KR102154795B1 - 조류 인플루엔자 바이러스 h5n6의 표면항원을 발현하는 뉴캣슬병 바이러스 발현 시스템 및 이를 이용한 조류 백신 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 뉴캣슬병 바이러스 벡터와 조류 인플루엔자 바이러스(AIV) 아형 H5N6의 HA 및 NA 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 키메라 바이러스, 및 상기 키메라 바이러스를 이용한 조류 바이러스 질환에 의한 백신 조성물 및 조류의 면역화 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 조류 백신에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 이종성 항원을 포함하는 변이 뉴캣슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) 및 상기 바이러스를 포함하는 조류 백신에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 내열성 및 증식성이 우수하고, 모체이행항체 및 능동면역을 극복 가능한 뉴캣슬병 바이러스 벡터를 이용한 기술에 관한 것이다. .
조류 인플루엔자(AI; avian influenza)는 약한 호흡기 증세에서 높은 사망률을 갖는 치명적인 가금류의 질병이다. 원인 물질은 오르토믹소비리다에(orthomixoviridae) 과에 속하는 조류 인플루엔자 A 바이러스(AIV: avian influenza A virus)이다. AIV는 10개의 단백질을 코딩하며 (-) 극성을 갖는 8개의 게놈 RNA 분획을 함유한다. 표면 당단백질인 헤마글루티닌(HA: Hemagglutinin)과 뉴라미니다제(N: Neuraminidase)의 항원성에 근거하여, AI 바이러스의 서브타입이 분류된다.
조류인플루엔자 (avian influenza, AI) 바이러스는 바이러스의 외피에는 헤마글루티닌 (hemagglutinin, HA)과 뉴라미니다아제 (neuraminidase, NA)라는 두 가지 종류의 항원 단백질이 존재하며, HA는 16종이, NA는 9종이 존재하므로, 이론상으로 이러한 두 가지 단백질의 조합에 따라서 총 144 종류의 AI 바이러스가 존재하게 된다.
최근 몇 년 동안의 여러 연구가 조류 질환에 대한 백신 벡터로서 사용되는 뉴캣슬병 바이러스 (Newcastle Disease Virus: NDV) 의 잠재력을 강조하고 있다. 뉴캣슬병 바이러스 (Newcastle Disease Virus: NDV) 벡터이다. 또한 조류 파라믹소바이러스 1 (APMV1, 파라믹소비리다에 (Paramyxoviridae) 과, 파라믹소비리나에 (Paramyxovirinae) 아과, 아불라바이러스 (Avulavirus) 속) 로도 지정되는 NDV는 병원체의 자연 발생적 균주가 광범위한 질환 심각성을 나타내는 조류 병원체이다.
NDV 는 파라믹소비리다에 (Paramyxoviridae) 과 아불라바이러스 (Avulavirus) 속에 속한다. NDV 는 호흡 및 위장관에서, 난관에서, 그리고 일부 단리물의 경우에는, 신경계에서 복제된다. 전염은 흡입성이고 구강 및 배설물 경로에 의해 이루어진다. NDV 는 모든 종의 새에 영향을 주는 고도로 전염성이고 치명적인 질환을 야기하며, 일부 포유류 종을 감염시킬 수 있다. 질환은 바이러스 균주 및 숙주 종에 따라, 임상적으로 명백하지 않은 형태에서 매우 악성인 형태까지 다양할 수 있다.
NDV 균주에 의해 보여지는 독성의 연속적인 스펙트럼은 이들을 3 가지 상이한 병원형인 약독형(lentogenic), 중간독형(mesogenic), 및 강독형(velogenic)으로 그룹을 나눌 수 있다. NDV의 유전형은 F 유전자의 부분 폴리뉴클레오티드 서열에 기초한 계통 분석에 의하여 I형부터 IX형까지로 분류된다. 약독형 균주는 통상적으로는 성체 닭에서 질환을 야기하지 않으며, 미국 및 다른 국가의 양계업에서 생 백신으로서 널리 사용된다. 중간 독성의 바이러스는 중간독형으로 불리는 반면, 높은 폐사율을 야기하는 바이러스는 강독형으로 불린다. 질환은 전세계적인 분포를 가지며 소비적 가금류 생산에 끊임없는 큰 위협을 주고 있다.
NDV 게놈은 대략 15 kb 의 RNA 의 비-분절 (-) 가닥이다. 게놈성 RNA 는 하기 단백질을 다음과 같은 순서로 코딩하는 6 개의 유전자를 함유한다: 뉴클레오캡시드 단백질 (NP), 인단백질 (P), 매트릭스 단백질 (M), 융합 단백질 (F), 적혈구응집소-뉴라미니다아제 (HN) 및 대형 폴리머라아제 단백질 (L). 알려지지 않은 기능의 2 개의 부가적인 단백질인 V 및 W 는 P 유전자 전사 동안의 RNA 편집에 의해 생산된다.
NDV를 벡터로 다양한 항원을 발현하는 수많은 연구들이 있었으나 이들 대부분은 NDV 의 약독형 백신 균주 (LaSota) 를 backbone로 개발된 벡터이다. 그러나 Lasota를 backbone으로 한 벡터는 NDV에 대한 면역항체가 존재하지 않는 SPF 동물에서는 효과가 확인되었으나, NDV에 대한 면역항체가 있는 상용계에서는 효과가 없다고 알려져 있다(David E. Swayne, 2018, Vaccine 36, p6361~6372). 최근 이러한 문제를 극복하고자 표면단백질인 F와 HN을 2형 Paramyxovirus로 치환한 키메라가 만들어 졌으나 면역 전달 능력은 뛰어나지 않다(Siba K. Samal, 2017, Vaccine 35, p4133~4139).
최근 사용되는 생백신들은 몇 가지 문제점을 가지고 있다. 상기 백신은 여전히 약간의 병원성을 가지고 있어 경우에 따라 백신 부작용이 나타날 수 있다. 게다가, 모계로부터 물려받은 항체들이 생백신 바이러스를 중화하여 성공적인 면역 형성이 방해 될 수 있다. 그러므로 1차 백신 접종은 극히 순한 바이러스를 사용하는 것이 중요하며, 모체 이행 항체의 극복이 가능한 백신이 요구된다. 또한, 불활화된 백신은 바이러스를 죽이기 위해 포르말린 또는 베타프로피오락톤으로 처리되고 적절한 보조제와 혼합된 감염성 요막강액으로부터 보통 생산된다. 불활화된 백신들은 근육 또는 피하 주사로 투여된다. 그러나 불활화된 백신들은 생산하고 적용하는데 비용이 비싼 단점이 있다.
본 발명의 일 예는, 이종 항원 또는 이종 펩티드를 발현하는 재조합형 뉴캣슬병 바이러스에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는 내열성 및 증식성이 우수하며, 모체이행항체 및 능동면역을 극복 가능한, 변이 F 유전자를 포함하는 약독화 뉴캣슬병 바이러스를 이용하여, 조류 인플루엔자 표면 항원을 발현하며, 모체이행항체 및 능동면역을 극복 가능한 생백신 개발 가능한 키메라 바이러스를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 일 예는 상기 키메라 바이러스를 포함하는 조류 질환용 면역화용 조성물 및 조류 면역화 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 예는 내열성 및 증식성이 우수하며, 모체이행항체 및 능동면역을 극복 가능한, 변이 F 유전자를 포함하는 약독화 뉴캣슬병 바이러스를 이용하여, 조류 인플루엔자 표면 항원을 발현하며, 모체이행항체 및 능동면역을 극복 가능한 생백신 개발 가능한 키메라 바이러스, 상기 키메라 바이러스를 포함하는 조류 질환용 면역화용 조성물 및 조류 면역화 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 본 발명의 키메라 바이러스는 하나 이상의 이종 항원 또는 이종 펩타이드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 더욱 포함하는 재조합 NDV이다. 더욱 자세하게는, 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 및/또는 NA 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 NDV 벡터에 도입된 키메라 뉴캣슬병 바이러스를 제공한다.
일 실시예에서 NDV 벡터에 삽입되는 뉴클레오티드 서열은, 병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 및/또는 NA 단백질일 수 있으며, 이들 단백질의 오픈 리딩 프레임 및/또는 분절일 수 있다. 구체적인 일 예에서, 조류 인플루엔자 바이러스는 아형 H5N1, H5N6 또는 H9N2일 수 있으며, 바람직하게는 H5N6일 수 있다.
외래 유전자는 다양한 위치에서 NDV 게놈으로 도입될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 재조합 NDV 벡터에서 (적절한 전사 유닛의 일부로서) 외래 유전자는 다음의 NDV 유전자 사이에 삽입될 수 있다: NP-P, P-M, M-F, F-HN, HN-L 및 3'UTR-NP, L-5'UTR. 구체적으로, 본 발명에 따른 재조합 NDV 키메라 바이러스는, NDV 바이러스의 NDV 게놈의 P와 M 사이 및 M과 F 사이에 위치에 외래 유전자가 삽입될 수 있다. 상기 외래 유전자는, NP 와 P의 유전자 사이, P와 M의 유전자 사이, M과 F의 유전자 사이, F와 HN의 유전자 사이, HN과 L의 유전자 사이, 3'UTR과 NP의 유전자 사이, 및 L과 5'UTR의 유전자 사이으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 영역내로 도입될 수 있다.
더욱 자세하게는 상기 뉴캣슬병 바이러스 게놈의 3'에서 5'방향으로 순차적으로 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 유전자를 포함하는 것이며, 상기 HA 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 뉴캣슬병 바이러스의 P 유전자와 M 유전자 사이에 위치하고, 상기 NA 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 뉴캣슬병 바이러스의 M 유전자와 F 유전자 사이에 위치하는 것일 수 있다.
본 발명에 사용 가능한 뉴캣슬병 바이러스는 뉴캣슬병 바이러스 게놈의 3'에서 5'방향으로 순차적으로 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 유전자를 포함하는 것일 수 있으며, 또한 상기 NP 단백질의 암호화 유전자의 3'-말단에 연결된 T7 promoter, 리더 서열 및 3' UTR 서열과, 상기 L 단백질의 암호화 유전자의 5'-말단에 5'UTR, 트레일러 서열 및 T7 terminator 서열을 추가로 포함하는 것일 수 있다. 구체적 일예에서, 상기 뉴캣슬병 바이러스 게놈의 일 예는 도 1c (BP-NDV-C7d 주를 backbone으로 한 재조합 NDV 게놈 전사벡터)에 나타낸다.
조류 인플루엔자 바이러스 H5N6 유래 이종 펩티드인 경우에, 상기 HA 펩티드는 서열번호 79의 아미노산 서열과 서열 동일성이 99.5% 이상, 99.7%이상 또는 99.8% 이상인 아미노산 서열일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 79의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드일 수 있다. 상기 NA 펩티드는 서열번호 81의 아미노산 서열과 서열 동일성이 99.5% 이상, 99.7%이상 또는 99.8& 이상인 아미노산 서열일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 81의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 HA 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 서열번호 80의 폴리뉴클레오티드 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 NA 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 서열번호 82의 폴리뉴클레오티드 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 AIV-HA 및 AIV-NA 단백질, 예컨대 서열번호 79 및 서열번호 81의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 외래 유전자가, 상기 뉴캣슬병 바이러스의 P 유전자와 M 유전자 사이와, M 유전자와 F 유전자 사이에 위치하는 것일 수 있다. 구체적 일예에서, 상기 HA 및 NA 단백질의 유전자가 뉴캣슬병 바이러스 게놈에 삽입된 일 예를 도6a-도 6h와 서열번호 83에 나타낸다.
본 발명의 일 예에 따라 상기 NDV벡터에 H5N6의 HA 및 NA 유전자가 도입된 키메라 바이러스는 BP-NDV-C7d-AIV-H5N6라고 명명하고 KCTC 생물자원센터에 기탁하여 2018년 7월 10일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC13576BP를 수여받았다.
상기 서열번호 3, 83 및 100에 나타낸 바이러스 게놈 서열은 바이러스 단백질의 CDS, 리더, 트레일러, 3'-UTR 및 5'-UTR 을 포함하는 게놈서열이다.
조류 인플루엔자 바이러스 H9N2 유래 이종 펩티드인 경우에, 상기 HA 펩티드는 서열번호 96의 아미노산 서열과 서열 동일성이 99.5% 이상, 99.7%이상 또는 99.8% 이상인 아미노산 서열일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 96의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드일 수 있다. 상기 NA 펩티드는 서열번호 98의 아미노산 서열과 서열 동일성이 99.5% 이상, 99.7%이상 또는 99.8& 이상인 아미노산 서열일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 98의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 HA 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 서열번호 97의 폴리뉴클레오티드 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 NA 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 서열번호 99의 폴리뉴클레오티드 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 구체적 일 예에서, 상기 HA 및 NA 단백질의 유전자가 뉴캣슬병 바이러스 게놈에 삽입된 일 예를 도 14a 내지 도 14h 및 서열번호 100에 나타낸다.
본 발명의 일 예에 따라 상기 NDV벡터에 H9N2의 HA 및 NA 유전자가 도입된 키메라 바이러스는 BP-NDV-C7d-AIV-H9N2-HANA라고 명명하고 KCTC 생물자원센터에 2019년 8월 20일에 수탁하여 기탁번호 KCTC13924BP를 수여받았다.
이하에서 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 예는 상기 변이 뉴캣슬병 바이러스 또는 약독화 뉴캣슬병 바이러스를 외래 항원을 발현시키기 위한 바이러스 벡터로 사용하여, NDV와 상이한 조류 바이러스의 외래 항원을 제공하는 유전자를 포함하는 키메라 바이러스, 및 이를 이용한 조류 백신 또는 변역화용 조성물, 면역화 방법 또는 면역화 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 뉴캣슬병 바이러스는 NP, P, M, F, HN, 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하며, 상기 F 유전자는 변이 절단부위를 포함하는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 약독화 뉴캣슬병 바이러스이다. 상기 변이 F 단백질은 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 것일 수 있다. 상기 F 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 서열 동일성이 99.5% 이상, 99.7%이상 또는 99.8% 이상인 아미노산 서열일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드일 수 있다. 상기 F 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 서열번호 97의 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 NA 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 99.3% 이상, 99.5% 이상 또는 99.7% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다.
상기 뉴캣슬병 바이러스는 F 유전자의 부분 폴리뉴클레오티드 서열에 기초한 계통 분석에 의하여 VII형을 갖는 강병원성 뉴캣슬병 바이러스에서 유래된 F 유전자의 절단부위(cleavage site)의 변이로 바이러스의 대상 세포 내에서 절단되지 않아 약독화된 것이다.
뉴캣슬병 바이러스는 엔벨롭(envelope)을 가지고 있으며 엔벨롭에는 바이러스가 숙주 세포에 결합할 수 있도록 해주는 HN(Haemagglutinin-Neuraminidase) 단백질과, 엔벨롭과 숙주 세포의 융합을 일으키는 F(Fusion) 단백질이 있다. F 단백질과 HN 단백질은 글리코단백질(glycoprotein)로서 엔벨롭의 표면에 분포되어 있다.
F 단백질은 I형 멤브레인 글리코단백질(type I membrane glycoprotein)로서 삼합체(trimeric) 구조를 형성한다. F 단백질은 비활성 전구체 형태(F0)로 만들어지고 골지 막(Golgi membranes)을 통해 이동하는 동안 활성 형태인 F1과 F2로 잘리게 된다. 이러한 과정은 F1 소단위체(subunit)의 아미노 말단에서 소수성 도메인(domain)을 노출시키고 이것은 성숙한 단백질의 생물학적 활성에 중요한 역할을 한다.
본 발명에 따른 BP-NDV-C7d NDV 바이러스는 아시아를 비롯한 전세계에서 유행하고 있는 Genotype VII NDV의 유전형을 갖고 있으나 F 단백질의 cleavage site는 약병원성의 특성을 갖도록 제조된 재조합 바이러스이다. 즉, 강병원성 뉴캣슬 바이러스의 폴리뉴클레오티드 서열을 근간으로 하되 F 단백질의 cleavage site 아미노산 서열은 세포내 효소에 의해 분절이 되지 않도록 변이서열 112-GRQARL-117이 되도록 제조한 바이러스이다. 그러므로 NDV 바이러스가 바이러스 벡터로 사용될 때, 도입된 외래 유전자의 발현항원뿐 아니라 NDV에 대한 방어 효능도 뛰어난 이가 백신을 제조할 수 있으며, 또한 병원성 복귀의 가능성 또한 거의 없는 매우 안전한 바이러스이다.
구체적으로 F 유전자의 cleavage site서열은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 112번 내지 117번 아미노산으로 구성된 펩타이드 부분이, 야생형 112-RRQKRF-117를 적어도 비병원성 아미노산 codon을 가지며, cleavage site 서열 중 특히 115번 아미노산은 야생형 K에서 변이형 A로 치환되며, 상기 115번 아미노산은 A로 치환되며, 이를 암호화하는 코돈은 GCU, GCC, GCA 또는 GCG일 수 있다. 바람직하게는 F 유전자의 절단부위인 112번 내지 117번 부분 112-GRQARL-117의 비병원성 아미노산 코돈을 갖도록 변이된다. 상기 변이 절단 부위는 최소 2번 이상의 점 돌연변이를 거쳐야 염기성 아미노산을 코딩하는 코돈으로 변하여 병원성을 나타낼 수 있어, 병원성 복귀의 가능성 또한 거의 없는 매우 안전한 바이러스이다.
본 발명에 따른 NDV 게놈에서 각각의 전사 유닛은 3'-NP-P-M-F-HN-L-5' 을 포함한다. 상기 NDV 게놈은 NP 단백질의 암호화 유전자의 3'-말단에 연결된 리더(leader) 서열 및 3' UTR 서열과, L 단백질의 암호화 유전자의 5'-말단에 5'UTR 및 트레일러 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 리더(leader)는 약 40 내지 50 뉴클레오티드 크기를 가지며 상기 트레일러(trailer)는 약 20 내지 60 뉴클레오티드 크기를 갖는 짧은 비-전사 영역을 갖는다. 리더 서열과 트레일러 서열은 게놈 RNA의 복제, 바이러스 캡시드화 및 포장을 제어하는 필수 서열이다. 본 발명의 일 예에 따른 NDV C7d의 게놈 구조는 도 1c에 나타낸다.
본 발명의 구체적인 일예에 따른 변이 뉴캣슬병 바이러스는 한국생명공학연구원의 유전자자원센터에 2018년 7월 23일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC13595BP를 받은 바이러스일 수 있다. 상기 BP-NDV-C7d 바이러스 게놈의 전체 폴리뉴클레오티드 서열을 도 3a 내지 도 3f와 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열에 나타내며, 이는 바이러스 단백질의 CDS, 리더, 트레일러, 3'-UTR 및 5'-UTR 을 포함하는 게놈서열이다.
본 발명에 따른 NDV는, 국내 및 아시아지역에서 유행하는 강병원성 뉴캣슬병 바이러스와 항원성이 유사하지만, 병원성은 현재 사용되고 있는 백신주들과 유사하거나 현저하게 낮고, 내열성이 매우 높으므로, 높은 면역원성을 유도할 수 있는 이점이 있다. NDV 는 그 자체가 필요한 조류 백신으로도 사용할 수 있어, 이종 항원의 발현을 위한 조류 백신의 제조를 위한 벡터로서 특히 유리하다. 본 발명에 따른 NDV는 열안정성(내열성) 및 생산성(증식성)을 가지며, 또한 NDV에 대한 모체이행항체나 능동면역항체를 가지고 있는 상용계에서 이들 항체를 극복하고 면역을 유도할 수 있는 능력을 가지고 있어, NDV 벡터로 사용하기에 매우 우수한 특징을 가지고 있다.
본 발명의 바람직한 뉴캣슬병 바이러스는 계태아에서 고역가로 증식할 수 있는 NDV 또는 NDV 벡터일 수 있다. 상기 계태아에서 측정한 바이러스의 역가가 109 EID50/ml 이상 또는 1010 EID50/ml 이상, 예를 들면 109 내지 1011 EID50/ml 범위로 증식할 수 있다. 상기 바이러스의 역가 측정은, 9-10일령 SPF 발육란의 장뇨막강 내에 인산완충액으로 10-1 내지 10-10 배 희석한 바이러스를 접종하여 바이러스 역가를 측정하였다. 접종 후 24시간 이내에 폐사한 것은 제외하고 24시간 이후에 폐사한 것은 뉴캣슬병 바이러스에 의한 폐사임을 확인하고 5일 후에 생존한 것에 대하여는 장뇨막강액의 닭 적혈구 응집성을 조사하였다. 닭 적혈구를 응집하는 것을 양성으로 인정하여 접종된 발육란의 50%에서 바이러스 성장을 일으키는 최대 희석배수의 역수로 EID50을 산출한다.
본 발명에 따른 키메라 뉴캣슬병 바이러스는 현저히 개선된 내열성을 갖는 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 NDV 벡터는 기존 KBNP-C4152이 50 내지 60 ℃의 온도에서 열처리 후 20분 내에 면역원성을 완전히 상실하는데 반해, 50 내지 60 ℃ 의 온도에서 열처리 후 25분 이상, 30분 이상, 40분 이상, 50분 이상, 또는 60분 이상까지, 예를 들면 30분 내지 60분 또는 30분 내지 50분 면역원성을 유도할 수 있으며, 즉 혈구응집능 및 감염능을 가질 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 NDV 바이러스와 달리, 국내 사용되고 있는 LaSota 오일백신은 국내 유행하고 있는 유전형 7형의 강병원성 NDV 감염으로 인한 난포와 수란관 손상으로 인한 산란율 및 난질 저하 피해를 막지 못한다. 또한, Lasota백신 및 이를 backbone으로 한 바이러스 항원이 56 ℃ 온도에서 열처리에 의해 곧바로 혈구응집능이 소실된다.
본 발명에 따른 NDV(C7d)를 벡터로 하여 국내외에서 유행하는 HPAI clade 2.3.4.4 H5N6의 HA와 NA유전자를 발현한 경우, 높은 역가(7.3log2)의 NDV 특이 모체이행항체를 갖는 1일령 병아리뿐만 아니라 능동면역항체가 있는 중병아리에서도 높은 능동면역이 이루어짐을 확인하여 탁월한 벡터임이 확인하였다. Lasota를 backbone으로한 벡터는 NDV에 대한 면역항체가 존재하지 않는 SPF 동물에서는 효과가 확인되었으나, NDV에 대한 면역항체가 있는 상용계에서는 효과가 없다고 알려져 있다(David E. Swayne, 2018, Vaccine 36, p6361~6372). 따라서, 기존 Lasota 백본으로 하는 벡터와 달리, 본 발명에 따른 NDV(C7d)를 벡터는 NDV에 대한 모체이행항체나 능동면역항체를 가지고 있는 상용계에서 이들 항체를 극복하고 면역을 유도할 수 있는 능력을 가지고 있어, NDV 벡터로 사용하기에 매우 우수한 특징을 가지고 있다.
뉴캣슬병 바이러스는 선형, 단일-가닥, 비분절의 네가티브 센스 RNA 게놈을 포함하는 외피형 바이러스이다. 게놈 RNA는 3'-NP-P-M-F-HN-L-5' 유전자들을 포함한다. 게놈 RNA는 NP 단백질의 암호화 유전자의 3'-말단에 연결된 리더(leader) 서열 및 3' UTR 서열과, 상기 L 단백질의 암호화 유전자의 5'-말단에 5'UTR 및 트레일러 서열을 추가로 포함한다. 상기 리더(leader)는 약 40 내지 50 뉴클레오티드 크기를 가지며 상기 트레일러(trailer)는 약 20 내지 60 뉴클레오티드 크기를 갖는 짧은 비-전사 영역을 갖는다. 리더 서열과 트레일러 서열은 게놈 RNA의 복제, 바이러스 캡시드화 및 포장을 제어하는 필수 서열이다.
재조합 DNA 기술 및 "역 유전학(reverse genetics)" 조작 기술은 면역원성 제제에 사용하기 위한 재조합 바이러스를 생산하는 독특한 방법을 제공한다. 역 유전자학 기술과 NDV의 구제로 인해 RNA 게놈을 cDNA 카피를 통해 조작하는 것이 가능해졌다.
바이러스 RNA를 합성하는데 필요한 최소한의 복제 개시 복합체는 RNP 복합체이다. 증식성 NDV는 (안티)게놈 RNA의 세포내 공동 발현과 (T7) RNA 폴리머라제 구동된 플라스미드에서 나온 적절한 지지 단백질에 의해 제조된다. NDV (안티)게놈과 지지 단백질을 전사 및 공동-발현하고 재조합 NDV 벡터의 생산을 허용하기에 충분한 조건 하에서, 전장 게놈 또는 바람직하게는 NDV 바이러스의 안티게놈(+ 센스)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 cDNA 분자를 포함하는 벡터, 및 필요한 지지 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 cDNA 분자를 포함하는 하나 이상의 벡터를 적절한 세포로 함께 형질감염시킨다. 이 방법에서, 전장 NDV 바이러스 (안티)게놈을 코딩하는 상기 핵산 분자는 상기 정의된 바와 같은 추가의 전사 유닛을 포함한다. 벡터를 이용한다는 것은, 그 벡터로 형질감염된 세포에서 부착된 DNA 분획이 복사되고, 전사 및/또는 발현될 수 있도록 다른 DNA 분획이 부착될 수 있는 레플리콘(replicon), 예를 들면 플라스미드, 파지 또는 코스미드를 이용함을 의미한다.
적절한 지지 단백질을 세포내 발현시키기 위해, 적절한 발현 제어 서열, 프로모터, 예를 들면 T7 폴리머라제 프로모터의 제어 하에서 이들 단백질을 코딩하는 cDNA 서열을 포함하는 플라스미드를 이용하는 것이 바람직하다. 구체적으로, NDV 바이러스의 전장 게놈의 전사를 위한 벡터는 NDV의 안티게놈의 전사(transcription) 개시부 바로 앞에 T7 프로모터가 있고(3'-> 5'방향으로 전사 프로모터-Leader-3'UTR), NDV 안티게놈 RNA 직후에는 간염 델타 바이러스(Hepatitis delta virus, HDV) 리보자임 RNA를 위치시켜 자가 절단 (self cleavage)가 일어날 수 있도록 하여(3'-> 5'방향으로 5'UTR-trailer-ribozyme RNA-전사 터미네이터), 바이러스 게놈의 5'과 3' 말단에 불필요한 염기의 첨가 없이 바이러스 게놈과 동일한 구조로 전사될 수 있는 벡터이다.
본 명세서에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 변이 NDV 및 외래 유전자를 포함하는 키메라 NDV)를 증식시키는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)는 NDV에 감염되기 쉬운 임의의 세포 (예, 조류 세포, 닭 세포 등), 조직, 장기, 부화란(예를 들면, 계란 또는 메추라기 알) 또는 동물(예를 들면, 조류)에서 증식될 수 있다. 한 실시양태에서, 본원은 본원에 기재된 NDV(예를 들면, 본원에 기재된 키메라 NDV)로 감염된 부화란을 제공한다.
본 발명의 추가 일 예는 상기 변이 뉴캣슬병 바이러스 또는 약독화 뉴캣슬병 바이러스를 외래 항원을 발현시키기 위한 바이러스 벡터로 사용하여, NDV와 상이한 조류 바이러스의 외래 항원을 제공하는 유전자를 포함하는 키메라 바이러스, 및 이를 이용한 조류 백신 또는 변역화용 조성물, 면역화 방법 또는 면역화 키트에 관한 것이다. 본 발명의 일 예에서, 벡터는 병원균에 대한 백신을 개발할 목적으로 병원균으로부터 유래된 외래 항원을 발현시키기 위한 바이러스 벡터이다. 키메라 바이러스는 특히 두 가지 이상의 바이러스에 대항하여 보호하는 재조합 백신의 제조에 사용될 수 있다. 본 발명의 키메라 바이러스는 하나 이상의 이종의 폴리뉴클레오티드 서열이 NDV 벡터에 도입된, 바이러스 게놈으로부터 유래하는 바이러스 벡터에 의해 코딩된다. 일 예에서, 본 발명은 본 발명의 바이러스를 포함하는 2가 백신에 관한 것이다.
본 발명에 따른 키메라 바이러스는 이종성 뉴클레오티드 서열이 게놈에 부가되거나 뉴클레오티드 서열이 이종성 뉴클레오티드 서열로 대체된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 일 실시예에서 본 발명의 NDV 벡터는 뉴캣슬병 바이러스에 대한 백신 기능뿐만 아니라, 추가적으로 이종 항원 유전자 산물인 유전자 산물을 코딩하는 하나 이상의 이종성 서열을 발현하기 위하여 고안되었다.
본 발명에 따른 NDV는 상기 ND 바이러스의 설명이 동일하게 적용될 수 있다. 본 발명에 따른 NDV는 열안정성(내열성) 및 생산성(증식성)을 가지며, 또한 NDV에 대한 모체이행항체나 능동면역항체를 가지고 있는 상용계에서 이들 항체를 극복하고 면역을 유도할 수 있는 능력을 가지고 있어, NDV 벡터로 사용하기에 매우 우수한 특징을 가지고 있다. 본 발명의 특히 바람직한 양태에서는 NDV가 인간과 동물 둘 모두에서, 특히 가금류에서 복제할 수 있기 때문에, 본 발명에 따른 재조합 NDV 벡터는 병원균, 특히 호흡기 병원균의 항체, 또는 인간이나 임의의 이들 동물에게서 적절한 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 면역-조절자를 코딩하는 외래 유전자를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 재조합 NDV 벡터는 유리하게는 가금류, 특히 닭에서 다른 병원균에 대한 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 일 실시예에서, 상기 이종성 서열은 이종성 유전자 산물의 면역원 및 항원 절편을 코딩한다. 본 발명은 조류에서 면역원성 반응을 유발하는 단백질, 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원은 조류와 같은 동물에서 반응을 도출, 유도하거나 자극하는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 또는 이의 절편과 같은, 그러나 이에 제한되지 않는 독감 단백질, 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "면역원성 조성물"은 조류 인플루엔자 바이러스로부터 발현되는 관심의 항원 또는 면역원에 대해 면역 반응을 유발시키는 임의의 조성물을 의미하는 것으로, 예를 들면, 대상에 투여될 후 관심의 표적 면역원 또는 항원에 대해 면역 반응을 유발시킬 수 있는 조성물을 포함한다. 용어 "백신"은 관심의 항원에 대하여 방어 면역 반응을 유도하거나 또는 그 항원에 대해 효과적으로 방어하는 조성물을 의미하는 것으로, 예를 들면, 대상에 투여하거나 주사된 후 표적 항원 또는 면역원에 대해 방어 면역 반응을 유발시키거나 또는 조류 인플루엔자 바이러스, 바람직하게는 본원 발명에 따른 조류 인플루엔자 바이러스의 항원 또는 면역원에 대해 효과적인 방어를 제공하는 임의의 조성물을 포함한다.
재조합 NDV 벡터는 바람직하게는 조류 병원균, 특히 인플루엔자 바이러스, 머레크병 바이러스(MDV; marek's disease virus), 전염성 후두기관염 바이러스(ILTV: infectious laryngotracheitis virus), 전염성 기관지염 바이러스(IBV: infectious bronchitis virus), 전염성 F 낭 병 바이러스(IBDV: infectious bursal disease virus); 닭의 빈혈 바이러스(CAV: chicken anemia virus), 레오바이러스, 조류 레트로 바이러스, 가금류 아데노바이러스, 칠면조 코기관염 바이러스(TRTV: turkey rhinotracheitis virus) 의 보호성 항체를 코딩하는 외래 유전자를 포함한다. 바람직하게는 재조합 NDV 벡터는 AIV, MDV, ILTV, IBV 또는 TRTV에서 유래된 표면 항원 단백질을 코딩하는 외래 유전자를 포함한다.
본 명세서에서 조류는, 예를 들어, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩, 앵무새, 핀치, 매, 까마귀, 타조, 에뮤 및 화식조로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 조류는 배아 및 태아 단계를 비롯한, 모든 발달 단계의 개개의 조류가 포함된다.
외래 유전자는 다양한 위치에서 NDV 게놈으로 도입될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 재조합 NDV 벡터에서 (적절한 전사 유닛의 일부로서) 외래 유전자는 다음의 NDV 유전자 사이에 삽입될 수 있다: NP-P, P-M, M-F, F-HN, HN-L 및 3'UTR-NP, L-5'UTR. 구체적으로, 본 발명에 따른 재조합 NDV 키메라 바이러스는, NDV 바이러스의 NDV 게놈의 P와 M 사이 및 M과 F 사이에 위치에 외래 유전자가 삽입될 수 있다.
더욱 자세하게는 상기 뉴캣슬병 바이러스 게놈의 3'에서 5'방향으로 순차적으로 NP, P, M, F, HN 및 L 단백질을 유전자를 포함하는 것이며, 상기 HA 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 뉴캣슬병 바이러스의 P 유전자와 M 유전자 사이에 위치하고, 상기 NA 단백질을 암호화하는 유전자는 상기 뉴캣슬병 바이러스의 M 유전자와 F 유전자 사이에 위치하는 것일 수 있다. 구체적 일예에서, 상기 HA 및 NA 단백질의 유전자가 뉴캣슬병 바이러스 게놈에 삽입된 일 예를 도6a-도 6h 및 도 14a 내지 도 14h에 나타낸다.
본 발명은 역유전학을 이용하여 계태아에서 고역가로 증식할 수 있는 뉴캣슬병 바이러스(NDV)를 벡터로 활용하여, 조류 인플루엔자 바이러스에서 유래된 적혈구응집소 단백질, 즉, HA 및 NA를 발현하는 재조합 키메라 바이러스를 제공한다. 외래 유전자는 유리하게는 NP 유전자 앞에, NP-P, P-M, M-F, F-HN, HN-L 사이에, 그리고 L 유전자 뒤에 삽입될 수 있다.
일 구현예에서, 조류 독감 면역학적 조성물 또는 백신은 유전자 조작된 벡터 및 약학적 또는 수의학적 허용가능 부형제, 담체 또는 비히클을 포함한다. 유전자조작된 벡터는 조류 인플루엔자 유래 단백질, 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 조류 인플루엔자 유래 단백질, 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원은, 적혈구응집소, 매트릭스 단백질, 뉴라미니다아제, 비구조적 단백질, 핵단백질, 폴리머라아제, 또는 이들의 임의의 절편일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 독감 단백질, 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원은 조류 인플루엔자 균주로 감염된 조류로부터 유래될 수 있다.
특히, NDV 벡터는 조류 인플루엔자 바이러스(AIV), 바람직하게는 고병원성 AIV의 바이러스의 HA 및/또는 NA 단백질을 암호화하는 유전자를 이종 항원 또는 이종 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드로 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 및/또는 NA 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 NDV 벡터에 도입된 키메라 뉴캣슬병 바이러스를 제공한다. 관련된 HA 유전자는 진뱅크(GenBank) 또는 NCBI 데이타베이스와 같은 폴리뉴클레오티드 서열 데이타베이스로부터 검색될 수 있다.
따라서, 본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 및/또는 NA 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 NDV 벡터에 도입된 키메라 뉴캣슬병 바이러스를 제공한다.
구체적으로, 본 발명에 따른 NDV 벡터를 이용한 조류 인플루엔자 바이러스(AIV) 백신의 장점은, 체액성, 세포성 및 점막성 반응을 비롯한 광대한 면역력을 유도할 수 있고, AIV의 HA와 NA유전자 외 AIV의 나머지 단백질에 대한 유전자를 전혀 가지고 있지 않으므로 백신접종된 동물로부터 감염된 분화체 (Differentiate Infected from Vaccinated Animals, DIVA) 전략과 양립될 수 있으며, 면역력의 빠른 개시를 유도하며, NDV와 AI에 모두 효과가 있는 2가 백신(bivalent vaccine)이며, 돌발 방출의 경우 비활성화된 백신보다 생산이 환경에 대해 위험이 적다는 것이다.
본 발명에 따른 조류 인플루엔자 바이러스의 비제한적인 예에는 아형 H10N4, 아형 H10N5, 아형 H10N7, 아형 H10N8, 아형 H10N9, 아형 Hl1Nl, 아형 Hl1N13, 아형 Hl1N2, 아형 Hl1N4, 아형 Hl1N6, 아형 Hl1N8, 아형 Hl1N9, 아형 H12N1, 아형 H12N4, 아형 H12N5, 아형 H12N8, 아형 H13N2, 아형 H13N3, 아형 H13N6, 아형 H13N7, 아형 H14N5, 아형 H14N6, 아형 H15N8, 아형 H15N9, 아형 H16N3, 아형 HlNl, 아형 H1N2, 아형 H1N3, 아형 H1N6, 아형 H1N9, 아형 H2N1, 아형 H2N2, 아형 H2N3, 아형 H2N5, 아형 H2N7, 아형 H2N8, 아형 H2N9, 아형 H3N1, 아형 H3N2, 아형 H3N3, 아형 H3N4, 아형 H3N5, 아형 H3N6, 아형 H3N8, 아형 H3N9, 아형 H4N1, 아형 H4N2, 아형 H4N3, 아형 H4N4, 아형 H4N5, 아형 H4N6, 아형 H4N8, 아형 H4N9, 아형 H5N1, 아형 H5N2, 아형 H5N3, 아형 H5N4, 아형 H5N6, 아형 H5N7, 아형 H5N8, 아형 H5N9, 아형 H6N1, 아형 H6N2, 아형 H6N3, 아형 H6N4, 아형 H6N5, 아형 H6N6, 아형 H6N7, 아형 H6N8, 아형 H6N9, 아형 H7N1, 아형 H7N2, 아형 H7N3, 아형 H7N4, 아형 H7N5, 아형 H7N7, 아형 H7N8, 아형 H7N9, 아형 H8N4, 아형 H8N5, 아형 H9N1, 아형 H9N2, 아형 H9N3, 아형 H9N5, 아형 H9N6, 아형 H9N7, 아형 H9N8, 또는 아형 H9N9일 수 있다. 조류 독감 단백질, 항원, 에피토프 또는 면역원은 적혈구응집소 (HA), 예컨대 HA 전구체, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, 또는 H16 단백질, 뉴라미니다아제, 예컨대 NA1, NA2, NA3, NA4, NA5, NA6, NA7, NA8, 또는 NA9이며, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게, 조류 인플루엔자 HA 항원은 H5 서브유형 HA 또는 H9 서브유형 HA일 수 있다.
일 실시예에서 NDV 벡터에 삽입되는 뉴클레오티드 서열은, 병원성 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 및/또는 NA 단백질일 수 있으며, 이들 단백질의 오픈 리딩 프레임 및/또는 분절일 수 있다. 구체적인 일 예에서, 조류 인플루엔자 바이러스는 아형 H5N1, H5N6 또는 H9N2일 수 있다.
조류 인플루엔자 바이러스 H5N6 유래 이종 펩티드인 경우에, 상기 HA 펩티드는 서열번호 79의 아미노산 서열과 서열 동일성이 99.5% 이상, 99.7%이상 또는 99.8% 이상인 아미노산 서열일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 79의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드일 수 있다. 상기 NA 펩티드는 서열번호 81의 아미노산 서열과 서열 동일성이 99.5% 이상, 99.7%이상 또는 99.8& 이상인 아미노산 서열일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 81의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 HA 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 서열번호 80의 폴리뉴클레오티드 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 NA 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 서열번호 82의 폴리뉴클레오티드 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 AIV-HA 및 AIV-NA 단백질, 예컨대 서열번호 79 및 서열번호 81의 아미노산 서열로 이루어진 단백질을 암호화하는 외래 유전자가, 상기 뉴캣슬병 바이러스의 P 유전자와 M 유전자 사이와, M 유전자와 F 유전자 사이에 위치하는 것일 수 있다. 구체적 일 예에서, 상기 HA 및 NA 단백질의 유전자가 뉴캣슬병 바이러스 게놈에 삽입된 일 예를 도6a-도 6h와 서열번호 83에 나타낸다.
본 발명의 일 예에 따라 상기 NDV벡터에 H5N6의 HA 및 NA 유전자가 도입된 키메라 바이러스는 BP-NDV-C7d-AIV-H5N6라고 명명하고 KCTC 생물자원센터에 기탁하여 2018년 7월 10일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC13576BP를 수여받았다. 상기 바이러스는 계태아에서 고역가로 증식할 수 있는 NDV 또는 NDV 벡터일 수 있다. 상기 계태아에서 측정한 바이러스의 역가가 109 EID50/ml 이상 또는 1010 EID50/ml 이상, 예를 들면 109 내지 1011 EID50/ml 범위로 증식할 수 있다. 상기 바이러스의 역가 측정은, 9-10일령 SPF 발육란의 장뇨막강 내에 인산완충액으로 10-1 내지 10-10배 희석한 바이러스를 접종하여 바이러스 역가를 측정하였다.
상기 서열번호 3, 서열번호 83 및 서열번호 100에 나타낸 바이러스 게놈 서열은 바이러스 단백질의 CDS, 리더, 트레일러, 3'-UTR 및 5'-UTR 을 포함하는 게놈서열이다.
조류 인플루엔자 바이러스 H9N2 유래 이종 펩티드인 경우에, 상기 HA 펩티드는 서열번호 96의 아미노산 서열과 서열 동일성이 99.5% 이상, 99.7%이상 또는 99.8% 이상인 아미노산 서열일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 96의 아미노산 서열로 이루어지는 펩티드일 수 있다. 상기 NA 펩티드는 서열번호 98의 아미노산 서열과 서열 동일성이 99.5% 이상, 99.7%이상 또는 99.8& 이상인 아미노산 서열일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 98의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드일 수 있다. 상기 HA 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 서열번호 97의 폴리뉴클레오티드 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 상기 NA 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 서열번호 99의 폴리뉴클레오티드 서열과 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 일치성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 구체적 일 예에서, 상기 HA 및 NA 단백질의 유전자가 뉴캣슬병 바이러스 게놈에 삽입된 일 예를 도 14a 내지 도 14h 및 서열번호 100에 나타낸다.
본 발명의 일 예에 따라 상기 NDV벡터에 H9N2의 HA 및 NA 유전자가 도입된 키메라 바이러스는 BP-NDV-C7d-AIV-H9N2-HANA라고 명명하고 KCTC 생물자원센터에 2019년 8월 20일에 수탁하여 기탁번호 KCTC13924BP를 수여받았다. 상기 바이러스는 계태아에서 고역가로 증식할 수 있는 NDV 또는 NDV 벡터일 수 있다. 상기 계태아에서 측정한 바이러스의 역가가 109 EID50/ml 이상 또는 1010 EID50/ml 이상, 예를 들면 109 내지 1011 EID50/ml 범위로 증식할 수 있다. 상기 바이러스의 역가 측정은, 9-10일령 SPF 발육란의 장뇨막강 내에 인산완충액으로 10-1 내지 10-10배 희석한 바이러스를 접종하여 바이러스 역가를 측정하였다.
본 발명은 약독화 뉴캣슬병 바이러스 (NDV), 또는 조류 질환 바이러스에 유래된 이종 항원 또는 이종 펩티드를 발현하는 키메라 바이러스를 포함하는 조류 질환용 백신, 조류 면역원성 제제, 또는 조류 면역화용 조성물에 관한 것이다. 상기 백신, 제제 또는 조성물은, 적어도 하나의 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다.
상기 구현예에서, 상기 백신은 생독 백신, 사독 백신, 서브유니트 백신, 벡터 백신, 키메라 백신 및 DNA 백신을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 뉴캣슬병 백신은 불활화된 사독백신 형태, 생독백신 형태 및 in ovo 백신 형태로 이루어진 군 중에서 선택된 어느 한 형태로 사용되는 것을 특징으로 하는 뉴캣슬병 백신이다. 생 백신은 향상된 교차-반응성 세포-중재 세포독성은 물론 체액성 항체 반응을 유발함으로써 불활성화 백신에 비해 더 우수한 보호를 제공하는 것으로 여겨지고 있다. 스프레이 및 에어로졸에 의한 생백신의 대량 적용은 많은 수의 새가 짧은 시간내에 백신 접종될 수 있다는 용이성 때문에 또한 매우 인기가 좋다. 입자들이 발생되는 조들을 조절함에 의해 정확한 입자 크기를 달성하는 것이 중요하다.
본 발명은 NDV 감염에 감수성인 부화란(embryonated egg) 또는 세포주(cell line)에서 키메라 NDV 바이러스를 배양하는 것을 포함하는, 본 발명 키메라 조류 NDV의 증식 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 면역원성 제제의 제조 방법을 제공하는 바, 상기 방법은: (a) 조류 NDV 감염에 감수성인 부화란 또는 세포주에서 본 발명의 키메라 NDV를 증식시키는 것; 및 (b) 자손 바이러스를 수집하는 것을 포함하며, 여기서 바이러스는, 자손 바이러스가 면역원성 제제, 예컨대 백신 제제에 사용하기에 적합하도록, 바이러스에 오염이 없게 하기에 충분한 조건 하에서 충분한 양으로 생육된다.
본 명세서에서 조류는 특별히 한정되지 않으나, 예를 들면 닭, 오리, 거위, 칠면조, 기니닭, 자고새 또는 타조 등을 포함한다. 상기 조류 대상은 성숙 조류, 조류 새끼 및 조류 배아/난을 포함할 수 있다. 닭에는 산란계, 종계, 육계, 팬시 닭, 및 교배 암닭이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 면역원성 조성물은 발육종란내(In Ovo), 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 결막 및 피하의 경로로 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특히, 본 발명에 따른 면역원성 조성물은 우수한 내열성을 갖기 때문에, 음용수를 통하는 것 또는 분무와 같이 농업적 목적을 위한 집단 투여의 경로에 적합할 수 있다.
본 발명에 따른 백신 생산 방법의 구체적 일 예로서, SPF 발육란에 NDV C7d-AIV 바이러스를 105.0 EID50 접종하고 접종 후 24시간마다 검란을 실시하여 중사란을 확인한다. 접종 72시간 후 접종란을 4 ℃ 온도에서 냉장한 후 요막강액을 채취하여 닭 적혈구 응집반응을 통해 바이러스의 배양을 확인한다. 배양이 확인된 바이러스는 9-11일령 SPF 발육란에 십진 희석 후 접종하여 EID50 측정한다. 포르말린을 최종함량 0.05%(v/v)가 되도록 첨가하고 37℃ 온도에서 24시간 교반하여 바이러스를 불활화한다. 불활화된 바이러스를 오일 어쥬번트(Seppic ISA70)과 3:7 중량비로 혼합하여 사독백신을 제조할 수 있다.
상기 구현예에서, 상기 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 당업계에 잘 알려져 있는 것으로, 예를 들면, 살균수, 식염수 용액 또는 인산염 완충액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의한 조류 독감 예방용 백신을 제조하기 위하여, 상기 조류 독감바이러스 입자는 그 자체로 사용할 수도 있지만, 수의학적으로 수용 가능한 매개체 내에 장입할 수 있고, 부형제로서 선택적으로 어쥬번트(adjuvant)를 보충할 수 있다. 본 발명의 특별한 구현양태에서, 조성물은 면역원성 조성물 및 항원보강제를 포함하고, 이들로 필수적으로 구성되고/되거나 구성된다. 본 발명의 항원보강제의 비제한적인 예는 알루미늄 유래 항원보강제, 사포닌, 미네랄 겔, 다가음이온, 플루로닉 폴리올, 사포닌 유도체, 리소레시틴 및 다른 유사한 표면 활성 물질, 글리코시드, 모든 유형의 오일 및 이들의 조합을 포함한다. 본 발명의 특별한 구현양태에서, 조성물은 수-중-유-중-수 에멀젼을 포함할 수 있다.
또다른 구현예에서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 비히클은 유중수 에멀젼일 수 있다. 적합한 유중수 에멀젼의 예에는 하기: 항원-함유 수상 6 내지 50 v/v %, 바람직하게는 12 내지 25 v/v %, 전체적으로 또는 부분적으로 비-대사성 오일 (예를 들어, 광유, 예컨대 파라핀 오일) 및/또는 대사성 오일 (예를 들어, 식물성 오일, 또는 지방산, 폴리올 또는 알코올 에스테르) 을 함유하는 유상 50 내지 94 v/v %, 계면활성제 0.2 내지 20 p/v %, 바람직하게는 3 내지 8 p/v % 를 함유하고 4 ℃ 온도에서 안정하고 유체인 오일계 유중수 백신 에멀젼이 포함되는데, 상기 계면활성제는 전체적으로 또는 부분적으로, 또는 혼합물에서 폴리글리세롤 에스테르로 있고, 상기 폴리글리세롤 에스테르는 바람직하게는 폴리글리세롤 (폴리)리시놀레에이트, 또는 폴리옥시에틸렌 리신 오일 또는 그 밖의 수소화된 폴리옥시에틸렌 리신 오일이다.
하나의 구현예에서, 백신의 투여는 예를 들어, 투여가 점안액에 의해 이루어지는 구현예에서, 투여량은 대략 약 1 닭 투여량, 2 닭 투여량, 3 닭 투여량, 4 닭 투여량, 5 닭 투여량, 6 닭 투여량, 7 닭 투여량, 8 닭 투여량, 9 닭 투여량 및 유리하게는 10 닭 투여량에 이르고 필요하다면 복용량을 약 20 에서 약 100 닭 투여량까지 올릴 수 있다. 참조의 편의를 위해, 5.5 log10 50% 계란 감염성 투여량 (Egg Infective Dose: EID50) 가 대략 1 닭 투여량이다.
본 발명의 백신은 조류 알 내에, 식수, 스프레이, 에어로졸, 비강 점적 주입, 점안액, 부리 담금을 통해, 날개-망 찌름, 경피, 피하 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 유리하게는, 백신은 피하, 알 내, 점안액, 스프레이 또는 식수에 의해 투여된다.
또다른 구현예에서, 백신은 부화 1 내지 3 일 전에 알 내에, 또는 1 일령, 2 일령, 3 일령, 4 일령, 5 일령, 6 일령, 7 일령, 8 일령, 9 일령, 10 일령, 11 일령, 12 일령, 13 일령, 14 일령, 15 일령, 16 일령, 17 일령, 18 일령, 19 일령, 20 일령 또는 21 일령 닭에 투여될 수 있다.
다양한 투여가 바람직하게는 약 1 주 내지 약 6 주 간격으로, 또는 약 2 내지 약 4 주 간격으로 수행된다. 매 2 내지 6 주 반복된 부스트 또는 연간 부스트가 또한 고려된다. 동물은 바람직하게는 첫 번째 투여 시에 1 일령 이상이다.
본 발명에 따른 변이 뉴캣슬병 바이러스(Newcastle Disease Virus, NDV) 및 상기 바이러스를 포함하는 조류 백신은 내열성, 증식성 및 모체이행항체 및 능동면역을 극복 가능하여 우수한 장점이 있으며, 상기 변이 뉴캣슬병 바이러스를 벡터로 이용하여 이종 항원을 발현하는 조류 면역화 조성물 및 면역화 방법을 제공할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 뉴캣슬병 바이러스를, F 유전자 다양성부위에 대한 Neighbor-Joining 법을 이용하여 계통 분석한 결과로 BP-NDV-C7d(8006)주는 7d 형에 속함을 나타낸다.
도 1b는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 7형 뉴캣슬병 바이러스 (BP-NDV-C7d)의 전체 RNA 게놈 폴리뉴클레오티드 서열 분석을 위한 8종 프라이머 세트의 증폭부위를 나타낸다.
도 1c는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d의 게놈 전사벡터 제조과정에서 클로닝 연결부위의 확인결과를 나타낸다.
도 2a는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d의 바이러스 작출 과정을 나타낸 것으로서, 구체적으로 작출된 BP-NDV-C7d의 F 유전자 증폭을 통한 바이러스 유무를 확인한 결과로 transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응여부를 확인하기 위해 추출한 RNA를 RT-PCR 및 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d의 바이러스 작출을 위해 형질감염에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응 여부를 확인하기 위해, RT-PCR를 통한 재조합 7형 NDV 바이러스 유무를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d의 주요항원부위를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a-3f는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d 바이러스 게놈의 전체 폴리뉴클레오티드 서열을 나타내며, 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하다.
도 4a는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d의 바이러스의 내열성을 야외분리 7형 NDV(SNU-0164, 2108, 4152, 5076, 5079 및 6014)와 Lasota 바이러스 및 이를 backbone으로 한 KBNP-C4152, 내열성을 가진 상용백신주(Avinew, NDW)와 비교하기 위해 56 ℃ 온도에서 해당 시간(0-50분) 에 따른 열처리 후 바이러스의 혈구응집능을 비교한 결과이다.
도 4b는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d의 바이러스의 내열성을 야외분리 7형 NDV(SNU-0164, 2108, 4152, 5076, 및 6014)와 Lasota 바이러스 및 이를 backbone으로 한 KBNP-C4152, 내열성을 가진 상용백신주(NDW)와 비교하기 위해 56 ℃ 온도에서 해당 시간(0-50분) 에 따른 열처리 후 바이러스의 CEK 세포감염능을 비교한 결과이다.
도 5a는 조류 인플루엔자 바이러스(H5N6)의 병원성과 관련되어 있는 HA cleavage site의 multibasic 서열(RERRRK)을 ASGR로 치환한 것과 HA2 common epitope 인근의 N-glycan을 제거하기 위해 495번째 아미노산을 기존 Asparagine에서 Threonine으로 치환한 것을 나타낸다.
도 5b는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d 백터내에 AIV-HA 및 AIV-NA 항원을 도입하기 위해 필요한 제한효소 인식부위(SbfI, AvrII site)를 가진 합성유전자 서열(AgeI-NDV M gene-BstZ1T1)을 나타낸다.
도 5c는 본 발명의 일 예에 따라 제작된 NDV-H5N6 키메라 바이러스의 게놈 전사벡터를 나타내며 AIV-HA 및 AIV-NA 항원 도입에 필요한 제한효소 위치 및 사용된 제한효소의 정보를 나타낸다.
도6a-6h는 본 발명의 일 예에 따라 제작된 BP-NDV-C7d-AIV-H5N6 바이러스 게놈의 전체 폴리뉴클레오티드 서열을 나타내며, 서열번호 83의 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하다.
도 7a는 본 발명의 일 예에 따라 제작된 AIV-HA 및 AIV-NA을 발현하는 재조합 NDV 게놈 전사벡터 (BP-NDV-C7d-AIV-H5N6)를 이용한 바이러스 작출 방법을 나타낸다.
도 7b는 본 발명의 일 예에 따라 작출된 BP-NDV-C7d-AIV-H5N6 키메라 바이러스의 NDV F 유전자 증폭을 통한 바이러스 유무를 확인한 결과로서, transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응여부를 확인하기 위해 추출한 RNA를 RT-PCR 및 PCR하여 확인하고 그 결과를 나타낸 것이다.
도 7c는 본 발명의 일 예에 따라 작출된 BP-NDV-C7d-AIV-H5N6 키메라 바이러스의 주요 항원부위를 확인하기 위한 프라이머 세트 위치와 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d-AIV-H5N6 키메라 바이러스를, NDV에 대한 모체이행항체를 갖는 상용계 1일령 병아리에 점안 또는 분무백신 후, 고병원성 H5N6 조류인플루엔자 공격접종에 대한 방어능을 비교한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d-AIV-H5N6 키메라 바이러스를, NDV에 대한 모체이행항체를 갖는 상용계 1일령 병아리에 점안 또는 분무백신 후 고병원성 NDV 공격접종에 대한 방어능을 비교한 결과이다.
도10은 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d-AIV-H5N6 키메라 바이러스를, NDV에 대한 능동면역을 갖는 시험그룹 및 같은 주령의 SPF 그룹에서 생독 프라이밍 및 사독 부스팅 백신 후 ND 바이러스에 대한 항체 형성능을 비교한 결과이다.
도11은 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d-AIV-H5N6 키메라 바이러스를, NDV에 대한 능동면역을 갖는 시험그룹 및 같은 주령의 SPF 그룹에서 생독 프라이밍 및 사독 부스팅 백신 후 AIV-H5N6 바이러스에 대한 항체 형성능을 비교한 결과이다.
도 12는 인플루엔자 바이러스의 HA2 common epitope 인근의 N-glycan을 제거하기 위해 492번째 아미노산을 기존 Asparagine에서 Threonine으로 치환한 것을 나타낸다.
도 13는 최종 제작된 NDV-H9N2 바이러스 게놈 전사벡터를 나타내며 인플루엔자 HA, NA 항원 도입에 필요한 제한효소 위치 및 사용된 제한효소의 정보를 나타낸다.
도 14a 내지 도 14h는 제조된 BP-NDV-C7d-AIV-H9N2-HANA 게놈 전체 폴리뉴클레오티드 서열을 나타내며, 서열번호 100의 폴리뉴클레오티드뉴클레오티드뉴클레오티드출된 조류인플루엔자 HA 및 NA를 발현하는 NDV-H9N2 키메라 바이러스의 주요항원부위 확인을 위한 프라이머 세트 위치와 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도16은 중병아리에서 BP-NDV-H9N2 바이러스의 불활화 백신을 투여한 후 ND 바이러스와 AIV-H9N2 바이러스에 대한 항체형성능을 나타낸 결과이다.
도 1b는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 7형 뉴캣슬병 바이러스 (BP-NDV-C7d)의 전체 RNA 게놈 폴리뉴클레오티드 서열 분석을 위한 8종 프라이머 세트의 증폭부위를 나타낸다.
도 1c는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d의 게놈 전사벡터 제조과정에서 클로닝 연결부위의 확인결과를 나타낸다.
도 2a는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d의 바이러스 작출 과정을 나타낸 것으로서, 구체적으로 작출된 BP-NDV-C7d의 F 유전자 증폭을 통한 바이러스 유무를 확인한 결과로 transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응여부를 확인하기 위해 추출한 RNA를 RT-PCR 및 PCR을 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d의 바이러스 작출을 위해 형질감염에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응 여부를 확인하기 위해, RT-PCR를 통한 재조합 7형 NDV 바이러스 유무를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2c는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d의 주요항원부위를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a-3f는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d 바이러스 게놈의 전체 폴리뉴클레오티드 서열을 나타내며, 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하다.
도 4a는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d의 바이러스의 내열성을 야외분리 7형 NDV(SNU-0164, 2108, 4152, 5076, 5079 및 6014)와 Lasota 바이러스 및 이를 backbone으로 한 KBNP-C4152, 내열성을 가진 상용백신주(Avinew, NDW)와 비교하기 위해 56 ℃ 온도에서 해당 시간(0-50분) 에 따른 열처리 후 바이러스의 혈구응집능을 비교한 결과이다.
도 4b는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d의 바이러스의 내열성을 야외분리 7형 NDV(SNU-0164, 2108, 4152, 5076, 및 6014)와 Lasota 바이러스 및 이를 backbone으로 한 KBNP-C4152, 내열성을 가진 상용백신주(NDW)와 비교하기 위해 56 ℃ 온도에서 해당 시간(0-50분) 에 따른 열처리 후 바이러스의 CEK 세포감염능을 비교한 결과이다.
도 5a는 조류 인플루엔자 바이러스(H5N6)의 병원성과 관련되어 있는 HA cleavage site의 multibasic 서열(RERRRK)을 ASGR로 치환한 것과 HA2 common epitope 인근의 N-glycan을 제거하기 위해 495번째 아미노산을 기존 Asparagine에서 Threonine으로 치환한 것을 나타낸다.
도 5b는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d 백터내에 AIV-HA 및 AIV-NA 항원을 도입하기 위해 필요한 제한효소 인식부위(SbfI, AvrII site)를 가진 합성유전자 서열(AgeI-NDV M gene-BstZ1T1)을 나타낸다.
도 5c는 본 발명의 일 예에 따라 제작된 NDV-H5N6 키메라 바이러스의 게놈 전사벡터를 나타내며 AIV-HA 및 AIV-NA 항원 도입에 필요한 제한효소 위치 및 사용된 제한효소의 정보를 나타낸다.
도6a-6h는 본 발명의 일 예에 따라 제작된 BP-NDV-C7d-AIV-H5N6 바이러스 게놈의 전체 폴리뉴클레오티드 서열을 나타내며, 서열번호 83의 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하다.
도 7a는 본 발명의 일 예에 따라 제작된 AIV-HA 및 AIV-NA을 발현하는 재조합 NDV 게놈 전사벡터 (BP-NDV-C7d-AIV-H5N6)를 이용한 바이러스 작출 방법을 나타낸다.
도 7b는 본 발명의 일 예에 따라 작출된 BP-NDV-C7d-AIV-H5N6 키메라 바이러스의 NDV F 유전자 증폭을 통한 바이러스 유무를 확인한 결과로서, transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응여부를 확인하기 위해 추출한 RNA를 RT-PCR 및 PCR하여 확인하고 그 결과를 나타낸 것이다.
도 7c는 본 발명의 일 예에 따라 작출된 BP-NDV-C7d-AIV-H5N6 키메라 바이러스의 주요 항원부위를 확인하기 위한 프라이머 세트 위치와 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d-AIV-H5N6 키메라 바이러스를, NDV에 대한 모체이행항체를 갖는 상용계 1일령 병아리에 점안 또는 분무백신 후, 고병원성 H5N6 조류인플루엔자 공격접종에 대한 방어능을 비교한 결과이다.
도 9는 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d-AIV-H5N6 키메라 바이러스를, NDV에 대한 모체이행항체를 갖는 상용계 1일령 병아리에 점안 또는 분무백신 후 고병원성 NDV 공격접종에 대한 방어능을 비교한 결과이다.
도10은 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d-AIV-H5N6 키메라 바이러스를, NDV에 대한 능동면역을 갖는 시험그룹 및 같은 주령의 SPF 그룹에서 생독 프라이밍 및 사독 부스팅 백신 후 ND 바이러스에 대한 항체 형성능을 비교한 결과이다.
도11은 본 발명의 일 예에 따라 얻어진 BP-NDV-C7d-AIV-H5N6 키메라 바이러스를, NDV에 대한 능동면역을 갖는 시험그룹 및 같은 주령의 SPF 그룹에서 생독 프라이밍 및 사독 부스팅 백신 후 AIV-H5N6 바이러스에 대한 항체 형성능을 비교한 결과이다.
도 12는 인플루엔자 바이러스의 HA2 common epitope 인근의 N-glycan을 제거하기 위해 492번째 아미노산을 기존 Asparagine에서 Threonine으로 치환한 것을 나타낸다.
도 13는 최종 제작된 NDV-H9N2 바이러스 게놈 전사벡터를 나타내며 인플루엔자 HA, NA 항원 도입에 필요한 제한효소 위치 및 사용된 제한효소의 정보를 나타낸다.
도 14a 내지 도 14h는 제조된 BP-NDV-C7d-AIV-H9N2-HANA 게놈 전체 폴리뉴클레오티드 서열을 나타내며, 서열번호 100의 폴리뉴클레오티드뉴클레오티드뉴클레오티드출된 조류인플루엔자 HA 및 NA를 발현하는 NDV-H9N2 키메라 바이러스의 주요항원부위 확인을 위한 프라이머 세트 위치와 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도16은 중병아리에서 BP-NDV-H9N2 바이러스의 불활화 백신을 투여한 후 ND 바이러스와 AIV-H9N2 바이러스에 대한 항체형성능을 나타낸 결과이다.
이하, 본 발명을 하기의 참고예 및 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
실시예
1:
뉴캣슬병
바이러스 발현벡터 제조
1-
1: 7형
뉴캣슬병
바이러스분리
2008년 5월 29일 경기도 용인시 처인구 소재 종계 농가(6계동, 37,000수 규모)에서 ㈜바이오포아 병성감정기관에 의뢰한 샘플로부터 7형 강병원성주의 항원성을 갖는 뉴캣슬병 바이러스를 분리하였다(8006주). 의뢰농가 6계동 전체에서 높은 폐사(매일 40여수씩 폐사 발생)와 함께 심한 산란율 저하가 보였으며(산란율이 68-70% 수준에서 정체됨) 수의사 현장부검 당시 암탉 2수, 수탉 1수 모두에 공통적으로 복막염과 선위출혈이 확인되었고 수탉에서는 청색증, 심한 기관지 출혈과 함께 기관내강에 저류된 삼출물이 관찰되었고 요산침착증 소견이 보였다. 현장부검에서 개체별로 채취한 기관 및 맹장편도를 멸균 PBS로 고형물이 10%가 되도록 유제한 후 NDV pathotyping RT-PCR을 실시한 결과 양성반응을 보였다. 유제액을 계태아 섬유아세포(CEF) 상에서 3회 플라크 정제를 수행하여 클로닝하였고, SPF 발육란에서 2회 계대배양하여 바이러스를 분리하였다.
상기 분리된 바이러스의 F 유전자 다양성부위(384bp)에 대해 Neighbor-Joining 법을 이용한 결과 7d 형에 속함을 확인하였다(도 1a 참조)
1-2: 국내 분리 7형
NDV
바이러스의 RNA 게놈 폴리뉴클레오티드 서열 분석
GenBank에 등록되어 있는 7형 NDV 바이러스 서열을 다중 정렬하여 공통적으로 특이적인 프라이머 세트를 제작하였다. 결과적으로 상기 BP-NDV-C7d 바이러스 15,210bp 게놈을 6개의 중첩되는 단편으로 나누어 증폭할 수 있는 프라이머 쌍을 제작하였다. 바이러스 게놈 RNA의 3'-말단 및 5'-말단을 제외한 전체부분을 각각의 프라이머를 이용, cDNA 합성 및 PCR증폭한 후 폴리뉴클레오티드 서열을 분석하였고 3' 및 5' 말단 폴리뉴클레오티드 서열은. RACE 방법을 사용하여 해당 부분에 대한 cDNA 합성 및 PCR 증폭하여 폴리뉴클레오티드 서열 분석을 진행하였다. 반응에 사용된 primer들은 표 1에 요약하였으며, 프라이머 설계 부위를 도 1b에 나타낸다.
Position | Oligonucleotide | Primer sequence (5' -> 3') | 서열 번호 |
3'-RACE | NDV C7d-NP-754R | CAAGTTGTAATATGTAGAGC | 4 |
751-3,570 | NDV C7d-NP-801-F | GAAGAAGTACATCCTTCATC | 5 |
NDV C7d-P gene-366R | GTCGAGCATGGACAGAAGG | 6 | |
NDV C7d-P-2268-F | AGACCAGCGACACACAGCTC | 7 | |
NDV-C7d-M-3621-R | AGCTCGTGCCTGGGATTGTC | 8 | |
3,443-5,101 | NDV C7d-M-130F | CAGCGTCTTGATTCGTGGAC | 9 |
NDV-C7d-F-realTime-R | GTGTTCTGTTATATGCCTCC | 10 | |
NDcomR/ptR | TGCCACTGMTAGTTGYGATA | 11 | |
4,723-7,613 | NDcom156/f | ATACACCTCRTCYCAGACAG | 12 |
NDV C7d-HN-62R | CATGTGTTCTTTGCTTCTC | 13 | |
NDV C7d-F 912F | GACCTTATCTGTAAGTACA | 14 | |
SF-7575R | TTAGGTGGAATAGTCAGCACC | 15 | |
7,053-9,616 | NDV C7d-HN-7102-F | AGCACTTGGTGTGCTTCGG | 16 |
NDV C7d-L gene 65R | GAGGATAGATGTGACTCTGG | 17 | |
NDV C7d-L gene 1212R | GTATCCATTGATGATTGTTC | 18 | |
8,520-11,945 | NDV C7d-L-8569-F | CGCTTCCTGATGAATGCG | 19 |
NDV-All-10772-R | ATTATCACTGGCTTGATGCA | 20 | |
NDV C7d-L-10018-F | TGGAATACCTGACAACCCTC | 21 | |
NDV C7d-L-11495-R | CATCAGTCAGCTCTATATTGC | 22 | |
11,598-14,992 | NDVC7d-L-3193-F | AGATTGCACTGACTAGGAGG | 23 |
NDV C7dCND-L-3512F | ATCTTCCAAGCAATATAGA | 24 | |
NDV C7dCND-L-5373R | GATGCCTTATACCAAGA | 25 | |
NDV C7dCND-L-5068F | ATTGGTGCTCGAGTGAAAG | 26 | |
C7d-Lgene-6588R | CTTGGCAGCATTACCTATG | 27 | |
5'-RACE | NDV C7d-L-14931-F | AGCGGTCCTGGGTATTACTA | 28 |
1-3: BP-NDV-C7d 주를 기본 backbone으로 한 재조합 NDV 게놈 전사 벡터 제조
실시예 1-2에서 얻어진 야외 분리 7형 ND 바이러스 전체 유전자를 8개의 단편으로 나누어 인공적으로 합성하였다. 모든 합성유전자는 제조사로부터 pBHA vector에 클로닝되어 제공받았다. 각 단편에는 해당 위치의 뉴캣슬병 바이러스 단백질을 암호화하는 서열 및 발현벡터 도입에 필요한 제한효소 인식부위를 부가하였다.
진핵 발현 숙주세포 내에서 전사 및 해독 발현조절을 위해 S1 단편에는 T7 promoter와 3' UTR 서열을, S8 단편에는 5'UTR와 T7 terminator 서열을 추가로 부가하였다. 특히 NDV의 cDNA로부터 바이러스를 만들어낼 때 바이러스 게놈의 5'과 3' 양쪽 끝에 불필요한 염기의 첨가없이 바이러스 게놈과 똑 같은 구조로 전사되도록 T7 프로모터를 전사개시부 바로 앞에 위치하도록 하였고, NDV 안티게놈 RNA 직후에는 간염 델타 바이러스(Hepatitis delta virus : HDV) ribozyme RNA 서열을 위치시켜 자가 절단(self cleavage)가 일어날 수 있도록 하였으며, T7 promoter와 3' UTR 사이, 5'UTR과 T7 terminator 사이에는 바이러스 비전사 영역인 리더(leader, 20nt) 및 트레일러(trailer, 22nt)를 각각 위치시켜 게놈 RNA의 복제, 바이러스의 encapsidation 및 packaging을 제어하도록 하였다.
또한, F gene의 cleavage site서열은 서열번호 1의 아미노산 서열에서 112번내지 117번째 아미노산으로 이루어진 부분이, 야생형 112- RRQKRF -117를 적어도 비병원성 아미노산 codon을 갖도록 디자인하여 합성하였다. 즉 cleavage site 서열 중 특히 115번 아미노산은 야생형 K에서 변이형 A로 치환되며, 바람직하게는 112번 내지 117번 부분 112- GRQARL -117의 비병원성 아미노산 codon을 갖도록 디자인하였는데 이 경우 2번 이상의 점 돌연 변이를 거쳐야 염기성 아미노산을 코딩하는 코돈으로 변하여 병원성을 나타낼 수 있다.
S2-S8까지 모든 합성유전자는 S1 pBHA vector 내 작성해 놓은 다중 제한효소 부위를 이용하여 순차적으로 도입하였고 각 도입단계마다 연결부위 전과 후에 위치하는 프라이머 조합으로 PCR하여 새롭게 도입된 유전자를 확인하였다. BP-NDV-C7d 바이러스 게놈 전사벡터 클로닝 단계 별 연결확인 프라이머세트는 표 2에 요약하며, 프라이머 설계 부위를 도 1c에 나타낸다. 연결부위가 확인된 NDV 게놈 전사 벡터는 표 3에 요약된 프라이머 세트로 전체 폴리뉴클레오티드 서열을 확인하였다.
연결확인 부위 | Oligonucleotide | Primer sequence (5' -> 3') |
Amplicon size(bp) |
서열 번호 |
S1-S2 | NDV C7d-178delta NgoMIV-IF | TACCAATGGCCGCCCTCTGCCAACT | 2,162 | 29 |
NDV C7d-Pgene-366R | GTCGAGCATGGACAGAAGG | 30 | ||
S2-S3 | NDV C7d-NP-1576-F | ATCCTGCACAGAGCACCA | 2,044 | 31 |
NDV-C7d-M-3621-R | AGCTCGTGCCTGGGATTGTC | 32 | ||
S3-S4 | NDcom156/f | ATACACCTCRTCYCAGACAG | 875 | 33 |
NDV C7d+Ampv-8563R | CCAGATCGGACTCTATACAG | 34 | ||
S4-S5 | NDV C7d-HN-7102-F | AGCACTTGGTGTGCTTCGG | 1,863 | 35 |
NDV-all-L-511R | TGGACCATTTTGAGTGAA | 36 | ||
S5-S6 | NDV C7d-L-10018-F | TGGAATACCTGACAACCCTC | 776 | 37 |
NDV-All-10772-R | ATTATCACTGGCTTGATGCA | 38 | ||
S6-S7 | NDVC7d-L-3193-F | AGATTGCACTGACTAGGAGG | 2,080 | 39 |
NDV C7dCND-L-5373R | GATGCCTTATACCAAGA | 40 | ||
S7-S8 | NDV C7dCND-L-5068F | ATTGGTGCTCGAGTGAAAG | 1,521 | 41 |
C7d-Lgene-6588R | CTTGGCAGCATTACCTATG | 42 |
Position | Oligonucleotide | 폴리뉴클레오티드 서열(5' -> 3') |
서열
번호 |
NP | T7-pro-new | CTTAATACGACTCACTATAGG | 43 |
NP-P | NDV C7d-NP-801-F | GAAGAAGTACATCCTTCATC | 44 |
NDV C7d-NP-1576-F | ATCCTGCACAGAGCACCA | 45 | |
P | NDV C7d-P-2268-F | AGACCAGCGACACACAGCTC | 46 |
P-M | NDV-C7d-M-339-R | CATGGTGAGGCAGGCTCTC | 47 |
M | NDV-C7d-M-1F | ATGGACTCATCCAGGACA | 48 |
M-F | NDV-C7d-M-856F | CGGACTAAGCTACTTGCTCCT | 49 |
NDV-C7d-F-realTime-R | GTGTTCTGTTATATGCCTCC | 50 | |
F | NDV-C7d-Fgene-7536F | TATCCGTCTGACAAGCTCT | 51 |
F-HN | NDV C7d-F-5704-F | TGAGCGGCAACACATCAGC | 52 |
HN | NDV-all-HN-948R | AACTGGGAACCATACACG | 53 |
NDV C7d-HN-7102-F | AGCACTTGGTGTGCTTCGG | 54 | |
HN-L | NDV C7d-HN-7834-F | AGGTAGTGTCCCTTGCCAG | 55 |
L | NDV C7d-L-8569-F | CGCTTCCTGATGAATGCG | 56 |
NDV C7d-L-9288-F | AGGTAATCAAGTCTATGATG | 57 | |
NDV C7d-L-10018-F | TGGAATACCTGACAACCCTC | 58 | |
NDV C7d-11842R | CTGTCAGGGGTGACCAGCT | 59 | |
NDV C7d-L-11495-R | CATCAGTCAGCTCTATATTGC | 60 | |
NDV C7d-L-3106F | CGTGTCGCACATGCTATCATGG | 61 | |
NDV C7d-L-12507-F | CGAGAAGCGCCTGTTGCGGT | 62 | |
NDV C7d-L-13307-F | CACTGAGTATCTACTGTCAG | 63 | |
NDV C7d-L-6588 | CTTGGCAGCATTACCTATGG | 64 | |
L-T7 terminator | NDV C7d-L-14931-F | AGCGGTCCTGGGTATTACTA | 65 |
Vector-ori-AmpR | pBHA-ORI-142F | CTTACCGGATACCTGTCCGC | 66 |
T7 promoter-3-leader-NP | NDV C7d-178delta NgoMIV-IR | AGTTGGCAGAGGGCGGCCATTGGTA | 67 |
실시예
2: 7형
재조합
NDV
바이러스
작출
2-
1: 7형
재조합
NDV
바이러스
작출
실시예 1에서 제조한 전체 NDV 유전자를 복제하는 재조합 전장 NDV C7d cDNA vector로부터 7형 ND 바이러스를 도 2a와 같이 작출하였다.
Hep-2세포 주를 6-well 플레이트 에 80% 가랑 키워놓은 후, vaccinia T7 바이러스를 감염시켰다. 이후 세포주에 T7 promoter에 의해 개시되어 단백질이 발현되는 pCR-TM-NP, pCR-TM-P, pCR-TM-L 플라스미드 벡터 3개와 T7 promoter에 의해 개시되어 HDV 라이보자임에 의해 스스로 절단되어 정확하고 완전한 전체 키메라 내열성 NDV 게놈을 만들어 낼 수 있는 플라스미드인 NDV-C7d-H5N6-HANA pBHA을 준비하였다. 각각을 1:1:0.1:1 비율로 섞어 Lipofectamine TM(Invitrogen. co)과 적정 비율로 혼합하여 트랜스펙션하였다. 이후 1ug/ml의 acetylated trypsin을 첨가하여 내열성 비병원성 재조합 바이러스가 생성되어 감염성을 갖도록 하였다. 2-3일간 37 ℃ 온도에서 배양한 후 6 well의 세포를 수확하여 11일령의 SPF 발육란에 접종하여 감염성 NDV를 얻었다.
2-
2:NDV
-F 유전자를 이용한 7형 재조합
NDV
바이러스의 확인 실험
11일령 SPF 발육란 접종 후 24시간마다 검란을 실시하여 중사란을 확인하고, 접종 72시간 후 접종란을 4 ℃ 온도 냉장한 후 요막강액을 채취하여 바이러스 확인실험을 실시하였다.
요막강액 150㎕에 Virus genome Ex Kit(BIOPOA) lysis buffer 150㎕를 첨가하고 균질하게 혼합한 후 실온에서 10분간 정치하였다. 여기에 다시 binding buffer 300㎕를 첨가하고 균질하게 혼합한 후 column에 loading하고 washing buffer A, B를 사용하여 차례로 column을 세척하고 elution buffer로 column에 부착되어있는 RNA를 용해시켰다.
추출한 재조합 뉴캣슬병바이러스의 RNA 2㎕를 다음 NDVcomF/NDVcomR primer를 사용하여 ONE-STEP RT-PCR Kit(iNtRON)로 45℃/20sec-50℃/15sec-72℃/30sec)30cycles 조건하에서 RT-PCR 하여 바이러스의 유무를 확인하였다. 또한, Transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응을 확인하기 위하여 추출한 RNA를 NDVcomF/NDVcomR primer를 사용하여 MG-taq polymerase(MGmed)로 94℃/15sec-72℃/30sec)30cycles 조건으로 PCR하여 확인하고, 그 결과를 도 2b에 나타내었다:
NDVcomF (서열번호 68): ATACACCTCRTCYCAGACAG
NDVcomR (서열번호 69): TGCCACTGMTAGTTGYGATA
2-3: 주요 항원부위를 이용한 7형 재조합
NDV
바이러스의 확인 실험
상기 프라이머 세트로 NDV F 유전자에 대한 확인이 완료된 바이러스는 NDV 주요 항원부위에 대하여 4종 RT-PCR을 45℃/20sec-50℃/20sec-72℃/1min 20sec)30cycles조건에서 수행하고, 얻어진 결과물을 폴리뉴클레오티드 서열 분석하였으며, 그 결과를 도 2c에 나타내었다.
No. | Oligonucleotide | Sequence (5'->3') | 확인 부분 | 서열번호 |
P1 | P480-NDV C7d-P-2268-F | AGACCAGCGACACACAGCTC | P->M M->P | 70 |
P550-NDV-C7d-M-3621-R | AGCTCGTGCCTGGGATTGTC | 71 | ||
P2 | P436-NDV-C7d-M-5168 | CAATCTTGCGCTCAATGTCA | M->F F->M | 72 |
P471-NDV C7d+Ampv-8563R | CCAGATCGGACTCTATACAG | 73 | ||
P3 | P753-NDV C7d-F 912F | GACCTTATCTGTAAGTACA | F->HN HN->F | 74 |
P754-NDV C7d-HN-62R | CATGTGTTCTTTGCTTCTC | 75 | ||
P4 | P482-NDV C7d-HN-6401-F | GAACGGTCAGAGGAGCCAC | HN | 76 |
P755-NDV C7d-HN gene end-R | GCTCAATCGGCCACGTCTAG | 77 |
상기 확인이 완료된 바이러스는 BP-NDV-C7d라고 명명하고 생명공학연구원 생물자원센터에 2019년 7월 23일자로 기탁하여 KCTC13595BP 기탁번호를 수여받았다. 상기 BP-NDV-C7d 바이러스의 게놈 폴리뉴클레오티드 서열을 도 3a 내지 도 3f 및 서열번호 3에 나타낸다.
2-4: 혈구응집반응을 이용한 7형 재조합
NDV
바이러스의 확인 실험
추출한 요막강액을 닭혈구와 반응하여 혈구응집반응을 통해 작출된 재조합 NDV 바이러스를 확인하였다. NDV 바이러스의 혈구응집반응 최초 작출을 확인한 이후 바이러스별로 종란에 2회, 3회 계대배양 후 혈구응집반응을 통해 바이러스의 배양을 확인하였다.
본 발명에 따른 BP-NDV-C7d 바이러스 작출 벡터는, 7형 NDV의 유전자를 도입하여 만든 벡터로 기존에 알려진 기탁번호 KCTC12444BP로을 갖는 BP-ACND와는 상이하며, 종래 Lasota 바이러스를 backbone으로 한 바이러스들에 비해 내열성이 향상되어 56℃온도에서 열처리 후 20분까지 HA 활성이 유지되나(Lasota backbone 바이러스의 경우 10분) BP-NDV-C7d 바이러스는 이보다 내열성이 더욱 향상된 바이러스로 56℃온도에서 열처리 후 20분 이상, 25분 이상, 또는 30분 이상, 바람직하게는 30분 내지 50분까지 HA (혈구응집반응) 활성이 유지되고 세포 감염능이 또한 유지됨을 확인하였다.
실시예
3: 재조합
NDV의
안정성 및 내열성
3-1: 재조합
NDV의
내열성 평가
표면 단백질의 안정성(내열성)을 보기 위해, 실시예 1에서 제조된 재조합 NDV를 56 ℃ 온도로 열처리 후 혈구응집(HA)능력을 평가하였다. 상기 혈구응집능력의 평가 결과를 도 4a에 나타낸다.
그 결과, 상기 NDV(C7d) 바이러스만이 30분 처리 이후에도 유일하게 높은 HA역가를 보였다. Genotype VII유래 주들(SNU-0164, 2108, 4152, 5079, 6014)과 비병원성 백신주 KBNP-C4152, Lasota, Avinew, NDW등 다른 NDV들은 10분 처리만으로 HA활성이 급감하거나 HA활성이 비교적 높게 유지되던 바이러스들도 20분 처리 후에는 대부분 활성이 사라졌다.
3-2: 열처리 재조합
NVD의
감염역가
측정
실시예 3-1에 따라 열처리한 바이러스를 CEK에 감염시켜 바이러스의 감염 역가를 측정하여 결과를 도 4b에 나타냈다. 도 4b에 나타낸 것과 같이, NDV-C7d주는 현재까지 가장 내열성이 뛰어나다고 알려진 NDW와 동등한 내열성을 보여주었다.
실시예
4:
HPAIV
단백질을 발현하는 재조합
NDV
벡터 제조
4-1:
HPAI
HA 및 NA 단백질 코딩 유전자 준비
최근 우리나라에서 발생한 Clade 2.3.4.4 C를 대표하는 고병원성 인플루엔자바이러스를 HA 및 NA 공여주로 선발하였다. Global Initiative on Sharing All Influenza Data (GISAID)에 등록 되어있는 A/broiler duck/Korea/ES2/2016(H5N6)바이러스 서열(HA, NA 각 EPI866093, EPI866095)을 기본으로 HA 유전자는 cleavage site 서열을 multi-basic한 RERRRK에서 ASGR로 변경하여 고병원성 모티브를 제거하고 HA2 common epitope 인근에 존재하면서 epitope 인식 및 항체 결합을 방해하는 N-glycan을 제거하여 면역원성을 높인 형태로 인공적으로 합성하였다. 상기 HA 유전자의 Cleavage site 약독화 및 N-glycan 제거를 위한 HA 아미노산 서열 변이에 대해서는 도 5a에 나타낸다. 이에, 상기 변이 HA 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 79 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 80에 나타낸다.
NA 유전자는 등록서열과 동일하게 인공적으로 합성하였으며, NA 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 81 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 82에 나타낸다. 상기 제조된 NA 유전자는, 상기 제작된 NDV 재조합 벡터 도입에 사용되는 각각의 제한효소 인식부위(SbfI: HA, AvrII: NA)를 도입하는 외래 유전자 앞과 뒤에 포함하였다.
4-
2:HPAIV
HA 및 NA 단백질
을
발현하는 재조합
NDV
벡터 제작
NDV의 각 유전자들은 개별적인 개시서열과 종결서열이 있어, RNA 의존성 RNA 중합효소에 의해 각각의 mRNA로 전사되는데 transcriptional polarity에 의해 5'쪽 ORF 일수록 전사된 mRNA 수준이 감소하고 이에 따라 발현되는 단백질량이 저하된다. 재조합 바이러스 증식성에는 영향을 미치지 않는 동시에 NDV 발현벡터 내 조류인플루엔자 HA 및 NA 항원의 발현율을 높이기 위해 발현벡터 내 3'쪽에 위치하는 P-M, M-F 사이에 조류인플루엔자 HA 및 NA 유전자를 도입하였다.
실시예 1에서 제작된 NDV-C7d vector 내에, AIV HA 및 NA 항원도입에 필요한 SbfI 및 AvrII 제한효소 인식부위(도 5b 및 서열번호 78)를 부가한 후에, 실시예 3-1에서 제조한 조류인플루엔자 HA 및 NA 단백질의 암호화 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하였다. 상기 변이 NDV와 AIV의 HA 및 NA 유전자를 포함하는 키메라 바이러스 (NDV-H5N6) 바이러스의 게놈 전사벡터를 도 5c에 나타내며 인플루엔자 HA 및 NA 항원 도입에 필요한 제한효소 위치 및 사용된 제한효소의 정보를 나타낸다.
최종 제작된 NDV-H5N6 바이러스 게놈의 전체 폴리뉴클레오티드 서열은 도 6a 내지 도 6h와 서열번호 83에 나타내었다.
실시예
5:
HPAIV
단백질을 발현하는 재조합
NDV
바이러스
작출
5-1: 재조합
NDV
바이러스
작출
전체 NDV 유전자를 복제하는 재조합 전장 NDV-C7d cDNA vector로부터 HPAIV의 HA 및 NA 단백질 발현하는 ND 바이러스를 도 7a과 같이 작출하였다.
Hep-2 세포주를 6-well 플레이트에 80% 가랑 키워놓은 후, vaccinia T7 바이러스를 감염시켰다. 이후 세포주에 T7 promoter에 의해 개시되어 단백질이 발현되는 pCR-TM-NP, pCR-TM-P, pCR-TM-L 플라스미드 벡터 3개와 T7 promoter에 의해 개시되어 HDV 라이보자임에 의해 스스로 절단되어 정확하고 완전한 전체 키메라 내열성 NDV 게놈을 만들어 낼 수 있는 플라스미드인 NDV-C7d-H5N6-HANA pBHA을 준비하였다. 각각을 1:1:0.1:1 비율로 섞어 Lipofectamine TM(Invitrogen. co)과 적정 비율로 혼합하여 트랜스펙션하였다. 이후 1ug/ml의 acetylated trypsin을 첨가하여 내열성 비병원성 재조합 바이러스가 생성되어 감염성을 갖도록 하였다. 2-3일간 37℃ 온도에서 배양한 후 6 well의 세포를 수확하여 11일령의 SPF 발육란에 접종하여 감염성 NDV를 얻었다.
5-2:
NDV
-F 유전자를 이용한
HPAIV
-HA
NDV
바이러스의 확인
11일령 SPF 발육란 접종 후 24시간마다 검란을 실시하여 중사란을 확인하고, 접종 72시간 후 접종란을 4℃ 온도에서 냉장한 후 요막강액을 채취하여 바이러스 확인실험을 실시하였다.
요막강액 150㎕에 Virus genome Ex Kit(BIOPOA) lysis buffer 150㎕를 첨가하고 균질하게 혼합한 후 실온에서 10분간 정치하였다. 여기에 다시 binding buffer 300㎕를 첨가하고 균질하게 혼합한 후 column에 loading하고 washing buffer A 및 B를 사용하여 차례로 column을 세척하고 elution buffer로 column에 부착되어있는 RNA를 용해시켰다.
추출한 재조합 뉴캣슬병바이러스의 RNA 2㎕를 다음 NDVcomF/NDVcomR primer를 사용하여 ONE-STEP RT-PCR Kit(iNtRON)로 45℃/5min-(94℃/20sec-50℃/15sec-72℃/30sec)30cycles 조건하에서 RT-PCR 하여 바이러스의 유무를 확인하였으며, Transfection에 사용한 DNA에 의한 false positive 반응을 확인하기 위하여 추출한 RNA를 NDVcomF/NDVcomR primer를 사용하여 MG-taq polymerase(MGmed)로 94℃/20sec-50℃/15sec-72℃/30sec)30cycles 조건하에서 PCR하여 확인하고, 그 결과를 도 7b에 나타내었다:
NDVcomF(서열번호 68): ATACACCTCRTCYCAGACAG
NDVcomR(서열번호 69): TGCCACTGMTAGTTGYGATA
5-3: 주요 항원부위를 이용한
HPAIV
-HA
NDV
바이러스의 확인
실시예 5-2에 따라 프라이머 세트로 NDV-F 유전자에 대한 확인이 완료된 바이러스는 도입된 HA 및 NA 항원 포함하며, 하기 표 5에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 주요 항원부위에 대하여, 45℃/5min-(94℃/20sec-50℃/20sec-72℃/1min 20sec)30cycles 조건으로 6종 RT-PCR 후 폴리뉴클레오티드 서열을 분석하였으며, 그 결과를 도 7c에 나타내었다.
Oligonucleotide | 폴리뉴클레오티드 서열 (5'->3’) | 확인 부분 |
서열
번호 |
|
P1 | P698-NDV C7d-P gene-1088-F | GATGCATCCGAGCTCCTCG | P-HA | 84 |
P576-AIV-H5N6-HA-1022R | CTACCTGATGCTAAAGGACT | 85 | ||
P2 | P551-AIV-H5N6-HA-F-SbfI | TTCCTGCAGGATGGAGAAAATAGTGCTTCTTC | HA | 86 |
P576-AIV-H5N6-HA-1022R | CTACCTGATGCTAAAGGACT | 87 | ||
P3 | P568-H5N6-HA-872-F | GAATATGGCCACTGCAACAC | HA, HA-M | 88 |
P550-NDV-C7d-M-3621-R | AGCTCGTGCCTGGGATTGTC | 89 | ||
P4 | P460-NDV-C7d-M-856F | CGGACTAAGCTACTTGCTCCT | NA | 90 |
P666-AIV-H5N6-NA-594R | CCGGTACCACACCACTGCCG | 91 | ||
P5 | P665-AIV-H5N6-NA-467F | CAGTCCATACAACACTAGG | NA-F | 92 |
P518-NDV-C7d-F-realTime-R | GTGTTCTGTTATATGCCTCC | 93 | ||
P6 | P438-NDV-C7d-Fgene-7536F | TATCCGTCTGACAAGCTCT | F cleavage site | 94 |
P471-NDV C7d+Ampv-8563R | CCAGATCGGACTCTATACAG | 95 |
상기 확인이 완료된 바이러스는 BP-NDV-C7d-AIV-H5N6라고 명명하고 KCTC 생물자원센터에 기탁하여 2018년 7월 10일자로 기탁하여 수탁번호 KCTC13576BP를 수여받았다.
5-4: 혈구응집반응을 이용한
HPAIV
NDV
바이러스의 확인
11일령 SPF 발육란 접종 후 24시간마다 검란을 실시하여 중사란을 확인하고, 접종 72시간 후 접종란을 4 ℃ 온도에서 냉장한 후 요막강액을 채취하여 바이러스 확인실험을 실시하였다.
구체적으로, 추출한 요막강액을 닭혈구와 반응하여 혈구응집반응을 통해 작출된 재조합 NDV 바이러스를 확인하였다. NDV 바이러스의 혈구응집반응 최초 작출 확인 이후 바이러스별로 종란에 2회, 3회 계대배양 후 혈구응집반응을 통해 바이러스의 배양을 확인하였다.
실시예
6:
모체이행항체를
갖는 병아리를 이용한
생독
벡터 백신의 효능 시험
실시예 4에서 제조한 NDV(C7d)-H5N6 키메라 바이러스를 이용하여, NDV 및 저병원성 AI바이러스에 대한 높은 모체이행항체를 갖는 1일령 병아리에서 백신효력시험을 수행하였다.
6-1: 실험대상 병아리 준비
시험은 사용한 1일령 상용 산란계 병아리를 사용했으며 시험 전 동일한 계군의 병아리 10수를 희생하여 NDV와 저병원성 조류인플루엔자 바이러스(H9N2형 AIV)에 대한 혈구응집 억제 항체가를 측정하였다. 그 결과 ND에 대한 모체이행 항체가는 7.3±1.1이였으며 저병원성인 H9N2형 조류인플루엔자에 대한 항체가는 6.0±1.1이였다(표 6). 표 6은 초생추 1일령 모체이행항체(NDV 및 AIV(H9N2) 항체가를 나타낸다.
Chick No. Antigen |
HI titer(log2) | Mean±S.D. | |||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||
NDV(Kr-005) | 7 | 8 | 7 | 7 | 7 | 8 | 9 | 8 | 5 | 7 | 7.3±1.1 |
AIV(H9N2) | 6 | 6 | 7 | 5 | 4 | 5 | 7 | 7 | 7 | 6 | 6.0±1.1 |
공격접종용 바이러스는 H5N6형 고병원성 조류인플루엔자 바이러스(A/broiler duck/Korea/ES2/2016(Clade 2.3.4.4C)): 이후 ES2로 명명) 및 Genotype VII형 강독형 NDV(Kr-005 strain: 이후 Kr-005로 명명) 바이러스를 시험에 사용하였다. 상기 고병원성 조류인플루엔자 공격접종용 바이러스는 2016년 충북 음성 육용오리농장에서 신경증상 및 폐사 등 HPAI 임상증상을 보이는 개체로부터 분리된 것을 사용하였다. 공격접종에 사용된 H5N6형 고병원성 조류인플루엔자 바이러스(A broiler duck Korea ES2 2016 H5N6) 주의 HA 유전자와 NDV(C7d)-H5N6 vector내 HA 유전자 간의 아미노산 서열 상동성은 99.41% 이었다.
55수의 1일령 병아리 중 20수는 대조군으로 하였으며, 나머지는 NDV(C7d)-H5N6 vector를 분무 및 점안으로 15수와 20수씩 각각 106. 0EID50씩 접종하였다. 백신접종 2주 후 모든 병아리에서 채혈하고, 대조군, 분무 접종 그룹, 및 점안 접종그룹에서 각각 5수씩 분리하여 H5N6형의 고병원성 조류인플루엔자 바이러스를 106.0 EID50/0.1ml농도로 100ul 비강으로 공격 접종하였으며, 나머지는 강병원성 NDV인 Kr-005주를 106. 5EID50/0.1ml농도로 100ul씩을 비강을 통해 공격 접종하였다. 고병원성 조류인플루엔자를 공격접종한 그룹은 3,5,7,10일 과 14일째에 인후두 및 총배설강에서 면봉으로 시료를 채취하여 바이러스 분비여부를 측정하였다. 공격접종 2주 후까지 생존한 병아리로 생존율을 계산하였다. 백신접종 2주후 ND 및 HPAI에 대한 HI항체가를 하기 표 7에 나타낸다.
그룹 | 채혈수 | ND 항체가(14dpv) HI titer(Ag:Kr-005) |
AI 항체가(14dpv) HI titer(Ag:ES2-H5N6) |
접안백신 | 10 | 4.3±1.0 | 2.8±0.6 |
분무백신 | 10 | 4.9±1.3 | 3.8±0.6 |
대조군 | 10 | 2.9±0.8 | 0.0 |
백신접종을 수행하고 2주가 경과한 후에 채혈하여 혈구응집억제 시험결과, 실시예 1에서 제조한NDV(C7d)를 벡터로 하여, 국내외에서 유행하는 HPAI clade 2.3.4.4 H5N6의 HA와 NA유전자를 발현한 실시예 5에서 제조한 NDV(C7d)-H5N6를 생백신으로 접종한 경우, 높은 역가 (7.3log2)의 NDV 특이 모체이행항체를 갖는 1일령 병아리에서 모체이행항체를 극복하고 높은 능동면역이 이루어짐을 확인되어(표 7) 탁월한 벡터임이 확인하였다.
H5N6형 고병원성 조류인플루엔자를 공격한 결과를 도 8의 HPAI방어능 평가 결과로 나타낸다. 상기 도 8의 결과로 부터, 대조군은 80% 닭이 폐사한 반면 백신 접종군의 경우 100% 생존하였으며, 바이러스의 배출여부를 측정한 결과 대조군에서는 인후두에서 60%이상에서 배출되는 반면 백신 접종군에서는 5일째 이후는 전혀 배출되지 않았으며, 총 배설강에서의 바이러스배출도 대조군에서 60%의 개체에서 평균 3.2±0.5 log10TCID50/0.1ml의 바이러스의 분비를 보인 반면, 분무백신 접종군에서는 20%의 개체에서 평균 1.6 log10TCID50/0.1ml의 바이러스의 분비를 보여 통계학적으로 유의미한 감소가 있었다(p<0.01)(표 8). 표 8은 2.3.4.4C(ES2,H5N6)HPAIV 바이러스로 공격 접종 후 인후두 및 총 배설강에서의 바이러스 배출 결과로서 공격 접종 이후 날짜별 바이러스 분비하는 병아리 수/전체 병아리 수(viral titer, log10TCID50/0.1ml, 평균±편차)를 나타낸다.
그룹 | 시료 | 3일 | 5일 | 7일 | 10일 | 14일 | 생존/전체 |
점안 백신 |
인후두 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 5/5 |
총배설강 | 0/5 | 2/5 (2.7±0.3) |
0/5 | 0/5 | 0/5 | ||
분무 백신 |
인후두 | 1/5 (1.5) |
0/5 | 0/5 | 0/5 | 0/5 | 5/5 |
총배설강 | 0/5 | 1/5 (1.6)* |
0/5 | 0/5 | 0/5 | ||
대조군 | 인후두 | 2/5 (2.7±0.3) |
3/5 (1.5±0.5) |
0/1 | 0/1 | 0/1 | 1/5 |
총배설강 | 0/5 | 3/5 (3.2±0.5)* |
0/1 | 0/1 | 0/1 |
*상기 표에서 바이러스 배출 억제가 통계학적으로 유의성 있게 나타남(p<0.01)
강병원성 뉴캣슬병 바이러스(Kr-005)를 공격접종한 결과, 대조군의 경우 6.7%만 생존한 반면, 백신 접종군은 모두 100% 생존하여 NDV에 대한 우수한 방어능을 보여 주였다(도 9). 도 9는 NDV에 대한 방어능 평가 결과를 나타낸다.
실시예
7:
NDV에
대한
능동면역능을
갖는 중병아리를 이용한 백신 효능 시험
실시예 4에서 제조한 NDV(C7d)-H5N6 vector를 이용하여 NDV에 대한 능동면역을 갖는 중병아리에서의 백신효력 시험을 수행하였다.
구체적으로, 6주령 SPF닭 20수를 각각 10수씩 2그룹으로 나누고, 10수는 ND 불활화 백신을 1수분씩 접종하고, 10수는 대조군으로 시험하였다. 3주후(9주령)에 두 그룹 모두 NDV(C7d)-H5N6 백신주의 생백신을 1수당 106.5 EID50씩 분무 접종하였으며, 14주령에 NDV(C7d)-H5N6 백신주의 불활화 백신을 1수당 108.0 EID50씩 근육 접종하였으며, 항체가는 매주 채혈하여 측정하였다. 그 항체가 측정결과를 도 10 및 도 11에 나타냈다. 도 10 및 도 11은 NDV가 면역된 닭에 대한 백신 효능시험 결과를 나타낸다.
NDV(C7d)를 벡터로 하여 국내외에서 유행하는 HPAI clade 2.3.4.4 H5N6의 HA와 NA유전자를 발현한 경우, 높은 역가(7.3log2)의 NDV 특이 모체이행항체를 갖는 1일령 병아리뿐만 아니라 능동면역항체가 있는 중병아리에서도 높은 능동면역이 이루어짐을 확인하여 탁월한 벡터임이 확인하였다. Lasota를 backbone으로한 벡터는 NDV에 대한 면역항체가 존재하지 않는 SPF 동물에서는 효과가 확인되었으나, NDV에 대한 면역항체가 있는 상용계에서는 효과가 없다고 알려져 있다(David E. Swayne, 2018, Vaccine 36, p6361~6372). 따라서, 기존 Lasota 백본으로 하는 벡터와 달리, 본 발명에 따른 NDV(C7d)를 벡터는 NDV에 대한 모체이행항체나 능동면역항체를 가지고 있는 상용계에서 이들 항체를 극복하고 면역을 유도할 수 있는 능력을 가지고 있어, NDV 벡터로 사용하기에 매우 우수한 특징을 가지고 있다.
실시예
8:
LPAIV
단백질을 발현하는 재조합
NDV
벡터 제조
8-1:
LPAIV
HA 및 NA 단백질 코딩 유전자 준비
최근 우리나라에서 발생한 저병원성 인플루엔자바이러스를 HA 및 NA 공여주로 선발하였다. GenBank에 등록 되어있는 A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2)바이러스 서열(HA, NA 각 EU253561, EU253562)을 기본으로 HA2 common epitope 인근에 존재하면서 epitope 인식 및 항체 결합을 방해하는 N-glycan을 제거하여 면역원성을 높인 형태로 인공적으로 합성하였다. 상기 HA 유전자의 N-glycan 제거를 위한 HA 코돈 수정에 대해, 구체적으로 인플루엔자 바이러스의 HA2 common epitope 인근의 N-glycan을 제거하기 위해 492번째 아미노산을 기존 Asparagine(N)에서 Threonine(T)으로 치환한 것을 나타낸다. 상기 N-glycan 제거를 위한 HA 아미노산 서열 치환에 대해서는 도 12에 나타낸다. 이에, 상기 변이 HA 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 96 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 97에 나타낸다.
NA 유전자는 등록서열과 동일하게 인공적으로 합성하였으며, NA 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 98 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 99에 나타낸다. NA 유전자는 등록서열과 동일하게 인공적으로 합성하였는데 상기 제작된 NDV 재조합 벡터 도입에 사용되는 각각의 제한효소 인식부위(SbfI: HA, AvrII: NA)를 도입하는 외래 유전자 앞과 뒤에 포함하였다.
8-
2:LPAIV
HA 및 NA 단백질을 발현하는 재조합
NDV
벡터 제작
NDV의 각 유전자들은 개별적인 개시서열과 종결서열이 있어, RNA 의존성 RNA 중합효소에 의해 각각의 mRNA로 전사되는데 transcriptional polarity에 의해 5'쪽 ORF 일수록 전사되는 mRNA가 감소하고 이에 따라 발현되는 단백질량이 저하된다. 재조합 바이러스 증식성에는 영향을 미치지 않는 동시에 NDV 발현벡터 내 조류인플루엔자 HA 및 NA 항원의 발현율을 높이기 위해 발현벡터 내 3'쪽에 위치하는 P-M, M-F 사이에 조류인플루엔자 HA 및 NA 유전자를 도입하였다.
실시예 1에서 제작된 NDV-C7d vector 내에, AIV-HA 및 AIV-NA 항원도입에 필요한 SbfI 및 AvrII 제한효소 인식부위(도 5b 및 서열번호 78)를 부가한 후에, 실시예 8-1에서 제조한 조류인플루엔자 바이러스의 HA 및 NA 단백질의 암호화 폴리뉴클레오티드 서열을 도입하였다. 상기 변이 NDV와 AIV의 HA 및 NA 유전자를 포함하는 키메라 바이러스 (NDV-H9N2) 바이러스의 게놈 전사벡터를 도 13에 나타내며 인플루엔자 HA 및 NA 항원 도입에 필요한 제한효소 위치 및 사용된 제한효소의 정보를 나타낸다.
최종 제작된 NDV-H9N2 바이러스 게놈의 전체 폴리뉴클레오티드 서열은 도 14a 내지 도 14h와 서열번호 100에 나타내었다.
실시예
9:
LPAIV
-HA 단백질을 발현하는 재조합
NDV
바이러스
작출
9-1: 재조합
NDV
바이러스
작출
전체 NDV 유전자를 복제하는 재조합 전장 NDV C7d cDNA vector로부터 LPAIV의 HA 및 NA 단백질 발현하는 ND 바이러스를 도 6a과 같이 작출하였다.
Hep-2 세포주를 6-well 플레이트에 80% 가랑 키워놓은 후, vaccinia T7 바이러스를 감염시켰다. 이후 세포주에 T7 promoter에 의해 개시되어 단백질이 발현되는 pCR-TM-NP, pCR-TM-P, pCR-TM-L 플라스미드 벡터 3개와 T7 promoter에 의해 개시되어 HDV 라이보자임에 의해 스스로 절단되어 정확하고 완전한 전체 키메라 내열성 NDV 게놈을 만들어 낼 수 있는 플라스미드인 NDV C7d-H9N2-HANA pBHA을 준비하였다. 각각을 1:1:0.1:1 비율로 섞어 Lipofectamine TM(Invitrogen. co)과 적정 비율로 혼합하여 트랜스펙션하였다. 이후 1ug/ml의 acetylated trypsin을 첨가하여 내열성 비병원성 재조합 바이러스가 생성되어 감염성을 갖도록 하였다. 2-3일간 37℃ 온도에서 배양한 후 6 well의 세포를 수확하여 11일령의 SPF 발육란에 접종하여 감염성 NDV를 얻었다.
9-2: 주요 항원부위를 이용한
LPAIV
-HA
NDV
바이러스의 확인
실시예 9-1에 따라 작출된 재조합 NDV 바이러스는 도입된 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 및 NA 항원 포함하며, 하기 표 9에 기재된 프라이머 세트를 이용하여 주요 항원부위에 대하여, 45℃/5min-(94℃/20sec-50℃/20sec-72℃/1min 20sec)30cycles 조건으로 6종 RT-PCR 후 폴리뉴클레오티드 서열을 분석하였으며, 그 결과를 도 15에 나타내었다.
Oligonucleotide | 폴리뉴클레오티드 서열 (5'->3’) | 확인 부분 |
서열
번호 |
|
P1 | P433-NDV-C7d-Pgene-2788-F | GGCATGATGAAAATTCTGGAC | P-HA | 101 |
P727-H9N2-HA-757R | TTCGCAATGTCTGGCCTGG | 102 | ||
P2 | P726-H9N2-HA-147F | ATTGCTCCACACAGAGCAC | HA | 103 |
P728-H9N2-HA-1125R | TGTCCGCGGCTATTCCAAC | 104 | ||
P3 | P569-AIV-H9N2-HA-830F | GAAGAATCCTGAAGACCGA | HA, HA-M | 105 |
P550-NDV-C7d-M-3621-R | AGCTCGTGCCTGGGATTGTC | 106 | ||
P4 | P460-NDV-C7d-M-856F | CGGACTAAGCTACTTGCTCCT | NA | 107 |
P570-AIV-H9N2-NA-601R | ACCATGAGCCAATACTGTCA | 108 | ||
P5 | P571-AIV-H9N2-NA-462F | CAGGTGTGTATAGCATGGTC | NA-F | 109 |
P518-NDV-C7d-F-realTime-R | GTGTTCTGTTATATGCCTCC | 110 | ||
P6 | P438-NDV-C7d-Fgene-7536F | TATCCGTCTGACAAGCTCT | F cleavage site | 111 |
P471-NDV C7d+Ampv-8563R | CCAGATCGGACTCTATACAG | 112 |
상기 확인이 완료된 바이러스는 BP-NDV-C7d-AIV-H9N2-HANA라고 명명하고 KCTC 생물자원센터에 2019년 8월 20일에 수탁하여 기탁번호 KCTC13924BP를 수여받았다.
실시예
10:
H9N2
혈청형 바이러스에 대한
항체형성능
평가
실시예 8에서 제조한 NDV(C7d)-H9N62 키메라 바이러스 벡터를 이용하여 SPF 중병아리에서의 백신효력 시험을 수행하였다.
구체적으로, 6주령 SPF닭 20수를 각각 10수씩 2그룹으로 나누고, 10수는 ND 불활화 백신을 1수분씩 접종하고, 10수는 대조군으로 시험하였다. 3주후(9주령)에 두 그룹 모두 NDV(C7d)-H9N2 백신주의 불활화 백신을 1수당 108.5 EID50 씩 근육주사로 접종하였으며, 백신 접종 3주 후 채혈하여 NDV 및 AIV 혈청형 별 항원에 대한 HI 역가를 측정하였다. 그 항체가 측정결과를 도 16에 나타냈다. 도 16은 NDV(C7d)-H9N2 키메라 바이러스로 면역된 닭에 대한 백신 효능시험 결과를 나타낸다. kr005는 바이오포아 병성감정연구소에서 사용하고 있는 바이러스이며 rH9N2, rH5N1, rH5N6, rH5N8 바이러스는 서울대 조류질병학교실로부터 수령한 바이러스로 계태아 및 포유류에서 병원성을 낮춘 재조합 조류인플루엔자 바이러스이다.
NDV(C7d)를 벡터로 하여 최근 우리나라에서 발생한 저병원성 인플루엔자바이러스 H9N2의 HA와 NA유전자를 발현한 경우, 중병아리에서 능동면역이 이루어짐을 확인하여 탁월한 벡터임이 확인하였다. 재조합 인플루엔자바이러스에 비해 ND 벡터에 발현한 재조합바이러스의 경우 종란에서 높은 역가로 생산이 가능하며 AIV의 HA와 NA유전자 외 AIV의 나머지 내부 단백에 대한 유전자를 전혀 가지고 있지 않으므로 DIVA 항원으로 사용 가능함을 확인하였다.
Lasota를 backbone으로한 벡터는 NDV에 대한 면역항체가 존재하지 않는 SPF 동물에서는 효과가 확인되었으나, NDV에 대한 면역항체가 있는 상용계에서는 효과가 없다고 알려져 있다. 따라서, 기존 Lasota 백본으로 하는 벡터와 달리, 본 발명에 따른 NDV(C7d)를 벡터는 NDV에 대한 능동면역항체를 가지고 있는 상용계에서 이들 항체를 극복하고 면역을 유도할 수 있는 능력을 가지고 있어, NDV 벡터로 사용하기에 매우 우수한 특징을 가지고 있다.
<110> BioPoA, Inc.
<120> New castle virus expression system for expressing the H5N6
surface antigen of avian influenza virus subtype H9N2 and avian
vaccine using the same
<130> DPP20193686KR
<160> 112
<170> koPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 553
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant F protein of NDV
<400> 1
Met Gly Ser Lys Pro Ser Thr Arg Ile Pro Ala Pro Leu Met Leu Ile
1 5 10 15
Thr Arg Ile Met Leu Ile Leu Ser Cys Ile Arg Leu Thr Ser Ser Leu
20 25 30
Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys
35 40 45
Ala Val Asn Val Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys
50 55 60
Leu Leu Pro Asn Met Pro Arg Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro
65 70 75 80
Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly
85 90 95
Asp Ser Ile Arg Lys Ile Gln Gly Ser Val Ser Thr Ser Gly Gly Gly
100 105 110
Arg Gln Ala Arg Leu Ile Gly Ala Val Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly
115 120 125
Val Ala Thr Ala Ala Gln Ile Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ile Gln Ala
130 135 140
Lys Gln Asn Ala Ala Asn Ile Leu Arg Leu Lys Glu Ser Ile Ala Ala
145 150 155 160
Thr Asn Glu Ala Val His Glu Val Thr Asp Gly Leu Ser Gln Leu Ser
165 170 175
Val Ala Val Gly Lys Met Gln Gln Phe Val Asn Asp Gln Leu Asn Asn
180 185 190
Thr Ala Arg Glu Leu Asp Cys Ile Lys Ile Thr Gln Gln Val Gly Val
195 200 205
Glu Leu Asn Leu Tyr Leu Thr Glu Leu Thr Thr Val Phe Gly Pro Gln
210 215 220
Ile Thr Ser Pro Ala Leu Thr Gln Leu Thr Ile Gln Ala Leu Tyr Asn
225 230 235 240
Leu Ala Gly Gly Asn Met Asp Tyr Leu Leu Thr Lys Leu Gly Ile Gly
245 250 255
Asn Asn Gln Leu Ser Ser Leu Ile Gly Ser Gly Leu Ile Thr Gly Tyr
260 265 270
Pro Ile Leu Tyr Asp Ser His Thr Gln Leu Leu Gly Ile Gln Val Asn
275 280 285
Leu Pro Ser Val Gly Asn Leu Asn Asn Met Arg Ala Thr Tyr Leu Glu
290 295 300
Thr Leu Ser Val Ser Thr Thr Lys Gly Tyr Ala Ser Ala Leu Val Pro
305 310 315 320
Lys Val Val Thr Gln Val Gly Ser Val Ile Glu Glu Leu Asp Thr Ser
325 330 335
Tyr Cys Ile Glu Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Cys Thr Arg Ile Val Thr
340 345 350
Phe Pro Met Ser Pro Gly Ile Tyr Ser Cys Leu Ser Gly Asn Thr Ser
355 360 365
Ala Cys Met Tyr Ser Lys Thr Glu Gly Ala Leu Thr Thr Pro Tyr Met
370 375 380
Ala Leu Arg Gly Ser Val Ile Ala Asn Cys Lys Ile Thr Thr Cys Arg
385 390 395 400
Cys Thr Asp Pro Pro Gly Ile Ile Ser Gln Asn Tyr Gly Glu Ala Val
405 410 415
Ser Leu Ile Asp Arg His Ser Cys Asn Val Leu Ser Leu Asp Gly Ile
420 425 430
Thr Leu Arg Leu Ser Gly Glu Phe Asp Ala Thr Tyr Gln Lys Asn Ile
435 440 445
Ser Ile Leu Asp Ser Gln Val Ile Val Thr Gly Asn Leu Asp Ile Ser
450 455 460
Thr Glu Leu Gly Asn Val Asn Asn Ser Ile Ser Asn Ala Leu Asp Arg
465 470 475 480
Leu Ala Glu Ser Asn Ser Lys Leu Glu Lys Val Asn Val Arg Leu Thr
485 490 495
Ser Thr Ser Ala Leu Ile Thr Tyr Ile Val Leu Thr Val Ile Ser Leu
500 505 510
Ile Phe Gly Ala Leu Ser Leu Val Leu Ala Cys Tyr Leu Met Tyr Lys
515 520 525
Gln Lys Ala Gln Gln Lys Thr Leu Leu Trp Leu Gly Asn Asn Thr Leu
530 535 540
Asp Gln Met Arg Ala Thr Thr Arg Ala
545 550
<210> 2
<211> 1659
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Mutant F gene of NDV
<400> 2
atgggctcca aaccttctac caggatccca gcacctctaa tgctgatcac tcggattatg 60
ctgatattga gctgtatccg tctgacaagc tctcttgacg gcaggcccct tgcagctgca 120
ggaattgtag taacaggaga taaggcagtc aatgtataca cctcgtctca gacagggtca 180
atcatagtca agttgctccc gaatatgccc agagataagg aggcatgtgc aaaagcccca 240
ttggaggcat ataacagaac actgactact ctgctcactc ctcttggcga ctccatccgc 300
aagatccaag ggtctgtgtc cacgtccgga ggggggagac aggcacgcct tataggtgct 360
gttattggca gtgtagctct tggggttgca acagcggcac agataacagc agctgcggcc 420
ctaatacaag ccaaacagaa tgccgccaac atcctccggc tgaaggagag cattgctgca 480
accaatgagg ctgtgcatga agtcaccgac ggattatcac aactatcagt ggcagttggg 540
aagatgcagc agtttgtcaa tgaccagtta aataatacgg cgcgagaatt ggactgtata 600
aaaatcacac aacaggtcgg tgtagaactc aacctatacc taactgaatt gactacagta 660
ttcgggccac agatcacctc ccctgcatta actcagctga ccatccaggc actttataat 720
ttagctggtg gcaatatgga ttacttatta actaagttag gtataggaaa caatcaactc 780
agctcattaa ttggtagcgg cctgatcact ggttacccta tactgtatga ctcacatact 840
caactcttgg gcatacaagt aaatctgccc tcagtcggga acttaaataa tatgcgtgcc 900
acctatttgg agaccttatc tgtaagtaca accaaaggat atgcctcagc acttgtcccg 960
aaagtagtga cacaagtcgg ttctgtgata gaagagcttg acacctcata ctgtatagag 1020
tccgatctgg atttatattg tactagaata gtgacattcc ccatgtcccc aggtatttac 1080
tcctgtttga gcggcaacac atcagcttgc atgtattcaa agactgaagg cgcactcact 1140
acgccgtata tggcccttag aggctcagtt attgccaatt gtaagataac aacatgcaga 1200
tgtacagacc ctcctggtat catatcgcaa aattacggag aagctgtatc cctgatagat 1260
agacattcat gcaatgtctt atcattagac ggaataactc tgaggctcag tggggaattt 1320
gatgcaactt atcaaaagaa catctcaatt ttagattctc aagtcatcgt gacaggcaat 1380
cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggatagg 1440
ttggcagaaa gcaacagcaa gctagaaaaa gtcaatgtca gactaactag cacatctgct 1500
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aataataccc tcgatcagat gagagccacc acaagagca 1659
<210> 3
<211> 15210
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Genome sequence of BP-NDV C7d
<400> 3
accaaacaga gaatctgtga ggtacgataa aaggcgaaga agcaatcgag atcgtacggg 60
tagaaggtgt gaaccccgag cgcgaggccg aagcttgaac ctgagggaac cttctaccaa 120
tggccgccct ctgccaacta tgtcgtctgt tttcgacgaa tacgagcagc tccttgctgc 180
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ctgtcttcgg attgctgtta gcgaggatgc caacaaacca ctcaggcaag gtgctcttat 360
atccctctta tgctcccatt ctcaggtgat gagaaaccat gttgcccttg cagggaaaca 420
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tctccctcgg gcatgcagca acggtactcc gtttgtcacg gctggggttg aagatgatgc 600
accagaagat atcactgaca ctctagaaag gatcctatct gtccaagtcc aggtatgggt 660
cacggtagca aaggccatga ctgcatatga gacagcagat gagtcagaaa caagaagaat 720
aaataagtat atgcagcaag gtagagttca gaagaagtac atccttcatc ctgtatgcag 780
gagtgcaatt caactcacaa tcagacattc tctggcagtc cgtattttcc tggttagtga 840
gctcaagagg ggccgtaata cagcaggtgg gagctctaca tattacaact tggtcgggga 900
tgtagactca tacatcagaa acaccgggct tactgcattt ttcctaacac tcaaatatgg 960
aatcaatacc aagacgtcag ccctcgcgct cagcagcctc acaggtgata tccaaaaaat 1020
gaaacagctc atgcgtttat atcggatgaa aggtgaaaat gcaccataca tgacattgtt 1080
aggtgacagt gaccagatga gctttgcacc agccgaatat gcacaacttt attcttttgc 1140
catgggcatg gcatcagtct tagataaggg aactggcaag taccaatttg ccagggactt 1200
tatgagcaca tcattctgga gacttggagt agagtatgct caggctcagg gaagtagtat 1260
caatgaggac atggctgctg agttaaaact aaccccggca gcaaggagag gcctggcagc 1320
tgctgcccaa cgagtatctg aagaaatcgg cagcatggac attcctactc aacaagcagg 1380
agtcctcacc gggctcagtg acgaaggccc ccgaactcca cagggcggat caaacaagct 1440
gcaagggcaa ccagatgctg gggatgggga gacccaattc ctggatttca tgagagcagt 1500
ggcgaacagc atgcgggaag cgccaaatcc tgcacagagc accacccatc tagagcctcc 1560
cccaacccct ggggcatccc aagacaacga cactgactgg gggtactgat cgactacacc 1620
cagcctgcct tcacaggatc acatcaaacc ctccgcccaa aaccctccca caccccctga 1680
cccacaaccc cgcacgaccc caccaataaa agctcccccc caccctctcc cccactccca 1740
gccacacgat cccacccacc cgggacaaca caggcacagc tcggccagtc aacaatccgc 1800
ccagagtcca aggtattaga aaaaaatacg ggtagaagag agacatccag agaccaggac 1860
gggtcactaa gttctctgtt ctcccttcta cccggtgagt tagggtgaag atggctactt 1920
ttacagatgc ggagatagat gacatatttg agaccagtgg gactgtcatt gacagcataa 1980
ttacggccca gggcaaatca gctgagaccg tcggaagaag cgcgatcccg cagggcaaga 2040
ccaaagctct aagcacagca tgggagaagc acgggagtgt ccagccacat gccagtcagg 2100
acgcccctga ccaacaagac agaacagaaa aacagccatc cacacctgag caggcgactc 2160
cacacaacaa cccgccgatc acatccactg aaccgccccc cactcaggcc gcaagcgaga 2220
ccagcgacac acagctcaaa accggagcaa gcaactccct tctgtccatg ctcgacaaat 2280
tgagcaataa atcgtctaat gctaaaaagg gcccatggtc gggtcctcaa gaagggcatc 2340
accaatctcc ggcccaacaa cacgggaacc agccgagcta tggaagcaac cagggaagac 2400
cacagcacca ggccaaggcc gtccctggaa accggggcat agacgagaac acagcatatc 2460
atggacaacg gaaggagtca caaccatcag ctggtgcaac ccctcatgcg ccccagtcag 2520
ggcagagcca agacaatatt cctgtacctg tggatcgtgt ccagctacct gccgactttg 2580
cgcaggtgat gatgtctatg atggaggcat tatcacagaa ggtaagtaaa gttgatcatc 2640
agctggacct agtcttgaaa cagacatcct ccattcctat gatgcgatct gaaatccaac 2700
agctcaagac atctgttgcg atcatggaag ctaacttagg catgatgaaa attctggacc 2760
ctggttgtgc taacgtttca tccttaagtg atctccgggc agtagcccga tcccacccag 2820
tcctagtttc aggccccgga gacccatctc cttacgtgac acaagggggt gaaatgacgc 2880
tcaataaact ctcacaaccg gtgcagcacc cctctgaatt gattaagtct gccactgcaa 2940
gcgggcctga catgggagtg gagaaggaca ctgtccgcgc attaatcacc tcgcgcccga 3000
tgcatccgag ctcctcggct aagctcctga gcaagctaga tgcagccagg tcaattgaag 3060
agatcaggaa gatcaaacgc cttgcgctga atggttgatg gccatcacaa ctcataacag 3120
gctcccgtca cttcagcgtc acacggaatc ccctgggggc ccccccttgc aaatccacgc 3180
ttcaacaccc caaacaacag ccctctctca ccccccccaa tcccccgaat gatagcacaa 3240
ctgcaaccaa tccagcagca ttagaaatta agaaaaaata cgggtagaat caaagtgcct 3300
cgattcctgc aggatggact catccaggac aatcgggctg tactttgatt ctgccctccc 3360
ttccagcagc ctattagcat ttccgattat cttacaagac acaggagacg ggaagaaaca 3420
aatcacccca caatacagga tccagcgtct tgattcgtgg acagacagta aggaagactc 3480
ggtatttatc accacctacg ggttcatctt tcaagttggg aatgaagaag ccaccgtcgg 3540
tgtgatcaat gacaatccca ggcacgagct actctcttcc gcaatgctct gcttagggag 3600
tgtcccgaac aacggagatc ttgttgagct ggcgagagcc tgcctcacca tggtggtaac 3660
ctgcaagaag agtgcaacta acactgagag aatagtcttc tcagtagtgc aggcacctcg 3720
ggtgctgcaa aattgtatgg ttgtgtcgaa taggtactca tcagtgaatg cagtgaagca 3780
tgtgaaggcg cccgaaaaga tccctgggag cggaacccta gagtataaag tgaattttgt 3840
ctctttgact gtggtgccga gaagggatgt ctacaggatc ccaactgcag tattgaaagt 3900
gtctggctca agcctgtaca atcttgcgct caatgtcact attgatgtgg acgtggatcc 3960
gaagagcccg ctagtcaaat ccctttctaa gtctgatagc ggatactatg cgaatctttt 4020
cctgcatatc gggcttatgt ccactgtaga taagagagga aagaaagtga catttgacaa 4080
gatagaggaa aagataagga gactcaatct atctgttggg ctcagtgatg tgctcggacc 4140
ctctgtgctt gtaaaggcga gaggtgcacg gactaagcta cttgctcctt tcttctctag 4200
cagtgggaca gcctgctatc ctatagcaaa tgcctctccc caggttgcca agatactctg 4260
gagccagacc gcgcacctgc ggagcgtgaa agtcatcatt caagccggca ctcagcgtgc 4320
tgtcgcagtg accgctgatc atgaggtaac ctccactaag atagagagga ggcacgccat 4380
tgctaaatac aatcctttca ggaaataagt tgcatcccta agactgcagt tcacctgctt 4440
tcctgaatca ccatgacacc agataatgat ccatctcgac tgcttatagt tagttcacct 4500
gtctagcaaa ttagaaaaaa cacgggtaga agagtctgga tcccgaccgg cacattcagg 4560
acctaggatg ggctccaaac cttctaccag gatcccagca cctctaatgc tgatcactcg 4620
gattatgctg atattgagct gtatccgtct gacaagctct cttgacggca ggccccttgc 4680
agctgcagga attgtagtaa caggagataa ggcagtcaat gtatacacct cgtctcagac 4740
agggtcaatc atagtcaagt tgctcccgaa tatgcccaga gataaggagg catgtgcaaa 4800
agccccattg gaggcatata acagaacact gactactctg ctcactcctc ttggcgactc 4860
catccgcaag atccaagggt ctgtgtccac gtccggaggg gggagacagg cacgccttat 4920
aggtgctgtt attggcagtg tagctcttgg ggttgcaaca gcggcacaga taacagcagc 4980
tgcggcccta atacaagcca aacagaatgc cgccaacatc ctccggctga aggagagcat 5040
tgctgcaacc aatgaggctg tgcatgaagt caccgacgga ttatcacaac tatcagtggc 5100
agttgggaag atgcagcagt ttgtcaatga ccagttaaat aatacggcgc gagaattgga 5160
ctgtataaaa atcacacaac aggtcggtgt agaactcaac ctatacctaa ctgaattgac 5220
tacagtattc gggccacaga tcacctcccc tgcattaact cagctgacca tccaggcact 5280
ttataattta gctggtggca atatggatta cttattaact aagttaggta taggaaacaa 5340
tcaactcagc tcattaattg gtagcggcct gatcactggt taccctatac tgtatgactc 5400
acatactcaa ctcttgggca tacaagtaaa tctgccctca gtcgggaact taaataatat 5460
gcgtgccacc tatttggaga ccttatctgt aagtacaacc aaaggatatg cctcagcact 5520
tgtcccgaaa gtagtgacac aagtcggttc tgtgatagaa gagcttgaca cctcatactg 5580
tatagagtcc gatctggatt tatattgtac tagaatagtg acattcccca tgtccccagg 5640
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actcactacg ccgtatatgg cccttagagg ctcagttatt gccaattgta agataacaac 5760
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gatagataga cattcatgca atgtcttatc attagacgga ataactctga ggctcagtgg 5880
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ggataggttg gcagaaagca acagcaagct agaaaaagtc aatgtcagac taactagcac 6060
atctgctctc attacctata ttgttctaac tgtcatttcc ctaattttcg gtgcacttag 6120
tctggtttta gcgtgttacc tgatgtacaa acagaaggca caacagaaga ccttgctatg 6180
gcttgggaat aataccctcg atcagatgag agccaccaca agagcatgaa tgcagataag 6240
aggtggacag atacccaaca gcagcctgtg tgtcaattcc gataacctgt caagtagaag 6300
acttaagaaa aaattactgg gaacaagcaa ccaaagagca atgcacgggt agaacggtca 6360
gaggagccac ccttcaatcg aaaattaggc ttcacaacat tcgttctacc acatcaccaa 6420
caacaagagt caatcatgga ccgcgcggtt aacagagtcg tgctggagaa tgaggaaaga 6480
gaagcaaaga acacatggcg cctagttttc cggatcgcag tcttactttt aatggtaatg 6540
actctagcta tctccgcggc tgccctggca cacagcatgg gggccagtac gccgcacgac 6600
ctcgcaggca tatcgactgt gatctccaag acagaagaca aggttacgtc tttactcagt 6660
tcaagtcaag atgtgataga taggatatac aagcaggtag ctcttgaatc cccgctggca 6720
ctactaaaca ccgaatctat aattatgaat gcaataacct ctctttctta tcaaattaac 6780
ggggctgaga acaatagcgg atgtggtgcg cctgttcatg acccagatta tatcgggggg 6840
ataggcaaag aactcatagt ggacgacatc agtgatgtca catcatttta tccttctgca 6900
tatcaagaac acttgaattt catcccggcg cctactacgg gatccggttg cactcggata 6960
ccctcatttg acatgagcac cacccattat tgttatactc acaatgtgat actatctggt 7020
tgcagagatc actcacactc acatcaatac ttagcacttg gtgtgcttcg gacatctgca 7080
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gtggcaaatt acccgggagt gggaggaggg tcttttattg acggccgtgt atggttccca 7380
gtttacggag ggctcaaacc caattcaccc agtgacgctg cacaagaagg gaaatatgta 7440
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atcaaagtgt caacatccct gggtaaggac ccggtgctga ctattccacc taatacaatc 7620
acactcatgg gagctgaagg cagaatcctc acagtaggga catctcactt cttgtaccaa 7680
cgagggtctt catatttctc ccctgcctta ttgtatccca tgacagtaaa taacaaaacg 7740
gctacactcc atagtcctta catgtttaat gctttcactc ggccaggtag tgtcccttgc 7800
caggcatcag caagatgccc caactcatgc attactgggg tctataccga tccatatccc 7860
ttaatcttcc ataggaatca tactctacga ggggtcttcg ggacgatgct tgatgatgaa 7920
caagcgaggc ttaaccccgt atctgcagta tttgacaaca tatctcgcag tcgtgtcacc 7980
cgggtgagtt caagcagcac caaggcagca tacacgacat cgacatgttt taaagttgtc 8040
aagaccaata aagcttattg tcttagtatc gcagaaatat ccaataccct attcggggaa 8100
tttaggatcg ttcccttact agttgagatc ctcaaggatg atagagttta agaagctaga 8160
cgtggccgat tgagccaatc ataggatggt tgggaagacg acaccgcgcc aatcatctcc 8220
cataatgctt agagtcaagc tgaatattaa cataagccag gatcccgtgt tgtcgggcaa 8280
ccacaatctg acaatgctga tatgattatt ctgagtctcg cccactgtca ctttattaag 8340
aaaaaacaca agaagcattg acatataagg gaaaacaacc aacaagggag aacacgggta 8400
ggacatggcg ggctccggtc ccgaaagggc agagcaccag atcatcctac cagagtcaca 8460
tctatcctct ccattggtca agcacaaatt gctatactac tggaaattga ctgggctacc 8520
gcttcctgat gaatgcgact ttgaccatct cattatcagc aggcaatgga agagaatact 8580
ggagtcggcc actcctgaca cagagagaat gataaaactc gggcgggcag tgcaccagac 8640
tctcaaccac aattccaaga taaccggagt gctccatccc aggtgtttag aagaactggc 8700
tagtattgag gtcccagatt caactaacaa attccggaag attgaaaaga agatccagat 8760
tcacaacaca aggtatggag acctgttcac aaagctgtgc acgcatgttg agaagaaatt 8820
gctaggatcg tcccggtcta ataatgtccc acgatcagag gaattcagta gtatccgtac 8880
agatccggca ttctggtttc actcaaaatg gtccagagcc aagttcgcgt ggctccatat 8940
aaaacaagtc caaaggcatc tgattgtagc agcaaggaca aggtctgcag tcaacaagtt 9000
agtaacatta agtcataaga taggccacgt ctttgttact cctgagcttg tcattgtgac 9060
acatacagat gagaacaagt tcacatgcct cacccaggaa cttgtattga tgtatgcgga 9120
tatgatggaa ggcagggaca tggtcaatat aatatcttct acagcagcac atctcaggaa 9180
cctatccgag aaaattgatg atattctgcg gttagtagat gctctggcaa aggacttagg 9240
taatcaagtc tatgatgttg tagcattaat ggagggattc gcatacggtg ccgttcagct 9300
gcttgaacca tcaggtacat ttgcaggaga tttcttcgca tttaacctac aggagctcaa 9360
aaacacgtta atcgaactcc tcccaaataa tatagcggaa gcagtaactc acgctattgc 9420
cactgtattc tccggcttag aacagaatca agcagctgag atgttgtgct tgctgcgttt 9480
gtggggtcat ccattgcttg agtctcgtag tgcagcaaga gcagtcagga gccagatgtg 9540
cgcaccaaag atggtagact tcgatatgat cctccaggta ttatctttct ttaaaggaac 9600
aatcatcaat ggatacagaa agaagaactc aggtgtgtgg ccgcgtgtca aagtagatac 9660
aatatatgga aatatcattg ggcagctaca tgctgattca gcagagatct cacatgatgt 9720
catgttgagg gagtacaaga gtttatctgc tcttgaattt gagccatgta tagattatga 9780
ccctgttacc aatctaagca tgttcctaaa agacaaggca atcgcacatc ctagtgataa 9840
ctggctcgcc tcatttaggc ggaacctact ctctgaggac cagaagaaac agataaaaga 9900
ggcaacttca actaaccgcc tcctgataga gttcttagaa tcaaatgatt ttgatccata 9960
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tctatcaaga gtcccaaatg atgatatata tattgtcagt gctagagggg gcattgaggg 10560
actctgtcag aagctatgga cgatgatctc aattgctgca atccaacttg ctgcagcaag 10620
atctcattgt cgagttgcct gcatggtaca aggtgacaat caagtaatag ctgtaacgag 10680
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tgaaaccatt agatcagaca cattcttcat atacagtaaa cgaatattca aagatggaac 10860
aatactcagt caggtcctca aaaattcatc taaattggtg ctaatatcag gtgaccttag 10920
cgaaaacact gtaatgtcct gtgccaacat tgcatccact gtagcacgac tatgtgagaa 10980
tgggcttcct aaggacttct gttactattt gaactaccta atgagttgcg tgcagacata 11040
ctttgattcg gagttttcta ttacccacag ctcgcagtca gattccaacc aatcctggat 11100
cgaggatatc tctttcgtac actcatacgt attaacccct gcccagctgg ggggactgag 11160
caaccttcaa tactcaaggc tctacacaag gaatattggt gacccaggga ccactgcttt 11220
tgcagaggtc aagcgactag aagcagtggg gttgttgagt cccagcatca tgactaacat 11280
cttaaccagg ccacctggca atggagattg ggccagccta tgcaacgacc catactcttt 11340
taattttgag actgttgcaa gcccaaatat tgtcctcaag aaacatacac agaaagtcct 11400
atttgagaca tgttcaaacc ccttattatc cggggtacat acagaggaca atgaggcaga 11460
agagaaagca ttggctgaat tcttactcaa tcaagaagtg attcacccac gtgtcgcaca 11520
tgctatcatg gaagcaagct ctgtgggtag gagaaagcaa attcaagggc ttgttgacac 11580
aacgaacact gtgattaaga ttgcactgac taggaggccc ctcggtatca aaagactgat 11640
gcggataatc aattactcga gcatgcatgc aatgttgttc agagatgata ttttcttatc 11700
caatagatcc aaccacccat tagtttcttc taatatgtgc tcgctgacgc tagcagatta 11760
tgcccggaac agaagctggt cacccctgac agggggcagg aaaatactgg gtgtatccaa 11820
ccccgatacc atagaacttg tggagggaga gattctcagc gtcagtggag ggtgcacaaa 11880
atgtgacagc ggagatgagc agtttacttg gttccatctt ccaagcaata tagagctgac 11940
tgatgacacc agcaaaaatc ccccgatgag agtgccatat ctcgggtcga agactcaaga 12000
gaggagagcc gcctcgcttg cgaaaatagc ccacatgtca ccacatgtga aagcagcact 12060
aagggcatca tccgtgttaa tctgggctta tggggacaac gaagtgaact ggactgctgc 12120
tcttaatatt gcaaggtctc gatgcaacat aagctcagag tatcttcggc tattgtcacc 12180
cctgcccaca gctgggaatc tccaacatag attggatgat ggcataaccc agatgacatt 12240
tacccctgca tctctctaca gagtgtcgcc ttacgttcac atatccaatg attctcaaag 12300
gttattcacc gaagaagggg tcaaagaggg aaacgtggtt taccaacaaa ttatgctctt 12360
ggggttatct ctaattgaat cactcttccc aatgacaaca accagaacat atgatgagat 12420
cacattacac ctccacagta aatttagctg ctgtatccga gaagcgcctg ttgcggttcc 12480
tttcgagctc ttcgggctgg caccggaatt aaggatggta acctcaaata agttcatgta 12540
tgatcctagc cctatatcag agagggattt tgcgagactt gacttagcta tcttcaagag 12600
ttatgagctt aatttggaat catattccac gctggagcta atgaacattc tttcgatatc 12660
tagcgggaaa ttgattggcc aatccgtggt ttcttatgat gaagatactt ctataaagaa 12720
tgatgctata atagtgtatg acaacacacg aaattggatt agtgaggcac agaactcaga 12780
tgtggtccgc ctgtttgagt atgcagcact cgaagtgctc cttgactgtg cttatcaact 12840
ctactatctg agggtaaggg gtctaaacaa catcgtccta tacatgaatg acttatataa 12900
gaacatgcca gggatcctac tctccaatat tgcggccacg atatcccacc ccctcattca 12960
ctcaaggttg aatgcagtag gtctaattaa tcatgacggg tcacaccagc ttgcagatat 13020
agacttcgtc gaggtgtctg caaaattgtt agtctcttgc actcgacgcg tggtctcagg 13080
cttatatgca gggaataagt acgatctgct gtttccatct gtcttagatg ataacctgaa 13140
tgagaagatg cttcaactga tttcccggtt atgctgtctg tacacagtgc tctttgctac 13200
aacaagagaa atcccaaaaa taaggggtct atcggcagaa gagaaatgct caatactcac 13260
tgagtatcta ctgtcagatg ctgtaaaacc attgcttagg cccgaacaag tgagttctat 13320
catgtctccc aacataatca cgttcccagc caatctatat tacatgtcta ggaagagcct 13380
taatttgatc agagaacgag aggacagaga tactatcttg tcattgttgt tccctcagga 13440
accactgctt gagcttcgcc cagtacgaga cattggtgct cgagtgaaag acccgtttac 13500
ccggcaaccc gcatcattca tacaagagct agatctgagt gccccagcaa ggtacgacgc 13560
atttacactg agtaaggttt gcttcgagca tacattaccg aacccaaagg aagattacct 13620
agtacggtac ttgttcagag gaatagggac tgcttcatct tcttggtata aggcatctca 13680
tcttctatcc gtacctgagg tcaggtgtgc aagacatggg aactccttat acttagcgga 13740
aggaagcgga gccatcatga gtcttcttga attgcatata ccacatgaga ctatctatta 13800
caatacactt ttctcgaatg agatgaaccc tccacagcga catttcggac ctacaccaac 13860
acagtttcta aactcggtcg tttataggaa tctacaagcg gaagtgccat gtaaagatgg 13920
atatgtccag gagttctgcc cattatggag agagaatgca gaagaaagtg acctgacctc 13980
agataaggca gttggatata tcacatctgt ggtaccctac aggtctgtat cattactaca 14040
ttgtgacatt gagattcctc cagggtccaa tcaaagctta ttagatcaac tggctactaa 14100
tttatccctg attgccatgc attctgtgag ggagggcggg gtagtgatca tcaaagtact 14160
gtatgcaatg gggtactact tccatttact catgaattta ttcactccat gttccacgaa 14220
aggatataca ctctccaatg gctatgcctg tagaggggat atggagtgtt acctgatatt 14280
cgttatgggc tgcttaggcg ggcccacttt cgtgcacgaa gtggtaagga tggcaaaaac 14340
tctaatacaa cgacacggta cacttctatc taaatcagat gaaatcacat tgactaagct 14400
atttacctca cagcagcgtc gtgtaacaga tctcctatcc agccctttac cgaagctaat 14460
gaagctctta agtgaaaata ttgatgctgc actaattgaa gccgggggac agcccgtccg 14520
tccattctgt gcagaaagtt tggtgagcac actaacaaat atgacccaga caactcagat 14580
cattgccagc cacattgaca cagtcattcg gtccgtgatt tacatggagg ctgagggtga 14640
cctcgccgac acagtgttct tatttactcc ttacaatcta tccacagacg gtaaaaagag 14700
aacatcactt aagcagtgca ccaaacagat cttggaagtc acaatactgg gtctcagagc 14760
caaagatatc aataaagtag gtgatgtaat cagcttagta ctcagaggtg cggtttccct 14820
agaggacctc atcccattaa ggacatacct gaagcgcagt acctgcccta aatacctgaa 14880
agcggtcctg ggtattacta aactcaaaga aatgttcaca gatacctcgt tactgtactt 14940
gactcgcgct caacaaaaat tctacatgaa aaccataggt aatgctgcca agggatatta 15000
cagtaataat gactcttaaa ggcaatcgta cgccaatcag ttatcttctt agctgatgac 15060
tccctcactg acttaattat accagattag aaaaaagtta aattccgact ctttggaact 15120
cgtattcgga ttcagttagt taactttaag caaaaatgcg caaagtcgtc tctaattata 15180
gttatgtcat tcaccaaatc tctgtttggt 15210
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<213> Artificial Sequence
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<223> T7-pro-new
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<223> NDVcomF
<400> 68
atacacctcr tcycagacag 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NDVcomR
<400> 69
tgccactgmt agttgygata 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P480-NDV C7d-P-2268-F
<400> 70
agaccagcga cacacagctc 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P550-NDV-C7d-M-3621-R
<400> 71
agctcgtgcc tgggattgtc 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P436-NDV-C7d-M-5168
<400> 72
caatcttgcg ctcaatgtca 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P471-NDV C7d+Ampv-8563R
<400> 73
ccagatcgga ctctatacag 20
<210> 74
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P753-NDV C7d-F 912F
<400> 74
gaccttatct gtaagtaca 19
<210> 75
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P754-NDV C7d-HN-62R
<400> 75
catgtgttct ttgcttctc 19
<210> 76
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P482-NDV C7d-HN-6401-F
<400> 76
gaacggtcag aggagccac 19
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P755-NDV C7d-HN gene end-R
<400> 77
gctcaatcgg ccacgtctag 20
<210> 78
<211> 1830
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of AgeI-(SbfI-NDV M-AvrII)-BstZITI region
<400> 78
accggtgcag cacccctctg aattgattaa gtctgccact gcaagcgggc ctgacatggg 60
agtggagaag gacactgtcc gcgcattaat cacctcgcgc ccgatgcatc cgagctcctc 120
ggctaagctc ctgagcaagc tagatgcagc caggtcaatt gaagagatca ggaagatcaa 180
acgccttgcg ctgaatggtt gatggccatc acaactcata acaggctccc gtcacttcag 240
cgtcacacgg aatcccctgg gggccccccc ttgcaaatcc acgcttcaac accccaaaca 300
acagccctct ctcacccccc ccaatccccc gaatgatagc acaactgcaa ccaatccagc 360
agcattagaa attaagaaaa aatacgggta gaatcaaagt gcctcgattc ctgcaggatg 420
gactcatcca ggacaatcgg gctgtacttt gattctgccc tcccttccag cagcctatta 480
gcatttccga ttatcttaca agacacagga gacgggaaga aacaaatcac cccacaatac 540
aggatccagc gtcttgattc gtggacagac agtaaggaag actcggtatt tatcaccacc 600
tacgggttca tctttcaagt tgggaatgaa gaagccaccg tcggtgtgat caatgacaat 660
cccaggcacg agctactctc ttccgcaatg ctctgcttag ggagtgtccc gaacaacgga 720
gatcttgttg agctggcgag agcctgcctc accatggtgg taacctgcaa gaagagtgca 780
actaacactg agagaatagt cttctcagta gtgcaggcac ctcgggtgct gcaaaattgt 840
atggttgtgt cgaataggta ctcatcagtg aatgcagtga agcatgtgaa ggcgcccgaa 900
aagatccctg ggagcggaac cctagagtat aaagtgaatt ttgtctcttt gactgtggtg 960
ccgagaaggg atgtctacag gatcccaact gcagtattga aagtgtctgg ctcaagcctg 1020
tacaatcttg cgctcaatgt cactattgat gtggacgtgg atccgaagag cccgctagtc 1080
aaatcccttt ctaagtctga tagcggatac tatgcgaatc ttttcctgca tatcgggctt 1140
atgtccactg tagataagag aggaaagaaa gtgacatttg acaagataga ggaaaagata 1200
aggagactca atctatctgt tgggctcagt gatgtgctcg gaccctctgt gcttgtaaag 1260
gcgagaggtg cacggactaa gctacttgct cctttcttct ctagcagtgg gacagcctgc 1320
tatcctatag caaatgcctc tccccaggtt gccaagatac tctggagcca gaccgcgcac 1380
ctgcggagcg tgaaagtcat cattcaagcc ggcactcagc gtgctgtcgc agtgaccgct 1440
gatcatgagg taacctccac taagatagag aggaggcacg ccattgctaa atacaatcct 1500
ttcaggaaat aagttgcatc cctaagactg cagttcacct gctttcctga atcaccatga 1560
caccagataa tgatccatct cgactgctta tagttagttc acctgtctag caaattagaa 1620
aaaacacggg tagaagagtc tggatcccga ccggcacatt caggacctag gatgggctcc 1680
aaaccttcta ccaggatccc agcacctcta atgctgatca ctcggattat gctgatattg 1740
agctgtatcc gtctgacaag ctctcttgac ggcaggcccc ttgcagctgc aggaattgta 1800
gtaacaggag ataaggcagt caatgtatac 1830
<210> 79
<211> 563
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of H5N6 AIV-HA
<400> 79
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Val Lys Ser
1 5 10 15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
20 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
35 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Arg Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys
50 55 60
Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65 70 75 80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Arg Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
85 90 95
Glu Arg Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Leu Asn
100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
115 120 125
Lys Thr Leu Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Pro Asn His Glu Thr Ser
130 135 140
Gly Val Ser Ala Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Val Pro Ser Phe Phe Arg
145 150 155 160
Asn Val Val Trp Leu Thr Lys Lys Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile Lys
165 170 175
Met Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gly Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp Gly
180 185 190
Ile His His Ser Asn Asn Ala Ala Glu Gln Thr Asn Leu Tyr Lys Asn
195 200 205
Pro Thr Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu
210 215 220
Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Gln Val Asn Gly Gln Gln Gly Arg
225 230 235 240
Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile His Phe
245 250 255
Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile Val
260 265 270
Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Met Glu Tyr Gly His
275 280 285
Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser Met
290 295 300
Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys Tyr
305 310 315 320
Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser Pro
325 330 335
Leu Ala Ser Gly Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu
340 345 350
Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser
355 360 365
Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Arg Glu Ser Thr Gln Lys
370 375 380
Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met
385 390 395 400
Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg
405 410 415
Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val
420 425 430
Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr
435 440 445
Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg
450 455 460
Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu
465 470 475 480
Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Arg Thr Gly
485 490 495
Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu
500 505 510
Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr Tyr Gln Ile Leu
515 520 525
Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile Ile Val
530 535 540
Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg
545 550 555 560
Ile Cys Ile
<210> 80
<211> 1692
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of H5N6 AIV-HA
<400> 80
atggagaaaa tagtgcttct tcttgcagtg gttagccttg ttaaaagtga tcagatttgc 60
attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca cgataatgga aaaaaacgtc 120
actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaggct ctgcgatctg 180
aatggagtga aacctctgat tttaaaggat tgtagtgtag ctggatggct tcttggaaac 240
ccaatgtgcg acgaattcat cagagtgccg gaatggtctt acatagtgga gagggctaac 300
ccagccaatg atctctgtta cccagggaac ctcaatgact atgaagaact gaaacaccta 360
ttgagcagaa taaatcattt tgagaagact ctgatcatcc ccaagagttc ttggcccaat 420
catgaaacat caggggtgag cgcagcatgc ccataccagg gagtgccctc ctttttcaga 480
aatgtggtat ggcttaccaa gaagaacgat gcatacccaa caataaagat gagctacaat 540
aataccaatg gggaagatct tttgatactg tgggggattc atcattccaa caatgcagca 600
gagcagacaa atctctataa aaacccaacc acctatgttt ccgttgggac atcaacatta 660
aaccagagat tggtgccaaa aatagctact agatcccaag taaacgggca acaaggaaga 720
atggatttct tctggacaat tttaaaaccg aatgatgcaa tccactttga gagtaatgga 780
aattttattg ctccagaata tgcatacaaa atagtcaaga aaggggactc aacaattatg 840
aaaagtgaaa tggaatatgg ccactgcaac accaaatgtc aaactccaat aggggcgata 900
aattctagta tgccattcca caatatacac cctctcacca tcggggagtg ccccaaatac 960
gtgaaatcaa acaaattagt ccttgcgact ggactcagaa atagtccttt agcatcaggt 1020
aggggactat ttggagctat agcagggttc atagagggag gatggcaagg aatggtagat 1080
ggttggtatg ggtaccacca tagcaatgaa caggggagtg ggtacgctgc agacagagaa 1140
tccacccaaa aggcaataga tggagttacc aataaggtca actcgataat cgacaaaatg 1200
aacactcaat ttgaggccgt tggaagggag tttaataact tagaacggag aatagagaat 1260
ttaaataaga aaatggaaga cggattccta gatgtctgga cttacaatgc tgaactttta 1320
gttctcatgg aaaatgagag aactttagat tttcacgatt caaatgtaaa aaacctttat 1380
gacaaagtcc gactacagct tagggataat gcaaaggagc taggtaatgg ttgtttcgag 1440
ttctatcata aatgtgataa tgaatgtatg gaaagtgtaa gaaccgggac gtatgactat 1500
ccccagtatt cagaagaagc aagattaaaa agggaagaaa taagcggagt gaaattggaa 1560
tcaataggaa cttaccaaat actgtcaatt tattcaacag tggcgagttc cctagcactg 1620
gcaatcattg tggctggtct atctttatgg atgtgctcca atgggtcgtt acaatgcaga 1680
atttgcattt aa 1692
<210> 81
<211> 459
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of H5N6 AIV-NA
<400> 81
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Thr Cys Ile Ser Ala Thr Gly Val Thr
1 5 10 15
Leu Ser Val Val Ser Leu Leu Ile Gly Ile Thr Asn Leu Gly Leu Asn
20 25 30
Ile Gly Leu His Tyr Lys Val Ser Asp Ser Thr Thr Met Asn Ile Pro
35 40 45
Asn Met Asn Glu Thr Asn Pro Thr Thr Thr Asn Ile Thr Asn Ile Ile
50 55 60
Met Asn Lys Asn Glu Glu Arg Thr Phe Leu Lys Leu Thr Lys Pro Leu
65 70 75 80
Cys Glu Val Asn Ser Trp His Ile Leu Ser Lys Asp Asn Ala Ile Arg
85 90 95
Ile Gly Glu Asp Ala His Ile Leu Val Thr Arg Glu Pro Tyr Leu Ser
100 105 110
Cys Asp Pro Gln Gly Cys Arg Met Phe Ala Leu Ser Gln Gly Thr Thr
115 120 125
Leu Arg Gly Gln His Ala Asn Gly Thr Ile His Asp Arg Ser Pro Phe
130 135 140
Arg Ala Leu Ile Ser Trp Glu Met Gly Gln Ala Pro Ser Pro Tyr Asn
145 150 155 160
Thr Arg Val Glu Cys Ile Gly Trp Ser Ser Thr Ser Cys His Asp Gly
165 170 175
Ile Ser Arg Met Ser Ile Cys Ile Ser Gly Pro Asn Asn Asn Ala Ser
180 185 190
Ala Val Val Trp Tyr Arg Gly Arg Pro Val Thr Glu Ile Pro Ser Trp
195 200 205
Ala Gly Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys His Lys
210 215 220
Gly Ile Cys Pro Val Val Met Thr Asp Gly Pro Ala Asn Ser Lys Ala
225 230 235 240
Ala Thr Lys Ile Ile Tyr Phe Lys Glu Gly Lys Ile Gln Lys Thr Glu
245 250 255
Glu Leu Gln Gly Asn Ala Gln His Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Gly
260 265 270
Ala Ala Gly Met Ile Lys Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ala
275 280 285
Asn Arg Pro Ile Ile Thr Ile Asp Pro Glu Met Met Thr His Thr Ser
290 295 300
Lys Tyr Leu Cys Ser Lys Ile Leu Thr Asp Thr Ser Arg Pro Asn Asp
305 310 315 320
Pro Thr Asn Gly Asn Cys Asp Ala Pro Ile Thr Gly Gly Ser Pro Asp
325 330 335
Pro Gly Val Lys Gly Phe Ala Phe Leu Asp Gly Glu Asn Ser Trp Leu
340 345 350
Gly Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ser Arg Ser Gly Tyr Glu Met Leu Lys
355 360 365
Val Pro Asn Ala Glu Ile Asp Thr Gln Ser Gly Pro Ile Ser Tyr Gln
370 375 380
Leu Ile Val Asn Asn Gln Asn Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Ile
385 390 395 400
Asp Tyr Trp Ala Asn Lys Glu Cys Phe Asn Pro Cys Phe Tyr Val Glu
405 410 415
Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys Glu Ser Gly Val Leu Trp Thr Ser Asn
420 425 430
Ser Met Val Ala Leu Cys Gly Ser Arg Glu Arg Leu Gly Ser Trp Ser
435 440 445
Trp His Asp Gly Ala Glu Ile Ile Tyr Phe Lys
450 455
<210> 82
<211> 1380
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of H5N6 AIV-NA
<400> 82
atgaatccaa atcaaaagat aacatgcatt tcagcaacag gagtaacact atcagtagta 60
agcctgctaa taggaatcac caatttgggc ctaaatatcg gactacacta caaagtgagt 120
gattcaacaa ctatgaacat tccaaacatg aatgagacca acccaacaac aacaaacatc 180
actaacatta taatgaataa gaacgaagaa agaacatttc tcaaattgac caaaccgcta 240
tgtgaagtca actcatggca cattctatcg aaagacaatg caataagaat aggtgaggat 300
gctcatatac tggtcacaag ggaaccttac ctgtcctgtg atccacaagg ctgcaggatg 360
tttgctctga gtcagggcac aacactcaga gggcaacatg cgaatggaac catacatgat 420
aggagcccat ttcgagctct tataagttgg gaaatgggtc aggcacccag tccatacaac 480
actagggtcg aatgcatagg atggtcaagc acgtcatgcc atgatggcat atcaaggatg 540
tcaatatgca tatcagggcc gaataacaat gcatcggcag tggtgtggta ccgggggaga 600
ccagtaacag aaatcccatc atgggcaggg aacattctta ggactcaaga atcagaatgt 660
gtgtgccata aaggaatctg cccagtggtc atgacagatg gtccagcaaa cagcaaggca 720
gcaactaaga taatctactt caaagaggga aagatacaaa aaactgaaga actgcaaggg 780
aacgctcaac acatcgaaga atgttcatgc tacggagcag cagggatgat caaatgtgta 840
tgcagagaca attggaaggg ggcaaataga ccaataatca ctatagatcc cgaaatgatg 900
acccacacaa gcaaatactt gtgttcgaaa atcttaaccg acacaagtcg tcctaatgac 960
cccaccaatg ggaactgtga tgcgccaata acaggaggga gcccagaccc aggggtaaaa 1020
gggtttgcat tcctagacgg ggagaattca tggcttggaa ggacaattag caaagactcc 1080
agatcagggt acgaaatgtt aaaggtccca aatgcagaaa tcgacactca atcagggcca 1140
atctcatacc agctgattgt caacaaccaa aattggtcag gatactcagg ggcattcata 1200
gactactggg caaacaagga gtgcttcaat ccttgttttt atgtggagct aatcaggggg 1260
agacccaaag agagtggtgt actgtggact tccaatagca tggtagctct ctgtggatcc 1320
agggagcgat tgggatcatg gtcctggcat gatggtgcag aaatcatcta ctttaagtag 1380
1380
<210> 83
<211> 18348
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Genome sequence of BP-NDV C7d-H5N6 chimera virus
<400> 83
accaaacaga gaatctgtga ggtacgataa aaggcgaaga agcaatcgag atcgtacggg 60
tagaaggtgt gaaccccgag cgcgaggccg aagcttgaac ctgagggaac cttctaccaa 120
tggccgccct ctgccaacta tgtcgtctgt tttcgacgaa tacgagcagc tccttgctgc 180
tcagacccgc cctaacggag ctcatggagg gggagagaaa gggagcactt taaaggttga 240
ggtcccagta tttaccctaa acagtgatga tccagaggat agatggaact ttgcggtatt 300
ctgtcttcgg attgctgtta gcgaggatgc caacaaacca ctcaggcaag gtgctcttat 360
atccctctta tgctcccatt ctcaggtgat gagaaaccat gttgcccttg cagggaaaca 420
gaatgaggcc acactggctg ttcttgaaat cgatggtttt gctaacagtg tgccccagtt 480
caacaatagg agtggggtgt ccgaggaaag agcacagaga ttcatggtaa tcgcaggatc 540
tctccctcgg gcatgcagca acggtactcc gtttgtcacg gctggggttg aagatgatgc 600
accagaagat atcactgaca ctctagaaag gatcctatct gtccaagtcc aggtatgggt 660
cacggtagca aaggccatga ctgcatatga gacagcagat gagtcagaaa caagaagaat 720
aaataagtat atgcagcaag gtagagttca gaagaagtac atccttcatc ctgtatgcag 780
gagtgcaatt caactcacaa tcagacattc tctggcagtc cgtattttcc tggttagtga 840
gctcaagagg ggccgtaata cagcaggtgg gagctctaca tattacaact tggtcgggga 900
tgtagactca tacatcagaa acaccgggct tactgcattt ttcctaacac tcaaatatgg 960
aatcaatacc aagacgtcag ccctcgcgct cagcagcctc acaggtgata tccaaaaaat 1020
gaaacagctc atgcgtttat atcggatgaa aggtgaaaat gcaccataca tgacattgtt 1080
aggtgacagt gaccagatga gctttgcacc agccgaatat gcacaacttt attcttttgc 1140
catgggcatg gcatcagtct tagataaggg aactggcaag taccaatttg ccagggactt 1200
tatgagcaca tcattctgga gacttggagt agagtatgct caggctcagg gaagtagtat 1260
caatgaggac atggctgctg agttaaaact aaccccggca gcaaggagag gcctggcagc 1320
tgctgcccaa cgagtatctg aagaaatcgg cagcatggac attcctactc aacaagcagg 1380
agtcctcacc gggctcagtg acgaaggccc ccgaactcca cagggcggat caaacaagct 1440
gcaagggcaa ccagatgctg gggatgggga gacccaattc ctggatttca tgagagcagt 1500
ggcgaacagc atgcgggaag cgccaaatcc tgcacagagc accacccatc tagagcctcc 1560
cccaacccct ggggcatccc aagacaacga cactgactgg gggtactgat cgactacacc 1620
cagcctgcct tcacaggatc acatcaaacc ctccgcccaa aaccctccca caccccctga 1680
cccacaaccc cgcacgaccc caccaataaa agctcccccc caccctctcc cccactccca 1740
gccacacgat cccacccacc cgggacaaca caggcacagc tcggccagtc aacaatccgc 1800
ccagagtcca aggtattaga aaaaaatacg ggtagaagag agacatccag agaccaggac 1860
gggtcactaa gttctctgtt ctcccttcta cccggtgagt tagggtgaag atggctactt 1920
ttacagatgc ggagatagat gacatatttg agaccagtgg gactgtcatt gacagcataa 1980
ttacggccca gggcaaatca gctgagaccg tcggaagaag cgcgatcccg cagggcaaga 2040
ccaaagctct aagcacagca tgggagaagc acgggagtgt ccagccacat gccagtcagg 2100
acgcccctga ccaacaagac agaacagaaa aacagccatc cacacctgag caggcgactc 2160
cacacaacaa cccgccgatc acatccactg aaccgccccc cactcaggcc gcaagcgaga 2220
ccagcgacac acagctcaaa accggagcaa gcaactccct tctgtccatg ctcgacaaat 2280
tgagcaataa atcgtctaat gctaaaaagg gcccatggtc gggtcctcaa gaagggcatc 2340
accaatctcc ggcccaacaa cacgggaacc agccgagcta tggaagcaac cagggaagac 2400
cacagcacca ggccaaggcc gtccctggaa accggggcat agacgagaac acagcatatc 2460
atggacaacg gaaggagtca caaccatcag ctggtgcaac ccctcatgcg ccccagtcag 2520
ggcagagcca agacaatatt cctgtacctg tggatcgtgt ccagctacct gccgactttg 2580
cgcaggtgat gatgtctatg atggaggcat tatcacagaa ggtaagtaaa gttgatcatc 2640
agctggacct agtcttgaaa cagacatcct ccattcctat gatgcgatct gaaatccaac 2700
agctcaagac atctgttgcg atcatggaag ctaacttagg catgatgaaa attctggacc 2760
ctggttgtgc taacgtttca tccttaagtg atctccgggc agtagcccga tcccacccag 2820
tcctagtttc aggccccgga gacccatctc cttacgtgac acaagggggt gaaatgacgc 2880
tcaataaact ctcacaaccg gtgcagcacc cctctgaatt gattaagtct gccactgcaa 2940
gcgggcctga catgggagtg gagaaggaca ctgtccgcgc attaatcacc tcgcgcccga 3000
tgcatccgag ctcctcggct aagctcctga gcaagctaga tgcagccagg tcaattgaag 3060
agatcaggaa gatcaaacgc cttgcgctga atggttgatg gccatcacaa ctcataacag 3120
gctcccgtca cttcagcgtc acacggaatc ccctgggggc ccccccttgc aaatccacgc 3180
ttcaacaccc caaacaacag ccctctctca ccccccccaa tcccccgaat gatagcacaa 3240
ctgcaaccaa tccagcagca ttagaaatta agaaaaaata cgggtagaat caaagtgcct 3300
cgattcctgc aggatggaga aaatagtgct tcttcttgca gtggttagcc ttgttaaaag 3360
tgatcagatt tgcattggtt accatgcaaa caactcgaca gagcaggttg acacgataat 3420
ggaaaaaaac gtcactgtta cacatgccca agacatactg gaaaagacac acaacgggag 3480
gctctgcgat ctgaatggag tgaaacctct gattttaaag gattgtagtg tagctggatg 3540
gcttcttgga aacccaatgt gcgacgaatt catcagagtg ccggaatggt cttacatagt 3600
ggagagggct aacccagcca atgatctctg ttacccaggg aacctcaatg actatgaaga 3660
actgaaacac ctattgagca gaataaatca ttttgagaag actctgatca tccccaagag 3720
ttcttggccc aatcatgaaa catcaggggt gagcgcagca tgcccatacc agggagtgcc 3780
ctcctttttc agaaatgtgg tatggcttac caagaagaac gatgcatacc caacaataaa 3840
gatgagctac aataatacca atggggaaga tcttttgata ctgtggggga ttcatcattc 3900
caacaatgca gcagagcaga caaatctcta taaaaaccca accacctatg tttccgttgg 3960
gacatcaaca ttaaaccaga gattggtgcc aaaaatagct actagatccc aagtaaacgg 4020
gcaacaagga agaatggatt tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatccactt 4080
tgagagtaat ggaaatttta ttgctccaga atatgcatac aaaatagtca agaaagggga 4140
ctcaacaatt atgaaaagtg aaatggaata tggccactgc aacaccaaat gtcaaactcc 4200
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tgcagacaga gaatccaccc aaaaggcaat agatggagtt accaataagg tcaactcgat 4500
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gagaatagag aatttaaata agaaaatgga agacggattc ctagatgtct ggacttacaa 4620
tgctgaactt ttagttctca tggaaaatga gagaacttta gattttcacg attcaaatgt 4680
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tggttgtttc gagttctatc ataaatgtga taatgaatgt atggaaagtg taagaaccgg 4800
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ataccagctg attgtcaaca accaaaattg gtcaggatac tcaggggcat tcatagacta 7500
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gcgattggga tcatggtcct ggcatgatgg tgcagaaatc atctacttta agtaggagta 7680
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tctaatgctg atcactcgga ttatgctgat attgagctgt atccgtctga caagctctct 7800
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ctttcttatc aaattaacgg ggctgagaac aatagcggat gtggtgcgcc tgttcatgac 9960
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gacccagaca actcagatca ttgccagcca cattgacaca gtcattcggt ccgtgattta 17760
catggaggct gagggtgacc tcgccgacac agtgttctta tttactcctt acaatctatc 17820
cacagacggt aaaaagagaa catcacttaa gcagtgcacc aaacagatct tggaagtcac 17880
aatactgggt ctcagagcca aagatatcaa taaagtaggt gatgtaatca gcttagtact 17940
cagaggtgcg gtttccctag aggacctcat cccattaagg acatacctga agcgcagtac 18000
ctgccctaaa tacctgaaag cggtcctggg tattactaaa ctcaaagaaa tgttcacaga 18060
tacctcgtta ctgtacttga ctcgcgctca acaaaaattc tacatgaaaa ccataggtaa 18120
tgctgccaag ggatattaca gtaataatga ctcttaaagg caatcgtacg ccaatcagtt 18180
atcttcttag ctgatgactc cctcactgac ttaattatac cagattagaa aaaagttaaa 18240
ttccgactct ttggaactcg tattcggatt cagttagtta actttaagca aaaatgcgca 18300
aagtcgtctc taattatagt tatgtcattc accaaatctc tgtttggt 18348
<210> 84
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P698-NDV C7d-P gene-1088-F?
<400> 84
gatgcatccg agctcctcg 19
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P576-AIV-H5N6-HA-1022R
<400> 85
ctacctgatg ctaaaggact 20
<210> 86
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P551-AIV-H5N6-HA-F-SbfI
<400> 86
ttcctgcagg atggagaaaa tagtgcttct tc 32
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P576-AIV-H5N6-HA-1022R
<400> 87
ctacctgatg ctaaaggact 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P568-H5N6-HA-872-F
<400> 88
gaatatggcc actgcaacac 20
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P550-NDV-C7d-M-3621-R
<400> 89
agctcgtgcc tgggattgtc 20
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P460-NDV-C7d-M-856F
<400> 90
cggactaagc tacttgctcc t 21
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P666-AIV-H5N6-NA-594R
<400> 91
ccggtaccac accactgccg 20
<210> 92
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P665-AIV-H5N6-NA-467F
<400> 92
cagtccatac aacactagg 19
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P518-NDV-C7d-F-realTime-R
<400> 93
gtgttctgtt atatgcctcc 20
<210> 94
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P438-NDV-C7d-Fgene-7536F
<400> 94
tatccgtctg acaagctct 19
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P471-NDV C7d+Ampv-8563R
<400> 95
ccagatcgga ctctatacag 20
<210> 96
<211> 560
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Amino acid sequence of H9N2 AIV-HA
<400> 96
Met Glu Ile Ile Ala Leu Ile Ala Ile Leu Val Val Thr Gly Thr Ser
1 5 10 15
Asp Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu
20 25 30
Thr Val Asp Thr Leu Val Glu Asn Asn Val Pro Val Thr His Thr Lys
35 40 45
Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Asn Leu
50 55 60
Gly His Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Ile Glu Gly Leu Val Tyr
65 70 75 80
Gly Asn Pro Ser Cys Asp Leu Leu Leu Gly Gly Lys Glu Trp Ser Tyr
85 90 95
Ile Val Glu Arg Ser Ser Ala Val Asn Gly Met Cys Tyr Pro Gly Arg
100 105 110
Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Ser Phe Phe Ser Ser Ala Arg Ser
115 120 125
Tyr Lys Arg Leu Leu Leu Phe Pro Asp Arg Thr Trp Asn Val Thr Phe
130 135 140
Asn Gly Thr Ser Lys Ala Cys Ser Gly Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg
145 150 155 160
Trp Leu Thr His Lys Asn Asn Ser Tyr Pro Ile Gln Asp Ala Gln Tyr
165 170 175
Thr Asn Asp Trp Gly Lys Asn Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile His His
180 185 190
Pro Pro Thr Asp Thr Glu Gln Met Asn Leu Tyr Lys Lys Ala Asp Thr
195 200 205
Thr Thr Ser Ile Thr Thr Glu Asp Ile Asn Arg Thr Phe Lys Pro Gly
210 215 220
Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Gln Gln Gly Arg Ile Asp Tyr
225 230 235 240
Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Arg Ser Asn
245 250 255
Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser
260 265 270
His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu Asn Ser Gly Asn Cys Ile Ile
275 280 285
Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Thr Thr Leu Pro Phe Gln
290 295 300
Asn Val Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn Cys Pro Lys Tyr Val Gly Val
305 310 315 320
Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu Arg Asn Val Pro Ala Thr Ser
325 330 335
Gly Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp
340 345 350
Pro Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gln His Ser Asn Asp Gln
355 360 365
Gly Val Gly Ile Ala Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Glu Ala Val Asp
370 375 380
Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile Ile Asp Lys Met Asn Lys Gln
385 390 395 400
Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser Glu Ile Glu Ala Arg Leu Asn
405 410 415
Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr
420 425 430
Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Gln Lys Thr Leu Asp Asp
435 440 445
His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu
450 455 460
Gly Ser Asn Ala Ile Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His
465 470 475 480
Lys Cys Asp Asp Gln Cys Met Glu Thr Ile Arg Thr Gly Thr Tyr Asp
485 490 495
Arg Leu Lys Tyr Lys Glu Glu Ser Lys Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu
500 505 510
Gly Val Lys Leu Glu Ser Glu Glu Thr Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr
515 520 525
Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Ala Ile Gly Leu Ala Ala Phe
530 535 540
Met Phe Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile
545 550 555 560
<210> 97
<211> 1683
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of H9N2 AIV-HA
<400> 97
atggaaataa tagcactaat agctatactg gtagtgacag gaacaagcga tgctgataaa 60
atttgcattg gctaccagtc aacaaactcc acagaaactg ttgatacact agtagaaaac 120
aatgtccctg tgacacatac caaagaattg ctccacacag agcacaatgg aatgttatgt 180
gcaacaaact tgggacaccc tcttatccta gacacctgca ccattgaagg gttggtgtac 240
ggcaatcctt cctgtgattt gctactggga gggaaagagt ggtcttacat tgtcgaaaga 300
tcatcagctg ttaatgggat gtgctaccct ggaagggtag agaatctgga agaactcagg 360
tcctttttca gttctgctcg ctcctacaaa agactcctac tttttccaga ccgtacttgg 420
aatgtgactt tcaatgggac aagcaaagca tgctcaggct cattctacag aagtatgaga 480
tggctgacac acaagaacaa ttcttaccct attcaagacg cccaatatac caacgactgg 540
ggaaagaata ttctcttcat gtggggcata caccatccac ctactgatac tgagcaaatg 600
aatctataca aaaaagctga tacaacaaca agtataacaa cggaagatat caatcgaact 660
ttcaaaccag ggatagggcc aaggcctctt gtcaatggtc aacaaggaag aattgattat 720
tattggtcag tactaaagcc aggccagaca ttgcgaataa gatccaatgg aaatctaatt 780
gccccatggt atggacacat tctttcagga gaaagccatg gaagaatcct gaagaccgat 840
ttgaatagtg gcaactgcat aatacaatgc caaactgaga aaggtggttt gaacacgacc 900
ttgccattcc aaaatgtcag caaatatgca tttgggaact gtcccaaata tgttggagtg 960
aagagtctca aactggcagt tggtctaagg aatgtgcctg ctacatcagg tagagggctt 1020
ttcggtgcca tagctggatt catagaagga ggttggccag gactagttgc aggctggtac 1080
gggtttcagc actcaaatga tcaaggggtt ggaatagccg cggacaaaga atcaactcaa 1140
gaagcagttg ataaaataac atccaaagta aataatataa tcgacaaaat gaacaagcag 1200
tatgaaatca ttgatcatga gttcagtgag attgaagcca gactcaatat gatcaacaat 1260
aagattgatg accaaataca ggacatctgg gcgtacaatg cagaattact agtactgctt 1320
gaaaaccaga aaacactcga tgatcatgat gcaaatgtga acaatctgta taataaggtg 1380
aagagagcat tgggttcaaa tgcaatagag gatgggaagg gatgcttcga gttgtatcac 1440
aaatgtgatg atcaatgcat ggaaacaatt agaaccggga cttatgacag gctaaaatat 1500
aaagaagaat caaaactaga aaggcagaaa atagaagggg taaaactgga gtctgaagaa 1560
acttacaaga ttcttaccat ttattcgact gtcgcctcat ctcttgtgct tgcaataggg 1620
cttgctgcct tcatgttctg ggccatgtcc aatggatctt gcagatgcaa catttgtata 1680
taa 1683
<210> 98
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of H9N2 AIV-NA
<400> 98
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Ser Leu Thr
1 5 10 15
Ile Ala Thr Val Cys Phe Leu Met Gln Ile Ala Ile Leu Ala Thr Thr
20 25 30
Val Thr Leu His Phe Lys Gln Asn Glu Cys Ser Ile Pro Ser Asn Asn
35 40 45
Gln Ala Val Pro Cys Asp Ile Glu Lys Glu Leu Cys Pro Lys Val Val
50 55 60
Glu Tyr Arg Ser Trp Ser Lys Pro Gln Cys Gln Ile Thr Gly Phe Ala
65 70 75 80
Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly Ser Ile
85 90 95
Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Ser Ser Asn Lys Cys Tyr
100 105 110
Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asp Asn Lys His Ser Asn
115 120 125
Gly Thr Ile His Asp Arg Ile Ser His Arg Thr Leu Leu Met Asn Glu
130 135 140
Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys Ile Ala Trp
145 150 155 160
Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Arg Ala Trp Leu His Val Cys Val
165 170 175
Thr Gly Asp Asp Arg Asn Ala Thr Ala Ser Phe Ile Tyr Asp Gly Val
180 185 190
Leu Val Asp Ser Ile Gly Ser Trp Ser Gln Asn Ile Leu Arg Thr Gln
195 200 205
Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr Val Val Met Thr
210 215 220
Asp Gly Ser Ala Ser Gly Arg Ala Asp Thr Arg Ile Leu Phe Ile Lys
225 230 235 240
Glu Gly Lys Ile Val His Ile Ser Gln Leu Ser Gly Ser Ala Gln His
245 250 255
Ile Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Asp Val Arg Cys Val
260 265 270
Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Ile Ile Asp Ile Asn
275 280 285
Met Ala Asp Tyr Ser Ile Asp Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly Leu Val
290 295 300
Gly Asp Thr Pro Arg Asn Asp Asp Ser Ser Ser Asn Ser Asn Cys Lys
305 310 315 320
Asp Pro Asn Asn Glu Arg Gly Asn Pro Gly Val Lys Gly Trp Ala Phe
325 330 335
Asp Tyr Gly Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Ser Lys Asp Ser
340 345 350
Arg Ser Gly Tyr Glu Thr Phe Arg Val Ile Gly Gly Trp Thr Thr Ala
355 360 365
Asn Ser Lys Ser Gln Val Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Asn Asn Asn
370 375 380
Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Ser Cys Ile
385 390 395 400
Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Gln Glu Thr
405 410 415
Arg Val Trp Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Val Phe Cys Gly Thr Ser
420 425 430
Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asn Ile Asn Phe
435 440 445
Met Pro Ile
450
<210> 99
<211> 1356
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of H9N2 AIV-NA
<400> 99
atgaatccaa atcagaaaat aataacaatt ggctctgtct ctctaaccat tgcaacagta 60
tgtttcctca tgcagattgc cattctagca acgactgtaa cactgcactt caagcaaaat 120
gaatgcagca taccctcgaa caaccaagca gttccatgtg acatagagaa agaactttgt 180
cctaaagtgg tagaatacag gagttggtcg aaaccgcagt gtcagattac agggtttgct 240
cctttctcca aggacaactc aatccggctt tctgctggtg ggagcatttg ggtaacaaga 300
gaaccttatg tatcatgcag ctccaataaa tgttatcaat ttgcacttgg gcagggaacc 360
acgctagata acaaacactc aaatgggaca atacatgata gaatctctca tcgaaccctt 420
ttaatgaacg agttgggtgt tccatttcat ttgggaacca aacaggtgtg tatagcatgg 480
tccagctcaa gctgtcatga tgggagagca tggttacatg tttgtgtcac tggagatgat 540
agaaatgcaa ctgctagttt catttatgat ggagtgcttg ttgacagtat tggctcatgg 600
tctcaaaata ttctcagaac tcaggagtca gaatgcgttt gcatcaatgg aacttgtaca 660
gtagtaatga ctgatggaag tgcatcagga agagctgaca ctagaatact attcattaaa 720
gaggggaaaa ttgtacatat tagccaatta tcaggaagtg ctcagcatat agaggaatgt 780
tcttgttatc ccagatatcc agacgtcaga tgtgtttgca gagacaattg gaaaggatct 840
aataggccca ttatagatat aaatatggcg gattatagca ttgattccag ttatgtgtgc 900
tcgggacttg ttggcgacac accaaggaat gatgatagct ctagcaacag caactgcaaa 960
gatcctaata atgagagagg gaacccggga gtaaaagggt gggcctttga ctatggaaat 1020
gatgtttgga tggggagaac aatcagcaag gattcacgct caggttatga aactttcaga 1080
gtcattggtg gttggaccac agctaactcc aaatcacagg tgaatagaca agtcatagtt 1140
gacaataaca actggtctgg ttattctggc attttctctg ttgaaggcaa aagctgcatc 1200
aataggtgtt tttatgtgga gttgataaga ggaaggccac aagagactag agtatggtgg 1260
acctcaaaca gcattgtcgt gttttgtggc acttcaggta cctatggaac aggctcatgg 1320
cctgatgggg cgaatatcaa ttttatgcct atataa 1356
<210> 100
<211> 18312
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Genome nucleotide sequence of BP-NDV-C7d-AIV-H9N2-HANA virus
<400> 100
accaaacaga gaatctgtga ggtacgataa aaggcgaaga agcaatcgag atcgtacggg 60
tagaaggtgt gaaccccgag cgcgaggccg aagcttgaac ctgagggaac cttctaccaa 120
tggccgccct ctgccaacta tgtcgtctgt tttcgacgaa tacgagcagc tccttgctgc 180
tcagacccgc cctaacggag ctcatggagg gggagagaaa gggagcactt taaaggttga 240
ggtcccagta tttaccctaa acagtgatga tccagaggat agatggaact ttgcggtatt 300
ctgtcttcgg attgctgtta gcgaggatgc caacaaacca ctcaggcaag gtgctcttat 360
atccctctta tgctcccatt ctcaggtgat gagaaaccat gttgcccttg cagggaaaca 420
gaatgaggcc acactggctg ttcttgaaat cgatggtttt gctaacagtg tgccccagtt 480
caacaatagg agtggggtgt ccgaggaaag agcacagaga ttcatggtaa tcgcaggatc 540
tctccctcgg gcatgcagca acggtactcc gtttgtcacg gctggggttg aagatgatgc 600
accagaagat atcactgaca ctctagaaag gatcctatct gtccaagtcc aggtatgggt 660
cacggtagca aaggccatga ctgcatatga gacagcagat gagtcagaaa caagaagaat 720
aaataagtat atgcagcaag gtagagttca gaagaagtac atccttcatc ctgtatgcag 780
gagtgcaatt caactcacaa tcagacattc tctggcagtc cgtattttcc tggttagtga 840
gctcaagagg ggccgtaata cagcaggtgg gagctctaca tattacaact tggtcgggga 900
tgtagactca tacatcagaa acaccgggct tactgcattt ttcctaacac tcaaatatgg 960
aatcaatacc aagacgtcag ccctcgcgct cagcagcctc acaggtgata tccaaaaaat 1020
gaaacagctc atgcgtttat atcggatgaa aggtgaaaat gcaccataca tgacattgtt 1080
aggtgacagt gaccagatga gctttgcacc agccgaatat gcacaacttt attcttttgc 1140
catgggcatg gcatcagtct tagataaggg aactggcaag taccaatttg ccagggactt 1200
tatgagcaca tcattctgga gacttggagt agagtatgct caggctcagg gaagtagtat 1260
caatgaggac atggctgctg agttaaaact aaccccggca gcaaggagag gcctggcagc 1320
tgctgcccaa cgagtatctg aagaaatcgg cagcatggac attcctactc aacaagcagg 1380
agtcctcacc gggctcagtg acgaaggccc ccgaactcca cagggcggat caaacaagct 1440
gcaagggcaa ccagatgctg gggatgggga gacccaattc ctggatttca tgagagcagt 1500
ggcgaacagc atgcgggaag cgccaaatcc tgcacagagc accacccatc tagagcctcc 1560
cccaacccct ggggcatccc aagacaacga cactgactgg gggtactgat cgactacacc 1620
cagcctgcct tcacaggatc acatcaaacc ctccgcccaa aaccctccca caccccctga 1680
cccacaaccc cgcacgaccc caccaataaa agctcccccc caccctctcc cccactccca 1740
gccacacgat cccacccacc cgggacaaca caggcacagc tcggccagtc aacaatccgc 1800
ccagagtcca aggtattaga aaaaaatacg ggtagaagag agacatccag agaccaggac 1860
gggtcactaa gttctctgtt ctcccttcta cccggtgagt tagggtgaag atggctactt 1920
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ttacggccca gggcaaatca gctgagaccg tcggaagaag cgcgatcccg cagggcaaga 2040
ccaaagctct aagcacagca tgggagaagc acgggagtgt ccagccacat gccagtcagg 2100
acgcccctga ccaacaagac agaacagaaa aacagccatc cacacctgag caggcgactc 2160
cacacaacaa cccgccgatc acatccactg aaccgccccc cactcaggcc gcaagcgaga 2220
ccagcgacac acagctcaaa accggagcaa gcaactccct tctgtccatg ctcgacaaat 2280
tgagcaataa atcgtctaat gctaaaaagg gcccatggtc gggtcctcaa gaagggcatc 2340
accaatctcc ggcccaacaa cacgggaacc agccgagcta tggaagcaac cagggaagac 2400
cacagcacca ggccaaggcc gtccctggaa accggggcat agacgagaac acagcatatc 2460
atggacaacg gaaggagtca caaccatcag ctggtgcaac ccctcatgcg ccccagtcag 2520
ggcagagcca agacaatatt cctgtacctg tggatcgtgt ccagctacct gccgactttg 2580
cgcaggtgat gatgtctatg atggaggcat tatcacagaa ggtaagtaaa gttgatcatc 2640
agctggacct agtcttgaaa cagacatcct ccattcctat gatgcgatct gaaatccaac 2700
agctcaagac atctgttgcg atcatggaag ctaacttagg catgatgaaa attctggacc 2760
ctggttgtgc taacgtttca tccttaagtg atctccgggc agtagcccga tcccacccag 2820
tcctagtttc aggccccgga gacccatctc cttacgtgac acaagggggt gaaatgacgc 2880
tcaataaact ctcacaaccg gtgcagcacc cctctgaatt gattaagtct gccactgcaa 2940
gcgggcctga catgggagtg gagaaggaca ctgtccgcgc attaatcacc tcgcgcccga 3000
tgcatccgag ctcctcggct aagctcctga gcaagctaga tgcagccagg tcaattgaag 3060
agatcaggaa gatcaaacgc cttgcgctga atggttgatg gccatcacaa ctcataacag 3120
gctcccgtca cttcagcgtc acacggaatc ccctgggggc ccccccttgc aaatccacgc 3180
ttcaacaccc caaacaacag ccctctctca ccccccccaa tcccccgaat gatagcacaa 3240
ctgcaaccaa tccagcagca ttagaaatta agaaaaaata cgggtagaat caaagtgcct 3300
cgattcctgc aggatggaaa taatagcact aatagctata ctggtagtga caggaacaag 3360
cgatgctgat aaaatttgca ttggctacca gtcaacaaac tccacagaaa ctgttgatac 3420
actagtagaa aacaatgtcc ctgtgacaca taccaaagaa ttgctccaca cagagcacaa 3480
tggaatgtta tgtgcaacaa acttgggaca ccctcttatc ctagacacct gcaccattga 3540
agggttggtg tacggcaatc cttcctgtga tttgctactg ggagggaaag agtggtctta 3600
cattgtcgaa agatcatcag ctgttaatgg gatgtgctac cctggaaggg tagagaatct 3660
ggaagaactc aggtcctttt tcagttctgc tcgctcctac aaaagactcc tactttttcc 3720
agaccgtact tggaatgtga ctttcaatgg gacaagcaaa gcatgctcag gctcattcta 3780
cagaagtatg agatggctga cacacaagaa caattcttac cctattcaag acgcccaata 3840
taccaacgac tggggaaaga atattctctt catgtggggc atacaccatc cacctactga 3900
tactgagcaa atgaatctat acaaaaaagc tgatacaaca acaagtataa caacggaaga 3960
tatcaatcga actttcaaac cagggatagg gccaaggcct cttgtcaatg gtcaacaagg 4020
aagaattgat tattattggt cagtactaaa gccaggccag acattgcgaa taagatccaa 4080
tggaaatcta attgccccat ggtatggaca cattctttca ggagaaagcc atggaagaat 4140
cctgaagacc gatttgaata gtggcaactg cataatacaa tgccaaactg agaaaggtgg 4200
tttgaacacg accttgccat tccaaaatgt cagcaaatat gcatttggga actgtcccaa 4260
atatgttgga gtgaagagtc tcaaactggc agttggtcta aggaatgtgc ctgctacatc 4320
aggtagaggg cttttcggtg ccatagctgg attcatagaa ggaggttggc caggactagt 4380
tgcaggctgg tacgggtttc agcactcaaa tgatcaaggg gttggaatag ccgcggacaa 4440
agaatcaact caagaagcag ttgataaaat aacatccaaa gtaaataata taatcgacaa 4500
aatgaacaag cagtatgaaa tcattgatca tgagttcagt gagattgaag ccagactcaa 4560
tatgatcaac aataagattg atgaccaaat acaggacatc tgggcgtaca atgcagaatt 4620
actagtactg cttgaaaacc agaaaacact cgatgatcat gatgcaaatg tgaacaatct 4680
gtataataag gtgaagagag cattgggttc aaatgcaata gaggatggga agggatgctt 4740
cgagttgtat cacaaatgtg atgatcaatg catggaaaca attagaaccg ggacttatga 4800
caggctaaaa tataaagaag aatcaaaact agaaaggcag aaaatagaag gggtaaaact 4860
ggagtctgaa gaaacttaca agattcttac catttattcg actgtcgcct catctcttgt 4920
gcttgcaata gggcttgctg ccttcatgtt ctgggccatg tccaatggat cttgcagatg 4980
caacatttgt atataagaga ttagaaaaaa cacgggtaga acctgcagga tggactcatc 5040
caggacaatc gggctgtact ttgattctgc cctcccttcc agcagcctat tagcatttcc 5100
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gtcgaatagg tactcatcag tgaatgcagt gaagcatgtg aaggcgcccg aaaagatccc 5520
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tgatgggaga gcatggttac atgtttgtgt cactggagat gatagaaatg caactgctag 6840
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tattagccaa ttatcaggaa gtgctcagca tatagaggaa tgttcttgtt atcccagata 7080
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cacagctaac tccaaatcac aggtgaatag acaagtcata gttgacaata acaactggtc 7440
tggttattct ggcattttct ctgttgaagg caaaagctgc atcaataggt gtttttatgt 7500
ggagttgata agaggaaggc cacaagagac tagagtatgg tggacctcaa acagcattgt 7560
cgtgttttgt ggcacttcag gtacctatgg aacaggctca tggcctgatg gggcgaatat 7620
caattttatg cctatataag agtaagaaaa aacacgggta gaacctagga tgggctccaa 7680
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ctgtatccgt ctgacaagct ctcttgacgg caggcccctt gcagctgcag gaattgtagt 7800
aacaggagat aaggcagtca atgtatacac ctcgtctcag acagggtcaa tcatagtcaa 7860
gttgctcccg aatatgccca gagataagga ggcatgtgca aaagccccat tggaggcata 7920
taacagaaca ctgactactc tgctcactcc tcttggcgac tccatccgca agatccaagg 7980
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ggcccttaga ggctcagtta ttgccaattg taagataaca acatgcagat gtacagaccc 8880
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gataggatat acaagcaggt agctcttgaa tccccgctgg cactactaaa caccgaatct 9840
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gatatgatta ttctgagtct cgcccactgt cactttatta agaaaaaaca caagaagcat 11460
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caagcacaaa ttgctatact actggaaatt gactgggcta ccgcttcctg atgaatgcga 11640
ctttgaccat ctcattatca gcaggcaatg gaagagaata ctggagtcgg ccactcctga 11700
cacagagaga atgataaaac tcgggcgggc agtgcaccag actctcaacc acaattccaa 11760
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tccagggtcc aatcaaagct tattagatca actggctact aatttatccc tgattgccat 17220
gcattctgtg agggagggcg gggtagtgat catcaaagta ctgtatgcaa tggggtacta 17280
cttccattta ctcatgaatt tattcactcc atgttccacg aaaggatata cactctccaa 17340
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ttcgcaatgt ctggcctgg 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P726-H9N2-HA-147F
<400> 103
attgctccac acagagcac 19
<210> 104
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P728-H9N2-HA-1125R
<400> 104
tgtccgcggc tattccaac 19
<210> 105
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P569-AIV-H9N2-HA-830F
<400> 105
gaagaatcct gaagaccga 19
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P550-NDV-C7d-M-3621-R
<400> 106
agctcgtgcc tgggattgtc 20
<210> 107
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P460-NDV-C7d-M-856F
<400> 107
cggactaagc tacttgctcc t 21
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P570-AIV-H9N2-NA-601R
<400> 108
accatgagcc aatactgtca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P571-AIV-H9N2-NA-462F
<400> 109
caggtgtgta tagcatggtc 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P518-NDV-C7d-F-realTime-R
<400> 110
gtgttctgtt atatgcctcc 20
<210> 111
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P438-NDV-C7d-Fgene-7536F
<400> 111
tatccgtctg acaagctct 19
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> P471-NDV C7d+Ampv-8563R
<400> 112
ccagatcgga ctctatacag 20
Claims (17)
- NP, P, M, F, HN, 및 L 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하며, 상기 F 단백질은 변이된 절단부위를 포함하는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 것인 약독화 뉴캣슬병 바이러스(NDV) 벡터, 및 조류 인플루엔자 바이러스(AIV) 아형 H5N6의 HA 및 NA 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 키메라 바이러스.
- 제1항에 있어서, 상기 HA 단백질은 서열번호 79의 아미노산 서열로 이루어지는 것인 키메라 바이러스.
- 제1항에 있어서, 상기 NA 단백질은 서열번호 81의 아미노산 서열로 이루어지는 것인 키메라 바이러스.
- 제1항에 있어서, 상기 HA 단백질의 암호화 유전자는 서열번호 80의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 키메라 바이러스.
- 제1항에 있어서, 상기 NA 단백질의 암호화 유전자는 서열번호 82의 폴리뉴클레오티드 서열로 이루어지는 것인 키메라 바이러스.
- 제1항에 있어서, 상기 외래 유전자는, NP와 P의 유전자 사이, P와 M의 유전자 사이, M과 F의 유전자 사이, F와 HN의 유전자 사이, HN과 L의 유전자 사이, 3'UTR과 NP의 유전자 사이, 및 L과 5'UTR의 유전자 사이로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 영역내로 도입되는 것인 키메라 바이러스.
- 제6항에 있어서, 상기 외래 유전자는, NDV 게놈의 P와 M 유전자 사이 및 M과 F 유전자 사이에 삽입되는 것인 키메라 바이러스.
- 제6항에 있어서, 상기 키메라 바이러스는 KCTC13576BP 수탁번호를 갖는 것인 키메라 바이러스.
- 제1항에 있어서, 상기 뉴캣슬병 바이러스는 하기 특성 중에서 적어도 하나 이상의 특성을 갖는 키메라 바이러스:
50 내지 60 ℃ 의 온도에서 열처리 후 25분 이상 동안 혈구응집능 및 감염능을 가지는 것, 계태아에서 측정한 바이러스의 역가가 1010 EID50/ml 이상을 가지는 것 및 모체이행항체나 능동면역항체를 갖는 닭에서 면역유도능을 갖는 것임. - 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 112-RRQKRF-117을 포함하는 F 단백질을 갖는 강병원성 뉴캣슬병 바이러스에서 유래된 것인, 키메라 바이러스.
- 제1항에 있어서, 상기 뉴캣슬병 바이러스는, 3'-NP-P-M-F-HN-L-5'단백질을 암호화하는 서열로 구성된 유전자를 포함하는 키메라 바이러스.
- 제1항에 있어서, 상기 뉴캣슬병 바이러스는, 상기 NP 단백질의 암호화 유전자의 3'-말단에 연결된 리더 서열 및 3' UTR 서열과, 상기 L 단백질의 암호화 유전자의 5'-말단에 5'UTR 및 트레일러를 포함하는 것인. 키메라 바이러스.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 뉴캣슬병 바이러스 벡터와 조류 인플루엔자 바이러스(AIV) 아형 H5N6의 HA 및 NA 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 키메라 바이러스를 포함하는, 조류 이가 (bivalent) 백신 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 백신 조성물은 생백신, 사독 백신, 서브유닛 백신, 벡터 백신, 키메라 백신 또는 DNA 백신인 것인, 백신 조성물.
- 제13항에 있어서, 상기 백신은 항원 보강제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
- 제13항에 있어서, 발육종란내(In Ovo), 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 결막 및 피하의 경로로 투여되는 것인 백신 조성물.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 뉴캣슬병 바이러스 벡터와 조류 인플루엔자 바이러스(AIV) 아형 H5N6의 HA 및 NA 단백질로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상을 암호화하는 외래 유전자를 포함하는 키메라 바이러스를 포함하는 조류 바이러스 질환에 대한 백신 조성물을, 조류에 투여하여 면역화를 유도하는 단계를 포함하는, 조류의 면역화 방법.
Priority Applications (1)
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KR1020190129584A KR102154795B1 (ko) | 2019-10-18 | 2019-10-18 | 조류 인플루엔자 바이러스 h5n6의 표면항원을 발현하는 뉴캣슬병 바이러스 발현 시스템 및 이를 이용한 조류 백신 |
Applications Claiming Priority (1)
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Family
ID=72707030
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KR (1) | KR102154795B1 (ko) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023085760A1 (ko) * | 2021-11-09 | 2023-05-19 | 건국대학교 산학협력단 | 신규한 재조합 뉴캣슬바이러스벡터 및 이를 포함하는 백신 조성물 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20080098359A (ko) * | 2005-12-02 | 2008-11-07 | 마운트 시나이 스쿨 오브 메디신 오브 뉴욕 유니버시티 | 비-천연 표면 단백질을 제시하는 키메라 바이러스 및 그의용도 |
-
2019
- 2019-10-18 KR KR1020190129584A patent/KR102154795B1/ko active IP Right Grant
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KR20080098359A (ko) * | 2005-12-02 | 2008-11-07 | 마운트 시나이 스쿨 오브 메디신 오브 뉴욕 유니버시티 | 비-천연 표면 단백질을 제시하는 키메라 바이러스 및 그의용도 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
GenBank: AGL09066.1, 2014.07.09. * |
GenBank: LC348826.1, 2018.06.19. * |
Infect. Genet. Evol. 21, 359-366 (2014) * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2023085760A1 (ko) * | 2021-11-09 | 2023-05-19 | 건국대학교 산학협력단 | 신규한 재조합 뉴캣슬바이러스벡터 및 이를 포함하는 백신 조성물 |
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