠单克隆抗-M2抗体(14C2，图C) 或兔多克隆抗MV-N(图D)，检测N-M2e融合蛋白。如所示，测定MV-N-1xM2e和 MV-N-3xM2e的两个病毒克隆(1、2)。使用由被MV-ATU1-M2opt或MV-ATU2-M2opt感染的维洛NK细胞制备的裂解物作为阳性对照。示出了MV N蛋白和N-M2e融合蛋白的位置以及分子量标记(以kDa为单位)。

图3：用MV-M2重组病毒免疫的CD46-IFNAR小鼠中的抗体应答。

对6只或12只CD46-IFNAR小鼠组，以四周的间隔腹膜内注射两次10⁵ TClD50的所示重组MV-M2麻疹病毒或亲本MVSchw，作为对照。另一组小鼠用0.1 LD50小鼠适用的A/苏格兰/20/74(SCOT)流感病毒进行两次鼻内给药免疫。每次注射后3周收集血清(分别为IS1和IS2)。如材料和方法中所述，通过间接ELISA测定M2e特异(A、C)或MV 特异(B、D)的IgG抗体滴度。A-D.每个符号表示一个单独的小鼠，短水平线表示该组的平均值。测定的检测限用虚线表示。

D-E.在用10 LD50的小鼠适用的A/苏格兰/20/74(H3N2)或A/巴黎/2590/09(H1N1v) 流感病毒鼻内攻击后，记录每组5-6只小鼠的22天存活曲线。

图4：用MV-NM2e重组病毒免疫的CD46-IFNAR小鼠中的抗体应答。

对CD46-IFNAR小鼠组，以四周的间隔腹膜内注射两次10⁵ TClD50的所示重组MV-M2 麻疹病毒或亲本MVSchw，作为对照。另一组小鼠用MV-ATU2-M2opt免疫。每次注射后 3周收集血清(分别为IS1和IS2)。通过间接ELISA测定M2e特异(A)或MV特异(B) 的IgG抗体滴度。

C.通过间接ELISA测定IS2血清的M2e特异性，IgG1(实心圆圈)和IgG2a(空心圆圈)同种型滴度。

D.如材料和方法中所述，使用基于细胞的ELISA来测量针对M2蛋白天然形式的特异性抗体。

A-D.每个符号表示一个单独的小鼠，短水平线表示该组的平均值。测定的检测限用虚线表示。

E.在用10 LD50的小鼠适用的A/苏格兰/20/74(H3N2)流感病毒鼻内攻击后，记录 21天存活曲线。

图5：体液应答对保护的贡献

在被动转移来自用MV-ATU1-M2opt或MV-ATU2-M2opt重组病毒免疫的CD46-IFNAR 小鼠的混合血清(pooled sera)之后，用10 LD50的小鼠适用的A/苏格兰/20/74(H3N2) 流感病毒对C57BL/6小鼠(6只小鼠/组)的存活进行致死性攻击。对照组小鼠接受来自用空的亲本MVSchw免疫的CD46-IFNAR小鼠的血清。

图6：同时表达M1和M2蛋白的双重组麻疹病毒的表征.

A.pTM-MV-ATU2-M1载体的示意图，其含有施瓦兹MV cDNA、具有M1密码子优化的共有基因作为P和M基因之间的ATU(ATU2)；pTM-MV-ATU3-M2载体的示意图，其具有M2密码子优化的共有基因作为H和L基因之间的ATU(ATU3)；以及双重组 pTM-MV-M1&M2载体的示意图。

MV基因如图1所示。

B.和C.M1和M2多肽表达的蛋白质印迹法分析。在用所示重组或亲本麻疹病毒感染的维洛-NK细胞的裂解物中，使用小鼠单克隆抗M1(GA2B，图B)或抗-M2抗体(14C2，图C)检测M1和M2。如所示，测定每个病毒构建体的三个病毒克隆(1、2、3)。使用由感染A/苏格兰/20/74(SCOT)流感病毒的MDCK细胞制备的裂解物作为阳性对照。示出了M1和M2蛋白的位置以及分子量标记(以kDa为单位)。

图7：本发明中使用的多核苷酸或蛋白质的序列的例子

图8：CD46-IFNAR小鼠中的抗体应答，小鼠用表达M1和M2蛋白的双重组麻疹病毒免疫。

对12只CD46-IFNAR小鼠组，以四周的间隔腹膜内注射两次10⁵ TClD50的所示单重组MV-ATU3-M2opt和MV-ATU2-M1opt病毒，双重组MV-M1&M2病毒或亲本MVSchw，作为对照。另一组小鼠用前者MV-ATU2-M2opt免疫。每次注射后3周收集血清(分别为 IS1和IS2)。如材料和方法中所述，通过间接ELISA测定M2e特异(A)或MV特异(B) 的IgG抗体滴度。A-B.每个符号表示一个单独的小鼠，短水平线表示该组的平均值。测定的检测限用虚线表示。

C.在用10 LD50的小鼠适用的A/苏格兰/20/74(H3N2)流感病毒鼻内攻击后，记录 21天存活曲线。

D.记录受感染小鼠的体重曲线。其值表示存活小鼠的平均体重，表示为感染当天初始体重的百分比。SD由单侧竖线表示。为了清楚起见，实心符号表示该组中所有小鼠在监测当天都活着，半实心符号表明至少一只小鼠事先死亡，空心符号表示单个小鼠在组中保持存活。

图9：双重组麻疹病毒的表征，其同时表达NP和M2全长流感蛋白，或表达NP蛋白与M2e胞外域的3个复制之间的融合蛋白。

A.pTM-MV-ATU2-NPflu载体的示意图，其含有施瓦兹MV cDNA具有NP密码子优化的共有基因作为P和M基因之间的ATU(ATU2)；pTM-MV-ATU3-M2载体的示意图，其具有M2密码子优化的共有基因作为H和L基因之间的ATU(ATU3)；以及双重组 pTM-MV-NPflu&M2载体的示意图。MV基因如图1所示。

B.如图1所示的pTM-MVSchw-ATU2载体的示意图。将编码融合到M2e的三个串联复制(NPflu-3xM2e)的共有甲型流感病毒核蛋白(NPflu)的基因，插入到ATU的BsiWI 和BssHII位点之间的pTM-MVSchw-ATU2中，代替eGFP基因。

C.和D.NP和M2多肽表达的蛋白质印迹法分析。在用所示重组或亲本麻疹病毒感染的维洛-NK细胞的裂解物中，使用兔多克隆抗流感病毒体抗体(图C)或小鼠单克隆抗-M2 抗体(14C2，图D)检测NP和M2(或M2e)。如所示，测定每个病毒构建体的三个或四个病毒克隆(1、2、3、4)。使用由感染A/苏格兰/20/74(SCOT)流感病毒的MDCK细胞制备的裂解物作为阳性对照。示出了NPflu、M2和NPflu-3xM2e蛋白的位置以及分子量标记(以kDa为单位)。

图10：CD46-IFNAR小鼠的抗体和细胞应答，小鼠用同时表达NP和M2蛋白的双重组麻疹病毒免疫。

对CD46-IFNAR小鼠组，以四周的间隔腹膜内注射两次10⁵ TClD50的所示单重组 MV-ATU2-NPflu和MV-ATU3-M2opt病毒、双重组MV-NPflu&M2病毒或亲本MVSchw，作为对照。每次注射后3周收集血清(分别为IS1和IS2)。通过间接ELISA测定M2e特异(A)或MV特异(B)的IgG抗体滴度。

C.单次注射所示的重组麻疹病毒7至10天后，通过ELISPOT定量免疫小鼠脾脏中流感特异性产生IFN-γ的T细胞的频率。如材料和方法中所述进行ELISPOT，响应NP366 (H3N2)共有肽(I类)、A/苏格兰/20/74攻击病毒的NP366(SCOT)肽(I类)和NP260-273 保守肽(II类)。

A-C.每个符号表示一个单独的小鼠，短水平线表示该组的平均值。测定的检测限用虚线表示。

D.在用10 LD50的小鼠适用的A/苏格兰/20/74(H3N2)流感病毒鼻内攻击后，记录 21天存活曲线。

E.记录受感染小鼠的体重曲线。其值表示存活小鼠的平均体重，表示为感染当天初始体重的百分比。SD由单侧竖线表示。为了清楚起见，实心符号表示该组中所有小鼠在监测当天都活着，半实心符号表明至少一只小鼠事先死亡。

图11：MV-N-3xM2e重组病毒的表征，其表达来自ATU2的N-M2e融合蛋白。

A.pTM-MVSchw-ATU2载体的示意图，其含有施瓦兹MV cDNA、具有绿色荧光蛋白(eGFP)基因作为P和M基因之间的ATU(ATU2)。将编码融合到M2e的三个串联复制 (N-3xM2e)的MV N蛋白的基因，插入到ATU的BsiWI和BssHII位点之间的 pTM-MVSchw-ATU2中，代替eGFP基因。

MV基因如图1所示。

B.和C.N-M2e融合多肽表达的蛋白质印迹法分析。在用所示病毒感染的维洛-NK细胞的裂解物中，使用小鼠单克隆抗-M2抗体(14C2，图B)或兔多克隆抗-MV-N(图C) 检测N-3xM2e融合蛋白。如所示，测定MV-ATU2-N-3xM2e的两个病毒克隆(1、2)。使用由MV-ATU3-N-3xM2e或MVSchw感染的维洛NK细胞制备的裂解物，作为阳性对照。示出了MVN蛋白和N-3xM2e融合蛋白的位置以及分子量标记(以kDa为单位)。

实施例

材料和方法

细胞系和病毒

维洛-NK(非洲绿猴肾)细胞在37℃和5％CO₂下，在完全DMEM(Dulbecco的修饰的Eagle培养基，具有4.5mg/ml L-葡萄糖、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)中生长，补充有5％热灭活的胎牛血清(FBS)。辅助293-T7-MV细胞在补充有10％FBS的完全 DMEM中生长，该细胞稳定表达来自Schwarz MV的T7 RNA聚合酶以及N和P基因。

MDCK(Madin-Darby犬肾)细胞在补充有青霉素、链霉素和10％FBS(MEM-10)的 MEM(最少必需培养基)中，在5％CO₂中和37℃下生长。组成性表达全长M2共有序列的MDCK-M2细胞，通过用慢病毒TRIP-M2opt载体重复转导产生。在细胞表面上表达高水平M2的细胞是通过荧光激活细胞分选来选择的，并且在补充有20μg/ml的金刚乙胺、 M2质子通道抑制剂(西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich))的MEM-10中稳定地保持培养。

先前描述了小鼠适用的甲型流感/苏格兰/20/74(H3N2)病毒(Ramisse等，1998)。通过在补充有1μg/ml TPCK处理的胰蛋白酶的完全MEM中，在35℃下以10^-3的感染复数 (MOI)在MDCK细胞中进行3天的两个连续扩增，从肺匀浆中制备工作储备(working stocks)。通过在覆盖层(overlays)下的标准噬菌斑测定法(a standard plaque assay) 在MDCK细胞上测定病毒滴度，并表示为每毫升噬菌斑形成单位(pfu/ml)。

法国巴黎巴斯德研究所国家流感中心(法国北部)在2009年大流行期间从巴黎收集的鼻拭子中分离到了A/巴黎/2590/09病毒(Jonges M.等，2010)，并在MDCK细胞中传代两次。将八个基因组片段从病毒RNA克隆到来源于pHW2000的双向转录质粒(Hoffmann 等，2002)以产生重组病毒。通过连续传代被感染的空白小鼠(mice)的肺匀浆，将拯救的病毒适应于小鼠，并如上所述在MDCK细胞中进一步扩增以组成工作储备。

质粒构建体

MVSchw重组质粒构建体来源于先前描述的pTM-MVSchw-ATU1、-ATU2和-ATU3质粒载体(Combredet等，2003)。这些载体是从商业批次的许可疫苗Rouvax(由Sanofi Pasteur MSD，Marcy l’Etoile，法国提供)克隆的。它们携带对应于施瓦兹MV疫苗株的抗基因组的感染性cDNA和另外的转录单元，另外的转录单元含有独特的BsiWI和BssHII限制性位点，用于将外源性开放阅读框插入N基因(ATU1)上游，P和M基因(ATU2)之间以及H和L基因(ATU3)之间。

全长M2共有序列，其反映循环的人类流感病毒谱系(季节性A/H3N2和A/H1N1菌株，以及2009年大流行A/H1N1变体，即H1N1v)，由可在NCBI流感病毒序列数据库获得的完整M2编码序列(于2011年10月可获取(Bao等，2008))产生。简而言之，选择并下载了总共1148个完整的M2编码序列，其代表了来自1918年至2011年的人类H3N2 (540个序列)、H1N1(386个序列)和H1N1v(222个序列)甲型流感多样性的谱系。从这些数据中，使用默认设置，在CLC MainWorkbench平台(版本6.1.1)上，对三个亚型的每一个计算序列比对和共有序列。接下来，通过对H3N2、H1N1和H1N1v M2共有序列各自赋予相同的权重，并在适用的情况下遵循多数规则，产生通用共有序列(a global consensus)。当三个共有序列在一个给定的位点处不同时，选择H3N2值反映在设计时在北半球2011-2012年流感季节中该亚型的优势。进一步编辑通用共有序列以移除两条链上的MV编辑(A₅G₃)-和核心基因末端(A₄CKT)-样序列。该共有序列被命名为M2raw并具有序列SEQ ID No.17。

全长M2raw共有序列由Geneart(美国生命技术公司)，分别在5′端和3′端用附加的BsiWI和BssHII限制性位点化学合成。序列遵循“六的规则”，其规定MV基因组的核苷酸数量必须是6的倍数(Calain和Roux，1993；Schneider等，1997)。还合成了共有序列(M2opt) 的人密码子优化版本，并具有序列SEQ ID No.18。除了在哺乳动物细胞中高表达的密码子偏好优化之外，还尽可能避免MV编辑(A₅G₃)-和核心基因末端(A₄CKT)-样序列以及非常高(＞80％)或低(＜30％)GC含量的区域。此外，还避免了顺式作用序列基序如内部TATA盒、chi-位点、核糖体进入位点、ARE、INS和CRS序列元素、以及重复序列、RNA二级结构和剪接供体和受体位点。

M2raw和M2opt的cDNA都被插入到BsiWI/BssHII-消化的pTM-MVSchw-ATU1(eGFP) 载体中，得到pTM-MV-ATU1-M2raw和pTM-MV-ATU1-M2opt质粒。类似地，通过将两种cDNA插入到pTM-MVSchw-ATU2(eGFP)中来产生pTM-MV-ATU2-M2raw和 pTM-MV-ATU2-M2opt。

通过Geneart化学合成构建体，构建体编码融合至源自共有序列的M2胞外域(M2e) 单复制的MVN蛋白。该构建体包含来自T7和锤头状核酶序列的MV拯救质粒的5′末端，一直到MV反基因组的2042位核苷酸。它含有独特的BspE1和BstB1限制酶位点，以便随后交换M2e胞外域序列。在该合成基因中，M2e肽(SLLTEVETPI RNEWGCRCND SSD SEQ ID No.21)通过柔性SGGSGG接头(N-1xM2e融合蛋白)连接至MV核蛋白的C末端。通过用合成的和密码子优化的序列交换BspE1-BstB1片段获得第二构建体，所述合成的和密码子优化的序列编码由GGG间隔子连接的M2e共有序列的三个串联复制。在M2e 序列的第三个复制之后还包括限制酶位点用于进一步亚克隆。接下来，编码N-3xM2e融合蛋白的构建体用作PCR扩增的模板，其使用含有BsiWI限制性位点(下划线)的正向引物5′-AGT CGTACGGAGATGGCCACACTTTTAAGG-3’(SEQID No.33)和反向引物 5′-GGC CTTGAGAGCCCGGATG-3’(SEQ ID No.34)。使用相同的正向引物和含有BssHII 限制性位点的反向引物5′-GTT GCGCGCTCGTTATCAATCAGAGCTGTCGTTGCAC-3’ (SEQ ID No.35)，通过PCR扩增编码N-1xM2e的序列。用BsiWI和BssHII限制酶消化后，将所得DNA片段插入到pTM-MVSchw-ATU3(eGFP)质粒的相应位点中，并通过测序插入物来检查pTM-MV-ATU3-N-1xM2e和pTM-MV-ATU3-N-3xM2e构建体。

重组MV-M2和MV-NM2e病毒的拯救

如前所述(Combredet等，2003)，使用基于辅助细胞的系统将pTM重组质粒用于拯救重组病毒。在维洛-NK细胞上扩增单个病毒克隆。所有病毒储备(viral stocks)在以0.1 的MOI感染后产生，储存于-80℃，并在维洛-NK细胞单层上通过终点限制稀释测定进行滴定。根据Reed和Muench方法(Reed和Muench，1938)确定感染性滴度为50％组织培养感染剂量(TClD₅₀)。如(Combredet等，2003)所述，在以0.1的MOI感染的维洛-NK 细胞上测定重组和亲本病毒的生长曲线。

免疫荧光分析

将平铺在12孔板中的20mm玻璃盖玻片上的维洛-NK细胞的单层，用MOI为0.01的重组或亲本MVSchw病毒感染。当合胞体清晰可见但尚未融合时(感染后30-36小时)，将细胞在杜氏(Dulbecco)PBS中洗涤并用PBS-4％多聚甲醛固定20分钟。为了分析N-M2e 融合蛋白的表达，在4℃用PBS-0.2％triton X-100将细胞进一步透化10分钟。然后将盖玻片与0.5μg/ml的14C2小鼠抗-M2e单克隆抗体(圣克鲁斯生物技术)或与在PBS-1％驴血清(DKS)中1/1500稀释的兔多克隆抗-MV-N(Covalab)一起孵育。随后用Alexa Fluor 标记的驴抗小鼠或抗兔IgG偶联物(美国生命技术公司，1/500稀释)孵育后，将盖玻片与含有DAPI的Prolong Gold抗淬灭试剂(Prolong Gold Antifade Reagent)(美国生命技术公司)一起安装在载玻片上，并在DM IRB荧光显微镜(莱卡)下使用20x物镜或40x油浸物镜进行分析。用QICAM Fast1394相机(QImaging)获取图像，并用Qcapture Pro软件(版本6.0.0.412，QImaging)处理。

蛋白质印迹法

用重组MV-M2、MV-NM2e或亲本MVSchw病毒，以0.05的MOI感染单层维洛-NK 细胞。感染后24或36小时，将细胞提取物收集在Laemmli样品缓冲液中，并通过在95℃加热10分钟使其变性。在用14C2抗-M2e抗体(圣克鲁斯生物技术，0.2μg/ml)或抗MV-N 抗体(Covalab，1/10000稀释)进行免疫印迹之前，将蛋白质用4-12％SDS Bis-Tris聚丙烯酰胺凝胶(美国生命技术公司)分离并转移到PVDF膜上。在与Alexa Fluor 680-标记的驴抗小鼠或抗-兔IgG偶联物(美国生命技术公司，1/40000稀释)孵育后，用Odyssey红外成像系统(Li-CorBiosciences)捕获荧光。

小鼠实验和体液免疫应答的表征

所有的实验都是根据巴斯德研究所的指导方针批准并进行的，符合欧洲动物福利法规(http：//ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/home_en.htm)。该协议得到了巴斯德研究所动物护理和使用委员会的批准。所有实验均在增强的生物安全级别2条件下进行。为了获得容许麻疹疫苗的CD46^+/-IFNα/βR^-/-小鼠(Mrkic等，1998)，将麻疹疫苗CD46 受体转基因杂合的FVB小鼠与缺乏IFN型的129/Sv小鼠回交(Combredet等，2003)。在我们的繁殖群体中经过10多代的回交后，得到的CD46-IFNAR系获得均匀的129/Sv背景。

使用六至九周龄的CD46-IFNAR小鼠，来评估由重组MV-M2和MV-NM2e病毒诱导的免疫应答。除非另有说明，对6只小鼠组的腹膜内(i.p.)注射10⁵ TClD₅₀的重组或亲本MVSchw或PBS，作为对照。此后四周施用加强注射。每次注射后三周收集血清样品(分别为IS1和IS2血清)。

通过间接ELISA测定免疫小鼠中M2蛋白的抗体应答。简言之，将对应于共有序列 M2e序列(SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSDK-生物素-SEQ ID No.39，Eurogentec)的生物素化的M2e肽，以1μg/ml的浓度在50μl PBS中，固定在链霉抗生物素蛋白偶联的微量滴定板(Nunc)上。随后用连续稀释的测试血清温育M2e-偶联的板。用与辣根过氧化物酶(南方生物科技，1/8000)和TMB(3，3′-5，5′-四甲基联苯胺，KPL)偶联的小鼠特异性抗IgG二抗，来暴露结合的抗体。使用与辣根过氧化物酶(南方生物科技)偶联的同种型特异性(IgG1和IgG2a)二抗，来进行抗体应答的同种型测定。通过加入等体积的H₃PO₄ (1M)来终止反应，并在450nm/620nm读取每个孔的吸光度。将M2e特异性抗体滴度计算为个体血清最高稀释度的倒数，给出比空白值高0.5的吸光度。用被50ng/孔纯化的麻疹抗原(耶拿生物科学，德国)覆盖的ELISA板(Maxisorp，Nunc)类似地测量MV特异性抗体。

使用基于细胞的ELISA，来测量针对天然形式的M2蛋白的特异性抗体。简而言之，将96孔微量滴定板中的单层MDCK和MDCK-M2细胞与连续稀释的测试血清一起温育。如上所述，用抗小鼠IgG二抗和TMB底物暴露结合的抗体。用接种MDCK-M2细胞的孔的读数减去接种MDCK细胞的孔的读数，并且将M2特异性IgG滴度计算为个体血清的最高稀释度的倒数，给出0.2的吸光度。

用流感病毒攻击的动物感染

第二次免疫四周后，将动物用氯胺酮/甲苯噻嗪溶液(分别为50mg/kg和10mg/kg)轻度麻醉，并且除非另有说明，于30μl PBS中鼻内接种10μl致死剂量50(LD50)的病毒。每隔一天称量小鼠，并在21天内每天监测发病率和死亡率的迹象。失去超过30％初始体重的动物通过颈椎脱臼安乐死。

被动免疫和病毒攻击

由之前用MV-M2重组病毒和对照的MVSchw病毒免疫的CD46-IFNAR小鼠制备免疫血清。在第二次施用病毒后3周和4周收集血液，并且血清通过在室温下将血液凝固2到 4小时，然后在4℃下孵育2小时来制备，并且每个免疫组合并离心血清、过滤灭菌并保存在-20℃。

8周龄的C57BL/6小鼠(查尔斯河)通过i.p.途径(腹膜内)注射400μl合并的免疫血清、用PBS稀释至500μl，或用500μl单独的PBS来作为对照。次日，被动免疫的小鼠用 10LD50的小鼠适应的A/苏格兰/20/74(H3N2)菌株攻击并监测，如上所述。

用于构建和表征重组MV-M1和MV-M1&M2病毒的补充材料和方法

全长M1共有序列，其反映循环的人类流感病毒谱系(季节性A/H3N2和A/H1N1菌株，以及2009年大流行A/H1N1菌株)，由可在NCBI流感病毒序列数据库获得的完整M1 蛋白序列(于2013年1月可获取)产生。简言之，总共有4686个完整的M1蛋白序列被选中并下载，其代表从1977年或2007年到2012年的H3N2(2007-2012年间的1480个序列)、H1N1(1977-2012年间的1740个序列)和H1N1v(1466个序列)人甲型流感多样性的谱系。从这些数据中，使用默认设置，在CLC Main Workbench平台(版本6.7.1)上，为三个亚型的每一个计算序列比对和共有序列。接下来，通过对H3N2、H1N1和H1N1v M1 共有序列各自赋予相同的权重，并在适用的情况下遵循多数规则，产生通用共有序列。当三个共有序列在一个给定的位点处不同时，选择H3N2值反映在设计之前在北半球 2011-2012年和2012-2013年流感季节中该亚型的整体优势。然后加工M1通用共有序列的氨基酸序列，以产生用于高表达哺乳动物细胞的密码子优化的核苷酸序列。该编码序列被进一步编辑，以尽可能抑制可变剪接并阻止截短的M2样多肽的合成，以及避免MV编辑(A₅G₃)-和核心基因末端(A₄CKT)样序列，和GC含量非常高(＞80％)或非常低(＜30％) 的区域。此外，避免顺式作用序列基序如内部TATA盒、chi-位点、核糖体进入位点、ARE、 INS和CRS序列元素，以及重复序列、RNA二级结构和其他隐蔽的剪接供体和受体位点。化学合成M1通用共有序列的优化核苷酸序列(M1opt)(Geneart，美国生命技术公司)，在其5′端和3′端分别具有附加BsiWI和BssHII限制性位点。该序列遵循“六的规则”，其规定MV基因组的核苷酸数量必须是6的倍数。

M1opt和M2opt cDNA都被插入到BsiWI/BssHII-消化的pTM-MVSchw-ATU2(eGFP) 和pTM-MVSchw-ATU3(eGFP)载体中，分别得到pTM-MV-ATU2-M1和pTM-MV-ATU3-M2 质粒。然后用SalI限制酶消化这两个质粒，并连接以产生双重组的pTM-MV-M1&M2质粒。

如上所述，进行MV-ATU2-M1、MV-ATU3-M2和MV-M1&M2重组病毒的拯救和表征。使用GA2B抗-M1 mAb(赛默科技，0.2μg/ml)进行M1表达的免疫荧光和蛋白质印迹分析。

补充材料和方法，其用于设计共有核蛋白(NP)基因以及设计编码与M2e的3个复制融合的NP共有蛋白的构建体(NPflu-3xM2e)

全长核蛋白(NP)共有序列，其反映循环的人类流感病毒谱系(季节性A/H3N2和 A/H1N1菌株，以及2009年大流行A/H1N1变体)，由可从NCBI流感病毒序列数据库获得(2015年5月访问时状态)的完整NP蛋白序列生成。简言之，总共有1494个完整的 NP蛋白序列被选中(在折叠相同的序列之后)并下载，其代表1968-2015年间的H3N2 (1968-2015年间的746个序列)、H1N1(1977-2015年间的249个序列)和H1N1v(499 个序列)人甲型流感多样性的谱系。从这些数据中，使用默认设置，在CLC Main Workbench 平台(版本6.8.4)上，为三个亚型的每一个计算序列比对和共有序列。接下来，通过对 H3N2、H1N1和H1N1v NP共有序列各自赋予相同的权重，并在适用的情况下遵循多数规则，产生通用共有序列。当三个蛋白共有序列在一个给定的位点上不同时，选择H3N2值反映在设计之前在北半球2011-2012、2012-2013和2014-2015年流感季节中该亚型的整体优势。然后加工NP通用共有序列的氨基酸序列，以产生用于高表达哺乳动物细胞的密码子优化的核苷酸序列。尽可能避免GC含量非常高(＞80％)或非常低(＜30％)的区域，并且避免顺式作用序列基序如内部TATA盒、chi-位点、核糖体进入位点、ARE、INS和 CRS序列元素，以及重复序列、RNA二级结构和剪接供体和受体位点。进一步编辑该序列以除去两条链上的MV编辑(A₅G₃)-和核心基因末端(A₄CKT)-样序列。然后在NP 通用共有序列的核苷酸序列(NPflu)的5′端和3′端，分别添加BsiWI和BssHII限制性位点。该序列遵循“六的规则”，其规定MV基因组的核苷酸数量必须是6的倍数并且具有序列SEQ ID No.30。

编码与M2e的三个复制融合的NP共有蛋白(NPflu-3xM2e)的另一构建体，通过PCR 扩增产生，其使用NPflu共有基因作为模板和含有BsiWI限制性位点(下划线)的正向引物5′-AGTCGTACGG CCACCATGGC CTCTC-3′5SEQ ID No：36和含有BspE1和BssHII 限制酶位点(下划线)的反向引物5′-TCGGCGCGCG ATCCTCCGGA GTTGTCGTAC TCTTCGGCGT TG-3′(SEQ IDNo.37)。将得到的cDNA克隆到PCR4Blunt-TOPO质粒中。它在NPflu编码序列的3′末端含有独特的BspE1和BssHII限制性内切酶位点，这允许随后插入上述合成的、密码子优化的3xM2e序列。

用于构建和表征重组MV-NPflu&M2和MV-NPflu-3xM2e病毒的补充材料和方法

将NPflu和NPflu-3xM2e cDNA插入BsiWI/BssHII消化的pTM-MVSchw-ATU2(eGFP) 载体，得到pTM-MV-ATU2-NPflu(SEQ ID No.11)和pTM-MV-ATU2-NPflu-3xM2e(SEQ ID No.13)质粒。然后用SalI限制酶消化质粒pTM-MV-ATU2-NPflu和pTM-MV-ATU3-M2，并连接以产生双重组的pTM-MV-NPflu&M2(SEQ ID No.10)质粒。

如上所述，在293T-T7-MV辅助细胞中进行MV-ATU2-NPflu、MV-NPflu&M2和 MV-ATU2-NPflu-3xM2e的重组病毒的拯救。通过对其基因组测序和通过蛋白质印迹分析流感NP和M2(或M2e)的表达，来表征病毒(图9)。

用于构建和表征重组MV-ATU2-N-3xM2e病毒的补充材料和方法

通过用pTM-MV-ATU3-N-3xM2e质粒的BsiWI和BssHII限制酶消化获得N-3xM2e编码序列。然后将得到的DNA片段插入pTM-MVSchw-ATU2(eGFP)载体的相应位点，并且通过测序插入物检查所得到的pTM-MV-ATU2-N-3xM2e构建体(SEQ ID No.12)。

如上所述在293T-T7-MV辅助细胞中进行MV-ATU2-N-3xM2e重组病毒的拯救。通过对其基因组测序和通过蛋白质印迹分析感染的细胞裂解物，对病毒进行表征。用抗MV N 抗体和14C2抗-M2e单克隆抗体证实N-3xM2e融合蛋白的高水平表达，证明这种融合蛋白可以由ATU2(图11)或ATU3(图2)表达。

用于表征细胞免疫应答的补充材料和方法

在单次给予重组或亲本麻疹病毒7-10天后，收集脾细胞，并在标准ELISPOT测定中定量流感病毒特异性产生IFN-γ的T细胞的频率。简言之，用PBS中的10μg/ml大鼠抗小鼠IFN-γ抗体(R4-6A2，美国BD公司)覆盖96孔多孔PVDF板(密理博(Millipore))。洗涤平板并用完全RPMI培养基(补充有10％FCS、10mM Hepes、5×10^-5M β-巯基乙醇、非必需氨基酸、丙酮酸钠、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(streptomycin)的RPMI 1640) 封闭2小时。然后将来自免疫小鼠和对照小鼠的各种数量的脾细胞(典型为4×10⁵、2× 10⁵和1×10⁵)，在存在或不存在合适的肽(10μM)和IL2(10U/ml)的情况下一式三份平铺平板。将细胞在37℃下温育20小时，经过充分洗涤后，通过用作为底物的生物素化的大鼠抗小鼠IFNγ抗体(XMG1.2，美国BD公司)、碱性磷酸酶缀合的链霉亲和素(美国BD公司)和5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/硝基蓝四唑(BCIP/NBT，西格玛Sigma)连续孵育来暴露斑点。使用自动S6 Ultimate-V分析仪和相关的Immunosoft软件(CTL分析仪) 对斑点进行计数。对于每只小鼠，通过计算不存在和存在肽时产生的斑点数量之间的差异，来确定肽特异性产生IFNγ的细胞的数量。结果表示为每10⁶个脾细胞的斑点形成细胞(SFC) 的数量。

NP366(H3N2)共有肽(ASNENMDNM-SEQ ID No.41)、NP366(苏格兰)肽 (ASNENMDTM-SEQID No.42)和NP263-276保守肽(ALILRGSVAHKSCL-SEQ ID No.43) 通过Eurogentec合成并用于测量流感特异性T细胞的频率。麻疹H22-30(RIVINREHL-SEQ ID No.44)和H446-454(SNHNNVYWL-SEQ ID No.45)肽和LCMV NP396-404 (FQPQNGQFI-SEQ ID No.46)肽分别用作阳性和阴性对照肽。

结果

重组MVSchw表达全长M2共有蛋白和有效地复制

本发明人设计了全长M2共有序列，其反映循环的人类流感病毒谱系：季节性A/H3N2 和A/H1N1菌株，以及2009年大流行A/H1N1变体菌株，来自于2011年11月可在NCBI 获得的完整编码序列。如材料和方法中所述，这种通用共有序列(M2raw)是由单独的H3N2、 H1N1和H1N1v共有序列产生的，并被编辑以移除潜在的MV编辑和聚腺苷酸化位点。除了在细胞质结构域中有一个保守性取代(Val51Ile)，通用共有氨基酸序列与H3N2共有序列相同，但是与H1N1(7个取代)和H1N1v(15个取代)共有序列不同。当只考虑M2 胞外域(M2e)时，通用M2e共有序列与H1N1和H3N2共有序列相同，与H1N1v共有序列有4个位点不同(表1)。

将共有基因的M2raw和人密码子优化版本(M2opt)作为附加转录单元(ATU)插入到MV载体中，插入到基因组的3位(ATU2，图1A)或1位(ATU1，未显示)。所有四种相应的重组病毒在辅助293-T7-MV中成功被拯救，如在MV感染的维洛-NK细胞中合胞体的形成(图1C为ATU2病毒，ATU1病毒未显示)和对所拯救的病毒基因组上ATU 的测序所表明。

然后在维洛-NK细胞中分析重组MV-ATU2病毒的生长。与亲本MVSchw相比，重组 MV-ATU2-M2raw和MV-ATU2-M2opt的生长动力学略微延迟(图1B)。此外，重组病毒的产量比亲本病毒低10倍，最大滴度为10^6.4TCID₅₀/ml。这可能是由于M2离子通道对哺乳动物细胞的毒性(Ilyinskii等，2007)以及MV-M2感染细胞表面的高水平M2表达。

实际上，通过用针对细胞外M2胞外域的14C2小鼠单克隆抗体，对非透化细胞进行免疫荧光分析(图1C)，证明了M2共有蛋白在感染细胞表面的表达。此外，用重组MV-M2 病毒感染的维洛-NK细胞中的M2的表达水平通过细胞裂解物的荧光蛋白质印迹进行分析，并显示远高于在用A/PR/8/34(PR8)或A/苏格兰/20/74(SCOT)流感病毒感染的MDCK 细胞中的表达水平(图1D-E)。更确切地说，来自MV-M2感染的维洛NK细胞的裂解物，必须被稀释超过1/4(图1D)或多达1/10(图1E)，而与来自流感感染的MDCK细胞的裂解物的条带强度相当。

重组MVSchw表达与M2e胞外域融合的另外的N蛋白和有效地复制

为了提高M2e免疫原性，我们设法将M2e表达为与麻疹核蛋白(N)的融合蛋白，从而实现病毒核蛋白上M2e的多聚化和显示。为此目的，通过柔性SGGSGG接头(SEQ ID No.38)，将23aa-共有的M2e序列的一个或三个串联复制基因连接到麻疹N的C-末端，并且由位于pTM-MVSchw-ATU3载体的6位的ATU表达所得到的蛋白质(图2)。在该方法中，麻疹N蛋白作为载体将M2e整合到麻疹核糖核蛋白(RNP)复合物中。

重组MV-N-1xM2e和MV-N-3xM2e病毒在辅助293-T7-MV中被成功拯救，正如MV 感染的维洛-NK细胞中合胞体的形成(图2B)和对所拯救的病毒基因组上的ATU的测序所表明。这两种重组病毒均生长至滴度为10⁷-10⁸ TClD₅₀/ml范围，这与亲本MVSchwarz 所实现的相似。这表明来自基因组6位中的附加基因的杂合N蛋白的表达，不影响病毒的体外繁殖。

通过感染的细胞的免疫荧光和感染的细胞裂解物的蛋白质印迹，分析N-M2e融合蛋白的表达。除了原本的N带外，通过用抗MV N抗体进行蛋白质印迹，观察到了每种融合蛋白期望尺寸的附加条带(图2D)。这些条带也与14C2抗-M2e单克隆抗体反应(图2C)，验证M2e表位在其N载体上的正确表达。值得注意的是，在印迹上可以看到几个较小的附加条带，这表明原本的和融合的N蛋白的降解以及麻疹N对蛋白水解的敏感性，这已经被其他人所证实(Rima，1983)。N-M2e条带的强度比原本的N带的强度低，这表明与位于反基因组近端1位的原本的N基因相比，来自位于远端6位的ATU的N-M2e基因表达水平降低。这是可以预期的，因为从MV基因组RNA的3′至5′端，所产生的病毒mRNAs 的量是减少的(Plumet等，2005)。如图2B所示，抗MVN抗体的免疫染色显示，N主要被包含在大的胞质包涵体中，如其他人所描述(Griffin，2013)。这些包涵体在MV生命周期中的作用还没有被大量地研究，但可能是病毒基因组转录和复制的位点，最近在其他副粘病毒和弹状病毒中得到证实(参见Zhang等，2013)。有趣的是，14C2抗-M2e单克隆抗体的免疫染色显示了两种N-M2e融合蛋白的相似定位，这表明它们的麻疹N区将融合蛋白引导至病毒复制的位点，而且同样地促进了它们的掺入和多聚化成活性RNP复合物。

MV-M2和MV-N-M2e诱导Th1型免疫应答

在对MV感染敏感的基因修饰的CD46-IFNAR小鼠中，研究了重组MV-M2病毒的免疫原性(Mrkic等，1998)，并将其与在用小鼠适用的A/苏格兰/20/74菌株的实验性流感感染期间所表达的M2的免疫原性相比较(图3)。

通过针对M2e肽和MV抗原的间接ELISA，分别评估每只个体小鼠的M2e-和麻疹特异性抗体应答。M2e肽在其C-末端被生物素化并被固定在链霉亲和素偶联的微量滴定板上，以确保肽以尽可能接近其天然构象的构象在聚苯乙烯孔上显示，M2e肽以C-末端与M2跨膜区连接并显示在细胞表面上。事实上，初步实验显示，当M2e肽被生物素化和被固定时，而不是吸附在ELISA板的塑料表面上时(未显示)，通过14C2单克隆抗体和通过实验性流感感染在小鼠中诱导的多克隆抗体识别M2e肽更为有效。

在首次注射重组MV-ATU2-M2病毒(图3A)和MV-ATU1-M2病毒(未显示)之后，所有小鼠中的抗-M2e IgG的高滴度升高至相似的水平，而免疫前血清(未显示)和来自接受空MVSchw的对照动物的血清保持阴性。MV-ATU2-M2raw和MV-ATU2-M2opt注射的动物的这些滴度(平均滴度分别为3.7±0.3和3.7±0.2log10)，均高于感染A/苏格兰/20/74 病毒的动物(滴度为2.9±0.3 log10，p＜10^-3)。第二次注射后，对于用MV载体免疫的动物，滴度增加10至20倍。结合第一次注射后观察到的结果，四种MV-M2重组病毒诱导了相似的高IgG滴度，其落在10⁴-10⁵范围内(图3A和3C)。值得注意的是，A/苏格兰/20/74 病毒的第二次接种没有扩增抗-M2抗体的应答(2.9±0.8 log10)。

接下来，将重组MV-N-M2e病毒的免疫原性，与MV-ATU2-M2opt病毒的免疫原性进行比较。在首次注射重组MV-N-3xM2e病毒(滴度为2.7±0.2 log10)之后，在所有小鼠中均引起了显著的抗-M2e IgG滴度，而来自对照动物的血清和来自接受MV-N-1xM2e的动物的血清均保持阴性(log 10滴度＜1.7，图4A)。在第二次注射后，用MV-3xM2e病毒免疫的动物的滴度被提高到3.5±0.4 log10，并且在用MV-N-1xM2e病毒免疫的6只小鼠的2只中，以低滴度检测到了抗-M2应答(2.0和2.7 log10滴度)。相反的是，MV-ATU2-M2opt 的单次注射诱导了高IgG滴度(3.9±0.2 log10滴度)，其在第二次注射后进一步增加(4.3±0.3 log10滴度)。

接着，为了分析由重组MV疫苗诱导的免疫应答的极化，我们在第二次注射三周后，测量IgG1和IgG2a同种型的水平(图4C)。用两剂量的MV-ATU2-M2或MV-N-3xM2e免疫诱导IgG2a的滴度比IgG1抗体的更高(IgG2a相对于IgG1的平均比分别为60和79)，表明免疫应答倾向于Th1型应答。

有趣的是，在接受MVSchw或MV-M2病毒(图3B和3D)或MV-N-M2e病毒(图 4B)的所有小鼠中，MV的抗体均以相似的水平升高。这表明，尽管生长曲线延迟并且在体外实验中滴度降低，重组病毒表达全长M2蛋白并不改变其在体内的复制，也不改变其的麻疹特异性免疫原性。

总之，这些结果表明麻疹载体能够在CD46-IFNAR小鼠(H-2b 129/Sv背景)中诱导非常高水平的抗-M2e抗体，无论全长M2基因由ATU表达或者短的23-aa M2e序列的3 个串联复制与N基因的附加复制融合。最有趣的是，两种载体化策略都能绕过抗-M2e应答的H-2限制，其最近被描述用于DNA免疫、腺病毒载体化和M2e-多抗原性肽(MAP) 免疫，并且其在H2^b单倍型小鼠中的应答性被证实非常差(Misplon等，2010；Wolf等， 2011)。另外，抗-M2e应答可能是Th1-倾向的，是减毒活病毒的标志，并且是抗病毒疫苗的非常希望的特征。

同源和异源攻击后小鼠的保护

为了确定MV-ATU1-M2opt和MV-ATU2-M2opt的保护效率，我们调查了用10 LD50 同源A/苏格兰/20/74(H3N2)菌株或异源A/巴黎/2590/09(H1N1v)菌株的鼻内致死攻击后，CD46-IFNAR小鼠的存活。还监测小鼠的体重变化，作为疾病的估量。用亲本MVSchw 免疫的作为对照的所有小鼠，在用A/巴黎/2590/09(H1N1v)攻击后10天内死亡(图3F)。用亲本MVSchw免疫的所有对照组小鼠(除了一只)，在用A/苏格兰/20/74(H3N2)攻击后10天内死亡(图3E)。相比之下，用MV-ATU1-M2或MV-ATU2-M2免疫的小鼠被部分保护而免受攻击，整体死亡率降低并且死亡时间延迟。存活率从17％到83％不等，存活的小鼠表现出体重减轻达到其初始体重的25％，并且在攻击后第8-10天开始恢复(未显示)。

为了确认用MV-M2重组病毒接种诱导的抗体是所观察到的保护的原因，由用 MV-ATU1-M2或MV-ATU2-M2免疫的CD46-IFNAR小鼠制备血清，并转移到天然C57BL/6 受体小鼠。通过腹膜内注射，每只小鼠接受400μl合并的免疫血清，该剂量足以在受体小鼠中获得约是供体小鼠中水平的1/10的抗-M2e循环抗体滴度(初步实验，未显示)。转移后第二天，用同源A/苏格兰/20/74(H3N2)攻击小鼠并记录生存曲线(图5)。正如对供体免疫小鼠所观察到的(图3E)，用免疫血清转移的小鼠被部分保护而免受攻击，整体死亡率降低且死亡时间延迟，而用对照血清转移的所有小鼠在11天内死亡。

总之，这些结果表明重组MV-M2病毒在CD46-IFNAR小鼠中，诱导了针对同源H3N2 和异源H1N1v流感的保护性免疫，还表明被免疫动物中存在的针对M2的循环抗体有助于所观察到的保护作用。

由N-M2e融合蛋白诱导的抗体识别天然四聚体M2并保护小鼠免受同源攻击

虽然仍不甚了解抗-M2e抗体的保护机制，但其主要是依赖于流感病毒感染细胞的Fc受体依赖性消除，ADCC和Ab依赖性细胞介导的吞噬作用(El Bakkouri等，2011；Jegerlehner 等，2004)。因此，至关重要的是，通过免疫产生的抗-M2e抗体能够识别天然的M2e，其在流感病毒感染的细胞表面如在流感病毒粒子上一样，呈现为四聚复合物。为了研究这一点，如材料和方法中所述，我们制造了MDCK细胞，其在细胞表面组成性表达全长共有M2蛋白。我们在基于细胞的间接ELISA中，使用这些MDCK-M2细胞来分析来自 MV-N-1xMe-和MV-N-3xM2e免疫的小鼠的血清的结合(图4D)。

MV-N-3xM2e重组病毒诱导了高水平的能够结合MDCK-M2细胞的抗体(2.8±0.4 log10滴度)。在这些MV-N-3xM2e免疫的小鼠中由N-显示的M2e诱导的抗MDCK-M2抗体滴度，比在MV-ATU2-M2免疫的小鼠中由天然M2共有蛋白诱导的抗体滴度(4.2±0.2 log10滴度，p＜10^-3)低20倍。来自用MV-N-1xM2e免疫的小鼠的血清保持阴性(log10 滴度＜1.7)。结合滴度的层级确实与用肽ELISA(图4A)观察到的相当，并且证实具有 M2e单复制的N-1xM2e构建体比表达M2的3个串联复制的N-3xM2e构建体具有更低的免疫原性。

总之，这些结果证明，在麻疹RNP复合物上呈现和多聚的M2e肽，能够诱导识别天然四聚M2蛋白的抗体，其中天然四聚M2蛋白在MDCK-M2细胞的细胞表面表达。

为了研究MV-N-1xM2e和MV-N-3xM2e的保护效率，我们调查了用同源A/苏格兰 /20/74(H3N2)病毒鼻内致死攻击后，CD46-IFNAR小鼠的存活。所有用亲本MVSchw免疫的小鼠在9天内死亡(图4E)。与此相反，用MV-N-1xM2e和MV-N-3xM2e免疫的6只小鼠中，分别有2只和3只存活至攻击后21天。值得注意的是，用MV-N-3xM2e的免疫导致最终死于感染的小鼠的死亡时间延迟，并且用MV-ATU2-M2opt的免疫诱导了更好的保护，这与诱导更高的抗-M2e和抗天然M2抗体滴度一致。总之，这些结果表明重组 MV-N-3xM2e和MV-N-1xM2e(在较小程度上)，在CD46-IFNAR小鼠中诱导了针对流感的显著保护性免疫。

对重组MV-M1和MV-M1&M2病毒的构建和表征的补充结果

可以改造重组MVSchw以表达来自两个ATU的全长M1和M2共有蛋白

我们设计了一个全长M1共有序列，其反映循环的人类流感病毒谱系：季节性A/H3N2 和A/H1N1菌株，以及2009年大流行A/H1N1菌株，来自于2013年1月可在NCBI获得的完整蛋白序列。正如材料和方法中所描述的，这种通用共有序列是由单独的H3N2、H1N1 和H1N1v共有序列产生的。然后产生相应的核苷酸编码序列，密码子优化以在哺乳动物细胞中高表达，并进一步编辑以移除流感剪接位点和防止截短的M2样多肽的合成。它还被编辑以移除潜在的MV编辑-和聚腺苷酸化位点。利用MV复制产生的基因表达梯度(Plumet 等，2005)，将所得的M1opt共有基因作为ATU插入MV载体的3位(ATU2，图6A)，将M2opt共有基因插入6位(ATU3)。该选择是为了减少M2表达以及减少对麻疹病毒载体复制的负面影响，我们先前在M2插入更接近ATU2时观察到该负面影响(图1)。

然后，通过SalI限制和连接产生具有M1opt和M2opt共有基因的麻疹载体(插在两个不同ATU中)。正如MV感染的维洛-NK细胞中合胞体的形成和对拯救的病毒基因组上 ATU的测序所表明，在辅助293-T7-MV中成功拯救了单重组病毒和双重组病毒。所有重组病毒均生长至滴度为10⁷-10⁸ TClD₅₀/ml范围，这与亲本MVSchwarz所实现的相似。有趣的是，哺乳动物细胞的M2毒性不损害MV-ATU3-M2opt和MV-M1&M2病毒的生长，正如其对MV-ATU2-M2opt那样，这表明如预期一样，来自远端ATU3的M2表达水平降低到低于毒性水平。

M1和M2在单重组病毒和双重组病毒感染的维洛-NK细胞中的表达，通过细胞裂解物的荧光蛋白质印迹来分析。显示M2表达水平高于在感染A/苏格兰/20/74流感病毒的MDCK细胞中的表达水平(图6C)，而M1表达水平显示略低(图6B)。双MV-M1&M2 重组病毒的M1和M2表达水平分别与单重组病毒MV-ATU2-M1opt和MV-ATU3-M2opt 相似。

总之，这些数据表明麻疹病毒载体可以被设计，以同时表达编码来自循环的流感谱系的M1基质和M2离子通道的共有基因。这种双重组病毒应该推动由感染细胞产生覆盖有 M2蛋白的流感病毒样颗粒(VLP)，并诱导免疫动物同时针对M1和M2流感抗原的增强的免疫应答。

同时表达M1和M2共有蛋白的双重组麻疹病毒在小鼠中表现出比单重组病毒更高的保护效率。

在CD46-IFNAR小鼠中研究了双重组MV-M1&M2病毒的免疫原性，并与单重组 MV-ATU2-M2opt和MV-ATU3-M2opt病毒的免疫原性进行比较。在首次注射3种重组病毒的任一种之后，在所有小鼠中均产生了高滴度的抗-M2e的IgG，而来自接受空MVSchw 或MV-ATU2-M1opt的对照动物的血清保持阴性(图8A)。第二次注射后，滴度提高至与用MV-ATU2-M2opt或MV-ATU3-M2opt病毒(分别为3.9±0.4和3.8±0.3 log10滴度)免疫的动物相似的水平。值得注意的是，在用双重组MV-M1&M2病毒(4.1±0.3 log10滴度) 免疫的小鼠中检测到比用亲本MV-ATU3-M2opt(p＜0.01)或前MV-ATU2-M2opt(p＜0.1) 病毒免疫的小鼠显著更高的抗-M2e应答。

有趣的是，在接受MVSchw或MV-M1&M2病毒的所有小鼠中，MV的抗体都以相似的水平升高(图8B)，这表明双重组病毒同时表达两种异种蛋白并不改变其在体内的复制，也不改变其麻疹特异性免疫原性，如单重组病毒中已经观察到的那样。

为了研究双重组MV-M1&M2病毒的保护效率，我们调查了用同源A/苏格兰/20/74(H3N2)病毒鼻内致死攻击后，CD46-IFNAR小鼠的存活。用MV-ATU2-M1opt或亲本 MVSchw免疫的小鼠自攻击后第3天呈现大量且快速的体重减轻，并且大部分在12天内死亡(图8C)。用MV-ATU2-M2opt或MV-ATU3-M2opt单重组病毒免疫的小鼠被部分保护而免受攻击，整体死亡率良好地降低。存活率分别为75％和70％，且从该攻击存活下来的小鼠表现出的体重减轻到其初始体重的25％(图8D)。与之形成鲜明对比的是，用双重组MV-M1&M2病毒免疫的所有小鼠在攻击后存活，其临床症状减轻且体重的减轻有限。

总之，这些结果表明，与用亲本MV-ATU2-M1opt或MV-ATU3-M2opt中的任一种相比，双重组MV-M1&M2病毒在CD46-IFNAR小鼠中诱导针对流感明显更好的保护性免疫。

重组MVSchw可被设计为同时表达全长NP共有序列和M2或M2e共有序列

我们设计了一个全长NP共有序列，其反映循环的人类流感病毒谱系：季节性A/H3N2 和A/H1N1菌株，以及2009年大流行A/H1N1菌株，来自于2015年5月可在NCBI获得的完整蛋白序列。如材料和方法中所述，这种通用共有序列是由单独的H3N2、H1N1和 H1N1v共有序列产生的。然后相应的核苷酸编码序列产生、密码子优化以在哺乳动物细胞中高表达，并进一步编辑以移除潜在的MV编辑-和聚腺苷酸化位点。

然后探索了两种可供选择的策略，以同时表达NP和M2共有序列。

首先，类似于用于表达M1和M2序列的策略(见上文)，将获得的NPflu共有基因作为ATU插入MV载体的3位(ATU2，图9A)，并将M2opt共有基因插在6位(ATU3)。然后，通过SalI限制和连接产生具有插入两个不同ATU中的NPflu和M2opt共有基因的麻疹载体。单MV-NPflu重组病毒和双MV-NPflu&M2重组病毒在辅助293-T7-MV中被成功拯救，正如MV感染的维洛-NK细胞中合胞体的形成和对所拯救的病毒基因组上ATU 的测序所表明。两种重组病毒均动力学迟滞地生长至滴度为10⁷ TClD₅₀/ml范围，其略低于亲本MVSchwarz所达到的滴度，表明NPflu的表达在一定程度上干扰麻疹病毒基因组的复制和/或病毒的传播。

第二，NP和M2e表达为来自位于pTM-MVSchw-ATU2载体3位的ATU的嵌合 NPflu-3xM2e抗原(图9B)。在该方法中，NPflu共有蛋白起到了载体的作用，并在其C- 末端显示了23个aa-共有M2e多肽的3个复制。最有可能的是，嵌合抗原会像真正的流感 NP那样进行多聚化，从而增强M2e多肽的免疫原性。重组MV-NPflu-3xM2e病毒在辅助 293-T7-MV中被成功拯救，并在维洛-NK细胞中繁殖至滴度为10⁷ TClD₅₀/ml范围，这与亲本MV-ATU2-NPflu所达到的滴度相似，尽管低于空MVSchwarz载体所达到的滴度。

通过细胞裂解物的荧光蛋白质印迹，分析NPflu和M2/M2e在单重组病毒或双重组病毒感染的维洛-NK细胞中的表达。显示NPflu的表达水平与在感染A/苏格兰/20/74流感病毒的MDCK细胞中的表达水平相似(图9C)，而M2的表达水平已经显示更高(图6C)。双MV-NPflu&M2重组病毒的M2表达水平稍低于单MV-ATU3-M2opt重组病毒的(图9D)，这与前面所观察到的生长延缓一致。双MV-NPflu&M2重组病毒的NP表达水平与单 MV-ATU2-NPflu重组病毒的相似。

依据存在比原本的NP(56kDa)分子量更高的预期尺寸(64.6kDa)的条带，证明了NPflu-M2e融合蛋白的表达。该条带与抗流感病毒粒子抗体和14C2抗-M2e单克隆抗体(图9C和9D)反应，证实了NP载体上M2e表位的正确表达。

总之，这些数据表明麻疹病毒载体也可以被设计以同时表达共有基因，该共有基因编码来自循环流感病毒谱系的NP核蛋白和M2离子通道。M2可以表达为来自专用ATU的全长整合蛋白，例如在双MV-NPflu&M2重组病毒中，或者表达为在其23aa-核M2e胞外域和NPflu之间的融合蛋白，例如在单MV-NPflu-3xM2e重组病毒中。

表达NPflu和M2共有蛋白的双重组麻疹病毒在小鼠中表现出比单重组病毒更高的保护效率。

在CD46-IFNAR小鼠中研究了双重组MV-NPflu&M2病毒的免疫原性，并与单重组MV-ATU3-M2opt病毒的免疫原性相比较。

在首次注射任一种重组病毒后，所有小鼠均产生高滴度的抗-M2e的IgG，而来自接受空MVSchw或MV-ATU2-NPflu的对照组动物的血清保持阴性(图10A)。在第二次注射后，用MV-NPflu&M2(3.6±0.5 log10滴度)免疫的动物的滴度比用MV-ATU3-M2opt病毒免疫的动物(4.2±0.4 log10滴度，p＜0.1)升高的水平更低，这与前面所观察到的延迟的生长曲线和降低的体外产量一致。

在已经用双MV-NPflu&M2病毒免疫的小鼠中，检查异源特异性细胞应答的诱导。使用流感病毒NP366免疫显性I类肽和NP260-273 II类肽，通过ELISPOT对免疫小鼠的脾中流感病毒特异性产生IFN-γ的T细胞的频率进行定量。

当从6只MV-NPflu&M2免疫小鼠中的5只，而不是从对照的MVSchw和 MV-ATU3-M2opt免疫小鼠中分离脾细胞时，检测到响应NP366(H3N2)共有I型肽(SEQ ID No.41)的产生IFNγ的CD8+ T细胞(图10C)。观察到670至2000之间(平均1300 ±510)/每10⁶个脾细胞的流感特异性T细胞前体频率，表明在用双MV-NPflu&M2重组病毒免疫后诱导了非常强的异源特异性CD8+ T细胞应答。这些NP366特异性T细胞具有交叉反应性并且能够以相似的效率(860±340 SFC/10⁶脾细胞)识别对应于A/苏格兰/20/74 病毒的NP366(苏格兰)(SEQ ID No.42)肽。检测到响应NP260-273保守II类肽(SEQ ID No.43)的产生IFNγ的CD4+ T细胞，尽管其频率稍低(520±150 SFC/10⁶脾细胞)。

为了研究双重组MV-NPflu&M2病毒的保护效率，我们检查了用同源A/苏格兰/20/74(H3N2)病毒鼻内致死攻击后，CD46-IFNAR小鼠的存活。用对照的亲本MVSchw免疫的小鼠从攻击后第3天(图10D)呈现大量且快速的体重减轻，且6只小鼠中有4只在12 天内死亡(图10E)。用MV-ATU2-NPflu或MV-ATU3-M2opt单重组病毒免疫的小鼠被部分保护而免受攻击，具有降低的整体死亡率和体重减轻。大多数小鼠在攻击后存活，并分别表现出最初体重的16.5±2.9％(第8天)和19.2±4.4％(第9天)的最大体重减轻(图 10E)。与此相反，用双重组MV-NPflu&M2病毒免疫的所有小鼠在攻击后都存活，临床症状净减少(未显示)和更短暂的体重减轻：他们在第7天时表现出11.0±3.7％的最大体重减轻，并且之后迅速恢复。

总之，这些结果表明在CD46-IFNAR小鼠中，双重组MV-NPflu&M2病毒比其亲本 MV-ATU2-NPflu或MV-ATU3-M2opt诱导明显更好的抗流感保护性免疫。更高的保护效率与诱导抗-M2e抗体和抗NP细胞应答相关。

表格

表1：M2e共有氨基酸序列的比对

通用共有序列 SLLTEVETPI RNEWGCRCND SSD(SEQ ID No.21)

H1N1共有序列 ---------- ---------- ---

H1N1v共有序列 ---------T-S--E---S- ---(SEQ ID No.32)

H3N2共有序列 ---------- ---------- ---

在报告的实验中用作免疫原。

-表示匹配的残基。

结论

这项临床前研究的目的是：基于被设计表达M2共有蛋白的标准麻疹疫苗，评价新通用流感疫苗策略的概念验证。本发明人发现疫苗诱导了高滴度的抗-M2e抗体并且保护了小鼠免受同源或异源流感病毒的鼻内致死攻击。

在用重组MV-M2或MV-NM2e病毒连续两次免疫后，小鼠被部分保护而免受小鼠适用的A/苏格兰/20/74(H3N2)和A/巴黎/2590/09(H1N1v)病毒的鼻内传染性攻击，而被动转移实验证明抗-M2抗体有助于该保护。抗-M2e应答可能是Th1-倾向的，这是减毒活病毒的标志，并且是抗病毒疫苗非常希望的特征。

有趣的是，如上所述，两种载体化策略都可以绕过抗-M2e应答的H-2限制，其在最近得到证实，并且预期H-2^bMHC单倍型的所有小鼠例如研究中使用的CD46-IFNAR小鼠的反应性非常差。这表明诱导针对麻疹载体的T细胞应答可能提供T辅助细胞应答，这是触发B细胞产生抗-M2e抗体所需的。显著地，在MV-ATU1-M2或MV-ATU2的情况下，无论M2表位是否与N-M2e杂合蛋白内(例如在半抗原-载体偶联物中)的麻疹N连接或与 MV蛋白共表达，都提供了帮助。

最有意思的是，针对A/苏格兰/20/74病毒的攻击产生了保护，而且针对大流行A/巴黎/2590/09H1N1v菌株(其M2e序列具有禽源并且与用于免疫的通用共有序列有4个位点不同)的攻击，也产生了保护。这个结果可能预示着对各种亚型的广泛保护，因为，例如，禽H5N1病毒仅有上述4个位点中的3个不同。

部分保护意味着重组疫苗可以被提高。在这方面，作为置于基因组(ATU3)的6位处的附加核蛋白基因，杂交N-M2e蛋白的表达不影响小鼠的体外复制和免疫原性。这给发明人提供进一步完善该策略的机会，通过将附加杂交N-M2e基因置于基因组上游，如P和M 基因之间的3位(ATU2)，从而增加N-M2e的表达以及可能的免疫原性和保护水平。通过双重组麻疹疫苗中第二种流感共有蛋白的共表达，如M1或NP共有序列，也可以提高保护水平。该方法将通过靶向保守流感结构蛋白的细胞应答，来有利地完成宽广的抗-M2抗体应答的诱导。实际上，发明人表明麻疹疫苗可以被进一步设计以表达M1和M2共有蛋白，或表达NP和M2/M2e共有蛋白，并且在IFNAR-CD46小鼠模型中，这种双重组病毒比任何单重组病毒提供的针对流感的保护作用增强。双MV-M1&M2重组病毒的更高保护效率与诱导针对NP蛋白的交叉反应细胞应答相关。有趣的是，双MV-M1&M2重组病毒的更好保护效率与诱导更高的抗-M2e抗体水平相关，强烈有利于在被双MV-M1&M2重组病毒感染的细胞中产生流感VLP。

或者，部分保护可能是小鼠模型严格性的表征。本发明人使用小鼠适用型病毒进行攻击，并且依靠在细胞培养基中经有限次(少于2次)传代制备的储备细胞。在所用攻击剂量(10LD50和小于10³PFU)下，大多数对照小鼠迅速死亡，CD46-IFNAR小鼠在8天内死亡(图3和4)以及免疫活性C57BL/6小鼠在10天内死亡(图5)。这与本发明人先前在其他小鼠品系中观察到的结果相匹配，并且是实验室品系小鼠中适用病毒高毒性的强力指示。此外，通过CD46转基因小鼠与缺乏1型IFN受体的IFNAR小鼠(IFNα/βR^-/-)回交，构建CD46-IFNAR小鼠，并且预期CD46-IFNAR小鼠会像其IFNAR亲本那样，在流感攻击后表现出增加的死亡率和发病率(Arimori等，2013)。

由于重组MV流感疫苗在大多数国家可以被容易且快速地大量且低成本生产，因此可以使用重组MV流感疫苗代替常规用于全世界婴儿的标准MV疫苗，尤其是通过WHO的扩大免疫计划。有趣的是，M1、M2和NP转基因中任一种的表达都没有改变小鼠临床前模型中麻疹特异性免疫的诱导，这表明MV流感疫苗甚至可能替代组合的麻疹、腮腺炎、风疹疫苗或麻疹、腮腺炎、风疹、水痘疫苗中的MV施瓦兹菌株。

总之，本发明人已经制备了新的重组MV流感病毒，其能够诱导高水平的抗-M2抗体和对流感的细胞应答和对鼻内攻击的广泛保护，从而形成通用流感疫苗的发展策略的概念验证。这也有助于在受动物传人疾病影响的地区，针对人畜共患流感病毒，如禽H5N1、 H9N2和H7N9病毒，在儿童和成年人中实现广泛的疫苗覆盖。

这些特征性的通用流感疫苗候选者应当在更适用的、非免疫损害以及遗传多样性的、非人灵长类模型中被评价，其中可以解决针对季节性和人畜共患流感病毒株的野外分离株的诱导免疫应答的保护性潜力。

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Claims (30)

1.至少表达第一抗原的重组麻疹病毒(MV)，其中，第一抗原包含或由如下构成：(i)M2抗原，其氨基酸序列是共有氨基酸序列，所述共有氨基酸序列代表包括循环的季节性人类病毒和任选的一种或多种大流行性人类病毒在内的多种甲型流感病毒亚型的选集中的M2序列，和/或包括动物病毒，特别是地方性动物病毒和任选的据报道已感染人类对象并被认为有大流行风险的动物病毒在内的多种甲型流感病毒亚型的选集中的M2序列，或者(ii)包含(i)的所述M2抗原的胞外域的部分或由所述胞外域构成的部分(基于M2e的抗原)。

2.根据权利要求1所述的重组麻疹病毒，其中，M2抗原或基于M2e的抗原具有来源于病毒的M2序列的共有氨基酸序列，所述病毒选自包含A/H1N1和A/H3N2季节性菌株和A/H1N1v大流行变体菌株的组，或者选自包含A/H5N1和A/H7N9禽类菌株和任选的A/H1N1v大流行变体菌株的组，或者选自包含A/H1N1、A/H3N2、A/H5N1和A/H7N9菌株和A/H1N1v大流行变体菌株的组，或者在所述组之一中进一步选择并进一步包含A/H9N2、A/H5N6和A/H10N8菌株中的至少一种。

3.根据权利要求1和2中任一项所述的重组麻疹病毒，其中，所述麻疹病毒是选自施瓦茨菌株、莫拉特纳菌株、萨格勒布菌株和AIK-C菌株的组的活减毒菌株。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组麻疹病毒，其中，M2共有抗原由序列SEQ IDNo.19构成，M2抗原的胞外域具有序列SEQ ID No.21，H1N1v的M2e共有抗原由序列SEQ IDNo.32构成，H5N1的M2e共有抗原由序列SEQ ID No.40构成。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的重组麻疹病毒，其中，所述重组麻疹病毒的基因组包含编码M2抗原的胞外域的多核苷酸的多个复制。

6.根据权利要求5所述的重组麻疹病毒，其中，所述重组麻疹病毒的基因组包含编码M2抗原的不同或相似胞外域的多核苷酸的多个复制。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的重组麻疹病毒，其中，所述重组麻疹病毒的基因组包含编码M2抗原的胞外域的多核苷酸、或编码M2抗原的多个胞外域的多个多核苷酸，其中，所述基因组中的所述多核苷酸或所述多个多核苷酸中的一个与编码载体蛋白的多核苷酸基因融合，所述载体蛋白任选地为免疫原性载体蛋白，其中，所述多核苷酸或所述多个多核苷酸中的一个任选地通过接头与编码载体或M2e结构域的其他多核苷酸连接。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的重组麻疹病毒，其中，载体分子是麻疹病毒或其变体的核蛋白的附加复制，所述变体例如为病毒的一部分，任选地为免疫原性部分，并且融合是与核蛋白或其一部分的C-末端的融合。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的重组麻疹病毒，其中，所述载体蛋白是甲型流感病毒的抗原，特别是核蛋白NP，特别是序列为SEQ ID No.31的NP或甲型流感病毒的此类抗原的免疫原性部分，特别是序列为SEQ ID No.31的NP的免疫原性部分。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的重组麻疹病毒，其还表达甲型流感病毒的一种或多种另外的抗原，或表达一种或多种另外的抗原，所述另外的抗原的氨基酸序列是共有序列，所述共有序列代表来自各种甲型流感病毒亚型的选集的确定的病毒抗原的序列，其中，所述选集包括循环的季节性人类病毒和任选的大流行性人类病毒，和/或包括动物病毒，特别是地方性动物病毒和任选的据报道已感染人类对象并被认为有大流行风险的动物病毒。

11.根据权利要求10所述的重组麻疹病毒，其中，所述另外的抗原选自基质蛋白M1，特别是序列为SEQ ID No.23的M1蛋白，核蛋白NP，特别是序列为SEQ ID No.31的NP蛋白，神经氨酸酶蛋白NA，或者是这些蛋白中至少一种的免疫原性部分。

12.根据权利要求8或9中任一项所述的重组麻疹病毒，其中，基于M2e的抗原选自具有序列SEQ ID No.25的NPflu-3xM2e、具有序列SEQ ID No.28的N-1xM2e、或具有序列SEQ IDNo.29的N-3xM2e。

13.一种转移载体，特别是在质粒载体中的转移载体，其适于拯救权利要求1至12中任一项所述的重组麻疹病毒，所述重组麻疹病毒包含可操作地连接在载体骨架中的插入物，其中，所述插入物被克隆到编码麻疹病毒全长反基因链RNA的cDNA中，并且包含或由编码权利要求1至12中任一项所定义的一种或多种抗原的多核苷酸构成。

14.根据权利要求13的转移载体，其包含在编码麻疹病毒全长反基因链RNA的cDNA中的不同插入位点处克隆的多个多核苷酸插入物。

15.根据权利要求13或14所述的转移载体，其是一种携带cDNA的重组质粒，所述cDNA的核苷酸序列包含：(i)编码MV的全长反基因链RNA的序列的核苷酸序列，其中一个或多个附加转录单元(ATU)已经插入到基因间区域，以及(ii)在所述ATU中插入异源多核苷酸，所述异源多核苷酸的序列包含编码权利要求1至12中任一项所定义的一种或多种抗原的开放阅读框。

16.根据权利要求13至15中任一项所述的转移载体，其中，所述质粒选自：

-具有序列SEQ ID No.1的pTM-MV-ATU1-M2raw、具有序列SEQ ID No.3的pTM-MV-ATU2-M2raw、具有序列SEQ ID No.2的pTM-MV-ATU1-M2opt、具有序列SEQ ID No.4的pTM-MV-ATU2-M2opt、具有序列SEQ ID No.8的pTM-MV-ATU3-M2opt，

-具有序列SEQ ID No.5的pTM-MV-ATU3-N-1xM2e、具有序列SEQ ID No.6的pTM-MV-ATU3-N-3xM2e(N是麻疹病毒N蛋白)，

-具有序列SEQ ID No.9的pTM-MV-M1&M2，

-具有序列SEQ ID No.10的pTM-MV-NPflu&M2和具有序列SEQ ID No.11的pTM-MV-ATU2-NPflu，其是pTM-MV-NPflu&M2的亲本构建体，

-具有序列SEQ ID No.13的pTM-MV-ATU2-NPflu-3xM2e，

-具有序列SEQ ID No.7的pTM-MV-ATU2-M1opt，

-具有序列SEQ ID No.12的pTM-MV-ATU2-N-3xM2e，其中N是麻疹病毒核蛋白。

17.权利要求13至16中任一项所述的转移载体的应用，用于制备权利要求1至12中任一项所述的重组麻疹病毒。

18.用于组装感染性重组麻疹病毒颗粒和任选的甲型流感VLP的拯救系统，其包含用载体、特别是质粒载体转化、特别是转染的细胞，优选哺乳动物细胞或细胞系，其中，载体适合表达聚合酶例如T7聚合酶、以及表达麻疹病毒的N、P和L蛋白，其中所述细胞进一步用权利要求13至16中任一项所述的载体转染。

19.根据权利要求17所述的拯救系统，其中，所述细胞是于2006年6月14日保藏在CNCM(法国，巴黎)的编号为I-3618的293-T7-NP细胞系或者于2006年8月4日保藏在CNCM(法国，巴黎)的编号为I-3662的293-Tnls7-NP。

20.用载体、特别是质粒载体转化、特别是转染的细胞，包含表达聚合酶如T7聚合酶的核苷酸序列，以及表达麻疹病毒的N，P和L蛋白的核苷酸序列，其中，所述细胞进一步用权利要求13至16中任一项所述的载体在能够产生重组麻疹病毒的条件下转染。

21.从权利要求20中所述的细胞中，特别是从权利要求20中所述的细胞的培养上清液或裂解物中回收的产物。

22.从权利要求20中所述的细胞中，特别是从权利要求20中所述的细胞的上清液或裂解物中回收的产物的应用，用于制备免疫原性组合物。

23.一种多核苷酸，其选自：

-具有序列SEQ ID No.1的pTM-MV-ATU1-M2raw、具有序列SEQ ID No.3的pTM-MV-ATU2-M2raw、具有序列SEQ ID No.2的pTM-MV-ATU1-M2opt、具有序列SEQ ID No.4的pTM-MV-ATU2-M2opt、具有序列SEQ ID No.8的pTM-MV-ATU3-M2opt，

-具有序列SEQ ID No.5的pTM-MV-ATU3-N-1xM2e、具有序列SEQ ID No.6的pTM-MV-ATU3-N-3xM2e，

-具有序列SEQ ID No.9的pTM-MV-M1&M2，

-具有序列SEQ ID No.10的pTM-MV-NPflu&M2和具有序列SEQ ID No.11的pTM-MV-ATU2-NPflu，

-具有序列SEQ ID No.13的pTM-MV-ATU2-NPflu-3xM2e，

-具有序列SEQ ID No.7的pTM-MV-ATU2-M1opt，

-具有序列SEQ ID No.12的pTM-MV-ATU2-N-3xM2e，

-M2raw合成基因的序列为SEQ ID No.17，或M2opt合成基因的序列为SEQ ID No.18的多核苷酸，

-编码共有M2e多肽的序列为SEQ ID No.20的多核苷酸，

-编码M1共有蛋白的优化序列为SEQ ID No.22的多核苷酸，

-编码NPflu-3xM2e融合蛋白的融合多核苷酸的序列为SEQ ID No.24的多核苷酸，

-编码N-1xM2e融合蛋白的融合多核苷酸的序列为SEQ ID No.26的多核苷酸，

-编码N-3xM2e融合蛋白的融合多核苷酸的序列为SEQ ID No.27的多核苷酸，

-编码共有NPflu蛋白的合成基因的序列为SEQ ID No.30的多核苷酸，

-编码任一多肽的多核苷酸，所述多肽的序列由选自下组中的序列组成：SEQ IDNo.19、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ IDNo.31、SEQ ID No.32和SEQ ID No.40.

24.一种免疫原性组合物，其包含权利要求1至12中任一项所述的重组麻疹病毒，任选地包含流感VLP，并且进一步包含适于向宿主施用的药物赋形剂和任选的免疫应答的佐剂，其中，所述组合物任选地配制成用于向儿童施用。

25.根据权利要求1至12中任一项所述的重组麻疹病毒，其用作活性成分以在人类宿主中引发用于预防流感的免疫应答，特别是当向儿童施用时。

26.根据权利要求24所述的免疫原性组合物，其进一步包含流感病毒样颗粒，并且从产生重组麻疹病毒的细胞的上清液或裂解物中获得。

27.根据权利要求1-12中任一项所述的重组麻疹病毒，任选地与流感VLP组合，用于引发针对甲型流感病毒的抗体，和/或用于引发针对人类宿主中甲型流感病毒感染的细胞应答。

28.根据权利要求1-12中任一项所述的重组麻疹病毒，任选地与流感VLP组合，用于保护、特别是用于预防性保护针对由人类宿主中的甲型流感病毒感染引起的病症或疾病。

29.权利要求1至12中任一项所述的重组麻疹病毒的应用，任选地与流感VLP组合以制备活性成分，活性成分在用于人类宿主的多价疫苗中，例如合并麻疹、腮腺炎、风疹和流感多价疫苗中或麻疹、腮腺炎、风疹、水痘和流感多价疫苗中，用于预防甲型流感病毒感染或用于预防甲型流感病毒感染所造成的后果。

30.根据权利要求29所述的应用，其中，权利要求1至12中任一项所述的重组麻疹病毒还是用于预防麻疹病毒感染或预防麻疹病毒感染后果的活性成分。