KR20080098359A - 비-천연 표면 단백질을 제시하는 키메라 바이러스 및 그의용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하나의 본 발명 키메라 바이러스를 사용하는 것에 의해 대상, 예컨대 조류가 2종의 감염원에 대하여 면역화되도록 하는 키메라형 음성-가닥 RNA 바이러스를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 감염원 단백질의 엑토도메인과 인플루엔자 바이러스 단백질의 막횡단 및 세포질 도메인을 포함하는 융합 단백질을 발현하여 자신의 비리온으로 혼입하도록 조작된 키메라 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 그러한 키메라 바이러스는 인플루엔자 바이러스와 해당 감염원에 대한 면역 반응을 유발한다. 본 발명은 또한 감염원 단백질의 엑토도메인과 NDV 단백질의 막횡단 및 세포질 도메인을 포함하는 융합 단백질을 발현하여 자신의 비리온으로 혼입하도록 조작된 키메라 뉴캐슬병 바이러스 (NDV)도 제공한다. 그러한 키메라 바이러스는 NDV와 해당 감염원에 대한 면역 반응을 유발한다.
키메라, 조류 인플루엔자, NDV, 융합 단백질, 엑토도메인, 면역원성 제제, 백신

Description

비-천연 표면 단백질을 제시하는 키메라 바이러스 및 그의 용도{CHIMERIC VIRUSES PRESENTING NON-NATIVE SURFACE PROTEINS AND USES THEREOF}
본 발명은, 본 발명의 단일 키메라 바이러스를 사용하는 것에 의해 대상, 예컨대 조류가 2종의 감염원에 대하여 면역화되도록 하는 키메라형 음성-가닥(negative-strand) RNA 바이러스를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 감염원 단백질의 엑토도메인(ectodomain)과, 인플루엔자 바이러스 단백질의 막횡단(transmembrane) 및 세포질 도메인을 포함하는 융합 단백질을 발현하여 자신의 비리온으로 혼입하도록 조작된 키메라 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 그러한 키메라 바이러스는 인플루엔자 바이러스와 해당 감염원에 대한 면역 반응을 유발한다. 본 발명은 또한 감염원 단백질의 엑토도메인과, 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) 단백질의 막횡단 및 세포질 도메인을 포함하는 융합 단백질을 발현하여 자신의 비리온으로 혼입하도록 조작된 키메라 뉴캐슬병 바이러스 (NDV)를 제공한다. 그러한 키메라 바이러스는 NDV와 해당 감염원에 대한 면역 반응을 유발한다.
숙주 세포 시스템 (예, 우두 바이러스, 바쿨로바이러스(baculovirus) 등) 내에서 이종유래 단백질의 발현을 이끌어내기 위하여 수많은 DNA 바이러스가 유전적으로 조작되어 왔다. 최근에는, 포지티브-가닥 RNA 바이러스 (예, 폴리오바이러 스(poliovirus))로 상당하는 진전이 이루어지고 있다. 이러한 구성체의 발현 산물, 즉 이종유래 유전자 산물 또는 이종유래 유전자 산물을 발현하는 키메라 바이러스는 백신 제제 (서브유닛 또는 전체 바이러스 백신 중 어느 것)에 잠재적으로 유용할 것으로 여겨진다. 백신에 사용하기 위한 재조합 또는 키메라 바이러스를 구성함에 있어 우두와 같은 바이러스를 사용하는 것의 한가지 약점은 그 주요 항원결정인자에서 변이가 부족하다는 것이다. 바이러스 균주(viral strain) 상의 이러한 다양성의 부족은 키메라형 우두의 반복 사용에 엄격한 제한을 부여하는데, 여러 번 예방접종하면 균주에 대한 숙주-내성을 야기하여 접종된 바이러스가 숙주를 감염시킬 수 없을 것이기 때문이다. 이에 따라, 키메라형 우두를 사용한 내성 개체의 접종은 면역 자극을 유발하지 않게 될 것이다.
반면, 음성-가닥 RNA 바이러스는 백신에 사용하기 위한 키메라 바이러스를 구성함에 있어 매력적인 후보이다. 음성-가닥 RNA 바이러스, 예컨대 인플루엔자는 그 광범위한 유전적 변이성이 내성 발달의 위험 없이 면역성을 자극하는 광대한 레퍼토리의 백신 제제 구성을 가능케 하기 때문에 바람직하다.
2.1 음성-가닥 RNA 바이러스
음성-센스(negative-sense) 게놈의 외피형 단일-가닥 RNA를 포함하는 바이러스 과는 비-분절화 게놈을 가지는 군 (파라믹소비리다에(Paramyxoviridae), 라브도비리다에(Rhabdoviridae)) 또는 분절화 게놈을 가지는 것들 (오르소믹소비리다에(Orthomyxoviridae), 부냐비리다에(Bunyaviridae) 및 아레나비리다에(Arenaviridae))로 분류된다. 파라믹소비리다에 및 오르소믹소비리다에 과는 하 기에 상세하게 기술되며, 여기에서 실시예에 사용된다. 파라믹소비리다에 과에는 뉴캐슬병 바이러스 (NDV), 파라인플루엔자 바이러스, 센다이 바이러스, 시미안 바이러스 5, 및 멈프스 바이러스의 바이러스가 포함된다. 오르소믹소비리다에 과에는 인플루엔자, 유형 A, B 및 C 바이러스는 물론 토고토 및 도리 바이러스와 감염성 연어 빈혈 바이러스의 바이러스가 포함된다.
2.1.1 인플루엔자 바이러스
인플루엔자 비리온은 단일-가닥 RNA 게놈을 포함하는 내부의 리보뉴클레오단백질 코어 (나선형 뉴클레오캡시드), 및 매트릭스 단백질 (M1)가 내측에 라이닝되어 있는 외부의 지질단백질 외피를 포함한다. 인플루엔자 A 바이러스의 분절화 게놈은 하기를 포함한 10종의 폴리펩티드를 코딩하는 8종 분자의 (인플루엔자 C는 7개) 선형, 음성 극성(negative polarity)의 단일-가닥 RNA들로 구성된다: RNA-의존 RNA 폴리머라제 단백질 (PB2, PB1 및 PA) 및 뉴클레오캡시드를 형성하는 뉴클레오단백질 (NP); 매트릭스 막 단백질 (M1, M2); 지질 함유 외피로부터 돌출되는 2종의 표면 당단백질인 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다제 (NA); 비구조성 단백질 (NS1) 및 핵 외수송 단백질 (NEP). 게놈의 전사와 복제는 핵에서 일어나며, 조립은 원형질 막 상에서의 출아(budding)를 통하여 이루어진다. 바이러스는 혼합 감염시 유전자를 재편성할 수 있다.
인플루엔자 바이러스는 세포 막 당단백질 및 당지질 중의 시알릴올리고당에 대한 HA 결합 활성을 통하여 세포에 흡착된다. 비리온의 세포내이입에 이어서, 세포 엔도좀 내에서 HA 분자의 구조 변화가 발생하고, 이것은 막의 융합을 촉진함으 로써 코팅해제(uncoating)를 촉발한다. 뉴클레오캡시드는 핵으로 이동하고, 거기에서 바이러스의 mRNA가 전사된다. 바이러스 mRNA는 바이러스 엔도뉴클레아제가 세포의 이종유래 mRNA로부터의 캡핑된 5'-말단을 절단하고, 이어서 이것이 바이러스 트랜스크립타제에 의한 바이러스 RNA 주형의 전사를 위한 프라이머로서 작용하는 독특한 기작에 의해 전사된다. 전사체는 그 주형의 단부로부터 15 내지 22 염기의 위치에서 종결되며, 여기에서 올리고(U) 서열이 폴리(A) 구간의 부가를 위한 신호로서 작용한다. 다음에, 바이러스 RNA 전사체는 세포 막으로 이동하여 새롭게 전사된 막횡단 바이러스 단백질과 결합한다. 다음에, NA가 막 결합 당단백질의 탄수화물 요소로부터 시알 잔기(sialy residue)를 절단함으로써 자손 바이러스의 피막화 및 세포 방출을 야기한다. 이렇게 생성되는 8종의 바이러스 RNA 분자들 중 6종은 HA, NA, NP 및 바이러스 폴리머라제 단백질인 PB2, PB1 및 PA로 표시되는 단백질로 직접 번역되는 단일시스트론 메시지이다. 나머지 2종의 전사체는 스플라이싱(splicing)되어 각각 상이한 리딩 프레임로 번역됨으로써 M1, M2, NS1 및 NEP를 생성시키는 2종의 mRNA를 생성한다. 다시 말하면, 8종의 바이러스 RNA 분절은 9종은 구조성이고 1종은 비구조성인 10종의 단백질을 코딩한다. 인플루엔자 바이러스의 유전자 및 그의 단백질 산물의 개요를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1: 인플루엔자 바이러스 게놈 RNA 분절 및 코딩 분배 a
Figure 112008047536917-PCT00001
인플루엔자 바이러스의 병원성은 다수의 바이러스 및 숙주 요인들에 의해 변화된다. 바이러스 감염에 대항하는 숙주 요인 중에서, 유형 I 인터페론 (IFNα/ β) 시스템은 진핵 생물의 진화에서 비교적 일찍 확립된 (문헌 [Garcia-Sastre, 2002, Microbes Infect 4:647-55]) 강력한 항바이러스 선천 방어 기작을 나타낸다. 항바이러스 IFNα/β 시스템은 하기의 3가지 주요 단계를 포함한다: (i) 바이러스 감염의 인지 및 IFNα/β 분비, (ii) 그 수용체에의 IFNα/β의 결합 및 IFNα/β-자극 유전자의 전사 유도, 및 (iii) 항바이러스 효소 및 단백질의 합성. 그러나, 대부분의 바이러스는 IFNα/β 길항제 분자를 코딩하는 후천성의 특이적 유전 정보를 가지고 있어서, 이것이 항바이러스 IFNα/β 시스템의 하나 이상의 단계를 효과적으로 차단한다. 인플루엔자 A 바이러스는 감염된 세포에서 비-구조성 단백질인 NS1 단백질 (하기에 상세하게 설명됨)을 발현하며, 이것이 세포의 IFNα/β 반응을 방해한다 (문헌 [Garcia-Sastre et al., 1998, Virology 252:324-30]).
2.1.1.1 고-병원성 조류 인플루엔자
근년에, 아시아와 유럽에서 고병원성 조류 인플루엔자 (HPAI)의 발생이 보고되고 있다 (문헌 [Kawaoka et al., 2005, Natl. Rev. Microbiol. 3:591-600; Koopmans et al., 2004, Lancet 363:587-593]). 인플루엔자 A, 아형 H5N1 또는 H7N7 바이러스를 수반하는 발생은 가축용 가금류의 치명적인 감염, 및 제한된 수의 인간의 경우 죽음을 초래한다 (문헌 [Tweed et al, 2004, Emerg. Infec. Dis. 10:2196-2199]). 현재 유행하고 있는 H5N1 바이러스는 근년 중국 내의 가금류 사이에서 순환되어 왔었는데 (문헌 [Chen et al., 2005, Nature 436:191-192]), 철새가 이 바이러스의 일차적인 보균자인 것으로 생각되고 있는 한편, 감염된 가금류로부터 다시 철새로의 전파가 그 지리학적 분포를 증가시키는 데에 기여하고 있는 것 으로 여겨진다. 현재, H5N1 바이러스는 아시아로부터 출현하여 유럽과 아프리카를 건너 퍼지고 있다 (문헌 [Enserink, 2006, Science, 311:932]). 홍콩에서 1997년에 그리고 네델란드에서 2003년에, 가금류의 전면적인 살처분이 H5N1 발생 근절의 성공적인 전략인 것으로 나타난 바 있다 (문헌 [Lipatov et al., 2004, J. Virol. 78:8951-8959]). 최근 HPAI 발생의 인간 희생자들은 감염된 가금류와 밀접한 접촉을 가졌었기 때문에, 조류 인플루엔자 바이러스 (AIV)의 종간 전파의 예방은 도살을 통한 가금류에서의 AIV의 근절에 의해 달성될 수 있을 것으로 생각된다. 그러나, 경제적 및 실질적 이유 때문에, 감염된 가금류 만의 살처분은 더 이상 이 질병의 억제에 좋은 방법으로 생각되지 않는다. 또한, 윤리적 및 생태학적 이유 때문에, 이동성 엽조의 살처분은 받아들이기 어려운 실천으로 생각되고 있다. 최근, OIE (세계 동물 건강 협회) 및 FAO (국제 연합의 식량 농업 기구)는 AIV의 억제를 위하여 가금류의 예방접종을 고려해야 한다고 권고하였다. 또한, 불활성화 H5 백신을 사용한 닭의 예방접종이 현장 조사에서 바이러스 전파의 저지에 성공적이었다는 것이 보고된 바 있다 (문헌 [Ellis et al., 2004, Avian Pathol. 33:405-412]). 최근, 중국은 예방접종을 그들의 AIV 억제 프로그램의 구성요소로서 수용하였다.
고병원성 H5N1 균주가 인간들 사이에 전파가능하게 될 수 있을 가능성이 전세계적인 전염병의 관점에서 언급되면서, WHO는 H5N1 바이러스가 인간 형태로 재조합된다면 그의 전세계적인 사망률을 추정하는 데에 난색을 표하고 있다. 따라서, 대부분의 인간으로의 전파가 그로부터 야기된 것으로 여겨지는 농업 가축에서의 H5N1 감염에 대한 관리 방법의 필요성이 분명하다.
2.1.2 뉴캐슬병 바이러스
뉴캐슬병 바이러스는 선형, 단일-가닥, 비분절의 음성 센스 RNA 게놈을 포함하는 외피형 바이러스이다. 게놈 RNA는 하기에 더 상세하게 기술되는 3'-N-P-M-F-HN-L 순서의 유전자들을 포함한다. 게놈 RNA는 또한 3' 말단에 리더(leader) 서열을 포함한다.
비리온의 구조적 요소에는 세포 원형질 막으로부터 유래되는 지질 이중층인 바이러스 외피가 포함된다. 당단백질인 헤마글루티닌-뉴라미니다제 (HN)가 외피로부터 돌출하여 헤마글루티닌 (예, 수용체 결합/융합생성)과 뉴라미니다제 모두의 활성을 제공한다. 역시 바이러스 막과 상호작용하는 융합 당단백질 (F)은 먼저 불활성의 전구체로서 생성된 다음, 번역-후 절단되어 2개의 디설파이드 연결된 폴리펩티드를 생성한다. 활성의 F 단백질은 바이러스 외피의 숙주 세포 원형질 막과의 융합을 촉진함으로써 NDV의 숙주 세포로의 침입에 관여한다. 매트릭스 단백질 (M)은 바이러스 조립과 관련이 있으며, 바이러스 막은 물론 뉴클레오캡시드 단백질 모두와 상호작용한다.
뉴클레오캡시드의 주된 단백질 서브유닛은 뉴클레오캡시드 단백질 (N)로서, 캡시드에 나선형의 대칭성을 부여한다. 뉴클레오캡시드와 관련이 있는 것은 P 및 L 단백질이다. 인산화되는 인단백질 (P)은 전사에서 조절 역할을 하며 메틸화, 인산화 및 폴리아데닐화에 관여할 수도 있는 것으로 여겨진다. RNA-의존 RNA 폴리머라제를 코딩하고 있는 L 유전자는 P 단백질과 함께 바이러스 RNA 합성에 필요하다. 바이러스 게놈 코딩 용량의 거의 절반을 차지하는 L 단백질은 바이러스 단백질 중 가장 크며, 전사와 복제 모두에서 중요한 역할을 한다.
RNA 복제에 필요한 세포내 기구가 없기 때문에, NDV를 포함한 모든 음성-가닥 RNA 바이러스의 복제는 복잡하다. 또한, 음성-가닥 게놈은 바로 단백질로 번역될 수 없으며, 먼저 양성-가닥 (mRNA) 사본으로 전사되어야 한다. 따라서, 숙주 세포로 진입하였다고 해서 바이러스가 필요한 RNA-의존 RNA 폴리머라제를 합성할 수 있는 것은 아니다. 감염시, 게놈과 함께 L, P 및 N 단백질이 세포로 진입해야 한다.
NDV mRNA를 전사하는 대부분 또는 모든 바이러스 단백질이 그의 복제 또한 수행한다는 것이 가설화되어 있다. 동일한 일련 단백질의 호환 사용 (즉, 전사 또는 복제)을 조절하는 기작이 명백하게 밝혀지지는 않았으나, 1종 이상의 뉴클레오캡시드 단백질, 특히 N의 유리 형태가 풍부한 것과 관련이 있는 것으로 보인다. 바이러스의 침입에 이어서 곧바로, 뉴클레오캡시드 중의 음성-극성 RNA를 주형으로 사용하여 L 단백질에 의해 전사가 개시된다. 바이러스 RNA 합성은 그것이 전사시 단일시스트론 mRNA를 생성하도록 조절된다.
전사에 이어서, 바이러스 게놈의 복제가 음성-가닥 RNA 바이러스에 의함 감염에서 두번째 필수적인 사건이다. 다른 음성-가닥 RNA 바이러스에서와 마찬가지로, 뉴캐슬병 바이러스 (NDV)에서의 바이러스 게놈 복제는 바이러스-특이적 단백질에 의해 중재된다. 복제를 위한 RNA 합성의 첫번째 산물은 NDV 게놈 RNA의 상보적 사본 (즉, 양성-극성) (cRNA)이다. 이 양성-가닥 사본 (안티-게놈)은 그 말단의 구조에서 양성-가닥 mRNA 전사체와 다르다. mRNA 전사체와는 달리, 안티-게놈 cRNA는 5'-말단에서 캡핑 및 메틸화되지 않으며, 3' 말단에서 절단 및 폴리아데닐화되지 않는다. cRNA는 그의 음성 가닥 주형과 공동 말단(coterminal)이며, 각 게놈 RNA 분절의 모든 유전적 정보를 상보적 형태로 포함한다. cRNA는 NDV 음성-가닥 바이러스 게놈 (vRNA)의 합성을 위한 주형으로서 작용한다.
NDV 음성 가닥 게놈 (vRNA) 및 안티게놈 (cRNA) 모두는 뉴클레오캡시드 단백질에 의해 캡시드화(encapsidated) 되는 바; 유일한 비캡시드화 RNA 종은 바이러스 mRNA이다. NDV에 있어서, 세포질은 바이러스 RNA 복제의 위치이며, 그와 마찬가지로 전사의 위치이다. 바이러스 구성요소의 조립은 숙주 세포의 원형질 막에서 일어나는 것으로 보이며, 성숙한 바이러스는 출아에 의해 방출된다.
2.2 면역원성 제제
재조합 DNA 기술 및 "역 유전학(reverse genetics)" 조작 기술은 면역원성 제제에 사용하기 위한 재조합 바이러스를 생산하는 독특한 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 그것이 천연 바이러스 항원뿐만 아니라 바이러스 단백질 코트(coat)로 혼입되도록 설계될 수 있는 어떠한 항원도 발현 또는 나타내도록 하는, 음성-가닥 RNA 바이러스의 조작 방법을 제공한다. 특히 중요한 것은 인플루엔자가 아닌 다른 감염성 생물로부터 유래하는 항원이다. 이러한 방식으로 하나의 바이러스가 2종 이상의 병원체에 대한 보호를 제공하게 될 면역 반응을 도출, 활성화 또는 유발하는 데에 유용한 면역원성 합성물로서 조작될 수 있다. 이러한 키메라 바이러스는 필요에 따라 그 독성(virulence)이 변형되도록 추가적으로 조작될 수 있는 바, 다시 말하면, 그것은 약독화된 것이거나 추가로 약독화될 수 있다. 약독화 된 인플루엔자 바이러스는 그것이 면역원성이면서 복제 가능하지만 병원성은 아니기 때문에 유리하다.
생 백신은 향상된 교차-반응성 세포-중재 세포독성은 물론 체액성 항체 반응을 유발함으로써 불활성화 백신에 비해 더 우수한 보호를 제공하는 것으로 여겨지고 있다 (문헌 [Gorse and Belshe, 1990, J. Clin. Microbiol. 28:2539-2550]; 및 [Gorse et al., 1995, J. Infect. Dis. 172:1-10]). 두번째로, 바이러스 질병에 대한 보호성 면역은 점막의 IgA 반응과 관련이 있는 것으로 여겨지는데, 이것은 통상적인 근육내 투여 백신으로는 볼 수 없는 것이다 (문헌 [Nelson et al., 1998, Vaccine 16:1306-1313]). 마지막으로, 생 백신은 또한, 때로 불활성화 보조 백신의 근육내 투여와 관련이 있는 부기 및 근육 동통을 피한다는 비강내 투여의 장점도 가진다. 이러한 생 백신은 동형 인플루엔자 바이러스에 대한 체액 반응뿐만 아니라 교차반응성 세포-중재 세포독성도 유발하는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 본 발명은 신규하고 더 효과적인 면역 제제, 예컨대 백신 제제의 개발을 위한, 그리고 바이러스성 및 비-바이러스성 병원체 모두의 진단, 예방, 관리 또는 치료를 위한 가능성을 제공한다.
3. 발명의 개요
본 발명은 비리온으로 혼입되는 융합 단백질을 발현하도록 조작된 키메라형 음성 가닥 RNA 바이러스, 그러한 키메라 바이러스의 제조 방법 및 그러한 바이러스의 예컨대 면역원성 제제 또는 생체외 분석에서의 면역원으로서의 용도를 제공한다. 본 발명의 키메라 바이러스는 비리온의 표면 상에 바이러스 관련 항원뿐만 아 니라 융합 단백질도 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 키메라 인플루엔자 바이러스 또는 키메라 NDV를 투여하는 것에 의해 대상, 예컨대 조류 또는 인간이 2종의 감염원에 대하여 면역화되도록 하는 키메라 인플루엔자 바이러스 및 키메라 NDV를 제공한다. 일 양태에서, 면역 반응을 유발하는 데에 단일의 바이러스를 사용하는 것은 면역화 제제의 투여 빈도를 감소시킨다. 다른 양태에서, 면역 반응을 유발하는 데에 단일의 바이러스를 사용하는 것은 면역화 대상의 비용을 감소시킨다. 면역화 대상의 더 낮은 비용은 더 많은 대상이 면역화될 수 있게 되고 그에 따라 감염으로 고통받는 대상의 치료와 관련한 보건 비용을 감소시킬 가능성을 증가시킨다.
본 발명은 또한 본 발명 키메라 바이러스의 인간 또는 동물용 조성물 (예, 면역원성 제제)에서의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 키메라 바이러스는 광범위한 바이러스 및/또는 항원에 대한 백신으로서 사용될 수 있다. 본 키메라 바이러스는 비리온에서 외래의 항원결정인자를 발현하도록 조작되기 때문에, 본 발명의 키메라 바이러스를 포함하는 조성물 (예, 백신 제제)은 다수의 균주 변이, 서로 다른 바이러스, 또는 완전히 상이한 감염원이나 질병 항원 (예, 세균, 기생충, 균류 또는 종양 특이적 항원)에 대한 면역화를 위하여 설계될 수 있다. 면역 또는 적절한 시토카인 반응을 유발하기 위하여 인간 또는 동물 대상에 생 약독화 바이러스 제제를 도입시키는 데에는 많은 방법들이 사용될 수 있다. 여기에는 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내 및 피하의 경로가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 키메라 바이러스는 키메라 바이러스를 투여하는 것에 의해 대상 (예, 조류)이 2종의 감염성 질병에 대하여 면역화될 수 있게 한다. 구체적인 구현예에서, 본 발명의 키메라 바이러스는 본 발명의 키메라 바이러스를 투여하는 것에 의해 조류가 조류 인플루엔자 바이러스 및 뉴캐슬병 바이러스에 대하여 면역화될 수 있게 한다. 조류는 키메라 바이러스를 그에 분무함으로써, 또는 그들이 마시는 물과 같은 수용액에 키메라 바이러스를 투여함으로써 쉽게 면역화될 수 있다.
본 발명은 부분적으로, 바이러스의 1종 이상 필수 당단백질의 세포질 및 막횡단 도메인 및 제2 감염원 단백질의 엑토도메인을 포함하는 융합 단백질(여기서 융합 단백질은 필수 당단백질을 기능적으로 대체함)을 발현하여 자신의 비리온으로 혼입하도록 인플루엔자 바이러스를 조작함으로써, 2종의 감염원에 대한 효과적인 면역 반응이 달성될 수 있다는 출원인의 발견을 기초로 한다. 일 양태에서, 비리온으로의 융합 단백질의 혼입은 제2 감염원의 엑토도메인에 대한 향상된 면역 반응으로 귀결된다. 바이러스 필수 당단백질의 세포질 및 막횡단 도메인을 융합 단백질 내로 조작해 넣음으로써 융합 단백질이 비리온 내로 혼입되도록 한다. 구체적인 구현예에서, 필수 당단백질은 인플루엔자 바이러스 HA 및/또는 NA 단백질 중 하나 또는 모두이다. 다른 구현예에서, 필수 당단백질은 NDV의 HN 또는 F 단백질 중 하나 또는 모두이다. 바이러스의 1종 이상 필수 당단백질의 기능적 대체(functional replacement)는 바이러스 게놈 (예, 인플루엔자 바이러스 게놈)의 크기 제한에 대한 염려를 해소한다. 소정 구현예에서, 융합 단백질을 사용한 바이러스의 1종 이상 필수 당단백질의 기능적 대체는 대상에서의 바이러스 복제를 약화 시킨다.
본 발명은 (i) 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의 엑토도메인 및 이것이 융합되는 (ii) 인플루엔자 바이러스의 필수 유전자에 의해 코딩되는 당단백질의 막횡단 및 세포질 도메인을 가지는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되고, 필수 유전자의 기능은 융합 단백질에 의해 또는 조류 인플루엔자 바이러스의 천연 당단백질에 의해 제공되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 소정 구현예에서, 인플루엔자 바이러스의 필수 유전자는 헤마글루티닌 (HA) 유전자이다. 다른 구현예에서, 인플루엔자 바이러스의 필수 유전자는 뉴라미니다제 (NA) 유전자이다. 소정 구현예에서, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 약독화된다. 이들 구현예에 있어서, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 NS1 유전자에서의 돌연변이에 의해 약독화될 수 있다.
본 발명은 (i) NDV HN 단백질의 엑토도메인 및 이것이 융합되는 (ii) 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 막횡단 도메인 및 세포질 도메인을 가지는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되고, NA 단백질의 기능은 융합 단백질에 의해 또는 조류 인플루엔자 바이러스의 천연 당단백질에 의해 제공되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 소정 구현예에서, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 약독화된다. 이들 구현예에 있어서, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 NS1 유전자에서의 돌연변이에 의해 약독화될 수 있다. 본 발명에 있어서, 어떠한 조류 인플루엔자 바이러스 유형, 아형 또는 균주도 사용될 수 있다.
본 발명은 뉴라미니다제 융합 단백질을 코딩하는 패키지화 인플루엔자 바이러스 NA 분절을 포함하며, 여기서 NA 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은, NA 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 그의 N-말단에 의해 앵커링되는(anchored) 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 뉴라미니다제 항원의 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되도록 변형되고, 이로써 상기 뉴라미니다제 융합 단백질이 발현되어 키메라 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
본 발명은 헤마글루티닌 융합 단백질을 코딩하는 패키지화 인플루엔자 바이러스 HA 분절을 포함하며, 여기서 HA 오픈 리딩 프레임은, HA 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 그의 C-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원 수용체 결합/융합생성 항원의 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되도록 변형되고, 이로써 상기 헤마글루티닌 융합 단백질이 발현되어 키메라 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
본 발명은 (a) 조류 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임, 및 (b) 헤마글루티닌 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 그의 C-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의 엑토도메인을 코딩하거나 질병 항원을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환된 헤마글루티닌 융합 단백질을 코딩하는 제2 오픈 리딩 프레임을 포함하는 패 키지화 이중시스트론성 인플루엔자 바이러스 HA 분절을 포함하고, 이로써 상기 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌과 융합 단백질 모두가 발현되어 키메라 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 소정 구현예에서, 키메라 조류 바이러스 HA 분절의 제1 오픈 리딩 프레임은 헤마글루티닌 다염기성 절단 부위가 제거되도록 변형된다.
본 발명은 (a) 조류 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임, 및 (b) 뉴라미니다제 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 N-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의 엑토도메인을 코딩하거나 질병 항원을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환된 뉴라미니다제 융합 단백질을 코딩하는 제2 오픈 리딩 프레임을 포함하는 패키지화 이중시스트론성 인플루엔자 바이러스 NA 분절을 포함하고, 이로써 상기 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제와 융합 단백질 모두가 발현되어 키메라 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 소정 구현예에서, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 헤마글루티닌 다염기성 절단 부위가 제거되도록 변형된 오픈 리딩 프레임을 가지는 HA 분절을 포함한다.
본 발명은 뉴라미니다제 융합 단백질을 코딩하는 패키지화 인플루엔자 바이러스 NA 분절을 포함하며, 여기서 NA 오픈 리딩 프레임은, NA 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 NDV HN 항원의 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되도록 변형되고, 이로써 상기 뉴라미니다제 융합 단백질이 발현되어 키메라 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한 다. 뉴라미니다제 융합 단백질은 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 위한 뉴라미니다제 활성을 제공한다.
소정 구현예에서, 본 발명의 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 바이러스의 세포 인터페론 길항제 활성을 감소시키는 변형 NS1 단백질을 코딩하는 패키지화 NS1 유전자 분절을 포함한다. 변형 NS1 단백질을 제공하는 NS1 유전자에서의 돌연변이의 비-제한적인 예는 하기 5.1.2 부문에 제공되어 있다.
본 발명은 본 발명 키메라 조류 인플루엔자 바이러스의 NA 분절을 코딩하는 재조합 핵산 분자 (예, 재조합 DNA 분자)를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명 키메라 조류 인플루엔자 바이러스의 HA 분절을 코딩하는 재조합 핵산 분자 (예, 재조합 DNA 분자)를 제공한다. 본 발명은 추가적으로 본 발명 키메라 조류 인플루엔자 바이러스의 NA 분절 또는 HA 분절을 코딩하는 재조합 핵산 분자 (예, 재조합 RNA 분자)를 제공한다.
본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 감수성인 부화란(embryonated egg) 또는 세포주(cell line)에서 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 배양하는 것을 포함하는, 본 발명 키메라 조류 인플루엔자 바이러스의 증식 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 면역원성 제제의 제조 방법을 제공하는 바, 상기 방법은: (a) 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 감수성인 부화란 또는 세포주에서 본 발명의 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 증식시키는 것; 및 (b) 자손 바이러스를 수집하는 것을 포함하며, 여기서 바이러스는, 자손 바이러스가 면역원성 제제, 예컨대 백신 제제에 사용하기에 적합하도록, 바이러스에 오염이 없게 하기에 충분한 조건 하에서 충분한 양으로 생육된다.
본 발명은 (i) 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의 엑토도메인 및 이것이 융합되는 (ii) 인플루엔자 바이러스의 필수 유전자에 의해 코딩되는 당단백질의 막횡단 및 세포질 도메인을 가지는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 약독화된 인플루엔자 바이러스로 혼입되고, 필수 유전자의 기능은 융합 단백질에 의해 또는 약독화된 인플루엔자 바이러스의 천연 당단백질에 의해 제공되는, 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 소정 구현예에서, 인플루엔자 바이러스의 필수 유전자는 헤마글루티닌 (HA) 유전자이다. 다른 구현예에서, 인플루엔자 바이러스의 필수 유전자는 뉴라미니다제 (NA) 유전자이다. 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스는 모든 유형, 아형 또는 균주의 인플루엔자 바이러스일 수 있다. 예를 들어, 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스 또는 인플루엔자 C 바이러스일 수 있다.
본 발명은 뉴라미니다제 융합 단백질을 코딩하는 패키지화 인플루엔자 바이러스 NA 분절을 포함하며, 여기서 NA 오픈 리딩 프레임은, NA 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 그의 N-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 뉴라미니다제 항원의 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되도록 변형되고, 이로써 상기 뉴라미니다제 융합 단백질이 발현되어 약독화된 키메라 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 소정 구현예에서, 본 발명의 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스는 헤마글루티닌 다염기성 절단 부위가 제거되도록 변형된 오픈 리딩 프레임을 가지는 HA 분절 을 포함한다.
본 발명은 헤마글루티닌 융합 단백질을 코딩하는 패키지화 인플루엔자 바이러스 HA 분절을 포함하며, 여기서 HA 오픈 리딩 프레임은, HA 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 그의 C-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자가 아닌 다른 감염원 헤마글루티닌 항원의 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되도록 변형되고, 이로써 상기 헤마글루티닌 융합 단백질이 발현되어 약독화된 키메라 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
본 발명은 (a) 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임, 및 (b) 헤마글루티닌 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 그의 C-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의 엑토도메인을 코딩하거나 질병 항원을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환된 헤마글루티닌 융합 단백질을 코딩하는 제2 오픈 리딩 프레임을 포함하는 패키지화 이중시스트론성 인플루엔자 바이러스 HA 분절을 포함하고, 이로써 상기 인플루엔자 헤마글루티닌과 융합 단백질 모두가 발현되어 약독화된 키메라 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 소정 구현예에서, 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스 HA 분절의 제1 오픈 리딩 프레임은 헤마글루티닌 다염기성 절단 부위가 제거되도록 변형된다.
본 발명은 (a) 인플루엔자 뉴라미니다제 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임, 및 (b) 뉴라미니다제 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 N-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의 엑토도메인을 코딩 하거나 질병 항원을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환된 뉴라미니다제 융합 단백질을 코딩하는 제2 오픈 리딩 프레임을 포함하는 패키지화 이중시스트론성 인플루엔자 바이러스 NA 분절을 포함하고, 이로써 상기 인플루엔자 뉴라미니다제와 융합 단백질 모두가 발현되어 약독화된 키메라 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 소정 구현예에서, 본 발명의 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스는 헤마글루티닌 다염기성 절단 부위가 제거되도록 변형된 오픈 리딩 프레임을 가지는 HA 분절을 포함한다.
소정의 구현예에서, 본 발명의 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스는 바이러스의 세포 인터페론 길항제 활성을 감소시키는 변형 NS1 단백질을 코딩하는 패키지화 NS1 유전자 분절을 포함한다.
본 발명은 본 발명 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스의 NA 분절을 코딩하는 재조합 핵산 분자 (예, 재조합 DNA 분자)를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스의 HA 분절을 코딩하는 재조합 핵산 분자 (예, 재조합 DNA 분자)를 제공한다. 본 발명은 추가적으로 본 발명 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스의 NA 분절 또는 HA 분절을 코딩하는 재조합 핵산 분자 (예, 재조합 RNA 분자)를 제공한다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염에 감수성인 부화란 또는 세포주에서 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스를 배양하는 것을 포함하는, 본 발명 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스의 증식 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 면역원성 제제의 제조 방법을 제공하는 바, 상기 방법은: (a) 약독화 인플루엔자 바이러스 감염 에 감수성인 부화란 또는 세포주에서 본 발명의 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스를 증식시키는 것; 및 (b) 자손 바이러스를 수집하는 것을 포함하며, 여기서 바이러스는, 자손 바이러스가 면역원성 제제, 예컨대 백신 제제에 사용하기에 적합하도록, 바이러스에 오염이 없게 하기에 충분한 조건 하에서 충분한 양으로 생육된다.
본 발명은 또한 키메라 NDV 바이러스를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 (i) NDV가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의 엑토도메인 및 이것이 융합되는 (ii) NDV의 필수 유전자에 의해 코딩되는 당단백질의 막횡단 및 세포질 도메인을 가지는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 NDV로 혼입되고, 필수 유전자의 기능은 융합 단백질에 의해 또는 NDV의 천연 당단백질에 의해 제공되는, 키메라 NDV를 제공한다. 소정 구현예에서, NDV의 필수 NDV 유전자는 F 단백질을 코딩하는 유전자이다. 다른 구현예에서, NDV의 필수 NDV 유전자는 HN 단백질을 코딩하는 유전자이다. 본 발명에 있어서, 어떠한 NDV 유형, 아형 또는 균주도 사용될 수 있다.
본 발명은 F 단백질의 막횡단 및 세포질 도메인과, C-말단에 의해 앵커링되는 NDV가 아닌 다른 감염원 항원의 엑토도메인 또는 질병 항원을 가지는 F 단백질-융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 패키지화 게놈을 포함함으로써, F 단백질-융합 단백질이 발현되어 키메라 NDV로 혼입되는 키메라 NDV를 제공한다. 소정 구현예에서, 키메라 NDV의 게놈은 F 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함함으로써, NDV F 단백질-융합 단백질 이외에도 F 단백질이 발현되어 키메라 NDV로 혼입된다. 다른 구현예에서는, NDV F 단백질-융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 NDV F 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 치환하며, F 단백질-융합 단백질이 키메라 NDV를 위한 F 단백질의 기능을 제공한다.
본 발명은 HN 단백질의 막횡단 및 세포질 도메인과, N-말단에 의해 앵커링되는 NDV가 아닌 다른 감염원 항원의 엑토도메인 또는 질병 항원을 가지는 HN 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 패키지화 게놈을 포함함으로써, HN 융합 단백질이 발현되어 키메라 NDV로 혼입되는 키메라 NDV를 제공한다. 소정 구현예에서, 키메라 NDV의 게놈은 HN 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함함으로써, NDV HN 융합 단백질 이외에도 HN 단백질이 발현되어 키메라 NDV로 혼입된다. 다른 구현예에서는, HN 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 NDV HN 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 치환하며, HN 융합 단백질이 키메라 NDV를 위한 HN 단백질의 기능을 제공한다. 본 발명은 NDV HN 단백질 또는 F 단백질을 코딩 및/또는 코딩하는 재조합 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 NDV 감염에 감수성인 부화란 또는 세포주에서 키메라 NDV를 배양하는 것을 포함하는, 본 발명 키메라 NDV의 증식 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 면역원성 제제의 제조 방법을 제공하는 바, 상기 방법은: (a) NDV 감염에 감수성인 부화란 또는 세포주에서 본 발명의 키메라 NDV를 증식시키는 것; 및 (b) 자손 바이러스를 수집하는 것을 포함하며, 여기서 바이러스는, 자손 바이러스가 면역원성 제제, 예컨대 백신 제제에 사용하기에 적합하도록, 바이러스에 오염이 없게 하기에 충분한 조건 하에서 충분한 양으로 생육된다.
본 발명은 본 발명의 키메라 바이러스를 포함하는 부화란을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 키메라 바이러스를 포함하는 세포주를 제공한다. 본 발명은 추가적으로 본 발명의 키메라 바이러스를 포함하는 면역원성 제제를 제공한다.
본 발명은 대상에서 1종, 2종 또는 그 이상의 감염원에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명 키메라 인플루엔자 바이러스의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 소정 구현예에서, 대상은 인간 대상이다. 다른 구현예에서, 대상은 비-인간 포유류 (예, 돼지, 말, 개, 또는 고양이)이다. 또 다른 구현예에서, 대상은 조류 대상이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 조류에서 1종, 2종 또는 그 이상의 감염원에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명 키메라 조류 인플루엔자 바이러스의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 대상에서 1종, 2종 또는 그 이상의 감염원에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명 키메라 NDV의 유효량을 대상에 투여하는 것을 포함한다. 소정 구현예에서, 대상은 인간 대상이다. 다른 구현예에서, 대상은 비-인간 포유류 (예, 돼지, 말, 개, 또는 고양이)이다. 또 다른 구현예에서, 대상은 조류 대상이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 조류에서 1종, 2종 또는 그 이상의 감염원에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명 키메라 NDV의 유효량을 조류에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 대상에서 1종, 2종 또는 그 이상의 감염원에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스의 유효량을 대상에 투여하는 것을 포함한다. 소정 구현예에서, 대상은 인간 대상 이다. 다른 구현예에서, 대상은 비-인간 포유류 (예, 돼지, 말, 개, 또는 고양이)이다. 또 다른 구현예에서, 대상은 조류 대상이다. 특정 구현예에서, 본 발명은 인간에서 1종, 2종 또는 그 이상의 감염원에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명 키메라 바이러스의 유효량을 그를 필요로 하는 인간에 투여하는 것을 포함한다.
본 발명은 질병 항원에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명 키메라 바이러스의 유효량을 대상에 투여하는 것을 포함한다. 소정 구현예에서, 대상은 인간이다. 다른 구현예에서, 대상은 조류이다.
3.1 용어
여기에서 사용되는 용어 "동물"에는 반려 동물 (예, 개 및 고양이), 동물원 동물, 농장 동물 (예, 반추동물, 비-반추동물, 가축류 및 가금류), 야생 동물, 및 실험실 동물 (예, 랫트, 마우스 및 기니 피그와 같은 설치류, 및 토끼), 및 유전적으로 또는 다르게 클로닝되거나 변형된 동물 (예, 유전자이전 동물)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여기에서 사용되는 용어 "약" 또는 "대략"이 수와 관련하여 사용될 경우, 언급된 수의 1, 5 또는 10 % 이내의 모든 수를 말한다.
여기에서 사용되는 NS1의 "아미노-말단"이라는 구는 인플루엔자 바이러스 NS1 단백질의 아미노 종단 아미노산 잔기 (아미노산 잔기 1) 내지 아미노산 잔기 115, 아미노산 잔기 1 내지 100, 아미노산 잔기 1 내지 75, 아미노산 잔기 1 내지 50, 아미노산 잔기 1 내지 25, 또는 아미노산 잔기 1 내지 10의 아미노산을 말한 다. 아미노 말단의 결실(deletion)에는 NS1 아미노 말단으로부터 5, 바람직하게는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 73, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 또는 175 아미노산 잔기로 구성되는 결실이 포함될 수 있다.
여기에서 사용되는 NS1의 "카르복시-말단"이라는 구는, NS1의 아미노-말단이 인플루엔자 바이러스 NS1 단백질의 아미노산 잔기 1 내지 아미노산 잔기 115, 아미노산 잔기 1 내지 100, 아미노산 잔기 1 내지 75, 아미노산 잔기 1 내지 50, 또는 아미노산 잔기 1 내지 25일 경우, 각각 말 인플루엔자 바이러스 NS1 단백질의 아미노산 잔기 116 내지 카르복시 종단 아미노산 잔기, 아미노산 잔기 101 내지 카르복시 종단 아미노산 잔기, 아미노산 잔기 76 내지 카르복시 종단 아미노산 잔기, 아미노산 잔기 51 내지 카르복시 종단 아미노산 잔기, 또는 아미노산 잔기 26 내지 카르복시 종단 아미노산 잔기를 말한다. 카르복시 말단의 결실에는 NS1의 카르복시 종단으로부터 5, 바람직하게는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 73, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 또는 175 아미노산 잔기로 구성되는 결실이 포함될 수 있다.
여기에서 사용되는 용어 "질병" 및 "장애"는 대상에서의 이상을 의미하기 위하여 호환적으로 사용되며, 증식성 장애 (예, 백혈병, 섬유증, 암종 (악성, 비-악성, 전이성 및 비-전이성 암종 포함), 및 림프종), 및 감염원 (예, 바이러스, 세균, 기생충)에 의한 감염, 또는 그와 관련된 이상이나 증상을 포괄하지만, 이에 제 한되는 것은 아니다.
여기에서 사용되는 용어 "항원결정인자(epitope)"는 대상에서 항원성 또는 면역원성 활성을 가지는 분자 (예, 폴리펩티드 또는 단백질)의 부위, 단편 또는 영역을 말한다. 면역원성 활성을 가지는 항원결정인자는 대상에서 항체 반응을 유발하는 분자 (예, 폴리펩티드 또는 단백질)의 부위, 단편 또는 영역이다. 항원성 활성을 가지는 항원결정인자는 업계 숙련자에게 잘 알려진 소정의 방법에 의해, 예컨대 면역분석에 의해 확인하였을 때 항체가 면역특이적으로 결합하는 분자의 부위, 단편 또는 영역이다.
여기에 사용되는 단백질성 물질 맥락의 용어 "단편"은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질 아미노산 서열 중 연속되는 아미노산 잔기 2 이상, 연속되는 아미노산 잔기 5 이상, 연속되는 아미노산 잔기 10 이상, 연속되는 아미노산 잔기 15 이상, 연속되는 아미노산 잔기 20 이상, 연속되는 아미노산 잔기 25 이상, 연속되는 아미노산 잔기 40 이상, 연속되는 아미노산 잔기 50 이상, 연속되는 아미노산 잔기 60 이상, 연속되는 아미노산 잔기 70 이상, 연속되는 아미노산 잔기 80 이상, 연속되는 아미노산 잔기 90 이상, 연속되는 아미노산 잔기 100 이상, 연속되는 아미노산 잔기 125 이상, 연속되는 아미노산 잔기 150 이상, 연속되는 아미노산 잔기 175 이상, 연속되는 아미노산 잔기 200 이상, 연속되는 아미노산 잔기 250 이상의 아미노산 서열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 말한다. 일 구현예에서, 전체-길이 단백질의 단편은 전체-길이 단백질의 활성을 보유한다. 다른 구현예에서, 전체-길이 단백질의 단편은 전체-길이 단백질의 활성을 보유하지 않는다.
여기에 사용되는 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 맥락의 용어 "단편"은 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 핵산 서열 중 연속되는 뉴클레오티드 2 이상, 연속되는 뉴클레오티드 5 이상, 연속되는 뉴클레오티드 10 이상, 연속되는 뉴클레오티드 15 이상, 연속되는 뉴클레오티드 20 이상, 연속되는 뉴클레오티드 25 이상, 연속되는 뉴클레오티드 30 이상, 연속되는 뉴클레오티드 35 이상, 연속되는 뉴클레오티드 40 이상, 연속되는 뉴클레오티드 50 이상, 연속되는 뉴클레오티드 60 이상, 연속되는 뉴클레오티드 70 이상, 연속되는 80 뉴클레오티드 이상, 연속되는 뉴클레오티드 90 이상, 연속되는 뉴클레오티드 100 이상, 연속되는 뉴클레오티드 125 이상, 연속되는 뉴클레오티드 150 이상, 연속되는 뉴클레오티드 175 이상, 연속되는 뉴클레오티드 200 이상, 연속되는 뉴클레오티드 250 이상, 연속되는 뉴클레오티드 300 이상, 연속되는 뉴클레오티드 350 이상, 연속되는 뉴클레오티드 380 이상의 핵산 서열을 포함하는 핵산을 말한다. 바람직한 구현예에서, 핵산의 단편은 전체-길이 단백질의 활성을 보유하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 코딩한다. 다른 구현예에서, 전체-길이 단백질의 단편은 전체-길이 단백질의 활성을 보유하지 않는다.
여기에서 사용되는 단백질성 물질 맥락의 용어 "이종유래 서열"은 자연 상에서는 키메라 바이러스 골격, 또는 구체적으로 키메라 바이러스 당단백질과 관련이 있는 것으로 확인되지 않는 분자를 말한다. 핵산 서열 또는 핵산 분자 맥락의 용어 "이종유래 서열"은 자연 상에서는 키메라 바이러스 골격의 게놈과 관련이 있는 것으로 확인되지 않는 분자를 말한다.
용어 "면역특이적으로 항원에 결합하다" 및 그와 유사한 용어가 여기에서 사용되는 경우, 항원에 특이적으로 결합하며 다른 분자에는 특이적으로 결합하지 않는 분자 (예, 변형 항체 (즉, 변형된 IgG (예, IgG1) 불변 도메인, 또는 그의 FcRn-결합 단편 (예, Fc-도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하는 항체) 및 비변형 항체 (즉, 변형된 IgG (예, IgG1) 불변 도메인, 또는 그의 FcRn-결합 단편 (예, Fc-도메인 또는 힌지-Fc 도메인)을 포함하지 않는 항체) 모두를 포함한 항원 특이적 항체)에 적용된다. 하나의 항원에 특이적으로 결합하는 분자가 연관 항원에 교차-반응성일 수 있다. 바람직하게는, 하나의 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 다른 항원과 교차-반응하지 않는다. 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 예컨대 면역분석, BIA코어(BIAcore), 또는 업계 숙련자에게 알려진 다른 기술에 의해 확인될 수 있다. 방사선면역분석 (RIA) 및 효소-연관 면역흡착 분석 (ELISA)과 같은 실험 기술을 사용하여 측정하였을 때, 항원에 특이적으로 결합하는 분자는 결합시 어떠한 교차-반응성 항원보다도 더 큰 친화성으로 상기 항원에 결합한다. 항체 특이성과 관련한 논의에 있어서는, 예컨대 문헌 [Paul, ed., 1989, Fundamental Immunology Second Edition, Raven Press, New York at pages 332-336]을 참조하라.
대상에 대한 요법(들)의 투여 맥락에서 용어 "조합하여"가 여기에서 사용되는 경우, 1종 이상의 요법 (예, 1종 이상의 예방제 및/또는 치료제)이 사용됨을 의미한다. 용어 "조합하여"의 사용이 대상 (예, 인플루엔자 바이러스 감염, 및 NDV 감염, 또는 그와 관련된 이상이나 증상을 가지는 대상, 또는 또 다른 감염(예, 또 다른 바이러스 감염)을 가지는 대상)에 요법 (예, 예방 및/또는 치료제)이 투여되는 순서를 제한하지는 않는다. 제1 요법 (예, 제1 예방 또는 치료제)은 제2 요법 (예, 제2 예방 또는 치료제)의 투여에 앞서 (예, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 전에), 그와 동시에, 또는 그에 이어서 (예, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 후에) 대상 (예, 인플루엔자 바이러스 감염, NDV 감염 또는 그와 관련된 이상이나 증상, 또는 또 다른 감염(예, 또 다른 바이러스 감염)을 가지는 대상)에 투여될 수 있다.
여기에서 사용되는 단백질성 물질의 "인터페론 길항제 활성"이라는 구는 세포의 인터페론 면역 반응을 감소시키거나 억제하는 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 그의 단편, 유도체 또는 유사물에 적용된다. 구체적으로, 인터페론 길항제 활성을 가지는 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 그의 단편, 유도체 또는 유사물 (예, 인플루엔자 바이러스 NS1)은 인터페론의 발현 및/또는 활성을 감소시키거나 억제한다. 특정 구현예에서, "인터페론 길항제 활성"이라는 구는 세포의 인터페론 면역 반응을 감소시키거나 억제하는 바이러스 단백질 또는 폴리펩티드, 또는 그의 단편, 유도체 또는 유사물 (예, 인플루엔자 바이러스 단백질)에 적용된다. 인터페론 길항제 활성을 가지는 바이러스 단백질 또는 폴리펩티드는 1 또는 2 유형의 인터페론 (IFN)의 발현 및/또는 활성에 우선적으로 영향을 줄 수 있다. 일 구현예에서는, IFN-α의 발현 및/또는 활성이 영향을 받는다. 다른 구현예에서는, IFN-β의 발현 및/또는 활성이 영향을 받는다. 또 다른 특정 구현예에서는, IFN-γ의 발현 및/또는 활성이 영향을 받는다. 소정 구현예에서, 부화란 또는 세포에서의 IFN-α, IFN-β 및/또는 IFN-γ의 발현 및/또는 활성은, 여기에서 기술되거나 업계 숙련자에게 알려진 기술에 의해 측정하였을 때, 그러한 단백질성 물질을 발현하지 않거나 그와 접촉하지 않는 대조용 부화란 또는 세포에서의 IFN-α, IFN-β 및/또는 IFN-γ의 발현 및/또는 활성에 비해, 인터페론 길항제 활성을 가지는 단백질성 물질에 의해 대략 1 내지 대략 100배, 대략 5 내지 대략 80배, 대략 20 내지 대략 80배, 대략 1 내지 대략 10배, 대략 1 내지 대략 5배, 대략 40 내지 대략 80배, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100배 감소된다.
여기에서 사용되는 "IFN 결핍 시스템" 또는 "IFN-결핍 재료"라는 구는 1, 2 또는 그 이상 유형의 IFN을 생성하지 않거나, 또는 모든 유형의 IFN을 생성하지 않거나, 또는 1, 2 또는 그 이상 유형의 IFN을 저농도로 생성하거나, 또는 모든 IFN을 저농도로 생성 (즉, 동일한 조건 하의 IFN-적격 시스템과 비교하였을 때 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% 또는 그 이상의 모든 IFN 발현 감소)하거나, 1, 2 또는 그 이상 유형의 IFN에 대하여 반응하지 않거나 또는 덜 효과적으로 반응하거나, 또는 모든 유형의 IFN에 대하여 반응하지 않거나, 및/또는 1, 2 또는 그 이상 유형의 IFN에 의해 유도되거나 또는 모든 유형의 IFN에 의해 유도되는 항바이러스 유전자의 활성이 결핍되어 있는, 시스템, 예컨대 세포, 세포주 및 마우스, 닭, 칠면조, 토끼, 랫트, 말 등과 같은 동물을 말한다.
여기에서 사용되는 용어 "감염", "인플루엔자 감염", "조류 인플루엔자 감염" 및 "NDV 감염"은 대상에서의 인플루엔자 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, NDV, 또는 다른 감염원 (예, 또 다른 바이러스 또는 세균 감염) 생활사의 모든 단계 (세포 또는 체조직에서의 인플루엔자 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, NDV 또는 다른 감염원에 의한 침입 및 그의 복제가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아님)는 물론, 인플루엔자 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스 또는 NDV에 의한 침입 및 그의 복제로부터 초래되는 병리학적 상태에 적용된다. 인플루엔자 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, NDV 또는 다른 감염원에 의한 침입 및 그의 증식은 하기의 단계들을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다: 바이러스 (예, 인플루엔자 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스 또는 NDV 입자)의 세포에의 도킹(docking), 바이러스의 세포 막과의 융합, 세포로의 바이러스 유전 정보의 도입, 바이러스 단백질 (예, 인플루엔자 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스 또는 NDV 단백질)의 발현, 새로운 바이러스 입자 (즉, 인플루엔자 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스 또는 NDV 입자)의 생성 및 세포로부터의 바이러스 (예, 인플루엔자 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스 또는 NDV 입자)의 방출. 호흡기 감염 (예, 인플루엔자 바이러스 또는 NDV 감염)은 상기도 감염 (URI), 하기도 감염 (LRI), 또는 그의 조합일 수 있다. 특정 구현예에서, 감염은 1차 감염 (예, 바이러스성 폐렴)의 발병 후에 나타나는 2차 감염 (예, 2차 폐렴)이다. 2차 감염은 감염된 대상을 그러한 2차 감염에 걸리기 쉽게 하는 1차 감염 또는 그와 관련된 증상이나 이상에 기인하여 발생한다. 특정 구현예에서, 인플루엔자 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스 또는 NDV에 의한 침입 및 그의 복제로부터 초래되는 병리학적 상태는 급성의 인플루엔자 바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스 또는 NDV 질병이다. 호흡기 감염의 급성 단계는 폐렴 및/또는 세기관지염으로 나타날 수 있으며, 그의 증상에는 저산소증, 무호흡, 호흡 곤란, 빈호흡, 쌕쌕거림, 청색증 등이 포함될 수 있다. 호흡기 감염 (예, 인플루엔자 바이러스 및 NDV 감염)의 급성 단계는 병에 걸린 개체에 입원, 산소 투여, 삽관 및/또는 환기와 같은 의료 시술을 가할 것을 요한다.
여기에서 사용되는 용어 "단리된"은, 바이러스 맥락에서, 하나의 모체 바이러스에서 유래하는 바이러스에 적용된다. 바이러스는 플라크 정제(plaque purification) 및 한계 희석(limiting dilution)에 기초한 것들을 포함하여 업계 숙련자에게 알려진 일상적인 방법을 사용하여 단리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여기에서 사용되는 핵산 분자 맥락의 용어 "단리된"은 핵산 분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 핵산 분자로부터 단리된 핵산 분자에 적용된다. 또한, cDNA 분자와 같은 "단리된" 핵산 분자는 재조합 기술에 의해 생성된 경우 다른 세포성 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 또는 화학적으로 합성된 경우 화학물질 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 바람직한 구현예에서는, 바이러스 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 단리된다.
여기에서 사용되는 용어 "관리하다", "관리하는" 및 "관리"는 요법 (예, 예방 또는 치료제)에 의해 대상이 이끌어내는 유익한 효과에 적용되는 것으로서, 이것이 질병 (예, 감염)의 치료로 귀결되는 것은 아니다. 소정 구현예에서, 인플루 엔자 바이러스 감염, 조류 인플루엔자 바이러스 또는 NDV 감염, 또는 다른 감염원의 감염, 그의 1종 이상의 증상, 또는 인플루엔자 바이러스 감염 또는 NDV 감염 또는 다른 감염원의 감염과 관련된, 그에 의해 강화되는, 또는 그를 강화하는 이상을 "관리"함으로써, 감염의 진행 또는 악화를 예방하기 위하여, 1종 이상의 요법 (예, 본 발명의 항체와 같은 예방 또는 치료제)이 대상에게 투여된다.
여기에서 사용되는 "감염 다중도"라는 구 또는 "MOI"는 감염된 세포 당 평균 바이러스 수이다. MOI는 첨가된 바이러스의 수 (첨가된 ml × Pfu)를 첨가된 세포의 수 (첨가된 ml × 세포/ml)로 나눔으로써 측정된다.
여기에서 사용되는 "NS1 유전자"라는 구는 인플루엔자의 비구조성 단백질 (NS1)을 코딩하는 유전자를 말한다. NS1은 인플루엔자 A 및 다른 바이러스의 분절화 게놈에 의해 코딩되는 8종의 분자들 중 하나이다. "NS1 유전자 산물"은 NS1 유전자에 의해 코딩되는 유전자 산물 (예, RNA 또는 단백질)을 말한다. 단백질의 경우, NS1 유전자 산물은 전체-길이이며, 야생형 NS1 활성을 가진다 (예, 균주 A/WSN/33의 것).
여기에서 사용되는 용어 "핵산", "뉴클레오티드 서열" 및 "핵산 분자"에는 DNA 분자 (예, cDNA 또는 게놈 DNA), RNA 분자 (예, mRNA), DNA 및 RNA 분자의 조합 또는 하이브리드 DNA/RNA 분자, 및 DNA 또는 RNA 분자의 유사물이 포함된다. 그러한 유사물은 예컨대, 그에 제한되는 것은 아니나, 이노신 또는 트리틸화 염기를 포함한 뉴클레오티드 유사물을 사용하여 생성될 수 있다. 그러한 유사물은 또한, 예컨대 분자에 뉴클레아제 내성 또는 증가된 세포 막 통과 능력과 같은 유익한 속성을 부여하는 변형된 골격을 포함하는 DNA 또는 RNA 분자를 포함할 수도 있다. 핵산 또는 뉴클레오티드 서열은 단일-가닥, 이중-가닥일 수 있으며, 단일-가닥 및 이중-가닥 부분 모두를 포함할 수 있으며, 삼중-가닥 부분을 포함할 수 있지만, 바람직하게는 이중-가닥 DNA이다.
여기에서 사용되는 용어 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은 요법 (예, 예방 또는 치료제) 투여의 결과로써 대상에서 질병 (예, 바이러스 감염 또는 다른 감염성 질병)의 증상 1종 이상의 재발 또는 발병을 예방하는 것, 또는 그를 감소시키는 것에 적용된다. 예를 들어, 감염에 대하여 대상에게 요법을 투여하는 맥락에서 "예방하다", "예방하는" 및 "예방"은, 요법 (예, 예방 또는 치료제)의 투여, 또는 요법 조합 (예, 예방 또는 치료제의 조합)의 투여에 기인하는, 대상에서의, 감염 (예, 인플루엔자 바이러스 감염, NDV 감염 또는 그와 관련된 이상, 또는 인플루엔자 바이러스나 NDV 감염이 아닌 다른 감염 또는 그와 관련된 이상)의 진전 또는 발병의 억제 또는 감소, 또는 감염 (예, 인플루엔자 바이러스 감염, NDV 감염 또는 그와 관련된 이상, 또는 인플루엔자 바이러스 감염, NDV 감염이 아닌 다른 감염 또는 그와 관련된 이상)의 증상 1종 이상의 재발, 발병 또는 진전의 예방에 적용된다.
여기에서 사용되는 감염원 맥락의 용어 "보호성 항원"에는 대상에 투여되었을 때 보호성 면역 반응을 이끌어낼 수 있으며 그 면역 반응은 감염원에 대항하는 것인 모든 분자가 포함된다.
여기에서 사용되는 용어 "예방제" 및 "예방제들"은 질병 (예, 감염) 또는 그 의 증상 (예, 인플루엔자 바이러스 감염, NDV 감염 또는 그와 관련된 이상 또는 증상, 또는 인플루엔자 바이러스나 NDV 감염이 아닌 다른 감염 또는 그와 관련된 이상 또는 증상)의 예방에 사용될 수 있는 모든 물질(들)을 말한다. 바람직하게는, 예방제는 질병 또는 그의 증상 (예, 감염 또는 그와 관련된 이상이나 증상)의 발병, 진전, 진행 및/또는 심각성을 예방 또는 방지하는 데에 유용한 것으로 알려져 있거나, 그에 사용되어 왔거나 또는 현재 그에 사용되고 있는 제제이다.
여기에서 사용되는 바이러스 맥락의 "정제된"이라는 구는 바이러스가 유래하는 세포 또는 조직 공급원으로부터의 세포성 물질 및 배양 배지가 실질적으로 없는 바이러스를 말한다. "세포성 물질이 실질적으로 없는"이라는 말에는 그것이 단리되거나 또는 재조합에 의해 생성된 세포의 세포성 성분으로부터 바이러스가 단리된 바이러스 표본이 포함된다. 따라서, 세포성 물질이 실질적으로 없는 바이러스에는 약 30 %, 20 %, 10 % 또는 5 % (건조 중량 기준) 미만의 세포성 단백질 (여기에서는 "오염성 단백질"로도 칭함)을 가지는 단백질 표본이 포함된다. 바이러스에는 또한 배양 배지가 실질적으로 없는데, 다시 말하면 배양 배지가 바이러스 표본 부피의 약 20 %, 10 % 또는 5 % 미만을 나타낸다. 바이러스는 크로마토그래피 및 원심분리를 포함하여 업계 숙련자에게 알려진 일상적인 방법을 사용하여 정제될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
여기에서 사용되는 용어 "대상" 또는 "환자"는 호환적으로 사용된다. 여기에서 사용되는 용어 "대상" 및 "대상들"은 동물 (예, 조류, 파충류 및 포유류)을 말한다. 일부 구현예에서, 대상은 비-영장류 (예, 낙타, 당나귀, 얼룩말, 소, 말, 고양이, 개, 랫트 및 마우스) 및 영장류 (예, 원숭이, 침팬지, 및 인간)을 포함한 포유류이다. 일부 구현예에서, 대상은 비-인간 포유류이다. 다른 구현예에서, 대상은 인간이다. 소정 구현예에서, 포유류 (예, 인간)는 0 내지 6개월 령, 6 내지 12개월 령, 1 내지 5년 령, 5 내지 10년 령, 10 내지 15년 령, 15 내지 20년 령, 20 내지 25년 령, 25 내지 30년 령, 30 내지 35년 령, 35 내지 40년 령, 40 내지 45년 령, 45 내지 50년 령, 50 내지 55년 령, 55 내지 60년 령, 60 내지 65년 령, 65 내지 70년 령, 70 내지 75년 령, 75 내지 80년 령, 80 내지 85년 령, 85 내지 90년 령, 90 내지 95년 령 또는 95 내지 100년 령이다. 특정 구현예에서, 대상 또는 환자는 조류이다. 소정 구현예에서, 조류는 0 내지 3개월 령, 3 내지 6개월 령, 6 내지 9개월 령, 9 내지 12개월 령, 12 내지 15개월 령, 15 내지 18개월 령, 또는 18 내지 24개월 령이다.
여기에서 사용되는 투여 또는 결과 또는 요법 맥락에서의 "상승적인"이라는 용어는 소정의 2종 이상 단일 요법 (예, 1종 이상의 예방 또는 치료제)의 부가적인 효과보다도 더 효과적인 요법 (예, 예방 또는 치료제)의 조합에 적용된다. 요법 조합 (예, 예방 또는 치료제의 조합)의 상승적인 효과는 1종 이상 요법 (예, 1종 이상의 예방 또는 치료제)을 더 낮은 투여량으로 사용하는 것 및/또는 질병 (예, 인플루엔자 바이러스 감염, NDV 감염 또는 그와 관련된 이상 또는 증상, 또는 인플루엔자 바이러스 감염, NDV 감염이 아닌 다른 감염 또는 그와 관련된 이상 또는 증상)을 가지는 대상에게 상기 요법을 더 적은 빈도로 투여하는 것을 가능케 한다. 더 낮은 투여량의 요법 (예, 예방 또는 치료제)을 이용하거나 및/또는 더 적은 빈 도로 상기 요법을 투여하는 능력은 질병 (예, 인플루엔자 바이러스 감염 또는 그와 관련된 이상 또는 증상, 또는 인플루엔자 바이러스 감염, NDV 감염이 아닌 다른 감염 또는 그와 관련된 이상 또는 증상)의 예방 또는 치료에서의 상기 요법의 효능 감소 없이도, 대상에 대한 상기 요법의 투여와 관련한 독성을 감소시킨다. 또한, 상승 효과는 질병 (예, 인플루엔자 바이러스 감염, NDV 감염 또는 그와 관련된 이상 또는 증상, 또는 인플루엔자 바이러스 감염, NDV 감염이 아닌 다른 감염 또는 그와 관련된 이상 또는 증상)의 예방, 관리 또는 치료에서의 요법 (예, 예방 또는 치료제) 효능의 향상으로 귀결될 수 있다. 마지막으로, 요법 (예, 예방 또는 치료제) 조합의 상승 효과는 소정 단일 요법의 사용과 관련되는 불리하거나 원치 않는 부작용을 피하거나 감소시킬 수 있다.
여기에서 사용되는 용어 "요법들" 및 "요법"은 질병 (예, 암, 인플루엔자 바이러스 감염, NDV 감염 또는 그와 관련된 이상 또는 증상, 또는 인플루엔자 바이러스 감염이나 NDV 감염이 아닌 다른 감염 또는 그와 관련된 이상 또는 증상)의 예방, 치료, 관리 또는 개선에 사용될 수 있는 모든 프로토콜(들), 방법(들) 및/또는 제제(들)에 적용될 수 있다. 소정 구현예에서, "요법들" 및 "요법"이라는 용어는, 업계 숙련자에게 알려져 있는, 질병, 감염 또는 그와 관련된 이상이나 증상의 치료, 관리, 예방 또는 개선에 유용한 생물학적 요법, 지지 요법 및/또는 다른 요법을 말한다.
여기에서 사용되는 용어 "치료제" 및 "치료제들"은 질병 (예, 감염 또는 그의 증상 (예, 인플루엔자 감염, NDV 감염 또는 그와 관련된 이상 또는 증상, 및 인 플루엔자 바이러스 감염, NDV 감염이 아닌 다른 감염 또는 그와 관련된 이상 또는 증상))의 예방, 치료, 관리 또는 개선에 사용될 수 있는 모든 제제(들)을 말한다. 바람직하게는, 치료제는 질병 또는 그와 관련된 증상 (예, 인플루엔자 감염, NDV 감염 또는 그와 관련된 이상 또는 증상, 및 인플루엔자 바이러스 감염, NDV 감염이 아닌 다른 감염 또는 그와 관련된 이상 또는 증상)의 예방, 치료, 관리 또는 개선에 유용한 것으로 알려져 있거나, 그에 사용되어 왔거나 또는 현재 그에 사용되고 있는 제제이다.
여기에서 사용되는 질병에 대하여 대상에게 요법을 투여하는 맥락에서의 "치료하다", "치료" 및 "치료하는"이라는 용어는 상기 질병 증상의 근절, 감소 또는 개선에 적용된다. 감염 (예, 인플루엔자 바이러스 또는 NDV 바이러스)과 관련하여, 치료는 감염원 (예, 바이러스) 복제의 근절 또는 억제, 감염원 수의 감소 (예, 바이러스 역가의 감소), 감염 (예, 인플루엔자 감염, NDV 감염 또는 그와 관련된 이상 또는 증상, 및 인플루엔자 바이러스 감염, NDV 감염이 아닌 다른 감염 또는 그와 관련된 이상 또는 증상)의 진행, 심각성 및/또는 기간의 감소 또는 개선, 또는 1종 이상 요법의 투여 (1종 이상 예방 또는 치료제의 투여를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아님)에 기인하는 1종 이상 증상의 개선에 적용된다. 암과 관련하여, 치료는 1종 이상 본 발명 치료제의 투여에 기인하는 원발성, 국소성 또는 전이성 암 조직의 근절, 제거, 변형 또는 억제에 적용된다. 소정 구현예에서, 이러한 용어는 그와 같은 질병을 가지는 대상에 대한 1종 이상 본 발명 치료제의 투여에 기인하는 암 확산의 최소화 또는 지연에 적용된다. 다른 구현예에서, 이러한 용어는 질병 야기 세포의 제거에 적용된다.
4. 도면의 설명
도 1. 하이브리드 NAf - HN 구성물의 도식적 표시
당 구성물은 WSN NA vRNA의 3' 비코딩 영역, NA 단백질의 세포질 테일 및 막횡단 도메인 더하기 NA 엑토도메인의 첫번째 아미노산에 상응하는 NA 코딩 영역, NDV B1 HN 단백질의 코딩 영역 (엑토도메인만), 2개의 연속하는 정지 코돈, WSN NA 리딩 프레임의 비번역 뉴클레오티드, 및 WSN vRNA의 5' 비코딩 영역의 뉴클레오티드를 코딩한다.
도 2. HA 다염기성 아미노산 서열에서의 변경의 도식적 표시
H5N1 HA로 식별되는 뉴클레오티드 서열은 인플루엔자 A/베트남/1203/04 (H5N1) HA 표면 당단백질 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 1013-1045 (SEQ ID NO: 13; 아미노산 서열 SEQ ID NO: 14)를 나타낸다. 절단 PCR 및 부위 의존 돌연변이유발을 사용하여 뉴클레오티드 1026-1038을 단일 뉴클레오티드 시토신으로 치환함으로써, 무독성 HA의 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO: 15; 아미노산 서열 SEQ ID NO: 16)을 생성시켰다. 서열 변화는 다염기성 서열 5 아미노산의 단일 아미노산 트레오닌으로의 치환에 상응한다.
도 3. HA 핵산 서열에서의 변경의 도식적 표시
무독성 HA로 식별되는 서열은 무독성 인플루엔자 A/베트남/1203/04 (H5N1) HA 단백질 공통 서열 (SEQ ID NO: 15; 아미노산 서열 SEQ ID NO: 16)에 기초한 HA 표면 당단백질 오픈 리딩 프레임의 뉴클레오티드 1-13-1033을 나타낸다.
돌연변이가 동의가 되도록 밑줄친 아데노신 잔기를 치환함으로써, SEQ ID NO: 17의 뉴클레오티드 서열 및 SEQ ID NO: 16의 아미노산 서열을 생성시켰다.
도 4. pPol1VN1203 NS 말단 절단 돌연변이의 도식
A. H5N1 NS 유전자 분절의 코딩 영역은 833 뉴클레오티드이다. B. pPol1VN1203 NS1-126 구성물은 NS 유전자에서의 코딩 영역 뉴클레오티드 379-456의 결실, 3 정지 코돈의 삽입 및 BglII 제한 부위를 가진다. C. pPol1VN1203 NS1-99 구성물은 NS 유전자에서의 코딩 영역 뉴클레오티드 298-456의 결실, 4 정지 코돈의 삽입, BglII 제한 부위 및 PacI 제한 부위를 가진다. D. pPol1VN1203 NS1-73 구성물은 NS 유전자에서의 코딩 영역 뉴클레오티드 219-456의 결실, 4 정지 코돈의 삽입, BglII 제한 부위 및 PacI 제한 부위를 가진다.
도 5. pNDV /B1의 도식
도시된 서열의 측면에는 3' 말단에 T7 프로모터가 위치하며, 5' 말단에 HDV 리보자임 및 T7 터미네이터가 위치한다. P 및 M 유전자 사이의 삽입 부위는 유일한 XbaI 제한 부위를 포함한다.
도 6. 키메라 rNDV 바이러스에서의 KGFR 발현의 웨스턴 블롯 분석
10-일 령의 부화 계란에서 키메라 바이러스 rNDV (레인 1), rNDV-KGFR (레인 2) 및 rNDV-KGFR/F-CT (레인 3)를 생육시켰다. 정제된 바이러스를 제1 및 제2 항체로서 각각 뮤린 항-KGFR 및 항-마우스 HRPO를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 적용시켰다.
도 7. 키메라 rNDV 바이러스에서의 H7 HA 발현의 웨스턴 블롯 분석
10-일 령의 부화 계란에서 키메라 바이러스 rNDV (레인 1), rNDV-KGFR (레인 2) 및 rNDV-KGFR/F-CT (레인 3)를 생육시켰다. 정제된 바이러스를 제1 및 제2 항체로서 각각 뮤린 항-KGFR 및 항-마우스 HRPO를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 적용시켰다.
도 8. rNDV F 단백질 절단 부위의 변형
(A) 그 F 단백질의 절단 부위에 2 또는 3개의 아미노산 변화를 가지는 rNDV/B1 게놈의 도식적 표시. F 단백질에서 절단되는 펩티드 결합은 사선으로 표시하였다. (B) 변형된 F 단백질을 가지는 rNDV에 의해 감염된 CEF 세포에서의 융합체 형성. rNDV/Bl, rNDV/F2aa, 및 rNDV/F3aa 바이러스를 사용하여 0.001의 감염 다중도로 CEF 세포를 감염시켰다. 면역형광 분석에 의해 매 24시간 마다 바이러스 확산을 모니터링하였다.
도 9. HPAI H7 HA 단백질을 발현하는 융합생성 rNDV 벡터의 구성 및 특성화
(A) GE/GS, 코작(Kozak), 및 (SEQ ID NO: 36)을 부여받은 부분적 H7 HA 서열을 가지는 rNDV/F3aa 키메라 H7 cDNA 구성물의 도식적 표시. (B) 바이러스 생육 동역학의 비교, Log TCID 대 접종 후 시간 (시간). 사각형은 rNDV/B1; 삼각형은 rNDV/F3aa; 굵은 별표는 rNDV/Bl-H7; 별표는 rNDV/F3aa-키메라H7. (C) rNDV로 감염된 세포에서의 WT H7 HA 단백질 또는 키메라 H7 HA 단백질의 발현. 레인 1은 가상 감염; 레인 2는 rNDV/F3aa; 레인 3은 rNDV/Bl-H7; 레인 4는 rNDV/F3aa-키메라H7. 열 1은 α-조류 H7; 열 2는 α-NDV. (D) rNDV 비리온에서의 키메라 H7 HA 단백질의 혼입은 야생형 H7 HA 단백질의 그것에 비해 증가하였다. 레인 1은 rNDV/B1-H7; rNDV/F3aa-키메라H7. 열 1은 α-조류 H7; 열 2는 α-NDV.
본 발명은 비리온으로 혼입되는 융합 단백질을 발현하도록 조작된 키메라형 음성 가닥 RNA 바이러스, 그러한 키메라 바이러스의 제조 방법 및 그러한 바이러스의 예컨대 면역원성 제제 또는 생체외 분석에서의 면역원으로서의 용도를 제공한다. 본 발명의 키메라 바이러스는 비리온의 표면 상에 바이러스 관련 항원뿐만 아니라 융합 단백질도 나타내는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 방법에 따라 조작될 수 있는 바이러스는 모든 외피형 바이러스일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법에 따라 조작될 수 있는 바이러스는 분절화 또는 비-분절화 게놈, 단일 가닥 또는 이중 가닥의 게놈을 가지며, 바이러스 외피로 혼입되는 1종 이상의 필수 당단백질 (예, NA, HA, HN 또는 F)을 발현한다. 본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 바이러스는 자연 상에서 발견되는 균주, 변이 또는 돌연변이; 돌연변이화 바이러스 (예, UV 조사, 돌연변이원 및/또는 계대접종(passaging)에의 노출에 의해); 유전자재편성체 (분절화 게놈을 가지는 바이러스의 경우); 및/또는 유전적으로 조작된 바이러스에서 선택될 수 있다. 예를 들어, 돌연변이 바이러스는 자연적 변이, UV 조사에의 노출, 화학적 면역원에의 노출에 의해, 비-허용(non-permissive) 숙주에서의 계대접종에 의해, 유전자재편성(즉, 약독화된 분절화 바이러스의 원하는 항원을 가지는 다른 균주와의 공동감염에 의한)에 의해, 및/또는 유전적 조작 (예, "역 유전학"을 사용한)에 의해 생성될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 분절화 게놈을 가지는 바이러스의 비-제한적인 예에는 오르소믹소비리다에 (예, 인플루엔자 바이러스), 부냐비리다에 (예, 분얌웨라(Bunyamwera)), 레오비리다에(reoviridae) 및 아레나비리다에 (예, 라싸열) 과에 속하는 바이러스들이 포함된다. 본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 비-분절화 게놈을 가지는 바이러스의 비-제한적인 예에는 코로나비리다에(coronaviridae) (예, 인간 코로나 바이러스 (SARS)), 헤파드나비리다에(hepadnaviridae) (예, 헤파티투스 A, B 또는 C 바이러스), 헤르페스비리다에(herpesviridae) (예, 단순 포진 바이러스), 폭스비리다에(poxviridae) (예, 마마), 라브도비리다에 (예, 수포성 구내염 바이러스 (VSV), 센다이 바이러스 및 광견병), 파라믹소비리다에 (예, 홍역 및 호흡기 세포융합 바이러스), 및 필로비리다에(filoviridae) (마버그 및 에볼라 바이러스)가 포함된다. 소정 구현예에서, 분절화 바이러스는 인플루엔자 바이러스이다. 다른 구현예에서, 비-분절화 바이러스는 NDV이다.
소정 구현예에서, 본 발명에 사용하기 위하여 선택되는 바이러스는 약독화되거나 및/또는 불완전한 IFN 길항제 활성을 가지는데; 다시 말하면, 그것은 감염성이며 생체 내에서 복제가능하지만, 비-병원성인 무증상 수준의 감염으로 귀결되는 낮은 역가만을 생성한다. 바이러스는 업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서도, 및/또는 여기에서 예시한 바와 같이 예컨대 NS1 유전자에 돌연변이를 포함하도록 또는 HA 단백질 절단 부위 전의 다염기성 아미노산 서열에 변형을 포함하도록 바이러스를 조작하는 것에 의해, 약독화될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라 조작된 이와 같은 약독화 바이러스는 면역원성 제제, 예컨대 생 바이러스 백신을 위한 이상적인 후보이다. 대상에 투여되었을 때, 본 발명의 약독화된 키메라 바이러스는 면역 반응을 발생시킴으로써 바이러스와 비-천연 또는 융합 단백질 모두에 대한 면역을 이끌어낼 수 있다. 일부 구현예에서, 비-천연 단백질은 병원체로부터 유래한다. 확대 해석하면, 대상에 대한 이러한 키메라 바이러스의 투여는 바이러스 이외에도 상기 병원체에 대한 면역 반응 및/또는 면역을 발생시킨다.
본 발명은 또한 본 발명 키메라 바이러스의 인간 또는 동물 (예, 조류)용 조성물 (예, 면역원성 제제)에서의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 약독화된 키메라 바이러스는 광범위한 바이러스 및/또는 질병에 대한 백신으로서 사용될 수 있다. 본 키메라 바이러스는 비리온에서 외래 항원결정인자로서 이종유래 유전자 서열을 발현하도록 조작되기 때문에, 본 발명의 키메라 바이러스를 포함하는 조성물 (예, 백신 제제)은 그로부터 이종유래 유전자 서열이 유래하는 다중의 균주 변이, 서로 다른 바이러스, 또는 완전히 상이한 감염원이나 질병 항원 (예, 세균, 기생충, 균류 또는 종양 특이적 항원)에 대한 면역화를 위하여 설계될 수 있다. 면역 또는 적절한 시토카인 반응을 유발하기 위하여 인간 또는 동물 대상에 생 약독화 바이러스 제제를 도입시키는 데에는 많은 방법들이 사용될 수 있다. 여기에는 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내 및 피하의 경로가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
5.1 키메라 인플루엔자 바이러스
5.1.1 자신의 비리온에 혼입된 융합 단백질을 포함하는 키메라 조류 인플루엔자 바이러스
본 발명은 융합 단백질이 게놈에 의해 코딩되며, 발현시에는 비리온으로 혼입되도록 하는, 조류 인플루엔자 바이러스의 조작을 포함한다. 그에 제한되는 것은 아니나 자연 상에서 발견되는 균주, 변이 또는 돌연변이, 돌연변이화 바이러스, 유전자재편성체 및/또는 유전적으로 조작된 바이러스를 포함하여, 융합 단백질을 발현하여 조류 인플루엔자 비리온으로 혼입하도록 조작될 수 있는 어떠한 조류 인플루엔자 바이러스 유형, 아형 또는 균주도 본 발명에 따라 선택되어 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스는 자연 상에서 발견되는 바이러스가 아니다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 조류 인플루엔자 바이러스는 유전적으로 조작된 바이러스이다. 조류 인플루엔자 바이러스의 비-제한적인 예에는 인플루엔자 A 아형 H5N1, H6N2, H7N3, H9N2 및 H10N7이 포함된다.
인플루엔자 바이러스의 유전적 조작은 바이러스 게놈을 구성하는 8종의 바이러스 RNA 분절 중 1종 이상의 조작을 필요로 한다. 게놈의 돌연변이유발은 "역 조작" 기술 (5.4 부문 참조)을 통하여 달성될 수 있다. 그러나, 인플루엔자 게놈의 유연성(plasticity)은 안정하게 바이러스로 통합될 수 있는 분절의 수 및 분절의 길이 모두에서 제한된다. 길이가 긴 삽입물의 전체적인 안정성은 불분명해서, 그러한 삽입물을 포함하는 분절 또는 그의 일부는 수 세대 후 바이러스 편성에 기인하여 소실될 수 있다. 따라서, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 조류 인플루엔자 바이러스는 그의 2종의 주요 표면 단백질 중 하나가 융합 단백질에 의해 치환되도록 조작된다.
따라서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원 단백질의 엑토도메인 (ED), 및 1종 이상 필수 인플루엔자 바이러스 당단백질의 세포질 (CT) 및 막횡단 (TM) 도메인 또는 막횡단 (TM) 도메인을 포함하는 1종 이상의 융합 단백질을 포함하며, 여기서 1종 이상의 융합 단백질은 1종 이상의 필수 조류 인플루엔자 바이러스 당단백질을 기능적으로 대체하는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 다른 말로 하면, 조류 인플루엔자 바이러스는 필수 조류 인플루엔자 바이러스 당단백질 대신 융합 단백질을 발현하여 자신의 비리온으로 혼입하도록 조작되는 "골격"으로서 작용한다. 융합 단백질에 의해 기능적으로 대체된 필수 조류 인플루엔자 바이러스 당단백질에 상응하는 인플루엔자 바이러스 당단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인을 포함함으로써 이 융합 단백질이 조류 인플루엔자 바이러스의 비리온으로 혼입되는 것이 가능하게 된다. 융합 단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인은 융합 단백질이 조류 인플루엔자 바이러스 골격의 비리온으로 혼입되는 것을 가능케 하는 소정의 인플루엔자 바이러스에 상응하거나 또는 그로부터 유래할 수 있다.
소정 구현예에서, 융합 단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인은 골격 조류 인플루엔자 바이러스와 다른 유형, 아형 또는 균주의 조류 인플루엔자 바이러스의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인에 상응한다. 다른 구현예에서, 융합 단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인은 조류 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 인플루엔자 바이러스의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인에 상응한다. 다른 구현예에서, 융합 단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인은 조류 인플루엔자 바이러스 골격의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인에 상응한다.
조류 인플루엔자 비리온은 2종의 주요 표면 당단백질인 헤마글루티닌 (HA) 및 뉴라미니다제 (N)를 포함하는데, 이들 모두는 세포질 도메인, 막횡단 도메인 및 엑토도메인을 포함한다. 따라서, 소정 구현예에서, 융합 단백질의 TM 및 CT 도메인은 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 또는 NA 단백질 중 하나의 TM 및 CT 도메인에 상응한다. HA 또는 NA의 CT 도메인은 융합 단백질의 조류 인플루엔자 바이러스 비리온으로의 혼입에 필요하지 않을 수 있기 때문에, 일부 구현예에서 융합 단백질은 HA 또는 NA의 TM 도메인만을 포함하도록 조작된다. 예를 들어, NA의 CT 도메인은 이 단백질의 인플루엔자 A 바이러스 외피로의 적절한 패키지화에는 필요치 않은 것으로 밝혀진 바 있다 (여기에 그 전체가 참조로써 개재되는 문헌 [Garcia-Sastre et al., 1995, Virus Res. 37:37-47]). 따라서, NA 단백질의 그것에 상응하는 구조성 도메인이 융합 단백질의 생성에 사용되는 경우, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 NA 단백질에 상응하는 TM 도메인만을 포함하도록 융합 단백질을 조작하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명의 일 구현예에서, 융합 단백질은 TM 도메인만을 포함하도록 조작되며, 그 TM 도메인은 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 TM 도메인에 상응한다.
인플루엔자 바이러스 HA 및 NA 단백질의 TM 및 CT 도메인은 도메인이 HA 단백질의 C-말단 및 NA 단백질의 N-말단에 위치한다는 점에서 구조적으로 구별된다. 각자의 표면 당단백질에서의 이 두 도메인의 구별되는 배향 이외에도, HA 및 CT 구조성 도메인은 폴리펩티드 사슬 내에서의 그들의 상대적인 배치에 따른 기능성에서 아직 알려지지 않은 차이를 포함할 수 있다. 따라서, 조류 인플루엔자 바이러스로 조작될 융합 단백질을 설계할 때에는, 인플루엔자 바이러스 당단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인에 융합될 감염원 엑토도메인의 배향이 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인의 선택을 이끌 것이다. 예를 들어, 감염원의 엑토도메인이 N-말단에 의해 앵커링되는 경우, 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 TM 및 CT 도메인이 사용될 수 있다.
HA 및 NA는 각각 바이러스의 감염 및 증식을 위하여 필요한 세포 융합 및 방출과 관련하여 경쟁적 활성을 나타낸다. HA는 세포 표면상의 N-아세틸뉴라민산 (NeuNAc; 시알산)에 결합하여 숙주 세포에 의한 바이러스의 흡수를 유발하는 반면, NA는 세포 표면으로부터 시알산 요소를 절단함으로써 감염된 세포로부터의 자손 바이러스의 방출을 유발한다. 이러한 활성들 중 어느 것의 와해는 비-기능성 바이러스로 귀결된다. 따라서, 바이러스로서의 적격성을 유지하기 위해서는, 표면 당단백질이 치환될 때 키메라 바이러스에서의 그의 기능이 융합 단백질에 의해 제공되어야 한다. 본 발명의 일 구현예에서, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 뉴라미니다제 활성을 나타내는 융합 단백질을 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에서, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 수용체 결합 활성을 나타내는 융합 단백질을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 그 중 하나는 뉴라미니다제 활성을 나타내고 다른 것은 수용체 결합 활성을 나타내는 2종의 융합 단백질을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 이종유래 감염원의 항원결정인자를 포함하는 융합 단백질을 포함하며, 그 융합 단백질은 뉴라미니다제 활성 또는 수용체 결합 활성을 나타낸다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 수용체 결합 활성을 나타내는 융합 단백질을 포함한다. 특정 구현예에서, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) HN 단백질의 엑토도메인 및 인플루엔자 A/WSN/33 NA 단백질의 TM 및 CT 도메인을 포함하는 표면 단백질을 포함하며, 이 HN 엑토도메인은 뉴라미니다제 활성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 이종유래 인플루엔자 바이러스 HA 단백질 (예, H7 HA 단백질 또는 H9 HA 단백질)의 엑토도메인을 포함하는 표면 단백질을 포함한다. HA 및 NA는 바이러스 게놈의 별도 분절에 의해 코딩되며, 천연 단백질 전체 코딩 영역의 치환은 도입되는 단백질을 코딩하는 서열 상의 대부분의 길이 제약을 해소한다.
소정 구현예에서, 융합 단백질은 막횡단 도메인에 더하여 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 필수 인플루엔자 바이러스 당단백질 엑토도메인의 바로 인접한 잔기(들)을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 융합 단백질은 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 막횡단 도메인, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 인플루엔자 바이러스 NA 단백질 엑토도메인의 바로 인접한 잔기(들), 및 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함으로써, 융합 단백질이 NA 단백질의 기능을 기능적으로 대체할 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 융합 단백질은 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 세포질 및 막횡단 도메인, 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 막횡단 도메인에 바로 인접한 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 인플루엔자 바이러스 NA 단백질 엑토도메인의 잔기(들), 및 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함으로써, 융합 단백질이 NA 단백질을 기능적으로 대체할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 융합 단백질은 NA 단백질의 막횡단 도메인 또는 세포질 및 막횡단 도메인, 그의 구상 헤드에 선행하는 NA 단백질의 완전한 줄기(stalk) 도메인 또는 그의 단편, 및 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함으로써, 융합 단백질이 NA 단백질의 기능을 기능적으로 대체할 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 융합 단백질은 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 막횡단 도메인, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 인플루엔자 바이러스 HA 단백질 엑토도메인의 바로 인접한 잔기(들), 및 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함으로써, 융합 단백질이 HA 단백질의 기능을 기능적으로 대체할 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 융합 단백질은 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 세포질 및 막횡단 도메인, 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 막횡단 도메인에 바로 인접한 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 인플루엔자 바이러스 HA 단백질 엑토도메인의 잔기(들), 및 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함으로써, 융합 단백질이 HA 단백질을 기능적으로 대체할 수 있다.
소정 구현예에서, 본 발명 키메라 조류 인플루엔자 바이러스의 1종 이상의 융합 단백질은 이종유래 단백질의 완전한 엑토도메인을 포함하지 않으며 (예, 이종유래 감염원 단백질 엑토도메인의 항원성 단편을 포함), 천연 필수 당단백질 엑토도메인의 1 이상의 단편을 더 포함할 수 있거나 더 포함하지 않을 수 있다. 따라서, 소정 구현예에서, 융합 단백질의 엑토도메인은 이종유래 감염원 단백질 엑토도메인의 단편을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 융합 단백질의 엑토도메인은 천연 필수 당단백질과 이종유래 감염원 단백질 모두의 단편을 포함할 수 있다. 융합 단백질이 필수 표면 당단백질을 치환하는 구현예에서, 표면 당단백질의 기능은 융합 단백질에 의해 제공되어야 하는 바, 다시 말하면, 융합 단백질은 그것이 치환하는 표면 당단백질의 기능성을 나타내야 한다.
본 발명은 본 5.1.1 부문에서 개시된 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (즉, 재조합 분절)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 5.1.1 부문에서 개시된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 분절은 vRNA의 적절한 복제, 전사 및 패키지화를 위하여 필요한 3' 및 5' 혼입 신호(incorporation signal) (그들 모두 여기에 그 전체가 참조로써 개재되는 문헌 [Fujii et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2002-2007]; [Zheng, et al., 1996, Virology 217:242-251])를 포함한다. 따라서, 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 재조합 분절은 골격 조류 인플루엔자 바이러스와 동일한 바이러스 유형 또는 균주 내 바이러스 분절의 3' 및 5' 비코딩 및/또는 비번역 서열을 사용한다. 특정 구현예에서, 재조합 분절은 본 5.1.1 부문에서 개시된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하며, 이것은 인플루엔자 바이러스 NA vRNA의 3' 비코딩 영역, NA 단백질의 CT 및 TM 도메인에 상응하는 NA 코딩 영역, 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 막횡단 도메인에 바로 인접한 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 인플루엔자 바이러스 NA 단백질 엑토도메인의 잔기(들), NA 단백질 리딩 프레임의 비번역 영역 및 NA vRNA의 5' 비-코딩 영역을 포함한다.
조류 인플루엔자 바이러스의 NA 또는 HA 단백질을 치환하는 것의 대안으로서, "역 유전학" 및 이중시스트론 기술이 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원 단백질의 엑토도메인 또는 그의 단편 및 인플루엔자 바이러스의 TM 및/또는 CT 도메인을 포함하는 키메라 인플루엔자 바이러스를 제조하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 그 각각이 전체적으로 여기에 참조로써 개재되는 U.S. 특허 제6,887,699호, U.S. 특허 제6,001,634호, U.S. 특허 제5,854,037호 및 U.S. 특허 제5,820,871호를 참조하라. 이중시스트론 방법은 융합 단백질의 코딩 영역을 바이러스의 필수 단백질의 오픈 리딩 프레임과 그의 정지 코돈으로 삽입하는 것을 포함한다. 삽입물의 측면에는 그것이 삽입되는 필수 단백질의 IRES 및 소정의 비번역 신호 서열이 위치하며, 필수 바이러스 단백질의 오픈 리딩 프레임, 패키지화 신호, 폴리아데닐화 또는 전사 프로모터를 와해시키지 말아야 한다. 업계에 잘 알려져 있거나 여기에서 기술되는 소정의 IRES가 본 발명에 따라 사용될 수 있다 (예, 진뱅크(GenBank) 데이터베이스 목록 HUMGRP78의 뉴클레오티드 372 내지 592인 BiP 유전자의 IRES; 또는 진뱅크 데이터베이스 목록 CQ867238의 뉴클레오티드 1430-2115인 뇌심근염 바이러스 (EMCV)의 IRES). 이중시스트론 방법이 사용되는 경우에는 HA 또는 NA의 기능이 대체되지 않을 수 있기 때문에, 융합 단백질의 엑토도메인 부분이 치환된 HA 또는 NA 단백질의 기능을 제공하는 단백질로 제한되지 않는다. 이러한 융합 단백질의 엑토도메인은 그에 제한되는 것은 아니나 항원, 질병 항원 및 감염원의 소정 단백질로부터 유래하는 항원 (예, 바이러스성, 세균성 또는 기생성 감염원과 관련된 소정의 보호성 항원)을 포함한, 소정의 이종유래 분자에 상응하거나 소정 이종유래 분자의 단편을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 사용하기 위한 감염원으로부터 유래하거나 그와 관련된 항원의 비-제한적인 예는 하기 5.3 부문에 제공되어 있다.
골격 바이러스 필수 표면 단백질의 치환 또는 바이러스 게놈으로의 재조합 분절의 도입은 생성되는 키메라 바이러스를 약독화시킬 수 있는 바, 다시 말하면, 키메라 바이러스는 야생형에 비해 손상된 복제를 나타낼 것이다. 본 발명의 소정 구현예에서, 키메라 바이러스의 약독화는 키메라 바이러스가 적어도 부분적으로 감염성으로 유지되고 생체 내에서 복제 가능하되, 비-병원성인 무증상 수준의 감염으로 귀결되는 낮은 역가만을 생성하도록 하는 것이 바람직하다. 이러한 약독화 키메라 바이러스는 바이러스가 면역원, 예컨대 생 백신으로서 작용하기 위하여 대상에게 투여되는 본 발명의 구현예에 특히 적합하다. 바이러스는 업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서도, 및/또는 여기에서 예시한 바와 같이 예컨대 NS1 유전자에 돌연변이를 포함하도록 또는 HA 단백질 절단 부위 전의 다염기성 아미노산 서열에 변형을 포함하도록 바이러스를 조작하는 것 (그 각각이 전체적으로 여기에 참조로써 개재되는 U.S. 특허 제6,468,544호; U.S. 특허 제6,669,943호; 문헌 [Li et al., 1999, J. Infect. Dis. 179:1132-1138]을 참조하라)에 의해, 약독화될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 약독화된 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 조류 인플루엔자 골격 바이러스의 NS1 유전자에 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함하는데, 이것은 다른 인플루엔자 바이러스에서 NS1 유전자 산물의 세포의 인터페론 반응을 길항하는 능력을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 약독화된 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 조류 인플루엔자 골격 바이러스의 HA 유전자에 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함하는데, 이것은 다른 인플루엔자 바이러스에서 단백질을 그의 활성 형태로 절단하는 세포 프로테아제의 능력을 감소시키거나 제거함으로써 HA 유도 융합 및 감염성을 감소시키거나 제거하는 것으로 알려져 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 약독화된 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 조류 인플루엔자 골격 바이러스의 HA 유전자와 NS1 유전자 모두에 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함하는데, 이것은 다른 인플루엔자 바이러스에서 개별적으로 또는 조합되어 바이러스 활성을 감소시키거나 떨어뜨리는 것으로 알려져 있다. 약독화-키메라형 및 야생-형 조류 인플루엔자 바이러스의 역가는 업계에 잘 알려져 있거나 여기에서 기술되는 어떠한 기술 (예, 헤마글루틴화 분석, 플라크 분석, 란 감염 투여량(egg infectious dose) (EID50), 조직 배양 감염 투여량(tissue culture infectious dose) (TCID50) 등)을 이용하여서도 측정될 수 있으며, 바이러스는 여기에서 기술되거나 업계에 잘 알려져 있는 조건 (예, CEF 세포, MDCK 세포 (예, 5 % CO2 가습되는 배양기 내에서 MEM, 10 % v/v 소 태아 혈청 (FCS), 1 % 페니실린/스트렙토마이신 중 37 ℃로) 또는 부화 계란 (예, 37 ℃, 상대 습도 55 %의 정지 배양기 내에서) 내에서) 하에서 증식될 수 있다. 다르게는, 바이러스는 무-혈청 또는 저혈청 (예, TPCK 트립신) 배지 중에서 생육되는 세포 (예, CEF 세포, MDCK 세포 등) 내에서 증식될 수 있다.
5.1.2 자신의 비리온에 혼입된 융합 단백질을 포함하는 키메라 약독화 인플루엔자 바이러스
본 발명은 융합 단백질이 게놈에 의해 코딩되고, 발현되면 비리온으로 혼입되도록 약독화 인플루엔자 바이러스를 조작하는 것을 포함한다. 다른 말로 하면, 본 발명은 융합 단백질을 발현하여 자신의 비리온으로 혼입하도록 조작되는 "골격"으로서의 약독화 인플루에자 바이러스 (모체 바이러스)의 용도를 포함한다. 그에 제한되는 것은 아니나, 자연 상에서 발견되는 균주, 변이 또는 돌연변이, 돌연변이화 바이러스, 유전자재편성체 및/또는 유전적으로 변형된 바이러스를 포함한 어떠한 약독화 인플루엔자 바이러스 유형 또는 균주도 융합 단백질을 발현하여 자신의 비리온으로 혼입하도록 그 골격이 조작되는 데에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 모체 인플루엔자 바이러스는 자연 상에서 발견되는 바이러스가 아니다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 모체 인플루엔자 바이러스는 유전적으로 조작된 바이러스이다.
본 발명에 따라 골격 바이러스로서 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스는 자연 상에서 약독화된 표현형을 가질 수 있거나 또는 약독화 표현형과 관련된 돌연변이를 포함하도록 조작될 수 있으며, 이러한 돌연변이는 업계에 알려져 있거나 여기에서 기술된다 (예, 바이러스 NS1 단백질 또는 바이러스 HA 단백질에서의 돌연변이). 특정 구현예에서, 약독화된 바이러스는 인플루엔자 A이다. 다른 구현예에서, 약독화된 바이러스는 인플루엔자 B이다. 또 다른 구현예에서, 약독화된 바이러스는 인플루엔자 C이다. 본 발명에 따라 조작될 수 있는 인플루엔자 바이러스의 비제한적인 예에는 인플루엔자 A 아형 H10N4, 아형 H10N5, 아형 H10N7, 아형 H10N8, 아형 H10N9, 아형 Hl1Nl, 아형 Hl1N13, 아형 Hl1N2, 아형 Hl1N4, 아형 Hl1N6, 아형 Hl1N8, 아형 Hl1N9, 아형 H12N1, 아형 H12N4, 아형 H12N5, 아형 H12N8, 아형 H13N2, 아형 H13N3, 아형 H13N6, 아형 H13N7, 아형 H14N5, 아형 H14N6, 아형 H15N8, 아형 H15N9, 아형 H16N3, 아형 HlNl, 아형 H1N2, 아형 H1N3, 아형 H1N6, 아형 H1N9, 아형 H2N1, 아형 H2N2, 아형 H2N3, 아형 H2N5, 아형 H2N7, 아형 H2N8, 아형 H2N9, 아형 H3N1, 아형 H3N2, 아형 H3N3, 아형 H3N4, 아형 H3N5, 아형 H3N6, 아형 H3N8, 아형 H3N9, 아형 H4N1, 아형 H4N2, 아형 H4N3, 아형 H4N4, 아형 H4N5, 아형 H4N6, 아형 H4N8, 아형 H4N9, 아형 H5N1, 아형 H5N2, 아형 H5N3, 아형 H5N4, 아형 H5N6, 아형 H5N7, 아형 H5N8, 아형 H5N9, 아형 H6N1, 아형 H6N2, 아형 H6N3, 아형 H6N4, 아형 H6N5, 아형 H6N6, 아형 H6N7, 아형 H6N8, 아형 H6N9, 아형 H7N1, 아형 H7N2, 아형 H7N3, 아형 H7N4, 아형 H7N5, 아형 H7N7, 아형 H7N8, 아형 H7N9, 아형 H8N4, 아형 H8N5, 아형 H9N1, 아형 H9N2, 아형 H9N3, 아형 H9N5, 아형 H9N6, 아형 H9N7, 아형 H9N8, 또는 아형 H9N9; 인플루엔자 B 균주 아이치/5/88, 균주 아키타/27/2001, 균주 아키타/5/2001, 균주 알라스카/16/2000, 균주 알라스카/1777/2005, 균주 아르헨티나/69/2001, 균주 아리조나/146/2005, 균주 아리조나/148/2005, 균주 방콕/163/90, 균주 방콕/34/99, 균주 방콕/460/03, 균주 방콕/54/99, 균주 바르셀로나/215/03, 균주 베이징/15/84, 균주 베이징/184/93, 균주 베이징/243/97, 균주 베이징/43/75, 균주 베이징/5/76, 균주 베이징/76/98, 균주 벨지움/WVl06/2002, 균주 벨지움/WV107/2002, 균주 벨지움/WV109/2002, 균주 벨지움/WVl14/2002, 균주 벨지움/WV122/2002, 균주 본/43, 균주 브라질/952/2001, 균주 부카레스트/795/03, 균주 부에노스 아이레스/161/00, 균주 부에노스 아이레스/9/95, 균주 부에노스 아이레스/SW16/97, 균주 부에노스 아이레스/VL518/99, 균주 캐나다/464/2001, 균주 캐나다/464/2002, 균주 차코/366/00, 균주 차코/R113/00, 균주 제주/303/03, 균주 치바/447/98, 균주 총킹/3/2000, 균주 임상 단리주 SAl 타일랜드/2002, 균주 임상 단리주 SAlO 타일랜드/2002, 균주 임상 단리주 SAlOO 필리핀/2002, 균주 임상 단리주 SAlOl 필리핀/2002, 균주 임상 단리주 SAl10 필리핀/2002, 균주 임상 단리주 SAl12 필리핀/2002, 균주 임상 단리주 SAl13 필리핀/2002, 균주 임상 단리주 SAl14 필리핀/2002, 균주 임상 단리주 SA2 타일랜드/2002, 균주 임상 단리주 SA20 타일랜드/2002, 균주 임상 단리주 SA38 필리핀/2002, 균주 임상 단리주 SA39 타일랜드/2002, 균주 임상 단리주 SA99 필리핀/2002, 균주 CNIC/27/2001, 균주 콜로라도/2597/2004, 균주 코르도바/VA418/99, 균주 체코슬로바키아/16/89, 균주 체코슬로바키아/69/90, 균주 대구/10/97, 균주 대구/45/97, 균주 대구/47/97, 균주 대구/9/97, 균주 B/Du/4/78, 균주 B/더반/39/98, 균주 더반/43/98, 균주 더반/44/98, 균주 B/더반/52/98, 균주 더반/55/98, 균주 더반/56/98, 균주 잉글랜드/1716/2005, 균주 잉글랜드/2054/2005, 균주 잉글랜드/23/04, 균주 핀란드/154/2002, 균주 핀란드/159/2002, 균주 핀란드/160/2002, 균주 핀란드/161/2002, 균주 핀란드/162/03, 균주 핀란드/162/2002, 균주 핀란드/ 162/91, 균주 핀란드/164/2003, 균주 핀란드/172/91, 균주 핀란드/173/2003, 균주 핀란드/176/2003, 균주 핀란드/184/91, 균주 핀란드/188/2003, 균주 핀란드/190/2003, 균주 핀란드/220/2003, 균주 핀란드/WV5/2002, 균주 푸지안/36/82, 균주 제노바/5079/03, 균주 제노바/11/02, 균주 제노바/2/02, 균주 제노바/21/02, 균주 제노바/54/02, 균주 제노바/55/02, 균주 광동/05/94, 균주 광동/08/93, 균주 광동/5/94, 균주 광동/55/89, 균주 광동/8/93, 균주 광조우/7/97, 균주 광조우/86/92, 균주 광조우/87/92, 균주 경기/592/2005, 균주 하노버/2/90, 균주 하르빈/07/94, 균주 하와이/10/2001, 균주 하와이/1990/2004, 균주 하와이/38/2001, 균주 하와이/9/2001, 균주 헤베이/19/94, 균주 헤베이/3/94, 균주 헤난/22/97, 균주 히로시마/23/2001, 균주 홍콩/110/99, 균주 홍콩/1115/2002, 균주 홍콩/112/2001, 균주 홍콩/123/2001, 균주 홍콩/1351/2002, 균주 홍콩/1434/2002, 균주 홍콩/147/99, 균주 홍콩/156/99, 균주 홍콩/157/99, 균주 홍콩/22/2001, 균주 홍콩/22/89, 균주 홍콩/336/2001, 균주 홍콩/666/2001, 균주 홍콩/9/89, 균주 휴스턴/1/91, 균주 휴스턴/1/96, 균주 휴스턴/2/96, 균주 후난/4/72, 균주 이바라키/2/85, 균주 은천/297/2005, 균주 인디아/3/89, 균주 인디아/77276/2001, 균주 이스라엘/95/03, 균주 이스라엘/WVl87/2002, 균주 재팬/1224/2005, 균주 지앙수/10/03, 균주 요하네스버그/1/99, 균주 요하네스버그/96/01, 균주 카도마/1076/99, 균주 카도마/122/99, 균주 카고시마/15/94, 균주 캔사스/22992/99, 균주 카즈코프/224/91, 균주 코베/1/2002, 균주 코우치/193/99, 균주 라지오/1/02, 균주 리/40, 균주 레닌그라드/129/91, 균주 리싸본/2/90, 균주 로스엔젤레스/1/02, 균주 루사카/270/99, 균주 리용/1271/96, 균주 말레이지아/83077/2001, 균주 마푸토/1/99, 균주 마르 델 플라타/595/99, 균주 메릴랜드/1/01, 균주 멤피스/1/01, 균주 멤피스/12/97-MA, 균주 미시간/22572/99, 균주 미에/1/93, 균주 밀라노/1/01, 균주 민스크/318/90, 균주 모스코우/3/03, 균주 나고야/20/99, 균주 난창/1/00, 균주 내쉬빌/107/93, 균주 내쉬빌/45/91, 균주 네브라스카/2/01, 균주 네덜란드/801/90, 균주 네덜란드/429/98, 균주 뉴욕/1/2002, 균주 NIB/48/90, 균주 닝시아/45/83, 균주 노르웨이/1/84, 균주 오만/16299/2001, 균주 오사카/1059/97, 균주 오사카/983/97-V2, 균주 오슬로/1329/2002, 균주 오슬로/1846/2002, 균주 파나마/45/90, 균주 파리/329/90, 균주 파르마/23/02, 균주 퍼스/211/2001, 균주 페루/1364/2004, 균주 필리핀/5072/2001, 균주 부산/270/99, 균주 퀘벡/173/98, 균주 퀘벡/465/98, 균주 퀘벡/7/01, 균주 로마/1/03, 균주 사가/S172/99, 균주 서울/13/95, 균주 서울/37/91, 균주 상동/7/97, 균주 상하이/361/2002, 균주 시가/T30/98, 균주 시추안/379/99, 균주 싱가포르/222/79, 균주 스페인/WV27/2002, 균주 스톡홀름/10/90, 균주 스위쩌랜드/5441/90, 균주 타이완/0409/00, 균주 타이완/0722/02, 균주 타이완/97271/2001, 균주 테헤란/80/02, 균주 토쿄/6/98, 균주 트리에스테/28/02, 균주 울란 우데/4/02, 균주 유나이티드 킹덤/34304/99, 균주 USSR/100/83, 균주 빅토리아/103/89, 균주 비엔나/1/99, 균주 우한/356/2000, 균주 WV194/2002, 균주 수안우/23/82, 균주 야마가타/1311/2003, 균주 야마가타/K500/2001, 균주 알라스카/12/96, 균주 GA/86, 균주 나가사키/1/87, 균주 토쿄/942/96, 또는 균주 로체스터/02/2001; 인플루엔자 C 균주 아이치/1/81, 균주 안 아보르/1/50, 균주 아오모리/74, 균주 캘리포니아/78, 균주 잉글랜드/83, 균주 그리스/79, 균주 히로시마/246/2000, 균주 히로시마/252/2000, 균주 효고/1/83, 균주 요하네스버그/66, 균주 카나가와/1/76, 균주 쿄토/1/79, 균주 미시시피/80, 균주 미야기/1/97, 균주 미야기/5/2000, 균주 미야기/9/96, 균주 나라/2/85, 균주 뉴저지/76, 균주 피그/베이징/115/81, 균주 사이타마/3/2000, 균주 시즈오카/79, 균주 야마가타/2/98, 균주 야마가타/6/2000, 균주 야마가타/9/96, 균주 베를린/1/85, 균주 잉글랜드/892/8, 균주 그레이트 레이크스/1167/54, 균주 JJ/50, 균주 피그/베이징/10/81, 균주 피그/베이징/439/82, 균주 테일러/1233/47, 또는 균주 C/야마가타/10/81이 포함된다.
일 구현예에서, 본 발명에 따라 사용되는 약독화 인플루엔자 바이러스 (모체 바이러스)는 손상된 세포 인터페론 (IFN) 길항 능력을 가진다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따라 사용되는 약독화 인플루엔자 바이러스 (모체 바이러스)는 손상된 바이러스의 세포 인터페론 반응 길항 능력으로 귀결되는 NS1 유전자에서의 돌연변이를 포함하는 인플루엔자 바이러스 유형 또는 균주이다. 인플루엔자 바이러스 NS1 유전자로 도입될 수 있는 돌연변이 유형의 예에는 결실, 치환, 삽입 및 그의 조합이 포함된다. NS1 유전자 (예, N-말단, C-말단 또는 그 사이의 어느 곳) 및/또는 NS1 유전자의 조절 인자(regulatory element) 전체에 걸친 어느 곳에나 하나 이상의 돌연변이가 도입될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명에 따라 사용되는 약독화 인플루엔자 바이러스 (모체 바이러스)는 N-말단에 돌연변이가 존재하는 인플루엔자 바이러스 NS1 유전자를 가지는 게놈을 포함한다. 다른 구현예에서, 약독화 인플루엔자 바이러스 (모체 바이러스)는 C-말단에 돌연변이가 존재하는 인플루엔자 바이러스 NS1 유전자를 가지는 게놈을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명에 따라 사용되는 약독화 인플루엔자 바이러스 (모체 바이러스)는 NS1의 C-말단으로부터 5, 바람직하게는 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 또는 175 아미노산 잔기로 구성되는 결실, 또는 C-말단으로부터 5-170, 25-170, 50-170, 100-170, 100-160, 또는 105-160 사이 아미노산 잔기의 결실로 귀결되는 인플루엔자 바이러스 NS1 유전자 상의 돌연변이를 가지는 게놈을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명에 따라 사용되는 약독화 인플루엔자 바이러스 (모체 바이러스)는, N-말단 아미노산이 1번일 때, 아미노산 잔기 1-126, 아미노산 잔기 1-120, 아미노산 잔기 1-115, 아미노산 잔기 1-110, 아미노산 잔기 1-100, 아미노산 잔기 1-99, 아미노산 잔기 1-95, 아미노산 잔기 1-85, 아미노산 잔기 1-80, 아미노산 잔기 1-75, 아미노산 잔기 1-73, 아미노산 잔기 1-70, 아미노산 잔기 1-65 또는 아미노산 잔기 1-60를 제외한 모든 아미노산 잔기의 결실로 귀결되는 인플루엔자 바이러스 NS1 유전자 상의 돌연변이를 가지는 게놈을 포함한다.
일 구현예에서, 본 발명의 약독화 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 바이러스 골격의 NS1 유전자에 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함하며, 이것은 NS1 유전자 산물의 세포 인터페론 반응 길항 능력을 감소시키고, 동일한 조건 하에서 증식되는 경우, 약독화 바이러스가, 0.0005 내지 0.001, 0.001 내지 0.01, 0.01 내지 0.1, 또는 0.1 내지 1 사이의 감염 다중도 (MOI), 또는 0.0005, 0.0007, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 또는 6.0의 MOI에서, 대략 감염-후 2 내지 10일, 3 내지 7일, 3 내지 5일, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일에 측정하였을 때, 세포 (예, 인간, 마우스, 랫트, 돼지, 개, 말 또는 조류 유래의 세포 (예, HEp-2, A549, 293T, 마딘-다르비 개 신장 세포(Madin-Darby canine kidney cell) (MDCK) 또는 닭 태아 섬유모세포(chicken embryo fibroblast) (CEF))) 중에서, 야생-형 인플루엔자 바이러스에 비해 대략 1 내지 대략 100 배, 대략 5 내지 대략 80 배, 대략 20 내지 대략 80 배, 또는 대략 40 내지 대략 80 배, 대략 1 내지 대략 10 배, 대략 1 내지 대략 5 배, 대략 1 내지 대략 4 배, 대략 1 내지 대략 3 배, 대략 1 내지 대략 2 배 사이, 또는 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 배 낮은 역가로 생육되는 것을 가능하게 한다. 약독화 및 야생-형 인플루엔자 바이러스의 역가는 업계에 잘 알려져 있거나 여기에서 기술되는 어떠한 기술(예, 헤마글루틴화 분석, 플라크 분석, 란 감염 투여량 (EID50), 조직 배양 감염 투여량 (TCID50) 등)을 이용하여서도 측정될 수 있으며, 바이러스는 여기에서 기술되거나 업계에 잘 알려져 있는 조건 (예, CEF 세포, MDCK 세포 (예, 5 % CO2 가습되는 배양기 내에서 MEM, 10 % v/v 소 태아 혈청 (FCS), 1 % 페니실린/스트렙토마이신 중 37 ℃로) 또는 부화 계란 (예, 37 ℃, 상대 습도 55 %의 정지 배양기 내에서) 내에서) 하에서 증식될 수 있다. 다르게는, 바이러스는 무-혈청 또는 저혈청 (예, TPCK 트립신) 배지 중에서 생육되는 세포 (예, CEF 세포, MDCK 세포 등) 내에서 증식될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따라 사용되는 약독화 인플루엔자 바이러스 (모체 바이러스)는 단백질을 그의 활성 형태로 절단하는 세포 프로테아제의 능력을 감소시키거나 제거하는 인플루엔자 골격 바이러스 HA 유전자 상의 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함한다. 인플루엔자 HA 유전자로 도입될 수 있는 돌연변이 유형의 예에는 결실, 치환, 삽입 또는 그의 조합이 포함된다. 바람직하게는, 1 이상의 돌연변이가 HA 절단 부위 (예, 진뱅크 목록 AY818135의 뉴클레오티드 1013-1039)에 도입된다. 일반적으로, CEF에서의 표준 방법에 의해 측정하였을 때의 HA 단백질의 절단가능성을 감소시키는 돌연변이는 생체내 분석에서의 독성의 감소와 관련이 있다 (여기에 그 전체가 참조로써 개재되는 문헌 [Horimoto and Kawaoka, 1994, 68:3120-3128]). 특정 구현예에서, 본 발명에 따라 사용되는 약독화 인플루엔자 바이러스 (모체 바이러스)는 뉴클레오티드 1026-1038의 단일 뉴클레오티드 티민으로의 치환으로 귀결되는 인플루엔자 바이러스 HA 유전자 상의 돌연변이를 가지는 게놈을 포함한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 약독화 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 골격 바이러스의 HA 유전자에 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함하며, 이것은 단백질을 그의 활성 형태로 절단하는 세포 프로테아제의 능력을 감소시키거나 제거하고, 동일한 조건 하에서 증식되는 경우, 약독화 바이러스가, 0.0005 내지 0.001, 0.001 내지 0.01, 0.01 내지 0.1, 또는 0.1 내지 1 사이의 감염 다중도 (MOI), 또는 0.0005, 0.0007, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 또는 6.0의 MOI에서, 대략 감염-후 2 내지 10일, 3 내지 7일, 3 내지 5일, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일에 측정하였을 때, 세포 (예, 인간, 마우스, 랫트, 돼지, 개, 말 또는 조류 유래의 세포 (예, HEp-2, A549, 293T, 마딘-다르비 개 신장 세포 (MDCK) 또는 닭 태아 섬유모세포 (CEF))) 중에서, 야생-형 인플루엔자 바이러스에 비해 대략 1 내지 대략 100 배, 대략 5 내지 대략 80 배, 대략 20 내지 대략 80 배, 또는 대략 40 내지 대략 80 배, 대략 1 내지 대략 10 배, 대략 1 내지 대략 5 배, 대략 1 내지 대략 4 배, 대략 1 내지 대략 3 배, 대략 1 내지 대략 2 배 사이, 또는 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 배 낮은 역가로 생육되는 것을 가능하게 한다. 이러한 돌연변이를 포함하는 HA 단백질은 야생-형 모체 HA 단백질과 항원적으로 구별되지 않는 바, 다시 말하면, 야생-형 HA 단백질에 대항하여 발생한 모든 항체가 돌연변이된 HA 단백질과 교차 반응할 것이며, 돌연변이된 HA 단백질에 대항하여 발생한 모든 항체는 야생-형 HA 단백질과 교차 반응할 것이다. 약독화 및 야생-형 인플루엔자 바이러스의 역가는 업계에 잘 알려져 있거나 여기에서 기술되는 어떠한 기술(예, 헤마글루틴화 분석, 플라크 분석, 란 감염 투여량 (EID50), 조직 배양 감염 투여량 (TCID50) 등)을 이용하여서도 측정될 수 있으며, 바이러스는 여기에서 기술되거나 업계에 잘 알려져 있는 조건 (예, CEF 세포, MDCK 세포 (예, 5 % CO2 가습되는 배양기 내에서 MEM, 10 % v/v 소 태아 혈청 (FCS), 1 % 페니실린/스트렙토마이신 중 37 ℃로) 또는 부화 계란 (예, 37 ℃, 상대 습도 55 %의 정지 배양기 내에서) 내에서) 하에서 증식될 수 있다. 다르게는, 바이러스는 무-혈청 또는 저혈청 (예, TPCK 트립신) 배지 중에서 생육되는 세포 (예, CEF 세포, MDCK 세포 등) 내에서 증식될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명에 따라 사용되는 약독화 인플루엔자 바이러스 (모체 바이러스)는: (i) 단백질을 그의 활성 형태로 절단하는 세포 프로테아제의 능력을 감소시키거나 제거하는 인플루엔자 골격 바이러스 HA 유전자 상의 돌연변이, 및 (ii) 손상된 바이러스의 세포 인터페론 반응 길항 능력으로 귀결되는 NS1 유전자 상의 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 약독화 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 골격 바이러스의 HA 유전자 및 NS1 유전자 모두에 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함하며, 이것은 동일한 조건 하에서 증식되는 경우, 약독화 바이러스가, 0.0005 내지 0.001, 0.001 내지 0.01, 0.01 내지 0.1, 또는 0.1 내지 1 사이의 감염 다중도 (MOI), 또는 0.0005, 0.0007, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 또는 6.0의 MOI에서, 대략 감염-후 2 내지 10일, 3 내지 7일, 3 내지 5일, 또는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일에 측정하였을 때, 세포 (예, 인간, 마우스, 랫트, 돼지, 개, 말 또는 조류 유래의 세포 (예, HEp-2, A549, 293T, 마딘-다르비 개 신장 세포 (MDCK) 또는 닭 태아 섬유모세포 (CEF))) 중에서, 야생-형 인플루엔자 바이러스에 비해 대략 1 내지 대략 100 배, 대략 5 내지 대략 80 배, 대략 20 내지 대략 80 배, 또는 대략 40 내지 대략 80 배, 대략 1 내지 대략 10 배, 대략 1 내지 대략 5 배, 대략 1 내지 대략 4 배, 대략 1 내지 대략 3 배, 대략 1 내지 대략 2 배 사이, 또는 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 배 낮은 역가로 생육되는 것을 가능하게 한다.
본 발명은 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원의 엑토도메인 (ED) 또는 그의 단편, 및 필수 인플루엔자 바이러스 당단백질의 세포질 (CT) 및 막횡단 (TM) 도메인 또는 막횡단 도메인을 가지는 1종 이상의 융합 단백질을 포함하며, 여기서 1종 이상의 융합 단백질은 1종 이상의 필수 인플루엔자 바이러스 당단백질을 기능적으로 대체하는, 키메라 약독화 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 다른 말로 하면, 약독화 인플루엔자 바이러스는 필수 인플루엔자 바이러스 당단백질 대신 1종 이상의 융합 단백질을 발현하여 자신의 비리온으로 혼입하도록 조작되는 "골격"으로서 작용한다. 융합 단백질에 의해 기능적으로 대체된 필수 인플루엔자 바이러스 당단백질에 상응하는 인플루엔자 바이러스 당단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인을 포함함으로써 이 융합 단백질이 약독화 인플루엔자 바이러스의 비리온으로 혼입되는 것이 가능하게 된다. 융합 단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인은, 융합 단백질이 약독화 인플루엔자 바이러스 골격의 비리온으로 혼입되는 것을 가능케 하는 소정의 인플루엔자 바이러스에 상응하거나 또는 그로부터 유래할 수 있다.
소정 구현예에서, 융합 단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인은 골격 약독화 인플루엔자 바이러스와 다른 유형, 아형 또는 균주의 인플루엔자 바이러스의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인에 상응한다. 다른 구현예에서, 융합 단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인은 골격 약독화 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 종 인플루엔자 바이러스의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인에 상응한다. 바람직한 구현예에서, 융합 단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인은 약독화 인플루엔자 바이러스 골격의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인에 상응한다.
소정 구현예에서, 융합 단백질의 TM 및 CT 도메인은 인플루엔자 바이러스의 HA 단백질 또는 NA 단백질 중 하나의 TM 및 CT 도메인에 상응한다. HA 또는 NA의 CT 도메인은 융합 단백질의 인플루엔자 바이러스 비리온으로의 혼입에 필요하지 않을 수 있기 때문에, 일부 구현예에서 융합 단백질은 HA 또는 NA의 TM 도메인만을 포함하도록 조작된다.
인플루엔자 바이러스 HA 및 NA 단백질의 TM 및 CT 도메인은 도메인이 HA 단백질의 C-말단과 NA 단백질의 N-말단에 위치한다는 점에서 구조적으로 구별된다. 각자의 표면 당단백질에서의 이 두 도메인의 구별되는 배향 이외에도, HA 및 CT 구조성 도메인은 폴리펩티드 사슬 내에서의 그들의 상대적인 배치에 따른 기능성에서 아직 알려지지 않은 차이를 포함할 수 있다. 따라서, 약독화 인플루엔자 바이러스로 조작될 융합 단백질을 설계할 때에는, 인플루엔자 바이러스 당단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인에 융합될 감염원 엑토도메인 또는 그 단편의 배향이 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인의 선택을 이끌 것이다.
바이러스로서의 적격성을 유지하기 위해서는, 표면 당단백질이 치환될 때 키메라 바이러스에서의 그의 기능이 융합 단백질에 의해 제공되어야 한다. 본 발명의 일 구현예에서, 키메라 약독화 인플루엔자 바이러스는 뉴라미니다제 활성을 나타내는 융합 단백질을 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에서, 키메라 약독화 인플루엔자 바이러스는 수용체 결합 활성을 나타내는 융합 단백질을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 키메라 약독화 바이러스는 그 중 하나는 뉴라미니다제 활성을 나타내고 다른 것은 수용체 결합 활성을 나타내는 2종의 융합 단백질을 포함한다. 본 발명의 또 다른 구현예에서, 키메라 약독화 인플루엔자 바이러스는 이종유래 감염원 단백질의 단편을 포함하는 융합 단백질을 포함하며, 그 융합 단백질은 뉴라미니다제 활성 또는 수용체 결합 활성을 나타낸다. 특정 구현예에서, 키메라 약독화 인플루엔자 바이러스는 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) HN 단백질의 엑토도메인 및 인플루엔자 A/WSN/33 NA 단백질의 TM 및 CT 도메인을 포함하는 표면 단백질을 포함하며, 이 HN 엑토도메인은 뉴라미니다제 활성을 나타낸다. 다른 구현예에서, 키메라 약독화 인플루엔자 바이러스는 이종유래 인플루엔자 아형 또는 균주 HA 단백질의 엑토도메인 (예, H7 HA의 엑토도메인 또는 H9 HA의 엑토도메인)을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
소정 구현예에서, 본 발명 키메라 약독화 인플루엔자 바이러스의 1종 이상의 융합 단백질은 이종유래 단백질의 완전한 엑토도메인을 포함하지 않으며 (예, 이종유래 감염원의 단백질 엑토도메인의 항원성 또는 보호성 단편을 포함), 천연 필수 당단백질 엑토도메인의 1 이상의 단편을 더 포함할 수 있거나 더 포함하지 않을 수 있다. 따라서, 소정 구현예에서, 융합 단백질의 엑토도메인은 이종유래 감염원 단백질 엑토도메인의 단편을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 융합 단백질의 엑토도메인은 천연 필수 당단백질과 이종유래 감염원 단백질 모두의 단편을 포함할 수 있다. 융합 단백질이 필수 표면 당단백질을 치환하는 구현예에서, 표면 당단백질의 기능은 융합 단백질에 의해 제공되어야 하는 바, 다시 말하면, 융합 단백질은 그것이 치환하는 표면 당단백질의 기능성을 나타내야 한다.
본 5.1.2 부문에서 기술된 융합 단백질의 엑토도메인은 감염원 (바이러스성, 세균성 및 기생성 감염원 포함)의 소정 당단백질 또는 그의 단편에 상응하거나 또는 그로부터 유래할 수 있다. 감염원 당단백질의 비-제한적인 예는 하기 5.3 부문에 제공되어 있다.
소정 구현예에서, 융합 단백질은 막횡단 도메인에 더하여 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 필수 인플루엔자 바이러스 당단백질 엑토도메인의 바로 인접한 잔기(들)을 포함한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질은 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 막횡단 도메인, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 인플루엔자 바이러스 NA 단백질 엑토도메인의 바로 인접한 잔기(들), 및 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함으로써, 융합 단백질이 NA 단백질의 기능을 기능적으로 대체할 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 융합 단백질은 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 세포질 및 막횡단 도메인, 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 막횡단 도메인에 바로 인접한 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 인플루엔자 바이러스 NA 단백질 엑토도메인의 잔기(들), 및 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함으로써, 융합 단백질이 NA 단백질을 기능적으로 대체할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 융합 단백질은 NA 단백질의 막횡단 도메인 또는 세포질 및 막횡단 도메인, 그의 구상 헤드에 선행하는 NA 단백질의 완전한 줄기 도메인 또는 그의 단편, 및 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함으로써, 융합 단백질이 NA 단백질의 기능을 기능적으로 대체할 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 융합 단백질은 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 막횡단 도메인, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 인플루엔자 바이러스 HA 단백질 엑토도메인의 바로 인접한 잔기(들), 및 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함으로써, 융합 단백질이 HA 단백질의 기능을 기능적으로 대체할 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 융합 단백질은 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 세포질 및 막횡단 도메인, 인플루엔자 바이러스 HA 단백질의 막횡단 도메인에 바로 인접한 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 인플루엔자 바이러스 HA 단백질 엑토도메인의 잔기(들), 및 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함으로써, 융합 단백질이 HA 단백질을 기능적으로 대체할 수 있다.
본 발명은 본 5.1.2 부문에서 개시된 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (즉, 재조합 분절)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 5.1.2 부문에서 개시된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 분절은 vRNA의 적절한 복제, 전사 및 패키지화를 위하여 필요한 3' 및 5' 혼입 신호 (그들 모두 여기에 그 전체가 참조로써 개재되는 문헌 [Fujii et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2002-2007]; [Zheng, et al., 1996, Virology 217:242-251])를 포함한다. 따라서, 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 재조합 분절은 골격 약독화 인플루엔자 바이러스와 동일한 바이러스 유형 또는 균주 내 바이러스 분절의 3' 및 5' 비코딩 및/또는 비번역 서열을 사용한다. 특정 구현예에서, 재조합 분절은 5.1.2 부문에서 개시된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하며, 이것은 인플루엔자 바이러스 NA vRNA의 3' 비코딩 영역, NA 단백질의 CT 및 TM 도메인에 상응하는 NA 코딩 영역, 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 막횡단 도메인에 바로 인접한 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 인플루엔자 바이러스 NA 단백질 엑토도메인의 잔기(들), NA 단백질 리딩 프레임의 비번역 영역 및 NA vRNA의 5' 비-코딩 영역을 포함한다. 소정 구현예에서, 재조합 분절은 5.1.2 부문에서 개시된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하며, 이것은 그의 구상 헤드에 선행하는 NA 단백질의 완전한 줄기 도메인 또는 그의 단편을 포함한다.
약독화 인플루엔자 바이러스의 NA 또는 HA 단백질을 치환하는 것의 대안으로서, "역 유전학" 및 이중시스트론 기술이 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원의 엑토도메인 또는 질병 항원, 및 인플루엔자 바이러스의 TM 및/또는 CT 도메인을 포함하는 키메라 인플루엔자 바이러스를 제조하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 그 각각이 전체적으로 여기에 참조로써 개재되는 U.S. 특허 제6,887,699호, U.S. 특허 제6,001,634호, U.S. 특허 제5,854,037호 및 U.S. 특허 제5,820,871호를 참조하라. 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는, 질병 항원 및 감염원으로부터 유래하는 항원과 같은 이종유래 분자 (예, 질병 또는 바이러스 단백질과 관련된 항원)의 비-제한적인 예는 하기 5.3 부문에 제공되어 있다.
5.1.3 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 엑토도메인을 포함하는 키메라 조류 인플루엔자 바이러스
본 발명은 뉴캐슬병 바이러스 HN 단백질의 엑토도메인을 포함하는 융합 단백질이 게놈에 의해 코딩되며, 발현시에는 비리온으로 혼입되도록 하는, 조류 인플루엔자 바이러스의 조작을 포함한다. 그에 제한되는 것은 아니나 자연 상에서 발견되는 균주, 변이 또는 돌연변이, 돌연변이화 바이러스, 유전자재편성체 및/또는 유전적으로 조작된 바이러스를 포함하여, 융합 단백질을 발현하여 조류 인플루엔자 비리온으로 혼입하도록 조작될 수 있는 어떠한 조류 인플루엔자 바이러스 유형 또는 균주도 본 발명에 따라 선택되어 사용될 수 있다. 조류 인플루엔자 바이러스의 비-제한적인 예에는 인플루엔자 A 아형 H5N1, H6N2, H7N3, H9N2 및 H10N7이 포함된다.
본 발명은 뉴캐슬병 바이러스 (NDV) HN 단백질의 엑토도메인 (ED), 및 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 세포질 (CT) 및 막횡단 (TM) 도메인 또는 막횡단 도메인을 가지는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 조류 인플루엔자 바이러스 NA 단백질을 기능적으로 대체하는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 다른 말로 하면, 조류 인플루엔자 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스 NA 단백질 대신 융합 단백질을 발현하여 자신의 비리온으로 혼입하도록 조작되는 "골격"으로서 작용한다. 융합 단백질 중 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인을 포함함으로써 이 융합 단백질이 조류 인플루엔자 바이러스의 비리온으로 혼입되는 것이 가능하게 된다. 융합 단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인은, 융합 단백질이 조류 인플루엔자 바이러스 골격의 비리온으로 혼입되는 것을 가능케 하는 소정의 인플루엔자 바이러스에 상응하거나 또는 그로부터 유래할 수 있다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 TM 및 CT 도메인의 코딩 서열은 모든 인플루엔자 균주 또는 아형에 속하는 소정 NA 단백질의 공지된 서열 (예, 진뱅크 목록 AY651447, A/VietNam/1203/2004(H5Nl) 균주 유래; 진뱅크 목록 AY96877, A/turkey/Canada/63 (H6N2) 균주 유래; 진뱅크 목록 AY706954, A/duck/Hainan/4/2004 (H6N2) 균주 유래; 진뱅크 목록 AY646080, A/chicken/British Columbia/GSC_human_B/04 (H7N3) 균주 유래; 또는 진뱅크 목록 DQ064434, A/chicken/Beijing/8/98 (H9N2) 균주 유래)로부터 수득되거나 유래할 수 있다. 소정 구현예에서, 융합 단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인은 골격 조류 인플루엔자 바이러스와 다른 유형 또는 균주의 조류 인플루엔자 바이러스의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인에 상응한다. 다른 구현예에서, 융합 단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인은 조류 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 인플루엔자 바이러스의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인에 상응한다. 바람직한 구현예에서, 융합 단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인은 조류 인플루엔자 바이러스 골격의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인에 상응한다. 특정 구현예에서, 융합 단백질의 TM 및 CT 도메인은 인플루엔자 A/WSN/33 NA 단백질의 TM 및 CT 도메인에 상응한다.
소정 구현예에서, 융합 단백질은 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 막횡단 도메인, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 인플루엔자 바이러스 NA 단백질 엑토도메인의 바로 인접한 잔기(들), 및 NDV HN 단백질의 엑토도메인을 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 융합 단백질은 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 세포질 및 막횡단 도메인, 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 막횡단 도메인에 바로 인접한 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 인플루엔자 바이러스 NA 단백질 엑토도메인의 잔기(들), 및 NDV HN 단백질의 엑토도메인을 포함한다. 또 다른 특정 구현예에서, 융합 단백질은 그의 구상 헤드에 선행하는 NA 단백질의 완전한 줄기 도메인 또는 그의 단편, 및 NDV HN 단백질의 엑토도메인을 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 융합 단백질은 NA 단백질의 막횡단 도메인 또는 세포질 및 막횡단 도메인을 포함하며, 그의 구상 헤드에 선행하는 NA 단백질의 완전한 줄기 도메인 또는 그의 단편 및 NDV HN 단백질의 엑토도메인을 더 포함한다.
조류 인플루엔자 바이러스의 NA 단백질을 치환하는 것의 대안으로서, "역 유전학" 및 이중시스트론 기술이 NDV HN 단백질의 엑토도메인 및 인플루엔자 바이러스의 TM 및/또는 CT 도메인을 포함하는 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제조하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 그 각각이 전체적으로 여기에 참조로써 개재되는 U.S. 특허 제6,887,699호, U.S. 특허 제6,001,634호, U.S. 특허 제5,854,037호 및 U.S. 특허 제5,820,871호를 참조하라.
본 발명은 본 5.1.3 부문에서 개시된 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 (즉, 재조합 분절)을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 5.1.3 부문에서 개시된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 분절은 vRNA의 적절한 복제, 전사 및 패키지화를 위하여 필요한 3' 및 5' 혼입 신호 (그들 모두 여기에 그 전체가 참조로써 개재되는 문헌 [Fujii et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:2002-2007]; [Zheng, et al., 1996, Virology 217:242-251])를 포함한다. 따라서, 바람직한 일 구현예에서, 본 발명의 재조합 분절은 골격 조류 인플루엔자 바이러스와 동일한 바이러스 유형 또는 균주 내 바이러스 분절의 3' 및 5' 비코딩 및/또는 비번역 서열을 사용한다. 특정 구현예에서, 재조합 분절은 5.1.3 부문에서 개시된 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하며, 이것은 인플루엔자 바이러스 NA vRNA의 3' 비코딩 영역, NA 단백질의 CT 및 TM 도메인에 상응하는 NA 코딩 영역, 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 막횡단 도메인에 바로 인접한 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 인플루엔자 바이러스 NA 단백질 엑토도메인의 잔기(들), NA 단백질 리딩 프레임의 비번역 영역 및 NA vRNA의 5' 비-코딩 영역을 포함한다. 다른 특정 구현예에서, 재조합 분절은, 3'에서 5'의 순서로, WSN NA vRNA의 3' 비코딩 영역 (19 뉴클레오티드), NA 코딩 영역의 아미노산 잔기 1-36을 코딩하는 뉴클레오티드 (108 뉴클레오티드), NDV B1 HN 단백질의 아미노산 잔기 51-568을 코딩하는 뉴클레오티드, 2개의 연속하는 정지 코돈, WSN NA 비번역 리딩 프레임의 157 뉴클레오티드, 및 WSN vRNA의 5' 비코딩 영역 (28 뉴클레오티드)를 포함한다. 도 1을 참조하라.
골격 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 치환 또는 바이러스 게놈으로의 재조합 분절의 도입은 생성되는 키메라 바이러스를 약독화시킬 수 있는 바, 다시 말하면, 키메라 바이러스는 야생형에 비해 손상된 복제를 나타낼 것이다. 본 발명의 소정 구현예에서, 키메라 바이러스의 약독화는 키메라 바이러스가 적어도 부분적으로 감염성으로 유지되고 생체 내에서 복제 가능하되, 비-병원성인 무증상 수준의 감염으로 귀결되는 낮은 역가만을 생성하도록 하는 것이 바람직하다. 이러한 약독화 키메라 바이러스는 바이러스가 면역원, 예컨대 생 백신으로서 작용하기 위하여 대상에게 투여되는 본 발명의 구현예에 특히 적합하다. 바이러스는 업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서도, 및/또는 여기에서 예시한 바와 같이 예컨대 NS1 유전자에 돌연변이를 포함하도록 또는 HA 단백질 절단 부위 전의 다염기성 아미노산 서열에 변형을 포함하도록 바이러스를 조작하는 것 (그 각각이 전체적으로 여기에 참조로써 개재되는 U.S. 특허 제6,468,544호; U.S. 특허 제6,669,943호; 문헌 [Li et al., J. Infect. Dis. 179:1132-1138]을 참조하라)에 의해, 약독화될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 약독화된 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 조류 인플루엔자 골격 바이러스의 NS1 유전자에 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함하는데, 이것은 다른 인플루엔자 바이러스에서 NS1 유전자 산물의 세포의 인터페론 반응을 길항하는 능력을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 다른 구현예에서, 본 발명의 약독화된 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 조류 인플루엔자 골격 바이러스의 HA 유전자에 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함하는데, 이것은 다른 인플루엔자 바이러스에서 단백질을 그의 활성 형태로 절단하는 세포 프로테아제의 능력을 감소시키거나 제거함으로써 HA 유도 융합 및 감염성을 감소시키거나 제거하는 것으로 알려져 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 약독화된 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 조류 인플루엔자 골격 바이러스의 HA 유전자와 NS1 유전자 모두에 돌연변이를 포함하는 게놈을 포함하는데, 이것은 다른 인플루엔자 바이러스에서 개별적으로 또는 조합되어 바이러스 활성을 감소시키거나 떨어뜨리는 것으로 알려져 있다. 약독화-키메라형 및 야생-형 조류 인플루엔자 바이러스의 역가는 계에 잘 알려져 있거나 여기에서 기술되는 어떠한 기술 (예, 헤마글루틴화 분석, 플라크 분석, 란 감염 투여량 (EID50), 조직 배양 감염 투여량 (TCID50) 등)을 이용하여서도 측정될 수 있으며, 바이러스는 여기에서 기술되거나 업계에 잘 알려져 있는 조건 (예, CEF 세포, MDCK 세포 (예, 5 % CO2 가습되는 배양기 내에서 MEM, 10 % v/v 소 태아 혈청 (FCS), 1 % 페니실린/스트렙토마이신 중 37 ℃로) 또는 부화 계란 (예, 37 ℃, 상대 습도 55 %의 정지 배양기 내에서) 내에서) 하에서 증식될 수 있다. 다르게는, 바이러스는 무-혈청 또는 저혈청 (예, TPCK 트립신) 배지 중에서 생육되는 세포 (예, CEF 세포, MDCK 세포 등) 내에서 증식될 수 있다.
5.2 키메라 뉴캐슬병 바이러스
본 발명은 1종 이상의 융합 단백질이 게놈에 의해 코딩되며, 발현시에는 비리온으로 혼입되도록 하는, 뉴캐슬병 바이러스 ("NSV")의 조작을 포함한다. 그에 제한되는 것은 아니나 자연 상에서 발견되는 균주, 변이 또는 돌연변이, 돌연변이화 바이러스, 유전자재편성체 및/또는 유전적으로 조작된 바이러스를 포함하여, 1종 이상의 융합 단백질을 발현하여 NDV 비리온으로 혼입하도록 조작될 수 있는 어떠한 NDV 유형 또는 균주도 본 발명에 따라 선택되어 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, NDV는 자연상에서 발견되는 바이러스이다. 다른 특정 구현예에서, NDV는 유전적으로 조작된 바이러스이다. 예를 들어, 여기에서 개시되는 바와 같이, F 단백질의 절단 부위가 1 또는 2개의 추가적인 아르기닌 잔기를 포함하는 것으로 치환됨으로써 돌연변이 절단 부위가 어디에서나 발현되는 퓨린 계열의 프로테아제에 의해 활성화되도록 한 재조합 NDV의 돌연변이 균주인 rNDV/F2aa 및 rNDV/F3aa가 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있는 NDV의 비-제한적인 예에는 B1, LaSota, YG97, MET95 및 F48E9이 포함된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 키메라 NDV 또는 rNDV는 인플루엔자 HA 단백질의 엑토도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함하며; 이 구현예에 따른 특정 실시예에서, 인플루엔자 HA 단백질은 인플루엔자 H7으로부터의 HA 단백질이다.
본 발명은 NDV 단백질이 아닌 다른 감염원 단백질의 엑토도메인 (ED) 또는 그의 단편, 및 필수 NDV 당단백질의 세포질 (CT) 및/또는 막횡단 (TM) 도메인을 가지는 1종 이상의 융합 단백질을 포함하는 키메라 NDV를 제공한다. 본 발명은 또한, NDV 당단백질이 아닌 다른 감염원 단백질의 ED 또는 그의 단편과 TM 도메인, 및 필수 NDV 당단백질의 CT를 가지는 1종 이상의 융합 단백질을 포함하는 키메라 NDV를 제공한다. 본 발명은 추가적으로, NDV 당단백질이 아닌 다른 감염원 단백질의 ED 또는 그의 단편과 CT 도메인, 및 필수 NDV 당단백질의 TM 도메인을 가지는 융합 단백질을 포함하는 키메라 NDV를 제공한다. 다른 말로 하면, NDV 바이러스는 융합 단백질을 발현하여 자신의 비리온으로 혼입하도록 조작되는 "골격"으로서 작용한다. 융합 단백질 중 필수 NDV 당단백질의 TM 및/또는 CT 도메인을 포함함으로써 이 융합 단백질이 NDV의 비리온으로 혼입되는 것이 가능하게 된다. 융합 단백질의 TM 및/또는 CT 도메인은, 융합 단백질이 NDV 골격의 비리온으로 혼입되는 것을 가능케 하는 소정의 NDV에 상응하거나 또는 그로부터 유래할 수 있다.
소정 구현예에서, 융합 단백질의 TM 및/또는 CT 도메인은 골격 NDV와 다른 유형 또는 균주의 NDV의 TM 및/또는 CT 도메인에 상응한다. 바람직한 구현예에서, 융합 단백질의 TM 및/또는 CT 도메인은 NDV 골격의 TM 및/또는 CT 도메인에 상응한다.
NDV 비리온은 2종의 주요 표면 당단백질인: 융합 단백질 (F) 및 헤마글루티닌-뉴라미니다제 (HN)를 포함하며, 이들 모두는 세포질 도메인, 막횡단 도메인 및 엑토도메인을 포함한다. 따라서, 소정 구현예에서, 융합 단백질의 TM 및/또는 CT 도메인은 NDV의 F 단백질 또는 HN 단백질 중 하나의 TM 및/또는 CT 도메인에 상응한다.
NDV F 및 HN 단백질의 TM 및 CT 도메인은 도메인이 F 단백질의 C-말단과 HN 단백질의 N-말단에 위치한다는 점에서 구조적으로 구별된다. 따라서, NDV로 조작될 융합 단백질을 설계할 때에는, NDV 당단백질의 TM 및/또는 CT 도메인에 융합될 감염원 엑토도메인의 배향이 TM 및/또는 CT 도메인의 선택을 이끌 것이다.
소정 구현예에서, 키메라 NDV의 1종 이상의 융합 단백질은 TM 도메인, 및 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 필수 NDV 당단백질 엑토도메인의 바로 인접한 잔기들을 포함한다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 융합 단백질은 NDV F 단백질의 막횡단 도메인, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 NDV F 단백질 엑토도메인의 바로 인접한 잔기(들), 및 NDV가 아닌 다른 감염원의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함으로써, 융합 단백질이 F 단백질의 기능을 기능적으로 대체할 수 있다. 다른 특정 구현예에서, 융합 단백질은 NDV F 단백질의 세포질 및 막횡단 도메인, NDV F 단백질의 막횡단 도메인에 바로 인접한 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 NDV F 단백질 엑토도메인의 잔기(들), 및 NDV가 아닌 다른 감염원의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함으로써, 융합 단백질이 F 단백질을 기능적으로 대체할 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 융합 단백질은 NDV HN 단백질의 막횡단 도메인, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 NDV HN 단백질 엑토도메인의 바로 인접한 잔기(들), 및 NDV가 아닌 다른 감염원의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함으로써, 융합 단백질이 HN 단백질의 기능을 기능적으로 대체할 수 있다. 또 다른 특정 구현예에서, 융합 단백질은 NDV HN 단백질의 세포질 및 막횡단 도메인, NDV HN 단백질의 막횡단 도메인에 바로 인접한 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 1 내지 3, 2 또는 1 개의 NDV HN 단백질 엑토도메인의 잔기(들), 및 NDV가 아닌 다른 감염원의 엑토도메인 또는 그의 단편을 포함함으로써, 융합 단백질이 HN 단백질을 기능적으로 대체할 수 있다.
소정 구현예에서, NDV 표면 당단백질 (즉, HN 또는 F 단백질)은 NDV 당단백질의 필수 기능(들)을 제공하는 융합 단백질에 의해 치환된다. 이러한 구현예에 있어서, 융합 단백질의 엑토도메인은 그것이 치환된 NDV 당단백질의 필수 기능(들)을 제공하게 되도록 선택되어야 한다. 다른 구현예에서, 융합 단백질은, 천연 NDV 표면 당단백질에 더하여, 발현되고 NDV의 비리온으로 혼입된다.
소정 구현예에서, 본 발명 키메라 NDV의 1종 이상 융합 단백질은 이종유래 단백질의 완전한 엑토도메인을 포함하지 않으며 (예, 이종유래 감염원 단백질 엑토도메인의 항원성 단편을 포함), 천연 필수 당단백질 엑토도메인의 1 이상의 단편을 더 포함할 수 있거나 더 포함하지 않을 수 있다. 따라서, 소정 구현예에서, 융합 단백질의 엑토도메인은 이종유래 감염원 단백질 엑토도메인의 단편을 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 융합 단백질의 엑토도메인은 천연 필수 당단백질과 이종유래 감염원 단백질 모두의 단편을 포함할 수 있다. 융합 단백질이 필수 표면 당단백질을 치환하는 구현예에서, 표면 당단백질의 기능은 융합 단백질에 의해 제공되어야 하는 바, 다시 말하면, 융합 단백질은 그것이 치환하는 표면 당단백질의 기능성을 나타내야 한다.
본 5.2 부문에서 개시된 융합 단백질이 필수 바이러스 당단백질의 기능을 대체할 필요가 없다면, 융합 단백질의 엑토도메인은, 그에 제한되는 것은 아니나 모든 감염원 항원 (바이러스성, 세균성 및 기생성 감염원 항원 포함) 및 모든 질병 항원을 포함한 모든 이종유래 분자에 상응하거나 또는 그로부터 유래할 수 있다. 감염원 항원 및/또는 질병 항원의 비-제한적인 예는 하기 5.3 부문에 제공되어 있다.
본 발명은 본 5.2 부문에서 개시된 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 구현예에서, 뉴클레오티드 서열은 코자크(Kozak) 서열, 이어서 NDV F 단백질의 유전자 말단, 시스트론간 뉴클레오티드 (T) 및 유전자 개시 서열, 이어서 H7N2 HA 단백질의 5' 비번역 영역 및 ORF를 코딩하는 핵산을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따라 사용되는 NDV 균주는 바이러스의 약독성 균주, 즉 조류에서 일반적으로 저독성 또는 무증상 감염을 나타내는 균주, 예컨대 균주 B1, 균주 LaSota 또는 균주 Met95이다. 본 발명은 또한 NDV의 고독성 균주, 예컨대 YG97 또는 F48E9, 또는 업계에 알려져 있거나 여기에서 예시되는 방법을 사용한 유전적 재조합에 의해 변형된 NDV 균주의 용도를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 NDV F 단백질이 융합생성 활성을 증가시키도록 절단 부위에서 유전적으로 변형된 NDV의 용도를 포함한다. 본 발명에 따른 특정 구현예에서, 변형된 F 단백질은 F 절단 부위에 2 내지 3개의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 골격 바이러스 필수 표면 단백질의 치환 또는 바이러스 게놈으로의 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 도입은 생성되는 키메라 바이러스를 약독화시키거나 또는 추가적으로 약독화시킬 수 있는 바, 다시 말하면, 키메라 바이러스는 야생형에 비해 손상된 복제를 나타낼 것이다. 본 발명의 소정 구현예에서, 키메라 바이러스의 약독화 또는 추가적인 약독화는 키메라 바이러스가 적어도 부분적으로 감염성으로 유지되고 생체 내에서 복제 가능하되, 비-병원성인 무증상 수준의 감염으로 귀결되는 낮은 역가만을 생성하도록 하는 것이 바람직하다. 이러한 약독화 키메라 바이러스는 바이러스가 면역원, 예컨대 생 백신으로서 작용하기 위하여 대상에게 투여되는 본 발명의 구현예에 특히 적합하다. 바이러스는 업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서도 약독화될 수 있다.
5.3 본 발명의 키메라 바이러스로 조작될 수 있는 항원
본 발명에 따라, 소정의 이종유래 분자가 그 분자에 대한 면역 반응을 이끌어내기 위하여 바이러스 골격으로 조작될 수 있다. 특정 구현예에서, 모든 감염성 병원체의, 또는 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 모든 질병과 관련된 소정의 항원이 NDV 및/또는 인플루엔자 바이러스 골격으로 조작될 수 있다. 특정 구현예에서, 항원은 당단백질이다. 소정의 바람직한 구현예에서, 항원은 인플루엔자 바이러스 및/또는 NDV의 필수 당단백질을 기능적으로 대체할 수 있다. 특정 구현예에서, 항원은 뉴라미니다제 또는 헤마글루티닌 (예, 수용체 결합/융합생성) 활성을 나타낸다. 항원을 발현할 바이러스 골격을 선택함에 있어서는, 항원을 코딩하는 뉴클레오티드의 배향이 고려된다. 예를 들어, 항원이 자연 상에서 그의 아미노-말단을 통하여 앵커링되는 경우, 융합 단백질의 조작에 사용하기 위한 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인은, 자연 상에서 역시 그의 아미노 말단을 통하여 앵커링되는 골격 바이러스 또는 연관 바이러스의 필수 바이러스 단백질, 예컨대 인플루엔자의 N 단백질 또는 NDV의 HN 단백질의 TM 및 CT 도메인 또는 TM 도메인에 상응할 것이다.
특정 구현예에서는, 바이러스 항원이 NDV 또는 인플루엔자 바이러스 골격으로 조작된다. 바이러스 항원의 비제한적인 예에는 아데노비리다에(adenoviridae) (예, 포유류아데노바이러스 및 조류아데노바이러스), 헤르페스비리다에(herpesviridae) (예, 단순 포진 바이러스 1, 단순 포진 바이러스 2, 단순 포진 바이러스 5, 단순 포진 바이러스 6, 엡스타인-바 바이러스, HHV6-HHV8 및 거대세포바이러스), 레비비리다에(leviviridae) (예, 레비바이러스, 장내세균 파아지 MS2, 알롤레바이러스), 폭스비리다에(poxviridae) (예, 코르도폭스비리나에, 파라폭스바이러스, 조류마마바이러스, 카프리폭스바이러스, 페로리이폭스바이러스, 수이폭스바이러스, 몰루스키폭스바이러스, 및 엔토모폭스비리나에), 파포바비리다에(papovaviridae) (예, 폴리오마바이러스 및 유두종바이러스), 파라믹소비리다에(paramyxoviridae) (예, 파라믹소바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 1, 모빌리바이러스 (예, 홍역 바이러스), 볼거리바이러스 (예, 멈프스 바이러스), 뉴모노비리나에 (예, 뉴모바이러스, 인간 호흡기 신크티알 바이러스), 인간 호흡기 세포융합 바이러스 및 폐렴후바이러스 (예, 조류 뉴모바이러스 및 인간 폐렴후바이러스)), 피코르나비리다에(picornaviridae) (예, 엔테로바이러스, 리노바이러스, 헤파토바이러스 (예, 인간 헤파티트스 A 바이러스), 카르디오바이러스, 및 앞토바이러스), 레오비리다에(reoviridae) (예, 오르소레오바이러스, 오비바이러스, 로타바이러스, 사이포바이러스, 피지바이러스, 파이토레오바이러스, 및 오리자바이러스), 레트로비리다에(retroviridae) (예, 포유류 유형 B 레트로바이러스, 포유류 유형 C 레트로바이러스, 조류 유형 C 레트로바이러스, 유형 D 레트로바이러스 군, BLV-HTLV 레트로바이러스, 렌티바이러스 (예, 인간 면역결핍 바이러스 1 및 인간 면역결핍 바이러스 2 (예, HIV gp16O), 스푸마바이러스)), 플라비비리다에(flaviviridae) (예, C형 간염 바이러스, 뎅기 바이러스, 서부 나일 바이러스), 헤파드나비리다에(hepadnaviridae) (예, B형 간염 바이러스), 토가비리다에(togaviridae) (예, 알파바이러스 (예, 신드비스 바이러스) 및 루비바이러스 (예, 루벨라 바이러스)), 라브도비리다에(rhabdoviridae) (예, 베지큘로바이러스, 리싸바이러스, 에페메로바이러스, 사이토라브도바이러스, 및 네클레오라브도바이러스), 아레나비리다에(arenaviridae) (예, 아레나바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 이삐 바이러스, 및 라싸 바이러스), 및 코로나비리다에(coronaviridae) (예, 코로나바이러스 및 토로바이러스) 로부터의 항원이 포함된다. 특정 구현예에서, 바이러스 항원은 HIV gp120, HIV nef, RSV F 당단백질, RSV G 당단백질, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, HTLV 택스(tax), 단순 포진 바이러스 당단백질 (예, gB, gC, gD 및 gE) 또는 B형 간염 표면 항원, C형 간염 바이러스 E 단백질 또는 코로나바이러스 스파이크 단백질이다. 소정 구현예에서, 바이러스 항원은 gp41이 아니다. 소정 구현예에서, 바이러스 항원은 파라믹소바이러스로부터 유래한다. 다른 대안적 구현예에서, 바이러스 항원은 파라믹소바이러스로부터 유래하지 않는다. 소정 구현예에서, 바이러스 항원은 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 1, 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 3, RSV 또는 센다이 바이러스로부터 유래한다. 다른 대안적인 구현예에서, 바이러스 항원은 인간 파라인플루엔자 바이러스 유형 1, 파라인플루엔자 바이러스 유형 3, RSV 또는 센다이 바이러스로부터 유래하지 않는다. 특정 구현예에서, 바이러스 골격은 인플루엔자 바이러스이며, 인플루엔자 바이러스 골격으로 조작되는 항원은 인플루엔자 항원이 아니다. 다른 특정 구현예에서, 바이러스 골격은 NDV이며, NDV 골격으로 조작되는 항원은 NDV 항원이 아니다.
다른 구현예에서는, 세균 항원 (예, 세균 외피 단백질 또는 그 세균과 관련된 보호성 항원)이 NDV 또는 인플루엔자 바이러스 골격으로 조작된다. 세균 항원의 비제한적인 예에는 아쿠아스피릴룸 ( Aquaspirillum ) 과, 아조스피릴룸( Azospirillum ) 과, 아조토박테라세아에 ( Azotobacteraceae ) 과, 박테로이다세아에 ( Bacteroidaceae ) 과, 바르 토넬라( Bartonella ) 종, 브델로비브리오 ( Bdellovibrio ) 과, 캄필로박터( Campylobacter ) 종, 클라마이디아 ( Chlamydia ) 종 (예, 클라마이디아 뉴모니아에( Chlamydia pneumoniae )), 클로스트리듐(Clostridium), 엔테로박테리아세아 에( Enterobacteriaceae ) 과 (예, 시트로박터 ( Citrobacter ) 종, 에드워드시엘라(Edwardsiella), 엔테로박터 에어로제네스( Enterobacter aerogenes ), 어위니 아( Erwinia ) 종, 에쉐리키아 콜리 ( Escherichia coli ), 하프니아(Hafnia) 종, 클렙시엘라( Klebsiella ) 종, 모르가넬라(Morganella) 종, 프로테우스 불가리스( Proteus vulgaris), 프로비덴시아(Providencia), 살모넬라( Salmonella ) 종, 세라티아 마르세센스( Serratia marcescens ), 및 쉬겔라 플레스너리 ( Shigella flexneri )), 가르디넬라( Gardinella ) 과, 해모필루스 인플루엔자에( Haemophilus influenzae ), 할로박테리아세아에 ( Halobacteriaceae ) 과, 헬리코박터( Helicobacter ) 과, 레지오날라세아에 ( Legionallaceae ) 과, 리스테리아( Listeria ) 종, 메틸로콕카세아에 ( Methylococcaceae ) 과, 마이코박테리아(mycobacteria) (예, 마이코박테리움 튜버큘로시스( Mycobacterium tuberculosis )), 네이쎄리아세아에 ( Neisseriaceae ) 과, 오셔노스피릴룸( Oceanospirillum ) 과, 파스퉤렐라세아에 ( Pasteurellaceae ) 과, 뉴 모 콕커스( Pneumococcus ) 종, 슈도모나스( Pseudomonas ) 종, 리조비아세아에( Rhizobiaceae ) 과, 스피릴룸 ( Spirillum ) 과, 스피로소마세아에 ( Spirosomaceae ) 과, 스태필로콕커스( Staphylococcus ) (예, 메티실린 내성 스태필로콕커스 아우레우 스( Staphylococcus aureus ) 및 스태필로콕커스 파이로제네스( Staphylococcus pyrogenes)), 스트렙토콕커스 ( Streptococcus ) (예, 스트렙토콕커스 엔터리티디스( Streptococcus enteritidis ), 스트렙토콕커스 패씨아에( Streptococcus fasciae), 및 스트렙토콕커스 뉴모니아에 ( Streptococcus pneumoniae )), 뱀피로비브 르 헬리코박터( Vampirovibr Helicobacter ) 과, 여시니아 ( Yersinia ) 과, 바실러스 안트라시스( Bacillus antracis ) 및 뱀피로비브리오 ( Vampirovibrio ) 과에 속하는 세균으로부터의 항원이 포함된다.
다른 구현예에서는, 기생충 (예, 원생동물)과 관련된 보호성 항원이 NDV 또는 인플루엔자 바이러스 골격으로 조작된다. 기생충 또는 기생충 (예, 원생동물)의 보호성 항원과 관련된 어떠한 항원도 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다. 기생충 항원의 비제한적인 예에는 아메바, 말라리아 원충, 열원충(Plasmodium), 크루스 파동편모충(Trypanosoma cruzi)과 같은 기생충으로부터의 항원이 포함된다.
다른 구현예에서는, 균류 항원이 NDV 또는 인플루엔자 바이러스 골격으로 조작된다. 균류 항원의 비제한적인 예에는 아브시디아 ( Absidia ) 종 (예, 아브시디아 코림비페라( Absidia corymbifera ) 및 아브시디아 라모사 ( Absidia ramosa )), 아스퍼길러스 ( Aspergillus ) 종, (예, 아 스퍼길러스 플라버스 ( Aspergillus flavus ), 아스퍼길러스 푸미가투스( Aspergillus fumigatus), 아스퍼길러스 니둘란스 ( Aspergillus nidulans ), 아스퍼길러스 니제 르( Aspergillus niger ), 및 아스퍼길러스 테레우스 ( Aspergillus terreus )), 바시디 오볼러스 라나룸 ( Basidiobolus ranarum ), 블라스토마이세스 더마티티디스( Blastomyces dermatitidis ), 칸디다( Candida ) 종 (예, 칸디다 알비칸스( Candida albicans), 칸디다 글라브라타 ( Candida glabrata ), 칸디다 케르 ( Candida kerr ), 칸디다 크루세이( Candida krusei ), 칸디다 파라프실로시스 ( Candida parapsilosis ), 칸디다 슈도트로피칼리스 ( Candida pseudotropicalis ), 칸디다 퀼레르몬디이( Candida quillermondii ), 칸디다 루고사 ( Candida rugosa ), 칸디다 스텔라토이데 아( Candida stellatoidea), 및 칸디다 트로피칼리스 ( Candida tropicalis )), 콕시디오이데스 임미티스( Coccidioides immitis ), 코니디오볼러스 ( Conidiobolus ) 종, 크립토콕커스 네오폼스( Cryptococcus neoforms ), 큐닝하멜라 ( Cunninghamella ) 종, 더마토파이테스(dermatophytes), 히스토플라스마 캡슐라툼 ( Histoplasma capsulatum ), 마이크로스포룸 집세움 ( Microsporum gypseum ), 뮤코 푸실러스 ( Mucor pusillus ), 파라콕시디 오이데스 브라질리엔시스 ( Paracoccidioides brasiliensis ), 슈달레쉐리아 보이디이( Pseudallescheria boydii ), 리노스포리디움 시베리 ( Rhinosporidium seeberi ), 뉴모시스티스 카리니이 ( Pneumocystis carinii ), 리조퍼스 ( Rhizopus ) 종 (예, 리조 퍼스 아리주스 ( Rhizopus arrhizus ), 리조퍼스 오 리자에( Rhizopus oryzae ), 및 리조퍼스 마이크로스포러스 ( Rhizopus microsporus )), 사카로마이세스( Saccharomyces ) 종, 스포로트릭스 쉔키이 ( Sporothrix schenckii ), 자이고마이세츠(zygomycetes), 및 자이고마이세츠 ( Zygomycetes ), 아스코마이세츠 ( Ascomycetes ), 바시디오마이세츠( Basidiomycetes ), 듀테로마이세츠 ( Deuteromycetes ), 및 우마이세츠( Oomycetes)와 같은 류에 속하는 균류로부터의 항원이 포함된다.
다른 구현예에서는, 종양 관련 항원이 NDV 또는 인플루엔자 바이러스 골격으로 조작된다. 업계에 알려져 있는 모든 종양 관련 항원이 본 발명의 방법에 따라 사용될 수 있다. 종양 관련 항원의 비제한적인 예에는 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, N-아세틸글루코스아미닐트랜스퍼라제-V, p-15, MART-1/MelanA, TRP-1 (gp75), 타이로시나제, 싸이클린-의존성 키나제 4, β-카테닌, MUM-1, CDK4, HER-2/neu, 인간 파필로마바이러스-E6, 인간 파필로마 바이러스 E7, MUC-1, 카스파제-8, CD5, CD20, CEA, 뮤신-1, 루이스X, CA-125, 표피 성장 인자 수용체, pl85HER2, IL-2R, Fap-α, 테나씬, 메탈로프로테이나제와 관련된 항원, 및 CAMPATH-1이 포함된다.
5.4 본 발명 키메라 바이러스의 구성 및 증식
본 발명의 키메라 바이러스는 역 유전학 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 역 유전학 기술은 바이러스 폴리머라제에 의한 인식을 위하여 그리고 성숙한 비리온을 생성하는 데에 필요한 패키지화 신호를 위하여 필수적인 음성-가닥 바이러스 RNA의 비-코딩 영역을 포함하는 합성 재조합 바이러스 RNA의 제조를 수반한다. 재조합 RNA는 재조합 DNA 주형으로부터 합성되고 생체 외에서 정제된 바이러스 폴리머라제 복합체를 사용하여 재구성됨으로써, 세포를 형질감염(transfect)시키는 데에 사용될 수 있는 재조합 리보뉴클레오단백질 (RNP)을 형성한다. 생체 외 또는 생체 내 모두에서 합성 RNA의 전사시 바이러스 폴리머라제 단백질이 존재할 경우 더 효율적인 형질감염이 이루어진다. 합성 재조합 RNP는 감염성 바이러스 입자로 회수될(rescued) 수 있다. 전술한 기술들은 1992년 11월 24일자로 공고된 U.S. 특허 제5,166,057호; 1998년 12월 29일자로 공고된 U.S. 특허 제5,854,037호; 1996년 2월 20일자로 공개된 유럽 특허 공개 EP 0702085A1호; U.S. 특허 출원 번호 제09/152,845호; 1997년 4월 3일자로 공개된 국제 특허 공개 PCT WO97/12032호; 1996년 11월 7일자로 공개된 WO96/34625호; 유럽 특허 공개 EP A780475호; 1999년 1월 21일자로 공개된 WO 99/02657호; 1998년 11월 26일자로 공개된 WO 98/53078호; 1998년 1월 22일자로 공개된 WO 98/02530호; 1999년 4월 1일자로 공개된 WO 99/15672호; 1998년 4월 2일자로 공개된 WO 98/13501호; 1997년 2월 20일자로 공개된 WO 97/06270호; 및 1997년 6월 25일자로 공개된 EPO 780 475Al호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 전체적으로 여기에 참조로써 개재된다.
무-헬퍼(helper-free) 플라스미드 기술 또한 본 발명의 키메라 바이러스를 조작하는 데에 이용될 수 있다. 간단하게 말하면, 인플루엔자 바이러스에 있어서는, 플라스미드 벡터로의 PCR 산물의 삽입을 가능케 하는 유일한 제한 부위를 포함하는 프라이머를 이용한 PCR을 사용하여 바이러스 분절의 전체 길이 cDNA가 증폭된다 (그 모두가 전체적으로 여기에 참조로써 개재되는 문헌 [Flandorfer et al., 2003, J. Virol. 77:9116-9123]; [Nakaya et al., 2001, J. Virol. 75:11868-11873]). 플라스미드 벡터는 PCR 산물을 말단 절단된(truncated) 인간 RNA 폴리머라제 I 프로모터와 델타 간염 바이러스 리보자임 서열 사이에 배치함으로써 폴리머라제 I 프로모터로부터 정확한 음성 (vRNA 극성)의 전사체가 생성되도록 설계된다. 각 바이러스 분절을 포함하는 별도의 플라스미드 벡터는 물론 필수 바이러스 단백질을 포함하는 발현 벡터가 세포로 형질감염됨으로써 재조합 바이러스 입자의 생성을 이끌어낸다. 무-헬퍼 플라스미드 기술의 상세한 설명은, 예컨대 그 전체가 여기에 참조로써 개재되는 국제 공개 제WO 01/04333호; U.S. 특허 제6,649,372호; 문헌 [Fodor et al., 1999, J. Virol. 73:9679-9682]; [Hoffmann et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6108-6113]; 및 [Neumann et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9345-9350]을 참조하라. 유사하게, NDV의 단일 분절 게놈에 있어서는, 힛치너(Hitchner) B1 균주의 완전한 cDNA가 구성되어 플라스미드 벡터로 삽입되고, P 및 M 유전자 사이에 유일한 제한 부위를 포함하도록 조작된다. 다음에, 본 발명에 따라 조작된 융합 단백질이 바이러스 게놈의 유일한 제한 부위로 삽입될 수 있다. T7 폴리머라제로부터 정확한 음성의 전사체가 생성되도록, 단일 분절은 T7 프로모터와 델타 간염 바이러스 리보자임 사이에 배치된다. 플라스미드 벡터와 필수 바이러스 단백질을 포함하는 발현 벡터가 세포로 형질감염됨으로써 재조합 바이러스 입자의 생성을 이끌어낸다 (그 각각이 전체적으로 참조로써 개재되는 문헌 [Swayne et al., 2003, Avian Dis. 47:1047-1050] 및 [Swayne et al., 2001, J. Virol. 11868- 11873]을 참조하라).
본 발명의 키메라 인플루엔자 바이러스는 이중시스트론성인 RNA 분절을 포함하도록 조작될 수 있다. 이중시스트론 기술은 IRES 서열의 사용을 통하여 다중 단백질의 코딩 서열을 단일의 mRNA로 조작하는 것을 가능케 한다. IRES 서열은 RNA 분자로의 리보자임의 내부적 동원을 이끌어 캡 무관 방식의 하향 번역을 가능케 한다. 간단하게 말하면, 한 단백질의 코딩 영역이 제2의 단백질의 ORF로 삽입된다. 삽입물의 측면에는 IRES 및 적절한 발현 및/또는 기능을 위하여 필요한 소정의 비번역 신호 서열이 위치한다. 삽입물은 제2 단백질의 오픈 리딩 프레임, 폴리아데닐화 또는 전사 프로모터를 와해시키지 말아야 한다 (예컨대 그 각각이 전체적으로 여기에 참조로써 개재되는 문헌 [Garcfa-Sastre et al., 1994, J. Virol. 68:6254-6261] 및 [Garcia-Sastre et al., 1994 Dev. Biol. Stand. 82:237-246]을 참조하라).
5.4.1 키메라 바이러스의 증식
본 발명의 키메라 인플루엔자 바이러스는 여기에서 개시되는 키메라 바이러스의 용도를 가능케 하는 역가로 바이러스가 생육될 수 있도록 하는 어떠한 기질에서도 증식될 수 있다. 일 구현예에서, 기질은 상응하는 야생-형 바이러스에서 측정되는 것에 비견될 만한 역가로 키메라 바이러스가 생육되는 것을 가능케 한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 약독화된 키메라 인플루엔자 바이러스는 IFN-결핍 기질에서 증식된다.
본 발명의 키메라 바이러스는 바이러스에 의한 감염에 감수성인 세포 (예, 조류 세포, 닭 세포 등), 부화란 또는 동물 (예, 새)에서 생육될 수 있다. 이러한 방법들은 업계 숙련자에게 잘 알려져 있다. 특정 구현예에서, 감소된 인터페론 길항제 활성을 가지는 약독화 인플루엔자 바이러스를 증식시키는 데에 사용되는 세포는 IFN-결핍성이다. 일 구현예에서, 본 발명의 키메라 조류 바이러스는 닭 세포 또는 부화란에서 증식된다. 대표적인 닭 세포에는 닭 태아 섬유모세포 또는 닭 태아 신장 세포가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 키메라 바이러스는 예컨대 6 내지 14일 령의 부화한에서 증식될 수 있다. 어리거나 미성숙한 부화란이 본 발명의 약독화된 키메라 인플루엔자 바이러스를 증식시키는 데에 사용될 수 있다. 미성숙 부화란에는 10일 미만, 예컨대 6 내지 9일 령의 란인 INF-결핍성의 란이 포함된다. 미성숙 부화란에는 또한, 생육 조건 변경, 예컨대 배양 온도의 변화; 약물을 사용한 처리; 또는 란의 발달 지체로 귀결됨으로써 10 내지 12일 령의 란과 비교할 때 IFN 시스템이 완전히 발달되지 않도록 하는 소정의 다른 변경의 결과로써, 인공적으로 10일 령 이하의 미성숙 란을 흉내낸 란이 포함된다. 본 발명의 키메라 바이러스는 부화란의 상이한 위치, 예컨대 요막 강(allantoic cavity)에서 증식될 수 있다. 바이러스, 특히 감소된 인터페론 길항제 활성을 가지는 약독화 인플루엔자 바이러스의 생육 및 증식에 관한 상세한 논의를 위해서는, 예컨대 그 모두가 전체적으로 여기에 참조로써 개재되는 U.S. 특허 제6,852,522호 및 U.S. 특허 제6,852,522호를 참조하라.
바이러스의 단리를 위하여, 키메라 바이러스는 일반적으로 예컨대 구배 원심분리 및 컬럼 크로마토그래피와 같은 잘 알려진 정제 방법에 의해, 세포 배양으로부터 제거되고 세포 성분으로부터 분리되며, 필요에 따라 업계 숙련자에게 잘 알려진 방법, 예컨대 플라크 분석을 사용하여 더 정제될 수 있다.
5.5 키메라 바이러스의 용도
본 발명의 키메라 바이러스는 대상에서의 활성 면역화에 사용될 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명의 키메라 바이러스는 1종 이상의 질병을 예방, 관리 및/또는 치료하는 데에 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 키메라 바이러스는 2종의 감염원에 의한 감염을 예방, 관리 및/또는 치료하는 데에 사용될 수 있다. 면역원성 제제 및 그러한 제제의 대상에서의 면역 반응 유발을 위한 용도에 대한 설명은 5.5.1 부문을 참조하라. 본 발명의 키메라 바이러스는 또한, 진단 면역분석, 수동 면역요법, 및 항개별특이형(antiidiotypic) 항체의 생성에 사용될 수 있는 항체를 제조하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러가 아닌 다른 감염원의 엑토도메인을 가지는 융합 단백질을 포함하는 키메라 인플루엔자 바이러스는 대상 (예, 마우스, 랫트, 돼지, 말, 당나귀, 새 또는 인간)에 투여되어 인플루엔자 골격 및 감염원 모두에 대한 항체를 생성시킬 수 있으며, 이것은 이후 분리되어 진단 분석, 수동 면역요법 및 항개별특이형 항체의 생성에 사용될 수 있다. 생성된 항체는 업계에 알려져 있는 표준 기술 (예, 면역친화성 크로마토그래피, 원심분리, 침전 등)에 의해 분리되어 진단 면역분석, 수동 면역요법 및 항개별특이형 항체의 생성에 사용될 수 있다. 단리된 항체는 수동 면역요법에 사용되기 전에 변형될 수 있는데, 예를 들어 항체는 키메라화되거나 인간화될 수 있다. 키메라화 및 인간화된 항체의 생성에 대한 논의를 위해서는, 예컨대 그 각각이 전체적으로 여기에 참조로써 개재되는 U.S. 특허 제4,444,887호 및 4,716,111호; 및 국제 공개 제WO 98/46645호, WO 98/50433호, WO 98/24893호, WO98/16654호, WO 96/34096호, WO 96/33735호, 및 WO 91/10741호를 참조하라.
수동 면역화에 사용하기 위하여 키메라 바이러스에 의해 제조되는 항체에 있어서, 대상에 투여되는 투여량은 일반적으로 환자 체중의 0.0001 mg/kg 내지 100 mg/kg이다. 바람직하게는, 환자에 투여되는 투여량은 대상 체중의 0.0001 mg/kg 내지 20 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 10 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 5 mg/kg, 0.0001 내지 2 mg/kg, 0.0001 내지 1 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.75 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.5 mg/kg, 0.0001 mg/kg 내지 0.25 mg/kg, 0.0001 내지 0.15 mg/kg, 0.0001 내지 0.10 mg/kg, 0.001 내지 0.5 mg/kg, 0.01 내지 0.25 mg/kg 또는 0.01 내지 0.10 mg/kg 사이이다. 본 발명에 포함되는 항체는 감염성 질병 또는 그의 이상이나 증상의 중복 면역화 또는 치료, 관리 또는 예방을 위한 다른 예방 또는 치료 조성물과 함께 투여될 수 있다. 본 발명 항체 투여분의 투여는 일시 주사에 의한 것이거나 IV에 의한 더 천천히 제공되는 것 (예, 약 5분, 약 15분, 약 30분, 약 45분, 약 1시간, 약 2시간, 약 4시간, 또는 약 6시간 이상)일 수 있다. 본 발명 항체의 투약은 또한, 치료 과정에 걸쳐 (예, 2주, 1개월, 2개월, 4개월, 6개월, 8개월, 10개월, 12개월, 16개월, 20개월, 또는 24개월 또는 그 이상) 반복될 수 있다 (예, 매일, 매 2일, 매 3일, 매주, 매 2주, 매 3주, 매 6주, 매 9주, 매 12주, 매 4개월, 매 6개월, 매 12개월, 매 18개월, 또는 매 2년). 소정 구현예에서, 본 발명의 키메라 바이러스에 의해 제조되는 항체는 비경구적으로, 예컨대 정맥내로, 근육내로 또는 피하로 투여될 수 있거나, 또는 다르게는 경구적으로 또는 비강내로 투여된다. 본 발명에 포함되는 항체는 서방형 제제로도 투여될 수 있다.
본 발명의 키메라 바이러스가 투여된 대상으로부터 단리되는 항체는 또한, 치료 및/또는 질병의 진행을 모니터링하는 데에 사용될 수 있다. 그에 제한되는 것은 아니나, 몇 가지 예만 들면 방사선면역분석, ELISA (효소-연관 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 침전 반응, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 분석, 응집 분석, 보체 고정 분석, 면역방사선 분석, 형광 면역분석, 단백질 A 면역분석 및 면역전기영동 분석과 같은 기술을 사용한 경쟁적 및 비경쟁적 분석 시스템을 포함하여, 업계에 알려져 있는 모든 면역분석 시스템이 이러한 목적에 사용될 수 있다.
본 발명의 키메라 바이러스에 의해 생성되는 항체는 또한, 항개별특이형 항체의 제조에 사용될 수 있다.
항개별특이형 항체는 이후에 다시 키메라 인플루엔자의 최초 항원에 결합하는 항체 부분군을 제조하기 위한 면역화에 사용될 수 있다 (문헌 [Jerne, 1974, Ann. Immunol. (Paris) 125c:373]; [Jerne et al., 1982, EMBO J. 1:234]).
면역화 과정에서, 사용되는 면역원의 양 및 면역화 일정은 업계 숙련의에 의해 결정될 것이며, 대상의 면역 반응 및 항체 역가를 참조하여 투여될 것이다.
5.5.1 면역원성 제제
본 발명은 또한, 본 발명 키메라 바이러스의 면역원성 제제, 예컨대 백신 제제에서의 용도를 포함한다. 면역원성 제제가 키메라 인플루엔자 바이러스를 포함하는 경우, 제제는 인플루엔자 바이러스 감염, 및/또는 다른 감염원에 의한 감염 및/또는 질병을 예방, 관리, 중화, 치료 및/또는 개선하는 방법에 사용될 수 있다. 면역원성 제제가 키메라 NDV를 포함하는 경우, 제제는 NDV 감염, 다른 감염원에 의한 감염 및/또는 질병을 예방, 관리, 중화, 치료 및/또는 개선하는 방법에 사용될 수 있다.
면역원성 제제는 생 또는 불활성화된 본 발명의 키메라 바이러스 중 하나를 포함할 수 있다. 키메라 바이러스는 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 방법에 의해 불활성화될 수 있다. 통상적인 방법은 불활성화에 포르말린과 열을 사용한다. 예를 들어, 여기에 그 전체가 참조로써 개재되는 U.S. 특허 제6,635,246호를 참조하라. 다른 방법에는 여기에 그 전체가 참조로써 개재되는 U.S. 특허 제5,891,705호; 5,106,619호 및 4,693,981호에서 기술된 것들이 포함된다.
대상에서의 증식이 자연 상의 감염에서 발생하는 것과 유사한 종류 및 크기의 자극을 연장시켜 주며 그에 따라 실질적이고 오래 지속되는 면역성을 부여하기 때문에, 생 면역원성 제제가 바람직할 수 있다. 이러한 생 재조합 면역원성 제제의 제조는 세포 배양 중에서 또는 부화란 (예, 닭 부화란)중에서의 키메라 바이러스의 증식과 그에 이어지는 정제를 포함하는 통상적인 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 또한, 키메라 바이러스는 생체 내에서 다른 생물학적 결과를 나타냄으로써 차후의 감염에 대한 보호를 제공하는, 강력한 IFN 반응을 유발할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 면역원성 제제는 유효량의 본 발명 키메라 바이러스, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. "약학적으로 허용가능한"이라는 용어는, 동물, 및 더 구체적으로는 인간에서의 용도로, 연방 정부 또는 주 정부의 관리 기관에 의해 승인되었거나, 또는 미국의 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 등재되어 있음을 의미한다. "담체"라는 용어는 그것과 함께 약학적 조성물 (예, 면역원성 또는 백신 제제)이 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 운반제를 말한다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스와 글리세롤 용액 역시, 특히 주사 용액에, 액체 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 부형제에는 전분, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 석회분, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 활석, 염화 나트륨, 건조 탈지유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 적합한 약학적 담체의 예는 E.W. 마틴(Martin)의 문헌 "[Remington's Pharmaceutical Sciences]"에 기술되어 있다. 제제는 투여 양태에 적합해야 한다. 구체적인 제제는 또한 키메라 바이러스가 생이냐 불활성이냐에 따라서도 달라질 수 있다.
본 발명의 면역원성 제제는 미경험 대상(naive subject), 즉 질병을 가지고 있지 않거나, 또는 1종 또는 양 감염원에 감염된 적이 없거나 현재 감염되어 있지 않은 대상에 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 면역원성 제제는 미경험 대상, 즉 질병을 가지고 있지 않거나, 또는 1종 또는 양 감염원에 감염된 적이 없으며 현재 감염되어 있지 않지만, 그러한 질병 (예, 바이러스 감염)에 걸릴 위험이 있는 대상에 투여된다. 일 구현예에서, 본 발명의 면역원성 제제는 질병을 가지고 있지 않거나, 또는 그에 대하여 키메라 바이러스가 면역 반응을 유발하는 감염원 중 하나를 가지고 있지 않으며 그에 감염되어 있지 않은 대상에 투여된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 면역원성 제제는 그에 대하여 키메라 바이러스가 면역 반응을 유발하는 양 감염원을 가지고 있지 않으며 그에 감염되어 있지 않은 대상에 투여된다. 본 발명의 면역원성 제제는 또한, 그에 대하여 키메라 바이러스가 면역 반응을 유발하는 1종 또는 양 감염원 또는 또 다른 유형, 아형 또는 균주의 감염원에 감염되어 있거나 및/또는 감염된 적이 있는 대상에도 투여될 수 있다.
많은 방법들이 면역원성 제제, 예컨대 상기한 백신 제제를 도입하는 데에 사용될 수 있으며, 여기에는 비강내, 기관내, 경구, 피내, 근육내, 복막내, 정맥내, 결막 및 피하의 경로가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 새에서는, 방법에 후비공 접종이 더 포함될 수 있다. 비경구적 투여에 대한 대안으로서, 본 발명은 또한 음용수를 통하는 것 또는 분무와 같이 농업적 목적을 위한 집단 투여의 경로도 포함한다. 야생-형 바이러스의 자연 상 감염 경로를 통하여 키메라 인플루엔자 바이러스 면역원성 제제를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 다르게는, 융합 단백질이 유래하는 감염원의 자연 상 감염 경로를 통하여 본 발명의 키메라 바이러스를 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 강력한 분비성 및 세포성 면역 반응을 유발하는 키메라 바이러스의 능력은 유리하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 키메라 바이러스에 의한 기도 감염은 특정 질병 유발 감염원에 대한 감염 보호(concomitant protection)와 함께, 예컨대 비뇨생식 시스템에서의 강한 분비성 면역 반응을 유발할 수 있다. 또한, 바람직한 일 구현예에서는, 본 발명의 약학적 제제를 소정의 적합한 경로에 의해 폐로 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 폐 투여는 또한 예컨대 흡입기 또는 분무기, 그리고 분무 용도의 에어로졸화제를 포함하는 제제의 사용에 의해서도 이용될 수 있다.
소정 구현예에서, 본 발명의 면역원성 제제는 감염 (예, 바이러스 감염 또는 비-바이러스 감염원에 의한 감염)에 대한 완전한 보호로 귀결되지 않으며, 대신 비처리된 대상에 비해 병원체 (예, 바이러스)가 저역가이거나 수가 감소되는 것으로 귀결된다. 소정 구현예에서, 본 발명 면역원성 제제의 투여는 비처리된 대상에 비해 0.5 배, 1 배, 2 배, 4 배, 6 배, 8 배, 10 배, 15 배, 20 배, 25 배, 50 배, 75 배, 100 배, 125 배, 150 배, 175 배, 200 배, 300 배, 400 배, 500 배, 750 배, 또는 1,000 배 이상의 병원체 역가 감소로 귀결된다. 병원체의 역가, 수 또는 총 존재량 감소의 이익에는 감염 증상의 심각성 경감 및 감염과 관련된 질병 또는 이상의 기간 감소가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
소정 구현예에서, 본 발명의 면역원성 제제는 미경험 대상을 질병 (예, 감염)으로부터 보호하는 데에 사용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 면역원성 제제는 미경험 대상을 인플루엔자 바이러스 및/또는 인플루엔자 바이러스가 아닌 1종 이상의 다른 감염원에 의한 감염으로부터 보호하는 데에, 및/또는 감염과 관련된 질병 또는 증상으로부터 보호하는 데에 사용된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 면역원성 제제는 미경험 대상을 NDV 및/또는 1종 이상의 다른 감염원에 의한 감염으로부터 보호하는 데에, 및/또는 그와 관련된 질병 또는 증상으로부터 보호하는 데에 사용된다. 그러한 다른 감염원의 비-제한적인 예는 파필로마 바이러스, 헤르페스 바이러스, 레트로바이러스 (예, HIV), 간염 바이러스, 리노바이러스, 호흡기 신크티알 바이러스, NDV, 거대세포바이러스, 아데노바이러스, 클로스트리디아 ( Clostridia ) 종, 살모넬라( Salmonella ) 종, 스태필로콕커스 ( Staphylococcus ) 종, 엔테로콕커스( Enterococcus ) 종, 비브리오( Vibrio ) 종, 이. 콜리 (E. coli ), 스트렙토콕커스 에퀴( Streptococcus equi ), 마이코플라스마 뉴모니아에 ( Mycoplasma pneumoniae ), 클 랩시엘라 뉴모니아에 ( Klebsiella pneumoniae ) 및 슈도모나스 아에루지노사( Pseudomonas aeruginosa ), 및 더마토필러스 콩골렌시스( Dermatophilus congolensis), 또는 아뫼바, 말라리아 기생충 또는 트리파노소마 크루 지( Trypanosoma cruzi )와 같은 원생동물이다.
본 발명 면역원성 제제의 예방 및/또는 치료 효과는 부분적으로 면역 반응 (예, 체액 면역 반응)의 획득 또는 유발에 기초한다. 일 양태에서, 면역원성 제제는 대상 또는 그의 동물 모델 (예, 마우스, 랫트 또는 개 모델) 중 어느 것에서 검출가능한 혈청 역가의 키메라 바이러스 항원에 대한 항체를 유발한다. 항체의 혈청 역가는 업계 숙련자에게 알려져 있는 기술, 예컨대 ELISA와 같은 면역분석을 사용하여 측정될 수 있다. 일 구현예에서, 항체는 키메라 바이러스 골격의 항원에 특이적으로 결합한다. 다른 구현예에서, 항체는 1종 이상 융합 단백질의 항원, 즉 감염원 또는 질병과 관련된 도입 단백질 엑토도메인의 항원에 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 면역원성 제제를 투여함으로써 생성되는 항체는 중화 항체이다.
일 구현예에서, 대상 또는 그의 동물 모델에 대한 본 발명 키메라 바이러스의 투여는 키메라 바이러스 골격의 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 약 1 ㎍/ml, 약 2 ㎍/ml, 약 5 ㎍/ml, 약 6 ㎍/ml, 약 10 ㎍/ml, 약 15 ㎍/ml, 약 20 ㎍/ml, 약 25 ㎍/ml, 약 50 mg/ml, 약 75 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 125 mg/ml, 약 150 mg/ml, 약 175 mg/ml, 약 200 mg/ml, 약 225 mg/ml, 약 250 mg/ml, 약 275 mg/ml, 또는 약 300 mg/ml 이상의 혈청 역가로 귀결된다. 다른 구현예에서, 대상 또는 그의 동물 모델에 대한 본 발명 키메라 바이러스의 투여는 융합 단백질의 항원, 즉 감염원 또는 질병과 관련된 도입 단백질 엑토도메인의 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 약 1 ㎍/ml, 약 2 ㎍/ml, 약 5 ㎍/ml, 약 6 ㎍/ml, 약 10 ㎍/ml, 약 15 ㎍/ml, 약 20 ㎍/ml, 약 25 ㎍/ml, 약 50 mg/ml, 약 75 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 125 mg/ml, 약 150 mg/ml, 약 175 mg/ml, 약 200 mg/ml, 약 225 mg/ml, 약 250 mg/ml, 약 275 mg/ml, 또는 약 300 mg/ml 이상의 혈청 역가로 귀결된다. 바람직하게는, 어떠한 다른 제제 투여분의 투여 없이, 본 발명 면역원성 제제 첫번째 투여분의 투여 대략 20일 (바람직하게는 25, 30, 35 또는 40일) 후에, 그와 같은 항체의 약 1 ㎍/ml, 약 2 ㎍/ml, 약 5 ㎍/ml, 약 6 ㎍/ml, 약 10 ㎍/ml, 약 15 ㎍/ml, 약 20 ㎍/ml, 약 25 ㎍/ml, 약 50 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 150 mg/ml 또는 약 300 mg/ml 이상의 혈청 역가가 달성된다. 면역 반응은 대상 또는 동물 모델에서 측정될 수 있으며, 그 반응은 이후 대상, 예컨대 인간에서의 예상되는 반응으로 상관 또는 외삽된다.
일 구현예에서, 본 발명은 대상에서 1종 이상의 질병 (예, 인플루엔자 감염 및/또는 인플루엔자가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염)을 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 인플루엔자 바이러스를 포함하는 면역원성 제제 유효량의 첫번째 투여분을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 바이러스는 이종유래 서열의 융합 단백질 (예, 질병 항원)을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 키메라 바이러스 골격의 항원 또는 항원결정인자에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 다른 구현예에서, 본 발명은 대상에서 1종 이상의 질병 (예, 인플루엔자 감염 및/또는 인플루엔자가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염)을 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 인플루엔자 바이러스를 포함하는 면역원성 제제 유효량의 첫번째 투여분을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 바이러스는 이종유래 서열의 융합 단백질 (예, 질병 항원)을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 융합 단백질의 항원 (즉, 질병과 관련된 도입 단백질 엑토도메인의 항원)에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 면역 반응은 대상 또는 동물 모델에서 측정될 수 있으며, 그 반응은 이후 대상, 예컨대 인간에서의 예상되는 반응으로 상관 또는 외삽된다. 일 구현예에서, 본 발명은 조류에서 조류 인플루엔자 감염 및/또는 조류 인플루엔자가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염을 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 포함하는 면역원성 제제의 첫번째 투여분을 본 발명 키메라 조류 바이러스의 유효량으로 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 이종유래 단백질 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 키메라 바이러스의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체 및/또는 융합 단백질의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 일부 구현예에서, 대상 또는 동물 모델에 투여되는 키메라 인플루엔자 바이러스의 투여량은 102, 5×102, 103, 5×103, 104, 5×104, 105, 5×105, 106, 5×106, 107, 5×107, 108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1O11 또는 1O12 pfu이다.
일 구현예에서, 본 발명은 대상에서 1종 이상의 질병 (예, 인플루엔자 감염 및/또는 인플루엔자가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염)을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 인플루엔자 바이러스를 포함하는 면역원성 제제 유효량의 첫번째 투여분을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 바이러스는 이종유래 서열의 융합 단백질 (예, 질병 항원)을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 키메라 바이러스 골격의 항원 또는 항원결정인자에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 다른 구현예에서, 본 발명은 대상에서 1종 이상의 질병 (예, 인플루엔자 감염 및/또는 인플루엔자가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염)을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 인플루엔자 바이러스를 포함하는 면역원성 제제 유효량의 첫번째 투여분을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 바이러스는 이종유래 서열의 융합 단백질 (예, 질병 항원)을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 융합 단백질의 항원 (즉, 질병과 관련된 도입 단백질 엑토도메인의 항원)에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 면역 반응은 대상 또는 동물 모델에서 측정될 수 있으며, 그 반응은 이후 대상, 예컨대 인간에서의 예상되는 반응으로 상관 또는 외삽된다. 일 구현예에서, 본 발명은 조류에서 조류 인플루엔자 감염 및/또는 조류 인플루엔자가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 포함하는 면역원성 제제의 첫번째 투여분을 본 발명 키메라 조류 바이러스의 유효량으로 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 이종유래 단백질 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 키메라 바이러스의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체 및/또는 융합 단백질의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 일부 구현예에서, 대상 또는 동물 모델에 투여되는 키메라 인플루엔자 바이러스의 투여량은 102, 5×102, 103, 5×103, 104, 5×104, 105, 5×105, 106, 5×106, 107, 5×107, 108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1O11 또는 1O12 pfu이다.
일 구현예에서, 본 발명은 대상에서 1종 이상의 질병 (예, 인플루엔자 감염 및/또는 인플루엔자가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염)을 관리 및/또는 개선하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 인플루엔자 바이러스를 포함하는 면역원성 제제 유효량의 첫번째 투여분을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 바이러스는 이종유래 서열의 융합 단백질 (예, 질병 항원)을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 키메라 바이러스 골격의 항원 또는 항원결정인자에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 다른 구현예에서, 본 발명은 대상에서 1종 이상의 질병 (예, 인플루엔자 감염 및/또는 인플루엔자가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염)을 관리 및/또는 개선하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 인플루엔자 바이러스를 포함하는 면역원성 제제 유효량의 첫번째 투여분을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 바이러스는 이종유래 서열의 융합 단백질 (예, 질병 항원)을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 융합 단백질의 항원 (즉, 질병과 관련된 도입 단백질 엑토도메인의 항원)에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 면역 반응은 대상 또는 동물 모델에서 측정될 수 있으며, 그 반응은 이후 대상, 예컨대 인간에서의 예상되는 반응으로 상관 또는 외삽된다. 일 구현예에서, 본 발명은 조류에서 조류 인플루엔자 감염 및/또는 조류 인플루엔자가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염을 관리 및/또는 개선하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 포함하는 면역원성 제제의 첫번째 투여분을 본 발명 키메라 조류 바이러스의 유효량으로 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 이종유래 단백질 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 키메라 바이러스의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체 및/또는 융합 단백질의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 일부 구현예에서, 대상 또는 동물 모델에 투여되는 키메라 인플루엔자 바이러스의 투여량은 102, 5×102, 103, 5×103, 104, 5×104, 105, 5×105, 106, 5×106, 107, 5×107, 108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1O11 또는 1O12 pfu이다.
일 구현예에서, 본 발명은 대상에서 1종 이상의 질병 (예, NDV 감염 및/또는 NDV가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염)을 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 NDV를 포함하는 면역원성 제제 유효량의 첫번째 투여분을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 바이러스는 이종유래 서열의 융합 단백질 (예, 질병 항원)을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 키메라 바이러스 골격의 항원 또는 항원결정인자에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 다른 구현예에서, 본 발명은 대상에서 1종 이상의 질병 (예, NDV 감염 및/또는 NDV가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염)을 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 NDV를 포함하는 면역원성 제제 유효량의 첫번째 투여분을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 바이러스는 이종유래 서열의 융합 단백질 (예, 질병 항원)을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 융합 단백질의 항원 (즉, 질병과 관련된 도입 단백질 엑토도메인의 항원)에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 면역 반응은 대상 또는 동물 모델에서 측정될 수 있으며, 그 반응은 이후 대상, 예컨대 인간에서의 예상되는 반응으로 상관 또는 외삽된다. 일 구현예에서, 본 발명은 조류에서 NDV 감염 및/또는 NDV가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염을 예방하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 NDV를 포함하는 면역원성 제제의 첫번째 투여분을 본 발명 키메라 바이러스의 유효량으로 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 NDV는 이종유래 단백질 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 키메라 바이러스의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체 및/또는 융합 단백질의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 일부 구현예에서, 대상 또는 동물 모델에 투여되는 키메라 인플루엔자 바이러스의 투여량은 102, 5×102, 103, 5×103, 104, 5×104, 105, 5×105, 106, 5×106, 107, 5×107, 108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1O11 또는 1O12 pfu이다.
일 구현예에서, 본 발명은 대상에서 1종 이상의 질병 (예, NDV 감염 및/또는 NDV가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염)을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 NDV를 포함하는 면역원성 제제 유효량의 첫번째 투여분을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 바이러스는 이종유래 서열의 융합 단백질 (예, 질병 항원)을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 키메라 바이러스 골격의 항원 또는 항원결정인자에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 다른 구현예에서, 본 발명은 대상에서 1종 이상의 질병 (예, NDV 감염 및/또는 NDV가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염)을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 NDV를 포함하는 면역원성 제제 유효량의 첫번째 투여분을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 바이러스는 이종유래 서열의 융합 단백질 (예, 질병 항원)을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 융합 단백질의 항원 (즉, 질병과 관련된 도입 단백질 엑토도메인의 항원)에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 면역 반응은 대상 또는 동물 모델에서 측정될 수 있으며, 그 반응은 이후 대상, 예컨대 인간에서의 예상되는 반응으로 상관 또는 외삽된다. 일 구현예에서, 본 발명은 조류에서 NDV 감염 및/또는 NDV가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염을 치료하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 NDV를 포함하는 면역원성 제제의 첫번째 투여분을 본 발명 키메라 바이러스의 유효량으로 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 NDV는 이종유래 단백질 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 키메라 바이러스의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체 및/또는 융합 단백질의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 일부 구현예에서, 대상 또는 동물 모델에 투여되는 키메라 인플루엔자 바이러스의 투여량은 102, 5×102, 103, 5×103, 104, 5×104, 105, 5×105, 106, 5×106, 107, 5×107, 108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1O11 또는 1O12 pfu이다.
일 구현예에서, 본 발명은 대상에서 1종 이상의 질병 (예, NDV 감염 및/또는 NDV가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염)을 관리 및/또는 개선하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 NDV를 포함하는 면역원성 제제 유효량의 첫번째 투여분을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 바이러스는 이종유래 서열의 융합 단백질 (예, 질병 항원)을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 키메라 바이러스 골격의 항원 또는 항원결정인자에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 다른 구현예에서, 본 발명은 대상에서 1종 이상의 질병 (예, NDV 감염 및/또는 NDV가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염)을 관리 및/또는 개선하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 NDV를 포함하는 면역원성 제제 유효량의 첫번째 투여분을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 바이러스는 이종유래 서열의 융합 단백질 (예, 질병 항원)을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 융합 단백질의 항원 (즉, 질병과 관련된 도입 단백질 엑토도메인의 항원)에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 면역 반응은 대상 또는 동물 모델에서 측정될 수 있으며, 그 반응은 이후 대상, 예컨대 인간에서의 예상되는 반응으로 상관 또는 외삽된다. 일 구현예에서, 본 발명은 조류에서 NDV 감염 및/또는 NDV가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염을 관리 및/또는 개선하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 NDV를 포함하는 면역원성 제제의 첫번째 투여분을 본 발명 키메라 바이러스의 유효량으로 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 상기 키메라 NDV는 이종유래 단백질 서열을 포함하는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 유효량은 첫번째 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후 그리고 소정의 차후 투여 전에, 키메라 바이러스의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체 및/또는 융합 단백질의 항원에 면역특이적으로 결합하는 항체의 약 10 ㎍/ml, 20 ㎍/ml, 30 ㎍/ml, 40 ㎍/ml, 50 ㎍/ml, 60 ㎍/ml, 70 ㎍/ml, 80 ㎍/ml, 100 ㎍/ml 이상의 혈청 역가로 귀결되는 양이다. 일부 구현예에서, 대상 또는 동물 모델에 투여되는 키메라 인플루엔자 바이러스의 투여량은 102, 5×102, 103, 5×103, 104, 5×104, 105, 5×105, 106, 5×106, 107, 5×107, 108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1O11 또는 1O12 pfu이다.
본 발명은 또한 1종 이상의 질병을 예방, 치료 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 인플루엔자 바이러스를 포함하는 면역원성 제제의 유효량을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 유효량은 본 발명의 면역원성 제제가 투여되지 않은 대상에 비해 사망률의 감소, 입원의 감소, 질병 심각성의 감소 및/또는 질병의 임상적 증상 감소로 귀결되는 양이다. 소정 구현예에서, 대상은 인간이다. 일부 구현예에서, 대상에 투여되는 키메라 인플루엔자 바이러스의 투여량은 102, 5×102, 103, 5×103, 104, 5×104, 105, 5×105, 106, 5×106, 107, 5×107, 108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1O11 또는 1O12 pfu이다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상 (바람직하게는 조류)에서 1종 이상의 질병 (예, 조류 인플루엔자 감염 및/또는 조류 인플루엔자가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염)을 예방, 치료 및/또는 관리하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 포함하는 면역원성 제제의 유효량을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 유효량은 본 발명의 면역원성 제제가 투여되지 않은 대상에 비해 감염원의 역가 또는 수의 감소, 사망률의 감소, 입원의 감소, 감염 심각성의 감소 및/또는 감염의 임상적 증상 감소로 귀결되는 양이다. 일부 구현예에서, 대상에 투여되는 키메라 조류 인플루엔자 바이러스의 투여량은 102, 5×102, 103, 5×103, 104, 5×104, 105, 5×105, 106, 5×106, 107, 5×107, 108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1O11 또는 1O12 pfu이다. 소정 구현예에서, 본 발명 면역원성 제제의 투여는 업계에 알려져 있거나 여기에서 예시되는 소정의 방법 (예, 바이러스 역가의 측정)에 의해 상기 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후에 측정하였을 때, 본 발명의 면역원성 제제가 투여되지 않은 대상에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80% 이상의 감염원 복제의 감소로 귀결된다. 다른 구현예에서, 본 발명 면역원성 제제의 투여는 업계에 알려져 있거나 여기에서 예시되는 소정의 방법 (예, 바이러스 역가 또는 세균 존재량 및/또는 농도의 측정)에 의해 상기 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후에 측정하였을 때, 본 발명의 면역원성 제제가 투여되지 않은 대상에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 또는 100 배의 감염원 복제 또는 감염원 존재량의 감소로 귀결된다.
다른 구현예에서, 본 발명은 대상 (예, 조류)에서 1종 이상의 질병 (예, NDV 감염 및/또는 NDV가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염)을 예방, 치료 및/또는 개선하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은 본 발명의 키메라 NDV 바이러스를 포함하는 면역원성 제제의 유효량을 상기 대상에 투여하는 것을 포함하고, 여기서 유효량은 본 발명의 면역원성 제제가 투여되지 않은 대상에 비해 감염원의 역가 또는 수의 감소, 사망률의 감소, 입원의 감소, 감염 심각성의 감소 및/또는 감염의 임상적 증상 감소로 귀결되는 양이다. 일부 구현예에서, 대상에 투여되는 키메라 NDV 바이러스의 투여량은 102, 5×102, 103, 5×103, 104, 5×104, 105, 5×105, 106, 5×106, 107, 5×107, 108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1O11 또는 1O12 pfu이다. 소정 구현예에서, 본 발명 면역원성 제제의 투여는 업계에 알려져 있거나 여기에서 예시되는 소정의 방법 (예, 바이러스 역가의 측정)에 의해 상기 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후에 측정하였을 때, 본 발명의 면역원성 제제가 투여되지 않은 대상에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80% 이상의 감염원 복제의 감소로 귀결된다. 다른 구현예에서, 본 발명 면역원성 제제의 투여는 업계에 알려져 있거나 여기에서 예시되는 소정의 방법 (예, 바이러스 역가의 측정)에 의해 상기 투여 2일, 5일, 10일, 15일, 20일, 또는 바람직하게는 30일 후에 측정하였을 때, 본 발명의 면역원성 제제가 투여되지 않은 대상에 비해 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 또는 100 배의 감염원 복제 또는 감염원 존재량의 감소로 귀결된다.
특정 질병 (예, 바이러스 감염)의 치료, 예방 및/또는 개선에 효과적일 본 발명 면역원성 제제의 양은 질병의 특징에 따라 달라질 것인 바, 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한, 생체외 분석이 최적 투여량 범위를 밝히는 것을 돕는 데에 임의로 사용될 수 있다. 제제에 사용될 정확한 투여량은 또한 투여 경로, 및 감염 또는 장애의 심각성에 따라 달라질 것인 바, 실시자의 판단과 각 대상의 상황에 따라 결정되어야 한다. 그러나, 투여를 위한 적합한 투여량 범위는 일반적으로 약 102, 5×102, 103, 5×103, 104, 5×104, 105, 5×105, 106, 5×106, 107, 5×107, 108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1O11 또는 1O12 pfu로서, 가장 바람직하게는 약 104 내지 약 1012이며, 1회, 2회, 3회 또는 필요한 빈도로 간격을 두어 그 이상의 회수로 대상에 투여될 수 있다. 효과적인 투여량은 생체외 또는 동물 모델 시험 시스템에 의해 유도되는 투여량 반응 곡선으로부터 외삽될 수 있다.
다양한 구현예들에서, 본 발명의 면역원성 제제 또는 본 발명 키메라 바이러스에 의해 생성되는 항체는 1종 이상의 질병 (예, 인플루엔자 감염 및/또는 인플루엔자 바이러스가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염)을 예방하기 위하여 1종 이상의 다른 요법 (예, 항바이러스 또는 면역조절 요법)과의 조합으로 대상에 투여된다. 다른 구현예에서, 본 발명의 면역원성 제제 또는 본 발명 키메라 바이러스에 의해 생성되는 항체는 1종 이상의 질병 (예, 인플루엔자 감염 및/또는 인플루엔자 바이러스가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염)을 치료하기 위하여 1종 이상의 다른 요법 (예, 항바이러스 또는 면역조절 요법)과의 조합으로 대상에 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 면역원성 제제 또는 본 발명 키메라 바이러스에 의해 생성되는 항체는 1종 이상의 질병 (예, 인플루엔자 감염 및/또는 인플루엔자 바이러스가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염)을 관리 및/또는 개선하기 위하여 1종 이상의 다른 요법 (예, 항바이러스 또는 면역조절 요법)과의 조합으로 대상에 투여된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 면역원성 제제 또는 본 발명 키메라 바이러스에 의해 생성되는 항체는 조류 인플루엔자 감염 및/또는 조류 인플루엔자 바이러스가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염을 예방하기 위하여 1종 이상의 다른 요법 (예, 항바이러스 또는 면역조절 요법)과의 조합으로 대상에 투여된다. 다른 특정 구현예에서, 본 발명의 면역원성 제제 또는 본 발명 키메라 바이러스에 의해 생성되는 항체는 조류 인플루엔자 감염 및/또는 조류 인플루엔자 바이러스가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염을 치료하기 위하여 1종 이상의 다른 요법 (예, 항바이러스 또는 면역조절 요법)과의 조합으로 대상에 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 면역원성 제제 또는 본 발명 키메라 바이러스에 의해 생성되는 항체는 NDV 감염 및/또는 NDV가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염을 예방하기 위하여 1종 이상의 다른 요법 (예, 항바이러스 또는 면역조절 요법)과의 조합으로 대상에 투여된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 면역원성 제제 또는 본 발명 키메라 바이러스에 의해 생성되는 항체는 NDV 감염 및/또는 NDV가 아닌 또 다른 감염원에 의한 감염을 치료하기 위하여 1종 이상의 다른 요법 (예, 항바이러스 또는 면역조절 요법)과의 조합으로 대상에 투여된다. 소정 구현예에서, 요법 (예, 예방 또는 치료제)들은 5분 미만의 시차로, 30분 미만의 시차로, 1시간 시차로, 약 1시간 시차로, 약 1 내지 약 2시간 시차로, 약 2시간 내지 약 3시간 시차로, 약 3시간 내지 약 4시간 시차로, 약 4시간 내지 약 5시간 시차로, 약 5시간 내지 약 6시간 시차로, 약 6시간 내지 약 7시간 시차로, 약 7시간 내지 약 8시간 시차로, 약 8시간 내지 약 9시간 시차로, 약 9시간 내지 약 10시간 시차로, 약 10시간 내지 약 11시간 시차로, 약 11시간 내지 약 12시간 시차로, 약 12시간 내지 18시간 시차로, 18시간 내지 24시간 시차로, 24시간 내지 36시간 시차로, 36시간 내지 48시간 시차로, 48시간 내지 52시간 시차로, 52시간 내지 60시간 시차로, 60시간 내지 72시간 시차로, 72시간 내지 84시간 시차로, 84시간 내지 96시간 시차로, 또는 96시간 내지 120시간 시차로 투여된다. 바람직한 구현예에서는, 2종 이상의 요법이 한번의 환자 접견시 투여된다.
업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 어떠한 항-바이러스제도 본 발명의 제제 (예, 백신 제제) 및 방법에 사용될 수 있다. 항-바이러스제의 비-제한적인 예에는 그의 수용체에 대한 바이러스의 부착, 바이러스의 세포로의 내재화, 바이러스의 복제, 또는 바이러스의 세포로부터의 방출을 억제하거나 및/또는 감소시키는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 융합 단백질 항체, 핵산 분자, 유기 분자, 무기 분자, 및 소분자가 포함된다. 구체적으로, 항-바이러스제에는 뉴클레오시드 유사체 (예, 지도부딘, 아시클로비르, 강시클로비르, 비다라빈, 이독스유리딘, 트리플루리딘, 및 리바비린), 포스카넷, 아만타딘, 리만타딘, 사퀴나비르, 인디나비르, 리토나비르, 알파-인터페론 및 다른 인터페론, 및 AZT가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특정 구현예에서, 항-바이러스제는 바이러스 항원에 대하여 면역특이적인 면역조절제이다. 여기에서 사용되는 용어 "바이러스 항원"에는 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 소정의 바이러스성 펩티드, 폴리펩티드 및 단백질 (예, HIV gp120, HIV nef, RSV F 당단백질, RSV G 당단백질, 인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌, HTLV 택스, 단순 포진 바이러스 당단백질 (예, gB, gC, gD 및 gE) 및 B형 간염 표면 항원)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 바이러스 감염성 질병의 치료에 유용한 항체에는 비제한적인 예로서 하기를 포함하는 병원성 바이러스의 항원에 대한 항체가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다: 아데노비리다에(adenoviridae) (예, 포유류아데노바이러스 및 조류아데노바이러스), 헤르페스비리다에(herpesviridae) (예, 단순 포진 바이러스 1, 단순 포진 바이러스 2, 단순 포진 바이러스 5, 및 단순 포진 바이러스 6), 레비비리다에(leviviridae) (예, 레비바이러스, 장내세균 파아지 MS2, 알롤레바이러스), 폭스비리다에(poxviridae) (예, 코르도폭스비리나에, 파라폭스바이러스, 조류마마바이러스, 카프리폭스바이러스, 페로리이폭스바이러스, 수이폭스바이러스, 몰루스키폭스바이러스, 및 엔토모폭스비리나에), 파포바비리다에(papovaviridae) (예, 폴리오마바이러스 및 유두종바이러스), 파라믹소비리다에(paramyxoviridae) (예, 파라믹소바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 1, 모빌리바이러스 (예, 홍역 바이러스), 볼거리바이러스 (예, 멈프스 바이러스), 뉴모노비리나에 (예, 뉴모바이러스, 인간 호흡기 신크티알 바이러스), 및 폐렴후바이러스 (예, 조류 뉴모바이러스 및 인간 폐렴후바이러스)), 피코르나비리다에(picornaviridae) (예, 엔테로바이러스, 리노바이러스, 헤파토바이러스 (예, 인간 헤파티트스 A 바이러스), 카르디오바이러스, 및 앞토바이러스), 레오비리다에(reoviridae) (예, 오르소레오바이러스, 오비바이러스, 로타바이러스, 사이포바이러스, 피지바이러스, 파이토레오바이러스, 및 오리자바이러스), 레트로비리다에(retroviridae) (예, 포유류 유형 B 레트로바이러스, 포유류 유형 C 레트로바이러스, 조류 유형 C 레트로바이러스, 유형 D 레트로바이러스 군, BLV-HTLV 레트로바이러스, 렌티바이러스 (예, 인간 면역결핍 바이러스 1 및 인간 면역결핍 바이러스 2), 스푸마바이러스), 플라비비리다에(flaviviridae) (예, C형 간염 바이러스, 뎅기 바이러스, 서부 나일 바이러스), 헤파드나비리다에(hepadnaviridae) (예, B형 간염 바이러스), 토가비리다에(togaviridae) (예, 알파바이러스 (예, 신드비스 바이러스) 및 루비바이러스 (예, 루벨라 바이러스)), 라브도비리다에(rhabdoviridae) (예, 베지큘로바이러스, 리싸바이러스, 에페메로바이러스, 사이토라브도바이러스, 및 네클레오라브도바이러스), 아레나비리다에(arenaviridae) (예, 아레나바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스, 이삐 바이러스, 및 라싸 바이러스), 및 코로나비리다에(coronaviridae) (예, 코로나바이러스 및 토로바이러스).
세균 감염의 예방, 치료, 관리 또는 개선 용으로 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 항-세균제 및 요법이 본 발명의 조성물 (예, 면역원성 제제) 및 방법에 사용될 수 있다. 항-세균제의 비-제한적인 예에는 세균 감염을 억제 또는 감소시키거나, 세균의 복제를 억제 또는 감소시키거나, 또는 세균의 다른 대상으로의 확산을 억제 또는 감소시키는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 융합 단백질, 항체, 핵산 분자, 유기 분자, 무기 분자, 및 소분자가 포함된다. 구체적으로, 항-세균제의 예에는 페니실린, 세팔로스포린, 이미페넴, 악스트레오남, 반코마이신, 싸이클로세린, 바시트라신, 클로르암페니콜, 에리트로마이신, 클린다마이신, 테트라싸이클린, 스트렙토마이신, 토브라마이신, 젠타마이신, 아미카신, 카나마이신, 네오마이신, 스펙티노마이신, 트리메토프림, 노르플록사신, 리팜핀, 폴리믹신, 암포테리신 B, 나이스타틴, 케토카나졸, 이소니아지드, 메트로니다졸, 및 펜타미딘이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 항-세균 요법 및 그의 투여량, 투여 경로 및 권장 용법은 업계에 알려져 있으며, 문헌 [Physician's Desk Reference (56th ed., 2002)]와 같은 문헌에 기술되어 있다. 호흡기 감염 및 항-세균 요법에 대한 추가적인 정보는 문헌 [Cecil Textbook of Medicine (18th ed., 1988)]에서 얻을 수 있다.
균류 감염 또는 그의 1종 이상 증상 (예, 균류 호흡기 감염)의 예방, 관리, 치료, 및/또는 개선 용으로 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 항균제 및 요법이 본 발명의 조성물 (예, 면역원성 제제) 및 방법에 사용될 수 있다. 항균제의 비-제한적인 예에는 균류 감염을 억제 및/또는 감소시키거나, 균류의 복제를 억제 및/또는 감소시키거나, 또는 균류의 다른 대상으로의 확산을 억제 및/또는 감소시키는 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 융합 단백질, 항체, 핵산 분자, 유기 분자, 무기 분자, 및 소분자가 포함된다. 항균제의 구체적인 예에는 아졸 약물 (예, 미코나졸, 케노코나졸 (니조랄(NIZORAL)®), 카스포펀진 아세테이트 (카니시다스(CANCIDAS)®), 이미다졸, 트리아졸 (예, 플루코나졸 (디플루칸(DIFLUCAN)®)), 및 이트라코나졸 (스포라녹스(SPORANOX)®)), 폴리엔 (예, 니스타틴, 암포테리신 B (펀지존(FUNGIZONE)®), 암포테리신 B 지질 복합체 ("ABLC") (아벨세트(ABELCET)®), 암포테리신 B 콜로이드 분산액 ("ABCD") (암포텍(AMPHOTEC)®), 리포좀 암포테리신 B (암비손(AMBISONE)®)), 요오드화 칼륨 (KI), 피리미딘 (예, 플루싸이토신 (안코본(ANCOBON)®)), 및 보리코나졸 (브이펜드(VFEND)®)이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 항균 요법 및 그의 투여량, 투여 경로 및 권장 용법은 업계에 알려져 있으며, 문헌 [Dodds et al., 2000 Pharmacotherapy 20(11) 1335-1355], [Physician's Desk Reference (57th ed., 2003)] 및 [Merk Manual of Diagnosis and Therapy (17th ed., 1999)]와 같은 문헌에 기술되어 있다.
소정 구현예에서, 본 발명의 면역원성 제제는 단일 투여량으로서 대상에 투여되며, 3 내지 6주 후에 제2 투여량이 후속된다. 이러한 구현예에 있어서는, 제2 접종에 이어서 6 내지 12개월 간격으로 대상에 추가 접종이 투여될 수 있다. 일 구현예에서, 대상은 포유류이다. 다른 구현예에서, 대상은 새이다. 또 다른 구현예에서, 대상은 인간이다. 더 바람직한 구현예에서는, 대상이 NDV 또는 조류 인플루엔자 바이러스 감염 중 어느 것에 감염될 위험이 있는 닭이다.
소정 구현예에서는, 한가지 본 발명 면역원성 제제의 투여가 반복될 수 있으며, 투여는 1일, 2일, 3일, 5일, 10일, 15일, 30일, 45일, 2개월, 75일, 3개월 이상, 또는 6개월 이상으로 분리될 수 있다.
5.6 생물학적 분석
본 발명 키메라 바이러스의 생육은 업계에 알려져 있거나 여기에서 개시되는 어떠한 방법에 의해서도 평가될 수 있다 (예, 세포 배양 (예, 닭 태아 신장 세포의 배양 또는 닭 태아 섬유모세포 (CEF)의 배양) 중에서). 본 발명 약독화 키메라 바이러스의 생육은 IFN-적격 및 IFN-결핍 세포에서 평가될 수 있다. 특정 구현예에서, CEF 세포는 0.0005 내지 0.001, 0.001 내지 0.01, 0.01 내지 0.1, 0.1 내지 1, 또는 1 내지 10의 MOI, 또는 0.0005, 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5 또는 10의 MOI로 감염되며, 5 % 요막액이 보강된 무혈청 배지로 배양된다. 바이러스 역가는 하기한 바와 같이 CEF 세포에 플라킹된(plaqued) HA에 의해 상청액에서 측정된다. 바이러스 역가가 측정될 수 있는 다른 세포에는 EFK-2 세포, 베로(Vero) 세포, 1차 인간 배꼽 정맥 내피 세포 (HUVEC), H292 인간 상피 세포주 및 헬라(HeLa) 세포가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명 키메라 바이러스 비리온으로의 융합 단백질의 혼입은 업계에 알려져 있거나 여기에서 개시되는 어떠한 방법에 의해서도 평가될 수 있다 (예, 세포 배양, 동물 모델 또는 부화란 중의 바이러스 배양에서). 예를 들어, 부화란 요막액 세포 배양으로부터의 바이러스 입자는 슈크로스 완충액(sucrose cushion)을 통한 원심분리에 의해 정제되고, 이어서 업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용한 웨스턴 블로팅(Western blotting)에 의해 융합 단백질의 발현에 대하여 분석될 수 있다.
바이러스 분석에는 업계에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 생체 외의 배양 세포에서 변화된 바이러스 복제 (예컨대 플라크 형성에 의해 측정) 또는 바이러스 단백질의 생성 (예컨대 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정) 또는 바이러스 RNA의 생성 (예컨대 RT-PCR 또는 노던(northern) 블롯 분석에 의해 측정)을 측정하는 것들이 포함된다.
본 발명의 키메라 바이러스에 의해 생성되는 항체 또는 그의 단편은 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 다양한 방법 (예, ELISA, 표면 플라스몬 공명 디스플레이 (BIA코어), 웨스턴 블롯, 면역형광, 면역염색 및/또는 미세중화 분석)에서 특성화될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 키메라 바이러스에 의해 생성되는 항체 또는 그의 단편은 키메라 골격 바이러스의 항원 또는 융합 단백질의 항원 또는 항원결정인자에 면역특이적으로 결합하는 능력에 대하여 분석될 수 있다. 이와 같은 분석은 용액에서 (예, 문헌 [Houghten, 1992, Bio/Techniques 13:412-421]), 비드(bead) 상에서 (문헌 [Lam, 1991, Nature 354:82-84]), 칩(chip) 상에서 (문헌 [Fodor, 1993, Nature 364:555-556]), 세균 상에서 (U.S. 특허 제5,223,409호), 포자 상에서 (U.S. 특허 제5,571,698호; 5,403,484호; 및 5,223,409호), 플라스미드 상에서 (문헌 [Cull et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869]), 또는 파아지 상에서 (문헌 [cott and Smith, 1990, Science 249:386-390]; [Cwirla et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382]; 및 [Felici, 1991, J. MoI. Biol. 222:301-310]) (이들 참조문헌 각각은 그 전체가 여기에 참조로써 개재된다) 수행될 수 있다. 키메라 골격 바이러스의 항원 또는 융합 단백질의 항원 또는 항원결정인자에 면역특이적으로 결합하는 것으로 확인된 본 발명의 키메라 바이러스에 의해 생성되는 항체 또는 그의 단편은 이후 상기 항원에 대한 그의 특이성에 대하여 분석될 수 있다.
본 발명의 키메라 바이러스에 의해 생성되는 항체 또는 그의 단편은 업계에 알려져 있는 소정의 방법에 의해 본 발명 키메라 바이러스의 항원 (예, 키메라 바이러스 골격의 항원 또는 항원결정인자, 또는 융합 단백질의 항원 또는 항원결정인자 (예, 질병과 관련된 항원))에 대한 면역특이적 결합 및 다른 항원과의 교차-반응성에 대하여 분석될 수 있다. 면역특이적 결합 및 교차-반응성을 분석하기 위하여 사용될 수 있는 면역분석에는, 몇 가지 예만 들면, 웨스턴 블롯, 방사선면역분석, ELISA (효소-연관 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 침전 반응, 겔 확산 침전 반응, 면역확산 분석, 응집 분석, 보체-고정 분석, 면역방사선 분석, 형광 면역분석, 단백질 A 면역분석과 같은 기술을 사용한 경쟁적 및 비경쟁적 분석 시스템이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 분석들은 통상적이며 업계에 잘 알려져 있다 (예컨대 그 전체가 여기에 참조로써 개재되는 문헌 [Ausubel et al., eds., 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York]을 참조하라). 예시적인 면역분석이 하기에 간단하게 기술된다 (그러나 제한하기 위한 의도는 아니다).
면역침전 프로토콜은 일반적으로 단백질 포스파타제 및/또는 프로테아제 억제제 (예, EDTA, PMSF, 아프로티닌, 나트륨 바나데이트)가 보강된 RIPA 버퍼 (1 % NP-40 또는 트리톤(Triton) X-100, 1 % 나트륨 데옥시콜레이트, 0.1 % SDS, 0.15 M NaCl, 0.01 M 나트륨 포스페이트로 pH 7.2, 1 % 트라실올(Trasylol))와 같은 용해 버퍼에서 세포 군집을 용해시키는 것, 대상 항체를 세포 용해물에 첨가하는 것, 40 ℃에서 일정 시간 기간 (예, 1 내지 4시간) 동안 배양하는 것, 세포 용해물에 단백질 A 및/또는 단백질 G 세파로스 비드를 첨가하는 것, 40 ℃에서 약 1시간 이상 동안 배양하는 것, 용해 버퍼에서 비드를 세척하는 것, 및 비드를 SDS/샘플 버퍼에 재현탁하는 것을 포함한다. 대상 항체의 특정 항원을 면역침전시키는 능력은 예컨대 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가될 수 있다. 업계 숙련자라면, 항원에 대한 항체의 결합을 증가시키고 바탕을 감소시키기 위하여 변경될 수 있는 파라미터들 (예, 세포 용해물을 세파로스 비드로 예비-세척하는 것)에 대해 알 수 있을 것이다. 면역침전 프로토콜에 관한 추가적인 논의를 위해서는, 예컨대 문헌 [Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York]의 10.16.1을 참조하라.
웨스턴 블롯 분석은 일반적으로 샘플을 준비하는 것, 폴리아크릴아미드 겔 (예, 항원의 분자량에 따라 8 % - 20 %의 SDS-PAGE)에서 단백질 샘플을 전기영동하는 것, 단백질 샘플을 폴리아크릴아미드 겔로부터 니트로셀룰로스, PVDF 또는 나일론과 같은 막으로 이동시키는 것, 차단 용액(blocking solution) (예, 3 % BSA 또는 무-지방 우유를 포함하는 PBS)에서 막을 배양하는 것, 세척 버퍼 (예, PBS-트윈(Tween) 20)에서 막을 세척하는 것, 차단 버퍼에 희석된 1차 항체 (대상 항체)로 막을 배양하는 것, 세척 버퍼에서 막을 세척하는 것, 차단 버퍼에 희석된, 효소 기질 (예, 당근 페록시다제 또는 알칼리성 포스파타제) 또는 방사성 분자 (예, 32P 또는 125I)에 결합된 제2 항체 (1차 항체를 인식, 예컨대 항-인간 항체)로 막을 배양하는 것, 세척 버퍼에서 막을 세척하는 것, 및 항원의 존재를 검출하는 것을 포함한다. 업계 숙련자라면, 검출되는 신호를 증가시키고 바탕 노이즈를 감소시키기 위하여 변경될 수 있는 파라미터들에 대해 알 수 있을 것이다. 웨스턴 블롯 프로토콜에 관한 추가적인 논의를 위해서는, 예컨대 문헌 [Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York]의 10.8.1을 참조하라.
ELISA는 항원을 준비하는 것, 96 웰 미량역가판(microtiter plate)의 웰을 항원으로 코팅하는 것, 효소 기질 (예, 당근 페록시다제 또는 알칼리성 포스파타제)과 같은 검출가능 화합물에 결합된 대상 항체를 웰에 첨가하는 것, 일정 시간 기간 동안 배양하는 것, 및 항원의 존재를 검출하는 것을 포함한다. ELISA에서, 대상 항체가 검출가능 화합물에 결합되어야 하는 것은 아니며; 대신, 검출가능 화합물에 결합된 제2 항체 (대상 항체를 인식)가 웰에 첨가될 수 있다. 또한, 항원으로 웰을 코팅하는 대신, 항체가 웰에 코팅될 수 있다. 이 경우, 코팅된 웰에의 대상 항원의 첨가에 이어서, 검출가능 화합물에 결합된 제2 항체가 첨가될 수 있다. 업계 숙련자라면, 검출되는 신호를 증가시키기 위하여 변경될 수 있는 파라미터들은 물론 업계에 알려져 있는 ELISA의 다른 변형들에 대해서도 알 수 있을 것이다. 바람직한 구현예에서, ELISA는 2 ㎍/ml의 PBS 중 rhu-IL-9으로 고결합 96-웰 미량역가판 (코스타(Costar))을 밤새 코팅함으로써 수행될 수 있다. PBS를 사용한 3회의 세척에 이어서, 25 ℃에서 1시간 동안 Fab의 3-배 시리즈 희석액으로 판이 배양된다. 또 다른 3회의 PBS 세척에 이어서, 1 ㎍/ml의 항-인간 카파-알칼리성 포스파타제-접합체(conjugate)가 첨가되고, 25 ℃에서 1시간 동안 판이 배양된다. PBST를 사용한 3회의 세척에 이어서, 50 ㎕/AMP/PPMP 기질에서 알칼리성 포스파타제 활성이 측정된다. 반응이 중지되고, VMAX 미량판 해독기를 사용하여 560 nm에서의 흡광도가 측정된다. ELISA에 관한 추가적인 논의를 위해서는, 예컨대 문헌 [Ausubel et al., eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., New York]의 11.2.1을 참조하라.
항원에 대한 항체의 결합 친화도 및 항체-항원 상호작용의 분리-속도(off-rate)는 경쟁적 결합 분석에 의해 측정될 수 있다. 경쟁적 결합 분석의 일 예는 증가량의 비표지 항원 존재하에서 표지된 항원 (예, 3H 또는 125I)을 대상 항체로 배양하는 것, 및 표지된 항원에 결합된 항체를 검출하는 것을 포함하는 방사선면역분석이다. IL-9 폴리펩티드에 대한 본 발명의 항체 또는 그의 단편의 친화도 및 결합 분리-속도는 스캐차드 플롯(scatchard plot) 분석에 의해 데이터로부터 측정될 수 있다. 제2 항체와의 경쟁 역시 방사선면역분석을 사용하여 측정될 수 있다. 이 경우에는, IL-9 폴리펩티드가 증가량의 비표지 제2 항체의 존재 하에 표지된 화합물 (예, 3H 또는 125I)에 결합된 본 발명의 항체로 배양된다.
바람직한 일 구현예에서는, 본 발명 키메라 바이러스의 항원 (예, 키메라 바이러스 골격의 항원 또는 항원결정인자, 또는 융합 단백질의 항원 또는 항원결정인자(예, 질병과 관련된 항원))에 대한 본 발명 항체의 결합 결성 및 분리 속도를 측정하기 위하여 BIA코어 동역학 분석(kinetic analysis)이 사용된다. BIA코어 동역학 분석은 그 표면 상에 본 발명의 키메라 바이러스에 의해 생성된 항체가 고정되어 있는 칩으로부터의, 대상 항원을 포함하는 폴리펩티드의 결합 및 해리를 분석하는 것을 포함한다. 전형적인 BIA코어 동역학 연구는 0.005 % 트윈-20을 함유하는 HBS 버퍼 중 다양한 농도의 항체 시약 (mAb, Fab) 250 μL를, 그 위에 항원이 고정되어 있는 센서 칩 표면 상에 주입하는 것을 포함한다. 유량은 75 μL/분으로 일정하게 유지된다. 해리 데이터는 필요에 따라 15분 이상 동안 수집된다. 각 주입/해리 주기에 이어서, 상황에 따라 다른 재생제(regenerant)가 사용되기도 하지만 보통은 10-100 mM HCl인 묽은 산을 1분의 펄스로 잠깐 사용하여 결합된 mAb가 항원 표면으로부터 제거된다. 더 구체적으로, 결합 속도 kon 및 해리 속도 koff의 측정을 위하여, 항원을 포함하는 폴리펩티드는 표준 아민 결합 화학작용, 즉 EDC/NHS 방법 (EDC = N-디에틸아미노프로필)-카보디이미드)의 사용을 통하여 센서 칩 표면 상에 직접 고정된다. 간단하게 말하면, pH4 또는 pH5의, 1O mM NaOAc 중의 항원을 포함하는 폴리펩티드 5-100 nM 용액이 제조되어, 대략 30-50 RU에 상응하는 항원이 고정될 때까지 EDC/NHS-활성화 표면 상으로 통과된다. 이에 이어서, 처리되지 않은 활성 에스테르가 1 M Et-NH2의 주입에 의해 "봉인" 제거("capped" off)된다. 참조 목적으로, 항원을 포함하지 않는 무처리 표면이 동일한 고정 조건 하에서 제조된다. 일단 적절한 표면이 준비되고 나면, HBS/트윈-20 중에서 항체 시약 각각의 적합한 희석액 시리즈가 제조되어, 직렬로 연결되어 있는 항원 및 참조 세포 표면 모두 상으로 통과된다. 제조되는 항체 농도의 범위는 평형 결합 상수 KD에 해당될 것으로 추정되는 값에 따라 달라진다. 상기한 바와 같이, 결합된 항체는 각 주입/해리 주기 후에 적당한 재생제를 사용하여 제거된다.
본 발명의 키메라 바이러스에 의해 생성되는 항체 또는 그의 단편은 또한, 업계 숙련자에게 알려져 있는 기술을 사용하여, 숙주 세포 수용체에 대한 본 발명 키메라 바이러스 항원 (예, 키메라 바이러스 골격의 항원 또는 항원결정인자, 또는 융합 단백질의 항원 또는 항원결정인자(예, 질병과 관련된 항원))의 결합을 억제하는 그의 능력에 대하여서도 분석될 수 있다. 예를 들어, 상기 항원에 결합하는 것으로 알려져 있는 수용체를 발현하는 세포가 본 발명의 키메라 바이러스에 의해 생성되는 항체 또는 그의 단편의 존재 또는 부존재 하에 항원과 접촉될 수 있으며, 예컨대 유세포분석(flow cytometry) 또는 섬광 분석에 의해 항원의 결합을 억제하는 항체 또는 그의 단편의 능력이 측정될 수 있다. 항원 또는 항체나 항체 단편은 항원과 세포 수용체 간 상호작용의 검출을 가능하게 하기 위하여 방사성 표지 (예, 32P, 35S 또는 125I) 또는 형광 표지 (예, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 파이코에리트린, 파이코시아닌, 알로파이코시아닌, o-프탈데하이드 및 플루오레스카민)와 같은 검출가능한 화합물로 표지될 수 있다. 다르게는, 본 발명의 키메라 바이러스에 의해 생성되는 항체 또는 그의 단편의 본 발명 키메라 바이러스의 항원 (예, 키메라 바이러스 골격의 항원 또는 항원결정인자, 또는 융합 단백질의 항원 또는 항원결정인자(예, 질병과 관련된 항원))이 수용체에 결합하는 것을 억제하는 능력은 무-세포 분석으로 측정될 수 있다. 예를 들어, 항원을 포함하는 폴리펩티드는 항체 또는 그의 단편과 접촉될 수 있으며, 폴리펩티드가 세포 수용체에 결합하는 것을 억제하는 항체 또는 항체 단편의 능력이 측정될 수 있다. 바람직하게는, 항체 또는 항체 단편은 고체 지지체 상에 고정되며, 폴리펩티드는 검출가능한 화합물로 표지된다. 다르게는, 항원을 포함하는 폴리펩티드가 고체 지지체 상에 고정되며, 항체 또는 그의 단편이 검출가능한 화합물로 표지된다.
5.6.2 생체내 분석
본 발명 키메라 바이러스의 독성은 대상에서, 특히 조류에서 또는 그의 동물 모델에서 평가될 수 있다. 일 실시예에서, 동물 모델에서 폐 손상을 유발하고 감염을 야기하는 바이러스 감염의 능력은 야생-형 바이러스 및 가상 바이러스와 비교된다. 폐 손상은 시각적 검사에 의한 건강한 폐엽의 백분율로서 평가될 수 있다. 동물은 펜토바비탈의 정맥내 투여에 의해 5일 내에 안락사되며, 그들의 폐는 완전히 제거된다. 육안으로 보이는 손상에 의해 영향을 받은 각 폐엽 표면의 백분율이 시각적으로 산정된다. 백분율은 평균하여 각 동물의 7 개의 폐엽에 대한 평균 값을 얻는다. 다른 분석에서는, 비강용 면봉을 시험하여 바이러스 존재량 또는 역가를 측정할 수 있다. 감염-후 바이러스 존재량을 측정하기 위하여, 부검시에 비강용 면봉이 사용될 수 있다.
조직 샘플에서의 바이러스의 정량을 위하여, 조직 샘플은 포스페이트-버퍼링된 염수 (PBS)에서 균질화되고, 투명화된 균질화물의 희석액은 37 ℃에서 1시간 동안 단층의 세포 (예, CEF 또는 MDCK 세포)로 흡착된다. 다음에, 감염된 단층에 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA), 0.01 % DEAE-덱스트란, 0.1 % NaHCO3, 및 1 % 아가를 함유하는 최소 필수 배지 용액이 첨가된다. 판은 플라크가 가시화될 수 있을 때까지 2 내지 3일 배양된다. PR8-감염 샘플로부터 바이러스를 적정하기 위한 조직 배양 감염 투여량 (TCID) 분석은 하기와 같이 수행된다. 96-웰 판의 융합성 단층 세포 (예, CEF 또는 MDCK 세포)가 투명화된 배지 중 조직 균질화물의 로그배수 희석액으로 배양된다. 접종 2 내지 3일 후, 각 웰의 0.05 ml 분취량이 헤마글루틴화 분석 (HA 분석)에 의해 바이러스 생육에 대하여 평가된다.
또 다른 분석에서는, 감염 후에 조직병리학적 평가가 수행된다. 비갑개(nasal turbinate) 및 기관이 상피 변화 및 상피하 염증에 대하여 시험될 수 있다. 폐는 대, 중 및 소 또는 종말 세기관지에서의 세기관지 상피 변화 및 세기관지주위 염증에 대하여 시험될 수 있다. 꽈리(alveoli) 또한 염증성 변화에 대하여 평가된다. 중 세기관지는 하기와 같은 0 내지 3+의 척도로 등급화된다: 0 (정상: 섬모화된 첨단 경계부(apical border) 및 기저 거짓중층 핵(basal pseudostratified nuclei)을 가지는 중간 내지 큰 원주 상피 세포로 정렬; 최소한의 염증); 1+ (원주형의 상피 층 및 윤곽에서도 약간 증가된 증식만을 보임; 아직 많은 세포에서 섬모가 관찰됨); 2+ (상피 층에서의 감쇠 내지는 두드러진 증식 범위의 현저한 변화; 세포의 비조직화 및 관강내 경계부(luminal border)에서의 불규칙한 층 윤곽); 3+ (관내강에서의 가시적인 세포 괴사가 보이며 현저하게 와해되고 비조직화된 상피 층; 일부 세기관지 감쇠 및 다른 것에서의 현저한 반응성 증식).
기관은 하기와 같은 0 내지 2.5+의 척도로 등급화된다: 0 (정상: 섬모화된 첨단 경계부, 기저 및 거짓중층 핵을 가지는 중간 내지 큰 원주 상피 세포로 정렬; 첨단 경계부와 핵 사이에 세포질 뚜렷; 편평 세포를 가지는 작은 병소 출현); 1+ (상피 층의 국소 편평상피화생(squamous metaplasia)); 2+ (많은 상피 층의 광범위 편평상피화생, 섬모는 국소적으로 뚜렷할 수 있음); 2.5+ (소수의 뚜렷한 섬모를 가지는 광범위 편평상피화생).
바이러스 면역조직화학은 바이러스-특이적 단일클론 항체 (예, NP-, N- 또는 HN-특이적 단일클론 항체)를 사용하여 수행된다. 염색은 하기와 같은 0 내지 3+의 척도로 등급화된다: 0 (감염된 세포 없음); 0.5+ (소수의 감염 세포); 1+ (멀리 떨어진 개별 세포로서의 소수의 감염 세포); 1.5+ (멀리 떨어진 단일체로서의 소수의 감염 세포 및 소형 군집); 2+ (중간 수의 감염 세포, 보통 세기관지에 정렬되어 있는 상피 층 일부의 인접 세포 군집에 침범, 또는 꽈리의 작은 소엽하 병소); 3+ (많은 수의 감염 세포, 세기관지 상피 층의 대부분 침범, 또는 꽈리의 큰 소엽하 병소 만연).
5.6.3 바이러스 역가의 측정
바이러스 역가는 키메라 바이러스 희석액 시리즈를 세포 배양 (예, CEF 또는 MDCK), 닭 태아, 또는 살아 있는 동물 (예, 조류)에 접종함으로써 측정된다. 특정 시간 동안의 바이러스 배양 후, 표준 방법을 사용하여 바이러스가 단리된다.
HA 분석은 V형저 96-웰 판에서 수행될 수 있다. PBS 중 각 샘플의 2배 희석액 시리즈가 동일한 부피의 PBS 중 닭 적혈구 0.5 % 현탁액을 사용하여 얼음 상에서 1시간 동안 배양된다. 양성 웰은 점착성의 균일한 적혈구 층을 포함하며; 음성 웰은 비점착성 펠렛을 포함한다.
바이러스 역가의 물리적 정량은 바이러스 상청액에 적용된 PCR (문헌 [Quinn & Trevor, 1997; Morgan et al., 1990]), 헤마글루틴화 분석, 조직 배양 감염 투여량 (TCID50) 또는 난 감염 투여량 (EID50)을 사용하여 수행될 수 있다.
5.6.4 독성 연구
본 발명 조성물 (예, 면역원성 제제)의 독성 및/또는 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준적인 약학적 방법에 의해 예컨대 LD50 (군집 50 % 치사 투여량) 및 ED50 (군집 50 % 치료 효과 투여량)을 측정함으로써 측정될 수 있다. 독성 및 치료 효과 사이의 투여량 비율은 치료 지수로서, LD50/ED50 비율로 표현될 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 요법이 바람직하다. 독성의 부작용을 나타내는 요법이 사용될 수 있는 경우에는, 비감염 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화함으로써 부작용을 감소시키기 위하여 그러한 제제를 병에 걸린 조직 부위로 보내는 약물전달 시스템을 설계함에 있어 신중을 기해야 한다.
세포 배양 분석 및 동물 연구로부터 수득된 데이터는 대상에 사용하기 위한 요법 투여량 범위를 공식화하는 데에 사용될 수 있다. 그러한 제제의 투여량은 바람직하게는 ED50을 포함하되 독성은 작거나 없는 혈중 농도의 범위 내에 있다. 투여량은 사용되는 투여 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 이 범위 내에서 변화할 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용되는 모든 요법에 있어서, 치료적으로 효과적인 투여량은 우선적으로 세포 배양 분석으로부터 산정될 수 있다. 투여량은 세포 배양에서 측정된 IC50 (즉, 증상의 반-최대치 억제가 달성되는 시험 화합물의 농도)을 포함하는 혈중 혈장 농도 범위에 도달하도록 동물 모델에서 공식화될 수 있다. 그러한 정보는 대상 (예, 말)에서의 유용한 투여량을 더 정밀하게 결정하는 데에 사용될 수 있다. 혈장 중의 농도는 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 측정될 수 있다.
또한, 업계 숙련자에게 알려져 있는 어떠한 분석도 바이러스 감염 또는 그와 관련된 이상이나 증상, 바이러스 감염이 아닌 다른 감염 또는 그와 관련된 이상이나 증상, 또는 그 이상과 관련된 항원에 대한 면역 반응을 유발하기 위하여 본 발명의 약독화 키메라 바이러스가 벡터로서 사용되는 이상을 위하여 여기에서 개시되는 조성물 (예, 백신 제제) 및 조합 요법의 예방적 및/또는 치료적 유용성을 평가하는 데에 사용될 수 있다.
5.7 본 발명의 특정 구현예
본 발명은
(i) 이종유래 펩티드 서열을 포함하는 엑토도메인으로서, 상기 이종유래 서열은 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의, 또는 질병과 관련된 항원의, 1종 이상의 항원결정인자를 포함함, 및
이것이 융합되는
(ii) 인플루에자 바이러스의 필수 유전자에 의해 코딩되는 당단백질의 막횡단 및 세포질 도메인
을 가지는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되고, 필수 유전자의 기능은 융합 단백질에 의해 또는 조류 인플루엔자 바이러스의 천연 당단백질에 의해 제공되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 소정 구현예에서, 인플루엔자 바이러스의 필수 유전자는 헤마글루티닌 (HA) 유전자이다. 다른 구현예에서, 인플루엔자 바이러스의 필수 유전자는 뉴라미니다제 (NA) 유전자이다. 소정 구현예에서, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 약독화된다. 이들 구현예에 있어서, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 NS1 유전자에서의 돌연변이에 의해 약독화될 수 있다.
본 발명은
(i) NDV HN 단백질의 엑토도메인, 및
이것이 융합되는
(ii) 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 막횡단 및 세포질 도메인
을 가지는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되고, NA 단백질의 기능은 융합 단백질에 의해 또는 조류 인플루엔자 바이러스의 천연 당단백질에 의해 제공되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 소정 구현예에서, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 약독화된다. 이들 구현예에 있어서, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 NS1 유전자에서의 돌연변이에 의해 약독화될 수 있다.
본 발명은
(i) 이종유래 펩티드 서열을 포함하는 엑토도메인으로서, 상기 이종유래 서열은 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의, 또는 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의 질병과 관련된 항원의, 1종 이상의 항원결정인자를 포함함, 및
이것이 융합되는
(ii) 인플루에자 바이러스의 필수 유전자에 의해 코딩되는 당단백질의 막횡단 및 세포질 도메인
을 가지는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 약독화 인플루엔자 바이러스로 혼입되고, 필수 유전자의 기능은 융합 단백질에 의해 또는 약독화 인플루엔자 바이러스의 천연 당단백질에 의해 제공되는, 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 소정 구현예에서, 인플루엔자 바이러스의 필수 유전자는 헤마글루티닌 (HA) 유전자이다. 다른 구현예에서, 인플루엔자 바이러스의 필수 유전자는 뉴라미니다제 (NA) 유전자이다.
본 발명은
(i) 이종유래 펩티드 서열을 포함하는 엑토도메인으로서, 상기 이종유래 서열은 NDV가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의, 또는 질병과 관련된 항원의, 1종 이상의 항원결정인자를 포함함, 및
이것이 융합되는
(ii) NDV의 필수 유전자에 의해 코딩되는 당단백질의 막횡단 및 세포질 도메인
을 가지는 융합 단백질을 포함하며, 여기서 융합 단백질은 NDV로 혼입되고, 필수 유전자의 기능은 융합 단백질에 의해 또는 NDV의 천연 당단백질에 의해 제공되는, 키메라 NDV를 제공한다.
본 발명은 뉴라미니다제 융합 단백질을 코딩하는 패키지화 인플루엔자 바이러스 NA 분절을 포함하며, 여기서 NA 오픈 리딩 프레임은, NA 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 그의 N-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 뉴라미니다제 항원의 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되도록 변형되고, 이로써 상기 뉴라미니다제 융합 단백질이 발현되어 키메라 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
본 발명은 헤마글루티닌 융합 단백질을 코딩하는 패키지화 인플루엔자 바이러스 HA 분절을 포함하며, 여기서 HA 오픈 리딩 프레임은, HA 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 C-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 헤마글루티닌 항원의 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되도록 변형되고, 이로써 상기 헤마글루티닌 융합 단백질이 발현되어 키메라 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
본 발명은
(a) 조류 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임, 및
(b) 헤마글루티닌 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 이종유래 펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되며, 상기 이종유래 서열은, 그의 C-말단에 의해 앵커링되는, 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의 또는 질병과 관련된 항원의 1종 이상의 항원결정인자를 포함하는, 헤마글루티닌 융합 단백질을 코딩하는 제2 오픈 리딩 프레임
을 포함하는 패키지화 이중시스트론성 인플루엔자 바이러스 HA 분절을 포함하고, 이로써 상기 인플루엔자 헤마글루티닌과 융합 단백질 모두가 발현되어 키메라 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
본 발명은
(a) 조류 인플루엔자 뉴라미니다제 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임, 및
(b) 뉴라미니다제 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 이종유래 펩티드 서열을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되며, 상기 이종유래 서열은, 그의 N-말단에 의해 앵커링되는, 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의 또는 질병과 관련된 항원의 1종 이상의 항원결정인자를 포함하는, 뉴라미니다제 융합 단백질을 코딩하는 제2 오픈 리딩 프레임
을 포함하는 패키지화 이중시스트론성 인플루엔자 바이러스 NA 분절을 포함함하고, 이로써 상기 인플루엔자 뉴라미니다제와 융합 단백질 모두가 발현되어 키메라 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
본 발명은 뉴라미니다제 융합 단백질을 코딩하는 패키지화 인플루엔자 바이러스 NA 분절을 포함하며, 여기서 NA 오픈 리딩 프레임은, NA 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 NDV HN 항원의 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되도록 변형되고, 이로써 상기 뉴라미니다제 융합 단백질이 발현되어 키메라 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
소정 구현예에서, 단락 209-211 및 213-217의 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 바이러스의 세포 인터페론 길항제 활성을 감소시키는 변형된 NS1 단백질을 코딩하는 패키지화 NS1 유전자 분절을 포함한다. 다른 구현예에서, 단락 209-211 및 213-217의 키메라 조류 인플루엔자 바이러스는 헤마글루티닌 다염기성 절단 부위가 제거되도록 변형된 오픈 리딩 프레임을 가지는 HA 분절을 포함한다. 또 다른 구현예에서는, 단락 215의 키메라 조류 인플루엔자 바이러스에서 제1 오픈 리딩 프레임이 헤마글루티닌 다염기성 절단 부위가 제거되도록 변형된다.
본 발명은 단락 213 및 216의 NA 분절을 코딩하는 재조합 핵산 분자 (예, 재조합 DNA 분자)를 제공한다. 본 발명은 또한 단락 214-215의 HA 분절을 코딩하는 재조합 핵산 분자 (예, 재조합 DNA 분자)를 제공한다.
본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 감수성인 부화란 또는 세포주에서 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 배양하는 것을 포함하는, 단락 209-211 및 213-218 키메라 조류 인플루엔자 바이러스의 증식 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 면역원성 제제의 제조 방법을 제공하는 바, 상기 방법은:
(a) 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 감수성인 부화란 또는 세포주에서 단락 209-211 및 213-218의 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 증식시키는 것; 및
(b) 자손 바이러스를 수집하는 것
을 포함하며, 여기서 바이러스는, 자손 바이러스가 면역원성 제제, 예컨대 백신 제제에 사용하기에 적합하도록, 바이러스에 오염이 없게 하기에 충분한 조건 하에서 충분한 양으로 생육된다.
본 발명은 뉴라미니다제 융합 단백질을 코딩하는 패키지화 인플루엔자 바이러스 NA 분절을 포함하며, 여기서 NA 오픈 리딩 프레임은, NA 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 그의 N-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 뉴라미니다제 항원의 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되도록 변형되고, 이로써 상기 뉴라미니다제 융합 단백질이 발현되어 약독화된 키메라 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
본 발명은 헤마글루티닌 융합 단백질을 코딩하는 패키지화 인플루엔자 바이러스 HA 분절을 포함하며, 여기서 HA 오픈 리딩 프레임은, HA 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 그의 C-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 헤마글루티닌 항원의 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되도록 변형되고, 이로써 상기 헤마글루티닌 융합 단백질이 발현되어 약독화된 키메라 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
본 발명은
(a) 조류 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임, 및
(b) 헤마글루티닌 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 이종유래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되고, 상기 단백질은 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의 또는 질병과 관련된 항원의 엑토도메인 항원결정인자를 포함하는, 헤마글루티닌 융합 단백질을 코딩하며 상기 융합 단백질은 C-말단에 의해 앵커링되는 제2 오픈 리딩 프레임
을 포함하는 패키지화 이중시스트론성 인플루엔자 바이러스 HA 분절을 포함함하고, 이로써 상기 인플루엔자 헤마글루티닌과 융합 단백질 모두가 발현되어 약독화된 키메라 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 약독화 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
본 발명은
(a) 조류 인플루엔자 뉴라미니다제 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임, 및
(b) 뉴라미니다제 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 이종유래 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되고, 상기 단백질은 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의 또는 질병과 관련된 항원의 엑토도메인 항원결정인자를 포함하는, 뉴라미니다제 융합 단백질을 코딩하며 상기 융합 단백질은 N-말단에 의해 앵커링되는 제2 오픈 리딩 프레임
을 포함하는 패키지화 이중시스트론성 인플루엔자 바이러스 NA 분절을 포함함하고, 이로써 상기 인플루엔자 뉴라미니다제와 융합 단백질 모두가 발현되어 약독화된 키메라 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스를 제공한다.
소정 구현예에서, 단락 221-224의 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스는 바이러스의 세포 인터페론 길항제 활성을 감소시키는 변형된 NS1 단백질을 코딩하는 패키지화 NS1 유전자 분절을 포함한다. 소정의 다른 구현예에서, 단락 221-224의 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스는 헤마글루티닌 다염기성 절단 부위가 제거되도록 변형된 오픈 리딩 프레임을 가지는 HA 분절을 포함한다. 또 다른 구현예에서는, 단락 223의 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스에서 제1 오픈 리딩 프레임이 헤마글루티닌 다염기성 절단 부위가 제거되도록 변형된다.
본 발명은 단락 221 및 224의 NA 분절을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 제공한다. 본 발명은 또한 단락 222-223의 HA 분절을 코딩하는 재조합 DNA 분자를 제공한다.
본 발명은 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 감수성인 부화란 또는 세포주에서 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스를 배양하는 것을 포함하는, 단락 221-225 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스의 증식 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 면역원성 제제의 제조 방법을 제공하는 바, 상기 방법은:
(a) 약독화 인플루엔자 바이러스 감염에 감수성인 부화란 또는 세포에서 단락 221 및 222-225의 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스를 증식시키는 것; 및
(b) 자손 바이러스를 수집하는 것
을 포함하며, 여기서 바이러스는, 자손 바이러스가 면역원성 제제, 예컨대 백신 제제에 사용하기에 적합하도록, 바이러스에 오염이 없게 하기에 충분한 조건 하에서 충분한 양으로 생육된다.
본 발명은 F 단백질의 막횡단 및 세포질 도메인, 및 C 말단에 의해 앵커링되는 NDV가 아닌 다른 감염원 항원의 엑토도메인을 가지는 F 단백질-융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 패키지화 게놈을 포함함으로써, F 단백질-융합 단백질이 발현되어 키메라 NDV로 혼입되는, 키메라 NDV를 제공한다.
본 발명은 HN 단백질의 막횡단 및 세포질 도메인, 및 N-말단에 의해 앵커링되는 NDV가 아닌 다른 감염원 항원의 엑토도메인을 가지는 HN 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 패키지화 게놈을 포함함으로써, HN 융합 단백질이 발현되어 키메라 NDV로 혼입되는, 키메라 NDV를 제공한다.
소정 구현예에서, 단락 213 및 228-229 키메라 NDV의 게놈은 F 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함함으로써, F 단백질-융합 단백질 이외에도 F 단백질이 발현되어 키메라 NDV로 혼입된다. 다른 구현예에서는, NDV F 단백질-융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 NDV F 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 치환하며, F 단백질-융합 단백질이 단락 228의 키메라 NDV를 위한 F 단백질의 기능을 제공한다.
소정 구현예에서, 단락 212 및 223-224 키메라 NDV의 게놈은 HN 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함함으로써, HN 단백질이 발현되어 키메라 NDV로 혼입된다. 다른 구현예에서는, HN 융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 NDV HN 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 치환하며, HN 융합 단백질이 단락 229의 키메라 NDV를 위한 HN 단백질의 기능을 제공한다.
본 발명은 NDV 감염에 감수성인 부화란 또는 세포주에서 키메라 NDV를 배양하는 것을 포함하는, 단락 212 및 228-229 키메라 NDV의 증식 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 면역원성 제제의 제조 방법을 제공하는 바, 상기 방법은:
(a) 부화란 또는 세포에서 단락 212 및 228-229의 키메라 NDV를 증식시키는 것; 및
(b) 자손 바이러스를 수집하는 것
을 포함하며, 여기서 바이러스는, 자손 바이러스가 면역원성 제제, 예컨대 백신 제제에 사용하기에 적합하도록, 바이러스에 오염이 없게 하기에 충분한 조건 하에서 충분한 양으로 생육된다.
본 발명은 단락 209-210, 212-218 및 228-229의 키메라 바이러스를 포함하는 부화란을 제공한다. 본 발명은 또한 단락 209-210, 212-218 및 228-229의 키메라 바이러스를 포함하는 세포주를 제공한다. 본 발명은 추가적으로, 단락 209-210, 212-218 및 228-229의 키메라 바이러스를 포함하는 면역원성 제제를 제공한다.
본 발명은 단락 211 및 221-225의 약독화 키메라 바이러스를 포함하는 부화란을 제공한다. 본 발명은 또한 단락 211 및 221-225의 약독화 키메라 바이러스를 포함하는 세포주를 제공한다. 본 발명은 추가적으로, 단락 211 및 221-225의 약독화 키메라 바이러스를 포함하는 면역원성 제제를 제공한다.
본 발명은 조류에서 2종의 감염원에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 단락 209-210 및 213-218 키메라 조류 인플루엔자 바이러스의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 또한 조류에서 2종의 감염원에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 단락 212 및 228-229 키메라 NDV의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 추가적으로, 대상에서 2종의 감염원에 대한 면역 반응을 유발하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 단락 211 및 221-225 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스의 유효량을 투여하는 것을 포함한다. 소정 구현예에서, 대상은 인간 대상이다. 다른 구현예에서, 대상은 비-인간 포유류 (예, 돼지, 말, 개, 고양이, 또는 소)이다. 또 다른 구현예에서, 대상은 조류 대상이다.
6. 실시예
6.1 뉴캐슬병 바이러스 항원결정인자를 발현하는 키메라 조류 인플루엔자 바이러스의 조작
하기의 실시예에서 예시적인 키메라 조류 인플루엔자 바이러스의 제조에 대해 개시한다. 구체적으로, 실시예는 조류 인플루엔자 바이러스 NA 단백질의 막횡단 및 세포질 도메인, 및 NDV HN 단백질의 엑토도메인을 포함하는 융합 단백질을 발현하여 자신의 비리온에 혼입하도록 조류 인플루엔자 바이러스인 인플루엔자 A/베트남/1203/04 (H5N1)을 조작하는 것에 대해 개시한다. 융합 단백질은 조류 인플루엔자 바이러스 NA 단백질을 기능적으로 대체한다.
6.1.1 재료 및 방법
6.1.1.1 플라스미드의 구성
통상적인 방법을 사용하여, 재조합 바이러스의 플라스미드-한정 회수(plasmid-only rescue)에 사용하기 위한 완전 플라스미드 구성물(all plasmid construct)을 클로닝하였다. pPolI-SapI-Rb 플라스미드 (그들 모두가 전체적으로 여기에 참조로써 개재되는 문헌 [Flandorfer et al., 2003, J. Virol. 77:9116- 9123]; [Nakaya et al., 2001, J. Virol. 75:11868-11873])의 Sap1 부위로의 PCR 산물의 삽입을 가능케 하는 SapI 제한 부위가 포함된 프라이머를 이용한 PCR을 사용하여, 바이러스 분절의 전체 길이 cDNA를 증폭하였다. 전체 PCR 삽입물의 서열을 확인하고 (NY의 마운트 시나이(Mount Sinai) 사 DNA 서열분석실), 경우에 따라 퀵체인지(QuickChange) XL 부위-의존 돌연변이유발 키트 (CA 라 욜라의 스트라진(Stragene) 사)를 사용하여 PCR에 의해 도입된 뉴클레오티드 변화를 보정하였다. 인플루엔자 A/베트남/1203/04 (H5N1), 인플루엔자 A/WSN/33 (WSN) 및 NDV에 대한 진뱅크 서열을 표 2에 나타내었다.
표 2. 바이러스 분절의 진뱅크 목록 번호
Figure 112008047536917-PCT00002
6.1.1.2 키메라 바이러스 분절의 구성
업계에 잘 알려져 있는 재조합 기술을 사용하여, NDV B1 HN 엑토도메인과 인플루엔자 A/WSN/33 뉴라미니다제 (NA)의 세포질 테일(tail) (CT) 및 막횡단 (TM) 도메인을 코딩하는 cDNA (A/베트남/1203/04-A/WSN/33 NA( CT + TM )-NDV B1 HN( ecto ))을 구성하였다.
상기 구성물은 WSN NA vRNA 3' 비코딩 영역의 19 뉴클레오티드, NA 단백질의 세포질 테일 및 막횡단 도메인에 더하여 NA 엑토도메인의 첫번째 아미노산에 상응하는 NA 코딩 영역 아미노산 1-36을 코딩하는 뉴클레오티드 (108 뉴클레오티드), 이어서 NDV B1 HN 단백질의 아미노산 51-568 (HN 엑토도메인)을 코딩하는 뉴클레오티드, 2개의 연속하는 정지 코돈, WSN NA 리딩 프레임의 157개의 비번역 뉴클레오티드 및 WSN vRNA의 5' 비코딩 영역을 코딩한다 (도 1).
6.1.1.3 키메라 H5N1 - NDV 를 코딩 하는 플라스미드 구성물의 구성
플라스미드 한정 회수에 의해 NDV 표면 당단백질을 발현하도록 조작된 H5N1 (숙주 바이러스) 기반의 키메라 바이러스를 제조하기 위하여, 플라스미드 구성물이 제작되었다. 표면 당단백질 NA를 코딩하는 H5N1의 분절이, NA 단백질의 CT 및 TM 도메인에 더하여 A/WSN/33 NA 엑토도메인의 첫번째 아미노산 및 NDV-B1 HN 단백질의 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 분절에 의해 치환되도록 선택되었다. 융합 단백질인 A/베트남/1203/04-A/WSN/33 NA( CT + TM )-NDV B1 HN( ecto )은 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 위한 뉴라미니다제 활성을 제공한다.
표 2에 나열된 나머지 7개의 H5N1 분절 (NS, M, NP, HA, PA, PB1 및 PB2)을 pPol1으로 클로닝하여 각각 pPol1VN1203-NS, pPol1VN1203-M, pPol1VN1203-NP, pPol1VN1203-HA, pPol1VN1203-PA, pPol1VN1203-PBl 및 pPol1VN1203-PB2를 제조하였다. 키메라 H5N1 바이러스의 약독화를 확보하기 위하여, HA 절단 부위 직전의 천연 다염기성 아미노산 서열 (H5N1 HA 코딩 서열의 뉴클레오티드 1013-1039)이 인플 루엔자 A H5의 무독성 조류 균주에 기반한 공통 서열로 전환되도록 H5N1 HA를 코딩하는 분절을 변경하였다. 이 영역의 아미노산 서열은 밑줄친 아미노산을 트레오닌으로 치환함으로써 QRERRRKKRG (SEQ ID NO: 11; SEQ ID NO: 14의 아미노산 2-11)로부터 QRETRG (SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 16의 아미노산 2-7)로 변경되었다 (도 2). 폴리머라제 미끄러짐에 의한 이 서열에서의 아데노신 잔기 재도입 및 이에 따른 HA 절단 부위로의 염기성 아미노산 잔기의 도입 가능성을 최소화하기 위하여, 아데노신 잔기의 수가 감소되도록 이 영역의 코돈 선호도 (codon usage)를 추가적으로 변경하였다. 동의 돌연변이(synonymous mutation) 만이 무독성 HA 서열로 도입되었다 (도 3). 저독성 조류 인플루엔자 A 균주에 상응하는 것으로서 변경된 HA 당단백질을 코딩하는 생성 분절을, 전기한 바와 같이 pPol1VN1203-HALO로서 pPol1 플라스미드로 클로닝하였다. PB1 및 PB2를 제외하고, H5N1의 분절들에 의해 코딩되는 유전자 산물들은 진뱅크 서열로부터 변경되지 않았다. PB1과 PB2의 서열은 SapI 제한 부위 도입의 결과로써 변경되었다. PB1 코딩 서열 32 위치에서의 뉴클레오티드 구아닌을 사용한 비-동의 치환은 라이신에서 아르기닌으로의 돌연변이로 귀결되었다; PB2 코딩 서열 1393 위치에서의 뉴클레오티드 티민을 사용한 비-동의 치환은 프롤린에서 세린으로의 돌연변이로 귀결되었다. H5N1의 모든 유전자 산물은 vRNA의 4 위치에 아데노신 잔기를 가진다.
야생-형 H5N1 NS를 코딩하는 플라스미드 구성물인 pPollVN1203-NS에 더하여, H5N1 NS 유전자 분절의 상이하게 말단 절단된 변형을 코딩하는 3개의 pPol1 구성물도 생성시켰다. NS 분절의 변경된 변형을 코딩하는 추가적인 구성물은 생성되는 키메라 바이러스의 추가적인 약독화에 사용하기 위한 것일 수 있다 (예컨대 그 전체가 여기에 참조로써 개재되는 U.S. 특허 6,669,943호를 참조하라). 3개의 구성물은 플라스미드 구성물에 의해 발현되는 NS1 단백질의 아미노산 수 (아미노 말단으로부터)에서 다르다. 이에 따라, pPol1VN1203 NS1-126, pPol1VN1203 NS1-99 및 pPol1VN1203 NS1-73은 야생형 NS1 단백질의 아미노 말단으로부터 계수하였을 때, 각각 처음 126개 만의, 처음 99개만의, 그리고 처음 73개만의 아미노산을 코딩한다. 말단 절단된 구성물을 생성시키기 위한 돌연변이유발은 NEP의 오픈 리딩 프레임에 영향을 주지 않는다 (도 4).
6.1.1.4 플라스미드 구성물로부터의 감염성 바이러스의 회수
본 발명의 재조합 키메라 바이러스는 여기에서 기술되거나 업계에 알려져 있는 소정의 수단에 의해 회수된다. 예를 들어, 293T, HEp-2 또는 A549 세포를 원하는 수준의 바이러스 약독화가 달성되도록 선택된 8개의 상기 pPol1 플라스미드로 형질감염시킬 수 있으며, 그에 따라 8개 모두의 분절이 발현되는 바, 다시 말하면 세포를 pPol1VN WSN-NA( CT + TM )-NDV Bl HN( ecto ); pPol1VN1203-HA 또는 pPol1VN1203-HALO; pPol1VN1203-NS, pPol1VN1203 NS1-126, pPol1VN1203 NS1-99 또는 pPol1VN1203 NS1-73; pPol1VN1203-M; pPol1VN1203-NP; pPol1VN1203-PA; pPol1VN1203-PB1 및 pPol1VN1203-PB2로 형질감염시킨다. vRNA의 복제 및 전사에 필요한 NA, PA, PB1 및 PB2를 코딩하는 진핵 발현 플라스미드로 세포를 더 형질감염시킨다. 밤새 배양한 후, 형질감염된 세포를 닭 태아 섬유모세포와 함께 공동- 배양하여 생성되는 바이러스를 증폭시킬 수 있다. 2 내지 3일 더 배양한 후, 증식을 위하여 공동-배양의 상청액을 9- 또는 10-일 령 부화 계란의 요막 강으로 주입할 수 있다. 약독화 바이러스에 대해서는, 적격의 인터페론 시스템을 가지고 있지 않은 7-일 령의 란이 사용될 수 있다. 바이러스의 생육은 업계에 알려져 있는 표준 프로토콜에 따라 수확된 요막액을 헤마글루티닌에 대하여 분석함으로써 확인될 수 있다.
6.2 외래 항원결정인자를 발현하는 키메라 뉴캐슬병 바이러스의 조작
하기의 실시예에서 예시적인 키메라 NDV의 제조에 대해 개시한다. 구체적으로, 실시예는 NDV 필수단백질의 막횡단 및 세포질 도메인, 및 조류 인플루엔자 바이러스의 엑토도메인을 포함하는 융합 단백질을 발현하여 자신의 비리온으로 혼입하는 키메라 NDV의 조작에 대해 개시한다. 실시예는 그러한 키메라 바이러스가 인플루엔자 바이러스 및 NDV 모두에 의한 후속 감염에 대하여 보호를 유발한다는 것을 증명한다.
실시예는 또한, NDV F 단백질의 세포질 도메인 및 인간 각막세포 성장 인자 수용체 (KGFR)의 엑토도메인 및 막횡단 도메인을 포함하는 융합 단백질을 발현하여 자신의 비리온으로 혼입하는 예시적인 NDV의 조작에 대해 개시한다.
6.2.1 재료 및 방법
6.2.1.1 세포주
10 % 소 태아 혈청 및 1 % 페니실린/스트렙토마이신이 보강된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 MDCK, HEp-2 및 A549 세포를 성장시켰다. NDV 힛치너 B1 균 주의 전체 길이 cDNA는 진뱅크 목록 번호 AF375823 하에 공지되어 있다 (그 전체가 여기에 참조로써 개재되는 문헌 [Nakaya et al., 2001, J. Virol. 75:11868-11873]).
6.2.1.2 플라스미드의 구성
외래 단백질을 코딩하는 NDV 재조합 cDNA의 조작에 대해서는 개시되어 있다 (문헌 [Nakaya et al., 2001, J. Virol. 75:11868-11873]). 간단하게 말하면, 플라스미드의 T7 프로모터와 델타 간염 바이러스 (HDV) 리보자임 및 T7 터미네이터 사이로 NDV의 전체 길이 cDNA를 도입하여 pNDV/B1을 제작한다. NDV cDNA는 P 및 M 유전자 사이로 조작된 XbalI 부위를 가지며, 이것은 NDV 게놈으로의 전사외(extratranscriptional) 유닛으로서의 외래 서열 도입을 가능케 한다 (도 5). 전체 삽입 유전자는 순서대로 유전자 말단; 5'-TTAGAAAAAA-3' (SEQ ID NO: 18); 시스트론간 뉴클레오티드 T; 및 유전자 개시 서열; 5'-ACGGGTAGAA-3' (SEQ ID NO: 19) (GE/GS 서열)을 포함하도록 조작된다.
NDV 힛치너 B1 균주에서 유래한 전체-길이 cDNA 사본으로부터 역 유전학에 의해 rNDV/B1-KGFR, rNDV/B1-KGFR/F-CT, 및 rNDV/B1-H7HA/F-TMCT 바이러스를 생성시켰다. 이러한 바이러스들을 구성하기 위하여, 다른 ORF에 대하여 개시되었던 것과 마찬가지로 (그들 모두가 전체적으로 여기에 참조로써 개재되는 문헌 [Nakaya et al., 2001, J. Virol. 75:11868-11873] 및 [Nakaya et al., 2004, J. Virol. 78:9366-9375]), KGFR 또는 H7 HA (인플루엔자 A 아형 H7N2로부터의 HA 단백질) ORF를 전사외 유닛으로서 NDV/B1 cDNA의 P 및 M 유전자 사이로 클로닝하였다. KGFR 및 H7 HA는 모두 막횡단 단백질로서, 각각 TM 및 CT 도메인을 포함한다. KGFR/F-CT 구성물에서는, KGFR 단백질의 CT 도메인을 NDV F 단백질의 그것으로 치환하였다. H7 HA/F-TMCT 구성물에서는, H7 HA 단백질의 TM 및 CT 도메인을 NDV F 단백질의 그것으로 치환하였다. cDNA로부터 재조합 NDV 바이러스를 회수하고, 업계에 잘 알려져 있는 표준 기술 (예컨대 그들 모두가 전체적으로 여기에 참조로써 개재되는 문헌 [Swayne et al., 2003, Avian Dis. 47: 1047-1053] 및 [Nakaya et al., 2001]을 참조하라)을 사용하여 증식시켰다. 재조합 바이러스 중 새로운 전사 유닛의 삽입은 역전사 PCD에 이어지는 서열분석에 의해 확인하였다.
예를 들면, 하기의 프라이머들 (GE/GS 서열 포함)을 사용한 PCR에 의해 H5 HA 유전자의 엑토도메인 (ECTO)을 제조하였다: NheI-H5HA P, 5'-CG GCT AGC TTAGAAAAAA T ACGGTAGAA GTGAA ACTAGT CC GCC ACC ATG GAA AGA ATA GTG ATT GCC TTT GCA-3' (SEQ ID NO: 20) 및 HpaI-H5HA P, 5'-CG GTT AAC CTG ATA AGC CCC CAT TGA TTC TAA T-3' (SEQ ID NO: 21). NheI 및 HpaI를 사용하여 H5 HAecto PCR 단편을 분해시키고, pSL1180 (아머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech) 사)으로 클로닝하였다 (pSLH5HAecto). 하기의 프라이머들을 사용한 PCR에 의해 NDV F 유전자의 TM 및 CT도 증폭시켰다: HpaI-NDVF(TM+CYTO) P, 5'-CG GTT AAC CTC ATT ACC TAT ATC GTT TTG ACT-3' (SEQ ID NO: 22), SacI-NheI-NDVF(TM+CYTO) M, 5'-CG GAG CTC AA GCT AGC TTA TCA CAT TTT TGT AGT GGC TCT CAT CTG-3' (SEQ ID NO: 23). H5 HAecto와 융합시키기 위하여 HpaI 및 SacI을 사용하여 NDV F 유전자의 TM 및 CT를 분해시킨 다음 pSLH5HAecto로 클로닝하여 하이브리드 융합 유전자를 수득하였다. 마지막으로, NheI를 사용하여 하이브리드 H5 HA 유전자를 포함하는 플라스미드를 분해시키고, rNDV cDNA의 P 및 M 유전자 사이로 클로닝하였다.
6.2.1.3 웨스턴 블롯 및 생물학적 분석
30 % 슈크로스 완충액을 통한 한외원심분리에 의해 세포 또는 요막 추출물로부터의 바이러스를 정제하였다. 특이적 항체 및 통상의 기술을 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 혼입된 단백질의 농도를 모니터링하였다.
BALB/c 마우스를 3×107 pfu의 키메라 바이러스를 사용하여 복막내로 면역화하고, 이어서 3주 후에 동일한 투여량을 사용하여 추가 면역화함으로써, 생체 내에서 비-바이러스성 단백질 KGFR을 발현하는 키메라 NDV의 능력을 측정하였다. 2차 면역화 2주 후, KGFR을 코딩하는 플라스미드로 형질감염된 MDCK 세포를 면역염색함으로써, 접종된 동물의 혈청을 KGFR에 대한 항체의 존재에 대하여 시험하였다.
하이브리드 H7 HA/F-TMCT를 포함하는 rNDV를 사용한 면역화가 H7 또는 NDV에 의한 차후의 감염에 대하여 보호를 제공할 수 있는지를 평가하기 위하여, 생체내 시스템을 설계하였다. 3종의 백신 rNDV, rNDV-H7 HA/F-TMCT 및 샴(Sham) 100 ㎕를 사용한 점안약 법에 의해 2-주 령의 닭을 면역화하였다. 4주 령에, 105.1 평균 태아 감염 투여량의 HP AIV (A/스틸(Steele)/ACC-10/59 [H7N7])를 포함하는 100 ㎕를, 후비공 슬릿을 통하여 투여하였다. HP AIV 감염의 징후 및 손상에 대하여 새를 관찰하였다. 6주 령에, 사망률을 기록하고, 나트륨 펜토바르비탈 (100 mg/kg) 에 의해 모든 생존자를 안락사시켰다.
6.2.2 결과
6.2.2.1 KGFR 또는 KGFR /F- CT 를 발현하는 키메라 NDV 에 의한 KGFR 의 존재
10-일 령 닭 부화란의 요막 강에서 키메라 바이러스 rNDV/B1-KGFR 및 rNDV/B1-KGFR/F-CT를 생육시켰다. 정제된 바이러스를 뮤린 항-KGFR 항체를 사용한 웨스턴 블롯 분석에 의해 KGFD 또는 KGFR/F-CT의 존재에 대하여 시험하였다. rNDV/B1-KGFR/F-CT로 접종된 란으로부터 단리된 샘플에서는 양성 반응이 검출되었으나, rNDV/B1-KGFR에서는 그렇지 않았다 (도 6).
또한, 이들 키메라 바이러스 각각을 사용하여 3마리의 BALB/c 마우스를 면역화하였다. 면역화된 동물로부터의 혈청을 KGFR 항체의 존재에 대하여 분석하였다. rNDV/B1-KGFR 바이러스로 면역화된 동물은 이 분석에서 검출가능한 농도의 KGFR 항체를 발현하지 않았다. 반면, rNDV/B1-KGFR/F-CT 바이러스로 면역화된 3마리의 모든 동물은 이 분석에서 KGFR 항체의 존재에 대하여 양성이었다.
6.2.2.2 rNDV - H7 HA /F- TMCT 를 사용한 면역화에 의한, H7 감염에 대한 보호
야생-형 H7 HA의 TM 및 CT 도메인을 NDV F 단백질의 TM 및 CT 도메인으로 치환함으로써, 하이브리드 HA 단백질 H7HAecto-NDV/F( TM + CT )를 생성시켰다. 웨스턴 블롯 분석에서, H7 HA의 완전한 ORF를 발현하는 대조 rNDV인 rNDV-H7HA와 하이브리드 H7HAecto-NDV/F( TM + CT )를 발현하는 키메라 rNDV인 rNDV-H7HAecto-NDV/F(TM+ CT ) 모두가 H7 항체에 대하여 양성 반응을 나타내었으나; rNDV-H7HAecto-NDV/F(TM+ CT )의 신호가 시각 적으로도 수배 강하였다 (도 7). rNDV-H7HAecto-NDV/F( TM + CT )을 사용하여 1회 면역화된 닭을 차후에 치사 투여량의 H7 인플루엔자로 시험감염시켰을 때, 면역화된 닭의 10 마리 중 9 마리 (90 %)가 생존하였다. rNDV-H7HAecto-NDV/F( TM + CT )을 사용하여 1회 면역화된 닭을 차후에 치사 투여량의 NDV로 시험감염시켰을 때에는, 면역화된 닭 10 마리 중 10 마리 (100 %)가 생존하였다.
6.3 외래 항원결정인자를 발현하는 키메라 뉴캐슬병 바이러스의 조작
하기의 실시예에서 키메라 변형 NDV의 제조에 대해 개시한다. 구체적으로는, 실시예 6.2에서 사용된 NDV 골격의 독성을 향상시킨 재조합 NDV를 제조한다. 실시예는 rNDV의 향상된 독성이 rNDV 기반의 키메라 바이러스를 포함하는 면역원성 제제의 면역원성 역시 향상시킨다는 것을 증명한다.
6.3.1 재료 및 방법
다르게 언급되지 않는 한, 본 부문에서 개시되는 모든 재료 및 방법은 상기 실시예 6.2에서 개시되고 예시된 것과 동일하다.
6.3.1.1 그 F 단백질에 변형된 절단 부위를 가지는 rNDV 의 생성
역 유전학에 의해, NDV 힛치너 B1 균주의 F 절단 부위에 2 또는 3개의 아미노산 돌연변이를 가지는 재조합 NDV 바이러스 rNDV/F2aa와 rNDV/F3aa 바이러스를 생성시켰다. 간단하게 말하면, rNDV/F2aa를 생성시키기 위하여, 정으로(forward) F2aa-1(+) 5'-GGA TCC CGG TTG GCG CCC TCC AGG (SEQ ID NO: 24), 역으로(reverse) F2aa-1(-) 5'-AAG GCG CCt CTG TCT CCg CCC TCC AGA TGT AGT CAC AG-3' (SEQ ID NO: 25)의 프라이머를 사용하고, 전체-길이 NDV B1 클론인 플라스미드 pT7NDV/Bl을 주형으로 사용하여 PCR 단편을 생성시켰다. 정으로 F2aa-2(+) 5'-GGc GGA GAC AGa GGC GCC TTA TAG GCG CCA TTA TTG G-3' (SEQ ID NO: 26), 역으로 F2aa-2(-) 5'-CCA TAT TCC CAC CAG CTA GAT TGT-3' (SEQ ID NO: 27)의 프라이머를 사용하고, pT7NDV/Bl을 주형으로 사용하여 다음 PCR 단편을 생성시켰다. 소문자로 나타낸 뉴클레오티드는 F 단백질 절단 분위의 아미노산 서열이 NDV/B1 균주의 그것 (GGRQGR↓L)으로부터 GRRQRR↓L로 변형되도록 돌연변이된 것이다. F2aa-1(+) 및 F2aa-2(-)의 프라이머를 사용한 PCR에 의해, 이들 2개의 겹쳐지는 PCR 단편 (프라이머 서열에서 겹치는 부분은 밑줄)을 조합하였다. 전체 F 유전자를 포함하는 생성 PCR 단편을 pSL1180 (아머샴 파마시아 바이오테크 사)으로 클로닝하고, pSLF2aa로 명명하였다. pSLF2aa의 StuI-NotI 단편 (뉴클레오티드 4646 내지 4952)을 절단하여 pT7NDV/B1 플라스미드의 상응하는 단편을 치환함으로써 pT7NDV/F2aa 플라스미드를 형성시켰으며, 이것을 역 유전학에 의해 rNDV/F2aa 바이러스를 생성시키는 데에 사용하였다. rNDV/F3aa의 생성을 위해서는, 정으로 F3aa-1(+) 5'-GGA TCC CGG TTG GCG CCC TCC AGG-3' (SEQ ID NO: 28); 역으로, F3aa-1(-) 5'-AAa GCG CCt CTG TCT CCg CCC TCC AGA TGT AGT CAC AG-3' (SEQ ID NO: 29); 정으로, F3aa-2(+) 5'-GGc GGA GAC AGa GGC GCt TTA TAG GCG CCA TTA TTG G-3' (SEQ ID NO: 30); 역으로, F3aa-2(-) 5'-CCA TAT TCC CAC CAG CTA GAT TGT-3' (SEQ ID NO: 31)의 프라이머를 사용하고 (돌연변이된 뉴클레오티드는 소문자로 표시), pT7NDV/Bl을 주형으로 사용하여 상기한 것과 동일한 방법에 의해 PCR 돌연변이유발을 수행하였다. F3aa-1(+) 및 F3aa-2(-)의 프라이머를 사용한 PCR에 의해, 이들 2개의 겹쳐지는 PCR 단편 (프라이머 서열에서 겹치는 영역은 밑줄)을 조합함으로써, 절단 부위를 GGRQGR↓L로부터 GRRQRR↓F로 변형시켰다. pSLF3aa의 StuI-NotI 단편 (뉴클레오티드 4646 내지 4952)을 절단하여 pT7NDV/B1 플라스미드의 상응하는 단편을 치환함으로써 pT7NDV/F3aa 플라스미드를 형성시켰으며, 이것을 rNDV/F3aa 바이러스를 생성시키는 데에 사용하였다.
6.3.1.2 키메라 H7 HA 단백질을 발현하는 융합생성 rNDV 벡터의 생성
rNDV/F3aa 게놈의 전사외 유닛으로서 키메라 H7 HA 유전자를 구성하기 위하여, HpaNDV F(TM+CYTO)P, 5'-cgGT TAA CCT CAT TAC CTA TAT CGT TTT GAC T-3' (SEQ ID NO: 32) 및 SacNheNDVF(TM+CYTO)M, 5'-cg GAG CTC AAG CTA GCT TAT CAC ATT TTT GTA GTG GCT CTC ATC TG-3' (SEQ ID NO: 33)의 프라이머를 사용하고, NDV F 유전자를 포함하는 플라스미드를 주형으로서 사용한 PCR에 의해, NDV F 유전자의 막횡단 (TM) 및 세포질 테일 (CYTO)을 포함하는 단편을 먼저 제조하였다. 이 PCR 산물을 Sac I 및 Hpa I으로 분해시킨 다음, NDV의 유전자 말단 및 유전자 개시 신호를 가지고 있는 플라스미드 pNhe-NDV-GE/GS로 클로닝함으로써, 플라스미드 pNhe-NDV-GE/GS-NDVF(TM+CYTO)를 형성시켰다. 다음 단계로서, H7 HA 엑토도메인을 포함하는 단편을 NDV F의 TM 및 CYTO 영역 단편과 연결시키기 위하여, SpeH7(ECTO)P, 5'-cgACT AGT CCG CCA CCA TGA ACA CTC AAA TTC TGG CAT TCA T-5' (SEQ ID NO: 34), 및 HpaH7(ECT0)M, 5'-cgG TTA ACG TCT TTG TAT CCA CTA CTC AAT TTC AC-3' (SEQ ID NO: 35)의 프라이머를 사용하고, A/닭/NY/13142-5/94(H7N2)으로부터의 H7 HA 유전 자를 포함하는 플라스미드를 주형으로서 사용한 PCR에 의해, H7HA 엑토도메인을 제조하였다. PCR 산물을 Spe I 및 Hpa I으로 분해시킨 다음, 카세트(cassette) 플라스미드 pNhe-NDV-GE/GS-NDVF(TM+CYTO)로 삽입하였다. 마지막 단계에서, 카세트 플라스미드 pNhe-NDV-GE/GS-NDVF(TM+CYTO)를 Nhe I으로 분해시켜 키메라 H7 HA 유전자를 절단 분리하였다. 이 단편 DNA를 pT7NDV/F3aa의 P 및 M 유전자 사이에 클로닝하여 pT7NDV/F3aa-키메라H7을 형성시켰다. 다음에, 상기한 방법을 사용하여 pT7NDV/F3aa-키메라H7으로부터 키메라 H7 HA 단백질을 발현하는 rNDV/F3aa 바이러스를 회수하였다.
6.3.1.3 바이러스 생육 동역학
rNDV/B1, rNDV/F2aa, rNDV/F3aa, rNDV/B1-H7, 또는 rNDV/F3aa-키메라H7 바이러스 (100 PFU/란)을 10-일 령의 부화 계란에 접종하였다. 상이한 시점 (24시간, 48시간 및 72시간)에 요막액을 수확하여 바이러스 역가를 측정하였다. 면역형광 분석 (IFA)에 의해 요막액에 존재하는 각 바이러스의 50 % 조직 배양 감염 투여량 (TCID50)을 측정하였다. 이러한 목적으로, 베로 세포를 포함하는 96 웰 판을 샘플의 10배 희석액 시리즈으로 감염시키고, IFA에 의해 NDV 단백질 또는 키메라 H7 HA 단백질의 존재를 측정하였다.
6.3.2 면역형광 분석
6.3.2.1 면역형광 분석
형질감염 인플루엔자 바이러스로 감염된 MDCK 세포를 고정하고, 빙냉 메탄올 로 투과화(permeabilized)시켰다. 항-NDV HN 단일클론 항체 (7B1), 항-인플루엔자 H1 HA 단일클론 창체 (2G9) 및 항-인플루엔자 H5 HA 다클론 혈청으로 바이러스 항원을 검출하였다. NDV 생육 및 바이러스 단백질 발현의 분석을 위하여, 융합성 베로 세포를 재조합 바이러스로 감염시키고, 상이한 시점 (24, 48 및 72시간)에 수확하였다. 0.1 % 트리톤(Triton) X-100을 포함하는 2.5 % 포름알데히드로 감염된 세포를 고정하였다. 고정된 세포를 항-토끼 NDV 다클론 항체 또는 항-닭 AIV H7 다클론 혈청으로 처리하여 세척하고, AIV H7 HA 단백질에 대하여 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)-결합 항-닭 면역글로뷸린 (다코(DAKO) 사)으로, NDV 바이러스 단백질에 대하여 텍사스 레드(Texas Red)-결합 항-토끼 면역글로뷸린 (몰큘라 프로브(Molecular Probe) 사)으로, 염색하였다. 형광 현미경법에 의해 바이러스 단백질 발현을 조사하였다.
6.3.2.2 평균 사망 시간
부화 계란에서의 재조합 바이러스의 병원성을 점검하기 위하여, 평균 사망 시간 (MDT)를 측정하였다. 간단하게 말하면, 5개의 10-일 령 부화 계란을 바이러스의 10배 희석액 시리즈로 감염시켰다. 37 ℃에서 란을 배양하고, 7일 동안 하루에 2회 모니터링하였다. 태아 사망까지의 시간을 기록하였다. 모든 태아를 사망시키는 가장 높은 희석액이 최소 치사 투여량인 것으로 측정하였다. 최소 치사 투여량이 태아를 사망시키는 평균 시간으로서 MDT를 산정하였다.
6.3.2.3 닭의 면역화 및 시험감염
2 및 4주 령에, 백색의 레그혼(Leghorn) 닭을, 105.7-6.1 평균 닭 태아 감염 투여량 (EID50)의 rNDV/F3aa-키메라H7으로, 또는 105.7-6.3 EID50의 모체 NDV/B1 (pNDV) 2회로, 또는 살균 조직 배양 배지 (샴) 2회로, 결막낭 점안액을 사용하여 1회 또는 2회 백신접종하였다. 6주 령에, 닭을, 강독성 NDV의 폰타나(Fontana) 균주 (vvNDV) (새 당 105.1 EID50) 또는 A/인간/스틸/59 (H7N7) HPAI (새 당 105.1 EID50)으로 비강내 시험감염시켰다. 시험감염 14일 후에, 생존자를 채혈하고 안락사시켰다. 표준 방법을 사용하여 헤마글루틴화 억제 (HI) 혈청학적 역가를 측정하였다.
6.3.3 결과
6.3.3.1 융합생성 rNDV 돌연변이의 생성
rNDV 골격의 융합생성 특성을 향상시키기 위하여, 2종의 rNDV 돌연변이 rNDV/F2aa 및 rNDV/F3aa 바이러스가 개발되었는데, 여기에서는 F 단백질의 절단 부위가 어디에서나 발현되는 프로테아제 (예, 퓨린 프로테아제)에 의해 활성화될 수 있는 2개의 변종 다염기성 절단 부위 중 하나로 치환된다 (도 8A). rNDV/B1이 아닌 rNDV/F2aa 및 rNDV/F3aa에 의한 닭 태아 섬유모세포 (CEF)의 감염은 외부로부터 첨가되는 프로테아제 없이도 융합체 형성으로 귀결된다 (도 8B). 또한, rNDV/F3aa는 rNDV/F2aa에 비해 CEF 세포에서 더욱 신속하게 융합체를 유발한다. 이에 따라, 면역화된 동물에서의 바이러스 확산의 향상이 삽입된 외래 단백질에 대한 면역원성 을 촉진시킬 수 있다고 가정하였다. 따라서, 융합생성 rNDV/F3aa가 AIV 및 NDV로부터 가금류를 보호하도록 설계되는 2가 백신을 개발하기 위한 골격 벡터로서 선택되었다.
6.3.3.2 부화 계란에서의 rNDV 플랫폼 벡터의 평균 사망 시간 분석
NDV는 닭에 대한 그의 병원성을 기준으로 고독성 (강독성), 중간독성 (중독성), 또는 비독성 (약독성)으로 분류될 수 있다. 다염기성 절단 부위를 가지는 F 단백질의 존재가 NDV의 독성 인자인 것으로 알려져 있기 때문에, 10-일 령의 부화 계란에서 변형된 F 단백질을 가지는 rNDV의 병원성을 평가하였다. NDV로 감염된 닭 태아의 평균 사망 시간 (MDT)은 생체 내에서의 독성과 상관된다. 약독성 균주 (새에서 무증상 감염 야기)는 90시간을 초과하는 MDT를 특징으로 하며, 중독성의 균주 (새에서 호흡기 질병을 야기)는 60 내지 90시간 사이의 MDT를 가지고, 강독성 균주 (새에서 심각한 질병 야기)는 60시간 미만의 MDT를 가진다. rNDV/F2aa의 MDT는 약독성 균주의 것을 나타내는 반면, rNDV/F3aa의 그것은 중독성 균주의 전형이다. 이들 균주들 중 아무 것도 고병원성 (강독성) 균주의 전형적인 MDT를 가지지는 않는다 (표 3).
표 3. 부화 계란에서의 rNDV 의 MDT
Figure 112008047536917-PCT00003
Figure 112008047536917-PCT00004
이러한 데이터로 볼 때, rNDV/F3aa 벡터가 새에 위협을 나타내지는 않을 것이며, 이에 따라 AIV 및 NDV에 대한 가금류 보호용 2가 백신을 개발하기 위한 골격으로서 적합하다.
6.3.3.3 AIV HA 단백질의 엑토도메인을 발현하는 융합생성 rNDV 벡터의 생성
A/닭/NY/13142-5/94(H7N2)로부터의 H7 HA 단백질을 코딩하는 유전자를 상기한 바와 같은 rNDV/F3aa 벡터에 혼입함으로써, rNDV/F3aa-키메라H7을 형성시켰다 (도 9A). 부화 계란에서의 rNDV/F3aa-키메라H7의 생육 동역학을 모체 rNDV/F3aa의 그것과 비교하였다 (도 9B). 키메라 H7 HA 단백질을 발현하는 바이러스가 삽입물이 없는 바이러스에 비해 더 천천히 생육되었으며, 최대 역가는 대략 로그배수로 낮았다. 흥미롭게도, 이 바이러스의 MDT는 약독성 균주의 그것 (128~140시간)이었다 (표 3). rNDV/F3aa-키메라H7으로부터의 키메라 H7 HA 단백질의 발현은 감염 36시간 후 감염된 베로 세포의 웨스턴 블로팅에 의해 확인하였다 (도 9C).
6.3.3.4 rNDV 비리온으로의 AIV H7 HA 단백질의 혼입 향상
NDV F 단백질의 이종유래 막횡단 및 세포질 테일 영역을 포함하는 키메라 H7 HA 단백질의 발현이 rNDV 비리온으로의 혼입 향상과 관련이 있는지를 확인하기 위하여, §6.3에 개시된 바와 같이 rNDV/B1-H7 및 rNDV/F3aa-키메라H7 비리온을 정제하였다. 항-닭 AIV H7 다클론 항체 또는 항-토끼 NDV 다클론 혈청을 사용한 웨스턴 블로팅에 의해 rNDV/B1-H7 또는 rNDV/F3aa-키메라H7으로부터의 H7 HA 단백질 또는 NDV 바이러스 단백질의 양을 측정하였다. 기대했던 바와 같이, 키메라 H7 HA 단백질의 rNDV 비리온으로의 혼입은 야생형 H7 HA 단백질의 그것에 비해 현저하게 증가하였다 (도 9D). 이러한 데이터는 NDV F 단백질의 막횡단 및 세포질 테일 영역이 바이러스 표면으로의 외래 단백질의 혼입 향상에 주요한 역할을 한다는 것을 암시한다.
6.3.3.5 닭의 면역화 및 시험감염
rNDV/F3aa-키메라H7을 사용한 1회 또는 2회의 백신접종에 따라, 50-80 %의 닭이 H7 AIV에 대한 헤마글루틴화 억제제 (HI) 역가를 가졌으며, 90-100 %의 닭이 NDV에 대한 HI 역가를 가졌다 (표 4A 및 B). 모체 NDV/B1 (pNDV)으로 2회 면역화된 닭은 모두 NDV에 대한 HI 역가는 가진 반면, 아무도 H7 AIV에 대한 역가는 가지지 않았다. 모든 살균 조직 배양 배지 (샴) 감염된 새들은 양 바이러스에 대한 HI 역가가 결핍되어 있었다. vvNDV로 시험감염된 경우에는, 100 %의 rNDV/F3aa-키메라H7 및 pNDV 면역화 닭들이 보호되었다. 이와 달리, 90 %의 rNDV/F3aa-키메라H7 백신접종된 닭들이 HPAI H7 바이러스로부터 보호되었으나, pNDV 백신접종된 어떠한 닭도 HPAI H7 바이러스로부터 보호되지 않았다. 반면, vvNDV 및 HPAI H7 바이러스 에 의해 시험감염된 경우, 각각 100 % 및 70 %의 샴 감염 새들이 사망하였다. 감염되었다는 혈청학적 증거가 없는 샴-HPAI H7 바이러스 시험감염 군의 3마리의 생존자를 제외하고, 생존자들은 각 시험감염 바이러스에 대한 HI 역가에서의 4배 이상의 상승으로서 분명히 나타나는 면역기억 반응(amnestic response)을 갖추고 있었다.
표 4A. 시험감염 전 키메라 바이러스로 면역화된 닭의 HI 혈청학
Figure 112008047536917-PCT00005
표 4B. 시험감염 후 (시험감염 14일 후) 키메라 바이러스로 면역화된 닭의 HI 혈청학
Figure 112008047536917-PCT00006
샴 = 살균 조직 배양 액
HPAIV = A/인간/스틸/59 (H7N7) 바이러스
HI 혈청학은 HI-양성 혈청을 가지는 닭의 수/백신접종된 닭의 수로 나타내며; 괄호 안의 값은 기하 평균 역가 (GMT)이다.
* = 군 당 10마리의 새, 1X = 1회 백신접종, 2X = 2회 백신접종
문헌명 ["Engineered Viral Vaccine Constructs with Dual Specificity: Avian Influenza and Newcastle Disease," by Man-Seong Park et al, in PNAS 103:8203-8208 (2006)]이 전체적으로 여기에 참조로써 개재된다.
6.4 등가물
본 발명이 발명 개별 양태의 단일 예시로서 의도된 특정 개시 구현예에 의해 그 영역이 제한되어서는 아니되며, 기능적으로 등가인 방법 및 성분들은 본 발명의 영역 내에 속한다. 실제로, 업계 숙련자에게는 전기 명세서 및 첨부된 도면에 의해 여기에 나타내고 기술한 것들 이외에도 본 발명의 다양한 변형들이 분명히 인식 될 것이다. 그러한 변형들은 부속 청구항의 영역 내에 속하는 것으로 한다.
본 출원 전체에 걸쳐 다양한 문헌들이 인용되었다. 여기에서, 그들의 내용은 모든 목적에 있어서 그 전체가 본 출원에 참조로써 개재된다.
SEQUENCE LISTING <110> Mt. Sinai School of Medicine of New York University <120> CHIMERIC VIRUSES PRESENTING NON-NATIVE SURFACE PROTEINS AND USES THEREOF <130> 6923-135-228 <150> 60/741,833 <151> 2005-12-02 <150> 60/802,864 <151> 2006-05-22 <160> 36 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 823 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A virus (A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)) nonstructural protein 2 (NS) gene <400> 1 atggattcca acactgtgtc aagctttcag gtagactgct ttctttggca tgtccgcaaa 60 cgatttgcag accaagaact gggtgatgcc ccattccttg accggcttcg ccgagatcag 120 aagtccctaa gaggaagagg caacactctt ggtctggaca tcgaaacagc tactcgcgca 180 ggaaagcaga tagtggagcg gattctggag ggggagtctg ataaggcact taaaatgccg 240 gcttcacgct acctaactga catgactctc gaagaaatgt caagggactg gttcatgctc 300 atgcccaagc agaaagtggc aggttccctt tgcatcaaaa tggaccaggc aataatggat 360 aaaaccatca tattgaaagc aaacttcagt gtgatttttg accggttgga aaccctaata 420 ctacttagag ctttcacaga agaaggagca atcgtgggag aaatctcacc attaccttct 480 cttccaggac atactggtga ggatgtcaaa aatgcaattg gcgtcctcat cggaggactt 540 gaatggaatg ataacacagt tcgagtcact gaaactatac agagattcgc ttggagaaac 600 agtgatgagg atgggagact tccactccct ccaaatcaga aacggtaaat ggcgagaaca 660 attgagtcag aagtttgaag aaataaggtg gctgattgaa gaagtaagac atagattgaa 720 aattacagaa aacagcttcg aacagataac gtttatgcaa gccttacaac tactgcttga 780 agtggagcaa gagataagag ccttctcgtt tcagcttatt taa 823 <210> 2 <211> 982 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A virus (A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)) membrane ion channel 2 and matrix protein 1 (M) gene <400> 2 atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctctcta tcatcccgtc aggccccctc 60 aaagccgaga tcgcacagaa acttgaagat gtctttgcag gaaagaacac cgatctcgag 120 gctctcatgg agtggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa agggattttg 180 ggatttgtat tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttgtc 240 cagaatgccc taaatggaaa tggagatcca aataatatgg atagggcagt taagctatat 300 aagaagctga aaagagaaat aacattccat ggggctaagg aggtcgcact cagctactca 360 accggtgcac ttgccagttg catgggtctc atatacaaca ggatgggaac ggtgactacg 420 gaagtggctt ttggcctagt gtgtgccact tgtgagcaga ttgcagattc acagcatcgg 480 tctcacagac agatggcaac tatcaccaac ccactaatca gacatgagaa cagaatggtg 540 ctggccagca ctacagctaa ggctatggag cagatggcgg gatcaagtga gcaggcagcg 600 gaagccatgg agatcgctaa tcaggctagg cagatggtgc aggcaatgag gacaattggg 660 actcatccta actctagtgc tggtctgaga gataatcttc ttgaaaattt gcaggcctac 720 cagaaacgaa tgggagtgca gatgcagcga ttcaagtgat cctattgttg ttgccgcaaa 780 tatcattggg atcttgcact tgatattgtg gattcttgat cgtcttttct tcaaatgcat 840 ttatcgtcgc cttaaatacg gtttgaaaag agggcctgct acggcagggg tacctgagtc 900 tatgagggaa gagtaccggc aggaacagca gagtgctgtg gatgttgacg atggtcattt 960 tgtcaacata gaattggagt aa 982 <210> 3 <211> 1485 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A virus (A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)) nucleocapsid protein(NP) gene <400> 3 atggcgtctc aaggcaccaa acgatcttat gaacagatgg aaactggtgg ggaacgccag 60 aatgctactg agatcagggc atctgttgga agaatggtta gtggcattgg gaggttctac 120 atacagatgt gcacagaact caaactcagt gactatgaag ggaggctgat ccagaacagc 180 ataacaatag agagaatggt actctctgca tttgatgaaa gaaggaacag atacctggaa 240 gaacacccca gtgcgggaaa ggacccgaag aagactggag gtccaattta tcggaggaga 300 gacgggaaat gggtgagaga gctaattctg tacgacaaag aggagatcag gaggatttgg 360 cgtcaagcga acaatggaga ggacgcaact gctggtctta cccacctgat gatatggcat 420 tccaatctaa atgatgccac atatcagaga acgagagctc tcgtgcgtac tggaatggac 480 ccaaggatgt gctctctgat gcaagggtca actctcccga ggagatctgg agctgccggt 540 gcagcagtaa agggggtagg gacaatggtg atggagctga ttcggatgat aaaacgaggg 600 atcaacgacc ggaatttctg gagaggcgaa aatggaagaa gaacaaggat tgcatatgag 660 agaatgtgca acatcctcaa agggaaattc caaacagcag cacaaagagc aatgatggat 720 caagtgcgag agagcagaaa tcctgggaat gctgaaattg aagatctcat ttttctggca 780 cggtctgcac tcatcctgag aggatcagtg gcccataagt cctgcttgcc tgcttgtgtg 840 tacggacttg cagtggccag tggatatgac tttgagagag aagggtactc tctggttgga 900 atagatcctt tccgcctgct tcaaaacagc caggtcttta gtctcattag accaaatgag 960 aatccagcac ataagagtca attagtgtgg atggcatgcc actctgcagc atttgaggac 1020 cttagagtct caagtttcat cagagggaca agagtggtcc caagaggaca gctatccacc 1080 agaggggttc aaattgcttc aaatgagaac atggaggcaa tggactccaa cactcttgaa 1140 ctgagaagca gatattgggc tataagaacc agaagcggag gaaacaccaa ccagcagagg 1200 gcatctgcag gacagatcag cgttcagccc actttctcgg tccagagaaa ccttcccttc 1260 gaaagagcga ccattatggc agcatttaca ggaaatactg agggcagaac gtctgacatg 1320 aggactgaaa tcataagaat gatggaaagt gccagaccag aagatgtgtc attccagggg 1380 cggggagtct tcgagctctc ggacgaaaag gcaacgaacc cgatcgtgcc ttcctttgac 1440 atgaataatg aaggatctta tttcttcgga gacaatgcag aggag 1485 <210> 4 <211> 1707 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A virus (A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)) hemagglutinin HA gene <400> 4 atggagaaaa tagtgcttct ttttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60 attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120 actgttacac atgcccaaga catactggaa aagaaacaca acgggaagct ctgcgatcta 180 gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagcgtag ctggatggct cctcggaaac 240 ccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccaat 300 ccagtcaatg acctctgtta cccaggggat ttcaatgact atgaagaatt gaaacaccta 360 ttgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccagt 420 catgaagcct cattaggggt gagctcagca tgtccatacc agggaaagtc ctcctttttc 480 agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtacatacc caacaataaa gaggagctac 540 aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg 600 gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg gacatcaaca 660 ctaaaccaga gattggtacc aagaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720 aggatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg caatcaactt cgagagtaat 780 ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatt 840 atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900 ataaactcta gcatgccatt ccacaatata caccctctca ccattgggga atgccccaaa 960 tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actgggctca gaaatagccc tcaaagagag 1020 agaagaagaa aaaagagagg attatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080 cagggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca atgagcaggg gagtgggtac 1140 gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactcg 1200 atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa caacttagaa 1260 aggagaatag agaatttaaa caagaagatg gaagacgggt tcctagatgt ctggacttat 1320 aatgctgaac ttctggttct catggaaaat gagagaactc tagactttca tgactcaaat 1380 gtcaagaacc tttacgacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt 1440 aacggttgtt tcgagttcta tcataaatgt gataatgaat gtatggaaag tgtaagaaat 1500 ggaacgtatg actacccgca gtattcagaa gaagcgagac taaaaagaga ggaaataagt 1560 ggagtaaaat tggaatcaat aggaatttac caaatactgt caatttattc tacagtggcg 1620 agttccctag cactggcaat catggtagct ggtctatcct tatggatgtg ctccaatgga 1680 tcgttacaat gcagaatttg catttaa 1707 <210> 5 <211> 1350 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A virus (A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)) neuramindase (NA) gene <400> 5 atgaatccaa atcagaagat aataaccatc ggatcaatct gtatggtaac tggaatagtt 60 agcttaatgt tacaaattgg gaacatgatc tcaatatggg tcagtcattc aattcacaca 120 gggaatcaac accaatctga accaatcagc aatactaatt ttcttactga gaaagctgtg 180 gcttcagtaa aattagcggg caattcatct ctttgcccca ttaacggatg ggctgtatac 240 agtaaggaca acagtataag gatcggttcc aagggggatg tgtttgttat aagagagccg 300 ttcatctcat gctcccactt ggaatgcaga actttctttt tgactcaggg agccttgctg 360 aatgacaagc actccaatgg gactgtcaaa gacagaagcc ctcacagaac attaatgagt 420 tgtcctgtgg gtgaggctcc ctccccatat aactcaaggt ttgagtctgt tgcttggtca 480 gcaagtgctt gccatgatgg caccagttgg ttgacgattg gaatttctgg cccagacaat 540 ggggctgtgg ctgtattgaa atacaatggc ataataacag acactatcaa gagttggagg 600 aacaacatac tgagaactca agagtctgaa tgtgcatgtg taaatggctc ttgctttact 660 gtaatgactg acggaccaag taatggtcag gcatcacata agatcttcaa aatggaaaaa 720 gggaaagtgg ttaaatcagt cgaattggat gctcctaatt atcactatga ggaatgctcc 780 tgttatccta atgccggaga aatcacatgt gtgtgcaggg ataattggca tggctcaaat 840 cggccatggg tatctttcaa tcaaaatttg gagtatcaaa taggatatat atgcagtgga 900 gttttcggag acaatccacg ccccaatgat ggaacaggta gttgtggtcc ggtgtcctct 960 aacggggcat atggggtaaa agggttttca tttaaatacg gcaatggtgt ctggatcggg 1020 agaaccaaaa gcactaattc caggagcggc tttgaaatga tttgggatcc aaatgggtgg 1080 actgaaacgg acagtagctt ttcagtgaaa caagatatcg tagcaataac tgattggtca 1140 ggatatagcg ggagttttgt ccagcatcca gaactgacag gactagattg cataagacct 1200 tgtttctggg ttgagttgat cagagggcgg cccaaagaga gcacaatttg gactagtggg 1260 agcagcatat ctttttgtgg tgtaaatagt gacactgtgg gttggtcttg gccagacggt 1320 gctgagttgc cattcaccat tgacaagtag 1350 <210> 6 <211> 2151 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A virus (A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)) polymerase protein PA gene <400> 6 atggaagact ttgtgcgaca atgcttcaat ccaatgattg tcgagcttgc ggaaaaggca 60 atgaaagaat atggggaaga tccgaaaatc gaaacgaaca agtttgctgc aatatgcaca 120 cacttggagg tctgtttcat gtattcggat tttcacttta ttgatgaacg gagtgaatca 180 ataattgtag aatctggaga tccgaatgca ttattgaaac accgatttga aataattgaa 240 ggaagagacc gaacgatggc ctggactgtg gtgaatagta tctgcaacac cacaggagtt 300 gagaaaccta aatttctccc agatttgtat gactacaaag agaaccgatt catcgaaatt 360 ggagtgacac ggagggaagt tcatacatac tatctggaga aagccaacaa gataaaatcc 420 gaggagacac atattcacat attctcattc acaggggagg aaatggccac caaagcggac 480 tacacccttg atgaagagag cagggcaaga attaaaacca ggctgttcac cataaggcag 540 gaaatggcca gtaggggtct atgggattcc tttcgtcaat ccgagagagg cgaagagaca 600 attgaagaaa aatttgaaat cactggaacc atgcgcagac ttgcagacca aagtctccca 660 ccgaacttct ccagccttga aaactttaga gcctatgtgg atggattcga accgaacggc 720 tgcattgagg gcaagctttc tcaaatgtca aaagaagtga atgctagaat tgagccattt 780 ttgaagacaa cgccacgccc tctcagacta cctgatgggc ctccttgctc tcagcggtcg 840 aagttcttgc tgatggatgc ccttaaatta agcatcgaag acccgagtca tgagggggag 900 gggataccac tatacgatgc aatcaaatgc atgaagacat ttttcggctg gaaagagccc 960 aacatcgtga aaccacatga aaaaggtata aaccccaatt acctcctggc ttggaagcaa 1020 gtgctggcag aactccaaga tattgaaaat gaggagaaaa tcccaaaaac aaagaacatg 1080 aaaaaaacaa gccagttgaa gtgggcactc ggtgagaaca tggcaccaga gaaagtagac 1140 tttgaggact gcaaagatgt tagcgatcta agacagtatg acagtgatga accagagtct 1200 agatcactag caagctggat tcagagtgaa ttcaacaagg catgtgaatt gacagattcg 1260 atttggattg aactcgatga aataggagaa gacgtagctc caattgagca cattgcaagt 1320 atgagaagga actattttac agcggaagta tcccattgca gggccactga atacataatg 1380 aagggagtgt acataaacac agccctgttg aatgcatcct gtgcagccat ggatgacttt 1440 caactgattc caatgataag caaatgcaga accaaagaag gaagacggaa aactaatctg 1500 tatggattca ttataaaagg gagatcccac ttgaggaatg ataccgatgt ggtaaatttt 1560 gtgagtatgg aattctctct tactgatccg aggctggagc cacacaagtg ggaaaagtac 1620 tgtgtcctcg agataggaga catgctcctc cggactgcag taggccaagt ttcgaggccc 1680 atgttcctgt atgtaagaac caatggaacc tccaagatca aaatgaaatg gggcatggaa 1740 atgaggcgat gccttcttca atcccttcaa caaattgaaa gcatgattga agccgagtct 1800 tctgtcaaag agaaggacat gaccaaagaa ttctttgaaa acaaatcaga aacatggccg 1860 attggagagt cccccaaggg agtggaggaa ggctccatcg gaaaggtgtg cagaaccttg 1920 ctggcgaagt ctgtgttcaa cagtttatat gcatctccac aactcgaggg gttttcagct 1980 gaatcaagaa aattgcttct cattgctcag gcacttaggg acaacctgga acctgggacc 2040 ttcgatcttg gagggctata tgaagcaatt gaggagtgcc tgattaacga tccctgggtt 2100 ttgcttaatg cgtcttggtt caactccttc ctcgcacatg cactgaaata g 2151 <210> 7 <211> 2274 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A virus (A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)) polymerase protein PB1 gene <400> 7 atggatgtca atccgacttt acttttcttg aaagtaccag tgcaaaatgc tataagtacc 60 accttccctt atactggaga ccctccatac agccatggaa cagggacagg atacaccatg 120 gacacagtca acagaacaca ccaatattca gaaaagggga agtggacaac aaacacagag 180 actggagcac cccaactcaa cccgattgat ggaccactac ctgaggataa tgagcccagt 240 gggtacgcac aaacagattg tgtattggaa gcaatggctt tccttgaaga atcccaccca 300 gggatctttg aaaactcgtg tcttgaaacg atggaaattg ttcaacaaac aagagtggat 360 aaactgaccc aaggtcgcca gacctatgac tggacattga atagaaacca accggctgca 420 actgctttgg ccaacactat agaaatcttc agatcgaacg gtctaacagc caatgaatcg 480 ggacggctaa tagatttcct caaggatgtg atggagtcaa tggataagga agaaatggag 540 ataacaacac atttccagag aaagagaagg gtgagggaca acatgaccaa gaaaatggtc 600 acacaaagaa caatagggaa gaaaaaacaa aggctgaaca aaaagagcta cctgataaga 660 gcactgacac tgaacacaat gacaaaagat gcagaaagag gcaaattgaa gaggcgagcg 720 attgcaacac ccggaatgca aatcagagga ttcgtgtact ttgttgaaac actagcgagg 780 agtatctgtg agaaacttga gcaatctgga ctcccagtcg gagggaatga gaagaaggct 840 aaattggcaa acgtcgtgag gaagatgatg actaactcac aagatactga actctccttt 900 acaattactg gagacaatac caaatggaat gagaatcaga atcctaggat gtttctggca 960 atgataacgt acatcacaag gaaccagcca gaatggtttc ggaatgtctt aagcatagct 1020 cctataatgt tctcaaacaa aatggcgaga ctaggaaaag gatacatgtt cgaaagtaag 1080 agcatgaagt tacgaacaca aataccagca gaaatgcttg caaacattga tcttaaatac 1140 ttcaatgaat taacgaaaaa gaaaattgag aaaataaggc ctctattaat agatggtaca 1200 gcctcattga gccctggaat gatgatgggc atgttcaaca tgctgagtac agtcctagga 1260 gtttcaatcc tgaatcttgg acagaaaagg tacaccaaaa ccacatattg gtgggacgga 1320 ctccaatcct ctgatgattt cgctctcatc gtaaatgcac cgaatcatga gggaatacaa 1380 gcaggagtgg ataggtttta taggacttgt aaactagttg gaatcaatat gagcaagaag 1440 aagtcttaca taaatcggac agggacattt gaattcacga gctttttcta ccgctatgga 1500 tttgtagcca atttcagtat ggagctgccc agttttggag tgtctggaat taatgaatcg 1560 gccgacatga gcattggtgt tacagtgata aaaaacaata tgataaacaa cgaccttggg 1620 ccagcaacag ctcagatggc tcttcagtta ttcatcaagg actacagata cacataccga 1680 tgccacagag gggatacgca aatccaaaca aggagatcat tcgagctgaa gaagctgtgg 1740 gagcaaaccc gttcaaaggc aggactgttg gtttcagatg gaggaccaaa tctatacaat 1800 atccgaaacc tccatattcc tgaagtctgc ttaaaatggg aattgatgga tgaagattac 1860 cagggcagac tgtgtaatcc tctgaatcca ttcgtcagcc ataaggaaat tgaatctgtc 1920 aacaatgctg tagtaatgcc agctcatggc ccggccaaga gtatggaata tgatgccgtt 1980 gcaactacac attcatggat tcctaaaagg aaccgttcca ttctcaatac gagtcaaagg 2040 ggaattcttg aggatgaaca gatgtaccag aagtgctgca atctattcga gaaattcttc 2100 cccagcagtt catatcggag gccagttgga atttccagca tggtggaggc catggtgtct 2160 agggcccgaa ttgacgcacg aatcgatttc gagtctggaa ggattaagaa agaagagttt 2220 gccgagatca tgaagatctg ttccaccatt gaagaactca gacggcaaaa atag 2274 <210> 8 <211> 2280 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A virus (A/Viet Nam/1203/2004(H5N1)) polymerase basic subunit 2 (PB2) gene <400> 8 atggagagaa taaaagaatt acgagatcta atgtcacagt cccgcactcg cgagatacta 60 acaaaaacca ctgtggacca tatggccata atcaagaaat acacatcagg aagacaagag 120 aagaaccctg ctctcagaat gaaatggatg atggcaatga aatatccaat cacagcggac 180 aagagaataa tagagatgat tcctgaaagg aatgaacaag ggcagacgct ctggagcaag 240 acaaatgatg ctggatcgga cagggtgatg gtgtctcccc tagctgtaac ttggtggaat 300 aggaatgggc cggcgacaag tgcagttcat tatccaaagg tttacaaaac atactttgag 360 aaggttgaaa gattaaaaca tggaaccttc ggtcccgttc atttccgaaa ccaggttaaa 420 atacgccgcc gagttgatat aaatcctggc catgcagatc tcagtgctaa agaagcacaa 480 gatgtcatca tggaggtcgt tttcccaaat gaagtgggag ctagaatatt gacatcagag 540 tcgcaattga caataacgaa agagaagaaa gaagagctcc aagattgtaa gattgctccc 600 ttaatggttg catacatgtt ggaaagggaa ctggtccgca aaaccagatt cctaccggta 660 gcaggcggaa caagtagtgt gtacattgag gtattgcatt tgactcaagg gacctgctgg 720 gaacagatgt acactccagg cggagaagtg agaaatgacg atgttgacca gagtttgatc 780 attgctgcca gaaacattgt taggagagca acagtatcag cggatccact ggcatcactg 840 ctggagatgt gtcacagcac acaaattggt gggataagga tggtggacat ccttaggcaa 900 aatccaactg aggaacaagc tgtggatata tgcaaagcag caatgggtct taggatcagt 960 tcttccttta gctttggagg cttcactttc aaaagaacaa gtggatcatc cgtcaagaag 1020 gaagaggaag tgcttacagg caacctccaa acattgaaaa taagagtaca tgaggggtat 1080 gaggaattca caatggttgg gcggagggca acagctatcc tgaggaaagc aactagaagg 1140 ctgattcagt tgatagtaag tggaagagac caacaatcaa tcgctgaggc aatcattgta 1200 gcaatggtgt tctcacagga ggattgcatg ataaaggcag tccgaggcga tctgaatttc 1260 gtaaacagag caaaccaaag attaaacccc atgcatcaac tcctgagaca ttttcaaaag 1320 gacgcaaaag tgctatttca gaattgggga attgaaccca ttgataatgt catggggatg 1380 atcggaatat tacctgacat gactcccagc acagaaatgt cactgagagg agtaagagtt 1440 agtaaaatgg gagtggatga atattccagc actgagagag tagttgtaag tattgaccgt 1500 ttcttaaggg ttcgagatca gcgggggaac gtactcttat ctcccgaaga ggtcagcgaa 1560 acccagggaa cagagaaatt gacaataaca tattcatcat caatgatgtg ggaaatcaac 1620 ggtcctgagt cagtgcttgt taacacctat cagtggatca tcagaaactg ggagactgtg 1680 aagattcaat ggtctcaaga ccccacgatg ctgtacaata agatggagtt tgaaccgttc 1740 caatccttgg tacccaaagc tgccagaggt caatacagtg gatttgtgag aacattattc 1800 cagcaaatgc gtgacgtact ggggacattt gatactgtcc agataataaa gctgctacca 1860 tttgcagcag ccccaccgaa gcagagcaga atgcagtttt cttctctaac tgtgaatgtg 1920 agaggctcag gaatgagaat actcgtaagg ggcaattccc ctgtgttcaa ctacaataag 1980 gcaaccaaaa ggcttaccgt ccttggaaag gacgcaggtg cattaacaga ggatccggat 2040 gaagggacag ccggagtgga gtctgcagta ctgaggggat tcttaatttt aggcaaggag 2100 gacaaaaggt atggaccagc attgagcatc aatgaactga gcaatcttgc gaagggggag 2160 aaagctaatg tgctgatagg gcaaggagac gtggtgttgg taatgaaacg aaaacgggac 2220 tctagcatac ttactgacag ccagacagcg accaaaagaa ttcggatggc catcaattag 2280 <210> 9 <211> 1409 <212> DNA <213> Influenza A virus <220> <223> Influenza A virus (A/WSN/1933(H1N1)) neuraminidase gene <400> 9 agcgaaagca ggagtttaaa tgaatccaaa ccagaaaata ataaccattg ggtcaatctg 60 tatggtagtc ggaataatta gcctaatatt gcaaatagga aatataatct caatatggat 120 tagccattca attcaaaccg gaaatcaaaa ccatactgga atatgcaacc aaggcagcat 180 tacctataaa gttgttgctg ggcaggactc aacttcagtg atattaaccg gcaattcatc 240 tctttgtccc atccgtgggt gggctataca cagcaaagac aatggcataa gaattggttc 300 caaaggagac gtttttgtca taagagagcc ttttatttca tgttctcact tggaatgcag 360 gacctttttt ctgactcaag gcgccttact gaatgacaag cattcaaggg ggacctttaa 420 ggacagaagc ccttataggg ccttaatgag ctgccctgtc ggtgaagctc cgtccccgta 480 caattcaagg tttgaatcgg ttgcttggtc agcaagtgca tgtcatgatg gaatgggctg 540 gctaacaatc ggaatttctg gtccagatga tggagcagtg gctgtattaa aatacaacgg 600 cataataact gaaaccataa aaagttggag gaagaatata ttgagaacac aagagtctga 660 atgtacctgt gtaaatggtt catgttttac cataatgacc gatggcccaa gtgatgggct 720 ggcctcgtac aaaattttca agatcgagaa ggggaaggtt actaaatcaa tagagttgaa 780 tgcacctaat tctcactacg aggaatgttc ctgttaccct gataccggca 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cctctacctg atagaccagg acaaacatgg ccacctttac agatgcagag atcgacgagc 1920 tatttgagac aagtggaact gtcattgaca acataattac agcccagggt aaaccagcag 1980 agactgttgg aaggagtgca atcccacaag gcaagaccaa ggtgctgagc gcagcatggg 2040 agaagcatgg gagcatccag ccaccggcca gtcaagacaa ccccgatcga caggacagat 2100 ctgacaaaca accatccaca cccgagcaaa cgaccccgca tgacagcccg ccggccacat 2160 ccgctgacca gccccccacc caggccacag acgaagccgt cgacacacag ctcaggaccg 2220 gagcaagcaa ctctctgctg ttgatgcttg acaagctcag caataaatcg tccaatgcta 2280 aaaagggccc atggtcgagc ccccaagagg ggaatcacca acgtccgact caacagcagg 2340 ggagtcaacc cagtcgcgga aacagtcagg aaagaccgca gaaccaagtc aaggccgccc 2400 ctggaaacca gggcacagac gtgaacacag catatcatgg acaatgggag gagtcacaac 2460 tatcagctgg tgcaacccct catggtctcc gatcaaagca gagccaaaac aatacccctg 2520 tttctgcgga tcatttccac ccacctgtag actttgtgca agcgatgatg tctattatgg 2580 aggggatttc ccaaagagta agtaaggttg cctatcaggt agatcttgtt tttaaacaga 2640 catcctccat ccctatgatg gggtccgaaa tccaacagct gaaaacattt gttgcagtca 2700 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ttcacctgcc ttaaacaagc tgactattca ggcactttac aatctagctg gtgggaatat 5280 ggattactta ttgactaagt taggtatagg gaacaatcaa ctcagctcat taatcggtag 5340 cggcttaatc accggtaacc ctattctata cgactcacag actcaactct tgggtataca 5400 ggtaactcta ccttcagtcg ggaacctaaa taatatgcgt gccacctact tggaaacctt 5460 atccgtaagc acaaccaggg gatttgcctc ggcacttgtc ccaaaagtgg tgacacaggt 5520 cggttctgtg atagaagaac ttgacacctc atactgtata gaaactgact tagatttata 5580 ttgtacaaga atagtaacgt tccctatgtc ccctggtatt tactcctgct tgagcggcaa 5640 tacatcggcc tgtatgtact caaagaccga aggcgcactt actacaccat atatgactat 5700 caaaggctca gtcatcgcta actgcaagat gacaacatgt agatgtgtaa accccccggg 5760 tatcatatcg caaaactatg gagaagccgt gtctctaata gataaacaat catgcaatgt 5820 tttatcctta ggcgggataa ctttaaggct cagtggggaa ttcgatgtaa cttatcagaa 5880 gaatatctca atacaagatt ctcaagtaat aataacaggc aatcttgata tctcaactga 5940 gcttgggaat gtcaacaact cgatcagtaa tgctttgaat aagttagagg aaagcaacag 6000 aaaactagac aaagtcaatg tcaaactgac cagcacatct gctctcatta cctatatcgt 6060 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ttcaatgcct tcactcggcc aggtagtatc ccttgccagg cttcagcaag atgccccaac 7800 tcgtgtgtta ctggagtcta tacagatcca tatcccctaa tcttctatag aaaccacacc 7860 ttgcgagggg tattcgggac aatgcttgat ggtgaacaag caagacttaa ccctgcgtct 7920 gcagtattcg atagcacatc ccgcagtcgc ataactcgag tgagttcaag cagcatcaaa 7980 gcagcataca caacatcaac ttgttttaaa gtggtcaaga ccaataagac ctattgtctc 8040 agcattgctg aaatatctaa tactctcttc ggagaattca gaatcgtccc gttactagtt 8100 gagatcctca aagatgacgg ggttagagaa gccaggtctg gctagttgag tcaactatga 8160 aagagttgga aagatggcat tgtatcacct atcttctgcg acatcaagaa tcaaaccgaa 8220 tgccggcgcg tgctcgaatt ccatgtcgcc agttgaccac aatcagccag tgctcatgcg 8280 atcagattaa gccttgtcaa tagtctcttg attaagaaaa aatgtaagtg gcaatgagat 8340 acaaggcaaa acagctcatg gtaaataata cgggtaggac atggcgagct ccggtcctga 8400 aagggcagag catcagatta tcctaccaga gtcacacctg tcttcaccat tggtcaagca 8460 caaactactc tattattgga aattaactgg gctaccgctt cctgatgaat gtgacttcga 8520 ccacctcatt ctcagccgac aatggaaaaa aatacttgaa tcggcctctc ctgatactga 8580 gagaatgata aaactcggaa gggcagtaca ccaaactctt aaccacaatt ccagaataac 8640 cggagtactc caccccaggt gtttagaaga actggctaat attgaggtcc ctgattcaac 8700 caacaaattt cggaagattg agaagaagat ccaaattcac aacacgagat atggagaact 8760 gttcacaagg ctgtgtacgc atatagagaa gaaactgctg gggtcatctt ggtctaacaa 8820 tgtcccccgg tcagaggagt tcagcagcat tcgtacggat ccggcattct ggtttcactc 8880 aaaatggtcc acagccaagt ttgcatggct ccatataaaa cagatccaga ggcatctgat 8940 tgtggcagct aggacaaggt ctgcggccaa caaattggtg atgctaaccc ataaggtagg 9000 ccaagtcttt gtcactcctg aacttgttgt tgtgacgcat acgaatgaga acaagttcac 9060 atgtcttacc caggaacttg tattgatgta tgcagatatg atggagggca gagatatggt 9120 caacataata tcaaccacgg cggtgcatct cagaagctta tcagagaaaa ttgatgacat 9180 tttgcggtta atagacgctc tggcaaaaga cttgggtaat caagtctacg atgttgtatc 9240 actaatggag ggatttgcat acggagctgt ccagctactc gagccgtcag gtacatttgc 9300 gggagatttc ttcgcattca acctgcagga gcttaaagac attctaattg gcctcctccc 9360 caatgatata gcagaatccg tgactcatgc aatcgctact gtattctctg gtttagaaca 9420 gaatcaagca gctgagatgt tgtgcctgtt gcgtctgtgg ggtcacccac tgcttgagtc 9480 ccgtattgca gcaaaggcag tcaggagcca aatgtgcgca ccgaaaatgg tagactttga 9540 tatgatcctt caggtactgt ctttcttcaa gggaacaatc atcaacggat acagaaagaa 9600 gaatgcaggt gtgtggccgc gagtcaaagt ggatacaata tatgggaagg tcattgggca 9660 actacatgca gattcagcag agatttcaca cgatatcatg ttgagagagt ataagagttt 9720 atctgcactt gaatttgagc catgtataga atacgaccct gtcactaacc tgagcatgtt 9780 cctaaaagac aaggcaatcg cacaccccaa cgataattgg cttgcctcgt ttaggcggaa 9840 ccttctctcc gaagaccaga agaaacatgt aaaggaagcg acttcgacta accgcctctt 9900 gatagagttt ttagagtcaa atgattttga tccatataaa gagatggaat atctgacgac 9960 ccttgagtac cttagagatg acaatgtggc agtatcatac tcgctcaaag agaaggaagt 10020 gaaagttaat ggacggatct tcgctaagct gacaaagaag ttaaggaact gtcaggtgat 10080 ggcggaaggg atcctagccg atcagattgc acctttcttt cagggaaatg gagtcattca 10140 ggatagcata tccttgacca agagtatgct agcgatgagt caactgtctt ttaacagcaa 10200 taagaaacgt atcactgact gtaaagaaag agtatcttca aaccgcaatc atgatccgaa 10260 aagcaagaac cgtcggagag ttgcaacctt cataacaact gacctgcaaa agtactgtct 10320 taattggaga tatcagacga tcaaattgtt cgctcatgcc atcaatcagt tgatgggcct 10380 acctcatttc ttcgagtgga ttcacctaag actgatggac actacgatgt tcgtaggaga 10440 ccctttcaat cctccaagtg accctactga ctgtgacctc tcaagagtcc ctaatgatga 10500 catatatatt gtcagtgcca gagggggtat cgaaggatta tgccagaagc tatggacaat 10560 gatctcaatt gctgcaatcc aacttgctgc agctagatcg cattgtcgtg ttgcctgtat 10620 ggtacagggt gataatcaag taatagcagt aacgagagag gtaagatcag atgactctcc 10680 ggagatggtg ttgacacagt tgcatcaagc cagtgataat ttcttcaagg aattaatcca 10740 tgtcaatcat ttgattggcc ataatttgaa ggatcgtgaa accatcaggt cagacacatt 10800 cttcatatac agcaaacgaa tcttcaaaga tggagcaatc ctcagtcaag tcctcaaaaa 10860 ttcatctaaa ttagtgctag tgtcaggtga tctcagtgaa aacaccgtaa tgtcctgtgc 10920 caacattgcc tctactgtag cacggctatg cgagaacggg cttcccaaag acttctgtta 10980 ctatttaaac tatataatga gttgtgtgca gacatacttt gactctgagt tctccatcac 11040 caacaattcg caccccgatc ttaatcagtc gtggattgag gacatctctt ttgtgcactc 11100 atatgttctg actcctgccc aattaggggg actgagtaac cttcaatact caaggctcta 11160 cactagaaat atcggtgacc cggggactac tgcttttgca gagatcaagc gactagaagc 11220 agtgggacta ctgagtccta acattatgac taatatctta actaggccgc ctgggaatgg 11280 agattgggcc agtctgtgca acgacccata ctctttcaat tttgagactg ttgcaagccc 11340 aaatattgtt cttaagaaac atacgcaaag agtcctattt gaaacttgtt caaatccctt 11400 attgtctgga gtgcacacag aggataatga ggcagaagag aaggcattgg ctgaattctt 11460 gcttaatcaa gaggtgattc atccccgcgt tgcgcatgcc atcatggagg caagctctgt 11520 aggtaggaga aagcaaattc aagggcttgt tgacacaaca aacactgtaa ttaagattgc 11580 gcttactagg aggccattag gcatcaagag gctgatgcgg atagtcaatt attctagcat 11640 gcatgcaatg ctgtttagag acgatgtttt ttcctctagt agatccaacc accccttagt 11700 ctcttctaat atgtgttctc tgacactggc agactatgca cggaatagaa gctggtcacc 11760 tttgacggga ggcaggaaaa tactgggtgt atctaatcct gatacgatag aactcgtaga 11820 gggtgagatt cttagtgtaa gcggagggtg tacaagatgt gacagcggag atgaacaatt 11880 tacttggttc catcttccaa gcaatataga attgaccgat gacaccagca agaatcctcc 11940 gatgagggta ccatatctcg ggtcaaagac acaggagagg agagctgcct cacttgcgaa 12000 aatagctcat atgtcgccac atgtgaaggc tgccctaagg gcatcatccg tgttgatctg 12060 ggcttatggg gataatgaag taaattggac tgctgctctc acgattgcaa aatctcggtg 12120 taatgtaaac ttagagtatc ttcggttact gtccccttta cccacggctg ggaatcttca 12180 acatagacta gatgatggta taactcagat gacattcacc cctgcatctc tctacaggtg 12240 tcaccttaca ttcacatatc caatgattct caaaggctgt tcactgaaga aggagtcaaa 12300 gaggggaatg tggtttacca acagagtcat gctcttgggt ttatctctaa tcgaatcgat 12360 ctttccaatg acaacaacca gaacatatga tgagatcaca ctgcacctac atagtaaatt 12420 tagttgctgt atcagggaag cacctgttgc ggttcctttc gagctacttg gggtggcacc 12480 ggaactgagg acagtgacct caaataagtt tatgtatgat cctagccctg tatcggaggg 12540 agactttgcg agacttgact tagctatctt caagagttat gagcttaatc tggagtcata 12600 tcccacgata gagctaatga acattctttc aatatccagc gggaagttga ttggccagtc 12660 tgtggtttct tatgatgaag atacctccat aaagaatgat gccataatag tgtatgacaa 12720 tacccgaaat tggatcagtg aagctcagaa ttcagatgtg gtccgcctat ttgaatatgc 12780 agcacttgaa gtgctcctcc accgttctta ccaactctat tacctgagag taagaggcct 12840 agacaatatt gtcttatata tgggtgattt atacaagaat atgccaggaa ttctactttc 12900 caacattgca gctacaatat ctcatcctgt cattcattca aggttacatg cagtgggcct 12960 ggtcaaccat gacggatcac accaacttgc agatacggat tttatcgaaa tgtctgcaaa 13020 actgttagta tcttgcaccc gacgtgtgat ctccggctta tattcaggaa ataagtatga 13080 tctgctgttc ccatctgtct tagatgataa cctgaatgag aagatgcttc agctgatatc 13140 ccggttatgc tgtctgtaca cggtactctt tgctacaaca agagaaatcc cgaaaataag 13200 aggcttaact gcagaagaga aatgttcaat actcactgag tatttactgt cggatgctgt 13260 gaaaccatta cttagccccg atcaagtgag ctctatcatg tctcctaaca taattacatt 13320 cccagctaat ctgtactaca tgtctcggaa gagcctcaat ttgatcaggg aaagggagga 13380 cagggatact atcctggcgt tgttgttccc ccaagagcca ttattagagt tcccttctgt 13440 gcaagatatt ggtgctcgag tgaaagatcc attcacccga caacctgcgg catttttgca 13500 agagttagat ttgagtgctc cagcaaggta tgacgcattc acacttagtc agattcatcc 13560 tgaactcaca tctccaaatc cggaggaaga ctacttagta cgatacttgt tcagagggat 13620 agggactgca tcttcctctt ggtataaggc atcccatctc ctttctgtac ccgaggtaag 13680 atgtgcaaga cacgggaact ccttatactt ggctgaagga agcggagcca tcatgagtct 13740 tcttgaactg catgtaccac atgaaactat ctattacaat acgctctttt caaatgagat 13800 gaaccccccg caacgacatt tcgggccgac cccaactcag tttttgaatt cggttgttta 13860 taggaatcta caggcggagg taacatgcaa ggatggattt gtccaagagt tccgtccatt 13920 atggagagaa aatacagagg aaagtgacct gacctcagat aaagcagtgg ggtatattac 13980 atctgcagta ccctacagat ctgtatcatt gctgcattgt gacattgaaa ttcctccagg 14040 gtccaatcaa agcttactag atcaactagc tatcaattta tctctgattg ccatgcattc 14100 tgtaagggag ggcggggtag taatcatcaa agtgttgtat gcaatgggat actactttca 14160 tctactcatg aacttgtttg ctccgtgttc cacaaaagga tatattctct ctaatggtta 14220 tgcatgtcga ggggatatgg agtgttacct ggtatttgtc atgggttacc tgggcgggcc 14280 tacatttgta catgaggtgg tgaggatggc aaaaactctg gtgcagcggc acggtacgct 14340 cttgtctaaa tcagatgaga tcacactgac caggttattc acctcacagc ggcagcgtgt 14400 gacagacatc ctatccagtc ctttaccaag attaataaag tacttgagga agaatattga 14460 cactgcgctg attgaagccg ggggacagcc cgtccgtcca ttttgtgcgg aaagtttggt 14520 gagcacgcta gcgaacataa ctcagataac ccagattatc gctagtcaca ttgacacagt 14580 catccggtct gtgatatata tggaagctga gggtgatctc gctgacacag tatttctatt 14640 taccccttac aatctctcta ctgacgggaa aaagaggaca tcacttaaac agtgcacgag 14700 acagatccta gaggttacaa tactaggtct tagagtcgaa aatctcaata aaataggcga 14760 tataatcagc ctagtgctta aaggcatgat ctccatggag gaccttatcc cactaaggac 14820 atacttgaag catagtacct gccctaaata tttgaaggct gtcctaggta ttaccaaact 14880 caaagaaatg tttacagaca cttctgtact gtacttgact cgtgctcaac aaaaattcta 14940 catgaaaact ataggcaatg cagtcaaagg atattacagt aactgtgact cctaacgaaa 15000 atcacatatt aataggctcc ttttttggcc aattgtattc ttgttgattt aattatatta 15060 tgttagaaaa aagttgaact ctgactcctt aggactcgaa ttcgaactca aataaatgtc 15120 tttaaaaaag gttgcgcaca attattcttg agtgtagtct cgtcattcac caaatctttg 15180 tttggt 15186 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a consensus sequence based on avirulent avian strains of influenza A H5 in the region immediately before the HA cleavage site <400> 11 Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly 1 5 10 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> altered consensus sequence based on avirulent avian strains of influenza A H5 in the region immediately before the HA cleavage site <400> 12 Gln Arg Glu Thr Arg Gly 1 5 <210> 13 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence based on avirulent avian strains of influenza A H5 in the region immediately before the HA cleavage site <400> 13 cct caa aga gag aga aga aga aaa aag aga gga 33 Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly 1 5 10 <210> 14 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence based on avirulent avian strains of influenza A H5 in the region immediately before the HA cleavage site <400> 14 Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly 1 5 10 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> altered consensus sequence based on avirulent avian strains of influenza A H5 in the region immediately before the HA cleavage site <400> 15 cct caa aga gag acg aga gga 21 Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly 1 5 <210> 16 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> consensus sequence based on avirulent avian strains of influenza A H5 in the region immediately before the HA cleavage site <400> 16 Pro Gln Arg Glu Thr Arg Gly 1 5 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> further altered DNA consensus sequence based on avirulent avian strains of influenza A H5 in the region immediately before the HA cleavage site <400> 17 cctcagcggg agacgcgggg a 21 <210> 18 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> "gene end" sequence engineered to the genes which were inserted into the NDV as an extratransciptional units <400> 18 ttagaaaaaa 10 <210> 19 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> "gene start" sequence engineered to the genes which were inserted into the NDV as an extratransciptional units <400> 19 acgggtagaa 10 <210> 20 <211> 74 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer used to produce ectodomain (ECTO) of the H5 HA gene <400> 20 cggctagctt agaaaaaata cggtagaagt gaaactagtc cgccaccatg gaaagaatag 60 tgattgcctt tgca 74 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer used to produce ectodomain (ECTO) of the H5 HA gene <400> 21 cggttaacct gataagcccc cattgattct aat 33 <210> 22 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer used to amplify TM and CT of the NDV F gene <400> 22 cggttaacct cattacctat atcgttttga ct 32 <210> 23 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer used to amplify TM and CT of the NDV F gene <400> 23 cggagctcaa gctagcttat cacatttttg tagtggctct catctg 46 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer F2aa-1(+) used to generate rNDV/F2aa <400> 24 ggatcccggt tggcgccctc cagg 24 <210> 25 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer F2aa-1(-) used to generate rNDV/F2aa <400> 25 aaggcgcctc tgtctccgcc ctccagatgt agtcacag 38 <210> 26 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer F2aa-2(+) used to generate rNDV/F2aa <400> 26 ggcggagaca gaggcgcctt ataggcgcca ttattgg 37 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer F2aa-2(-) used to generate rNDV/F2aa <400> 27 ccatattccc accagctaga ttgt 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer F3aa-1(+) used to generate rNDV/F3aa <400> 28 ggatcccggt tggcgccctc cagg 24 <210> 29 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer F3aa-1(-) used to generate rNDV/F3aa <400> 29 aaagcgcctc tgtctccgcc ctccagatgt agtcacag 38 <210> 30 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer F3aa-2(+) used to generate rNDV/F3aa <400> 30 ggcggagaca gaggcgcttt ataggcgcca ttattgg 37 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer F3aa-2(-) used to generate rNDV/F3aa <400> 31 ccatattccc accagctaga ttgt 24 <210> 32 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpaNDV F(TM+CYTO)P primer used to generate chimeric H7HA gene <400> 32 cggttaacct cattacctat atcgttttga ct 32 <210> 33 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SacNheNDVF(TM+CYTO)M primer used to generate chimeric H7HA gene <400> 33 cggagctcaa gctagcttat cacatttttg tagtggctct catctg 46 <210> 34 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SpeH7(ECTO)P primer used to generate chimeric H7HA gene <400> 34 cgactagtcc gccaccatga acactcaaat tctggcattc at 42 <210> 35 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HpaH7(ECTO)M primer used to generate chimeric H7HA gene <400> 35 cggttaacgt ctttgtatcc actactcaat ttcac 35 <210> 36 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> partical H7HA with GE/GS and Kozak sequence <400> 36 gctagcttag aaaaaatacg ggtagaacac tagtccgcca ccatggtcag ct 52

Claims (33)

  1. 뉴라미니다제 융합 단백질을 코딩하는 패키지화 인플루엔자 바이러스 NA 분절을 포함하며, 여기서 NA 오픈 리딩 프레임은, NA 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 그의 N-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 뉴라미니다제 항원의 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되도록 변형되고, 이로써 상기 뉴라미니다제 융합 단백질이 발현되어 키메라 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스.
  2. 헤마글루티닌 융합 단백질을 코딩하는 패키지화 인플루엔자 바이러스 HA 분절을 포함하며, 여기서 HA 오픈 리딩 프레임은, HA 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 그의 C-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자 바이러스가 아닌 다른 감염원의 수용체 결합/융합생성 항원의 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되도록 변형되고, 이로써 상기 헤마글루티닌 융합 단백질이 발현되어 키메라 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스.
  3. (a) 조류 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임, 및
    (b) 헤마글루티닌 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 그의 C-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의 엑토도메인을 코딩 하는 뉴클레오티드에 의해 치환된 헤마글루티닌 융합 단백질을 코딩하는 제2 오픈 리딩 프레임
    을 포함하는 패키지화 이중시스트론성 인플루엔자 바이러스 HA 분절을 포함하고, 이로써 상기 인플루엔자 헤마글루티닌과 융합 단백질 모두가 발현되어 키메라 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스.
  4. (a) 조류 인플루엔자 뉴라미니다제 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임, 및
    (b) 뉴라미니다제 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 그의 N-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환된 뉴라미니다제 융합 단백질을 코딩하는 제2 오픈 리딩 프레임
    을 포함하는 패키지화 이중시스트론성 인플루엔자 바이러스 NA 분절을 포함함하고, 이로써 상기 인플루엔자 뉴라미니다제와 융합 단백질 모두가 발현되어 키메라 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스.
  5. 뉴라미니다제 융합 단백질을 코딩하는 패키지화 인플루엔자 바이러스 NA 분절을 포함하며, 여기서 NA 오픈 리딩 프레임은, NA 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 NDV의 HN 항원의 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되도록 변형되고, 이로써 상기 뉴라미니다제 융합 단백질이 발현되어 키메라 조류 인플루 엔자 바이러스로 혼입되는, 키메라 조류 인플루엔자 바이러스.
  6. 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스의 세포 인터페론 길항제 활성을 감소시키는 변형 NS1 단백질을 코딩하는 패키지화 NS1 유전자 분절을 포함하는 키메라 조류 인플루엔자 바이러스.
  7. 제 1항, 4항 또는 5항 중 어느 한 항에 있어서, 헤마글루티닌 다염기성 절단 부위가 제거되도록 변형된 오픈 리딩 프레임을 가지는 HA 분절을 포함하는 키메라 조류 인플루엔자 바이러스.
  8. 제 3항에 있어서, 제1 오픈 리딩 프레임이, 헤마글루티닌 다염기성 절단 부위가 제거되도록 변형된 키메라 조류 인플루엔자 바이러스.
  9. 제 1항, 4항 또는 5항 중 어느 한 항의 NA 분절을 코딩하는 재조합 DNA 분자.
  10. 제 2항 또는 3항의 HA 분절을 코딩하는 재조합 DNA 분자.
  11. (a) 부화란에서 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항의 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 증식시키고; 및
    (b) 자손 바이러스를 수집하는 것
    을 포함하며, 여기서 바이러스는, 자손 바이러스가 면역원성 제제에 사용하기에 적합하도록, 바이러스에 오염이 없게 하기에 충분한 조건 하에서 충분한 양으로 생육되는, 면역원성 제제의 제조 방법.
  12. (a) 조류 인플루엔자 바이러스 감염에 감수성인 세포주에서 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항의 키메라 조류 인플루엔자 바이러스를 증식시키고; 및
    (b) 자손 바이러스를 수집하는 것
    을 포함하며, 여기서 바이러스는, 자손 바이러스가 면역원성 제제에 사용하기에 적합하도록, 바이러스에 오염이 없게 하기에 충분한 조건 하에서 충분한 양으로 생육되는, 면역원성 제제의 제조 방법.
  13. 뉴라미니다제 융합 단백질을 코딩하는 패키지화 인플루엔자 바이러스 NA 분절을 포함하며, 여기서 NA 오픈 리딩 프레임은, NA 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 그의 N-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 뉴라미니다제 항원의 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되도록 변형되고, 이로써 상기 뉴라미니다제 융합 단백질이 발현되어 약독화된 키메라 조류 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스.
  14. 헤마글루티닌 융합 단백질을 코딩하는 패키지화 인플루엔자 바이러스 HA 분 절을 포함하며, 여기서 HA 오픈 리딩 프레임은, HA 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 그의 C-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 수용체 결합/융합생성 항원의 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환되도록 변형되고, 이로써 상기 헤마글루티닌 융합 단백질이 발현되어 약독화된 키메라 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스.
  15. (a) 조류 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임, 및
    (b) 헤마글루티닌 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 그의 C-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의 또는 질병과 관련된 항원의 엑토도메인의 1종 이상 항원결정인자를 포함하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환된 헤마글루티닌 융합 단백질을 코딩하는 제2 오픈 리딩 프레임
    을 포함하는 패키지화 이중시스트론성 인플루엔자 바이러스 HA 분절을 포함하고, 이로써 상기 인플루엔자 헤마글루티닌과 융합 단백질 모두가 발현되어 약독화된 키메라 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 약독화 키메라 조류 인플루엔자 바이러스.
  16. (a) 조류 인플루엔자 뉴라미니다제 단백질을 코딩하는 제1 오픈 리딩 프레임, 및
    (b) 뉴라미니다제 엑토도메인을 코딩하는 뉴클레오티드가 그의 N-말단에 의해 앵커링되는 인플루엔자가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의 또는 질병과 관련된 항원의 엑토도메인의 1종 이상 항원결정인자를 포함하는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드에 의해 치환된 뉴라미니다제 융합 단백질을 코딩하는 제2 오픈 리딩 프레임
    을 포함하는 패키지화 이중시스트론성 인플루엔자 바이러스 NA 분절을 포함하고, 이로써 상기 인플루엔자 뉴라미니다제와 융합 단백질 모두가 발현되어 약독화된 키메라 인플루엔자 바이러스로 혼입되는, 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스.
  17. 제 13항 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스의 세포 인터페론 길항제 활성을 감소시키는 변형 NS1 단백질을 코딩하는 패키지화 NS1 유전자 분절을 포함하는 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스.
  18. 제 13항 또는 16항에 있어서, 헤마글루티닌 다염기성 절단 부위가 제거되도록 변형된 오픈 리딩 프레임을 가지는 HA 분절을 포함하는 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스.
  19. 제 15항에 있어서, 제1 오픈 리딩 프레임이, 헤마글루티닌 다염기성 절단 부위가 제거되도록 변형된 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스.
  20. 제 13항 또는 16항의 NA 분절을 코딩하는 재조합 DNA 분자.
  21. 제 14항 또는 15항의 HA 분절을 코딩하는 재조합 DNA 분자.
  22. (a) 부화란에서 제 13항 내지 16항 중 어느 한 항의 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스를 증식시키고; 및
    (b) 자손 바이러스를 수집하는 것
    을 포함하며, 여기서 바이러스는, 자손 바이러스가 면역원성 제제에 사용하기에 적합하도록, 바이러스에 오염이 없게 하기에 충분한 조건 하에서 충분한 양으로 생육되는, 면역원성 제제의 제조 방법.
  23. (a) 약독화 인플루엔자 바이러스 감염에 감수성인 세포주에서 제 13항 내지 16항 중 어느 한 항의 약독화 키메라 인플루엔자 바이러스를 증식시키고; 및
    (b) 자손 바이러스를 수집하는 것
    을 포함하며, 여기서 바이러스는, 자손 바이러스가 면역원성 제제에 사용하기에 적합하도록, 바이러스에 오염이 없게 하기에 충분한 조건 하에서 충분한 양으로 생육되는, 면역원성 제제의 제조 방법.
  24. F 단백질의 막횡단 및 세포질 도메인과, C-말단에 의해 앵커링되는 NDV가 아 닌 다른 감염원의 보호성 항원의 또는 질병과 관련된 항원의 엑토도메인의 1종 이상 항원결정인자를 가지는 F-융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 패키지화 게놈을 포함하고, 이로써 상기 F 단백질-융합 단백질이 발현되어 키메라 NDV로 혼입되는, 키메라 NDV.
  25. 제 24항에 있어서, 게놈은 F 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함함으로써, F 단백질이 발현되어 키메라 NDV로 혼입되는 키메라 NDV.
  26. 제 24항에 있어서, F-융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 NDV F 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 치환하며, F-융합 단백질이 F 단백질의 기능을 제공하는 키메라 NDV.
  27. HN 단백질의 막횡단 및 세포질 도메인과, N-말단에 의해 앵커링되는 NDV가 아닌 다른 감염원의 보호성 항원의 또는 질병과 관련된 항원의 엑토도메인의 1종 이상 항원결정인자를 가지는 HN-융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 패키지화 게놈을 포함하고, 이로써 상기 HN 단백질-융합 단백질이 발현되어 키메라 NDV로 혼입되는, 키메라 NDV.
  28. 제 27항에 있어서, 게놈이, HN 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함함하고, 이로써 HN 단백질이 발현되어 키메라 NDV로 혼입되는 키메라 NDV.
  29. 제 27항에 있어서, HN-융합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 NDV HN 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 치환하며, F 융합 단백질이 HN 단백질의 기능을 제공하는 키메라 NDV.
  30. (a) 부화란에서 제 24항 내지 29항 중 어느 한 항의 키메라 NDV를 증식시키고; 및
    (b) 자손 바이러스를 수집하는 것
    을 포함하며, 여기서 바이러스는, 자손 바이러스가 면역원성 제제에 사용하기에 적합하도록, 바이러스에 오염이 없게 하기에 충분한 조건 하에서 충분한 양으로 생육되는, 면역원성 제제의 제조 방법.
  31. (a) NDV 감염에 감수성인 세포주에서 제 24항 내지 29항 중 어느 한 항의 키메라 NDV를 증식시키고; 및
    (b) 자손 바이러스를 수집하는 것
    을 포함하며, 여기서 바이러스는, 자손 바이러스가 면역원성 제제로의 제제화에 적합하도록, 바이러스에 오염이 없게 하기에 충분한 조건 하에서 충분한 양으로 생육되는, 면역원성 제제의 제조 방법.
  32. 제 1항, 2항, 3항, 4항, 5항, 13항, 14항, 15항, 16항, 24항, 25항, 26항, 27항, 28항 또는 29항 중 어느 한 항의 키메라 바이러스를 투여하는 것을 포함하는, 조류에서 2종의 감염원에 대한 면역 반응을 유발하는 방법.
  33. 제 13항, 14항, 16항, 24항, 25항, 26항, 27항, 28항 또는 29항 중 어느 한 항의 키메라 바이러스를 투여하는 것을 포함하는, 인간에서 2종의 감염원에 대한 면역 반응을 유발하는 방법.
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