BR112014006694A2 - vacinas contra o vírus influenza e usos dessas - Google Patents

vacinas contra o vírus influenza e usos dessas Download PDF

Info

Publication number
BR112014006694A2
BR112014006694A2 BR112014006694-9A BR112014006694A BR112014006694A2 BR 112014006694 A2 BR112014006694 A2 BR 112014006694A2 BR 112014006694 A BR112014006694 A BR 112014006694A BR 112014006694 A2 BR112014006694 A2 BR 112014006694A2
Authority
BR
Brazil
Prior art keywords
domain
influenza virus
polypeptide
influenza
hemagglutinin
Prior art date
Application number
BR112014006694-9A
Other languages
English (en)
Inventor
Adolfo Garcia-Sastre
Peter Palese
Florian Krammer
Natalie Pica
Dirk Eggink
Rafael A Medina-Silva
Rong Hai
Original Assignee
Mount Sinai School Of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mount Sinai School Of Medicine filed Critical Mount Sinai School Of Medicine
Publication of BR112014006694A2 publication Critical patent/BR112014006694A2/pt

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/14011—Baculoviridae
    • C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
    • C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/16162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

vacinas contra o vírus influenza e usos dessas trata-se de polipeptídeos de hemaglutinina de gripe, incluindo polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico, e polipeptídeos de hemaglutinina de gripe que compreende sítios de glicosilação modificados e sítios de glicosilação de ocorrência não-natural, composições que compreendem os mesmos, vacinas que compreendem os mesmos e métodos de uso destes.

Description

;VACINAS CONTRA O VÏRUS INFLUENZA E USOS DESSAS" Este pedido reivindica o benefício de prioridade de Pedido Provisório No. U.S. 61/536.924, depositado em 20 de setembro de 2011, Pedido Provisório No. U.S. 61/565.899, 5 depositado em 1 0 de dezembro de 2011, Pedido Provisório No. U.S. 61/607.526, depositado em 6 de março de 2012, Pedido Provisório No. U.S. 61/648.525, depositado em 17 de maio de 2012, Pedido Provisório No. U.S. 61/670.108, depositado em 10 de julho de 2012, e Pedido Provisório No. U.S. 10 61/684.481, depositado em 17 de agosto de 2012, esses estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.
Essa invenção foi realizada com o suporte governamental sob concessão Nos. AI070469, A1086061 e HHSN266200700010C outorgada pelo National Institutes of 15 Health. O governo possui alguns direitos na invenção. r
1. INTRODUÇÃO No presente documento, proporcionam-se polipeptideos de hemaglutinina de gripe, por exemplo, polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico, 20 e composições que compreendem os mesmos, vacinas que compreendem os mesmos e métodos de seu uso.
2. ANTECEDENTES Os vírus da grupe são vírus e RNA envelopados que pertencem à família de Orthomyxoviridae (Palese and Shaw 25 (2007) Orthomyxoviridae: The Viruses and Their Replication, 5th ed. Fields' Virology, edited by B.N. Fields, D.M. Knipe and P.M. Howley. Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, USA, p1647-1689). O hospedeiro natural de vírus da gripe A consiste principalmente em aves, 30 porém os vírus da gripe A (inclusive aqueles de origem aviária) também podem infectar e causar doença em humanos e outros hospedeiros animais (morcegos, cães, porcos, cavalos, mamíferos marinhos, e mustelídeos). Por exemplo, o vírus da gripe aviária A H5N1 que circula na Ásia foi encontrado em 5 porcos na China e Indonésia e também expandiu sua gama de hospedeiros para incluir gatos, leopardos, e tigres, que geralmente não são considerados suscetíveis ao vírus influenza A (CIDRAP - Avian Influenza: Agricultural and Wildlife Considerations). A ocorrência de infecções por 10 vírus influenza em animais poderia originar potencialmente cepas de vírus influenza pandémicas humanas.
Os vírus influenza A e B são patógenos humanos importantes, que causam uma doença respiratória que varia em gravidade de infecção sub-clínica à pneumonia viral '« 15 primária que pode resultar em morte. Os efeitos clínicos de infecção variam com a virulência da cepa de influenza e a exposição, histórico, idade, e status imunológico do hospedeiro. A morbidez e mortalidade cumulativas causadas por influenza sazonal se devem substancialmente à taxa de 20 ataque relativamente alta. Em uma estação normal, a influenza pode causar entre 3-5 milhões de casos de doença grave e até 500.000 mortes em todo o mundo (World Health Organization (2003) Influenza: Overview; March 2003). Nos Estados Unidos, os vírus influenza infectam uma estimativa 25 de 10-15% da população (Glezen and Couch RB (1978) Interpandemic influenza in the Houston area, 1974-76. N Engl J Med 298: 587-592; Fox et al. (1982) Influenza virus infections in Seattle families, 1975-1979. II. PatLern of infection in invaded households and relation of age and 30 prior antibody to occurrence of infection and related illness. Am J Epidemiol 116: 228-242) e estão associados a aproximadamente 30.000 mortes todo ano (Thompson WW at a1. (2003) Mortality Associated with Influenza and Respiratory Syncytial Virus in the United States. JAMA 289: 179-186; 5 Belshe (2007) Translational research on vaccines: influenza as an example. Clin Pharmacol Ther 82: 745-749).
Além de epidemias anuais, os vírus influenza são a causa de pandemias infrequentes. Por exemplo, os vírus influenza A podem causar pandemias como aquelas que ocorreram em 1918, 1957, 1968, e 2009. Devido à falta de imunidade pré-formada contra o antígeno viral principal, hemaglutinina (HA), a influenza pandêmica pode afetar mais de 50% da população em um único ano e geralmente causa doenças mais graves do que a influenza epidêmica. Um exemplo claro é a pandemia de 1918, em que estimou-se a morte de 50-100 milhões de pessoas (Johnson and Mueller (2002) Updating the Accounts: Global Mortality of the 1918- 1920 "Spanish" Influenza Pandemic Bulletin of the History of Medicine 76: 105-115). Desde o surgimento do virus influenza H5N1 aviário altamente patogênico no final de 1990 (Clans et al. (1998) Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus. Lancet 351: 472-7), há preocupações que esse possa ser o próximo vírus pandémico. Ademais, as cepas H7 e H9 são candidatos a novas pandemias visto que essas cepas às vezes infectam humanos.
Uma maneira eficaz para se proteger contra a infecção por vírus influenza é através da vacinação; entretanto, as abordagens de vacinação atuais contam com a obtenção de uma correspondência satisfatória entre as cepas circulantes e os isolados incluídos na vacina. Essa correspondência é geralmente difícil de obter devido a uma combinação de fatores. Primeiro, os vírus influenza sofrem mudança constantemente: a cada 3-5 anos a cepa predominante 5 de vírus influenza A é substituída por uma variante que foi submetida à variação antigênica suficiente para evadir respostas de anticorpos existentes. Os isolados que serão incluídos em preparações de vacina devem ser, portanto, selecionados a cada ano com base nos esforços de vigilância intensivos dos centros de colaboração World Health Organization (WHO). Segundo, para permitir tempo suficiente para a fabricação e distribuição de vacina, as cepas devem ser selecionadas aproximadamente seis meses antes do início da influenza sazonal. Geralmente, as previsões do comitê de seleção de cepa para vacina são imprecisas, resultando em uma redução substancial na eficácia de vacinação.
A possibilidade de um novo subtipo de vírus influenza A que entra na população humana também apresenta um desafio significativo para estratégias de vacinação atuais. Visto que é impossível prever o subtipo e a cepa de vírus influenza que irá causar a próxima pandemia, abordagens cepa-específicas atuais não podem ser usadas para preparar uma vacina contra pandemia de influenza.
3. SUMÁRIO 25 Proporcionam-se aqui polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) que induzem uma resposta imunológica protetora cruzada contra o domínio de tronco HA conservado (às vezes referido aqui como domínio de "caule") de vírus influenza. Em um aspecto, a invenção se refere ao desenho e construção de polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico que possui um caule HA estável que exibe uma cabeça globular HA heteróloga ao caule (isto é polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico descritos aqui). Os irnunôgenos de HA destinado à vacinação 5 compartilham a região de caule HA, porém são altamente divergentes em suas cabeças globulares. Essas construções são modificadas por engenharia genética formando formulações de vacina como vírus influenza vivo, vírus influenza morto, partículas de vírus/tipo virais ("VLPs"), vacinas de subunidade, vacinas divididas, etc., que extraem anticorpos altamente potentes e amplamente neutralizantes contra o caule de HA conservado. Essas vacinas "universais" podem ser usadas para induzir e/ou estimular respostas imunológicas protetoras cruzadas através de subtipos de vírus influenza.
A título de base, os anticorpos neutralizantes contra o vírus influenza visam a glicoproteína HA e impedem a etapa de ligação ou a fusão envolvida em entrada viral. Dois subconjuntos básicos de anticorpos neutralizantes são obtidos por exposição ao vírus influenza: aqueles dirigidos para a cabeça globular cepa-específica (um domínio que é não-conservado através das várias cepas e subtipos de vírus influenza), e aqueles dirigidos para o tronco altamente conservado da glicoproteína HA. A cabeça globular HA não- . v, conservada contém os epítopos imunodominantes. Sem se ater à teoria, os anticorpos de cabeça anti-globular cepa- específicos são considerados mais potentes do que os anticorpos antissoro, explicando assim a imunidade amplamente cepa-específica conferida por infecção com vacinas atuais.
A invenção se baseia, em parte, nas estratégias de desenho racionais dos inventores para vacinas contra vírus influenza que extraem anticorpos altamente potentes e amplamente neutralizantes contra o tronco HA. Nesse sentido, 5 o imunógeno de HA quimérico é desenhado para compartilhar um domínio de caule relativamente bem conservado de exposições/vacinações anteriores, porém contém uma cabeça globular HA heteróloga - de preferência, uma à qual o vacinado destinado é virgem. A exposição a essa construção deveria estimular principalmente os anticorpos dirigidos para o tronco HA conservado. Imunizações repetidas com o tronco HA conservado e a alteração da cabeça globular deveriam induzir os anticorpos neutralizantes cruzados robustos contra a região de tronco comum de HA. 15 Quando se desenha as construções de HA ç quiméricas, deve-se tomar cuidado para manter a estabilidade da proteína resultante. Nesse sentido, recomenda-se que os resíduos de cisteína identificados como Ap e Aq na Figura 1 sejam mantidos visto que esses contribuem para a 20 estabilidade do caule HA como discutido em mais detalhes na Seção 5.1 infra. Para a melhor estabilidade, prefere-se "trocar" o globular domínio HA como um todo (entre os resíduos de cisteina Ap e Aq como mostrado na Figura 1) visto que a conformação resultante poderia estar mais próxima à estrutura nativa. Em outras palavras, o "ligante" referido na Seção 5.1.2 pode ser o domínio de cabeça globular total de uma HA heteróloga.
Em vez de "trocar" a cabeça globular nativa do caule HA, a cabeça globular pode se tornar heteróloga ao 30 caule conservado ao alterar as alças que contribuem para os epítopos de cabeça globular HA. Essa abordagem pode não funcionar tão bem para gerar a resposta imunológica desejada contra o caule conservado, exceto onde a cabeça globular alterada for desenhada para ser muito diferente da 5 cabeça globular HA nativa- especialmente quando se utiliza uma HA à qual a população foi exposta. Entretanto, essas alterações podem ser realizadas, por exemplo, ao alterar a maior parte das cinco alças que contribuem para os epítopos de cabeça globular HA. Em uma abordagem útil, todas as 10 cinco alças podem ser alteradas. Alternativamente, ou, além disso, os epítopos nos cinco loops podem ser mascarados ao introduzir sítios de glicosilação no domínio de cabeça globular.
As construções usadas para vacinação podem ser u 15 vantajosamente desenhadas para os indivíduos/população particular que serão vacinados. Há três subtipos de influenza aos quais os serem humanos atualmente são expostos: subtipos Hl, H2, e H3. Os vírus influenza do subtipo H2 desapareceram da população em 1968, enquanto o 20 vírus influenza dos subtipos H1 e H3 persistem na população até hoje. Como resultado, os adultos que nasceram antes de 1968 provavelmente foram expostos a cada um dos subtipos H1, H2, e H3. Em contrapartida, os adultos que nasceram depois de 1968 provavelmente foram expostos apenas aos subtipos Hi 25 e H3.
Assim, em modalidades preferidas para a vacinação de adultos, os polipeptídeos de hemaglutir.ina de vírus influenza quimérico não possuem um domínio de cabeça globular da HA de um vírus influenza de subtipo H1, H2, ou 30 H3, porém possuem um domínio de tronco da HA de um desses três subtipos. A cabeça globular heteróloga pode ser selecionada a partir da HA de qualquer subtipo não-Hl, não- H2, ou não-H3. Também, construções quiméricas separadas feitas utilizando troncos H1/H2 por um lado, e troncos H3 5 por outro lado podem ser beneficamente usadas em um programa de vacinação - os subtipos Hl e H2 são subtipos HA de Grupo 1 que compartilham um domínio de caule conservado; enquanto H3 é um subtipo do Grupo 2 que possui um domínio de caule que é estruturalmente diferente do caule de Grupo 10 1. 0 uso das construções Hl e H3 poderia garantir gerar/estimular uma resposta imunológica contra cada domínio de tronco. A imunização de indivíduos adultos com esses polipeptïdeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico irá estimular a resposta imunológica de memória
U 15 do indivíduo, resultando na produção em larga escala de anticorpos reativos cruzados, amplamente neutralizantes de domínio de anti-tronco que fornecem longa imunidade a vírus influenza no indivíduo.
Os bebês que não foram expostos, naturalmente, 20 são virgens a todos os subtipos de vírus influenza. Como resultado, uma ampla gama de combinações de tronco/cabeça globular HA pode ser construída para uso em vacinas para bebês. Em uma modalidade preferida, os bebês virgens podem ser vacinados com construções feitas utilizando o caule HA 25 de uma cepa de Grupo 1 (Hl ou H2) ou Grupo 2 (H3), e uma cabeça globular de uma cepa heteróloga; isto é, cepas não- Hi, não-H2, e/ou não-H3. Três construções de HA quimérica diferentes para cada caule HA podem ser usadas vantajosamente em três vacinações sequenciais para induzir 30 uma resposta protetora cruzada.
Os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico usados para vacinação também podem ser vantajosamente desenhados para extrair efetivamente anticorpos altamente potentes e amplamente neutralizantes 5 contra o domínio de tronco HA em um indivíduo pela adição ou modificação de sítios de glicosilação nesses polipeptídeos.
Acredita-se que a glicosilação da cabeça globular HA e o domínio de tronco possam mascarar os sítios antigênicos, permitindo assim que um vírus influenza evada uma resposta imunológica de um indivíduo.
Dentro do contexto de um polipeptídeo HA do vírus influenza, entretanto, a glicosilação dentro do domínio de tronco do quimérico polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza pode impedir ou evitar as respostas imunes desejadas contra regiões antigênicas dentro desse domínio que são protegidas por glicosilação.
Portanto, em algumas modalidades preferidas, o polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérica compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados que interrompem a ligação de glicano ao domínio de tronco, tornado assim o domínio de tronco mais acessível para obter uma resposta imunológica.
Para aumentar adicionalmente a imunogenicidade do domínio de tronco, as construções podem compreender ainda sítios de glicosilação de ocorrência não-natural no domínio de cabeça globular que, quando glicosiladas, protegem as regiões antigênicas imunodominantes encontradas no domínio de
~abeça globular a partir da obtenção de uma resposta imunológica.
Um exemplo de um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural é a adição deum sítio de glicosilação ao domínio de cabeça globular de um vírus influenza HA de um subtipo, em que o sítio de glicosilação é naturalmente encontrado no domínio de cabeça globular de um vírus influenza HA de outro subtipo.
Outro exemplo de um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural é a adição 5 de um sítio de glicosilação ao domínio de cabeça globular de um vírus influenza HA a partir de uma cepa, em que o sítio de glicosilação é naturalmente encontrado na cabeça globular de uma HA de outra cepa de vírus influenza.
Ainda em outro exemplo de um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural é a adição de um sítio de glicosilação à cabeça globular de uma HA de uma cepa, em que o sítio de glicosilação não é naturalmente encontrado na cabeça glóbul~r de uma HA de outro subtipo ou cepa de vírus influenza.
Embora sem se ater a qualquer teoria particular de operação, acredita-se que a glicosilação adicional dentro do domínio de cabeça globular irá aumentar a resposta imunológica ao domínio de tronco conservado,
enquanto reduz a resposta imunológica ao domínio de cabeça globular. 20 Deve ser entendido que o uso dos polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é vantajoso, pois (i) os ditos polipeptídeos são altamente estáveis (devido ao fato de esses possuírem um domínio de cabeça globular intacto) e (ii) os sistemas imunológicos dos indivíduos aos quais os ditos polipeptideos são administrados não foram anteriormente expostos aos domínios de cabeça globular da hemaglutinina de vírus influenza quimérico, porém foram expostos aos epítopos conservados dos domínios de tronco da hemaglutinina de vírus influenza quimérico.
Em outro aspecto, proporciona-se aqui um polipeptídeo HA de gripe (por exemplo, polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza e polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe não- 5 quimérico) que compreende um domínio de tronco que compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados que interrompem a ligação de glicano ao domínio de tronco.
Em outro aspecto, proporciona-se aqui um polipeptídeo HA de gripe (por exemplo, polipeptídeos de 10 domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza e polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe não- quimérico) que compreende um domínio de cabeça globular que compreende um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
15 Ainda em outro aspecto, proporciona-se aqui um polipeptídeo HA de gripe (por exemplo, polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza e polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe não- quimérico) que compreende (1) um domínio de tronco que 20 compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados que interrompem a ligação de glicano ao domínio de tronco; e (2) um domínio de cabeça globular que compreende um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
Em uma modalidade especifica, proporciona-se aqui 25 um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico (HA) que compreende um domínio de tronco HA e um domínio de cabeça globular HA, em que: (1) o domínio de cabeça globular HA é heterólogo ao domínio de tronco HA; e (2) o domínio de tronco HA compreende um ou mais sítio de 30 glicosilação modificado(s), em que o(s) sítio(s) de glicosilação modificado(s) compreende(m) uma modificação para um sítio de glicosilação que interrompe/interfere na ligação de um glicano ao sítio de glicosilação no domínio de tronco. Em modalidades específicas, o sítio de 5 glicosilação modificado compreende uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural que possui uma sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, e em que Xaa é qualquer aminoácido. Em determinadas modalidades, o domínio de cabeça globular HA compreende ainda um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural que possuem uma sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido.
Em outra modalidade, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza não- quimérico (HA) que compreende um domínio de tronco HA e um domínio de cabeça globular HA, em que: (1) o domínio de cabeça globular HA é homólogo ao domínio de tronco HA, e (2) o domínio de tronco HA compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados, em que o(s) sítio(s) de glicosilação modificado(s) compreende(m) uma modificação em um sítio de glicosilação que interrompe/interfere na ligação de um glicano ao sítio de glicosilação no domínio de tronco. Em modalidades específicas, o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural que possui uma sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que a modificação interfere na capacidade de um glicano se ligar ao sítio de glicosilação modificado, em que Xaa é qualquer aminoácido.
Em outra modalidade, proporciona-se aqui a um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina (HA) de vírus influenza que compreende: um domínio de hemaglutinina de vírus influenza HAl que compreende um segmento de tronco 5 N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante de 1 a 50 resíduos heterólogos que é por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco curto C-terminal HA1; o dito domínio está em associação terciária ou quaternária com um domínio de hemaglutinina de vírus influenza HA2, em que o domínio de polipeptídeo de HA de domínio de tronco de vírus influenza compreende ainda um ou mais sítios de glicosilação modificado, em que o(s) sítio(s) de glicosilação modificado(s) compreendem) uma modificação em um sítio de glicosilação que interrompe/interfere na ligação de um glicano ao sítio de glicosilação no domínio de tronco. Em modalidades específicas, o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural que possui uma sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, onde a modificação interfere na capacidade um glicano se ligar ao sítio de glicosilação modificado, e em que Xaa é qualquer aminoácido.
Em outra modalidade, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza (HA) que compreende: um domínio de hemaglutinina de vírus influenza HA1 que compreende um segmento de tronco longo N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante de 1 a 50 resíduos heterólogos que é por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C- M1 30 terminal HAl; o dito domínio HAl está em associação terciária ou quaternária com um domínio de hemaglutinina de vírus influenza HA2, em que o domínio de polipeptidec de HA de domínio de tronco de vírus influenza compreende ainda um ou mais sítios de glicosilação modificados, em que o(s) 5 sítio(s) de glicosilação modificado(s) compreende(m) uma modificação em um sítio de glicosilação que interrompe/interfere na ligação de um glicano ao sítio de glicosilação no domínio de tronco.
Em modalidades específicas, o sítio de glicosilação modificado compreende 10 uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural que possui uma sequência de aminoácido Asn-Xaa- Ser/Thr/Cys, onde a modificação interfere na capacidade de um glicano se ligar ao sítio de glicosilação modificado, e em que Xaa é qualquer aminoácido. 15 Em outra modalidade, proporciona-se aqui um polipeptideo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza (HA) que compreende: um domínio de hemaglutinina de vírus influenza HA1 que compreende um segmento de tronco
N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante de 1 a 50 20 resíduos heterólogos que é por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco C-terminal HAl o dito domínio HA1 está em associação terciária ou quaternária com um domínio de hemaglutinina de vírus influenza HA2, em que o domínio de polipeptídeo de HA de domínio de tronco de
25 vírus influenza compreende ainda um ou mais sítios de glicosilação modificados, em que o(s) sítio(s) de glicosilação modificado(s) compreende(m) uma modificação em um sítio de glicosilação que interrompe/interfere na ligação de um glicano ao sítio de glicosilação no domínio 30 de tronco.
Em modalidades específicas, o sítio de glicosilação modificado compreende urna modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural que possui uma sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, onde a modificação interfere na capacidade de um glicano se ligar 5 ao sítio de glicosilação modificado, e em que Xaa é qualquer aminoácido.
Em outra modalidade, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza (HA) que compreende: um domínio de hemaglutinina de vírus influenza HA1 que compreende, ligado na seguinte ordem: um segmento de tronco N-terminal HA1, um primeiro ligante de 1 a 50 resíduos heterólogos, um segmento de tronco intermediário HAl, um segundo ligante de 1 a 50 resíduos heterólogos e um segmento de tronco C-terminal HA1; o dito domínio HAl está em associação terciária ou quaternária com um domínio de hemaglutinina de vírus influenza HA2, em que o domínio de polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza (HA) compreende ainda um ou mais sítios de glicosilação modificados, em que o(s) sitio(s) de glicosilação modificado(s) compreende(m) uma modificação em um sítio de glicosilação que interrompe/interfere na ligação de um glicano ao sítio de glicosilação no domínio de tronco. Em modalidades específicas, o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural que possui uma sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, onde a modificação interfere na capacidade de um glicano se ligar ao sítio de glicosilação modificado, e em que Xaa é qualquer aminoácido.
A invenção é ilustrada pelos Exemplos de trabalho (por exemplo, Seção 6, Exemplos) que demonstram, inter alia, a construção de um polipeptídeo HA de influenza quimérico que compreende um tronco HA e exibem uma cabeça HA 5 heteróloga, e a produção de uma proteína de HA quimérica estável desse polipeptídeo que reage de maneira cruzada com anticorpos no domínio de tronco e no domínio de cabeça.
Os Exemplos de trabalho também ilustram o uso dessas construções na geração de uma resposta imunológica protetora em indivíduos contra múltiplas cepas e subtipos diferentes de vírus influenza, isto é, os Exemplos demonstram que os polipeptídeos HA de vírus influenza quimérico descritos aqui podem ser usados como uma vacina contra influenza universal. Ademais, os Exemplos de trabalho (por exemplo, Seção 6.11, Exemplo 11) demonstram a construção de polipeptídeos HA de gripe que compreendem um domínio de tronco HA com um ou mais sítios de glicosilação modificados e/ou um domínio de cabeça globular HA com um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural, em que os sítios de glicosilação modificados são modificações em um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência natural que interferem na capacidade de um glicano se ligar aos sítios de glicosilação. Os Exemplos de trabalho (veja a Seção 6.11, Exemplo 11) também demonstram a capacidade de esses polipeptídeos HA de vírus influenza obterem uma resposta imunológica aumentada ao domínio de caule conservado de um vírus influenza.
3.1 TERMINOLOGIA Os termos "cerca de" ou "aproximadamente", quando usados em referência a uma aminoácido posição de aminoácido particular em uma sequência ou qualquer aminoácido que está dentro de cinco, quatro, três, dois, ou um resíduo daquela posição de aminoácido, em uma direção N-terminal ou uma direção C-terminal. 5 Como usado aqui, o termo "cerca de" ou
"aproximadamente" quando usados em conjunto com um número se refere a qualquer número dentro de 1, 5 ou 10% do número mencionado.
Em determinadas modalidades, o termo "cerca de" abrange o número exato citado. 10 0 termo "identidade de sequência de aminoácido"
se refere ao grau de identidade ou similaridade entre um par de sequências de aminoácido alinhadas, geralmente expresso como uma porcentagem.
A porcentagem de identidade é a porcentagem de resíduos de aminoácido em uma sequência 15 candidata que são idênticos (isto é, os resíduos de aminoácido em uma determinada posição no alinhamento são o mesmo resíduo) ou similares (isto é, a substituição de aminoácido em uma determinada posição no alinhamento é uma substituição conservadora, como discutido abaixo), ao 20 resíduo de aminoácido correspondente no peptídeo após alinhar as sequências e introduzir lacunas, se necessário, para obter a máxima porcentagem de homologia de sequência.
A homologia de sequência, inclusive as porcentagens de identidade de sequência e similaridade, podem ser
25 determinadas utilizando técnicas de alinhamento de sequência bem conhecidos, de preferência, algoritmos de computador desenhados para esse propósito, utilizando os parâmetros padrão de ditos algoritmos de computador ou dos pacotes de software contendo os mesmos.
Exemplos não 30 limitativas de algoritmos de computador e pacotes de software que incorporam esses algoritmos incluem os seguintes. A família BLAST de programas exemplificam um exemplo não limitativo particular de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências 5 (por exemplo, Karlin & Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268 (modificado como em Karlin & Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877), Altschul et a1., 1990, J. Moi. Bid. 215:403-410, (describing NBLAST and XBLAST), Altschul et a1., 1997, Nucleic Acids Res. 10 25:3389-3402 (que descreve Gapped BLAST, e PSI-Blast). Outro exemplo particular é o algoritmo de Myers e Miller (1988 CABIOS 4:11-17) que é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) e está disponível como parte do pacote de software de alinhamento de sequência GCG. Também o programa 15 FASTA é particular (Pearson W.R. and Lipman D.J., Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, 85:2444-2448, 1988), disponível como parte do Pacote de Análise de Sequência de Wisconsin. Exemplos adicionais incluem BESTFIT, que usa o algoritmo de "homologia local" de Smith and Waterman (Advances in 20 Applied Mathematics, 2:482-489, 1981) para encontrar a melhor região de similaridade entre duas sequências, e que é preferida onde as duas sequências que são comparadas são dissimilares em comprimento; e GAP, que alinha duas sequências ao encontrar uma "similaridade máxima" de acordo 25 com o algoritmo de Neddleman and Wunsch (J. Moi. Biol. 48:443-354, 1970), e é preferido onde as duas sequências possuem aproximadamente o mesmo comprimento e um alinhamento é esperado ao longo de todo o comprimento. "Substituição conservadora" se refere à 30 substituição de um aminoácido de uma classe por outro aminoácido da mesma classe. Em modalidades particulares, uma substituição conservadora não altera a estrutura ou função, ou ambas, de um polipeptídeo. As classes de aminoácidos para os propósitos de substituição conservadora 5 incluem hidrofóbicos (Met, Ala, Val, Leu, Ile), hidrofílicos neutros (Cys, Ser, Thr) , acídicos (Asp, Glu), básicos (Asn, Gin, His, Lys, Arg), ruptores de conformação (Gly, Pro) e aromáticos (Trp, Tyr, Phe).
Como usado aqui, o termo "fragmento" no contexto de uma sequência de ácido nucleico se refere a uma sequência de nucleotídeo que compreende uma porção de nucleotídeos consecutivos de uma sequência-pai. Em uma modalidade específica, o termo se refere a uma sequência de nucleotídeo de 5 a 15, 5 a 25, 10 a 30, 15 a 30, 10 a 60, 25 a 100, 150 a 300 ou mais nucleotídeos consecutivos de uma sequência-pai. Em outra modalidade, o termo se refere a uma sequência de nucleotídeo de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 150, 175, 200, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450 ou 475 nucleotídeos consecutivos de uma sequência-pai.
Como usado aqui, o termo "fragmento" no contexto de uma sequência de aminoácido se refere a uma sequência de aminoácido que compreende uma porção de resíduos de aminoácido consecutivos de uma sequência-pai. Em uma modalidade específica, o termo se refere a uma sequência de aminoácido de 2 a 30, 5 a 30, 10 a 60, 25 a 100, 150 a 300 ou mais resíduos de aminoácido consecutivos de uma sequência-pai. Em outra modalidade, o termo se refere a uma sequência de aminoácido de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30,
35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 125, 150, 175, ou 200 resíduos de aminoácido consecutivos de uma sequência-pai.
Como usado aqui, os termos "doença" e "distúrbio" 5 são usados de maneira intercambiável para se referirem a uma condição em um indivíduo. Em algumas modalidades, a condição é uma infecção viral. Em modalidades específicas, um termo "doença" se refere ao estado patológico resultante da presença do vírus em uma célula ou um indivíduo, ou pela 10 invasão de uma célula ou indivíduo pelo vírus. Em determinadas modalidades, a condição é uma doença em um indivíduo, cuja gravidade é reduzida ao induzir uma resposta imunológica no indivíduo através da administração de uma composição imunogênica. 15 Como usado aqui, o termo "quantidade eficaz" no contexto de administrar uma terapia a um indivíduo se refere à quantidade de uma terapia que possui um efeito profilático e/ou terapêutico. Em determinadas modalidades, uma "quantidade eficaz" no contexto de administração de uma 20 terapia a um indivíduo se refere à quantidade de uma terapia que é suficiente para obter um, dois, três, quatro, ou mais dos seguintes efeitos: (i) reduzir ou melhorar a gravidade de uma infecção por vírus influenza, doença ou sintoma associado a essa; (ii) reduzir a duração de uma 25 infecção por vírus influenza, doença ou sintoma associado a essa; (iii') impedir o progresso de uma infecção por virus influenza, doença ou sintoma associado a essa; (iv) causar a regressão de uma infecção por vírus influenza, doença ou sintoma associado a essa; (v) impedir o desenvolvimento ou 30 início de uma infeção por vírus influenza, doença ou sintoma associado a essa; (vi) impedir a recorrência de uma infecção por vírus influenza, doença ou sintoma associado a essa; (vii) reduzir ou impedir a disseminação de um vírus influenza a partir de uma célula para outra célula, um 5 tecido para outro tecido, ou um órgão para outro órgão; (ix)
impedir ou reduzir a disseminação de um vírus influenza de um indivíduo para outro indivíduo; (x) reduzir a falência do órgão associada a uma infecção por vírus influenza; (xi)
reduzir a hospitalização de um indivíduo; (xii) reduzir a o 10 período de tempo de hospitalização; (xiii) aumentar a sobrevivência de um indivíduo com uma infecção por vírus influenza, doença ou sintoma associado a essa; (xiv)
eliminar uma infecção por vírus influenza, doença ou sintoma associado a essa; (xv) inibir ou reduzir a
15 replicação de vírus influenza; (xvi) inibir ou reduzir a entrada de um vírus influenza em uma célula hospedeira; (xviii) inibir ou reduzir a replicação do genoma de vírus influenza; (xix) inibir ou reduzir a síntese de proteínas de vírus influenza; (xx) inibir ou reduzir a reunião de 20 partículas de vírus influenza; (xxi) inibir ou reduzir a liberação de partículas de vírus influenza de uma célula hospedeira; (xxii) reduzir o título de vírus influenza; e/ou (xxiii) aumentar ou intensificar o(s) efeito(s) profiláticos) ou terapêutico(s) de outra terapia. 25 Em determinadas modalidades, a quantidade eficaz não resulta em proteção completa de uma doença de vírus influenza, porém resulta em um título inferior ou número reduzido de vírus influenza comparado com um indivíduo não tratado.
Em determinadas modalidades, a quantidade eficaz 30 resulta em uma redução de 0,5 vez, 1 vez, 2 vezes, 4 vezes,
6 vezes, 8 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 75 vezes, 100 vezes, 125 vezes, 150 vezes, 175 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 750 vezes, ou 1.000 vezes ou mais em título de vírus influenza 5 em relação a um indivíduo não tratado. Em algumas modalidades, a quantidade eficaz resulta em uma redução em título de vírus influenza em relação a um indivíduo não tratado de aproximadamente 1 log ou mais, aproximadamente 2 logs ou mais, aproximadamente 3 logs ou mais, aproximadamente 4 logs ou mais, aproximadamente 5 logs ou mais, aproximadamente 6 logs ou mais, aproximadamente 7 logs ou mais, aproximadamente 8 logs ou mais, aproximadamente 9 logs ou mais, aproximadamente 10 logs ou mais, 1 a 3 logs, 1 a 5 logs, 1 a 8 logs, 1 a 9 logs, 2 a 10 logs, 2 a 5 logs, 2 a 7 logs, 2 logs a 8 logs, 2 a 9 logs, 2 a 10 logs 3 a 5 logs, 3 a 7 logs, 3 a 8 logs, 3 a 9 logs, 4 a 6 logs, 4 a 8 logs, 4 a 9 logs, 5 a 6 logs, 5 a 7 logs, 5 a 8 logs, 5 a 9 logs, 6 a 7 logs, 6 a 8 logs, 6 a 9 logs, 7 a 8 logs, 7 a 9 logs, ou 8 a 9 logs. Benefícios de uma redução no título, número ou carga total de vírus influenza incluem, porém sem se limitarem a, sintomas menos graves da infecção, menos sintomas da infecção e uma redução na duração da doença associados à infecção.
Como usado aqui, o termo "polipeptdeo de hemaglutinina de gripe" e "polipeptideo HA de gripe" se refere a (i) polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico (HA) descritos aqui; e (ii) quaisquer polipeptídeos descritos aqui que compreendem um domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza e/ou um domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza ou fragmento desse, em que cada domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados; o domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza compreende um ou mais 5 sítios de glicosilação de ocorrência não-natural; ou ambos.
Os polipeptídeos de gripe HA incluem, mas sem se limitarem a, polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico, polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe não-quimérico, polipeptideos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza e polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza.
Em uma modalidade específica, o polipeptídeo HA de gripe é um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados no domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que interrompe a ligação de glicano ao domínio de tronco; uma hemaglutinina de domínio de cabeça globular de vírus influenza que compreende um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural; ou ambos.
Em outra modalidade, o polipeptídeo HA de gripe é um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza (de ou a partir de qualquer cepa, subtipo, ou tipo de vírus influenza) que compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados no domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que interrompe a ligação de glicano ao domínio de tronco, uma hemaglutinina de domínio de cabeça globular de vírus influenza que compreende um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural; ou ambos.
Veja, por exemplo, Exemplo 11, infra, para esse polipeptídeo de gripe.
"Hemaglutinina" e "HA" se referem a qualquer hemaglutinina conhecida pelos elementos versados na técnica.
Em determinadas modalidades, a hemaglutinina é uma hemaglutinina de vírus influenza, como uma hemaglutinina de 5 vírus influenza A, uma hemaglutinina de vírus influenza B,
ou uma hemaglutinina de influenza C.
Uma hemaglutinina típica compreende domínios conhecidos pelos elementos versados na técnica que incluem um peptídeo de sinal (opcional aqui), um domínio de tronco, um domínio de cabeça globular, um domínio luminal (opcional aqui), um domínio de transmembrana (opcional aqui) e um domínio citoplásmico
(opcional aqui). Em determinadas modalidades, uma hemaglutinina consiste em uma única cadeia de polipeptídeo, como HAO.
Em determinadas modalidades, uma hemaglutinina consiste em mais de uma cadeia de polipeptídeo em associação quaternária, por exemplo, HA1 e HA2. Os elementos versados na técnica irão reconhecer que uma HAO imatura deve ser clivado para liberar um peptídeo de sinal
(aproximadamente 20 aminoácidos) que produz uma hemaglutinina HAO madura.
Uma hemaglutinina HAO deve ser clivada em outro sítio para produzir o polipeptídeo HAl (aproximadamente 320 aminoácidos, inclusive o domínio de cabeça globular e uma porção do domínio de tronco) e o polipeptideo HA2 (aproximadamente 220 aminoácidos, inclusive o restante do domínio de tronco, um domínio luminal, um domínio de transmembrana e um domínio citoplásmico). Em determinadas modalidades, uma hemaglutinina compreende um peptídeo de sinal, um domínio de transmembrana e um domínio citoplásmico.
Em determinadas modalidades, uma hemaglutinina é desprovida de um peptídeo de sinal, isto é, a hemaglutinina é uma hemaglutinina madura. Em determinadas modalidades, uma hemaglutinina é desprovida de um domínio de transmembrana ou domínio citoplásmico, ou ambos. Como usado aqui, os termos 5 "hemaglutinina" e 'HA" abrangem os polipeptídeos de hemaglutinina que são modificados por processamento pós- traducional como a clivagem de peptídeo de sinal, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação (por exemplo, glicosilação N--ligada), clivagem de protease e modificação lipídica (por exemplo, S-palmitoilação).
Como usado aqui, os termos "polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico", "polipeptídeo HA do vírus influenza quimérico", "polipeptídeo de hemaglutinina quimérica" e "polipeptideo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico" se referem a uma hemaglutinina de vírus influenza que compreende um domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza e um domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza, em que o domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Em determinadas modalidades, o domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico é de uma cepa ou subtipo de vírus influenza diferente daquela do domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Em determinadas modalidades, no contexto dos polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico descritos aqui, um domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza heterólogo se refere a uma cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que é pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos
20%, pelo menos 25%, pelo menos 5-10%, pelo menos 10-15%, pelo menos 10-20%, pelo menos 15-20%, ou pelo menos 20-25ó diferente da cabeça homóloga (isto é, o domínio de cabeça que poderia estar normalmente associado ao domínio de 5 tronco do polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico). Os elementos versados na técnica irão reconhecer que essa diferença pode ser medida utilizando abordagens conhecidas na técnica e descritas aqui, por exemplo, comparando-se a identidade de sequência ou homologia de sequência dos domínios de cabeça. Em determinadas modalidades, no contexto dos polipeptideos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico descritos aqui, um domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza heterólogo se refere a uma cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que, em um ensaio de inibição de hemaglutinação, resulta em antissoros com pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5, ou pelo menos 6 vezes menos títulos de inibição de hemaglutinação em relação aos títulos de inibição de hemaglutinação dos antissoros gerados contra as cabeças homólogas (isto é, o domínio de cabeça que poderia estar normalmente associado ao domínio de tronco do polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico). Os elementos versados na técnica irão reconhecer que essa diferença pode ser medida utilizando abordagens conhecidas na técnicã e descritas aqui (veja, por exemplo, Seção 5.14, infra) .
"Segmento de tronco N-terminal HA1" se refere a um segmento de polipeptídeo que corresponde á porção amino- terminal do domínio de tronco de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza HA1. Em determinadas modalidades, um segmento de tronco N-terminal HA1 consiste em resíduos de aminoácido que correspondem aproximadamente a aminoácidos HAlN _term a Ap de um domínio HA1. HA1N_term é o aminoácido N-terminal de HAl como reconhecido pelos 5 elementos versados na técnica. Ap é o resíduo de cisteína no segmento de tronco N-terminal HA1 que forma ou é capaz de formar uma ligação de dissulfeto com um resíduo de cisteína em um segmento de tronco C-terminal HA1. 0 resíduo Ap é identificado em polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza A na Figura 1. Segmentos de tronco N- terminais HAl exemplares são descritos aqui. Em determinadas modalidades, um segmento de tronco N-terminal HA1 consiste em resíduos de aminoácido que correspondem aproximadamente a aminoácidos 1-52 de HA1 de uma hemaglutinina H3. Nota-se que, nesse sistema de numeração, 1 se refere ao aminoácido N-terminal da proteína HAO madura, do qual o peptídeo de sinal foi removido. Os elementos versados na técnica serão capazes de reconhecer facilmente os resíduos de aminoácido que correspondem ao segmento de tronco N-terminal HAl de outros polipeptídeos HA de vírus influenza, por exemplo, os resíduos de aminoácido que correspondem ao segmento de tronco N-terminal HA1 de HAl de uma hemaglutinina H1 (veja, por exemplo, a Figura 1).
"Segmento de tronco C-terminal HA1" se refere a um segmento de polipeptídeo que corresponde à porção carbáxi-terminal do domínio de tronco de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza HAl. Em determinadas modalidades, um segmento de tronco C-terminal HAl consiste em resíduos de aminoácido que correspondem aproximadamente 30 a aminoácidos Aq a HAle -term de um domínio HAl. HAlc_tex.,C, é o aminoácido C-terminal do domínio HA1 como reconhecido por elementos versados na técnica. b resíduo Aq é identificado em polipeptídeos de hemaglutinina de vírus Influenza A na Figura 1. Os segmentos de tronco C-terminal HAl exemplares 5 são descritos aqui. Em determinadas modalidades, um segmento de tronco C-terminal HAl consiste em resíduos de aminoácido que correspondem aproximadamente a aminoácidos 277-346 de HA1 de uma hemaglutinina H3. Nota-se que, nesse sistema de numeração, 1 se refere ao aminoácido N-terminal da proteína HAD madura, do qual o peptídeo de sinal foi removido. Os elementos versados na técnica serão capazes de reconhecer facilmente os resíduos de aminoácido que correspondem ao segmento de tronco C-terminal HAl de outros polipeptideos HA de vírus influenza, por exemplo, os resíduos de aminoácido que correspondem ao segmento de tronco C-terminal HA1 de HAl de uma hemaglutinina H1 (veja, por exemplo, a Figura 1).
"Segmento de tronco curto C-terminal HAl" se refere a um segmento de polipeptídeo que corresponde à porção carboxila-terminal do domínio de tronco de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza HAl. Em determinadas modalidades, um segmento de tronco curto C- terminal HAl consiste em resíduos de aminoácido que correspondem aproximadamente a aminoácidos Bq a HA1c -term de um domínio HAl. o resíduo Bq é identificado em polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza A na Figura 1. Os segmentos de tronco curtos C-terminal HAl exemplares são descritos aqui. Em determinadas modalidades, um segmento de tronco curto C--terminal HA1 consiste em resíduos de aminoácido que correspondem aproximadamente a aminoácidos 305-346 de HAl de uma hemaglutinina H3. Nota-se que, nesse sistema de numeração, 1 se refere ao aminoácido N-terminal da proteína HAG madura, do qual o peptídeo de sinal foi removido.
5 "Segmento de tronco longo N-terminal HA1" se refere a um segmento de polipeptídeo que corresponde à porção amino-terminal do domínio de tronco de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza HA1. Em determinadas modalidades, um segmento de tronco longo N- 10 terminal HA1 consiste em resíduos de aminoácido que correspondem aproximadamente a aminoácidos HAl N _ tC a Cp de um domínio HAl. Cp é um resíduo de cisteína no segmento de tronco longo N-terminal HA1 que é ou é capaz de ser ligado a um resíduo de alanina em um segmento de tronco longo C- 15 terminal HA1. 0 resíduo Cp é identificado em polipept deos de hemaglutinina de vírus influenza A na Figura 1. Os segmentos de tronco longos N-terminal HA1 exemplares são descritos aqui. Em determinadas modalidades, um segmento de tronco longo N-terminal HAl consiste em resíduos de 20 aminoácido que correspondem aproximadamente a aminoácidos 1-97 de HAl de uma hemaglutinina H3. Nota-se que, nesse sistema de numeração, 1 se refere ao aminoácido N-terminal da proteína HAD madura, do qual o peptídeo de sinal foi removido. 25 "Segmento de tronco longo C-terminal HA1" se refere a um segmento de polipeptídeo que corresponde à porção carboxila-terminal do domínio de tronco de um polipeptídeo de hemaglutinina de virus influenza HAl. Em determinadas modalidades, um segmento de tronco longo C- 30 terminal HA1 consiste em resíduos de aminoácido que correspondem aproximadamente a aminoácidos Cq a HAlc_term de um domínio HAl.
Cq é um resíduo de alanina no segmento de tronco longo C-terminal HAl que é ou é capaz de ser ligado a um resíduo de cistina em um segmento de tronco longo N- 5 terminal HAl. d resíduo C. é identificado em polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza A na Figura 1. Os segmentos de tronco longos C-terminal HA1 exemplares são descritos aqui.
Em determinadas modalidades, um segmento de tronco longo C-terminal HAl consiste em resíduos de aminoácido que correspondem aproximadamente a aminoácidos
252-346 de HAl de uma hemaglutinina H3. Nota-se que, nesse sistema de numeração, 1 se refere ao aminoácido N-terminal da proteína HAD madura, do qual o peptídeo de sinal foi removido. 15 "HA2" se refere a um domínio de polipeptídeo que corresponde ao domínio HA2 de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza conhecido pelos elementos versados na técnica.
Em determinadas modalidades, uma HA2 consiste em um domínio de tronco, um domínio luminal, um domínio de transmembrana e um domínio citoplásmico (veja, por exemplo, Scheiffle et a1., 2007, EMBO J. 16(18):5501-
5508, cujos conteúdos estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade). Em determinadas modalidades, uma HA2 consiste em um domínio de tronco, um domínio luminal e um domínio de transmembrana.
Em determinadas modalidades, uma HA2 consiste em um domínio de tronco e um domínio luminal; nessas modalidades, a HA2 pode ser solúvel.
Em determinadas modalidades, uma HA2 consiste em um domínio de tronco; nessas modalidades, a HA2 pode ser solúvel.
Conforme usado aqui, o termo "`heterólogo" no contexto de um polipeptídeo, ácido nucleico ou vírus se refere a um polipeptídeo, ácido nucleico ou vírus, respectivamente, que não é normalmente encontrado na 5 natureza ou não está normalmente associado em natureza a um polipeptídeo, ácido nucleico ou vírus de interesse. Por exemplo, um "'polipeptídeo heterólogo" pode se referir a um polipeptídeo derivado de um vírus diferente, por exemplo, uma cepa ou subtipo de influenza diferente, ou um vírus não relacionado ou espécie diferente. Em modalidades específicas, quando usado no contexto de um domínio de cabeça globular de uma hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrita aqui, o termo heterólogo se refere a um domínio de cabeça globular de influenza HA que é associado a um domínio de tronco HA de vírus influenza que poderia não ser normalmente encontrado associado a esse (por exemplo, os domínios de cabeça e tronco da HA não poderiam ser encontrados em conjunto na natureza). Como descrito acima, em determinadas modalidades, um domínio de cabeça globular de influenza HA heterólogo de uma hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrita aqui e pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 5-10%, pelo menos 10-15%, pelo menos 10-20%, pelo menos 15-20%, ou pelo menos 20-25% diferente da cabeça homóloga da hemaglutinina (isto é, o domínio de cabeça que poderia ser normalmente associado ao domínio de tronco do polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico).
Como usado aqui, o termo "'em combinação", no contexto da administração de duas ou mais terapias a um indivíduo, se refere ao uso de mais de uma terapia (por exemplo, mais de um agente profilático e/ou agente terapêutico). 0 uso do termo "em combinação" não restringe a ordem na qual as terapias são administradas a um indivíduo. Por exemplo, uma primeira terapia (por exemplo, 5 um primeiro agente profilático ou terapêutico) pode ser administrada antes (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hour, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas antes), simultaneamente, ou subsequente (por exemplo, 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hour, 2 horas, 4 horas, 6 horas, 12 horas, 16 horas, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 96 horas, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 5 semanas, 6 semanas, 8 semanas, ou 12 semanas após) à administração de uma segunda terapia a um indivíduo.
Como usado aqui, o termo "infecção" significa a invasão, multiplicação e/ou presença de um vírus em uma célula ou um indivíduo. Em uma modalidade, uma infecção é uma infecção "ativa", isto é, uma em que o vírus se replica em uma célula ou um indivíduo. Essa infecção é caracterizada pela disseminação do vírus para outras células, tecidos, e/ou órgãos, das células, tecidos, e/ou órgãos inicialmente infectados pelo vírus. Uma infecção também pode ser uma infecção latente, isto é, uma em que o vírus não está se replicando. Em determinadas modalidades, uma infecção se refere ao estado patológico que resulta da presença do virus em uma célula ou um indivíduo, ou pela invasão de uma célula ou indivíduo pelo vírus.
Como usado aqui, o termo "doença de vírus influenza" se refere ao estado patológico resultante da presença de um vírus influenza (por exemplo, vírus influenza A ou B) em uma célula ou indivíduo ou a invasão 5 de uma célula ou indivíduo por um vírus influenza. Em modalidades específicas, o termo se refere a uma doença respiratória causada por um vírus influenza.
Como usado aqui, as frases `sistema deficiente de IFN" ou "substrato deficiente de IFN" se referem a sistemas, por exemplo, células, linhagens celulares e animais, como porcos, camundongos, galinhas, perus, coelhos, ratos, etc., que não produzem IFN ou produzem baixos níveis de IFN (isto é, uma redução na expressão de IFN de 5-10%, 10-20%, 20-30%, 30-40%, 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90% ou mais quando comparado com sistemas competentes de IFN sob as mesmas condições), não respondem ou respondem de maneira menos eficiente a IFN, e/ou são deficientes na atividade de um ou mais genes antivirais induzidos por IFN.
Como usado aqui, o termo numérico "log" se refere 20 a log10 .
Como usado aqui, o termo "sítio de glicosilação modificado" se refere a um sítio de glicosilação de ocorrência natural em um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza que foi modificado pela adição, substituição ou deleção de um ou mais aminoácidos. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação modificado é incapaz de se ligar a glicano. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação modificado interrompe ou interfere na glicosilação no sítio de glicosilação modificado. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação modificado não interfere no enovelamento apropriado de um polipeptídeo HA de gripe (por exemplo, um polipeptídeo HA do vírus influenza quimérico) descrito aqui. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação 5 modificado compreende uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural que possui o motivo de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido. Em particular modalidades, o sítio de glicosilação modificado compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que possui o motivo de aminoácido Asn- Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido.
Como usado aqui, a frase "multiplicidade de infecção" ou "MOI" é o número médio de partículas virais infecciosas por célula infectada. A MOI é determinada ao dividir o número de partículas virais infecciosas adicionadas (ml adicionado x PFLI/ml) pelo número de células adicionadas (ml adicionado x células /ml).
Como usado aqui, o termo "polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza não-quimérico" se refere a um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza que compreende um domínio de tronco HA e um domínio de cabeça HA do mesmo subtipo ou cepa, e em que o polipeptídeo compreende um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural como discutido na Seção 5.4.2, infra, e/ou um ou mais sítios de glicosilação modificados como discutido na Seção 5.4.1, infra. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza não- quimérico compreende um domínio de tronco HA e um domínio de cabeça globular HA do mesmo subtipo de vírus influenza.
Em modalidades específicas, o subtipo de vírus influenza é um subtipo Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, HiO, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de vírus 5 influenza não-quimérico compreende um domínio de tronco HA e domínio de cabeça globular HA da mesma cepa de vírus influenza. Em determinadas modalidades, a cepa de vírus influenza é A/Netherlands/602/2009.
Como usado aqui, o termo "sítio de glicosilação de ocorrência não-natural" se refere a um sítio de glicosilação que fica localizado em quaisquer posições de aminoácido dentro de um domínio de cabeça globular particular onde um sítio de glicosilação de ocorrência natural, em relação a um subtipo ou cepa particular de HA, não está localizado. Um exemplo de um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural é a adição de um sítio de glicosilação ao domínio de cabeça globular de uma hemaglutinina de vírus influenza de um subtipo, em que a glicosilação é naturalmente encontrada no domínio de cabeça globular de uma hemaglutinina de um vírus influenza de outro subtipo. Outro exemplo de uma glicosilação de ocorrência não-natural é a adição de um sítio de glicosilação ao domínio de cabeça globular de uma hemaglutinina de vírus influenza de uma cepa, em que o sítio de glicosilação é naturalmente encontrado na cabeça globular de uma hemaglutinina de outra cepa de vírus influenza. Ainda outro exemplo de um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural é a adição de um sítio de glicosilação ao domínio de cabeça globular de uma hemaglutinina de vírus influenza de uma cepa, em que o sítio de glicosilação não é naturalmente encontrado na cabeça globular de uma hemaglutinina de outro subtipo ou cepa de vírus influenza. Em modalidades preferidas, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural possui o motivo 5 de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido , ou, em determinadas modalidades, em que Xaa é qualquer aminoácido exceto Pro.
Como usado aqui, o termo "ácido nucleico" pretende incluir moléculas de DNA (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) e moléculas de RNA (por exemplo, mRNA) e análogos do DNA ou RNA gerados utilizando análogos de nucleotídeo. 0 ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla.
"Polipeptídeo" se refere a um polímero de aminoácidos ligados por ligações de amida como conhecido pelos elementos versados na técnica. Como usado aqui, o termo pode se referir a uma única cadeia de polipeptídeo ligada por ligações de amida covalentes. C termo também pode se referir a múltiplas cadeias de polipeptídeo associadas por interações não-covalentes como contatos iônicos, ligações de hidrogênio, contatos de Van der Waals e contatos hidrofóbicos. os elementos versados na técnica irão reconhecer que o termo inclui polipeptídeos que foram modificados, por exemplo, por processamento pós-traducional como clivagem de peptídeo de sinal, formação de ligação de dissulfeto, glicosilação (por exemplo, glicosilação N- ligada), clivagem de protease e modificação lipídica (por exemplo S-palmitoilação). Como usado aqui, os termos "prevenir", "previne" e "prevenção" no contexto da administração de uma terapia a um indivíduo para prevenir uma doença de vírus influenza se referem a um ou mais efeitos profiláticos/benéficos resultante da administração de uma terapia ou uma combinação de terapias.
Em uma modalidade específica, os 5 termos "prevenir", "previne" e "prevenção" no contexto da administração de uma terapia a um indivíduo para prevenir uma doença de vírus influenza se referem a um ou mais dos seguintes efeitos resultantes da administração de uma terapia ou uma combinação de terapias: (i) a inibição do 10 desenvolvimento ou início de uma doença de vírus influenza ou um sintoma dessa; (ii) a inibição da recorrência de uma doença de vírus influenza ou um sintoma associado a essa; e (iii) a redução ou inibição em infecção e/ou replicação de vírus influenza. 15 Como usado aqui, os termos "purificado" e
"isolado" quando usados no contexto de um polipeptídeo (inclusive um anticorpo) que é obtido de uma origem natural, por exemplo, células, se referem a um polipeptídeo que é substancialmente livre de materiais contaminantes da origem 20 natural, por exemplo, partículas de sujeira, minerais, substâncias químicas do ambiente, e/ou materiais celulares da origem natural, como, mas sem se limitarem a, resíduos celulares, materiais de parede celular, organelas, a massa dos ácidos nucleicos, carboidratos, proteínas, e/ou 25 lipídeos presentes em células.
Assim, um polipeptídeo que é isolado inclui preparações de um polipeptídeo que possui menos que cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, 2%, ou 1% (por peso seco) de materiais celulares e/ou materiais contaminantes.
Como usado aqui, os termos "purificado" e "isolado" quando 30 usados no contexto de um polipeptídeo (inclusive um anticorpo) que é quimicamente sintetizado se referem a um polipeptídeo que é substancialmente livre de precursores químicos ou outras substâncias químicas que estão envolvidas na síntese do polipeptídeo. Em uma modalidade 5 específica, um polipeptídeo HA de gripe (por exemplo, um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza, um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico e/ou um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza não- quimérico) é quimicamente sintetizado. Em outra modalidade específica, um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza, um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza, e/ou um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico é isolado.
Como usado aqui, os termos "replicação", "replicação viral" e "replicação de vírus" no contexto de um vírus se referem a um ou mais, ou todos os estágios de um ciclo de vida viral que resultam na propagação de vírus.
As etapas de um ciclo de vida viral incluem, mas sem se limitarem a, ligação de vírus na superfície de célula hospedeira, penetração ou entrada da célula hospedeira (por exemplo, através de endocitose mediada por receptor ou fusão de membrana), descapsidação (o processo por meio do qual o capsídeo viral é removido e degradado por enzimas virais ou enzimas de hospedeiro liberando assim o ácido nucleico genõmico viral), replicação de genoma, síntese de RNA mensageiro viral (mRNA), síntese proteica viral, e reunião de complexos de ribonucleoproteína viral para replicação de genoma, arranjo de partículas de vírus, modificação pós-traducional das proteínas virais, e a liberação da célula hospedeira por lise ou germinação e aquisição de um envelope de fosfolipídeo que contém 5 glicoproteínas virais incorporadas. Em algumas modalidades, os termos "replicação", "replicação viral" e "replicação de vírus" se referem à replicação do genoma viral. Em outras modalidades, os termos "replicação", "replicação viral" e "replicação de vírus" se referem à síntese de proteínas 10 virais.
Como usado aqui, os termos "polipeptídeo de domínio de tronco" e "polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza" se referem a um derivado, por exemplo, um derivado modificado por engenharia genética, de um polipeptídeo de hemaglutinina que compreende uma ou mais cadeias de polipeptídeo que constituem um domínio de tronco de hemaglutinina. Um polipeptídeo de domínio de tronco pode ser uma única cadeia de polipeptídeo, duas cadeias de polipeptídeo ou mais cadeias de polipeptídeo. Tipicamente, um polipeptídeo de domínio de tronco é uma única cadeia de polipeptídeo (isto é correspondente ao domínio de tronco de um polipeptídeo de hemaglutinina HAO) ou duas cadeias de polipeptídeo (isto é correspondentes ao domínio de tronco de um polipeptídeo de hemaglutinina HAl em associação a um polipeptídeo de hemaglutinina HA2). Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de domínio de tronco é derivado de uma hemaglutinina de vírus influenza. Em modalidades específicas, um polipeptídeo de domínio de tronco é derivado de uma hemaglutinina de vírus influenza H1 ou H3. Os polipeptídeos de domínio de tronco modificados por engenharia genética compreendem um ou mais ligantes como descrito abaixo.
Como usado aqui, os termos "polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza", 5 "domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza", "domínio de cabeça globular HA", e "domínio de cabeça HA" se referem ao domínio de cabeça globular de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza. Um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza ou domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza pode compreender ou consistir em um domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza conhecido (por exemplo, tipo selvagem) ou pode compreender ou consistir em um derivado, por exemplo, um derivado modificado por engenharia genética, de um domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza conhecido (por exemplo, tipo selvagem).
Como usado aqui, os termos "indivíduo" ou "paciente" são usados de maneira intercambïável para se referirem a um animal (por exemplo, aves, répteis, e mamíferos). Em uma modalidade específica, um indivíduo é uma ave. Em outra modalidade, um indivíduo é um mamífero que inclui um não-primata (por exemplo, um camelo, burro, zebra, vaca, porco, cavalo, cabra, ovelha, gato, cachorro, rato, e camundongo) e um primata (por exemplo, um macaco, chimpanzé, e um humano) . Em determinadas modalidades, um indivíduo é um animal não-humano. Em algumas modalidades, um indivíduo é um animal de fazenda ou doméstico. Em outra modalidade, um indivíduo é um humano. Em outra modalidade, um indivíduo é um bebê. Em outra modalidade, um indivíduo é uma criança. Em outra modalidade, um indivíduo é um adulto. Em outra modalidade, um indivíduo é um idoso. Em outra modalidade, um indivíduo é um bebê prematuro.
Como usado aqui, o termo "bebê prematuro" se 5 refere a um bebê nascido com menos de 37 semanas de idade gestacional.
Como usado aqui, o termo "bebê" se refere a um recém-nascido até 1 ano de idade.
Como usado aqui, o termo "criança" se refere a um 10 humano que tem 1 ano a 18 anos de idade.
Como usado aqui, o termo "adulto" se refere a um humano que tem 18 anos ou mais.
Como usado aqui, o termo "idoso" se refere a um humano com 65 anos ou mais. 15 Os termos "estrutura terciária" e "estrutura quaternária" possuem os significados entendidos pelos elementos versados na técnica. A estrutura terciária se refere à estrutura tridimensional de uma única cadeia de polipeptideo. A estrutura quaternária se refere à estrutura 20 tridimensional de um polipeptídeo que possui múltiplas cadeias de polipeptídeo.
Como usado aqui, o termo "cepa de vírus influenza sazonal" se refere a uma cepa de vírus influenza à qual uma população de indivíduos é exposta em uma base sazonal. Em 25 modalidades específicas, o termo cepa de vírus influenza sazonal se refere a uma cepa de vírus influenza A. Em modalidades específicas, o termo cepa de vírus influenza sazonal se refere a uma cepa de vírus influenza que pertence ao subtipo H1 ou H3, isto é, os dois subtipos que 30 atualmente persistem na população de indivíduos humanos. Em r outras modalidades, o termo cepa de vírus influenza sazonal se refere a uma cepa de vírus influenza B.
Como usado aqui, os termos "terapias" e "terapia" podem se referir a qualquer/quaisquer protocolo(s), 5 método(s), composto(s), composição(ões), formulação (ões), e/ou agente(s) que podem ser usados na prevenção ou tratamento de uma infecção viral ou uma doença ou sintoma associado a essa. Em determinadas modalidades, os termos "terapias" e "terapia" se referem à terapia biológica, 10 terapia de suporte, e/ou outras terapias úteis no tratamento ou prevenção de uma infecção viral ou uma doença ou sintoma associado a essa conhecidas por um elemento versado na técnica. Em algumas modalidades, o termo "terapia" se refere a (i) um ácido nucleico que codifica um 15 polipeptídeo HA de gripe (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico), (ii) um polipeptídeo HA de gripe (por exemplo, polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico), ou (iii) um vetor ou composição que compreende um ácido nucleico que 20 codifica um polipeptídeo HA de gripe (por exemplo, polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) ou compreende um polipeptídeo HA de gripe. Em algumas modalidades, o termo "terapia" se refere a um anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo de hemaglutinina 25 de vírus influenza quimérico.
Como usado aqui, os termos `tratar," "tratamento", e "tratando" se referem no contexto de administração de uma terapia(s) a um indivíduo para tratar uma doença ou infecção por vírus influenza para obter um efeito benéfico 30 ou terapêutico de uma terapia ou uma combinação de terapias.
Em modalidades específicas, esses termos se referem a um, dois, três, quatro, cinco ou mais dos seguintes efeitos que resultam da administração de uma terapia ou uma combinação de terapias: (i) a redução ou melhora da gravidade de uma 5 infecção por vírus influenza ou uma doença ou um sintoma associado a essa; (ii) a redução na duração de uma infecção por vírus influenza ou uma doença ou um sintoma associado a essa; (iii) a regressão de uma infecção por vírus influenza ou uma doença ou um sintoma associado a essa; (iv) a redução do titulo de um vírus influenza; (v) a redução em falência de órgão associada a uma infecção por vírus influenza ou uma doença associada a essa; (vi) a redução na hospitalização de um indivíduo; (vii) a redução no período de tempo de hospitalização; (viii) o aumento na sobrevivência de um indivíduo; (ix) a eliminação de uma infecção por vírus influenza ou uma doença ou sintoma associado a essa; (x) a inibição do progresso de uma infecção por vírus influenza ou uma doença ou um sintoma associado a essa; (xi) a prevenção da disseminação de um vírus influenza de uma célula, tecido, órgão ou indivíduo para outra célula, tecido, órgão ou indivíduo; (xii) a inibição ou redução na entrada de um vírus influenza em uma célula hospedeira; (xiii) a inibição ou redução na replicação de um genoma de vírus influenza; (xiv) a inibição ou redução na síntese de proteínas de vírus influenza; (xv) a inibição ou redução na liberação de partículas de vírus influenza de uma célula hospedeira; e/ou (xvi) o aumento ou melhora do efeito terapêutico de outra terapia.
Como usado aqui, em algumas modalidades, a frase "tipo selvagem" no contexto de um vírus se refere aos tipos de um vírus que são prevalentes, circulando naturalmente e produzindo ocorrências típicas de doença. Em outras 5 modalidades, o termo `tipo selvagem" no contexto de um vírus se refere a um vírus-pai.
4. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 apresenta um alinhamento de sequência por CLUSTALW de sequências representativas de 16 subtipos de hemaglutinina de vírus influenza A (SEQ ID NOS:1-16, respectivamente). 0 resíduo designado AF é o resíduo de cisteína no segmento de tronco N-terminal HA1 que forma ou é capaz de formar uma ligação de dissulfeto com o resíduo designado Aq , um resíduo de cisteína em um segmento de tronco C-terminal HA1. 0 resíduo designado Bq representa o aminoácido N-terminal próximo dos segmentos de tronco curtos C-terminal HA1 descritos aqui. O resíduo designado Cq representa o aminoácido N-terminal próximo dos segmentos de tronco longos C-terminal HAl descritos aqui. 0 resíduo designado Cp representa o aminoácido C-terminal próximo dos segmentos de tronco longos N-terminal HA.l descritos aqui. A Figura 2 apresenta um alinhamento de sequência por CLUSTALW de uma sequência representativa de hemaglutinina de vírus influenza B (SEQ ID NO:558) alinhada com as hemaglutininas HK68-H3N2 (SEQ ID NO:3) e PR8-H1N1 (SEQ ID NO:1) de influenza A.
A Figura 3 apresenta uma listagem de sequência de hemaglutinina de virus influenza B (SEQ ID NO:17), apontando os aminoácidos que constituem os limites de vários segmentos de tronco N- e C- terminais e segmentos de tronco intermediários descritos aqui. A Figura 4 fornece estruturas putativas de polipeptídeos de domínio de tronco HA de influenza A 5 baseados em uma proteína de hemaglutinina HK68-H3N2. A Figura 4A fornece a estrutura putativa de um polipeptídeo de domínio de tronco HA de influenza A com base em uma proteína de hemaglutinina HK68-H3N2, segmento de tronco N- terminal HAl SEQ ID NO:36 e segmento de tronco C-terminal 10 SEQ ID NO:52. A Figura 4B fornece a estrutura putativa de um polipeptídeo de domínio de tronco curto HA de influenza A com base em uma proteína de hemaglutinina HK68-H3N2, segmento de tronco N-terminal HA1 SEQ ID NO:36 e segmento de tronco curto C-terminal SEQ ID NO:352. A Figura 4C 15 fornece a estrutura putativa de um polipeptídeo de domínio de tronco longo HA de influenza A com base em uma proteína de hemaglutinina HK68-H3N2, segmento de tronco longo N- terminal HAl SEQ ID NO:417 e segmento de tronco longo C- terminal SEQ ID NO:433. 20 A Figura 5 fornece estruturas putativas de polipeptídeos de domínio de tronco HA de influenza A com base em uma proteína de hemaglutinina PR8-H1N1. A Figura 5A fornece a estrutura putativa de um polipeptídeo de domínio de tronco HA de influenza A com base em uma proteína de 25 hemaglutinina PR8-H1N1, segmento de tronco N-terminal HAl SEQ ID NO:18 e segmento de tronco C-terminal SEQ ID N0:34.
A Figura SB fornece a estrutura putativa de um polipeptídeo de domínio de tronco curto HA de influenza A, segmento de tronco N-terminal HAl SEQ ID NO:18 e segmento de tronco 30 curto C-terminal SEQ ID NO:350. A Figura 5C fornece a estrutura putativa de um polipeptídeo de domínio de tronco longo HA de influenza A com base em uma proteína de hemaglutinina PR8-HÍN1, segmento de tronco longo N-terminal HAl SEQ ID NO:414 e segmento de tronco longo C-terminal SEQ 5 ID NO:430.
A Figura 6 fornece estruturas putativas de polipeptídeos de domínio de tronco HA de influenza B. A Figura 6A fornece uma molécula de HA parcialmente sem cabeça com base na proteína de hemaglutinina B/Hong Kong/8/73, em que os primeiros 94 aminoácidos do domínio HAl da HA são retidos (SEQ ID NO:550), e onde Cys94 está diretamente ligada à Cys143 do domínio HA1 (SEQ ID NO: 553), por meio de uma ponte de ligante. A Figura 6B mostra uma molécula de HA parcialmente sem cabeça com base na proteína de hemaglutinina B/Hong Kong/8/73, em que os primeiros 178 aminoácidos do domínio HA1 da HA são retidos (SEQ ID NO:551), e onde Cys178 é diretamente ligada à Cys272 do domínio HA1 (SEQ ID NO:554), por meio de uma ponte de ligante. A Figura, 6C mostra uma molécula de HA sem cabeça com base na proteína de hemaglutinina B/Hong Kong/8/73, em que os primeiros 94 aminoácidos do domínio HA1 da HA são retidos (SEQ ID NO:555), e onde Cys94 está diretamente ligada à Cys143 do domínio HA1, por meio de uma ponte de ligante. Os aminoácidos 143 a 178 do domínio HA1 são ainda retidos (SEQ ID NO:556), e Cys178 é diretamente ligada à Cys272 do domínio HA1 (SEQ ID NO:557), por meio de uma ponte de ligante. A Figura 6D mostra uma molécula de HA sem cabeça com base na proteína de hemaglutinina B/Hong Kong/8/73, em que os primeiros 54 aminoácidos do domínio HAl da HA são retidos (SEQ ID NO:552), e onde Cys54 é diretamente ligada à Cys272 do domínio HAl (SEQ ID NO:554), por meio de uma ponte de ligante. A Figura 7 fornece um esquema de HAs quiméricas com um domínio de caule H1 conservado e domínios de cabeça 5 globular diferentes de subtipos de HA diferentes. A Figura 8 fornece uma nova vacina contra influenza e uma plataforma de ferramenta de diagnóstico para induzir e analisar os anticorpos e soro reativo. A) Expressão de HAs quiméricas. As HAs quiméricas que 10 consistem no domínio de caule de A/PR8/34 HA e no domínio de cabeça globular de A/California/4/09 (HA quimérica) bem como HAs tipo selvagem (PR8-HA e CAL09-HA) e um controle GFP foram expressos em células 293T. O ensaio Western blot superior sondado com um anticorpo PR8-específico (PY102) 15 enquanto o blot no lado inferior foi sondado com um anticorpo específico de Cal©9 (39C2). B) Desenho esquemático de construções de HA expressas em A. A quimérica é composta do domínio de caule HA A/PR/8/34 e do domínio de cabeça globular 2009 A/California/04/09. 20 A Figura 9 fornece um esquema de HAs quiméricas.
A) Estrutura básica de uma HA quimérica. A cabeça globular pode ser trocada convenientemente em ligação de dissulfeto Cys 52-Cys 277. B) Regime de preparação-estímulo com administração sequencial de HAs quiméricas que consistem em 25 um domínio de caule completamente conservado e um domínio de cabeça globular variado. A Figura 10 descreve a geração de uma HA quimérica com o caule de uma HA H1 e a cabeça globular de uma HA H3. Uma HA quimérica que consiste no domínio de 30 caule de A/PR8/34 HA e no domínio de cabeça globular de
HK/68 (H3 quimérica) bem como HAs tipo selvagem (PR8-HA e HK68 HA) foram expressas em células 293T.
C ensaio Western blot superior foi sondado com um anticorpo PR8-específico enquanto o blot no lado inferior foi sondado com um 5 anticorpo especifico de H3. A Figura li mostra uma comparação de sequência das sequências de proteína de hemaglutinina de A/Hong Kong/1/1968 (H3), A/Perth/16/2009 (H3), A/PR/8/34 (Hl), A/Cal/4/09 (H1), A/Viet Nam/1203/04 (H5), e
10 A/mallard/Alberta/24/01 (H7). Os resíduos de aminoácido
Cys52 e Cys272 são especificados (com base na numeração H3). A sombra preta indica os aminoácidos conservados.
A linha ondulada preta representa a região de cabeça globular de HAs.
Os pontos de partida de HAl e HA2 são indicados. 15 A Figura 12 mostra um esquema de hemaglutininas quiméricas. (A) Diagrama de construção da HA PR8-cH1 quimérica.
A HA quimérica foi construída ao trocar o domínio de cabeça globular localizado entre Cys52 e Cys277 de HA A/PR/8/34(H1) por aquela da HA A/California/4/09(Hl). 20 A HA quimérica resultante possui a região de caule de HA A/PR8/34 (Hl) com um domínio de cabeça globular da HA A/California/4/09 (H1) designado como PR8-cHl. (B) Esquema das estruturas enoveladas de HAs tipo selvagem e quiméricas diferentes, como HA PR8 tipo selvagem, a HA quimérica PR8- 25 cHl, a HA quimérica PR8-cH5, a HA Perth tipo selvagem, e a
HA quimérica Perth-cH7 (da esquerda para a direita). As estruturas de HA de comprimento completo foram transferidas do Banco de Dados de Proteínas (PDB) : HA PR8 (PDB ID 1RU7) e HA Perth (representadas por HA HK68, PDB ID 1MQN). 30 Imagens finais foram geradas com PyMol (Delano Scientific).
A Figura 13 mostra a expressão de superfície e a análise funcional de construções de HA quimérica. (A) A expressão de superfície de construções de HA quimérica foi avaliada em células temporariamente transfectadas. 24 h 5 após a transfecção, as células 293T foram tripsinizadas e a expressão de superfície celular de proteínas de HA quimérica foi analisada por citometria de fluxo. Nos painéis superiores, as células transfectadas por simulação (região sombreada à esquerda) são comparadas com as células transfectadas com HA PR8 (direita) ou células transfectadas com PR8-cHl (direita) ou PR8-cH5 (direita). Nos painéis inferiores, as células transfectadas por simulação (região sombreada à esquerda) são comparadas com as células transfectadas com construções Perth e Perth-cH7 (direita).
(B) Pseudo-partículas de codificação de Luciferase que expressam HAs quiméricas foram usadas para infectar as células MDCK. As unidades relativas de luz (RLU) geradas no ensaio de luciferase indicam que as pseudopartículas que expressam as HAs quiméricas foram capazes de entrar nas células.
A Figura 14 descreve a geração de vírus recombinantes que contêm hemaglutininas quiméricas. (A) Análise Western blot dos vírus recombinantes. Extratos de células MDCK infectadas por simulação ou infectadas com os vírus indicados (16 hpi) em uma MOI de 2 foram preparados e sondados com anticorpos: anti-A/PR8/HA(H1) (PY102), anti- A/Cal/09/HA(H1) (29C1), anti-A/VN/HA(H5) (MOO), anti-H3/HA (12D1), anti-H7 (NR -3125), anti-A/NP (HT103) e anti-GAPDH como um controle de carregamento interno. (B) Análise de imunofluorescência das células MDCK infectadas com vírus recombinantes utilizando anticorpos: vírus anti-A/NP (HT103), anti-A/Hl HA (6F12), anti-A/PR8/HA (PY102), anti- A/Cal/09/HA (29C1), anti-A/VN/HA (M08), anti-H3/HA (12D1), e anti-A/H7 (NR-3152). 5 A Figura 15 descreve a cinética de crescimento e fenótipos de placa de vírus recombinantes. (A) Ovos de galinha embrionados de 10 dias foram infectados com um vírus tipo selvagem ou recombinante 100 pfu por ovo e o crescimento viral monitorado durante 72 horas após a 10 infecção. (B) 0 fenótipo de placa de vírus recombinantes foi avaliado por ensaio de placa. As células MDCK foram infectadas com um vírus tipo selvagem ou recombinante e 48 horas após a infecção foram imunocoradas para revelar o fenótipo de placa utilizando o anticorpo contra A/NP 15 (HT103).
A Figura 16 mostra uma análise de imunofluorescência de células transfectadas com hemaglutinina H6 quimérica. As células 293T foram transfectadas com 1 pg de plasmídeo pCAGOS que expressa a 20 hemaglutinina H6 quimérica. Os soros de animais que receberam o DNA (A), infecção por Cal/09 (B), DNA e infecção por Cal/09 (C), ou vacina dividida Cal/09 (D) foram adicionados às células transfectadas e visualizados por microscopia de fluorescência após a incubação com um 25 IgG anti-camundongo 594-conjugado Alexa Fluor.
A Figura 17 demonstra que a preparação de DNA e estímulo de vírus quimérico conferem proteção a animais desafiados com o desafio de vírus influenza letal. Os animais foram tratados com DNA individualmente, vírus 30 quimérico H9 individualmente, preparação de DNA e estímulo de vírus quimérico H9, ou com vírus PR8 inativado. Os camundongos foram então desafiados com 5 x 10 4 PFU de vírus PR8, instilados de maneira intranasal, e o peso dos animais foi monitorado durante 14 dias. 5 A Figura 18 demonstra a reatividade de anticorpos específicos de caule à proteína cH6 como determinado por ELISA.
A Figura 19 mostra a estrutura de trímero de hemaglutinina A/PR/8/34 H1 que possui um domínio de tronco 10 e um domínio de cabeça globular. 0 trímero de hemaglutinina é mostrado sem glicanos (A), em forma tipo selvagem, com estruturas de glicano (B), e em forma mutante em que as estruturas de glicano são removidas do domínio de caule e adicionadas ao domínio de cabeça globular (C). 15 A Figura 20 mostra as sequências de hemaglutinina A/PR/8/34 (PR8) e A/HK/1/68 (HK68) (HA). Os aminoácidos que formam o domínio de tronco estão em uma caixa. As cisteínas ("C") que formam a borda entre o caule e o domínio de cabeça globular são aquelas mostradas após a primeira caixa 20 de aminoácidos que forma o domínio de tronco e antes da segunda caixa de aminoácidos que forma o domínio de tronco. Os aminoácidos restantes (os aminoácidos que não estão em caixas, não incluindo as cisteínas presentes após a primeira caixa de aminoácidos que forma o domínio de tronco 25 e antes da segunda caixa de aminoácidos que forma o domínio de tronco) são aqueles que formam o domínio de cabeça globular. Os sítios de glicosilação de ocorrência natural são indicados por letras escuras nas seções de aminoácidos correspondentes ao domínio de cabeça globular. A 30 transmembrana e o ectodomínio são representados pelo estiramento destacado de aminoácidos no final de cada sequência. Os sítios de glicosilação que podem ser modificados para interromper a ligação de glicanos ao domínio de tronco são indicados; esses incluem as seguintes 5 sequências: NNST, NVT, NSS, NGT (in HA PR8) e NST, NGT, NAT, NGS, NGT (in HA HK68).
A Figura 21 mostra um desenho esquemático de sítios antigênicos imunodominantes no domínio de cabeça globular de um monômero de hemaglutinina de vírus influenza 10 (Hl) (A). As mutações exemplares que introduzem os sítios de glicosilação de ocorrência não-natural nos sítios antigênicos de hemaglutinina H1 A/Pr/8/34 (B). Esses sítios de glicosilação de ocorrência não-natural são indicados pelo motivo de aminoácido N-Xaa-S/T, em que Xaa pode ser qualquer aminoácido.
A Figura 22 mostra a aquisição de sítios de glicosilação em HA de subtipo H1 humano ao longo do tempo (até e inclusive o vírus 2009 . H1N1, e outro vírus influenza 2009). Q alinhamento de aminoácido de sítios antigênicos na 20 HAl de cepas de HIN1 sazonais que circulam em humanos desde 1918 e antes do surgimento do vírus pandêmico 2009 H1N1 (A). Para simplicidade, o alinhamento foi feito com cepas de referência prototípicas selecionadas e cepas de vacina obtidas do banco de dados Influenza Research Database e do banco de dados Influenza Virus Resource Database (os números de acesso são listados nos métodos). Os anos não representados correspondem à ausência de uma sequência isolada para aquele ano ou uma sequência prototípica não evidente devido a poucas sequências disponíveis. As regiões sombreadas mostram os sítios antigênicos conhecidos listados na parte superior. O texto em caixas nas regiões designadas 1, 2, e 3 representa a glicosilação conservada; o texto em caixas nas regiões designadas 4, 5, 6, e 7 representa as glicosilações que aparecem ao longo do tempo. 5 A linha do tempo mostra o ano de aquisição de glicosilações na cabeça globular da proteína HA (B). Os números indicam a posição de aminoácido do sítio de glicosilação que aparece nos anos específicos mostrados na parte inferior. As setas denotam a persistência do sítio de glicosilação ao longo do 10 tempo, e os círculos representam o desaparecimento de sítios de glicosilação específicos. As linhas descontínuas mostram o período de tempo durante o qual H1N1 não circulou em humanos. A representação estrutural da posição específica de cada glicosilação como aparece ao longo do 15 tempo desde 1918 até o surgimento do vírus 2009 pH1Nl (C). A HA é representada como fitas que formam a molécula trimérica de HA. A posição se refere à nomenclatura H1 (71, 142, 144, 172 e 177 correspondem à numeração H3 58, 128, 130, 158 e 163, respectivamente). 20 A Figura 23 mostra a caracterização fenotípica de vírus 2009 mutantes de glicosilação pH1N1HA. 0 fenótipo de tamanho de placa de vírus mutantes de glicosilação de HAA/Netherlands/602/2009 resgatados em células MDCK (A). A análise Western blot de usados celulares totais obtidos de 25 células MDCK infectadas em uma MOI de 5 durante 12 h (B) .
Os lisados foram administrados sob condições não redutoras e blots foram detectados com um anticorpo policlonal de coelho 3851 gerado contra um vírus PRO desprovido de H1, quê foi removido por tratamento ácido e DTT. A cinética de 30 crescimento de vírus resgatados em células epiteliais traqueobroquiais humanas diferenciadas infectadas em uma MOT de 0,001 (C). As titulações de vírus foram conduzidas para cada ponto de tempo mostrado por ensaio de placas padrão em células MDCK. 5 A Figura 24 mostra que os vírus 2009 pH1Nl com glicosilações adicionais na HA são atenuados em camundongos e furões. (A - E) Infecção de camundongos fêmeas C57B/6 de 9 semanas de idade com vírus mutantes de glicosilação Neth/09. Os grupos de n=5 camundongos por vírus 10 recombinante foram infectados i.n. com as doses de vírus indicadas.
O peso corporal representa a média de cada grupo e as barras de erro indicam o desvio padrão (s.d.) em cada ponto de tempo. (F) Os títulos pulmonares de camundongos infectados com 1X103 pfu de cada vírus mutante foram
15 ôb€ïdos em 2 (círculo), 3 (quadrado), e 7 dias (triângulo) p.i. como mostrado.
A barra preta representa o título viral médio de 2 (setas) ou 3 camundongos por grupo em cada ponto de tempo como comparado com o vírus rNeth/09 WT. (G) O peso corporal muda em furões infectados (n=3 por grupo) com os 20 vírus indicados.
Os pesos são mostrados como a média e as barras de erro representam o s.d. de cada ponto de tempo. (H) Os títulos virais em enxaguatórios nasais obtidos de furões mostrados em (G). (I) A carga viral em tecidos de furões (n=3) no 3° dia p.i. com os vírus indicados.
Os
25 valores são representados como em (F). As diferenças estatisticamente significativas do peso corporal de furões foram estimadas com o teste pareado de Wilcoxon (G). A Figura 25 mostra que os Vírus contendo deleções de glicosilação na HA de Tx/91 exibem virulência aumentada 30 em camundongos e proteção cruzada contra a cepa 2009 pH1N1.
A caracterização fenotípica de vírus influenza recombinante Aes contendo as HAs tipo selvagem ou mutante de deleção de glicosilação A/Texas/36/1991 e os 7 genes restantes de PR8 (os vírus são rPR8 7:1 Tx/91 HA). (A) Análise Western blot
5 de lisados obtidos de células MDCK infectadas em uma MOI de
5 durante 12 h com os respectivos vírus mutantes de deleção de glicosilação.
Os lisados foram administrados sob condições redutoras e os blots foram detectados com o anticorpo 3951 policlonal. (B) Camundongos fêmeas C57B/6 de 8 semanas de idade infectados com 1X104 pfu de cada vírus mostrado.
Peso corporal médio de camundongos n=5 por grupo.
As barras de erro denotam o s.d. para cada ponto de tempo. (C) Os camundongos infectados em (B) foram submetidos à soroconversão durante 27 dias, durante esse período os mesmos foram desafiados com 100 LD50 de Neth/09. 0 peso corporal representa a média de cada grupo com seu respectivo s.d. (D) A porcentagem de sobrevivência é mostrada para camundongos em (C). 0 teste t de student foi usado para determinar a significãncia em perda de peso corporal e o teste log-rank foi usado para avaliar a significância (* P<0,05) para o resultado de sobrevivência.
A Figura 26 mostra uma representação esquemática de proteínas de HA quimérica (cHA) (A) e expressão cHA em células MDCK (B). Proteínas de HA quimérica (cHA) e vírus quimérico recombinante. (A) Representação esquemática de cHAs. 0 domínio de cabeça globular é definido como a sequência de aminoácido interveniente entre os resíduos 052 e 0277 (numeração H3). Utilizando-se essa ligação de dissulfeto como a demarcação entre cabeça e caule, as cabeças de HA exóticas foram introduzidas sobre os caules heterólogos. 0 domínio de caule é definido como as porções restantes de HAl e as subunidades HA2. CT, cauda citoplasmática; SP, peptídeo de sinal; TM, domínio de transmembrana.
As estruturas de HA de comprimento completo 5 foram transferidas do Banco de Dados de Proteína (PDB): PR8 (Hl) HA (PDB ID 1RÚ7) e A/guinea fowl/Hong Kong/WF10/99 HA
[representado por A/swine/Hong Kong/9/98 (H9; PDB ID 1JSD)]. As imagens finais foram geradas com PyMol (Delano Scientific). Devido ao fato de nenhuma estrutura de uma HA
H6 ter sido publicada, a imagem do enovelamento de cabeça da HA PR8 é usada para a construção cH6/1. (B) Imunofluorescérncia para confirmar a expressão de cHA.
As células MDCK foram infectadas com o vírus WT PR8 ou cH9/1
N3, ou essas foram infectadas por simulação.
Os anticorpos específicos para a cabeça e caule de vírus PR8 bem como um anticorpo com reatividade H9 foram usados para confirmar a expressão de cHA. (Barra de aumento: 40x). A Figura 27 mostra que os pacientes adultos infectados com vírus H1N1 pandêmico possuem altos títulos de anticorpos neutralizantes que são reativos com o caule
HA.
A reatividade de soro de adultos infectados por pH1N1 (n = 9), crianças não infectadas com pHlNl (n = 5), e adulto não infectados com vírus pHlNl (n = 11) com proteína cH6/1 (A), proteína cH9/l; (B), a LAH da proteína HA2 (o anticorpo anti-LAH foi usado como um controle positivo; (C), a proteína H5 HA (soro policlonal de camundongo gerado contra H5 HA foi usado como um controle positivo e um anticorpo pan-H3, 12D1, foi usado como controle negativo;
(D) (13), ou a proteína H3 HA (12D1 foi usada como um controle positivo e soro policlorial de camundongo gerado contra H5 HA foi usado como um controle negativo; (E). Todos foram avaliados por ELISA; os pontos de dados representam os títulos médios com SE ou reatividade de amostras agrupadas. 5 A Figura 28 mostra que os pacientes adultos infectados com o vírus H1N1 pandêmico possuem altos títulos de anticorpos neutralizantes que são específicos para o caule HA (A e B). O soro de adultos infectados com pH1Nl (n = 14) e adultos não infectados com pH1N1 (n = 5) foram 10 agrupados separadamente, e o IgG total de ambos os grupos foi purificado. A capacidade neutralizante de anticorpos de caule foi avaliada por ensaio de redução de placa durante o uso de vírus cH9/1 N3. Os pontos de dados representam a média e SE de dois experimentos. As placas foram 15 imunocoradas com o anticorpo anti -H9 G1-26. (B) mostra a redução de placa das quatro diluições de soro mostradas ao longo da parte superior. (C) 0 ensaio de neutralização de partícula pseudotípicas mede a atividade de anticorpo neutralizante das preparações de IgG purificado humano 20 (soro de adultos infectados com pH1N1 e adultos não infectados com pH1Nl). As concentrações de IgG total foram 50, 10, e 2 pg/mL. Como um controle positivo, o anticorpo caule monoclonal-específico 6F12 foi usado.
A Figura 29 mostra a expressão e função de 25 proteína cH6/1 e cH9/l. A) Gel de Coomasie de 2 pg de proteína cH6/1 e cH9/1. M, proteínas marcadoras. (B) Análise Western blot de proteínas cHA expressas em baculovírus. Faixa 1, proteína cH6/l; faixa 2, proteína cH9/l; faixa 3, WT PR8 HA; faixa 4, WT H3 HA. Os blots 30 foram sondados com anticorpos conhecidos por reagirem com o caule de vírus PR8 (anti-HA2 policlonal de coelho) ou vírus H3 (mAb 12D1 de camundongo) e a cabeça globular de H6 (anti-H6 policlonal de cabra) ou vírus H9 (mAb Gl-26 de camundongo) para confirmar a identidade de cHAs expressas 5 em baculovírus. mAb 12D1 reage com HAG e HA2 (a preparação de proteína H3 é clivada, resultando em duas faixas distintas). (C) Ensaio de placa de vírus cH9/1 N3 reordenado. 0 fenótipo de placa de vírus cH9/1 N3 reordenado é similar às placas feitas por vírus WT PR8. As 10 placas foram imunocoradas com PY102 e anticorpo G1-26 anti- H9.
A Figura 30 mostra que os anticorpos monoclonais dirigidos contra o caule de vírus influenza HA se ligam e neutralizam cHAs. (A) 0 anticorpo de caule C179 foi usado 15 para testar a reatividade à proteína expressa em baculovírus cH6/1 por ELISA. 0179 reagiu com cH9/1 de maneira dose-dependente. (B) 0 anticorpo de caule 0179 foi usado para testar a reatividade à proteína expressa em baculovírus cH9/1 por ELISA. 0179 reagiu com cH9/1 de 20 maneira dose-dependente (C e D). 0 anticorpo 6F12 neutraliza a replicação de vírus cH9/1 N3. 6F12 foi usado para avaliar a capacidade de os anticorpos monoclonais caule-específicos neutralizarem o vírus cH9/1 N3 por ensaio de redução de placa. D mostra a redução de placa de vírus 25 cH9/1 N3 utilizando cinco diluições de mAb 6F12 (100, 20, 4, 0,8, e 0,16 pg/mL). As placas foram imunocoradas com o anticorpo G1-26 anti-H9. A Figura 31 mostra esquemas de hemaglutininas quiméricas. A Figura 31A mostra um diagrama de vírus tipo 30 selvagem e cHl/1. A HA quimérica foi construída ao trocar o domínio de cabeça globular localizado entre Cys52 e Cys277 de HA PR8 (H1) com aquele da HA A/California/4/09 (H1). A HA quimérica resultante possui a região de caule de HA A/PR8/34 (H1) com um domínio de cabeça globular da HA 5 A/California/4/09 (H1) e é designada como cHl/l.
A Figura 31B mostra esquemas teóricos das estruturas enoveladas de HAs tipo selvagem e quiméricas diferentes.
Da esquerda para a direita: HA PR8 tipo selvagem, a HA quimérica cH1/1, a HA quimérica cH5/1, a HA tipo selvagem Perth, a HA quimérica cH7/3, e a HA quimérica cH5/3. A Figura 32 mostra uma tabela que compara a identidade de aminoácido entre HAs H1, H3, H5 e H7 usadas nesse estudo.
A porcentagem de identidade de aminoácido foi calculada utilizando ClustalW (excluindo o peptideo de sinal). A porcentagem de identidade de aminoácido é comparada com a HA de comprimento completo, bem como os domínios de cabeça globular e caule.
As barras cinzas indicam 100% de identidade.
A Figura 33 mostra a expressão de superfície de construções de HA quimérica.
A expressão de superfície de construções de HA quimérica foi avaliada em células temporariamente transfectadas ou infectadas. 48 h após a transfecção, as células 293T foram tripsinizadas e a expressão de superfície celular de proteínas de HA quimérica foi analisada por citometria de fluxo.
Nos painéis superiores, as células transfectadas por simulação (cinzas) são comparadas com as células transfectadas com HA PR8 (linha preta) ou as células transfectadas com cHl/1 (linha preta) ou cH5/1 (linha preta). Nos painéis centrais, as células transfectadas por simulação (cinzas) são comparadas com as células transfectadas com as construções Perth/09, cH7/3 (linha preta) e cH5/3 (linha preta). Nos painéis inferiores, as células MDCK foram infectadas com vírus recombinantes de expressão Perth/09, cH7/3 e cH5/3.
5 12 h após a infecção, a expressão de superfície celular das HAs diferentes foi analisada utilizando citometria de fluxo. A Figura 34 demonstra a capacidade de as. HAs quiméricas entrarem nas células MDCK. Pseudoparticulas de codificação de Luciferase que expressam HAs quiméricas 10 foram usadas para traduzir as células MDCK. As unidades relativas de luz (RLU) geradas no ensaio de luciferase indicam que as pseudopartículas que expressam as HAs quiméricas são capazes de entrar nas células. A Figura 35 mostra uma análise Western blot de 15 células infectadas com os vírus de expressão de cHA recombinantes. Os extratos de células MDCK infectadas por simulação ou infectadas com os vírus indicados em uma MOI de 2 foram preparados e sondados com anticorpos em 16 hpi: anti-A/PR8/HA (H1) (PYI02), anti-A/Cal/09/HA (H1) (29E3), 20 anti-A/VN/HA (H5) (mAb #8), arnti-H3/HA (12D1), anti-H7 (NR- 3152), anti-A/NP (HT103) e anti-GAPDH como um controle de carga.
A Figura 36 mostra uma análise de imunofluorescéncia de células MDCK infectadas com viroses 25 recombinantes utilizando anticorpos: vírus anti-A/NP (HT103), anti-A/Hi HA (6F12), anti-A/PR8/HA (PY102), anti- A/Cal/09/HA (29E3), anti-A/VN/HA (mAb #8), anti-H3/HA (12D1), e anti-A/H7 virus (NR-3152). A Figura 37 mostra a cinética de crescimento e 30 fenótipos de placa de vírus tipo selvagem e recombinantes.
(A) Ovos de galinha embrionados de 10 dias foram infectados com 100 pfu por ovo de um vírus tipo selvagem ou recombinante e o crescimento viral foi monitorado durante
72 horas após a infecção.
Os pontos de dados representam o 5 desvio médio e padrão de réplicas experimentais. (B) Os fenótipos de placa de vírus recombinantes foram avaliados por ensaio de placa.
As células MDCK foram infectadas com um vírus tipo selvagem ou recombinante.
As células foram fixadas 48 horas após a infecção e imunocoradas para revelar os fenótipos de placa utilizando o anticorpo contra A/NP (HT103). A Figura 38 mostra que o anticorpo monoclonal caule-específico neutraliza os vírus de expressão de cHA e partículas pseudotípicas.
A capacidade de um mAb (KB2)
neutralizar os vírus de expressão de cHA ou partículas pseudotipicas foi avaliada por ensaio de redução de placa ou ensaio de inibição de partículas pseudotípicas.
As células MDCK foram infectadas ou transduzidas com vírus de expressão de cHA ou partículas pseudotípicas na presença da quantidade indicada (ug/mL) do mAb ou sem anticorpo.
A formação de placa ou atividade de luciferase foi usada como uma leitura para determinar o grau de inibição pelo mAb. 0 mAb neutraliza a replicação de vírus cHl/1 (caixas pretas) e cH5/1 (triângulos pretos) de maneira dose-dependente, com
100% de inibição em concentrações acima de 100 ug/mL.
Os pontos de dados representam o desvio médio e padrão de réplicas experimentais. (B) 0 mAb também inibe a entrada de partículas pseudotípicas cHl/l (caixas pretas) e cH5/1 (triângulos pretos) de maneira dose-dependente, com inibição completa acima de 4ug/mL.
Os pontos de dados representam o desvio médio e padrão de réplicas experimentais.
Os ensaios de inibição pseudotípicas foram processados independentemente.
A Figura 39 demonstra que os receptores de vacina
5 NJ/76 possuíam anticorpos de caule anti-HA elevados antes da vacinação Cal/09. As diluições seriais de soro de vacinas NJ/76 (n = 20) ou indivíduos de controle da mesma idade (n = 15) foram testados quanto à sua reatividade a A) HA cH6/1 ou B) HA NC/99 por ELISA e os títulos finais de IgG foram calculados.
Devido a quantidades limitadas de soro disponível, vacinação com pre-Cal/09, os títulos finais de IgG também foram determinados para vacinas NJ/76 agrupadas (N=5) e indivíduos de controle (n=7) contra C) cH6/1 e D) NC/99. Cada grupo consiste em todos os indivíduos de cada grupo para o qual amostras de vacinação pré- e pós-Cal/09 estavam disponíveis. testes T de Student não pareados foram realizados e os p-valores bicaudais <0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
N.D. = não detectado.
N.S = não significativo. *estatisticamente significativo.
A Figura 40 demonstra que os receptores de vacina
NJ/76 possuíam títulos de HAI elevados contra Cal/09 antes da vacinação Cal/09. A) Os títulos do HAI foram determinados para amostras de soro agrupadas para vacinação pré-Cal/09 de vacinas NJ/76 (n=5) e indivíduos de controle
(n=7) contra Cal/09 e France/76 utilizando cRBCs.
B) Ensaios HAI contra Cal/09 também foram realizados utilizando amostras de soro correspondentes aos indivíduos de dentro de cada grupo para garantir resultados agrupados representativos do grupo como um todo.
Testes T de Student não pareados foram realizados e os p-valores bicaudais <0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
N.D. = não detectado.
N.S = não significativo. *estatisticamente significativo. 5 A Figura 41 demonstra que as vacinas NJ/76 e Cal/09 estimularam os anticorpos amplamente neutralizantes.
Ensaios de microneutralização foram realizados em MDCK contra A) vírus cH5/1 N3 e B) Cal/09 utilizando amostras de soro agrupadas tratadas com TPCK-tripsina coletadas de 10 vacinas NJ/76 (n = 5) e indivíduos de controle (n = 7)
antes e após a vacinação Cal/09. Após a infecção, as células foram coradas com um anticorpo anti-NP e um anticorpo secundário conjugado por HRP.
Os títulos de neutralização foram definidos como a menor diluição de soro 15 que resultou em pelo menos 50% de redução em sinal específico.
A Figura 42 demonstra que a vacinação sequencial com as construções cHA obtém anticorpos caule-específicos de HA e fornece proteção contra o desafio letal.
Os 20 camundongos foram preparados com 20 pg de proteína cH9/l, administrados com adjuvante de maneira intranasal e intraperitoneal.
Três semanas depois, os camundongos foram estimulados com 20 uq de proteína cH6/l, administrados com adjuvante de maneira intranasal e intraperitoneal.
Como 25 controles, os camundongos foram preparados e estimulados de maneira similar utilizando BSA, ou administrados com vírus
FM1 inativado de maneira intramuscular.
Foram coletadas amostras de sangue dos animais e os mesmos foram desafiados três semanas após a última vacinação com 5LD50 de vírus 30 A/Fort Monmouth/1/1947 (FM1). (A) Placas de ELISA foram cobertas com o vírus cH5/1 Ni para avaliar o grau de reatividade de caule obtido através da vacinação. (B) Os camundongos foram pesados diariamente durante 14 dias para avaliar a proteção contra o desafio. (C) A curva de Kaplan 5 Meier mostra a taxa de sobrevivência após o desafio.
Os camundongos vacinados com cH9/1 + cH6/1 possuem uma taxa de sobrevivência estatisticamente maior comparado com os controles BSA (p = .0003)
A Figura 43 demonstra que a vacinação com cH6/1 obtém imunidade caule-específica que media a proteção contra o desafio viral cH9/1 Ni.
Os animais foram inoculados com o vírus YAM-HA para simulação antes da infecção ou vacinação contra vírus influenza.
Três semanas depois, os animais foram vacinados com cH6/1 ou BSA com adjuvante, de maneira intranasal e intraperitoneal.
Os animais de controle foram inoculados com B/Yamagata/16/1988 tipo selvagem e vacinados de maneira similar com BSA, ou administrados com o vírus cH9/1 NI inativado de maneira intramuscular.
Foram coletadas amostras de sangue dos animais e os mesmos foram desafiados com o vírus 250LD50 cH9/1 Ni três semanas após a vacinação. (A) Os animais foram pesados durante 8 dias para avaliar a proteção contra o desafio.
Nos 3-5° dias, os animais YAM-HA + cH6/1 demonstraram estatisticamente menos perda de peso comparado com o coorte YAM-HA + BSA (p < ,05). (B) A curva de Kaplan Meier mostra a sobrevivência.
Taxas de sobrevivência estatisticamente diferentes foram observadas no grupo YAM- HA + cH6/1 comparado com o coorte YAM-HA + BSA (p = ,038), bem como animais virgens e WT YAM + BSA (p < ,0001). As taxas de sobrevivência de coorte YAM-HA + BSA não eram estatisticamente diferentes daquelas do coorte WT-YAM + BSA (p = 0,058). (C) AS placas de ELISA foram cobertas com o vírus cH5/1 Ni para avaliar o grau de reatividade de caule obtido através ad vacinação. (D) Os resultados de um ensaio 5 de redução de plaque utilizando o vírus cH5/1 são mostrados. (E) Os animais foram vacinados, amostras de sangue coletadas e o IgG total foi coletado para o ensaio de inibição de entrada de pseudopartícula baseado em H5. A porcentagem de inibição foi avaliada como uma redução em expressão de luciferase comparado com os controles. A Figura 44 demonstra que a vacinação com cH6/l protege os camundongos contra o desafio letal de vírus influenza H5. Os animais foram inoculados com o vírus YAM- HÁ para simulação antes de infecção ou vacinação contra o vírus _influenza. Três semanas depois, os animais foram vacinados com cH6/1 ou BSA com adjuvante, de maneira intranasal e intraperitoneal. Os animais de controle foram inoculados com B/Yamagata/16/1988 tipo selvagem e vacinados de maneira similar com BSA ou administrados com o vírus cH5/1 Ni inativado de maneira intramuscular. Foram coletadas amostras de sangue dos animais e os mesmos foram desafiados com IOLD50 de 2:6 H5 reordenado no PR8 anterior (veja, por exemplo, Steel et al., 2009, J Virol 83:1742- 1753) . (A) A curva de Kaplan Meier mostra a sobrevivência.
As diferenças em taxas de sobrevivência se aproximaram da significância estatística quando compara-se o grupo YAM- HA+cH6/1 com o coorte YAM-HA+BSA (p = , 06) . (B) O período de tempo de sobrevivência é em médio mais longo em animais inoculados com YAM-HA e vacinados com cH6/1 do que em animais vacinados com BSA (p = 0,037), bem como controles virgens e WT YAM/BSA (p < 0,001). (C) As placas de ELISA foram cobertas o vírus cH5/1 Ni para avaliar o grau de reatividade de caule obtido através da vacinação. 1:50 diluições de soro foram realizadas contra % de perda de 5 peso máxima.
Um valor foi determinado como um valor discrepante e foi omitido da análise.
Para regressão linear, R' = 0,56 e p = ,02. A Figura 45 demonstra que a vacinação com cHA obtém imunidade caule-específica que media a proteção contra o desafio de vírus H1N1. (A-F) Os animais foram preparados com DNA que codifica cH9/1 e então foram vacinados com cH6/1 e estimulados com proteína solúvel cH5/1 (n.=10) ou BSA (n=5), enquanto os camundongos de controle positivos receberam o vírus inativado de maneira intramuscular (n=5). (A) Os animais foram vacinados e desafiados com o vírus FM1; os camundongos foram pesados diariamente, e a perda de peso ao longo do tempo é mostrada como uma mudança na porcentagem de peso inicial. (B) Q gráfico mostra a sobrevivência de camundongos desafiados em (A). (C) Os animais foram vacinados e desafiados com o vírus pH1N1; os camundongos foram pesados diariamente, e a perda de peso ao longo do tempo é mostrada como uma mudança na porcentagem de peso inicial. (D) O gráfico mostra a sobrevivência de camundongos desafiados em (C). (E) Os animais foram vacinados e desafiados com o vírus PR8; os camundongos foram pesados diariamente, e a perda de peso ao longo do tempo é mostrada como uma mudança na porcentagem de peso inicial. (F) Q gráfico mostra a sobrevivência de camundongos desafiados em (E). (G) A reatividade à HA Hl de soro de animais vacinados como descrito acima em A-F e abaixo em H-I e desafiados com 5 LD50 de A/FM/1/1947 (A, B), 10 LD5 © de A/Netherland/602/2009 (C, D), ou 5 LD50 de
A/PR/8/1934 (E, F, H, I). (H) Os animais foram vacinados como descrito acima em A-F (quadrado, n=4) ou eram virgens 5 (triângulo, n=3), enquanto os camundongos de controle positivo receberam o vírus PR8 inativado de maneira intramuscular (marca X, n=5). As células T CD8 foram depletadas antes do desafio com o vírus PR8. Os camundongos foram pesados diariamente, e a perda de peso ao longo do tempo é mostrada como uma mudança na porcentagem de peso inicial. (I) O gráfico mostra a sobrevivência de camundongos desafiados em (H). (J) Os animais foram vacinados como descrito para A-F.
O IgG total foi purificado para uso em ensaio de inibição de pseudopartícula baseado em H2. A porcentagem de inibição foi avaliada como uma redução na expressão de luciferase comparado com os controles.
O fragmento Fab CR6261 foi usado como um controle positivo.
A Figura 46 demonstra que os anticorpos de caule de hemaglutinina são produzidos após a infecção replicativa.
Os animais foram infectados com 104 PFU de vírus A/California/04/09 (Ca109), A/New Caledonia/20/99 (NC99),
ou A/Solomon Islands/3/06 (S106). Os soros foram coletados de camundongos quatro semanas após a infecção e os anticorpos caule-específicos de hemaglutinina foram analisados por ELISA utilizando a proteína cH6/1. A Figura 47 demonstra que os anticorpos de caule de hemaglutinina são estimulados após uma segunda exposição ao vírus influenza.
Os animais foram infectados com 10 4 PFU de NC99 e então estimulados quatro semanas depois com 105 ou 106 PFU de vírus S106 ou 10 3 ou 104 PFU de vírus Ca109.
Os soros foram coletados de camundongos quatro semanas após a segunda infecção e os anticorpos caule-específicos de hemaglutinina foram analisados por ELISA utilizando a 5 proteína cH6/1. Os valores mostrados na Figura 46 para animais que receberam apenas uma inoculação de vírus NC99 foram incluídos para servir como uma comparação. A Figura 48 demonstra que o soro de camundongos sequencialmente infectados protege os animais virgens de desafio letal com vírus H5. Os animais foram infectados com 104 PFU de NC99 e então estimulados quatro semanas depois com 106 PFU de SI06 ou 104 PFU de vírus Ca109. O soro coletado desses animais foi transferido de maneira intraperitoneal para animais virgens que foram desafiados com uma dose letal de vírus recombinante H5. Os animais que receberam de animais que experimentaram apenas uma infecção NC99 não foram protegidos contra o desafio e morreram com cinética similar aos controles. O soro de animais expostos a vírus NC99 e SI06 protegeu 60% de animais desafiados, enquanto o soro de animais infectados com os vírus NC99 e Ca109 protegeu 80% de camundongos desafiados contra a morte. As taxas de sobrevivência entre os grupos NC99-5106 e NC99- Ca109 são similares (p=0.575) enquanto as diferenças em taxas de sobrevivência comparadas com grupos infectados apenas com NC99 foram estatisticamente significativas (NC99-SI06 versus NC99 p=0.018, NC99-Ca109 versus NC99 p=0.0023).
A Figura 49 demonstra que os mutantes de glicosilação de vírus influenza são expressos e apropriadamente glicosilados. As células 293 T foram tranfectadas com o vírus HA A/PR/8/34 tipo selvagem (PR8) ou construções PR8 que possuem sítios de glicosilação introduzidos no domínio de cabeça PR8 e/ou sítios de glicosilação removidos por mutação do domínio de caule PRB. 5 A análise Western blot foi realizada com anticorpo HA2 de virus anti-influenza A NR-4539 e visualizada com um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de raiz-forte anti-camundongo.
As proteínas virais mutantes que possuem sítios de glicosilação introduzidos migraram em um peso molecular maior do que o PR8 tipo selvagem; aquelas que possuem sítios de glicosilação eliminados migraram em um peso molecular menor que o PR8 tipo selvagem.
Todas as proteínas virais mutantes migraram no peso molecular esperado, indicando que os glicanos foram adicionados ou eliminados com sucesso in vitro nos sítios de glicosilação relevantes.
Os sítios de sítios de glicosilação introduzidos são indicados para mutantes 42-1, 42-4, e 42-5. A Figura 50 demonstra que a adição de sítios de glicosilação e a eliminação de sítios de glicosilação em PR8 não possuem efeito sobre a expressão das proteínas virais ou sua capacidade de se enovelar em conformação apropriada.
As células 293 T foram transfectadas com PR8 tipo selvagem ou mutantes de glicosilação de hemaglutinina PR8 ou cH5/1. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram fixadas e coradas com o anticorpo de domínio anti-cabeça apropriado (PY102) ou domínio anti-caule (KB2,
C179 e 6F12) e incubados com um anticorpo anti-camundongo de burro fluorescente.
A reatividade de fluorescéncia foi visualizada utilizando um microscópio de fluorescência invertido. (A) A introdução de sítios de glicosilação no domínio de cabeça de PR8 não afeta a expressão proteica viral ou a ligação de anticorpo de caule (6F12). (B) A coloração imunfluorescente de proteínas virais em que os sítios de glicosilação foram introduzidos no domínio de 5 cabeça reduziu a ligação de anticorpo anti-cabeça, indicando que a hiperglicosilação do domínio de cabeça mascarou o sítio de ligação de anticorpo.
Não houve alteração na ligação de anticorpos de domínio anti-caule que ligaram os epítopos de conformação do domínio de caule, indicando que os mutantes virais foram adequadamente enovelados. (C) A imunofluorescência de mutantes virais PR8 com sítios de glicosilação introduzidos no domínio de cabeça e eliminados do domínio de caule utilizando anticorpos específicos anti-cabeça e anti-caule demonstrou que as proteínas foram expressas e adequadamente enoveladas.
Nenhuma diferença na capacidade de anticorpos anti-caule se ligarem ao domínio de caule de construções mutantes em que os sítios de glicosilação foram introduzidos no domínio de cabeça (42-1, 42-4 e 42-5) e removidos do domínio de caule (033/289) como comparado com PR8 tipo selvagem foi observada.
A Figura 51 demonstra mutantes de glicosilação virais que podem ligar os receptores sialilados e o vírus mutante viável resgatado.
As células transfectadas foram incubadas cm neuraminidase (sialidase) a 37 °C durante 1 hora, então com 2% de suspensão de eritrócitos de galinha.
Os eritrócitos ligados foram usados e a absorbãncia do usado medida em 540 nm.
Para resgatar o vírus mutante de influenza A, células 293T foram co-transfectadas com 1 pg de plasmídeos resgatados 8 pDZ PR8. Vinte e quatro horas após a transfecção, o sobrenadante contendo vírus foi inoculado em ovos de galinha embrionados de 8 dias. 0 fluido alantoico foi coletado após 2 dias de incubação a 37°C e avaliado quanto à presença de vírus por
5 hemaglutinationa de eritrócitos de galinha e por formação de placa em células MDCK.
Os mutantes virais de caule de influenza A ©289, ã483 e 633/289 foram ligados a eritrócitos de galinha e foram capazes de serem resgatados.
Figura 52. Esquema de HA tipo selvagem e 10 construções de expressão. (A) Hemaglutinina de vírus influenza de comprimento completo não clivada.
O peptideo de sinal é o componente mais à esquerda, o ectodomínio de
HA é o componente intermediário e a transmembrana e o endodomínio são o componente mais à direita. (B) Construção • 15 de expressão com domínio de trimerização.
A transmembrana e endodomínio foram trocados por um sítio de clivagem de trombina (terceiro componente da esquerda), um domínio de trimerização T4 (quarto componente da esquerda) e um tag de hexahistidina (tag 6xhis, quinto componente da esquerda) na
20 posição V503 (numeração H3). (C) Construção de expressão sem domínio de trimerização.
A transmembrana e endodomínio foram trocados por um tag de hexahistidina (tag 6xhis, componente mais à direita) na posição de aminoácido 509 (H1,
H2 e H5) ou 508 (H3) respectivamente (numeração H3). 25 Figura 53. A introdução de um domínio de trimerização influencia a estabilidade e a formação de oligômeros em HAs recombinantes. (A) Análise de HAs recombinantes com e sem domínio de trimerização ao reduzir, desnaturar SDS-PAGE.
As HAs recombinantes que são expressas 30 com o domínio de trimerização (+) mostram maior estabilidade do que as HAs expressas sem (-). HA não clivada (HAD) e produtos de clivagem (HA1/degr. produto; HA2) são indicados por setas. (B) Análise SDS-PAGE redutora, desnaturaste de HAs reticuladas. Espécies diferentes de HA 5 são indicadas no blot. Multímeros de alto peso molecular são indicados por H, trimeros por T, dímeros por D e monômeros por M. (C) Painel esquerdo (caixas 1-4) : Análise Western blot de HAs de grupo 1 reduzidas, desnaturadas e reticuladas de B sondadas com u m anticorpo anti- hexahistidina-tag. Painel direito (caixa mais à direita) Controle de reticulação (IgG) com BS 3 analisado em um SDS- PAGE. Espécies diferentes (anticorpo total, cadeia pesada, cadeia leve) são indicadas por setas. Os pesos moleculares das faixas de marcador são indicados à esquerda de cada painel.
Figura 54. Ligação de anticorpos reativos de caule a HAS PR8 (H1) e Ca109 (H1) recombinantes. (A) Ligação de anticorpos reativos de caule C179, CR6261 e 6F12 e anticorpo reativo de cabeça PY102 e antissoro PR8 a HA PR8 solúvel recombinante sem (w/o domínio trim. T4, linhas pretas) ou com (w/ domínio trim. T4, linha vermelha) domínio de trimerização. (B) Ligação de anticorpos reativos de caule C179, CR6261 e 6F12 e anticorpo reativo de cabeça 7B2 e antissoro Ca109 a HA Ca109 solúvel recombinante sem (w/o domínio trim. T4, linhas pretas) ou com (w/ domínio trim. T4, linha vermelha) domínio de trimerização.
Figura 55. Ligação de anticorpos reativos de caule a HAS JAP57 (H2) e VN04 (H5) recombinantes. (A) Ligação de anticorpos reativos de caule C179 e CR6261 e anticorpo reativo de cabeça 8F8 e antissoro H2 a HA JAP57 solúvel recombinante sem (w/o domínio trim. T4, linhas pretas) ou com (w/ domínio trim. T4, linha vermelha) domínio de trimerização, (B) Ligação de anticorpos reativos de caule C179 e CR6261 e anticorpo reativo de cabeça mAb#8 5 e antissoro H5 a HA VN04 solúvel recombinante sem (w/o domínio trim. T4, linhas pretas) ou com (w/ domínio trim. T4, linha vermelha) domínio de trimerização.
Figura 56. Ligação de anticorpos reativos de caule a HAs de grupo 2. (A) Ligação de anticorpos reativos 10 de caule l2Dl e CR8020 e anticorpo reativo de cabeça XY102 e antissoro H3 à HA HK68 solúvel recombinante sem (w/o domínio trim. T4, linhas pretas) ou com (w/ domínio trim. T4, linha vermelha) domínio de trimerização. (B) Ligação de anticorpos reativos de caule 12D1 e CR8020 e antissoro H3 a 15 HA Wisc05 solúvel recombinante sem (w/o domínio trim. T4, linhas pretas) ou com (w/ domínio trim. T4, linha vermelha) domínio de trimerização,
5. DESCRIÇÃO DETALHADA Esta invenção refere-se a imunógenos de 20 hemaglutinina (HA) de vírus influenza (isto é, polipeptídeos HA de gripe), que induzem uma resposta imunológica protetora cruzada contra o domínio de tronco HA conservado (às vezes referido aqui como o domínio de "caule") de vírus influenza. 25 Em um aspecto, proporcionam-se aqui polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico (HA). Esses polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico (HA) compreendem um domínio de tronco HA que exibe um domínio de cabeça globular HA heterólogo ao domínio de 30 tronco. ©s polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico desenhados para vacinação compartilham o mesmo domínio de tronco HA, porém são altamente divergentes em suas cabeças globulares. Essas construções são modificadas por engenharia genética em formulações de vacina como vírus 5 influenza vivo, virus influenza morto, partículas tipo vírus ("VLPs"), vacinas de subunidade, vacinas divididas, etc., que extraem anticorpos altamente potentes e amplamente neutralizantes contra o tronco HA conservado.
Essas vacinas `universais" podem ser usadas para induzir e/ou estimular respostas imunológicas protetoras cruzadas através de subtipos de vírus influenza.
Por meio de bases, os anticorpos neutralizantes contra o vírus influenza visam a glicoproteina HA e impedem a etapa de ligação ou fusão envolvida na entrada viral. Dois subconjuntos básicos de anticorpos neutralizantes são obtidos por exposição ao vírus influenza: aqueles dirigidos para a cabeça globular cepa-específica (um domínio que é não-conservado através das várias cepas e subtipos de vírus influenza), e aqueles dirigidos para o tronco altamente conservado da glicoproteína HA. A cabeça globular HA não- conservada contém os epítopos imunodominantes- os anticorpos de cabeça anti-globular cepa-específicos são considerados mais potentes do que as especificidades de anticorpo anti-tronco, explicando assim a imunidade amplamente cepa-específica conferida por infecção com vacinas atuais.
Os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico (HA) descritos aqui são baseados, em parte, nas estratégias de desenho racionais dos inventores para vacinas contra vírus influenza que extraem anticorpos altamente potentes e amplamente neutralizantes contra o tronco HA. Nesse sentido, o polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico (HA) é desenhado para compartilhar um domínio de tronco relativamente bem 5 conservado de exposições/vacinações anteriores, porém contém um domínio de cabeça globular HA heterólogo - de preferência, um ao qual um vacinado destinado é virgem. A exposição a essa construção deveria estimular principalmente os anticorpos dirigidos para o tronco HA conservado. Imunizações repetidas com o tronco HA conservado e a alteração da cabeça globular deveriam induzir os anticorpos neutralizantes cruzados robustos contra a região de tronco comum de HA.
Quando se desenha os polipeptdeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico (HA), deve-se tomar cuidado para manter a estabilidade da proteína resultante. Nesse sentido, recomenda-se que os resíduos de cisteína identificados como Ap e Aq na Figura 1 sejam mantidos visto que esses contribuem para a estabilidade do 20 caule HA como discutido em mais detalhes na Seção 5.1 infra.
Para a melhor estabilidade, prefere-se "trocar" o globular domínio HA como um todo (entre os resíduos de cisteina Ap e Aq como mostrado na Figura 1) visto que a conformação resultante poderia estar mais próxima à estrutura nativa. Em outras palavras, o "ligante" referido na Seção 5.1.2 pode ser o domínio de cabeça globular total de uma HA heteróloga.
Em vez de "trocar" a cabeça globular nativa do caule HA, a cabeça globular pode se tornar heteróloga ao caule conservado ao alterar as alças que contribuem para os í6/64B epítopos de cabeça globular HA. Essa abordagem pode não funcionar tão bem para gerar a resposta imunológica desejada contra o caule conservado, exceto onde a cabeça globular alterada for desenhada para ser muito diferente da 5 cabeça globular HA nativa- especialmente quando se utiliza uma HA à qual a população foi exposta. Entretanto, essas alterações podem ser realizadas, por exemplo, ao alterar a maior parte das cinco alças que contribuem para os epítopos de cabeça globular HA. Em uma abordagem útil, todas as cinco alças podem ser alteradas.
As construções usadas para a vacinação podem ser vantajosamente desenhadas para os indivzduos/população particular que serão vacinados. Há três subtipos de influenza aos quais os serem humanos atualmente são expostos: subtipos Hl, H2, e H3. Os vírus influenza do subtipo H2 desapareceram da população em 1968, enquanto o vírus influenza dos subtipos Hl e H3 persistem na população até hoje. Como resultado, os adultos que nasceram antes de 1968 provavelmente foram expostos a cada um dos subtipos H1, H2, e H3. Em contrapartida, os adultos que nasceram depois de 1968 provavelmente foram expostos apenas aos subtipos Hi e H3.
Assim, em modalidades preferidas para a vacinação de adultos, os polipeptideos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico não possuem um domínio de cabeça globular da HA de um vírus influenza de subtipo Hl, H2, ou H3, porém possuem um domínio de tronco da HA de um desses trés subtipos. A cabeça globular heteróloga pode ser selecionada a partir da HA de qualquer subtipo não-H1, não- H2, ou não-H3. Também, construções quiméricas separadas feitas utilizando troncos H1/H2 por um lado, e troncos H3 por outro lado podem ser beneficamente usadas em um programa de vacinação - os subtipos Hl e H2 são subtipos HA de Grupo 1 que compartilham um domínio de caule conservado; 5 enquanto H3 é um subtipo do Grupo 2 que possui um domínio de caule que é estruturalmente diferente do caule de Grupo
1. 0 uso das construções H1 e H3 poderia garantir gerar/estimular uma resposta imunológica contra cada domínio de tronco. A imunização de indivíduos adultos com 10 esses polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quiméricos irá estimular a resposta imunológica de memória do indivíduo, resultando na produção em larga escala de anticorpos reativos cruzados, amplamente neutralizantes de domínio de anti-tronco que fornecem longa imunidade a vírus • 15 influenza no indivíduo.
Os bebês que não foram expostos, naturalmente, são virgens a todos os subtipos de vírus influenza. Como resultado, uma ampla gama de combinações de tronco/cabeça globular HA pode ser construída para uso em vacinas para 20 bebês. Em uma modalidade preferida, os bebês virgens podem ser vacinados com construções feitas utilizando o caule HA de uma cepa de Grupo 1 (Hl ou H2) ou Grupo 2 (H3), e uma cabeça globular de urna cepa heteróloga; isto é, cepas não- Hi, não-H2, e/ou não-H3. Três construções de HA quimérica 25 diferentes para cada caule HA podem ser usadas vantajosamente em três vacinações sequenciais para induzir uma resposta protetora cruzada.
Deve ser entendido que o uso dos polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descritos aqui é 30 vantajoso, pois (i) os ditos polipeptídeos são altamente estáveis (devido ao fato de esses possuírem um domínio de cabeça globular intacto) e (ii) os sistemas imunológicos dos indivíduos aos quais os ditos polipeptídeos são administrados não foram anteriormente expostos aos domínios 5 de cabeça globular da hemaglutinina de vírus influenza quimérico, porém foram expostos aos epítopos conservados dos domínios de tronco da hemaglutinina de vírus influenza quimérico.
O polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico (HA) é ilustrado pelos Exemplos de trabalho (por exemplo, Seção 6.2) que demonstram a construção de um polipeptídeo HA de influenza quimérico que compreende um tronco HA e exibem uma cabeça HA heteróloga, e a produção de uma proteína de HA quimérica estável desse polipeptídeo que reage de maneira cruzada com anticorpos no domínio de tronco e no domínio de cabeça.
Em um aspecto, proporcionam-se aqui polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico que compreendem um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza e um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza (por exemplo, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza e o polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza são derivados de subtipos de hemaglutinina de vírus influenza diferentes). Os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico fornecidos aqui podem ser gerados ao combinar um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza (veja a Seção 5.2) com um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza (Seção 5.3). Isto é, utilizando-se os princípios 5 da invenção, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenzas descrito aqui (veja a Seção 5.1.1, infra) e os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza descritos aqui (Seção
5.1.2, infra) podem ser misturados e combinados para gerar um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico.
Hm outro aspecto, proporcionam-se aqui polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico 15 (HA), polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza (HA) de domínio de tronco) que compreendem um ou mais sítios de glicosilação modificados e/ou um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural. Como mostrado nas Figuras 20A e B, a glicosilação de hemaglutinina tipo selvagem ocorre nos domínios de cabeça globular e tronco.
Acredita-se que a glicosilação dentro desses domínios possa mascarar as regiões antigénicas, permitindo assim que um vírus influenza evada uma resposta de sistema imunológico de hospedeiro. Por exemplo, as cepas de vírus influenza sazonal (por exemplo, H1N1 e H3N2) são conhecidas por adquirir sítios de glicosilação adicionais ao longo do tempo em regiões antigênicas imunodominantes do domínio de cabeça globular. Dentro do contexto de um polipeptídeo HA do vírus influenza descrito aqui, entretanto, a glicosilação dentro do domínio de tronco do polipeptídeo
LqL pode impedir ou evitar respostas imunológicas desejadas contra as regiões antigênicas conservadas encontradas nesse domínio.
Veja a Figura 19C.
Em uma modalidade, proporciona-
se aqui um polipeptídeo HA de gripe que compreende um 5 domínio de tronco que possui pelo menos um sítio de glicosilação modificado, em que o sítio de glicosilação modificado, em que a modificação interfere na capacidade de um glicano se ligar ao sítio de glicosilação modificado.
Em outra modalidade, proporciona-se aqui um polipeptídeo HA de gripe que compreende um domínio de cabeça globular HA, em que o domínio de cabeça globular HA compreende pelo menos um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural que possuí uma sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, e em que Xaa é qualquer aminoácido.
Em outra modalidade, o polipeptídeo HA de gripe compreende (1) um domínio de tronco que compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados, em que o(s) sítio(s) de glicosilação modificado(s) compreende(m) a modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural, em que a modificação interfere na capacidade de um glicano se ligar ao sítio de glicosilação modificado; e (2) um domínio de cabeça globular HA que compreende um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural que possuem uma sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido.
Em modalidades específicas, the sítio de glicosilação modificado in the domínio de tronco do polipeptídeo HA de gripe compreende a modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural que possui a sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido.
Sem se ater a qualquer teoria particular de operação, acredita-se que uma resposta imunológica a regiões antigênicas conservadas dentro do domínio de tronco do polipeptídeo HA do vírus influenza fornecido aqui possa 5 ser aumentada ao modificar um ou mais sítios de glicosilação dentro do domínio de tronco de tal maneira que interrompe a glicosilação (isto é, a ligação de um glicano) nos sítios.
Ademais, acredita-se que o mascaramento das regiões antigénicas imunodominantes do domínio de cabeça globular HA pela adição de um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural nessas regiões imunodominantes também possa aumentar a imunogenicidade de regiões antigênicas sub-imunodominantes conservadas dentro do domínio de tronco. 15 Em outro aspecto, proporcionam-se aqui métodos de usar os . polipeptídeos HA de gripe (por exemplo,
polipeptídeos de hemagiutinina de vírus da gripe quimérico)
descritos aqui na prevenção e/ou tratamento e/ou imunização contra doença e/ou infecção por vírus influenza, isto é, os polipeptídeos HA de gripe podem ser usados para vacinar um indivíduo contra uma doença ou infecção por vírus influenza ou para tratar um indivíduo que sofre de uma doença ou infecção por vírus influenza.
Em uma modalidade, o método de usar o polipeptídeo HA de gripe serve para a prevenção de uma doença de vírus influenza em um indivíduo que compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um polipeptídeo HA de gripe.
Em outra modalidade, o método de usar o polipeptídeo HA de gripe serve para o tratamento de uma doença e/ou infecção por vírus influenza em um indivíduo que compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz de um polipeptideo HA de gripe . Ainda em outra modalidade, o método de usar o polipeptídeo HA de gripe serve para a imunização contra a doença e/ou infecção por vírus influenza em um indivíduo. 5 Em uma modalidade, proporcionam-se aqui vírus influenza modificados por engenharia genética para expressar um ou mais polipeptídeos HA de gripe (por exemplo, polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico) descritos aqui. Esses vírus podem ser utilizados como 10 vacinas contra vírus influenza, por exemplo, o vírus influenza fornecido aqui que expressa um ou mais polipeptídeos HA de gripe (por exemplo, polipeptideos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico (HA)) aqui pode ser utilizado em uma subunidade de vacina, uma vacina 15 dividida, uma vacina inativada, e/ou uma vacina de vírus vivo, atenuada.
Em determinadas modalidades, o vírus influenza modificado por engenharia genética para expressar um ou mais polipeptídeos HA de gripe (por exemplo, polipeptídeos 20 de hemaglutinina de vírus influenza quimérico (HA)) descritos aqui compreende uma neuraminidase (NA), ou fragmento dessa, que é da mesma origem (por exemplo, cepa ou subtipo de vírus influenza) que aquela a partir da qual o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de 25 vírus influenza dos polipeptídeos HA de gripe é derivado. Em determinadas modalidades, o vírus influenza modificado por engenharia genética para expressar um ou mais polipeptídeos HA de gripe (por exemplo, polipeptideos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico (HA)) compreende 30 uma neuraminidase de uma cepa diferente de vírus influenza daquela do domínio de cabeça globular e/ou domínio de tronco do polipeptídeo HA de gripe. Em determinadas modalidades, o vírus influenza modificado por engenharia genética para expressar um ou mais polipeptídeos HA de 5 gripe compreende uma neuraminidase de um vírus influenza diferente em relação às outras proteínas codificadas pelo vírus influenza modificado por engenharia genética para expressar um ou mais polipeptídeos HA de gripe.
Em uma modalidade, proporcionam-se aqui ácidos nucleicos que codificam os polipeptídeos HA de gripe (por exemplo, polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico) descritos aqui (veja, por exemplo, a Seção 5.5, infra) .
Em outra modalidade, proporcionam-se aqui vetores, por exemplo, vetores de expressão, que contêm um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo HA de gripe descrito aqui (veja, por exemplo, a Seção 5.6, infra). Em uma modalidade específica, o vetor é um vetor de plasmídeo. Em outra modalidade específica, o vetor é um vetor viral (veja, por exemplo, as Seções 5.7 e 5.8, infra), por exemplo, um vetor de vírus influenza no qual um polipeptídeo HA de gripe (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico (HA)) descrito aqui foi incorporado nos vrions ou um vetor de vírus influenza que compreende um genoma modificado por engenharia genética para expressar um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico. Em outra modalidade específica, o vetor é um vetor bacteriano (veja, por exemplo, a Seção
5.10, infra). Em outra modalidade específica, o vetor é um baculovírus. Os vetores fornecidos aqui podem ser desenhados para a expressão de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico utilizando células procarióticas (por exemplo, bacterianas} ou células eucarióticas (por exemplo, células de insetos, células de 5 levedura, células de plantas, células de algas e mamíferos).
Com isso, também proporcionam-se aqui células (isto é, células procarióticas e eucarióticas) que compreendem os vetores fornecidos aqui, e capazes de produzir um ou mais polipeptídeos HA de gripe (por exemplo, polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descritos aqui.
Em outra modalidade, proporcionam-se aqui partículas tipo vírus (VLPs) e virossomas nos quais os polipeptídeos HA de gripe (por exemplo, os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico) descritos aqui 15 foram incorporados (veja a Seção 5.9, infra).
Em outra modalidade, proporcionam-se aqui composições que compreendem um ou mais polipeptídeos HA de gripe (por exemplo, polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico) descritos aqui, e/ou um ou mais ácidos nucleicos, vetores, VLPs, bactérias, ou virossomas descritos aqui (veja, por exemplo, a Seção 5.14). Em uma modalidade específica, uma composição fornecida aqui compreende um polipeptídeo HA de gripe (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito aqui. Em outra modalidade específica, uma composição fornecida aqui compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptldeo HA de gripe (por exemplo, um polipeptideo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito aqui. Em outra modalidade específica, uma composição fornecida aqui compreende um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo HA de gripe (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito aqui.
Em outra modalidade específica, uma composição fornecida 5 aqui compreende um vírus influenza ou vírus não-influenza que possui um genoma modificado por engenharia genética para expressar um polipeptideo HA de gripe (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito aqui. 10 Em determinadas modalidades, um ou mais polipeptídeos HA de gripe descrito aqui (veja, por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico, Seção 5.1, infra) ou uma composição desse, e/ou um ou mais dos ácidos nucleicos, vetores, VLPs, ou 15 virossomas descritos aqui, são administrados a um indivíduo para imunizar o indivíduo contra múltiplas cepas ou subtipos de vírus influenza. Em uma modalidade específica, a dita administração é suficiente para gerar uma resposta imúnológicà de hospedeiro no dito indivíduo contra qualquer 20 um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis ou dezessete subtipos de hemaglutinina de vírus influenza A conhecidos ou um subtipo de hemaglutinina de vírus influenza A posteriormente identificado. Em outra modalidade específica, 25 a dita administração é suficiente para gerar uma resposta imunológica de hospedeiro no dito indivíduo contra qualquer subtipo de hemaglutinina de vírus influenza B conhecido agora ou posteriormente identificado. Em determinadas modalidades, um ou mais 30 polipeptídeos HA de gripe descritos aqui (veja, por exemplo,
um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico, veja a Seção 5.1, infra) ou uma composição desse e/ou um ou mais dos ácidos nucleicos, vetores, VLPs, ou virossomas descritos aqui, são administrados a um indivíduo 5 uma vez como uma dose única.
Em uma modalidade específica, o indivíduo é uma criança.
Em outra modalidade específica, o indivíduo é um adulto.
Em outra modalidade específica, o indivíduo é um idoso.
Em determinadas modalidades, um primeiro polipeptídeo HA de gripe descrito aqui ou um ácido 10 nucleico, vetor, VLP, ou virossoma de composição descrito aqui, é administrado a um indivíduo como uma dose única,
seguido pela administração de um segundo polipeptídeo HA de gripe descrito aqui ou um nucleico, vetor, VLP, ou virossoma de composição descrito aqui 3 a 6 semanas depois. 15 Em determinadas modalidades, um ou mais polipeptídeos HA de gripe descritos aqui (veja, por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) ou uma composição desse e/ou um ou mais ácidos nucleicos, vetores, VLPs, ou virossomas descritos aqui, é 20 administrado a um indivíduo como uma dose única, seguido pela administração de uma segunda dose 3 a 6 semanas depois, em que o domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza dos polipeptídeos HA de gripe (por exemplo, polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico)
25 usados na primeira dose é de uma cepa ou subtipo diferente do domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza dos polipeptideos HA de gripe (por exemplo polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) usados na segunda dose.
Em determinadas modalidades, inoculações de 30 estimulantes podem ser administradas ao indivíduo em intervalos de6 a 12 meses após a segunda inoculação. Em determinadas modalidades, o domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza do polipeptídeo HA de gripe usado no estimulante é de uma cepa ou subtipo 5 diferente do domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza do polipeptídeo HA de gripe usado nas primeira e segunda doses. Em uma modalidade específica, o indivíduo é uma criança. Em outra modalidade específica, o indivíduo é um adulto. Em outra modalidade específica, o indivíduo é um idoso.
Em uma modalidade específica, para a administração a bebês, duas doses de polipeptídeos HA de gripe (por exemplo, polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico) descritos aqui (veja, por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico, Seção 5.1, infra) ou uma composição desse e/ou um ou mais ácidos nucleicos, vetores, VLPs, ou virossomas descritos aqui, são administrados a um bebê, em que o domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza do polipeptídeo HA de gripe usado na primeira dose é de uma cepa ou subtipo diferente do domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza dos polipeptideos HA de gripe usados na segunda dose.
Em uma modalidade específica, para a administração a bebês, três doses de polipeptideos HA de gripe (por exemplo, polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico, Seção 5.1, infra) ou uma composição desse e/ou um ou mais ácidos nucleicos, vetores, VLPs, ou virossomas descritos aqui, são administrados a um bebê, em que os domínios de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza do polipeptídeo HA de gripe usado nas primeira, segunda, e terceira doses são de cepas ou subtipos diferentes de vírus influenza.
Em outro aspecto, proporcionam-se aqui métodos de 5 imunizar um indivíduo contra uma doença ou infecção por vírus influenza que compreende expor o indivíduo a uma hemaglutinina de um vírus influenza ao qual o indivíduo é virgem, isto é, o indivíduo não foi anteriormente exposto ao vírus influenza e/ou à hemaglutinina do vírus influenza. Em uma modalidade específica a hemaglutinina é um polipeptídeo HA de gripe descrito aqui. Em uma modalidade específica, a hemaglutinina é um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico (HA).
Em uma modalidade, proporciona-se aqui um método de imunizar um indivíduo contra uma doença ou infecção por vírus influenza que compreende administrar ao dito indivíduo um ou mais vírus influenza, em que cada dito um ou mais vírus influenza compreende um polipeptídeo de hemaglutinina ao qual o indivíduo é virgem, isto é, o indivíduo não foi anteriormente exposto a um ou mais vírus influenza. Em uma modalidade específica, um ou mais vírus influenza consistem em um vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 e/ou H17. Em outra modalidade específica, o método compreende (i) uma primeira administração de um vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 ou H17 e (ii) uma segunda administração de um vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17 em que o vírus influenza da primeira administração é de um subtipo diferente do vírus influenza da segunda administração. Em outra modalidade específica, o método compreende (i) uma primeira administração de um vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17; 5 (ii) uma segunda administração de um vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, Hlb, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17; e (iii) uma terceira administração de um vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que os vírus influenza das primeira, segunda e terceira administrações são de subtipos diferentes.
Em outra modalidade, proporciona-se aqui um método de imunizar um indivíduo contra uma doença ou infecção por vírus influenza que compreende administrar ao dito indivíduo um ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza aos quais o indivíduo é virgem, isto é, o indivíduo não foi anteriormente exposto a um ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza. Em determinadas modalidades, o dito um ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza ao qual o indivíduo é virgem estão em uma composição (por exemplo, uma composição que compreende uma vacina). Em determinadas modalidades, um ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza aos quais o indivíduo é virgem estão em um vetor, por exemplo, um vetor de vírus influenza. Em determinadas modalidades, um ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza aos quais o indivíduo é virgem estão em uma VLP. Em determinadas modalidades, um ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza aos quais o indivíduo é virgem estão em um virossoma. Em uma modalidade específica,
um ou mais polipeptideos de hemaglutinina de vírus influenza consistem em um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza de um virus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e/ou H17. 5 Em outra modalidade específica, o método compreende (i) uma primeira administração de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17 e (ii) uma segunda administração de um polipeptídeo de hemaglutínina 10 de vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que o polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza da primeira administração é de um subtipo diferente do polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza da segunda 15 administração. Em outra modalidade específica, o método compreende (i) uma primeira administração de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, (ii) uma segunda administração de um 20 polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17; e (iii) uma terceira administração de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, 25 H16, ou H17, em que os polipeptideos de hemaglutinina de vírus influenza das primeira, segunda, e terceira administrações são de subtipos de vírus influenza diferentes.
Em outra modalidade, proporciona-se aqui um 30 método de imunizar um indivíduo contra uma doença ou infecção por vírus influenza que compreende (i) preparar o dito indivíduo ao administrar ao dito indivíduo um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza (ou um ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo de 5 hemaglutinina, um vírus que expressa o dito polipeptídeo de hemaglutinina, uma VLP que expressa o dito polipeptídeo de hemaglutinina, etc.) de um subtipo de influenza (por exemplo, uma hemaglutinina Hl) e, após um período de tempo, e (ii) estimular o dito indivíduo com um polipeptídeo HA de gripe (por exemplo, polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito aqui (ou um ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo HA de gripe, um vírus que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, uma VLP que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, etc.). Em uma modalidade específica, o polipeptídeo HA de gripe é um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico HA que compreende um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza (ou porção desse) ao qual o indivíduo é virgem e um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza (ou porção desse) que é igual ou similar (por exemplo, da mesma cepa ou subtipo de vírus influenza) ao polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza no polipeptídeo de hemaglutinina usado na preparação da etapa (i). Em determinadas modalidades, o indivíduo pode ser administrado com um segundo estímulo, que compreende uma segunda administração de um polipeptídeo HA de gripe igual ou diferente descrito aqui (ou um ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo HA de gripe, um vírus que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, uma VLP que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, etc.). Em determinadas modalidades, o indivíduo pode ser administrado com um terceiro estímulo, que compreende uma terceira administração de um polipeptídeo HA de gripe similar ou 5 diferente descrito aqui (ou um ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo HA de gripe, um vírus que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, uma VLP que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, etc.). Em determinadas modalidades, o período de tempo entre a preparação e o 10 estímulo, ou entre os estímulos se mais de um estímulo for administrado, do dito indivíduo pode ser, por exemplo, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, ou mais.
Em determinadas modalidades, o período de tempo entre a preparação e o estímulo (ou entre os primeiro 15 e segundo estímulos) do dito indivíduo pode, por exemplo, variar de 3-5 dias, 7-10 dias, 7-14 dias, 14-21 dias, 14-28 dias, 21-28 dias, 21 dias a 1 mês, 1 mês a 2 meses, 1 mês a 3 meses, 2 meses a 3 meses, 2 meses a 4 meses, ou 4 meses a 6 meses. 20 Em outra modalidade, proporciona-se aqui um método de imunizar um indivíduo contra uma doença ou infecção por vírus influenza que compreende (i) preparar o dito indivíduo ao administrar ao dito indivíduo um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza sem cabeça
25 (isto é, um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza, ou um ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo de hemaglutinina, um vírus que expressa o dito polipeptídeo de hemaglutinina, uma VLP que expressa o dito polipeptídeo de hemaglutinina, etc.) como 30 aquele descrito aqui de um subtipo de influenza (por exemplo, unia hemaglutinina H1) e, após um período de tempo, e (ii) estimular o dito indivíduo com um polipeptídeo HA de gripe (por exemplo, o polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito aqui (ou um ácido 5 nucleico que codifica o dito polipeptídeo HA de gripe, um vírus que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, uma VLP que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, etc.). Em uma modalidade específica, o polipeptídeo HA de gripe é um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza (ou porção desse) ao qual o indivíduo é virgem e um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza (ou porção desse) que é igual ou similar (por exemplo, da mesma cepa ou subtipo de vírus influenza) ao polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza no polipeptídeo de hemaglutinina sem cabeça (isto é, o polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza) usado na preparação da etapa (i). Em determinadas modalidades, o indivíduo pode ser administrado com um segundo estímulo, que compreende uma segunda administração de um polipeptídeo HA de gripe similar ou diferente descrito aqui (ou um ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo HA de gripe, um vírus que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, uma VLP que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, etc.). Em determinadas modalidades, o indivíduo pode ser administrado com um terceiro estímulo, que compreende uma terceira administração de um polipeptídeo HA de gripe similar ou diferente descrito aqui (ou um ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo HA de gripe, um vírus que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, uma VLP que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, etc.). Em modalidades específicas, o polipeptídeo HA de gripe (que em modalidades específicas é um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza 5 quimérico) usado no segundo e/ou terceiro estímulo compreende um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que é igual ou similar ao polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza da HA sem cabeça e pode ou não compreender uma 10 cabeça diferente. Em determinadas modalidades, o período de tempo entre a preparação e o estímulo, ou entre os estímulos se mais de um estímulo for administrado, do dito indivíduo pode ser, por exemplo, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, ou mais. Em 15 determinadas modalidades, o período de tempo entre a • preparação e o estímulo (ou entre os primeiro e segundo estímulos) do dito indivíduo pode, por exemplo, variar de 3-5 dias, 7-10 dias, 7-14 dias, 14-21 dias, 14-28 dias, 21- 28 dias, 21 dias a 1 mês, 1 mês a 2 meses, 1 mês a 3 meses, 20 2 meses a 3 meses, 2 meses a 4 meses, ou 4 meses a 6 meses.
Em outra modalidade, proporciona-se aqui um método de imunizar um indivíduo contra uma doença ou infecção por vírus influenza que compreende (i) preparar o dito indivíduo ao administrar ao dito indivíduo um primeiro 25 polipeptídeo HA de gripe (por exemplo, polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito aqui (ou um ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo HA de gripe, um vírus que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, uma VLP que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, 30 etc.) e, após um período de tempo, e (ii) estimular o dito indivíduo com um segundo polipeptideo HA de gripe (por exemplo, o polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito aqui (ou um ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo HA de gripe, um vírus que expressa o 5 dito polipeptídeo HA de gripe, uma VLP que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, etc.). Em uma modalidade específica, o segundo polipeptídeo HA de gripe é um polipeptideo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza (ou porção desse) ao qual o indivíduo é virgem e um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza (ou porção desse) que é igual ou similar (por exemplo, da mesma cepa ou subtipo de vírus influenza) ao polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza do primeiro polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico usado na preparação da etapa (i). Em determinadas modalidades, o indivíduo pode ser administrado com um segundo estímulo, que compreende uma segunda administração do primeiro ou segundo polipeptídeo HA de gripe (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico), ou um polipeptídeo HA de gripe diferente (por exemplo, um polipeptídeo dc hemaglutinina de vírus influenza quimérico)
descrito aqui (ou um ácido nucleico que codifica o dito polipeptídeo HA de gripe, um vírus que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, uma VLP que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, etc.). Em determinadas modalidades, o indivíduo pode ser administrado com um terceiro estímulo, que compreende a administração de um mesmo polipeptídeo HA de gripe (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) anteriormente administrado ou um polipeptídeo HA de gripe diferente (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito aqui (ou um ácido 5 nucleico que codifica o dito polipeptídeo HA de gripe, um vírus que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe e, uma VLP que expressa o dito polipeptídeo HA de gripe, etc.). Em modalidades específicas, o polipeptídeo HA de gripe usado no segundo e/ou terceiro estímulo é um polioeotídeo de 10 hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que é igual ou similar ao polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza do primeiro polipeptídeo HA de gripe (que em modalidades 15 específicas, é um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) e pode ou não compreender uma cabeça diferente. Em determinadas modalidades, o período de tempo entre a preparação e o estímulo, ou entre os estímulos se mais de um estímulo for administrado, do dito indivíduo 20 pode ser, por exemplo, 1 semana, 2 semanas, 3 semanas, 4 semanas, 1 mês, 2 meses, 3 meses, ou mais. Em determinadas modalidades, o período de tempo entre a preparação e o estímulo (ou entre os primeiro e segundo estímulos) do dito indivíduo pode, por exemplo, variar de 3-5 dias, 7-10 dias, 25 7-14 dias, 14-21 dias, 14-28 dias, 21-28 dias, 21 dias a 1 mês, 1 mês a 2 meses, 1 mês a 3 meses, 2 meses a 3 meses, 2 meses a 4 meses, ou 4 meses a 6 meses.
5.1 POLIPEPTÏDEOS DE HEMAGLUTININA DE VÌRUS DA
GRIPE QUIMÉRICO
Proporcionam-se aqui polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico que compreendem ou consistem em um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglútinina de vírus influenza e um polipeptídeo de 5 domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza (por exemplo, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza e o polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza são derivados de subtipos de hemaglutinina de vírus influenza diferentes). Os polipeptídeos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza são descritos na Seção 5.2, infra. Os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza, que são capazes de formar domínios de tronco sem cabeça estáveis, são descritos na Seção 5.3, infra.
Uma hemaglutinina de vírus influenza de comprimento completo compreende tipicamente um domínio HAl e um domínio HA2. O domínio de tronco é formado por dois segmentos do domínio HAl e a maior parte ou todo o domínio HA2. Os dois segmentos do domínio HA1 são separados, na sequência primária, pelo domínio de cabeça globular (veja, por exemplo, os resíduos de aminoácido entre os resíduos designados Ap e Aq na Figura 1). Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico descritos aqui mantêm essa estrutura. Isto é, em determinadas modalidades, os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico descritos aqui çompreendem uma estrutura de tronco estável composta de um domínio HAl e um domínio HA2, e um domínio de cabeça globular que separa os dois segmentos do domínio HAl (na sequência primária), em que o dito domínio de cabeça 5 globular é heterólogo ao domínio de tronco formado pelos outros segmentos do domínio HA1 e domínio HA2.
Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui (veja, por exemplo, a Seção 5.1.2, infra) ou um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influeiza de qualquer cepa ou subtipo conhecido de vírus influenza conhecido (por exemplo, qualquer polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza tipo selvagem como o domínio de tronco da hemaglutinina de um. vírus influenza descrito na Seção 5.4, infra) e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui (veja, por exemplo, as Seções 5.2 e
5.4.2, infra) ou um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de qualquer cepa ou subtipo conhecido de vírus influenza conhecido (por exemplo, qualquer polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza tipo selvagem), em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza, e em que dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de virus influenza de vírus influenza A subtipo H1 ou H3.
Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui 5 compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui (veja, por exemplo, a Seção 5.3 e 5.4.1, infra) ou um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de qualquer cepa ou subtipo conhecido de vírus influenza conhecido (por exemplo, qualquer polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza tipo selvagem) e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui (veja, por exemplo, se Seções 5.2 e 5.4.2 , infra) ou um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de qualquer cepa ou subtipo conhecido de vírus influenza conhecido (por exemplo, qualquer polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza tipo selvagem), em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza, e em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de vírus influenza A subtipo H2.
Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui 3Q (veja, por exemplo, as Seções 5.3 e 5.4.1, infra) ou um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de qualquer cepa ou subtipo conhecido de vírus influenza (por exemplo, qualquer polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza tipo selvagem) e 5 (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui (veja, por exemplo, as Seções 5.2 e 5.4.2 , infra) ou um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de qualquer cepa ou subtipo conhecido de vírus influenza (por exemplo, 10 qualquer polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza tipo selvagem), em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza, e em que o dito 15 polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é um polipeptideo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de virus influenza A de subtipo H5.
Em uma modalidade específica, proporciona-se aqui 20 um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui (veja, por exemplo, as Seções 5.3 e 5.4.1, infra) ou um polipeptídeo de domínio de tronco de 25 hemaglutinina de vírus influenza de qualquer cepa ou subtipo conhecido de vírus influenza (por exemplo, qualquer polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza tipo selvagem) e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de vírus 30 influenza A subtipo Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, HiO,
10 1 / 6 48 H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. 5 Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui (veja, por exemplo, a Seção 5.3 e 5.4.1, 10 infra) ou um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de qualquer cepa ou subtipo conhecido de vírus influenza (por exemplo, qualquer polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza tipo selvagem) e (ii) um polipeptídeo de domínio 15 de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de vírus influenza A subtipo H4, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de 20 hemaglutinina de vírus influenza.
Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza 25 descrito aqui (veja, por exemplo, a Seção 5.3 e 5.4.1, infra) ou um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de qualquer cepa ou subtipo conhecido de vírus influenza (por exemplo, qualquer polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus 30 influenza topotipo selvagem) e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de vírus influenza aviário de subtipo H1, H2, ou H3, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de 5 domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza.
Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui (veja, por exemplo, a Seção 5.3 e 5.4.1, infra) ou um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de qualquer cepa ou subtipo conhecido de vírus influenza (por exemplo, qualquer polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza tipo selvagem) e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de vírus influenza de cavalo de subtipo H3, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza.
Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus influenza A de subtipo H1 e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, H16, 5 ou H17. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H1, H2, ou H3. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus 10 influenza A de subtipo H5.
Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de 15 um vírus influenza A de subtipo H3 e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de 1 um vírus influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17 em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de 20 vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H4, H7, H10, H14, ou H15. Em outra 25 modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H1, H2, ou H3. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus 30 influenza A de subtipo H5.
Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de 5 um vírus influenza A de subtipo H2 e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus influenza A de subtipo U1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17 em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de 10 vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo Hl, H2, ou H3. Em outra 15 modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça 1 de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H5.
Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza 20 quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17 e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus 25 influenza de um vírus influenza B, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza.
Em outra modalidade específica, proporciona-se 30 aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus influenza B e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus 5 influenza A de subtipo Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Em uma 10 modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus 15 influenza não é de urn vírus influenza A de subtipo Hl, H2, ou H3. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H5.
Em outra modalidade específica proporciona-se 20 aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus influenza B e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus 25 influenza B, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de virus influenza.
Em outra modalidade específica, proporciona-se 30 aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de vírus influenza A A/California/7/2009 (H1) e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus 5 influenza de um vírus influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, ou H16. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo Hl. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H2. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H3.
Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H5.
Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de vírus influenza A A/California/7/2009 (H1) e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus influenza A de subtipo H2, H4, H5, H6,
H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H4. Em uma modalidade específica, o 5 polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H5. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza
A de subtipo H6. Em uma modalidade específica, o 10 polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H7. Em uma modalidade específica, o polipeptideo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H8. Em uma modalidade específica, o 15 polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus
J influenza é de um vírus influenza A de subtipo H9. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H10. Em uma modalidade específica, o 20 polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H11. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H12. Em uma modalidade específica, o 25 polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H13. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H14. Em uma modalidade específica, o 30 polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H15. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H16. 5 Em outra modalidade específica, proporciona--se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de vírus influenza A tipo A/Brisbane/59/2007 (H1) e (ii) um 10 polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito 15 polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, ou H16. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo 20 de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo Hl. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H2. Em outra modalidade específica, 25 o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H3.
Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H5.
Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptideo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de 5 vírus influenza A A/South Carolina/1918 (H1) e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, Hll, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que o dito polipeptideo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de üm vírus .influenza A de subtipo H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, ou H16. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H1. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H2. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H3. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H5.
Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza. quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de vírus influenza A A/USSR/92/1977 (H1) e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de 5 hemaglutinina de vírus influenza é heterálogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, ou H16. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H1. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H2. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H3. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H5.
Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de vírus influenza A A/California/04/2009 (Hl) e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, ou H16. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo Hl. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H2. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H3.
Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H5.
Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de vírus influenza A A/Perth/16/2009 (H3) e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H4, H7, H10, H14, ou H15. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H5. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de A/Viet Nam/1203/04 (H5). Em outra 5 modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H7. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de A/Alberta/24/01 (H7). Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H1. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinína de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H2.
Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H3. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H5.
Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de vírus influenza A tipo A/Brisbane/10/2007 (H3) e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H4, H7, H10, H14, ou H15. 5 Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H1. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H2. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H3.
Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H5.
Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de vírus influenza A A/Hong Kong/1/1968 (H3) e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterálogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de dm vírus influenza A de subtipo H4, H7, H10, H14, ou H15. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H1. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus 5 influenza A de subtipo H2. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H3.
Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H5.
Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de vírus L influenza A A/California/1/1988 (H3) e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heter©logo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Em uma modalidade especifica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H4, H7, H10, H14, ou H15. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H1. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H2. Em outra modalidade específica,
115/64fá o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H3.
Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um 5 vírus influenza A de subtipo H5.
Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de vírus influenza A A/Ann Arbor/6/60 (H2) e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, 1 r H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H4, H7, H10, H14, ou H15. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H1. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus 1 influenza A de subtipo H2. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H3. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H5.
Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende ou consiste em (i) um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de 5 vírus influenza A A/Puerto Rico/8/1934 (Hl) e (ii) um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de um vírus influenza A de subtipo H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou
H17, em que o dito polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é heterólogo ao dito polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza.
Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H1, H2, H4, H5, H6, H7, H9, H10, H14, ou H15. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um virus influenza A de subtipo H1, H2, H5, H6, ou H9. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H1. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H2. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de dorrníniu de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H3. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza não é de um vírus influenza A de subtipo H5. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H5. Em outra modalidade específica, o r polipeptídeo de domínio de cabeça hemaglutinina de vírus influenza é de A/Viet Nam/1203/04 (H5). Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de 5 hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H6. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza é de A/mallard/Sweden/81/02 (H6). Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça 10 de hemaglutinina de vírus influenza é de um vírus influenza A de subtipo H9. Em outra modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de virus influenza é de A/guinea fowl/Hong Kong/WE10/99 (H9).
Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de 15 hemaglutinina de vírus influenza quimérico fornecido aqui compreende um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza e um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza, em que o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de 20 vírus influenza é heterólogo ao polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza, e em que o polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico possui uma estrutura primária de, na seguinte ordem: um s mento de tronco N-terminal HAl, um polipeptídeo de 25 domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza, um segmento de tronco C-terminal HA1 e uma HA2. A sequência primária de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico fornecido aqui pode ser formada por um único polipeptídeo, ou pode ser formada por múltiplos 30 polipeptídeos. Tipicamente, um único polipeptídeo é expresso por qualquer técnica considerada adequada por um 1 elemento versado na técnica.
Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico fornecido aqui é 5 monomérico. Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico fornecido aqui é multimérico. Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico fornecido aqui é trimérico. 10 Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico fornecido aqui compreende um peptídeo de sinal. Tipicamente, o peptídeo de sinal é clivado durante ou após a expressão e tradução de polipeptídeo para produzir um polipeptídeo de hemaglutinina 15 de vírus influenza quimérico maduro. Em determinadas modalidades, também proporcionam-se aqui polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico maduros que são desprovidos de um peptídeo de sinal. Em modalidades onde um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico 20 fornecido aqui compreende um peptídeo de sinal, o peptídeo de sinal pode ser baseado em qualquer peptídeo de sinal de vírus influenza conhecido por elementos versados na técnica. Em determinadas modalidades, os peptídeos de sinal são baseados em peptídeos de sinal de influenza A. Em 25 determinadas modalidades, os peptídeos de sinal são baseados no peptídeo de sinal de uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do grupo que consiste em H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e H17. Em determinadas modalidades, o peptídeo de 30 sinal pode ser qualquer peptídeo de sinal considerado útil por um elemento versado na técnica. Em determinadas V modalidades, o peptídeo de sinal é selecionado a partir de SEQ ID NOS:18-33.
Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de 5 hemaglutinina de vírus influenza quimérico fornecido aqui compreende um domínio luminal. Em modalidades onde um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico fornecido aqui compreende um domínio luminal, o domínio luminal pode ser baseado em qualquer domínio luminal de 10 influenza conhecido pelos elementos versados na técnica. Em determinadas modalidades, os domínios luminais são baseados em domínios luminais de influenza A. Em determinadas modalidades, os domínios luminais são baseados no domínio luminal de uma hemaglutinina de vírus influenza A • 15 selecionada a partir do grupo que consiste em Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e H17. Em determinadas modalidades, o domínio luminal pode ser qualquer domínio luminal considerado útil por um elemento versado na técnica. Em determinadas modalidades, o 20 domínio luminal é selecionado a partir de SEQ ID NOS:98-113.
Em determinadas modalidades, os domínios luminais são mesma hemaglutinina que o domínio de tronco. Em determinadas modalidades, os domínios luminais são da cepa ou subtipo de vírus influenza como a subunidade HA2 de domínio de tronco. 25 Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico fornecido aqui compreende um domínio de transmembrana. Em modalidades onde um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico fornecido aqui compreende um domínio de 30 transmembrana, o domínio de transmembrana pode ser baseado em qualquer domínio de transmembrana de influenza conhecido pelos elementos versados na técnica. Em determinadas modalidades, os domínios de transmembrana são baseados em domínios de transmembrana de influenza A. Em determinadas 5 modalidades, os domínios de transmembrana são baseados em um domínio de transmembrana de uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do grupo que consiste em H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e H17. Em determinadas modalidades, o domínio de transmembrana pode ser qualquer domínio de transmembrana considerado útil por um elemento versado na técnica. Em determinadas modalidades, o domínio de transmembrana é selecionado a partir de SEQ ID NOS:114-129. Em determinadas irtodalidades, os domínios de transmembrana são da mesma hemaglutinina que o domínio de tronco. Em determinadas modalidades, os domínios de transmembrana são da cepa ou subtipo de virus influenza como a subunidade HA2 de domínio de tronco.
Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico fornecido aqui compreende um domínio citoplásmico. Em modalidades onde um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico fornecido aqui compreende um domínio citoplásmico, o domínio citoplásmico deve ser baseado em qualquer domínio citoplásmico de influenza conhecido pelos elementos versados na técnica. Em determinadas modalidades, os domínios citoplásmicos são baseados em domínios citoplásmicos de influenza A. Em determinadas modalidades, os domínios citoplásmicos são baseados em um domínio citoplásmico de uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do grupo que consiste em Hl, H2, H3, o H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e H17. Em determinadas modalidades, o domínio citoplásmico pode ser qualquer domínio citoplásmico considerado útil por 5 um elemento versado na técnica. Em determinadas modalidades, o domínio citoplásmico é selecionado a partir de SEQ ID NOS:130-145. Em determinadas modalidades, os domínios citoplásmicos são da mesma hemaglutinina que o domínio de tronco. Em determinadas modalidades, os domínios 10 citoplásmicos são da cepa ou subtipo de vírus influenza como a subunidade HA2 de domínio de tronco.
Em determinadas modalidades, um ou mais sítios de glicosilação em um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico fornecido aqui são modificados (por 15 exemplo, por adição, deleção ou substituição de aminoácido). Em modalidades específicas, um ou mais sítios de glicosilação são modificados de modo que a glicosilação nesses sítios não ocorra durante o processamento e maturação do polipeptídeo. Os elementos versados na técnica 20 irão reconhecer que a HA de influenza compreende tipicamente um ou mais sítios de glicosilação (por exemplo, Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido ou Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, ou, em determinadas modalidades, em que Xaa é qualquer aminoácido exceto Pro). Em determinadas 25 modalidades, o sítio de glicosilação modificado fica localizado no domínio de tronco do polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico. Em determinadas modalidades, um ou mais resíduos de aminoácido em um sítio de glicosilação são substituídos de maneira conservadora 30 por um resíduo de aminoácido que interrompe o sítio de glicosilação. Em determinadas modalidades, um ou mais
M resíduos de aminoácido em um sítio de glicosilação são substituídos por qualquer resíduo de aminoácido que interrompe o sítio de glicosilação. Em determinadas 5 modalidades, um ou mais resíduos de asparagina em um sítio de glicosilação são substituídos por alanina. Em uma modalidade particular, a asparagina na posição 38 de uma hemaglutinina H3 é alterada para uma alanina. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina 10 de vírus influenza quimérico compreende um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural em seu domínio de cabeça globular. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados 15 e/ou sítios de glicosilação de ocorrência não-natural como discutido na Seção 5.4, infra.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico fornecidos aqui são capazes de formar uma estrutura tridimensional que é 20 similar à estrutura tridimensional de uma hemaglutinina de vírus influenza nativa. A similaridade estrutural pode ser avaliada com base em qualquer técnica considerada adequada por elementos versados na técnica. Por exemplo, a reação, por exemplo, sob condições não-desnaturantes, de um 25 polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico com um anticorpo ou antissoro neutralizante que reconhece uma hemaglutinina de vírus influenza nativa pode indicar similaridade estrutural. Os anticorpos ou antissoros neutralizantes úteis são descritos, por exemplo, em Sui, et 30 a1., 2009, Nat. Struct. Moi. Biol. 16(3):265-273, Ekiert et al., February 26, 2009, Science [DOI:
10.1126/science.1171491], e Kashyap et a1., 2008, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105(16):5986-5991, cujos conteúdos estão aqui incorporados a título referência em sua 5 totalidade. Em determinadas modalidades, o anticorpo ou antissoro é um anticorpo ou antissoro que reage com um epítopo não-contíguo (isto é, não contíguo na sequência primária) que é formado pela estrutura terciária ou quaternária de uma hemaglutinina. 10 Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico fornecidos aqui compreendem ainda um ou mais domínios de polipeptídeo. Os domínios de polipeptídeo úteis incluem domínios que facilitam a purificação, enovelamento e clivagem de porções 15 de um polipeptídeo. Por exemplo, um tag de His (His-His- His-His-His-His, SEQ ID NO:166), epítopo FLAG ou outro tag de purificação pode facilitar a purificação de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico fornecido aqui. Em algumas modalidades, o tag de His possui 20 a sequência, (His),,, em que n é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou maior. Um domínio foldon ou de trimerização de fibritina de bacteriófagn T4 pode facilitar a trimerizaçao de polipeptídeos fornecidos aqui. Em algumas modalidades, o 25 domínio de trimerização compreende uma repetição de trimerização heptavalente GGN4pII tipo selvagem ou uma repetição de trimerização heptavalente GCN4pII modificada que permite a formação de bobinas enroladas triméricas ou tetraméricas. Veja, por exemplo, Weldon et al., 2010, 30 PLoSONE 5(9): e12466. O domínio foldon pode ter qualquer sequência foldon conhecida pelos elementos versados na técnica (veja, por exemplo, Papanikolopoulou et a1., 2004, J. Bio2. Chem. 279(10) :8991-8998, cujos conteúdos estão aqui incorporados a título referência em sua totalidade. Exemplos incluem GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO:167). Um domínio foldon pode ser útil para facilitar a trimerização de polipeptídeos solúveis fornecidos aqui. Os sítios de clivagem podem ser usados para facilitar a clivagem de uma porção de um polipeptídeo, por exemplo, a clivagem de um tag de purificação ou domínio foldon ou ambos. Os sítios de clivagem úteis incluem um sítio de clivagem de trombina, por exemplo, um com a sequência LVPRGSP (SEQ ID NO:168). Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem é um sítio de clivagem reconhecido por protease de Vírus Etch do Tabaco (TEV) (por exemplo, sequência de aminoácido Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)). Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quiméricos são polipeptídeos solúveis, como aqueles descritos nos Exemplos 20 6 e 9, infra.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza dos polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico descritos aqui mantêm os resíduos de cisteína identificados nos polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza como Ap e Aq na Figura 1, isto é, os resíduos de cisteína identificados nos polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza como Ap e Aq na Figura 1 são mantidos nos polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico descritos aqui. Assim, em determinadas modalidades, na sequência primária de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui: (i) o segmento N- terminal de um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de virus influenza termina no resíduo de 5 cisteína identificado como Ap na Figura 1, (ii) o segmento C-terminal de um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza começa no resíduo de cisteína identificado como Aq na Figura 1; e (iii) o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus 10 influenza (que é heterólogo ao polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza) está entre os segmentos N-terminal e C-terminal do polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de ' 15 vírus influenza são descritos em detalhes na Seção 5.1.2, infra.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HA1 dos polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico descrito aqui não termina exatamente em 20 Ap (por exemplo, Cys 52 de uma subunidade HA1 de uma hemaglutinina H3), porém em um resíduo em sequência e adjacências estruturais a A. Por exemplo, em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HA1 dos polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico 25 descritos aqui termina em Ap -1 , Ap_2 , Ap_3 , Ap-4 , Ap _5 , Ap_6 , Ap-7 , Ap-8,, Ap-9, Ap-10, Ap-11, Ap-12, Ap-13, Ap-14, Ap-15, Ap-16, Ap-17, Ap-18, Ap-19, Ap-2a, Ap-21, Ap-22, Ap-23, Ap-23, Ap-29, Ap-25, Ap-26, Ap-27, Ap- 28, Ap-29 , Ap _ 3a . Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HA1 dos polipeptídeos de hemaglutinina de 30 vírus da gripe quimérico descrito aqui termina na faixa de
A p'-1 a Ap-3, Ap--3 a Ap-5, Ap-5 a Ap-8, Ap-8 a Ap-l0, Ap-10 a Ap-15, Ap- 15 a Pip -20, Ap-20 a Ap-30, Ap-30 a Ap-46. Por exemplo, um segmento de tronco N-terminal HA1 que termina em Ap-10 poderia terminar em Lys42 de uma hemaglutinina H3. Em determinadas 5 modalidades, o segmento de tronco N-terminal HAl dos polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico descritos aqui termina em Ap+1, Ap+2, Ap+3, Ap+4, Ap+5, Ap+6, Ap+7r Ap+B, Ap+9, Ap+10, Ap+11, Ap+12, Ap+13, Ap+14, Ap+15, Ap+16, Ap+17, A+1, A+19 Ap+20, Ap+21, Ap+19, Ap+22, Ap+23, Ap+24, Ap+25, Ap+26, Ap+27, Ap+28, Ap+29, 10 Ap+30, Ap+31, Ap+32, Ap+33, Ap+34, Ap+35, Ap+36, Ap+37, Ap+38, Ap+39, A + 40.
Em Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N- terminal HAl dos polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico descrito aqui termina na faixa de A p+1 a Ap+5 , Ap+5 a +gyp+10, A+10 a Ap+15, Ap+15 a Ap+20, Ap+20 a Ap+25, Ap+25 a Ap+30, 15 Ap+30 a Ap+35, Ap+35 a Ap+40, ou Ap+40 a Ap+50. Por exemplo, um segmento de tronco N-terminal HAl que termina em Ap+3a poderia terminar em Arg90 de uma hemaglutinina H3. © final de um segmento de tronco N-terminal HAl deve ser selecionado em conjunto com o final do segmento de tronco C-terminal HA1 e o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza de modo que o polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico resultante seja capaz de formar uma estrutura tridimensional similar a uma hemaglutinina de vírus influenza tipo selvagem. Nessas modalidades, um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza (que é heterólogo ao polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza) fica localizado, ria sequência primária, entre os segmentos N-terminal e C-terminal do polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco C-terminal HA1 dos polipeptideos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico descritos aqui não começa em Aq (por exemplo, Cys277 de uma subunidade HAl de uma hemaglutinina 5 H3), porém em um resíduo em sequência e adjacências estruturais a A.. Por exemplo, em determinadas modalidades, o segmento de tronco C-terminal HA1 dos polipeptideos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico descritos aqui começa mais ou menos em Aq-1, Aq-2 i Aq-3 i Aq-4, Aq-5, Aq-6, Aq-7, Aq-8 , Aq-9, Aq- q- lo, A 1i. Aq-13~ Aq-12, A q-14r Aq-15, A A q-20f A q-25i q-3flr Aq- 35, Aq-40, Aq-45, Aq-50, Aq-55, Aq-60, Aq-65, Aq-70, Aq-75, Ou Aq-g0.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco C- terminal HAl dos polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico descritos aqui começa na faixa de Aq-1 a Aq_5i 15 Aq-5 a Aq-lo, Aq-lo a Aq-15, Aq-is a Aq-2o, Aq-2o a Aq-25, Aq-25 a Aq-3o, Aq-30 a Aq-35, Aq-35 a Aq-4D, Aq-40 a Aq-45, Aq-45 a Aq-56, Aq-5Q a Aq-55, Aq-55 a Aq-60, Aq-6o a Aq-65, Aq-65 a Aq-70, Aq-75 a Aq_ o. Por exemplo, um segmento de tronco C-terminal HAl que termina em Aq_ 77 poderia começar em G1y200 de uma hemaglutinina H3; e um segmento de tronco C-terminal HAl que termina em Aq-lo poderia começar em Isoleucina 262 de uma hemaglutinina H3. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco C- terminal HA.1 dos polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico descritos aqui começa em Aq+l, Aq+2, Aq+3, Aq+4, Aq+5, Aq+6, Aq+7, Aq+e, Aq+9, Aq+10, Aq+l+, Aq+12, Aq+13, Aq+14, Aq+15, Aq+16, Aq+17, Aq+18, Aq+19, Aq+20, Aq+21, Aq+22 , esq+23, Aq+24, Aq+25, Aq+26, Aq+27, Aq+2b, Aq+29, Aq+3o. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco C-terminal HA1 dos polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico descritos aqui 30 começa na faixa de Aq+l a Aq+3, Aq+3 a Aq+5, Aq+5 a Aq+s, Aq+e a
Aq+io, Aq+io a Aq+15, ou Aq+ls a Aq+20. 0 final de um segmento de tronco N-terminal HA1 deve ser selecionado em conjunto com o início do segmento de tronco C-terminal HAl e o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus 5 influenza de modo que o polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico resultante seja capaz de formar uma estrutura tridimensional similar a uma hemaglutinina de vírus influenza tipo selvagem.
Nessas modalidades, um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus 10 influenza (que é heterólogo ao polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza) fica localizado, na sequência primária, entre os segmentos N-terminal e C- terminal do polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. 15 Em um exemplo, um segmento de tronco N-terminal
HAl de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui pode terminar em qualquer uma das posições de aminoácido de hemaglutinina 45-48 (utilizando a numeração H3) e um segmento de tronco C-terminal HAl do 20 polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico pode começar em qualquer uma das posições de aminoácido de hemaglutinina 285-290 (utilizando a numeração H3); e o domínio de cabeça heterólogo pode começar em qualquer uma das posições de aminoácido 46-49 e terminar em qualquer 25 posição de aminoácido 284-289 (utilizando a numeração H3)_ Em outro exemplo, um segmento de tronco N-terminal HAl de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui termina na posição de aminoácido de hemaglutinina 90 (utilizando a numeração H3) e um segmento 30 de tronco C-terminal HAl do polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico começa na posição de aminoácido de hemaglutinina 200 (utilizando a numeração H3); e o domínio de cabeça heterólogo começa na posição de aminoácido 91 e termina na posição de aminoácido 199 5 (utilizando a numeração H3).
Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Ap _ 1, e o início do segmento de tronco C-terminal de um polipeptídeo de 10 hemaglutinina de virus influenza quimérico descrito aqui é Aq_l. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Ap _ Z , e o início do segmento de tronco C-terminal de um polipeptídeo de ' 15 hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é • Aq_2. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é AF _ 3 , e o início do segmento de tronco C-terminal de um polipeptídeo de 20 hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Aq_3. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Ap _ 4 , e o início do segmento de tronco C-terminal de um polipeptídeo de 25 hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Aq_4. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é A,,_ 5 , e o início do segmento de tronco C-terminal de um polipeptídeo de 30 hemaglútinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é
Aq_5. Nessas modalidades, um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza (que é heterólogo ao polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza) fica localizado, na 5 sequência primária, entre os segmentos N-terminal e C- terminal do polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza.
Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Ap+l , e o início do segmento de tronco C-terminal é de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui Aq+l. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Ap+z, e o início do segmento de tronco C-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Aq+2. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Ap+3, e o início do segmento de tronco C-terminal é de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui Aq+3. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Ap+4, e o início do segmento de tronco C-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Aq+4. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N~terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é A~,+5, e o início do segmento de tronco C-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Aq+5. Nessas modalidades, um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza (que é 5 heterólogo ao polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza) fica localizado, na sequência primária, entre os segmentos N-terminal e C- terminal do polipeptideo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza.
Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Ap_1, e o início do segmento de tronco C-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Aq+i.
Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Ap_2, e o início do segmento de tronco C-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Aq+2. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Ap_ 3i e o início do segmento de tronco C-terminal é de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui Ag +3. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Ap_4, e o início do segmento de tronco C-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Aq+4. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Ap _ 5 , e o início do segmento de tronco C-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é 5 Aq+s. Nessas modalidades, um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza (que é heterólogo ao polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza) fica localizado, na sequência primária, entre os segmentos N-terminal e C- 10 terminal do polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza.
Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Ap+1, e o início • 15 do segmento de tronco C-terminal de um polipeptídeo de • hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Aq_,i. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Ap+2, e o início 20 do segmento de tronco C-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Aq _2. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Ap+3, e o início 25 do segmento de tronco C-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Aq _ 3. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Ap+4, e o início 30 do segmento de tronco C-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Aq _ 4 Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N--terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é AP+5, e o início do segmento de tronco C-terminal de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito aqui é Aq _ 5. Nessas modalidades, um polipeptideo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza (que é heterólogo ao polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza) fica localizado, na sequência primária, entre os segmentos N-terminal e C- terminal do polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza.
Também proporcionam-se aqui polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quiméricos que compreendem uma subunidade HA2 e uma subunidade HAl quimérica.
Em determinadas modalidades, a subunidade HA1 de quimérico compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14,
15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44,
45, 46, 47, 48, 49, 60, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75,
75, 76, 77, 78, 79, ou 80 aminoácidos da subunidade HAl de uma primeira cepa ou subtipo de vírus influenza e o restante de aminoácidos da subunidade HA1 de quimérico são de uma segunda cepa ou subtipo de vírus influenza.
Em determinadas modalidades, a subunidade HAl quimérica compreende 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, ou 90-100 aminoácidos da subunidade HAl de uma primeira cepa ou subtipo de vírus influenza e o restante de aminoácidos da subunidade HA1 de quimérico é de uma segunda cepa ou subtipo de vírus influenza. Em determinadas modalidades, os aminoácidos da primeira cepa ou subtipo de vírus influenza podem ser consecutivos, ou 5 podem representar porções das N- e/ou C-terminações de um domínio HA1 quimérico. Em modalidades específicas, a subunidade HA1 de quimérico compreende um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que compreende aminoácidos de dois ou mais subtipos ou cepas 10 diferentes de vírus influenza. Em modalidades específicas, a subunidade HA1 de quimérico compreende uma cabeça globular com aminoácidos de dois ou mais subtipos ou cepas diferentes de vírus influenza.
Será entendido pelos elementos versados na • 15 técnica que os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico fornecidos aqui podem ser preparados de acordo com qualquer técnica conhecida ou considerada adequada pelos elementos versados na técnica, inclusive as técnicas descritas aqui. Em determinadas modalidades, os 20 polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico são isolados.
5.2 INFLUENZA HEMAGGLUTININ HEAD DOMAIN
POLYPEPTIDES Proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de 25 cabeça de hemaglutinina de vírus influenza para uso na geração dos polipeptídeos HA de gripe, inclusive os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico, descritos aqui.
Geralmente, os polipeptideos de domínio de cabeça 30 de hemaglutinina de vírus influenza fornecidos aqui são polipeptídeos que compreendem ou consistem essencialmente no domínio de cabeça globular de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza. 0 domínio de cabeça de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza é o 5 domínio de cabeça que é geralmente reconhecido por elementos versados na técnica.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza fornecidos aqui compreendem um domínio de cabeça de 10 hemaglutinina de vírus influenza que possui pelo menos 70s, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 98%, ou 99% identidade de sequência de aminoácido a um domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza conhecido pelos elementos versados na técnica. 15 Também proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem aminoácidos de duas ou mais cepas ou subtipos de vírus influenza. Em determinadas modalidades, a quimérico subunidade HA1 compreende 1, 2, 3, 1, 5, 6, 7, 8, 20 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 60, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 75, 76, 77, 78, 79, ou 80 25 aminoácidos da subunidade HA1 de uma primeira cepa ou subtipo de vírus influenza e o restante de aminoácidos da subunidade HA1 de quimérico são de uma segunda cepa ou subtipo de vírus influenza. Em determinadas modalidades, uma subunidade HAl de quimérico compreende 1-10, 10-20, 20- 30 30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, ou 90-100 aminoácidos da subunidade HA1 de uma primeira cepa ou subtipo de vírus influenza e o restante de aminoácidos da subunidade. HA1 de quimérico são de uma segunda cepa ou subtipo de vírus influenza. Em determinadas modalidades, os 5 aminoácidos da primeira cepa ou subtipo de vírus influenza podem ser consecutivos e/ou podem representar porções das N- e/ou C-terminações de um domínio HAlquimérico.
Também proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que 10 compreendem formas deletadas de um domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza conhecido, em que até cerca de 150, 145, 140, 135, 130, 125, 120, 115, 110, 105, 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduos de • 15 aminoácido são deletados do domínio de cabeça. Também proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas deletadas de um domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza conhecido, em que cerca de 1-10, 10-20, 20-30, 20 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, 130-140, ou 140-150 resíduos de aminoácido são deletados do domínio de cabeça. Proporcionam-se ainda aqui polipeptídeos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem 25 formas alteradas de um domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza conhecido, em que até cerca de 80, 75, 70 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduos de aminoácido do domínio de cabeça são substituídos (por exemplo, substituídos de 30 maneira conservadora) por outros aminoácidos. Também proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas alteradas de um domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza conhecido, em que até cerca de 1-10, 10-20, 20-30, 5 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, ou 90-100 resíduos de aminoácido do domínio de cabeça são substituídos (por exemplo, substituídos de maneira conservadora) por outros aminoácidos. Em determinadas modalidades, até 50, 60, ou mais aminoácidos são deletados 10 da N-terminação de um domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza (como observado a partir da sequência de aminoácido primária) e até 70, 80, ou mais aminoácidos são delatados da C-terminação de um domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza (como observado a partir ' 15 da sequência de aminoácido primária).
Também proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem uma deleção de uma ou mais regiões antigênicas (por exemplo, uma região do domínio de cabeça conhecida por 20 compreender ou consistir em um epítopo) associada ao domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza (por exemplo, sítios antigênicos A, B, C, e D, em que o domínio de cabeça é de subtipo H3 ou sítios antigênicos Sa, Sb, Ca e Cb, em que o domínio de cabeça é de subtipo H1) . Em uma 25 modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que compreende uma deleção de uma região antigênica (por exemplo, uma região do domínio de cabeça conhecida por compreender ou consistir em um epítopo). Em outra 30 modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que compreende uma deleção de duas regiões antigênicas (por exemplo, duas regiões do domínio de cabeça conhecidas por compreender ou consistir em um epítopo). Em outra 5 modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que compreende uma deleção de três regiões antigênicas (por exemplo, três regiões do domínio de cabeça conhecidas por compreender ou consistir em um epítopo). Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que compreende uma deleção de quatro regiões antigênicas (por exemplo, quatro regiões do domínio de cabeça conhecidas por compreender ou consistir em um epitopo). Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que compreende uma deleção de cinco regiões antigênicas (por exemplo, cinco regiões do domínio de cabeça conhecidas por compreender ou consistir em um epítopo). Os elementos versados na técnica podem determinar facilmente as regiões antigénicas (por exemplo, epitopos) de domínios de cabeça de influenza conhecidos na técnica ou posteriormente identificados utilizando técnicas conhecidas pelos elementos versados na técnica e descritas aqui. 25 Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza dos polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico descritos aqui compreendem (i) uma, duas, três, ou mais regiões antigênicas de um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que são homólogas ao
139/64$ domínio de tronco (isto é, derivadas da mesma cepa ou subtipo de vírus influenza) e (ii) uma, duas, três, ou mais regiões antigénícas de um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que são heterólogas ao 5 domínio de tronco (isto é, derivadas de uma cepa ou subtipo de vírus influenza diferente). Em uma modalidade específica,
o sítio/região antigênica C do domínio de cabeça é homólogo ao domínio de tronco (isto é, derivado da mesma cepa ou subtipo de vírus influenza). Em outra modalidade específica, 10 o sítio/região antigênica D do domínio de cabeça é homólogo ao domínio de tronco (isto é, derivado da mesma cepa ou subtipo de vírus influenza). Em outra modalidade específica, os sítios/regiões antigênicas C e D do domínio de cabeça são homólogos ao domínio de tronco (isto é, derivados da 15 mesma cepa ou subtipo de vírus influenza). Ainda em outra modalidade específica, os sítios/regiões antigênicas Ca e/ou Cb do domínio de cabeça são homólogos ao domínio de tronco (isto é, derivados da mesma cepa ou subtipo de vírus influenza). 20 Também proporcionam-se polipeptídeos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem a substituição de um ou mais das regiões antigênicas (por exemplo, uma região do domínio de cabeça conhecida por compreender ou consistir em um epítopo)
25 associada ao domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza por uma sequência de polipeptídeo não-antigênica (por exemplo, uma sequência de polipeptideo que é conhecida por não induzir uma resposta imunológica ou é conhecida por gerar uma resposta imunológica que é não específica à 30 influenza). Em uma modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que compreende a substituição de uma região antigénica (por exemplo, uma região do domínio de cabeça conhecida por compreender ou consistir em um epítopo) 5 por uma sequência de polipeptídeo não-antigênica (por exemplo, uma sequência de polipeptídeo que é conhecida por não induzir uma resposta imunológica ou é conhecida por gerar uma resposta imunológica que é não específica à influenza). Em outra modalidade específica, proporciona-se 10 aqui um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que compreende a substituição de duas regiões antigênicas (por exemplo, duas regiões do domínio de cabeça conhecidas por compreender ou consistir em um epítopo) por sequências de polipeptídeo não-antigênicas • 15 (por exemplo, sequências de polipeptídeo que são conhecidas por não induzir uma resposta imunológica ou são conhecidas por gerar uma resposta imunológica que é não específica à influenza). Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina
20 de vírus influenza que compreende uma substituição de três regiões antigênicas (por exemplo, três regiões do domínio de cabeça conhecidas por compreender ou consistir em um epítopo) por sequências de polipeptídeo não-antigênicas (por exemplo, sequências de polipeptídeo que são conhecidas
25 por não induzir uma resposta imunológica ou são conhecidas por gerar uma resposta imunológica que é não específica à influenza). Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que compreende uma substituição de 30 quatro regiões antigênicas (por exemplo, quatro regiões do domínio de cabeça conhecidas por compreender ou consistir em um epítopo) por sequências de polipeptídeo não- antigênicas (por exemplo, sequências de polipeptídeo que são conhecidas por não induzir uma resposta imunológica ou 5 são conhecidas por gerar uma resposta imunológica que é não específica à influenza). Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que compreende uma substituição de cinco regiões antigénicas (por exemplo, cinco regiões do domínio de cabeça conhecidas por compreender ou consistir em um epítopo) por sequências de polipeptídeo não-antigênicas (por exemplo, sequências de polipeptídeo que são conhecidas por não induzir uma resposta imunológica ou são conhecidas por gerar uma resposta imunológica que é não específica à influenza). Os elementos versados na técnica podem determinar facilmente as regiões antigênicas (por exemplo, eptopos) de domínios de cabeça de influenza conhecidos na técnica ou posteriormente identificados utilizando técnicas conhecidas pelos elementos versados na técnica e descritas aqui.
Em outra modalidade específica, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza que compreende uma, duas, três, ou mais regiões antigênicas heterólogas, isto é, uma, duas, três, ou mais regiões antigênicas da hemaglutinina de uma cepa ou subtipo de vírus influenza diferente (por exemplo, uma cepa ou subtipo de vírus influenza em que toda ou parte da população é virgem). Em outra modalidade específica, as regiões antigênicas heterólogas do polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza compreendem um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural como discutido, infra na Seção 5.4.2. Sem se ater a qualquer teoria particular de operação, acredita-se que a imunogenicidade de regiões antigênicas sub-imunodominantes 5 conservadas dentro do domínio de tronco podem ser aumentadas pela adição de um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural nessas regiões imunodominantes no domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza. Em modalidades específicas, o polipeptídeo de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza compreende uma, duas, três, ou mais regiões antigênicas heterólogas em que as regiões antigênicas heterólogas compreendem um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
Os polipeptídeos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza fornecidos aqui podem ser baseados (isto é, podem ter identidade de sequência) no domínio de cabeça de qualquer hemaglutinina de vírus influenza conhecida pelos elementos versados na técnica, descoberta mais tarde. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza são baseados no domínio de cabeça de uma hemaglutinina de vírus influenza A (por exemplo, o domínio de cabeça da hemaglutinina de um vírus influenza A descrito na Seção 5.4, infra). Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza são baseados no domínio de cabeça de uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do grupo que consiste em H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e H17. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza são baseados no domínio de cabeça de uma hemaglutinina de vírus influenza B (por exemplo, o domínio de cabeça da hemaglutinina de um vírus influenza B descrito na Seção 5.4, infra). Em algumas 5 modalidades, os polipeptídeos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza estão baseados no domínio de cabeça de B/Seal/Netherlands/1/99. Em uma modalidade específica, os polipeptídeos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza são baseados no domínio de cabeça de uma hernaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir de um grupo H5, H6, e/ou H9. Em outra modalidade específica, os polipeptídeos de domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza são baseados no domínio de cabeça de uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir de um grupo H5, H7, e/ou H9.
5.3 POLIPEPTÌDEOS DE DOMÍNIO DE TRONCO DE
HEMAGLUTININA DE INFLUENZA Proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza para uso na geração de polipeptideos de hemaglutinina de gripe (por exemplo, polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico). Embora sem a intenção de se ater a qualquer teoria particular de operação, acredita-se que, no contexto dos polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (por exemplo, polipeptídeos de hemaglutinina de vírus da gripe quimérico) fornecidos aqui, os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza são úteis para apresentar uma ou mais regiões antigênicas relativamente conservadas a um sistema imunológico de hospedeiro para gerar uma resposta imunológica que é capaz de reação cruzada com uma
14 4 / 6 48 pluralidade de cepas de influenza. Visto que uma ou mais regiões antigênicas são bem conservadas através de subtipos de hemaglutinina de vírus influenza, como uma resposta imunológica deve realizar a reação cruzada com vários 5 subtipos de polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza de comprimento completo.
Geralmente, os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza fornecidos aqui são polipeptídeos que compreendem ou consistem essencialmente no domínio de tronco de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza. O domínio de tronco de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza é o domínio de tronco que é geralmente reconhecido por elementos versados na técnica.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza fornecidos aqui compreendem pouco ou nenhum domínio de cabeça globular de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza. Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza é uma hemaglutinina de vírus influenza que teve o seu domínio de cabeça globular deletado por qualquer técnica considerada adequada por um elemento versado na técnica.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza descritos aqui mantém os resíduos de cisteína identificados nos polipeptideos de hemaglutinina de vírus influenza como Ap e Aq na Figura 1. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza descritos aqui possuem maior estabilidade em um pH menor que a hemaglutinina de um vírus influenza tipo selvagem (por exemplo, um pH menor que 5,2, menor que 5, 1, menor que 5, 0, ou menor que 4, 9, como 4, 8, 4, 7, 4, 6, 4, 5, 4, 4, 4, 3, 4, 2, 4,1, 4, 0, 3, 9, 3, 8, etc.). Em 5 particular modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza descritos aqui são submetidos a mudanças de conformação da pré-fusão para a conformação de fusão em um pH menor que a hemaglutinina de vírus influenza tipo selvagem. Em algumas modalidades, 10 os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza descritos aqui compreendem uma ou mais substituições de aminoácido, como á-íA1 H17Y (a numeração H3) que aumenta a estabilidade dos polipeptídeos em um baixo pH (por exemplo, um pH entre 4,9 a 5,2, 4,5 a 3,5, 3,5 a 2,5, • 15 2,5 a 1, 5, 1,5 a 0,5) . A estabilidade de polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza pode ser avaliada utilizando as técnicas conhecidas na técnica, como a sensibilidade das moléculas de hemaglutinina à digestão de tripsina, como descrito, por exemplo, em 20 Thoennes et al., 2008, Virology 370: 403-414.
Os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza podem ser preparados de acordo com qualquer técnica considerada adequada por um elemento versado na técnica, inclusive técnicas descritas 25 abaixo. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco são isolados.
Em algumas modalidades, uma estrutura primária de um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreende, na seguinte ordem: um segmento 30 de tronco N-terminal HA1, um ligante, um segmento de tronco
C-terminal HA1 e uma HA2. Em algumas modalidades, a estrutura primária de um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreende, na seguinte ordem: um segmento de tronco N-terminal HA1, um ligante, um 5 segmen€o de 'tronco curto C-terminal HAl e uma HA2. Em algumas modalidades, uma estrutura primária de um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreende, na seguinte ordem: um segmento de tronco longo N-terminal HAl, um ligante, um segmento de tronco longo C-terminal HA1 e uma HA2. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreende na seguinte ordem: um segmento de tronco N-terminal HAl, um ligante, um segmento de tronco intermediário HAl, um segundo ligante, um segmento de tronco C-terminal HAl e uma HA2.
A sequência primária pode ser formada por um único polipeptídeo, ou essa pode ser formada por múltiplos polipeptideos. Tipicamente, um único polipeptídeo é expresso por qualquer técnica considerada adequada por um elemento versado na técnica. Em modalidades de um único polipeptídeo, os segmentos HAl e a HA2 estão em associação terciária. Como conhecido pelos elementos versados na técnica, um único polipeptídeo HA deve ser clivado, por exemplo, por uma protease, sob condições de expressão apropriadas para produzir dois polipeptídeos em associação quaternária. A clivagem é tipicamente entre o segmento de tronco C-terminal HAl e a HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui múltiplos polipeptídeos, por exemplo, dois domínios de tronco de hemaglutinina de vírus influenza de polipeptídeo. Em modalidades de múltiplos polipeptídeos, os segmentos HAl e HA2 estão em associação quaternária.
Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza 5 fornecido aqui é monomérico. Em determinadas modalidades, um polipeptideo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza fornecido aqui é multimérico. Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza fornecido aqui é trimérico. Os elementos versados na técnica irão reconhecer que os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza nativos são capazes de trimerização in vivo e que alguns polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza fornecidos aqui são capazes de trimerização. Em modalidades particulares descritas abaixo, os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza fornecidos aqui compreendem domínios de trimerização para facilitar a trimerização.
Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreende um peptídeo de sinal. Tipicamente, o peptídeo de sinal é clivado durante ou após a expressão e tradução de polipeptídeo para produzir um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza maduro. peptídeo de sinal pode ser vantajoso para a expressão dos polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Em determinadas modalidades, também proporcionam-se aqui polipeptideos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza maduros que são desprovidos de um peptídeo de sinal.
A hemaglutinina HA2 de influenza compreende tipicamente um domínio de tronco, domínio de transmembrana e um domínio citoplásmico.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de 5 hemaglutinina de vírus influenza que compreendem um domínio de tronco HA2, um domínio luminal HA2, um domínio de transmembrana HA2 e um domínio citoplásmico HA2. Esses polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza podem ser expressos como antígenos ligados à membrana.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem um domínio de tronco HA2,
um domínio luminal HA2, e um domínio de transmembrana HA2, porém são desprovidos de algum ou todo o domínio citoplásmico típico.
Esses polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza podem ser expressos como antígenos ligados à membrana.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem um domínio de tronco HA2 e um domínio luminal HA2, porém são desprovidos de um domínio de transmembrana HA2 e um domínio citoplásmico HA2. Esses polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza podem ser vantajosamente expressos como polipeptídeos solúveis.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem um domínio de tronco HA2, porém são desprovidos de um domínio luminal HA2, um domínio de transmembrana HA2 e um domínio citoplásmico HA2. Esses polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza podem ser vantajosamente expressos como polipeptídeos solúveis. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreendem um 5 domínio de tronco HA2 que possui pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% de identidade de sequência de aminoácido a um domínio de tronco HA2 de influenza conhecido pelos elementos versados na técnica. Os domínios de tronco HA2 conhecidos exemplares de hemaglutininas de 10 influenza A e influenza B são fornecidos nas tabelas abaixo. Também proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas deletadas de domínios de tronco HA2 em que até 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, a 15 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduos de aminoácido são deletados de cada ou ambas as terminações do domínio de tronco HA2. Ademais, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas 20 alteradas de domínios de tronco HA2 em que até 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduos de aminoácido são substituídos de maneira conservadora por outros aminoácidos.
Ademais, proporcionam-se polipeptídeos de domínio de tronco 25 de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem os domínios de tronco HA2 deletados e alterados. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreendem um domínio de tronco HA2 que compreende um ou mais sítios de 30 glicosilação modificados, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural que interfere na capacidade de um glicano se ligar ao sítio de glicosilação modificado, como descrito na Seção 5.4.1, infra. Sem se 5 ater a qualquer teoria particular de operação, acredita-se que as regiões antigênicas de irnunogenicidade e acessibilidade dentro do domínio de tronco podem ser aumentadas ao modificar um ou mais sítios de glicosilação dentro do domínio de tronco de maneira que interrompe a glicosilação (isto é, a ligação de um glicano) nos sítios. Em algumas modalidades, a estrutura primária de um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreende, na seguinte ordem: um segmento de tronco N-terminal HA1, um ligante, um segmento de tronco C-terminal HAl e uma HA2. 0 segmento de tronco N-terminal HAl pode ser qualquer segmento de tronco N-terminal HA1 reconhecido por um elemento versado na técnica com base na definição fornecida aqui. Tipicamente, um segmento de tronco N-terminal HA1 corresponde a um polipeptídeo que consiste no aminoácido N-terminal de uma HA1 madura (isto é, uma HA1 desprovida de um peptídeo de sinal) através do resíduo de cisteína localizado em sequência aproximadamente no 52A resíduo da HAl. Esse resíduo de cisteína, denominado Ap aqui, é geralmente capaz de formar uma ponte de dissulfeto com um resíduo de cisteína no segmento de tronco C-terminal da HAl. As sequências de 16 hemaglutininas de influenza A representativas são apresentadas na Figura 1, e o resíduo Ap é identificado em cada uma.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HA1 não termina exatamente em Ap ( por exemplo,
Cys52 de uma subunidade HA1 de uma hemaglutinina H3), porém em um resíduo em sequência e nas adjacências estruturais a A. Por exemplo, em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HA1 termina em Ap-1, Ap-2 , Ap-3 , Ap-9 , Ap-5 , 5 Ap-6, Ap-7, Ap-8, Ap-9, Ap-1o, Ap-11, Ap-12, Ap-13, Ap-14, Ap-15, Ap-16, Ap-17, Ap-18, Ap-19, Ap-20r Ap-21, Ap-22, Ap-23, Ap-23, Ap-24, Ap-25, Ap- 26, Ap-27, Ap-28, A 29 , Ap-30. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HA1 dos polipeptídeos de hemaglutinina de gripe descritos aqui termina na faixa de 10 Ap-1 a Ap-3r Ap-3 a Ap--5, Ap-5 a Ap-E, Ap-8 a Ap-10, A_10 a Ap-15, Ap- 15 a Ap-20, Ap-20 a Ap-30, Ap-30 a Ap-40. Em outras modalidades, o segmento de tronco N-terminal HA1 termina em A + 1, Ap+2, Ap+4, Ap+5, Ap+6, Ap+?, Ap+8, Ap+9, Ap+10, A+11, Ap+12, Ap+13, Ap+14, Ap+15, Ap+16, Ap+17, A+18, Ap+19, Ap+20, Ap+21, Ap+22, Ap+23, Ap+24, Ap+25r 15 Ap+26, Ap+27, Ap+28, Ap+29, Ap+30, Ap+31, Ap+32, Ap+33, Ap+34, Ap+35, Ap+36r ié Ap+37, Ap+36, Ap+39, Ap+43. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HA1 dos polipeptídeos de hemaglutinina de gripe descritos aqui termina na faixa de Ap+l a Ap+5, Ap+5 a Ap+10, Ap+10 a Ap+15, Ap+15 a Ap+20, Ap+20 a Ap+25, 20 Ap+25 a Ap+30, Ap+30 a Ap+35, Ap+35 a Ap+40, ou Ap+40 a Ap+50. Q final de um segmento de tronco N-terminal HA1 deve ser selecionado em conjunto com o final do segmento de tronco C-terminal HA1 e o ligante de modo que o domínio de tronco HA1 ligado resultante seja capaz de formar uma estrutura 25 tridimensional similar, como descrito abaixo, a um domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza.
Em determinadas modalidades, os polipeptideos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreendem um segmento de tronco N-terminal HA1 que possui 30 pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% de identidade de sequência de aminoácido a um segmento de tronco N-terminal HAl de influenza conhecido por elementos versados na técnica. Os segmentos de tronco N-terminal HAl conhecidos exemplares são fornecidos nas tabelas abaixo. 5 Também, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas deletadas de segmentos de tronco N- terminal HAl em que até 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 10 2 ou 1 resíduos de aminoácido são deletados de cada ou ambas as terminações do segmento de tronco N-terminal HAI. Também, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas deletadas de um domínio de tronco de hemaglutinina 15 de vírus influenza conhecido, em que cerca de 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100 resíduos de aminoácido são deletados do domínio de tronco.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de 20 vírus influenza que compreendem formas expandidas de segmentos de tronco N-terminal HA1 em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos são adicionados à C-terminação dos segmentos de tronco N-terminal HAl; esses resíduos adicionados podem ser derivados da sequência de aminoácido 25 de um domínio de cabeça globular adjacente a um segmento de tronco N-terminal HAl. Ademais, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas alteradas de segmentos de tronco N-terminal HA1 em que até 80, 75, 70 65, 30 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5,
4, 3, 2 ou 1 resíduos de aminoácido são substituídos de maneira conservadora por outros aminoácidos. Também proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas 5 alteradas de um domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza conhecido, em que até cerca de 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, ou 90-100 resíduos de aminoácido do domínio de tronco são substituídos (por exemplo, substituídos de maneira 10 conservadora) por outros aminoácidos. Ademais, proporcionam-se polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem segmentos de tronco N-terminal HAl deletados e alterados. Em determinadas modalidades, até 50, 60, ou mais aminoácidos 15 são deletados da N-terminação de um domínio de tronco de i! hemaglutinina de vírus influenza (como observado a partir da sequência de aminoácido primária) e até 70, 80, ou mais aminoácidos são deletados da C-terminação de um domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza (como observado 20 a partir da sequência de aminoácido primária).
0 segmento de tronco C-terminal HA1 pode ser qualquer segmento de tronco C-terminal HAl reconhecido por um elemento versado na técnica com base na definição fornecida aqui. Tipicamente, um segmento de tronco C- 25 terminal HA1 corresponde a um polipeptïdeo que consiste no resíduo de cisteína localizado em sequência aproximadamente no 277 resíduo de uma HA1 (utilizando a numeração H3) através do aminoácido C-terminal da HAl. Esse resíduo de cisteína, denominado Aq aqui, é geralmente capaz de formar 30 uma ponte de dissulfeto com resíduo de cisteína Ap no segmento de tronco N-terminal de HAI.
As sequências de 17 hemaglutininas de influenza A representativas são apresentadas na Figura 1, e o resíduo Aq é identificado em cada uma. 5 Em determinadas modalidades, o segmento de tronco
C-terminal HAl não começa em Aq (por exemplo, Cys277 de uma subunidade HAl de uma hemaglutinina H3), porém em um resíduo em sequência e adjacências estruturais a Aq.
Por exemplo, em determinadas modalidades, o segmento de tronco 10 C-terminal HA1 começa mais ou menos em Aq-1, Aq_2, Aq_3, Aq-4,
A q- q-6, Aq-7, 5i A A g-9, q-®r A A q-10, A q-llr A q-12r A q-13, A Aq_14, q-15,
Aq-20, Aq-25, Aq-30r Aq-35, Aq-40, Aq-45, Aq-50, Aq-55, Aq-60, Aq-65, Aq-
70, Aq-75, ou Aq _e p.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco C-terminal HAl começa em na faixa de Aq-1 a 15 Aq-5 a Aq-10, Aq-10 a Aq-15, Aq-15 a Aq-20, Aq-20 a Aq-25, Aq-25 a Aq-30,
Aq-30 a Aq_35r Aq-35 a Aq-40, Aq-40 a Aq-45, Aq-45 a Aq-50, Aq-50 a Aq-55,
A q-55 a Aq-60, Aq-60 a Aq-65, Aq-65 a Aq-7o, Aq-7s a Aq-80. Em outras modalidades, o segmento de tronco C-terminal HAl começa em
Aq+1, Aq+2, Aq-l-3, Aq+4, Aq+5, Aq+6, Aq+7r Aq+8, Aq-i-9, Ou Aq+lo.
Em 20 determinadas modalidades, o segmento de tronco C-terminal HAl dos polipeptídeos de hemaglutinina de gripe descrito aqui começa na faixa de Aq+1 a Aq+3, Aq+3 a Aq+5, Aq+5 a Aq+s r
Aq+e a Aq+ o, Aq+lo a Aq+15 , ou Aq+15 a Aq+2o. 0 final de um segmento de tronco N-terminal HAl deve ser selecionado em
25 conjunto com o início do segmento de tronco C-terminal HAl e o ligante de modo que o domínio de tronco HAl resultante seja capaz de formar uma estrutura tridimensional similar, como descrito abaixo, a uma hemaglutinina de vírus influenza.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreendem um segmento de tronco C-terminal HA1 que possui pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% de 5 identidade de sequência de aminoácido a um segmento de tronco C-terminal HA1 de influenza conhecido pelos elementos versados na técnica. Os segmentos de tronco C- terminal HA1 conhecidos exemplares são fornecidos nas tabelas abaixo. 10 Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é Ap _ 1, e o início do segmento de tronco C-terminal é Aq _ 1. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é Ap- 2, e o início do segmento de tronco C-terminal é Aq-2. Em determinadas 15 modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é AP _ 3 , e o início do segmento de tronco C-terminal é Aq _ 3. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N- terminal é AP _ 4 , e o início do segmento de tronco C-terminal é Aq _ 4. Em determinadas modalidades, o final do segmento de 20 tronco N-terminal é Ap _ 5 , e o início do segmento de tronco C-terminal é A.
Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é Ap+1, e o início do segmento de tronco C-terminal é Aq+l. Em determinadas modalidades, o 25 final do segmento de tronco N-terminal é Ap+2, e o início do segmento de tronco C-terminal é Aq+2. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é Ap+3, e o início do segmento de tronco C-terminal é Aq +3. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N- 30 terminal é Ap+4, e o início do segmento de tronco C-terminal é Aq+4. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é Ap+5, e o início do segmento de tronco C-terminal é Aq+5 Em determinadas modalidades, o final do segmento 5 de tronco N-terminal é Ap_1, e o início do segmento de tronco C-terminal é Aq+l. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é A p_Z , e o inicio do segmento de tronco C-terminal é Aq +2. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é A p-3 , 10 e o inicio do segmento de tronco C-terminal é Aq+3. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N- terminal é Ap_q , e o início do segmento de tronco C-terminal é Aq +4. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é Ap_ 5 , e o início do segmento de tronco 15 C-terminal é Aq+5 . 1 Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é Ap+1, e o início do segmento de tronco C-terminal é Aq_1, Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é Ap+2 , e o inicio do 20 segmento de tronco C-terminal é Aq_2. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é Ap+3, e o início do segmento de tronco C-terminal é Aq_3. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N- terminal é Ap+4, e o início do segmento de tronco C-terminal 25 é Aq _ 4. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é Ap+5 , e o início do segmento de tronco C-terminal é Aq_5.
Também proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que 30 compreendem formas deletadas de segmentos de tronco C-
terminal HA1 em que até 100, 95, 90, 85, 80, 75, 7Q, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduos de aminoácido são deletados de cada ou ambas as terminações do segmento de tronco C-terminal HAl. 5 Também proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco, de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas deletadas de um domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza conhecido, em que cerca de 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, ou 90-100 resíduos de aminoácido são deletados do domínio de tronco. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas expandidas de segmentos de tronco C-terminal HA1 em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos são adicionados à N-terminação dos segmentos de tronco C-terminal HA1; esses resíduos adicionados podem ser derivados da sequência de aminoácido de um domínio de cabeça globular adjacente a um segmento de tronco C-terminal HA1. Em modalidades particulares, se um resíduo for adicionado ao segmento de tronco C-terminal, então um resíduo é adicionado ao segmento de tronco N- terminal; se dois resíduos forem adicionados ao segmento de tronco C-terminal, então dois resíduos são adicionados ao segmento de tronco N-terminal; se três resíduos forem adicionados ao segmento de tronco C-terminal, então três resíduos são adicionados ao segmento de tronco N-terminal.
Ademais, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas alteradas de segmentos de tronco C-terminal HAl em 30 que até cerca de 80, 75, 70 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30,
25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduos de aminoácido são substituídos de maneira conservadora por outros aminoácidos. Também proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de 5 vírus influenza que compreendem formas alteradas de segmentos de tronco C-terminal HAl, em que até cerca de 1- 10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, ou 90-100 resíduos de aminoácido do segmento de tronco C- terminal HA1 são substituídos (por exemplo, substituídos de maneira conservadora) por outros aminoácidos. Ademais, proporcionam-se polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem segmentos de tronco C-terminal HAl deletados e alterados. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco C-terminal compreende ou mais sítios de glicosilação modificados. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal compreende ou mais sítios de glicosilação modificados. Em outras modalidades, o segmento de tronco C-terminal e N- terminal compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados.
Em determinadas modalidades, os polipeptideos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza fornecidos aqui compreendem um quimérico/híbrido do domínio de tronco da subunidade HA1. O quimérico do domínio de tronco da subunidade HAl pode compreender 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, t 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 60, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 75, 75, 76, 77, 78, 79, ou 80 aminoácidos do domínio de tronco da subunidade HA1 de uma primeira cepa ou subtipo de vírus influenza e o restante dos aminoácidos do quimérico do domínio de tronco da subunidade HAl pode ser de uma segunda cepa ou subtipo de 5 vírus influenza. Em determinadas modalidades, o quimérico do domínio de tronco da subunidade HA1 compreende 1-10, 10- 20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, ou 90- 100 aminoácidos do domínio de tronco da subunidade HAl de uma primeira cepa ou subtipo de vírus influenza e o restante de aminoácidos do quimérico do domínio de tronco da subunidade HA1 são de uma segunda cepa ou subtipo de vírus influenza. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus Influenza fornecidos aqui compreendem uma subunidade HA2 e um quimérico do domínio de tronco da subunidade HAl. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreende um quimérico/híbrido do domínio de tronco de uma subunidade HAl em que um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência natural foram modificados de modo que a modificação, interfere na capacidade de um glicano se ligar ao sítio de glicosilação modificado, como descrito na Seção 5.4.1, infra. Sem se ater a qualquer teoria particular de operação, acredita-se que as regiões antigênicas de imunogenicidade e acessibilidade dentro do domínio de tronco possam ser aumentadas ao modificar um ou mais sítios de glicosilação dentro do domínio de tronco de maneira que interrompa a glicosilação (isto é, a ligação de um glicano) nos sítios.
Os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza devem ser baseados (isto é,
devem ter identidade de sequência, como descrito acima) em qualquer hemaglutinina de vírus influenza conhecida pelos elementos versados na técnica, descoberta mais tarde. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de 5 tronco de hemaglutinina de vírus influenza são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do 10 grupo que consiste em Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e H17. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza B, como descrito em 15 detalhes abaixo.
Os segmentos de tronco N-terminal HAl devem ser baseados (isto é, devem ter identidade de sequência, como descrito acima) em quaisquer segmentos de tronco N-terminal HA1 conhecidos pelos elementos versados na técnica, 20 descobertos mais tarde. Em determinadas modalidades, os segmentos de tronco N-terminal HAl são baseados em segmentos de tronco N-terminal HAl de influenza A. Em determinadas modalidades, os segmentos de tronco N-terminal HAl são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A 25 selecionada a partir do grupo que consiste em Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e H17. Em determinadas modalidades, the segmento de tronco N-terminal HAl é selecionado a partir de SEQ ID NOS:34-49. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N- 30 terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:34-49,
161/ 6 48 cada um tem um aminoácido deletado de sua C-terminação.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal
HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:34-49, cada um tem dois aminoácidos deletados de sua C-terminação.
Em 5 determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HAl é selecionado a partir de SEQ ID NOS:34-49, cada um tem três aminoácidos deletados de sua C-terminação.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal
HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:34-49, cada um tem quatro aminoácidos deletados de sua C-terminação.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:34-49, cada um tem cinco aminoácidos deletados de sua C-terminação.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:177-224. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HAl é ou é baseado no segmento de tronco N-terminal HA-1 de um vírus influenza Ann Arbor/6/60, A/Puerto Rico/8/34, ou
A/Perth/16/2009. Os segmentos de tronco C-terminal HAl devem ser baseados (isto é, devem ter identidade de sequência, como descrito acima) em quaisquer segmentos de tronco C-terminal HA1 conhecidos pelos elementos versados na técnica,
descobertos mais tarde.
Em determinadas modalidades, os segmentos de tronco C-terminal HA1 são baseados em segmentos de tronco C-terminal HAl de influenza A.
Em determinadas modalidades, os segmentos de tronco C-terminal
HA1 são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do grupo que consiste em H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16,
e H17. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco C- terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:50-65. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco C-terminal HAl é selecionado a partir de SEQ ID NOS: 50-65, cada um 5 tem um aminoácido deletado de sua N-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco C-terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS: 50-65, cada um tem dois aminoácidos deletados de sua N-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco C-terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS: 50-65, cada um tem três aminoácidos deletados de sua N-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco C-terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS: 50-65, cada um tem quatro aminoácidos deletados de sua N-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco C-terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS: 50-65, cada um tem cinco aminoácidos deletados de sua N-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco C-terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:226-273. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco C-terminal HAl é ou é baseado no segmento de tronco N-terminal HA-1 de um vírus influenza Ann Arbor/6/60, A/Puerto Rico/8/34, ou A/Perth/16/2009.
Os domínios de tronco HA2 devem ser baseados (isto é, devem ter identidade de sequência, como descrito acima) em quaisquer domínios de tronco HA2 conhecidos pelos elementos versados na técnica, descobertos mais tarde. Em determinadas modalidades, os domínios de tronco HA2 são baseados em domínios de tronco HA2 de influenza A. Em determinadas modalidades, os domínios de tronco HA2 são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do grupo que consiste em H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e H17. Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA2 5 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:66-97. Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA2 é ou é baseado no domínio de tronco HA de um vírus influenza tipo A/Ann Arbor/6/60, tipo A/Puerto Rico/8/1934, tipo A/Perth/16/2009, A/California/07/2009, tipo A/Brisbane/59/07, tipo A/New Caledonia/20/1999 ou A/Victoria/361/201. Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA2 é ou é baseado em um domínio de tronco HA2 posteriormente descoberto. Em determinadas modalidades, os domínios de tronco HA2 pertencem à mesma cepa ou subtipo de vírus influenza que o domínio de tronco da subunidade HAl. Em modalidades que compreendem um peptídeo de sinal, o peptídeo de sinal deve ser baseado em qualquer peptídeo de sinal de vírus influenza conhecido pelos elementos versados na técnica. Em determinadas modalidades, os peptídeos de sinal são baseados em peptídeos de sinal de influenza A. Em determinadas modalidades, os peptídeos de sinal são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do grupo que consiste em Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 e H16. Em determinadas modalidades, o peptídeo de sinal deve ser qualquer peptídeo de sinal considerado útil por um elemento versado na técnica. Em determinadas modalidades, o peptídeo de sinal é selecionado a partir de SEQ ID NOS:18-33.
Em modalidades que compreendem um domínio luminal, o domínio luminal deve ser baseado em qualquer domínio luminal de influenza conhecido pelos elementos versados na técnica.
Em determinadas modalidades, os domínios luminais são baseados em domínios luminais de influenza A.
Em determinadas modalidades, os domínios luminais HA2 são 5 baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do grupo que consiste em HI, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, HiE, e H17. Em determinadas modalidades, o domínio luminal deve ser qualquer domínio luminal considerado útil por um elemento versado na técnica.
Em determinadas modalidades, o domínio lumínal é selecionado a partir de SEQ ID NOS:98-113. Em determinadas modalidades, o domínio luminal pertence à mesma cepa ou subtipo de vírus influenza que o domínio de tronco da subunidade HA2. Em determinadas modalidades, os domínios citoplásmico, de transmembrana e luminais pertencem à mesma cepa ou subtipo de vírus influenza que o domínio de tronco da subunidade HA2. Em outras modalidades, os domínios citoplásmico e de transmembrana pertencem à mesma cepa ou subtipo de vírus influenza que o domínio de tronco da subunidade HA2. Em determinadas modalidades, os domínios citoplásmico e luminal pertencem à mesma cepa ou subtipo de vírus influenza que o domínio de tronco da subunidade HA2. Em modalidades que compreendem um domínio de transmembrana, o domínio de transmembrana deve estar baseado em qualquer domínio de transmembrana de influenza conhecido pelos elementos versados na técnica.
Em determinadas modalidades, os domínios de transmembrana são baseados em domínios de transmembrana de influenza A.
Em determinadas modalidades, os domínios de transmembrana HA2 são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do grupo que consiste em H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e H17. Em determinadas modalidades, o domínio de 5 transmembrana deve ser qualquer domínio de transmembrana considerado útil por um elemento versado na técnica. Em determinadas modalidades, o domínio de transmembrana é selecionado a partir de SEQ ID NOS:114-129. Em determinadas modalidades, os domínios de transmembrana pertencem à mesma 10 cepa ou subtipo de vírus influenza que o domínio de tronco da subunidade HA2.
Em modalidades que compreendem um domínio citoplásmico, o domínio citoplásmico deve ser baseado em qualquer domínio citoplásmico de influenza conhecido pelos 15 elementos versados na técnica. Em determinadas modalidades, os domínios citoplásmicos são baseados em domínios citoplásmicos de influenza A. Em determinadas modalidades, os domínios citoplásmicos HA2 são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do 20 grupo que consiste em HI, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e H17. Em determinadas modalidades, o domínio citoplásmico deve ser qualquer domínio citoplásmico considerado útil por um elemento versado na técnica. Em determinadas modalidades, o domínio 25 citoplásmico é selecionado a partir de SEQ ID NOS:130-145.
Em determinadas modalidades, os domínios citoplásmicos pertencem à mesma cepa ou subtipo de vírus influenza que o domínio de tronco da subunidade HA2.
Em determinadas modalidades, um ou mais sítios de 30 glicosilação no domínio de tronco de hemaglutinina são modificados (por exemplo, por adição, deleção ou substituição de aminoácido) de modo que a glicosilação nesses sítios não ocorra durante o processamento e maturação do polipeptídeo. Os elementos versados na técnica 5 irão reconhecer que a HA de influenza tipicamente compreende um ou mais sítios de glicosilação (por exemplo, Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido ou, em determinadas modalidades, em que Xaa é qualquer aminoácido exceto Pro). Em determinadas modalidades, um ou mais resíduos de aminoácido em um sítio de glicosilação são substituídos de maneira conservadora por um resíduo de aminoácido que interrompe o sítio de glicosilação. Em determinadas modalidades, um ou mais resíduos de aminoácido em um sítio de glicosilação são substituídos por qualquer resíduo de aminoácido que interrompe o sítio de glicosilação. Em determinadas modalidades, um ou mais resíduos de asparagina em uma sequência de glicosilação são substituídos por alanina. Em uma modalidade particular, a asparagina na posição 38 de uma hemaglutinina H3 é alterada para uma alanina. Em determinadas modalidades, o domínio de tronco de hemaglutinina compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados como discutido na Seção 5.4.1, infra.
A Tabela 1, abaixo, identifica os peptídeos de sinal, segmentos de tronco N-terminal HAI, segmentos de tronco C-terminal HAl e domínios HA2 de polipeptideos de hemaglutinina de vírus influenza A. Esses peptídeos de sinal, segmentos de tronco e domínios são úteis nos polipeptídeos e métodos descritos aqui.
TABELA 1. Sequências de Hemaglutinina de Influenza A Exemplares Subtipo HA Segmento de Segmento de Peptídeo (Genbank Tronco N- Tronco C- Domínio HA2 de Sinal No.) terminal HA1 terminal HA1 H1 MKANLLVLLC DTICIGYHANNSTD CNTKCQTPLGAINSGLFGAIAGFIEGGWTGMID
ALAAADA TVDTVLEKNVTVTH SLPYQNIHPVTIGE GWYGYHHQNEQGSGYAADQ PR8-H1N1 SVNLLEDSHNGKLC CPKYVRSAKLRMVT KSTQNAINGITNKVNTVIE [SEQ ID GLRNNPSIQSR KMNIQFTAVGKEFNKLEKR (EF467821.1) N0:18] [SEQ ID NO:34] MENLNKKVDDGFLDIWTYN [SEQ ID NO:50] AELLVLLENERTLDFHDSN
VKNLYEKVKSQLKNNAKEI GNGCFEFYHKGDNECMESV RNGTYDYPKYSEESKLNRE KVDGVKLESMGIYQILAIY ST VAS SLVLLVSEGAISFW
MCSNGSLQCRICI [SEQ ID NO:66] H2 MAIIYLILLF DQICIGYHSNNSTE CETKCQTPLGAINT GLFGAIAGFIEGGWQGMID
TAVRG KVDTILERNVTVTH TLPFHNVHPLTIGE GWYGYHHSNDQGSGYAADK (L11136) AQNILEKTHNGKLC CPKYVKSERLVLAT ESTQKAIDGITNRVNSVIE [SEQ ID GLRNVPQIESR KMNTQFEAVGKEFSNLEKR NO:19] [SEQ ID NO:35] LENLNKKMEDGFLDVWTYN [SEQ ID NO:51] AELLVLMENERTLDFHDSN
VKNLYDRVRMQLRDNAKEL GNGCFEFYHKCDDECMNSV KNGTYDYPKYEEESKLNRN EIKGVKLSNMGVYQILAIY ATVAGSLSLAIMIAGISLW
MCSNGSLQCRICI [SEQ ID NO:67] H3 MKTIIALSYI QDLPGNDNSTATLC CISECITPNGSIPN GLFGAIAGFIENGWEGMID HK68-H3N2 FCLALG LGHHAVPNGTLVKT DKPFQNVNKITYGA GWYGFRHQNSEGTGQAADL (EF409245) ITDDQIEVTNATEL CPKYVKQNTLKLAT KSTQAAIDQINGKLNRVIE [SEQ ID VQSSSTGKIC GMRNVPEKQTR KTNEKFHQIEKEFSEVEGR PDB: 1HGJ NO:20] IQDLEKYVEDTKIDLWSYN [SEQ ID NO:36] [SEQ ID NO:52] AELLVALENQHTIDLTDSE
MNKLFEKTRRQLRENAEDM GNGCFKIYHKCDNACIESI RNGTYDHDVYRDEAT.NNRF QIKGVELKSGYKDWILWIS FAISCFLLCVVLLGFIMWA
CQRGNIRCNICI [SEQ ID NO:681 H4 MLSIVILFLL QNYTGNPVICMGHH CVSKCHTDKGSLST GLFGAIAGFIENGWQGLID
IAENSS AVANGTMVKTLADD TKPFQNISRIAVGD GWYGFRHQNAEGTGTAADL (D90302) QVEVVTAQELVESQ CPRYVKQGSLKLAT KSTQAAIDQINGKLNRLIE [SEQ ID NLPELC GMRNIPEKASR KTNDKYHQIEKEFEQVEGR NO: 211 IQDLENYVEDTKIDLWSYN [SEQ ID NO:37] [SEQ ID NO:53] AELLVALENQHTIDVTDSE
MNKLFERVRRQLRENAEDE GNGCFEIFHKCDNNCIESI
Subtipo RA Segmento de Segmento de Peptideo (Genbank Tronco N- Tronco C- Domínio HA2 de Sinal No.) terminal HA1 terminal HA1
RNGTYDHDIYRDEAINNRF QIQGVKLTQGYKDIILWIS FSISCFLLVALLLAFILWA
CQNGNIRCQICI [SEQ ID NO:69] H5 MERIVLLLAI DQICIGYHANKSTK CDTKCQTPVGEINS GLFGAIAGFIEGGWQGMVD
VSLVKS QVDTIMEKNVTTVTH SMPFHNIHPHTIGE GWYGYHHSNEQGSGYAADK (X07826) AQDILERTHNGKLC CPKYVKSDRLVLAT ESTQKAIDGITNKVNSIID [SEQ ID GLRNVPQRKKR KMNTRFEAVGKEFNNLERR NO:22] [SEQ ID N0:38] VENLNKKMEDGFLDVWTYN [SEQ ID NO:54] VELLVLMENERTLDFHDSN
VNNLYDKVRLQLKDNAREL GNGCFEFYHKCDNECMESV RNGTYDYPQYSEEARLNRE EISGVKLESMGVYQILSIY STVASSLALAIMIAGLSFW
MCSNGSLQCRICI [SEQ ID N0:70] H6 MIAIIVVAIL DKICIGYHANNSTT CDATCQTVAGVLRT GLFGAIAGFIEGGWTGMID
ATAGRS QIDTILEKNVTVTH NKTFQNVSPLWIGE GWYGYHHENSQGSGYAADR (D90303) SVELLENQKEERFC CPKYVKSESLRLAT ESTQKAVDGITNKVNSIID [SEQ ID GLRNVPQIETR KMNTQFEAVDHEFSNLERR NO:23] [SEQ ID NO:39] IDNLNKRMEDGFLDVWTYN [SEQ ID N0:55] AELLVLLENERTLDLHDAN
VKNLYERVKSQLRDNAMIL GNGCFEFWHKCDDECMESV KNGTYDYPKYQDESKLNRQ EIESVKLESLGVYQILAIY STVSSSLVLVGLIIAVGLW
MCSNGSMQCRICI [SEQ ID NO:71] H7 MNTQII.LVFAL DKICLGHHAVSNGT CEGECYHSGGTITSGLFGAIAGFIENGWEGLVD (M24457) VAVIPTNA KVNTLTERGVEVVN RLPFQNINSRAVGK GWYGFRHQNAQGEGTAADY
ATETVERTNIPKIC CPRYVKQESLLLATKSTQSAIDQITGKLNRLIE [SEQ ID GMKNVPEPSKKRKKKTNQQFELIDNEFTEVEKQ NO:24] [SEQ ID NO:401 R IGNLINWTKDSITEVWSYN
AELIVAMENQHTIDLADSE [SEQ ID NO:5b] MN.RLYERvRKQLRENAEED
GTGCFEIFHKCDDDCMASI RNNTYDHSKYREEAMQNRI QIDPVKLSSGYKDVILWFS FGASCFLLLAIAMGLVFIC'
VKNGNMRCTICI [SEQ ID NO:72] H8 MEKFIAIATL DRICIGYQSNNSTD CNTKCQTYAGAINS GLFGAIAGFIEGGWSGMID
ASTNAY TVNTLIEQNVPVTQ SKPFQNASRHYMGE GWYGFHHSNSEGTGMAADQ (D90304) TMELVETEKHPAYC CPKYVKKASLRLAV KSTQEAIDKITNKVNNIVD [SEQ ID GLRNTPSVEPR KM NREFEVVNHEFSEVEKR NO:25] [SEQ ID NO:41] INMINDKIDDQIEDLWAYN
Subtipo HA Segmento de Segmento de Pe ptídeo (Genbank Tronco N- Tronco C- Domínio HA2 de Sinal No.) terminal HA]. terminal HA1 [SEQ ID NO:57] AELLVLLENQKTLDEHDSN VKNI.FDEVKRRLSANAIDA
GNGCFDILHKCDNECMETI KNGTYDHKEYEEEAKLERS KINGVKLEENTTYKILSIY STVAASLCLAILIAGGLIL
GMQNGSCRCMFCI [SEQ ID NO:73] H9 METKAIIAAL DKICIGYQSTNSTE CVVQCQTEKGGLNT GLFGAIAGFIEGGWPGLVA
LMVTAANA TVDTLTESNVPVTH TLPFHNISKYAFGN GWYGFQHSNDQGVGMAADK (D90305) TKELLHTEHNGMLC CPKYVGVKSLKLPV GSTQKAIDKITSKVNNIID [SEQ ID GLRNVPAVSSR KMNKQYEVIDHEFNELEAR NO:26] [SEQ ID NO:42] LNMINNKIDDQIQDIWAYN [SEQ ID NO:58] AELLVLLENQKTLDEHDAN
VNNLYNKVKRALGSNAVED GNGCFELYHKCDDQCMETI RNGTYDRQKYQEESRLERQ, KÌEGVKLESEGTYKILTIY STVASSLVLAMGFAAFLFW
AMSNGSCRCNICI [SEQ ID NO:74] H10 MYKVVVIIAL LDRICLGHHAVANG CESKCFWRGGSINT GLFGAIAGEIENGWEGMVD
LGAVKG TIVKTLTNEQEEVT KLPFQNLSPRTVGQ GWYGFRHQNAQGTGQAADY (M21647) NATETVESTNLNKL CPKYVNQRSLLLAT KSTQAAIDQITGKLNRLIE [SEQ ID C GMRNVPEVVQGR KTNTEFESIESEFSETEHQ NO:2~] IGNVINWTKDSITDIWTYN [SEQ ID N0:43] [SEQ ID N0:59] AELLVAMENQHTIDMADSE
MLNLYERVRKQLRQNAEED GKGCEEIYHTCDDSCMESI RNNTYDHSQYREEALLNRL NINPVKLSSGYKDIILWFS FGESCFVLLAVVMGLVFFC
LKNGNMRCTICI [SEQ ID NO:75] H1l MEKTLLFAAI DEICIGYLSNNSTD CSTKCQTEIGGINT GLFGAIAGFIEGGWPGLIN
FLCVKA KVDTIIENNVTVTS NKSFHNVHRNTIGD GWYGFQHRDEEGTGIAADK (D9G306} SVELVETEHTGSFC CPKYVNVKSLKLAT ESTQKAIDQITSKVNNIVD [SEQ ID GPRNVPAIASR RMNTNbSVQHEFGEIEER NO:26] [SEQ ID NO:441 INQLSKHVDDSVVDIWSYN [SEQ ID N0:60] AQLLVLLENEKTLDLHDSN
VRNLHEKVRRMLKDNAKDE GNGCFTFYHKCDNKCIERV RNGTYDHKEFEEESKINR.Q EIEGVKLDSSGNVYKILSI YSCIASSLVLAALIMGFMF
WACSNGSCRCTICI [SEQ ID NO:76] H12 MEKFIILSTV DKICIGYQTNNSTE CVTECQLNEGVMNT GLFGAIAGFIEGGWPGLVA
LAASFAY TVNTLSEQNVPVTQ SKPFQNTSKHYIGK GWYGFQHQNAEGTGIAADR
Subtipo HP+ Segmento de Segmento de Pe ptídeo (Genbank Tronco N- Tronco C- Domínio HA2 de Sinal No.) terminal HA1 terminal HAl (D90307) VEELVHRGIDPILC CPKYIPSGSLKLAI DSTQRAIDNMQNKLNNVID [SEQ ID GLRNVPQVQDR KMNKQFEVVNHEFSEVESR NO:29] [SEQ ID NO:45] INMINSKIDDQITDIWAYN [SEQ ID N0:61] AELLVLLENQKTLDEHDAN
VRNLHDRVRRVLRENAIDT GDGCFEILHKCDNNCMDTI RNGTYNHKEYEEESKIERQ KVNGVKLEENSTYKILSIY SSVASSLVLLLMIIGGFIF
GCQNGNVRCTFCI [SEQ ID NO:77] H13 MALNVIATLT DRICVGYLSTNSSE CNTKCQTSVGGINT GLFGAIPGFIEGGWPGLIN
LISVCVHA RVDTLLENGVPVTS NRTFQNIDKNALGD GWYGFQHQNEQGTGIAADK (D90308) SIDLIETNHTGTYC CPKYIKSGQLKLAT ESTQKAIDQITTKINNIID [SEQ ID GLRNVPAISNR KMNGNYDSIRGEFNQVEKR NO:30] [SEQ ID NO:46j INMLADRIDDAVTDIWSYN [SEQ ID NO:62] AKLLVLLENDKTLDMHDAN
VKNLHEQVRRELKDNAIDE GNGCFELLHKCNDSCMETI RNGTYDHTEYAEESKLKRQ EIDGIKLKSEDNVYKALSI YSCIASSVVLVGLILSEIM
WACSSGNCRFNVCI [SEQ ID NO:78] H14 MIALILVALA QITNGTTGNPIICL CTSPCLTDKGSIQS GLFGAIAGFIENGWQGLID
LSHTAYS GHHAVENGTSVKTL DKPFQNVSRIAIGN GWYGFRHQNAEGTGTAADL (M35997) TDNHVEVVSAKELV CPKYVKQGSLMLAT KSTQAAIDQINGKLNRLIE [SEQ ID ETNHTDELC GMRNIPGKQAK KTNEKYHQIEKEFEQVEGR NO:31] IQDLEKYVEDTKIDLWSYN [SEQ ID NO:47] [SEQ ID NO:63] AELLVALENQHTIDVTDSE
MNKLFERVRRQLRENAEDQ GNGCFEIFHQCDNNCIESI RNGTYDHNIYRDEAINNRI KINPVTLTMGYKDIILWIS FSMSCFVFVALILGFVLWA
CQNGNIRCQICI [SEQ ID NO:79] H15 MNTQIIVILV DKICLGHHAVANGT CEGECFYSGGTINS GLFGAIAGFIENGWEGLlll
LGLSMVKS KVNTLTERGVEVVN PLPFQN I DSRAVGK GWYGFRHQNAQGQGTAADY (L43917) ATETVEITGIDKVC CPRYVKQSSLPLAL KSTQAAIDQITGKLNRLIE [SEQ ID GMKNVPEKIRTR KTNKQFELIDNEFTEVEQQ NO:32] [SEQ ID NO:48] IGNVINWTRDSLTEIWSYN [SEQ ID NO:64] AELLVAMENQHTIDLADSE
MNKLYERVRRQLRENAEED GTGCFEIFHRCDDQCMESI RNNTYNHTEYRQEALQNRI MINPVKLSSGYKDVILWFS FGASCVMLLAIAMGLIFMC VKNGNLRCTICI
Subtipo HA Segmento de Segmento de C Fe ptídeo (Genbank Tronco N- Tronco C- Domínio HA2 de Sinal No.) terminal HA1 terminal HA1 [SEQ ID NO:80] H16 MMIKVLYFLI DKICIGYLSNNSSD CNTKCQTSLGGINT GLFGAIAGFIEGGWPGLIN
IVLGRYSKA TVDTLTENGVPVTS NKTFQNIERNALGD GWYGFQHQNEQGTGIAADK (EU293865) SVDLVETNHTGTYC CPKYIKSGQLKLAT ASTQKAINEITTKINNIIE [SEQ ID GLRNVPSIGER KMNGNYDSIRGEFNQVEKR NO:33] [SEQ ID N0:49] INMLADRVDDAVTDIWSYN [SEQ ID NO:65] AKLLVLLENDRTLDLHDAN
VRNLHDQVKRALKSNAIDE GDGCFNLLHKCNDSCMETI ENGTYNHEDYREESQLKRQ EIEGIKLKTEDNVYKVLSI YSCIASSIVLVGLILAFIM
WACSNGSCRFNVCI [SEQ ID NQ:81] H17 MELIVLLILL DRICIGYQANQNNQ CSTKCQTPLGALNS GLFGAIAGFIEGGWQGMID
NPYTFVLG TVNTLLEQNVPVTG TLPFQNVHQQTIGN GWYGYHHENQEGSGYAADK (CY103876) AQEILETNHNGKLC CPKYVKATSLMLAT EATQKAVDAITNKVNSIID
GLRNNPQMEGR KMNSQFESNIKEFNRLELR IQHLSDRVDDALLDIWSYN TE LLVLLENERTLDFHDAN VKNLFEKVKAQLKDNAIDE GNGCFLLLHKCNNSCMDDI KNGTYKYMDYREESHIEKQ KIDGVKLTDYSRYYIMTLY STIASSVVLGSLIIAAFLW
GCQKGSIQCKICI A Tabela lA, abaixo, identifica os segmentos de tronco N-terminal HA1 e os segmentos de tronco C-terminal HA1 úteis nos polipeptídeos e métodos descritos aqui. TABELA lA. Sequências de Hemaglutinina de 5 Influenza A Exemplares Subtipo üiSegmentoo S da Tronco Ai- Segmento de Tronco G- (Genbank No.) terminal HA1 terminal HA1 H1 DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVT NTKCQTPLGAINSSLPYQNIHPVTIGE PR8-H1N1 HSVNLLEDSHNGKL CPKYVRSAKLRMVTGLRNNPSIQSR (EF467821.1) No Cys [SEQ 1D NC:177] [SEQ ID N©:226] H1 DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVT TKCQTPLGAINSSLPYQNIHPVTIGEC PR8-H1N1 HSVNLLEDSHNGKL PKYVRSAKLRMVTGLRNNPSIQSR (EF467821.1) No Cys â1 [SEQ ID NO:178] [SEQ ID NO:227]
Subtipo HA Segmento de Tronco N- Segmento de Tronco C- (Genbank No.) terminal HA1 terminal HA1 Hl DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVT KCQTPLGAINSSLPYQNIHPVTIGECP PR8-H1N1 HSVNLLEDSHNGK KYVRSAKLRMVTGLRNNPSIQSR (EF467821.1) No Cys ❑3 [SEQ ID N0:179] [SEQ ID NO:228]
HI DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVT CKCQTPLGAINSSLPYQNIHPVTIGEC I PR8-H1N1 HSVNLLEDSHNGKLCRLKC PKYVRSAKLRMVTGLRNNPSIQSRG (EF467821.1) PR8-CON-A [SEQ ID NO:312] [SEQ ID N0:313] Hl DT ICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVT CVRSAKLRMVTGLRNNPS I QSRG PRB-H1N1 HSVNLLEDSHNGKLC (EF467821.1) [SEQ ID NO:3141 PRB-CON-B [SEQ ID NO:341 H1 DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVT AFALSRGFGSGIITSNASMHECNTKCQ PR8-H1N1 HSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGK TPLGAINSSLPYQNIHPVTIGECPKYV (EF467821.1) CNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVE RSAKLRMVTGLRNNPSIQSRG PRB-CON-C TPNSENGICYPGC [SEQ ID NO:316] [SEQ ID NO:315] H2 DQICIGYHSNNSTEKVDTILERNVTVT ETKCQTPLGAINTTLPFHNVHPLTIGE (L11136) HAQNILEKTHNGKL CPKYVKSERLVLATGLRNVPQIESR No Cys [SEQ ID NO:180] [SEQ ID NO:229] H2 DQICIGYHSNNSTEKVDTILERNVTVT TKCQTPLGAINTTLPFHNVHPLTIGEC (L11136) HAQNILEKTHNGKL PKYVKSERLVLATGLRNVPQIESR No Cys AI [SEQ ID NO:181] [SEQ ID N0:230] H2 DQICIGYHSNNSTEKVDTILERNVTVT KCQTPLGAINTTLPFHNVHPLTIGECP (L11136) HAQNILEKTHNGK KYVKSERLVLATGLRNVPQIESR No Cys A3 [SEQ ID NO:182] [SEQ ID NO:231] H3 QDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVK ISECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA HK68-H3N2 TITDDQIEVTNATELVQSSSTGKI CPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTR (EF409245) PDB: 1HGJ [SEQ ID NO:183] [SEQ ID NO:232] No Cys H3 QDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVK SECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGAC HK68-H3N2 TITDDQIEVTNATELVQSSSTGKI PKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTR (EF409245) PDB: 1HGJ [SEQ ID NO:184] [SEQ ID NO:233] No Cys dl H3 QDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVK ECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACP HK68-H3N2 TI TDDQIEVTNATELVQSSSTGK KYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTR (EF409245) PDH: IHGJ [SEQ ID NO:185] [SEQ ID N0:234] No Cys 43 H3 STATLCLGHHAVPNGTLVKTITDDQIE CISECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYG HK68-H3N2 VTNATELVQSSSTGKIC ACPKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTR PDB: 1HGJ (EF409245) [SEQ ID NO:308] [SEQ ID NO:52] HK68--CON-A
Subtipo HA Segmento de Tronco N- Segmento de Tronco C- (Genbank No.) terminal HA1 terminal HA1 H3 QDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVK CKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTR HK68-H3N2 TITDDQIEVTNATELVQSSSTGKIC PDB: 1HGJ [SEQ ID NO:309] {EF409245) [SEQ ID NO:36] HK68-CON-B H3 QDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVK APRGYFKMRTGKSSIMSSDAPIDTCIS HK68-H3N2 TITDDQIEVTNATELVQSSSTGKICNN ECITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACP PDB: 1HGJ PHRILDGIDCTLIDALLGDPHCDVFQN KYVKQNTLKLATGMRNVPEK (EF409245) ETWDLFVERSKAFSNC HK68-CON-C [SEQ ID NO:311] [SEQ ID NO:310]
H4 QNYTGNPVICMGHHAVANGTMVKTLAD VSKCHTDKGSLSTTKPFQNISRIAVGD (D90302) DQVEVVTAQELVESQNLPEL CPRYVKQGSLKLATGMRNIPEKASR No Cys [SEQ ID NO:186] [SEQ ID NO:235] H4 QNYTGNPVICMGHHAVANGTMVKTLAD SKCHTDKGSLSTTKPFQNISRIAVGDC (D90302) DQVEVVTAQELVESQNLPEL PRYVKQGSLKLATGMRNIPEKASR No Cys Al [SEQ ID NO:1871 [SEQ ID N0:236] H4 QNYTGNPVICMGHHAVANGTMVKTLAD KCHTDKGSLSTTKPFQNISRIAVGDCP (D90302) DQVEVVTAQELVESQNLPE RYVKQGSLKLATGMRNIPEKASR No Cys A3 [SEQ ID NO:188] [SEQ ID NO:2371
H5 DQICIGYHANKSTKQVDTIMEKNVTVT DTKCQTPVGEINSSMPFHNIHPHTIGE (X07826) HAQDILERTHNGKL CPKYVKSDRLVLATGLRNVPQRKKR No Cys [SEQ ID NO:189] [SEQ ID NO:238] H5 DQICIGYHANKSTKQVDTIMEKNVTVT TKCQTPVGEINSSMPFHNIHPHTIGEC )X07826) HAQDILERTHNGKL PKYVKSDRLVLATGLRNVPQRKKR No Cys Al [SEQ ID NO:190] [SEQ ID NO:239] H5 DQICIGYHANKSTKQVDTIMEKNVTVT KCQTPVGEINSSMPFHNIHPHTIGECP (X07826) HAQDILERTHNGK KYVKSDRLVLATGLRNVPQRKKR No Cys A3 [SEQ ID NO:191] [SEQ ID NO:240]
H6 DKTCIrYHANNSTTOIDTILEKNVTVT DATCQTVAGVLRTNKTFQNVSPLWIGE (D90303) HSVELLENQKEERF CPKYVKSESLRLATGLRNVPQIETR No Cys [SEQ ID NO:192] [SEQ ID NO:241] H6 DKICIGYHANNSTTQIDTILEKNVTVT ATCQTVAGVLRTNKTFQNVSPLWIGEC (D90303) HSVELLENQKEERF PKYVKSESLRLATGLRNVPQIETR No Cys Al [SEQ ID NO:193] [SEQ ID NO:242] H6 DKICIGYHANNSTTQIDTILEKNVTVT TCQTVAGVLRTNKTFQNVSPLWIGECP (090303) HSVELLENQKEER KYVKSESLRLATGLRNVPQIETR No Cys A3 [SEQ ID N0:194] [SEQ ID NO:243]
Subtipo HA Segmento de Tronco N- Segmento de Tronco C- (Genbank No.) terminal HA1 terminal HA1 H7 DKICLGHHAVSNGTKVNTLTERGVEVV EGECYHSGGTITSRLPFQNINSRAVCK (M24457) NATETVERTNIPKI CPRYVKQESLLLATGMKNVPEPSKKRK No Cys KR [SEQ ID NO:195] [SEQ ID NO:244] H7 DKICLGHHAVSNGTKVNTLTERGVEVV GECYHSGGTITSRLPFQNINSRAVGKC (M24437) NATETVERTNIPKI PRYVKQESLLLATGMKNVPEPSKKRKK No Cys Al R [SEQ ID NO:196] [SEQ ID NO:245] H7 DKICLGHHAVSNGTKVNTLTERGVEVV ECYHSGGTITSRLPFQNINSRAVGKCP (M24457) NATETVERTNIPK RYVKQESLLLATGMKNVPEPSKKRKKR No Cys d3 [SEQ ID NO:197] [SEQ ID NO:246]
H8 DRICIGYQSNNSTDTVNTLIEQNVPVT NTKCQTYAGAINSSKPFQNASRHYMGE (D90304) QTMELVETEKHPAY CPKYVKKASLRLAVGLRNTPSVEPR No Cys [SEQ ID NO:196] [SEQ ID NO:247] H8 DRICIGYQSNNSTDTVNTLIEQNVPVT TKCQTYAGAINSSKPFQNASRHYMGEC (D90304) QTMELVETEKHPAY PKYVKKASLRLAVGLRNTPSVEPR No Cys Al [SEQ ID NC:199] [SEQ ID NO:248] H8 DRICIGYQSNNSTDTVNTLIEQNVPVT KCQTYAGAINSSKPFQNASRHYMGECP (D90304) QTMELVETEKHPA KYVKKASLRLAVGLRNTPSVEPR No Cys 63 [SEQ ID NO:200] [SEQ ID NO:249]
H9 DKICIGYQSTNSTETVDTLTESNVPVT VVQCQTEKGGLNTTLPFHNISKYAFGN (D90305) HTKELLHTEHNGML CPKYVCVKSLKLPVGLRNVPAVSSR No Cys [SEQ ID NO:201] [SEQ 1D NO:2501 H9 DKICIGYQSTNSTÉTVDTLTESNVPVT VQCQTEKCGLNTTLPFHNISKYAFGNC (D90305) HTKELLHTEHNGML PKYVGVKSLKLPVGLRNVPAVSSR No Cys Al [SEQ ID NO:202] [SEQ ID NO:251] H9 DKICIGYQSTNSTETVDTLTESNVPVT QCQTEKGGLNTTLPFHNISKYAFGNCP (D90305) HTKELLHTEHNGM KYVGVKSLKLPVGLRNVPAVSSR No Cys 63 [SEQ ID NU:2Ú3] [SEQ ID NO:252]
H10 LDRICLGHHAVANGTIVKTLTNEQEEV ESKCFWRGGSINTKLPFQNLSPRTVGQ (M21647) TNATETVESTNLNKL CPKYVNQRSLLLATGMRNVPEVVQGR No Cys [SEQ ID NO:204] [SEQ ID NO:253] H10 LDRICLGHHAVANGTIVKTLTNEQEEV SKCFWRGGSINTKLPFQNLSPRTVGQC (M21647) TNATETVESTNLNKL PKYVNQRSLLLATGMRNVPEVVQGR No Cys Al [SEQ ID NO:205] [SEQ ID NO:254]
Subtipo MA Segmento de Tronco N- Segmento de Tronco C- (Genbank No.) terminal HA1 terminal HA1. 510 LDRICLGHHAVANGTIVKTLTNEQEEV KCFWRGGSINTKLPFQNLSPRTVGQCP (M21647) TNATETVESTNLNK KYVNQRSLLLATGMRNVPEVVQGR No Cys A3 [SEQ ID NO:206] [SEQ ID NQ:255]
H11 DEICIGYLSNNSTDKVDTIIENNVTVT STKCQTEIGGINTNKSFHNVHRNTIGD (D90306) SSVELVETEHTGSF CPKYVNVKSLKLATGPRNVPAIASR No Cys [SEQ ID NO:2071 [SEQ ID NO:256] H11 DEICIGYLSNNSTDKVDTIIENNVTVT TKCQTEIGGINTNKSFHNVHRNTIGDC (D90306) SSVELVETEHTGSF PKYVNVKSLKLATGPRNVPAIASR No Cys 61 [SEQ ID NO:2081 [SEQ ID Ní:257] H11 DEICIGYLSNNSTDKVDTITENNVTVT KCQTEIGGINTNKSFHNVHRNTIGDCP (D90306) SSVELVETEHTGS KYVNVKSLKLATGPRNVPAIASR No Cys A3 [SEQ ID NO:209] [SEQ ID NO:258]
H12 DKICIGYQTNNSTETVNTLSEQNVPVT VTECQLNEGVMNTSKPFQNTSKHYIGK )D90307) QVEELVHRGIDPIL CPKYIPSGSLKLAIGLRNVPQVQDR No Cys [SEQ ID Ní:210] [SEQ ID Ní:259] H1 DKICIGYQTNNSTETVNTLSEQNVPVT TECQLNEGVMNTSKPFQNTSKHYIGKC (D90307) QVEELVHRGIDPIL PKYIPSGSLKLAIGLRNVPQVQDR No Cys dl [SEQ ID NO:211] [SEQ ID NO:260] H12 DKICIGYQTNNSTETVNTLSEQNVPVT ECQLNEGVMNTSKPFQNTSKHYIGKCP (D90307) QVEELVHRGIDPI KYIPSGSLKLAIGLRNVPQVQDR No Cys n3 [SEQ ID NO:212] [SEQ ID NO:261]
H13 DRICVGYLSTNSSERVDTLLENGVPVT NTKCQTSVGGINTNRTFQNIDKNALGD (D90308) SSIDLIETNHTGTY CPKYIKSGQLKLATGLRNVPAISNR No Cys [SEQ ID NO:213) [SEQ ID Ní:262] I-H13 DRICVGYLSTNSSERVDTLLENGVPVT TKCQTSVGGINTNRTFQNIDKNALGDC (D90308) SSIDLIETNHTGTY PKYIKSGQLKLATGLRNVPAISNR No Cys ©1 [SEI) Ii) NO:2141 [SEQ ID Ní:263] H13 DRICVGYLSTNSSERVDTLLENGVPVT KCQTSVGGINTNRTFQNIDKNALGDCP (D90308) SSIDLIETNHTGT KYIKSGQLKLATGLRNVPAISNR No Cys 63 [SEQ ID Ní:215] [SEQ ID NO:264]
H14 QITNGTTGNPIICLGHHAVENGTSVKT TSPCLTDKGSIQSDKPFQNVSRIAIGN (M35997) LTDNHVEVVSAKELVETNHTDEL CPKYVKQGSLMLATGMRNIPGKQAK No Cys [SEQ ID Ní:2161 [SEQ ID NO:265]
Subtipo HA Segmento de Tronco N- Segmento de Tronco C- (Genbank No.) terminal HA1 terminal HA1 H14 QITNGTTGNPIICLGHHAVENGTSVKT SPCLTDKGSIQSDKPFQNVSRIAIGNC )M35997) LTDNHVEVVSAKELVETNHTDEL PKYVKQGSLMLATGMRNIPGKQAK No Cys Al [SEQ ID NO:217] [SEQ ID N0:2661 H14 QITNGTTGNPIICLGHHAVENGTSVKT PCLTDKGSIQSDKPFQNVSRIAIGNCP (M35997) LTDNHVEVVSAKELVETNHTDE KYVKQGSLMLATGMRNIPGKQAK No Cys A3 [SEQ ID NO:218] [SEQ ID NO:267]
H15 DKICLGHHAVANGTKVNTLTERGVEVV EGECFYSGGTINSPLPFQNIDSRAVGK (L43917) NATETVEITGIDKV CPRYVKQSSLPLALGMKNVPEKIRTR No Cys [SEQ ID NO:219] [SEQ ID N0:2681 H15 DKICLGHHAVANGTKVNTLTERGVEVV GECFYSGGTINSPLPFQNIDSRAVGKC (L43917) NATETVEITGIDKV PRYVKQSSLPLALGMKNVPEKIRTR No Cys Al [SEQ ID N0:220] [SEQ ID NO:269] H15 DKICLGHHAVANGTKVNTLTERGVEVV ECFYSGGTINSPLPFQNIDSRAVGKCP (L43917) NATETVEITGIDK RYVKQSSLPLALGMKNVPEKIRTR No Cyr A3' [SEQ ID NO:221] [SEQ ID N0:270]
H16 DKICIGYLSNNSSDTVDTLTENGVPVT NTKCQTSLGGINTNKTFQNIERNALGD (EÚ293865) SSVDLVETNHTGTY CPKYIKSGQLKLATGLRNVPSIGER No Cys [SEQ ID N0:222] [SEQ ID NO:271] H16 DKICIGYLSNNSSDTVDTLTENGVPVT TKCQTSLGGINTNKTFQNIERNALGDC (EÚ293865) SSVDLVETNHTGTY PKYIKSGQLKLATGLRNVPSIGER No Cys Al [SEQ ID NO:223] [SEQ ID NO:272] H16 DKICIGYLSNNSSDTVDTLTENGVPVT KCQTSLGGINTNKTFQNIERNALGDCP (EU293865) SSVDLVETNHTGT KYIKSGQLKLATGLRNVPSIGER No Cys A3 [SEQ ID N0:224] [SEQ ID NO:273]
H17 DRICIGYQANQNNQTVNTLLEQNVPVT STKCQTPLGALNSTLPFQNVHQQTIGN (CY103876) GAQEILETNHNGKL CPKYVKATSLMLATGLRNNPQMEGR No Cys
A Tabela 2, abaixo, identifica os domínios de tronco putativos, domínios luminais, domínios de transmembrana e domínios citoplásmicos de HA2 polipeptídeos.
TABELA 2. Sequências de Hemaglutinina de Influenza A Exemplares
Subtipo de Domínio HA2 Domínio Domínio de Domínio Domínio de Tronco (Genbank Luminal Transmembrana Citoplásmico No.) H1 GLFGAIAGFIEGGWTGMI MGIYQ ILAIYSTVASSLV NGSLQCRICI PR8-H1N1 DGWYGYHHQNEQGSGYAA LLVSLGAISFWMC (EF467821. DQKSTQNAINGITNKVNT [SEQ ID S [SEQ ID 1) VIEKMNIQFTAVGKEFNK NO:98] NO:130] LEKRMENLNKKVDDGFLD [SEQ ID IWTYNAELLVLLENERTL NO: 114
DFHDSNVKNLYEKVKSQL KNNAKEIGNGCFEFYHKC DNECMESVRNGTYDYPKY
SEESKLNREKVDGVKLES [SEQ ID NO:82] H2 GLFGAIAGFIEGGWQGMI MGVYQ ILAIYATVAGSLS NGSLQCRICI (L11136) DGWYGYHHSNDQGSGYAA LAIMIAGISLWMC DKESTQKAIDGITNRVNS [SEQ ID S [SEQ ID VIEKMNTQFEAVGKEF'SN NO:99] NO:131] LEKRLENLNKKMEDGFLD [SEQ ID VWTYNAELLVLMENERTL NO: 115 DFHDSNVKNI,YDRVRMQL
RDNAKELGNGCFEFYHKC DDECMNSVKNGTYDYPKY
EEESKLNRNEIKGVKLSN [SEQ ID NO:83] H3 GLFGAIAGFIENGWEGMI SGYKD WILWISFAISCFL RGNIRCNICI HK68-H3N2 DGWYGFRHQNSEGTGQAA LCVVLLGFIMWAC (EF409245) DLKSTQAAIDQINGKLNR Q [SEQ ID PDB: 1HGJ VIEKTNEKFHQIEKEFSE [SEQ ID NO:132] VEGRIQDLEKYVEDTKID NO:100] [SEQ ID LWSYNAELLVALENQHTI NO:116]
DLTDSEMNKLFEKTRRQL RENAEDMGNGCFKIYHKC DNACIESIRNGTYDHDVY
RDEALNNRFQIKGVELK [SEQ ID NO:84] H4 GLFGAIAGFIENGWQGLI QGYKD IILWISFSISCFL NGNIRCQICI (D90302) DGWYGFRHQNAEGTGTAA LVALLLAFILWAC DLKSTQAAIDQINGKLNR Q [SEQ ID LIEKTNDKYHQIEKEFEQ [SEQ ID NO:1JJ] VEGRIQDLENYVEDTKID NØ:101] [SEQ ID LWSYNAELLVALENQHTI NO:117]
DVTDSEMNKLFERVRRQL RENAEDKGNGCFEIFHKC DNNCIESIRNGTYDHDIY
RDEAINNRFQIQGVKLT [SEQ ID NO:85] 1-15 GLFGAIAGFIEGGWQGMV ILSIYSTVASSLA NGSLQCRICI (X07826) DGWYGYHHSNEQGSGYAA MGVYQ LAIMIAGLSEWMC DKESTQKAIDGITNKVNS S [SEQ ID IIDKMNTRFEAVGKEFNN [SEQ ID NO:134] LERRVENLNKKMEDGFLD NO:102] [SEQ ID
Subtipo de Domínio }1A2 Domínio Domínio de Domínio Domínio de Tronco (Genbank Luminal Transmembrana Citoplásmico No.) VWTYNVELLVLMENERTL N©:118]
DFHDSNVNNLYDKVRLQL KDNARELGNGCFEFYHKC DNECMESVRNGTYDYPQY
SEEARLNREEISGVKLES [SEQ ID N0:86] H6 GLFGAIAGFIEGGWTGMI LGVYQ ILAIYSTVSSSLV NGSMQCRICI (D90303) DGWYGYHHENSQGSGYAA LVGLIIAVGLWMC - DRESTQKAVDGITNKVNS S [SEQ ID IIDKMNTQFEAVDHEFSN [SEQ ID NO:135] LERRIDNLNKRMEDGFLD NO:103] [SEQ ID VWTYNAELLVLLENERTL NO:119]
DLHDANVKNLYERVKSQL RDNAMILGNGCFEFWHKC DDECMESVKNGTYDYPKY
QDESKLNRQEIESVKLES [SEQ ID NO:871 H7 GLFGAIAGFIENGWEGLV SGYKD VILWFSFGASCFL NGNMRCTICI (M24457) DGWYGFRHQNAQGEGTAA LLAIAMGLVFICV DYKSTQSATDQITGKLNR [SEQ ID K [SEQ ID LIEKTNQQFELIDNEFTE NO:104] NO:136] VEKQIGNLINWTKDSITE [SEQ ID VWSYNAELIVAMENQHTI NO:120]
DLADSEMNRLYERVRKQL RENAEEDGTGCFEIFHKC DDDCMASIRNNTYDHSKY
REEAMQNRIQIDPVKLS [SEQ ID NO:88] H8 - GLFGAIAGFIEGGWSGMI NTTYK ILSIYSTVAASLC NGSCRCMFCI (D90304) DGWYGFHHSNSEGTGMAA LAILIAGGLILGM DQKSTQEAIDKITNKVNN [SEQ ID Q [SEQ ID IVDKMNREFEVVNHEFSE NO:105] NO:137] VEKRINMINDKIDDQIED [SEQ ID LWAYNAELLVLLENQKTL N0:121]
DEHDSNVKNLFDEVKRRL SANAIDAGNGCFDILHKC DNECMETIKNGTYDHKEY
EEEAKLERSKINGVKLEE [SEQ ID NO:89] H9 GLFGAIAGFIEGGWPGLV EGTYK ILTIYSTVASSLV NGSCRCNICI (D90305) AGWYGFQHSNDQGVGMAA LAMGFAAFLFWAM DKGSTQKAIDKITSKVNN [SEQ ID S [SEQ ID IIDKMNKQYEVIDHEFNE NO:106] NO:138] LEARLNMINNKIDDQIQD [SEQ ID IWAYNAELLVLLENQKTL NO:122]
DEHDANVNNLYNKVKRAL GSNAVEDGNGCFELYHKC DDQCMETIRNGTYDRQKY QEESRLERQKIEGVKLES
Subtipo de Domínio HA2 Domínio Domínio de Domínio Domínio de Tronco (Genbank Luminal Transmembrana Citoplasmico No.) [SEQ ID NO:90] H10 GLFGAIAGFIENGWEGMV SGYKD IILWFSFGESCFV NGNMRCTICI (M21647) DGWYGFRHQNAQGTGQAA LLAVVMGLVFFCL DYKSTQAAIDQITGKLNR K [SEQ ID LIEKTNTEFESIESEFSE [SEQ ID NO:139] TEHQIGNVINWTKDSITD NO:107] [SEQ ID IWTYNAELLVAMENQHTI NO:123]
DMADSEMLNLYERVRKQL RQNAEEDGKGCFEIYHTC DDSCMESIRNNTYDHSQY
REEALLNRLNINPVKLS [SEQ ID NO:91] H11 GLFGAIAGFIEGGWPGLI GNVYK ILSIYSCIASSLV NGSCRCTICI (D90306) NGWYGFQHRDEEGTGIAA LAALIMGFMFWAC DKESTQKAIDQITSKVNN [SEQ ID S [SEQ ID IVDRMNTNFESVQHEFSE NO:108] NO:140] IEERINQLSKHVDDSVVD [SEQ ID IWSYNAQLLVLLENEKTL NO:124]
DLHDSNVRNLHEKVRRML KDNAKDEGNGCFTFYHKC DNKCIERVRNGTYDHKEF EEESKINRQEIEGVKLDS
S [SEQ ID NO:92] H12 GLFGAIAGFIEGGWPGLV NSTYK ILSIYSSVASSLV GNVRCTFCI (D90307) AGWYGFQHQNAEGTGIAA LLLMIIGGFIFGC DRDSTQRAIDNMQNKLNN QN [SEQ ID VIDKMNKQFEVVNHEFSE [SEQ ID NO:141] VESRINMINSKIDDQITD NO:109] [SEQ ID IWAYNAELLVLLENQKTL NO:125]
DEHDANVRNLHDRVRRVL RENAIDTGDGCFEILHKC DNNCMDTIRNGTYNHKEY
EEESKIERQKVNGVKLEE [SEQ ID NO:93] H13 GLFGAIAGFIEGGWPGLI DNVYK ALSIYSCIASSVV GNCRFNVCI )D90308) NGWYGFQHQNEQGTGIAA LVGLILSFIMWAC DKESTQKAIDQITTKINN [SEQ ID SS [SEQ ID IIDKMNGNYDSIRGEFNQ NO:110] NO:142] VEKRINMLADRIDDAVTD [SEQ ID IWSYNAKLLVLLENDKTL NO:126]
DMHDANVKNLHEQVRREL KDNAIDEGNGCFELLHKC NDSCMETIRNGTYDHTEY AEESKLKRQEIDGIKLKS
E [SEQ ID NO:94] H14 GLFGAIAGFIENGWQGLI MGYKD IILWISFSMSCFV NGNIRCQICI
Subtipo de Domínio HA2 Domínio Domínio de Domínio Domínio de Tronco Luminal Transmembrana Citoplásmico (Genbank No.) ]E35997) DGWYGFRHQNAEGTGTAA FVALILGFVLWAC DLKSTQAAIDQINGKLNR [SEQ ID Q [SEQ ID LIEKTNEKYHQIEKEFEQ NO:1111 NO:143] VEGRIQDLEKYVEDTK]iD [SEQ ID LWSYNAELLVALENQHTI NO: 127]
DVTDSEMNKLFERVRRQL RENAEDQGNGCFEIFHQC DNNCIESIRNGTYDHNIY
RDEAINNRIKINPVTLT [SEQ ID NO:95] H15 GLFGAIAGFIENGWEGLI SGYKD VILWFSFGASCVM GNLRCTICI (L43917) DGWYGFRHQNAQGQGTAA LLAIAMGLIFMCV DYKSTQAAIDQITGKLNR [SEQ ID EN [SEQ ID LIEKTNKQFELIDNEFTE NO:112] NO:144] VEQQIGNVINWTRDSLTE [SEQ ID IWSYNAELLVAMENQHTI NO: 128[
DLADSEMNKLYERVREQL RENAEEDGTGCFEIFHRC DDQCMESIRNNTYNHTEY
RQEALQNRIMINPVKLS [SEQ ID NO:96] H16 GLFGAIAGFIEGGWPGLI DNVYK VLSIYSCIASSIV NGSCRFNVCI (EÜ293865] NGWYGFQHQNEQGTGIAA LVGLILAFIMWAC DKASTQKAINEITTKINN S [SEQ ID IIEKMNGNYDSIRGEFNQ [SEQ ID NO:145] VEKRINMLADRVDDAVTD NO:113] [SEQ ID IWSYNAKLLVLLENDRTL NO:129] DLHDANVRNLHDQVKF:AL
KSNAIDEGDGCFNLLHKC NDSCMETIRNGT'YNHEDY REESQLKRQEIEGIKLKT
E [SEQ ID NO:97] H17 GLFGAIAGFIEGGWQGMI YSRYY IMTLYSTIASSVV KGSIQCKICI (CY103876] DGWYGYHHENQEGSGYAA LGSLIIAAFLWGC
DKEATQKAVDAITNKVNS Q IIDKMNSQFESNIKEFNR LELRIQHLSDRVDDALLD IWSYNTELLVLLENERTL DFHDANVKNLFEKVKAQL KDNAIDEGNGCFLLLHKC NNSCMDDIKNGTYKYMDY
REESHIEKQKIDGVKLTD Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreendem um ou mais epítopos imunogênicos na estrutura terciária ou quaternária de um polipeptídeo de hemaglutinina de virus influenza.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco 5 N-terminal HAl compreende a sequência de aminoácido A17 -A18- (Xaa) -A38 (SEQ ID NO :14 6) , em que A17 é Y ou H; A19 é H, L, ou Q; (Xaa) representa uma sequência de 18-20 resíduos de aminoácido; e A39 é H, S, Q, T ou N.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco C-terminal HA1 compreende a sequência de aminoácido A291-A292 (SEQ ID NO:147), em que A291 é T, S, N, D, P ou K; e A292 é L, M, K ou R.
Em determinadas modalidades, o domínio HA2 compreende a sequência de aminoácido A19 -A19-A20 -A21 (SEQ ID NO:148), em que A19 é V ou I; A19 é D, N ou A; A20 é G, e A21 é W. Em determinadas modalidades, o domínio HA2 compreende a sequência de aminoácido A38-A39-A4D-A41-A4 2-A9 3- A44-A45-A46-A47 -A4B-A49-A5í-A51-A52-A53-A54 -A55-A56 (SEQ ID NO: 149) , em que A39 é K, Q, R, L ou Y; A39 é qualquer resíduo de aminoácido; 30 A40 é qualquer resíduo de aminoácido;
A41 é T; A42 é Q; A43 é qualquer resíduo de aminoácido; A94 é A; 5 A45 é I; A46 é D; A47 é qualquer resíduo de aminoácido; A48 é I, V ou M; A49 é T, Q ou N; 10 Aso é qualquer resíduo de aminoácido; A51 é K; A52 é V ou L; A53 é N; A54 é qualquer resíduo de aminoácido; 15 AS5 é V, I ou L; e A56 é V ou I.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de influenza compreendem duas sequências de aminoácido selecionadas a partir de SEQ ID NOS:146-149.
20 Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de influenza compreendem três sequências de aminoácido selecionadas a partir de SEQ ID NOS:146-149. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de influenza compreendem quatro sequências de 25 aminoácido selecionadas a partir de SEQ ID NOS:146-149.
Em determinadas modalidades, os segmentos de tronco N-terminal HAl são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza B. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID 30 NOS:154-157, apresentada na Tabela 3 abaixo.
Em determinadas modalidades, os segmentos de tronco C-terminal HA1 são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza B. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco C-terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID 5 NOS:158-159 e 553-554, apresentadas na Tabela 3 abaixo.
Em determinadas modalidades, os domínios de tronco HA2 são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza B. Os resíduos exemplares do final de um segmento de tronco N-terminal e do final de um segmento de tronco C- terminal de uma hemaglutinina de vírus influenza B são indicados na Figura 2. Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA2 está de acordo com a SEQ ID N©:160, apresentada nas Tabelas 3 e 4 abaixo.
Em particular modalidades, os limites do segmento de tronco N-terminal HA1 de vírus influenza B e do segmento C-terminal HA1 de vírus influenza B são definidos em relação a seis pares de resíduos de aminoácido: Arg50 e Ser277; Ala66 e Trp271; Lys8o e Ser277; CYsg4 e Cys143; Cys178 e Cys272 e Cyss4 e Cys27 2. As posições desses seis pares de resíduos também estão sublinhadas na Figura 3. Os números de resíduos estão baseados na numeração de B-HA de vírus influenza B como descrito no Banco de Dados de Proteínas No.
de acesso 3BT6. A sequência de aminoácido correspondente à estrutura cristalina de raios X da proteína B-HA no Banco de Dados de Proteínas No. de acesso 3BT6 está alinhada com a sequência de aminoácido H1 e H3 representativa e mostrada na Figura 2.
Em determinadas modalidades, um segmento de tronco N-terminal HAl de vírus influenza B começa em resíduo 1 (com base na numeração de uma subunidade de HAl de vírus influenza B como no arquivo PDB 3BT6) e termina em Arg50 . Em determinadas modalidades, um segmento de tronco N-terminal HAl de vírus influenza B começa em resíduo 1 e termina em Ala66. Em algumas modalidades, um segmento de 5 tronco N-terminal HA1 de vírus influenza B começa em resíduo 1 e termina em Lys80 . Em algumas modalidades, um segmento de tronco N-terminal de vírus influenza B começa em resíduo 1 e termina em Arg80 . Em algumas modalidades, um segmento de tronco N-terminal de vírus influenza B começa 10 em resíduo 1 e termina em Cys54. Em algumas modalidades, um segmento de tronco N-terminal de vírus influenza B começa em resíduo 1 e termina em CySg 4 . Em algumas modalidades, um segmento de tronco N-terminal de vírus influenza B começa em resíduo 1 e termina em Cys178. 15 Em algumas modalidades, um segmento de tronco N- terminal HAl de vírus influenza B possui uma sequência de aminoácido de acordo com quaisquer SEQ ID NOS:154-157 e 550-552, como ilustrado na TABELA 3. Em algumas modalidades, um segmento de tronco N-terminal HAl de vírus influenza B 20 possui uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntica a qualquer uma das sequências de aminoácido de quaisquer SEQ ID NOS:154- 157 ou 550-552.
Em algumas modalidades, um segmento de tronco N- 25 terminal HAl de vírus influenza B possui uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntica à sequência de aminoácido SEQ ID NO:154, que corresponde aos resíduos 1-50 de HA1 de vírus influenza B.
Em algumas modalidades, um segmento de tronco N- terminal HAl de vírus influenza B possui uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntica à sequência de aminoácido SEQ ID NO:155, 5 que corresponde aos resíduos 1-66 de HAl de virus influenza B.
Em algumas modalidades, um segmento de tronco N- terminal HAl de vírus influenza B possui uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 10 96% ou 98% idêntica à sequência de aminoácido SEQ ID NO:156, que corresponde aos resíduos 1-80 de HAl de vírus influenza Em algumas modalidades, um segmento de tronco N- terminal HA1 de vírus influenza B possui uma sequência de 15 aminoácido que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntica à sequência de aminoácido SEQ ID NO:157, que corresponde aos resíduos 1-80 de HAl de vírus influenza B em que a lisina na posição 80 é substituída por uma arginina. 20 Em algumas modalidades, um segmento de tronco N- terminal HA1 de vírus influenza B possui uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntica à sequência de aminoácido SEQ ID NO:550, que corresponde aos resíduos 1-94 de HA1 de vírus influenza 25 B.
Em algumas modalidades, um segmento de tronco N- terminal HAl de vírus influenza B possui uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntica à sequência de aminoácido SEQ ID NO:551,
que corresponde aos resíduos 1-178 de HAl de vírus influenza E.
Em algumas modalidades, um segmento de tronco N- terminal HA1 de vírus influenza B possui uma sequência de 5 aminoácido que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntica à sequência de aminoácido SEQ ID NO:552, que corresponde aos resíduos 1-54 de HAl de vírus influenza B.
Em algumas modalidades, um segmento de tronco C- terminal HAl de vírus influenza B possui uma sequência de aminoácido que começa em Ser 277i Trp271, Cysi43 , Cys272 ou resíduos correspondentes em outros subtipos HA de vírus influenza B.
Em algumas modalidades, um segmento de tronco C- terminal HAl de vírus influenza B possui uma sequência de aminoácido de acordo com qualquer SEQ ID NOS:158-159 ou 553-554, como ilustrado na TABELA 3. Em algumas modalidades, um segmento de tronco C-terminal HA1 de vírus influenza B possui uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntica à SEQ ID NO:158, que corresponde aos resíduos 277-344 de HA1 de vírus influenza B. Em algumas modalidades, um segmento de tronco C-terminal HAl de vírus influenza B possui uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntica à SEQ ID NO:159, que corresponde aos resíduos 271-344 de HAl de vírus influenza B. Em algumas modalidades, um segmento de tronco C-terminal HAl de vírus influenza B possui uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntica à SEQ ID NO:553, que corresponde aos resíduos 137-
344 de HAl de vírus influenza B. Em algumas modalidades, um segmento de tronco C-terminal HA1 de vírus influenza B possui uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntica à SEQ ID NC:554, que corresponde aos resíduos 272-344 de HAT de vírus influenza B.
Em algumas modalidades, um segmento de tronco C- terminal HAl de vírus influenza B começa em resíduo-276, resíduo-275, resíduo-274, resíduo-273, ou resíduo-272. Em outras modalidades, um segmento de tronco C-terminal HA1 de vírus influenza B começa em resíduo-278, resíduo-279, resíduo-280, resíduo-281, ou resíduo-282.
Em determinadas modalidades, o domínio HA2 de vírus influenza B está em associação terciária ou quaternária com o domínio HAl de vírus influenza B através do segmento N-terminal HAl de vírus influenza B, o segmento C-terminal HA1 de vírus influenza B, ou ambos.
Em algumas modalidades, o segmento C-terminal HAl de vírus influenza B e a subunidade HA2 de vírus influenza B são covalentemente ligados. Por exemplo, em sua C- terminação (por exemplo, no resíduo final da segunda sequência), o segmento C-terminal HAl de vírus influenza B é covalentemente ligado ao domínio HA2 de vírus influenza B nessas modalidades. Em algumas modalidades, o segmento C- terminal HA1 de vírus influenza B e o domínio HA2 de vírus influenza B formam uma cadeia polipeptídica contínua. Em algumas modalidades, o domínio HA2 de vírus influenza B possui a sequência de aminoácido de SEQ ID N©:160 ou 161, como ilustrado na TABELA 3 ou 4. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido do domínio HA2 é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntica a qualquer SEQ ID NOS:160-161.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de influenza B compreendem um peptídeo de 5 sinal. O peptídeo de sinal pode ser qualquer peptídeo de sinal considerado adequado pelos elementos versados na técnica, inclusive qualquer peptídeo de sinal descrito aqui. Em determinadas modalidades, o peptídeo de sinal é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntico a 10 qualquer SEQ ID NOS:150-153. Em determinadas modalidades, o peptídeo de sinal está acordo com qualquer SEQ ID NOS:150-
153.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de influenza B compreendem um domínio 15 luminal. 0 domínio luminal pode ser qualquer domínio luminal considerado adequado pelos elementos versados na • técnica, inclusive qualquer domínio luminal descrito aqui. Em determinadas modalidades, o domínio luminal é pelo menos 60% ou 80%, idêntico à SEQ ID NO:162. Em determinadas 20 modalidades, o domínio luminal está de acordo com SEQ ID NO: 162.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de influenza B compreendem um domínio de transmembrana. 0 domínio de transmembrana pode ser qualquer 25 domínio de transmembrana considerado adequado pelos elementos versados na técnica, inclusive qualquer domínio de transmembrana descrito aqui. Em determinadas modalidades, o domínio de transmembrana é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntico à SEQ ID NO:163. Em determinadas modalidades, o domínio de transmembrana está de acordo com SEQ ID NO:163.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de influenza B compreendem um domínio citoplásmico. 0 domínio citoplásmico pode ser qualquer domínio citoplásmico considerado adequado pelos elementos versados na técnica, inclusive qualquer domínio citoplásmico descrito aqui. Em determinadas modalidades, o domínio citoplásmico é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntico à SEQ ID NO:164. Em determinadas modalidades, o domínio citoplásmico está de acordo com SEQ ID NO:164.
TABELA, 3: Sequências de Hemaglutinina de Influenza B Exemplares Variantes Segmento de Segmento de de Peptídeo de Tronco N- Tronco C- Domínio HA2 construção sinal HA terminal HAS. terminal HA1 ArgS©- MKAIIVILMVVTS DRICTGITSSNSPH SKVIKGSLPLIGEA GFFGAIAGFLEGGWEGM Ser277 NA VVKTATQGEVNVTG DCLHEKYGGLNKSK IAGWHGYTSHGAHGVAV
VIPLTTTPTKSHFA PYYTGEHAKAIGNC AADLKSTQEAINKITKN [SEQ ID NLKGTETR PIWVKTPLKLANGT LNSLSELEVKNLQRLSG NO:1501 KYRPPAKLLKER AMDELHNEILELDEKVD [SEQ ID DLRADTISSQIELAVLL NO:1:54] [SEQ ID SNEGIINSEDEHLLALE NO:158] RKLKKMLGPSAVEIGNG
CFETKHKCNQTCLDRIA AGTFDAGEFSLPTFDSL NITAASLNDDGLDNHTI LLYYSTAASSLAVTLMI AIFVVYMVSRDNVSCSI
CL [SEQ ID NO:1601 A1a66- MKAIIVILMVVTS DRICTGITSSNSPH WCASGRSKVIKGSL GFFGAIAGFLEGGWEGM Trp271 NA VVKTATQGEVNVTG PLIGEADCLHEKYG IAGWHGYTSHGAHGVAV
VIPLTTTPTKSHFA GLNKSKPYYTGEHA AADLKSTQEAINKITKN [SEQ ID NLKGTETRGKLCPK KAIGNCPIWVKTPL LNSLSELEVKNLQRLSG NO:151] CLNCTDLDVA KLANGTKYRPPAKL AMDELHNEILELDEKVD
LKER DLRADTISSQIELAVLL [SEQ ID SNEGIINSEDEHLLALE NO:155] [SEQ ID RKLKKMLGPSAVEIGNG NO:159] CFETKHKCNQTCLDRIA
AGTFDAGEFSLPTFDSL
Variantes de Segmento de Segmento de Peptídeo de construção Tronco N- Tronco C- Domínio HA2 sinal I terminal HA1 terminal HA1
NITAASLNDDGLDNHTI LLYYSTAASSLAVTLMI AI FVVYMVSRDNVSCSI
CL [SEQ ID NO:160] Lys80- MKAIIVILMVVTS DRICTGITSSNSPH SKVIKGSLPLIGEA GEFGAIAGFLEGGWEGM Ser277 NA VVKTATQCEVNVTG DCLHEKYGGLNKSK IAGWHGYTSHGAHGVAV
VIPLTTTPTKSHFA PYYTGEHAKAIGNC AADLKSTQEAINKITKN [SEQ ID NLKGTETRGKLCPK PIWVKTPLKLANGT LNSLSELEVKNLQRLSG NO:152] CLNCTDLDVALGRP KYRPPAKLLKER AMDELHNEILELDEKVD
KCTGKIPSAK DLRADTISSQIELAVLL [SEQ ID SNEGIINSEDEHLLALE [SEQ ID NO:158] RKLKKMLGPSAVEIGNG NO: 15€] CFETKHKCNQTCLDRIA
AGTFDAGEFSLPTFDSL NITAASLNDDGLDNHTI LLYYSTAASSLAVTLMI AIFVVYMVSRDNVSCSI
CL [SEQ ID NO:160] Arg80- MKAIIVILMVVTS DRICTGITSSNSPH SKVIKGSLPLIGEA GFFGAIAGFLEGGWEGM Ser277 NA VVKTATQGEVNVTG DCLHEKYGGLNKSK IAGWHGYTSHGAHGVAV
VIPLTTTPTKSHFA PYYTGEHAKAIGNC AADLKSTQEAINKITKN [SEQ ID NLKGTETRGKLCPK PIWVKTPLKLANGT LNSLSELEVKNLQRLSG NO:153] CLNCTDLDVALGRP KYRPPAKLLKER AMDELHNEILELDEKVD
KCTGKIPSAR DLRADTISSQIELAVLL [SEQ ID SNEGIINSEDEHLLALE [SEQ ID NO:158] RKLKKMLGPSAVEIGNG NO:1571 CFETKHKCNQTCLDRIA
AGTFDAGEFSLPTFDSL NITAASLNDDGLDNHTI LLYYSTAASSLAVTLMI AI FVVYMVSRDNVSCSI
CL [SEQ ID NO:160] Cys94- MKAIIVILMVVTS DRICTGITSSNSPH CPNVTNGNGFFATM GFFGAIAGFLEGGWEGM Cys143 NA VVKTATQGEVNVTG AWAVPKNKTATNPL TAGWHGYTSHGAHGVAV
VIPLTTTPTKSHFA TVEVPYICTKGEDQ AADLKSTQEAINKITKN [SEQ ID NLKGTQTRGKLCPN ITVWGFHSDDETQM LNSLSELEVKNLQRLSG NO:150] CLNCTDLDVALGRP VKLYGDSKPQKFTS AMDELHNEILELDEKVD
KCMGTIPSAKASIL SANGVTTHYVSQIG DLRADTISSQIELAVLL HEVKPVTSGC GFPNQAEDEGLPQS SNEGIINSEDEHLLALE
GRIVVDYMVQKPGK RKLKKMLGPSAVEIGNG [SEQ ID TGTIAYQRGVLLPQ CFETKHKCNQTCLDRIA NO: 550) KVWCASGRSKVIKG AGTFDAGEFSLPTFDSL
SLPLIGEADCLHEK NITAASLNDDGLDNHTI YGGLNKSKPYYTGE LLYYSTAASSLAVTLMI HAKAIGNCPIWVKT AIFVVYMVSRDNVSCSI PLKLANGTKYRPPA CL
Variantes Segmento de Segmento de de Peptídeo de Tronco N- Tronco C- Domínio HA2 construção sinal HA terminal HAI terminal HA1
KLLK [SEQ ID NO:160] [SEQ ID NO: 553 Cys178- MKAIIVILMVVTS DRICTGITSSNSPH CASGRSKVIKGSLP GFFGAIAGFLEGGWEGM Cys272 NA VVKTATQGEVNVTG LIGEADCLHEKYGG IAGWHGYTSHGAHGVAV
VIPLTTTPTKSHFA LNKSKPYYTGEHAK AADLKSTQEAINKITKN [SEQ ID NLKGTQTRGKLCPN AIGNCPIWVKTPLK LNSLSELEVKNLQRLSG NO:150] CLNCTDLDVALGRP LANGTKYRPPAKLL AMDELHNEILELDEKVD
KCMGTIPSAKASIL K DLRADTISSQIELAVLL
HEVKPVTSGCFPIM SNEGIINSEDEHLLALE HDRTKIRQLPNLLR [SEQ ID RKLKKMLGPSAVEIGNG GYENIRLSARNVTN NO:554] CFETKHKCNQTCLDRIA
AETAPGGPYIVGTS AGTFDAGEFSLPTFDSL GSCPNVTNGNGFFA NITAASLNDDGLDNHTI TMAWAVPKNKTATN LLYYSTAASSLAVTLMI PLTVEVPYIC AIFVVYMVSRDNVSCSI
CL [SEQ ID NO:5511 [SEQ ID NO:160] Cys54- MKAIIVILMVVTS DRICTGITSSNSPH CASGRSKVIKGSLP GFFGAIAGFLEGGWEGM Cys272 NA VVKTATQGEVNVTG LIGEADCLHEKYGG IAGWHGYTSHGAHGVAV
VIPLTTTPTKSHFA LNKSKPYYTGEHAK AADLKSTQEAINKITKN [SEQ ID NLKGTQTRGKLC AIGNCPIWVKTPLK LNSLSELEVKNLQRLSG NO:150] LANGTKYRPPAKLL AMDELHNEILELDEKVD [SEQ ID K DLRADTISSQIELAVLL NO:5521 SNEGIINSEDEHLLALE [SEQ ID RKLKKMLGPSAVEIGNG NO:554] CFETKHKCNQTCLDRIA
AGTFDAGEFSLPTFDSL NITAASLNDDGLDNHTI LLYYSTAASSLAVTLMI AIFVVYMVSRDNVSCSI
CL [SEQ ID NO:160] A Tabela 4 fornece o domínio de tronco putativo, domínio luminal, domínio de transmembrana e domínio citoplásmico de HA de influenza B. TABELA 4: Sequências de Hemaglutinina de Influenza B Exemplares
Subtipo de domínio HA2 Domínio de Domínio Domínio de Domínio Tronco Luminal Transmembrana Citoplásmico (Genbank No.) HA2 GFFGAIAGFLEGG DGLDN HTILLYYSTAASS SRDNVSCSICL (AY096185) WEGMIAGWHGYTS LAVTLMIAIFVVY HGAHGVAVAADLK [SEQ ID MV [SEQ ID STQEAINKITKNL NO:162] NO:164] NSLSELEVKNLQR [SEQ ID LSGAMDELHNEIL NO:163]
ELDEKVDDLRADT ISSQIELAVLLSN EGIINSEDEHLLA LERKLKKMLGPSA VEIGNGCFETKHK CNQTCLDRIAAGT FDAGEFSLPTFDS
LNITAASLND [SEQ ID NO:161] Como ilustrado nas Figuras 1 e 2, os segmentos de tronco N-terminal HA1 compartilham a identidade de sequência entre influenza A e influenza B e adicionalmente através de subtipos de influenza A. Similarmente, os segmentos de tronco C-terminal HAl também compartilham identidade de sequência entre influenza A e influenza B e adicionalmente através de subtipos de influenza A. Ademais, os domínios HA2 também compartilham identidade de sequência entre influenza A e influenza B e adicionalmente através de subtipos de influenza A. - Em algumas modalidades, o polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreende na seguinte ordem: um segmento de tronco N-terminal HAl, a ligante, um segmento de tronco intermediário HAl, um segundo ligante, um segmento de tronco C-terminal HA1 e uma HA2. Em algumas modalidades, o segmento de tronco N- terminal HA1 possui uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntica à SEQ ID NO:555, como ilustrado na Tabela 5. SEQ ID NO:555 corresponde aos resíduos 1-94 de HA1 de vírus influenza B.
Em algumas modalidades, o segmento de tronco C-terminal HAl 5 possui uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntica à SEQ ID NO:557, como ilustrado na Tabela 5. A SEQ ID NO:557 corresponde aos resíduos 272-344 de HAl de vírus influenza B. Em algumas modalidades, o segmento intermediário HA1 possui uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntica à SEQ ID NO:556, como ilustrado na Tabela 5. A SEQ ID NO:556 corresponde aos resíduos 143-178 de vírus influenza B HA1. Em algumas modalidades, o domínio HA2 possui uma sequência de aminoácido que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% idêntica à SEQ ID NO:160, como descrito aqui. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo ligante podem ser qualquer ligante conhecido pelos elementos versados na técnica inclusive, mas sem se limitarem a, ligantes descritos aqui.
TABELA 5. Sequências de Hemaglutinina de Influenza B Exemplares Variante Segmento Segmento de Segmento de de Tronco Tronco N- Intermediário Domínio HA2 construção C-terminal terminal HAl HAl RA1 Cys94-Cysl DRICTGITSSNSP CPNVTNGNGFFATMA CASGRSKVIK GFFGAIAGFLE 43Cys178-C HVVKTATQGEVNV WAVPKNKTATNPLTV GSLPLIGEAD GGWEGMIAGWH ys272 TGVIPLTTTPTKS EVPYIC CLHEKYGGLN GYTSHGAHGVA
HFANLKGTQTRGK KSKPYYTGEH VAADLKSTQEA LCPNCLNCTDLDV [SEQ ID NO:555] AKAIGNCPIW INKITKNLNSL
ALGRPKCMGTIPS VKTPLKLANG SELEVKNLQRL AKASILHEVKPVT TKYRPPAKLL SGAMDELHNEI SGC K LELDEKVDDLR
ADTISSQIELA [SEQ ID [SEQ ID VLLSNEGIINS NO:555] NO:557] EDEELLALERK
LKKMLGPSAVE
Variante Segmento Segmento de Segmento de de Tronco Tronco N- Intermediário Domínio HA2 constru㺠C-t ~i nal ç terminal FIAI ~yl
IGNGCFETKHK CNQTCLDRIAA GTFDAGEFSLP TFDSLNITAAS LNDDGLDNHTI LLYYSTAASSL AVTLMIAIFVV YNIVSRDNVSCS
ICL [SEQ ID NO:160] Em algumas modalidades, o polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza é um polipeptídeo híbrido que compreende ou consiste essencialmente em segmentos e/ou domínios de uma 5 pluralidade de cepas ou subtipos de influenza. Por exemplo, um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza deve compreender segmentos de tronco N- terminal HA1 e C-terminal HA1 de subtipos de HA de vírus influenza A diferentes. Em algumas modalidades, o segmento 10 de tronco N-terminal HA1 pertence ao vírus influenza A enquanto o segmento de tronco C-terminal HA1 pertence ao vírus influenza B. Similarmente, HA2 também pode pertencer ao vírus influenza A enquanto o segmento de tronco N- termlTal /cU ~- terminal inY ii per t encc u. v í r us influenza R.
15 Será entendido que qualquer combinação dos elementos de sequência listados nas Tabelas 1-4 ou as variantes desses podem ser usadas para formar os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina HA da present invenção. 20 Em um polipeptídeo de domínio de tronco de influenza fornecido aqui, um ligante conecta covalentemente o segmento de tronco N-terminal HAl ao segmento de tronco C-terminal HAl.
Em determinadas modalidades, o ligante é uma ligação direta.
Em determinadas modalidades, o ligante é uma cabeça globular, ou um fragmento dessa, de um vírus 5 influenza heterólogo ao domínio de tronco de influenza.
Em determinadas modalidades, o ligante é uma cabeça globular, ou um fragmento dessa, de um vírus influenza heterólogo ao domínio de tronco da subunidade HA2 de uma hemaglutinina de vírus influenza quimérico.
Em determinadas modalidades, o ligante é uma cabeça globular, ou um fragmento dessa, de um vírus influenza heterólogo ao domínio de tronco da subunidade HAl e/ou HA2 de uma hemaglutinina de vírus influenza quimérico.
Em determinadas modalidades, o ligante é uma região de anticorpo Fab ou fragmento dessa.
Em outras modalidades, o ligante é uma glicoproteina viral não- influenza ou fragmento dessa.
Em determinadas modalidades, o ligante é um peptídeo que compreende um resíduo de aminoácido, dois ou menos resíduos de aminoácido, três ou menos resíduos de aminoácido, quatro ou menos resíduos de aminoácido, cinco ou menos resíduos de aminoácido, dez ou menos resíduos de aminoácido, 15 ou menos resíduos de aminoácido, 20 ou menos resíduos de aminoácido, 30 ou menos resíduos de aminoácido, 40 ou menos resíduos de aminoácido, ou 50 ou menos resíduos de aminoácido.
Em determinadas modalidades, o peptídeo ligante compreende 50 ou mais resíduos de aminoácido.
Em determinadas modalidades, o ligante é substancialmente desprovido de um domínio de cabeça globular.
Em outras palavras, o ligante compreende não mais que 10, 9, 8, 7, 6, 5 ou 4 resíduos de aminoácido contíguos sequenciais da sequência de aminoácido de um domínio de cabeça globular de influenza. Em determinadas modalidades, o ligante não é Lys-Leu-Asn-Gly-Ser-Gly-Ile- Met-Lys-Thr-Clu-Gly-Thr-Leu-Glu-Asn (SEQ ID NO:542). Em determinadas modalidades, o ligante não é Asn-Asn-Ile-Asp- Thr (SEQ ID NO:546) ou Lys-Leu-Asn-Gly-Ser-Gly-Ile-Met-Lys- Thr-Glu-Gly-Thr-Leu-Glu-Asn (SEQ ID NO.559). Em determinadas modalidades, o ligante não é Asn-Asn-Ile-Asp- Thr (SEQ ID NO:546).
Em determinadas modalidades, o ligante é covalentemente conectado, em uma extremidade, à C- terminação do segmento de tronco N-terminal HAl. O peptídeo ligante também é covalentemente conectado, na outra extremidade, à N-terminação do segmento de tronco C- terminal HAl. Em determinadas modalidades, uma das ligações 15 covalentes é uma ligação amida. Em determinadas modalidades, ambas as ligações covalentes são ligações amida.
0 ligante deve ser qualquer ligante considerado adequado por um elemento versado na técnica. Em determinadas modalidades, o ligante é selecionado com base no segmento de tronco N-terminal HAl e no segmento de tronco C-terminal HA1. Nessas modalidades, o ligante deve ser selecionado com programas de modelagem molecular como Insightll e Quanta, ambos de Accelrys. Em determinadas modalidades, o ligante é um motivo estrutural que permite o alinhamento estrutural do segmento de tronco N-terminal HAl e do segmento de tronco C-terminal HAl que é compatível com a estrutura de um domínio de tronco de hemaglutinina como reconhecido por elementos versados na técnica. Em determinadas modalidades, o ligante é selecionado a partir de uma biblioteca de ligantes candidatos. Em determinadas modalidades, a biblioteca inclui estruturas de polipeptídeo tridimensionais em um banco de dados publicamente disponível como o Banco de Dados de Proteínas (PDB) ou o Banco de Dados Macromolecular no Laboratório Europeu de 5 Biologia Molecular (EMBL) ou Instituto Europeu de Bioinformática (EBI). Em determinadas modalidades, a biblioteca inclui estruturas de polipeptídeo tridimensionais proprietárias associadas a programas comerciais como Insightll e Quanta, ambos de Accelrys.
Adicionalmente, quaisquer bancos de dados ou coleções de estruturas proteicas ou elementos estruturais podem ser usados para selecionar o ligante. Bancos de dados ou coleç©es exemplares de elementos estruturais proteicos incluem, mas sem se limitarem a, a Classificação Estrutural de Proteínas (SCOP, mantida e disponível através de Cambridge University); o banco de dados de famílias de proteínas (Pfam, manado e disponível através de Wellcome Trust Sanger Institute); o Recurso Universal de Proteínas (UniProt, mantido e disponível através de UniProt 20 Consortium); o recurso Integrado de famílias de proteínas (InterPro; mantido e disponível através de EMBL-EBI); a superfamília de Class Architecture Topology Homologous (CATH, mantida e disponível através de Institute of Structural and Molecular Biology na University College London); e as famílias de proteínas estruturalmente similares (FSSP, mantidas e disponíveis através de EBI).
Qualquer algoritmo considerado adequado por um elemento versado na técnica pode ser usado para selecionar o ligante, inclusive, mas sem se limitar por aqueles usados por SCOP, CATH e FSSP. Exemplos úteis incluem, mas sem se limitarem a,
Pymol (Delano Scientific LLC), Insightll e Quanta (ambos de Accelrys), MIDAS (University of California, San Francisco), SwissPDB viewer (Swiss Institute of Bioinformatics), TOPOFIT (Northeastern University), CBSU LOOPP (Cornell 5 University), e Superpose (University of Alberta, Edmonton).
Em determinadas modalidades, o ligante é uma ligação direta. Em determinadas modalidades, o ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly e Gly-Gly-Gly-Gly-Gly. Em 10 determinadas modalidades, o ligante é selecionado a partir do grupo que consiste em Gly-Pro e Pro-Gly. Em determinadas modalidades, o ligante é uma alça de 281 voltas, por exemplo, que possui a sequência ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165). 15 Em determinadas modalidades, o ligante compreende uma sequência de glicosilação. Em determinadas modalidades, o ligante compreende uma sequência de aminoácido de acordo com Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys onde Xaa é qualquer aminoácido ou, em determinadas modalidades, em que Xaa é qualquer 20 aminoácido exceto Pro e Ser/Thr/Cys é serina, treonina ou cisteína. Em determinadas modalidades, o ligante compreende a sequência de aminoácido Asn-Ala-Ser. Em determinadas modalidades, o ligante é uma sequência de glicosilação. Em determinadas modalidades, o ligante é uma sequência de 25 aminoácido de acordo com Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys onde Xaa é qualquer aminoácido ou, em determinadas modalidades, em que Xaa é qualquer aminoácido exceto Pro e Ser/Thr/Cys é serina, treonina ou cisteína. Em determinadas modalidades, o ligante é a sequência de aminoácido Asn-Ala-Ser.
Em determinadas modalidades, os polipeptideos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza são capazes de formar uma estrutura tridimensional que é similar à estrutura tridimensional do domínio de tronco de 5 uma hemaglutinina de vírus influenza nativa. A similaridade estrutural deve ser avaliada com base em qualquer técnica considerada adequada por elementos versados na técnica. Por exemplo, a reação, por exemplo, sob condições não- desnaturantes, de um polipeptídeo de domínio de tronco de 10 hemaglutinina de vírus influenza com um anticorpo ou antissoro neutralizante que reconhece uma hemaglutinina de vírus influenza nativa deve indicar a similaridade estrutural. Os anticorpos ou antissoros neutralizantes úteis são descritos, por exemplo, em Sui, et a1., 2009, Nat. 15 Struct. Moi. Biol. 16(3) :265-273, Ekiert et a1., February 26, 2009, Science [DOI: 10.1126/science.1171491], e Kashyap et al., 2008, Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 105(16):5986-5991, cujos conteúdos estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade. Em determinadas modalidades, 20 o anticorpo ou antissoro é um anticorpo ou antissoro que reage com um epítopo não-contíguo (isto é, não contíguo em sequência primária) que é formado pela estrutura terciária ou quaternária de uma hemaglutinina.
Em determinadas modalidades, a similaridade 25 estrutural deve ser avaliada por técnicas espectroscópicas como dicroísmo circular, espectroscopia Raman, NMR, 3D NMR e cristalografia de raios X. As estruturas de hemaglutinina de vírus influenza conhecidas determinadas por cristalografia de raios X são descritas em coordenadas 30 estruturais em arquivos do Banco de Dados de Proteínas que incluem, mas sem se limitarem a, 1HGJ (uma cepa HA H3N2) e 1RUZ (uma cepa HA H1N1).
Em determinadas modalidades, a similaridade estrutural é avaliada por desvio RMS entre as porções 5 sobrepostas correspondentes de duas estruturas. Para criar uma sobreposição significativa, em determinadas modalidades, as coordenadas de pelo menos 20 átomos correspondentes, 25 átomos correspondentes, 30 átomos correspondentes, 40 átomos correspondentes, 50 átomos correspondentes, 60 10 átomos correspondentes, 70 átomos correspondentes, 80 átomos correspondentes, 90 átomos correspondentes, 100 átomos correspondentes, 120 átomos correspondentes, 150 átomos correspondentes, 200 átomos correspondentes, ou 250 átomos correspondentes são usadas para calcular um desvio 15 RMS.
Em determinadas modalidades, as coordenadas de todos os átomos correspondentes em cadeias principais de aminoácido são usadas para calcular um desvio RMS. Em determinadas modalidades, as coordenadas de todos os átomos 20 de carbono alfa correspondentes nas cadeias principais de aminoácido são usados para calcular um desvio RMS. Em determinadas modalidades, as coordenadas de todos os resíduos idênticos correspondentes, inclusive cadeias laterais, são usados para calcular um desvio RMS. 25 Em determinadas modalidades, as coordenadas de todos ou uma porção dos átomos correspondentes em um segmento N-terminal HAl são usados para calcular um desvio RMS. Em determinadas modalidades, as coordenadas de todos ou uma porção dos átomos correspondentes em um segmento C- 30 terminal HAl são usados para calcular um desvio RMS. Em determinadas modalidades, as coordenadas de todos ou uma porção dos átomos correspondentes em um segmento N-terminal e um segmento C-terminal HA1 são usadas para calcular um desvio RMS. Em determinadas modalidades, as coordenadas de 5 todos ou uma porção dos átomos correspondentes em domínios HA2 são usados para calcular um desvio RMS.
Em determinadas modalidades, o desvio RMS entre as estruturas de um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza e as porções 10 correspondentes de um domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza A conhecido (por exemplo, de 1HGJ ou 1RUZ) é 5 A ou menos, 4 A ou menos, 3 Á ou menos, 2,5 Á ou menos, 2 A ou menos, 1,5 A ou menos, 1 A ou menos, 0,75 A ou menos, 0,5 Á ou menos, 0,3 A ou menos, 0,2 A ou menos, ou 0,1 A ou 15 menos. Um software comercialmente disponível ou de código aberto pode ser usado para realizar as sobreposições estruturais e/ou cálculos de desvio RMS. Exemplos úteis incluem, mas sem se limitarem a, Pymol (Delano Scientific LLC), InsightII e Quanta (ambos de Accelrys), MIDAS 20 (University of California, San Francisco), SwissPDB viewer (Swiss Institute of Bioinformatics), TOPOFIT (Northeastern University), CBSU LOOPP (Cornell University), e SuperPose (University of Alberta, Edmonton). Em determinadas modalidades, qualquer 25 polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza fornecido aqui pode compreender ainda um ou mais domínios de polipeptídeo considerados adequados para os elementos versados na técnica. Os domínios de polipeptídeo úteis incluem domínios que facilitam a purificação, 30 enovelamento e clivagem de porções de um polipeptídeo. Por exemplo, um tag de His (His-His-His-His-His-His, SEQ ID NO:166), epitopo FLAG ou outro tag de purificação pode facilitar a purificação de um polipeptídeo fornecido aqui.
Em algumas modalidades, o tag de His possui a sequência, 5 (His)n, em que n é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13,
14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais.
Um domínio foldon ou de trimerização de fibritina de bacteriófago T4 pode facilitar a trimerização de polipeptídeos fornecidos aqui.
Em algumas modalidades, o domínio de trimerização compreende uma 10 repetição de trimerização heptavalente GCN4pII tipo selvagem ou uma repetição de trimerização heptavalente GCN4pII modificada que permite a formação de bobinas enroladas triméricas ou tetraméricas.
Veja, por exemplo, Weldon et a1., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. © domínio foldon
15 pode ter qualquer sequência foldon conhecida pelos elementos versados na técnica (veja, por exemplo, Papanikolopoulou et al., 2004, J.
Biol.
Chem. 279(10):8991-
8998, cujos conteúdos estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.
Exemplos incluem 20 GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO:167). Um domínio foldon pode ser útil para facilitar a trimerização de polipeptídeos solúveis fornecidos aqui.
Os sítios de clivagem podem ser usados para facilitar a clivagem de uma porção de um polipeptídeo, por exemplo, a clivagem de um 25 tag de purificação ou domínio foldon ou ambos.
Os sítios de clivagem úteis incluem um sítio de clivagem de trombina, por exemplo, um com a sequência LVPRGSP (SEQ ID NO:168). Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem é um sítio de clivagem reconhecido por protease de Vírus Etch do Tabaco
(TEV) (por exemplo, a sequência de aminoácido Glu-Asn-Leu- Tyr-Phe-Gen-(Gly/Ser)).
Em determinadas modalidades, proporcionam-se polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de 5 vírus influenza que compreendem um sítio de clivagem de elastase. Os elementos versados na técnica irão reconhecer que o sítio de clivagem de tripsina na ligação entre HAl e HA2 pode ser modificado para um sítio de clivagem de elastase ao substituir valina pela arginine ou usina no sítio de clivagem HA1-HA2 em uma sequência de hemaglutinina (veja, por exemplo, Stech et a1., 2005, Nature Med. 11(6):683-689). Consequentemente, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que possuem uma substituição de valina na C-terminação do segmento de tronco C-terminal (isto é, a C- terminação do domínio HA1). Em particular modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem qualquer SEQ ID NOS:50-65 ou 158-159 em que o resíduo de aminoácido C-terminal, por exemplo, arginina ou lisina, de SEQ ID NOS:50-65 ou 158-159 é substituído por um resíduo de valina. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptideos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que são resistentes à clivagem de protease na junção entre HAl e HA2. Os elementos versados na técnica devem reconhecer que a sequência Arg-Gly que abrange HAl e HA2 é um sítio de reconhecimento de tripsina e é tipicamente clivada para a ativação de hemaglutinina. Visto que os polipeptídeos de domínio de tronco descritos aqui não precisam ser ativados, proporcionam-se aqui polipeptideos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que são resistentes à clivagem de protease.
Em determinadas modalidades, proporciona-se qualquer polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus 5 influenza descrito aqui em que o sítio de protease que abrange HA1 e HA2 é modificado para uma sequência que é resistente à clivagem de protease. Em determinadas modalidades, proporciona-se qualquer polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de virus influenza 10 descrito aqui em que o resíduo C-terminal do segmento de tronco C-terminal HAl é qualquer resíduo exceto Lys ou Arg.
Em determinadas modalidades, proporciona-se qualquer polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui em que o resíduo N-terminal do 15 domínio HA2 é prolina. Em determinadas modalidades, proporciona-se qualquer polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui em que o resíduo C-terminal do segmento de tronco C-terminal HA1 é Ala e o resíduo N-terminal do domínio HA2 também é Ala. 20 Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N- terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco C- 25 terminal HA1 em associação de ligação com um domínio de tronco HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N- terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua 30 vez covalentemente ligado a um segmento de tronco C-
terminal HAl, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um 5 peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco C-terminal HAl, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2. 10 Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N- terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco C- 15 terminal HA1 em associação de ligação com um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal
HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N- 20 terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco C- terminal HAl, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2. Em determinadas modalidades, 25 proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco 30 C-terminal HAl, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de 5 vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N- terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco C- terminal HAl em associação de ligação com um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado, em sequência, a um sítio de clivagem de protease, a domínio de trimerização, e um tag de purificação. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco C-terminal HAl, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado, em sequência, a um sítio de clivagem, um domínio de trimerização e um tag de purificação. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco C-terminal HA1, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado, em sequência, a um sítio de clivagem de protease, a domínio de trimerização e um tag de purificação. Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem de protease é um sítio de clivagem de trombina. Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem possui a sequência de aminoácido LVPRGSP (SEQ ID NO:168). Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem é um sítio de clivagem reconhecido por protease de Virus Etch do Tabaco (TEV) (por exemplo, sequência de 5 aminoácido Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)). Em determinadas modalidades, o domínio de trimerização é um domínio foldon. Em algumas modalidades, o domínio de trimerização compreende uma repetição de trimerização heptavalente GCN4pII tipo selvagem ou uma repetição de trimerização heptavalente GCN4pII modificada que permite a formação de bobinas enroladas triméricas ou tetraméricas. Veja, por exemplo, Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. Em algumas modalidades, o tag de purificação é um tag de His, que possui a sequência, (His)n, em que n é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N- terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco C- terminal HA1 em associação de ligação com um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é covalentemente ligado, em sequência, a um sítio de clivagem, a domínio de trimerização e um tag de purificação. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N- terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco C-
terminal HA1, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é covalentemente ligado, em sequência, a um sítio de clivagem, a domínio de 5 trimerização e um tag de purificação.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco C-terminal HA1, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é covalentemente ligado, em sequência, a um sítio de clivagem, um domínio de trimerzação e um tag de purificação.
Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem de protease é um sítio de clivagem de trombina.
Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem possui a sequência de aminoácido LVPRGSP (SEQ ID NO:168). Em determinadas modalidades, o sitio de clivagem é um sítio de clivagem reconhecido por protease de Vírus Etch do Tabaco (TEV) (por exemplo, sequência de aminoácido Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)). Em determinadas modalidades, o domínio de trimerização é um domínio foldon.
Em algumas modalidades, o domínio de trimerização compreende uma repetição de trimerização heptavalente GCN4pII tipo selvagem ou uma repetição de trimerização heptavalente GCN4pII modificada que permite a formação de bobinas enroladas triméricas ou tetraméricas.
Veja, por exemplo, Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. Em algumas modalidades, o tag de purificação é um tag de His, que possui a sequência, (His)n, em que n é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui 5 polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N- terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco C- terminal HA1 em associação de ligação com um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio de transmembrana HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco C-terminal HA1, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio de transmembrana HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco C-terminal HAl, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio de transmembrana HA2.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptïdeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N- terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua 5 vez covalentemente ligado a um segmento de tronco C- terminal HA1 em associação de ligação com um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio de transmembrana HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio citoplásmico HA2. Em determinadas modalidades,
proporcionam-se aqui polipeptideos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covaleritemente ligado a um segmento de tronco C-terminal HA1, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio de transmembrana HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio citoplásmico HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de virus influenza que consistem em um peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco C-terminal HA1, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio de transmembrana HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio citoplásmico HA2.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina devírus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: 5 (SEQ ID NO:34)-LL-(SEQ ID NO:50)-(SEQ ID NO:66),
(SEQ ID NO:35)-LL-(SEQ ID NO:51)-(SEQ ID NO:67), (SEQ ID NO:36)-LL-(SEQ ID NO:52)-(SEQ ID NO:68), (SEQ ID NO:37)-LL-(SEQ ID NO:53)-(SEQ ID NO:69), (SEQ ID NO:38)-LL-(SEQ ID NO:54)-(SEQ ID NO:70), 10 (SEQ ID ND:39)-LL-(SEQ ID NO:55)-(SEQ ID NO:71),
(SEQ ID NO:40)-LL-(SEQ ID NO:56)-(SEQ ID NO:72), (SEQ ID NO:41)-LL-(SEQ ID NO:57)-(SEQ ID NO:73), (SEQ ID NO:42)-LL-(SEQ ID NO:58)-(SEQ ID NO:74), (SEQ ID NO:43)-LL-(SEQ ID NO:59)-(SEQ ID NO:75), 15 (SEQ ID NO:44)-LL-(SEQ ID NO:60)-(SEQ ID NO:76),
(SEQ ID NO:45)-LL-(SEQ ID NO:61)-(SEQ ID NO:77), (SEQ ID NO:46)-LL-(SEQ ID NO:62)-(SEQ ID NO:78), (SEQ ID NO:47)-LL-(SEQ ID NO:63)-(SEQ ID NO:79), (SEQ ID NO:48)-LL-(SEQ ID NO:64)-(SEQ ID NO:80), 20 e
(SEQ ID NC:49)-LL-(SEQ ID NO.65)-(SEQ - ID NO: 81) , em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um ligante como descrito aqui.
Em particular, os segmentos C-terminal HAl 25 podem ser covalente ou não-covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n (em que n indica qualquer número de resíduos de Glicina desde que 30 haja flexibilidade no ligante de peptídeo; em determinadas modalidades, n é 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 resíduos de Glicina) , Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala- Ser.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui 5 um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: (SEQ ID NO:34)-LL--(SEQ ID NO:50)-(SEQ ID NO:82), (SEQ ID NO:35)-LL-(SEQ ID NC:51)-(SEQ ID NO:83), 10 (SEQ ID NO:36)-LL-(SEQ ID NO:52)-(SEQ ID NO:84), (SEQ ID NO:37)-LL-(SEQ ID NO:53)-(SEQ ID NO:85), (SEQ ID NO:38)-LL-(SEQ ID NO:54)-(SEQ ID NO:86), (SEQ ID NO:39)-LL-(SEQ ID NO:55)-(SEQ ID NO:87), (SEQ ID NO:40)-LL-(SEQ ID NO:56)-(SEQ ID NO:88), 15 (SEQ ID NO:41)-LL-(SEQ ID NO:57)-(SEQ ID NO:89), (SEQ ID NO:42)-LL-(SEQ ID NO:58)-(SEQ ID NO:90), (SEQ ID NO:43)-LL-(SEQ ID NO:59)-(SEQ ID NO:91), (SEQ ID NO:44)-LL-(SEQ ID NO:60)-(SEQ ID NO:92), (SEQ ID NO:45)-LL-(SEQ ID NO:61)-(SEQ ID NO:93), 20 (SEQ ID NO:46)-LL-(SEQ ID NO:62)-(SEQ ID N0:94), (SEQ ID NO:47)-LL-(SEQ ID NO:63)-(SEQ ID NO:95), (SEQ ID NO:48)-LL-(SEQ ID NO:64)-(SEQ TD NO:96), e (SEQ ID NO:49)-LL-(SEQ ID NO:65)-(SEQ ID NO:97), 25 em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um ligante como descrito aqui. Em particular, the segmentos C- terminal HM podem ser covalente ou não-covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é 30 selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly) n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala- Ser.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui 5 um polipeptideo de hemaglutinina de vírus influenza que possuí uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: (SEQ ID NO:34)-LL-(SEQ ID NO:50)-(SEQ ID NO:82)- (SEQ ID NO:98), (SEQ ID NO:35)-LL-(SEQ ID NO:51)-(SEQ ID NO:83)- (SEQ ID NO:99), (SEQ ID NO:36)-LL-(SEQ ID NO:52)-(SEQ ID NO:84)- (SEQ ID NO:100), (SEQ ID NO:37) -LL- (SEQ ID NO: 53) - (SEQ ID NO: 85) - (SEQ ID NO:101), (SEQ ID NO:38)-LL-(SEQ ID NO:54)-(SEQ ID NO:86)- (SEQ ID NO:102), (SEQ ID NO:39)-LL-(SEQ ID NO:55)-(SEQ ID NO:87)- (SEQ ID NO:103), (SEQ ID NO:40)-LL-(SEQ ID NO:56)-(SEQ ID NO:88)- (SEQ ID NO:104), (SEQ ID NO:41)-LL-(SEQ ID NO:57)-(SEQ ID NO:89)- (SEQ ID NO:105), (SEQ ID NO:42)-LL-(SEQ ID NO:58)-(SEQ ID NO:90)- (SEQ ID NO:106), (SEQ ID NO:43)-LL-(SEQ ID NO:59)-(SEQ ID NO:91)- (SEQ ID NO:107), (SEQ ID NO:44)-LL-(SEQ ID NO:60)-(SEQ ID NO:92)- (SEQ ID NO:108),
(SEQ ID NO: 45)- LL- (SEQ ID NO: 61) - (SEQ ID NO: 93) - (SEQ ID NO:109),
(SEQ ID NO:46)-LL-(SEQ ID NO:62)-(SEQ ID NO:94)- (SEQ ID NO:110),
5 (SEQ ID NO:47)-LL-(SEQ ID NO:63)-(SEQ ID NO:95)- (SEQ ID NO:111),
(SEQ ID NO:48)-LL-(SEQ ID NO:64)-(SEQ ID NO:96)- (SEQ ID NO:112), e
(SEQ ID NO:49)-LL-(SEQ ID NO:65)-(SEQ ID NO:97)- 10 (SEQ ID NO:113),
em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um ligante como descrito aqui.
Em particular, os segmentos C- terminal HA1 podem ser covalente ou não-covalentemente 15 ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n,
Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala- Ser. 20 Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em:
(SEQ ID NO:34)-LL-(SEQ ID NO:50)-(SEQ ID NO:82)- 25 (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:35)-LL-(SEQ ID NO:51)-(SEQ ID NO:83)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:36)-LL-(SEQ ID NO:52)-(SEQ ID NO:84)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:37)-LL-(SEQ ID NO:53)-(SEQ ID NO:85)-
(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:38)-LL-(SEQ ID NO:54)-(SEQ ID NO:86)-
(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
5 (SEQ ID NO:39)-LL-(SEQ ID NO:55)-(SEQ ID NO:87) - (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:40)-LL-(SEQ ID NO:56)-(SEQ ID NO:88)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:41)-LL-(SEQ ID NO:57)-(SEQ ID NO:89)- 10 (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:42) -LL- (SEQ ID NO: 58) - (SEQ ID NO: 90) -
(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:43)-LL-(SEQ ID NO:59)-(SEQ ID NO:91)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), 15 (SEQ ID NO:44)-LL-(SEQ ID NO:60)-(SEQ ID NO:92)-
(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
• (SEQ ID NO:45)-LL-(SEQ ID NO:61)-(SEQ ID NO:93)-
(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:46)-LL-(SEQ ID NO:62)-(SEQ ID NO:94)- 20 (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:47)-LL-(SEQ ID NO:63)-(SEQ ID NO:95)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:48)-LL-(SEQ ID NC:64)-(SEQ ID NO:96)-
(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), e 25 (SEQ ID NO:49)-LL-(SEQ ID NO:65)-(SEQ ID NO:97)-
(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um ligante como descrito aqui.
Em particular, os segmentos C- 30 terminal HAl podem ser covalente ou não-covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala- 5 Ser.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: 10 (SEQ ID NO:34)-LL-(SEQ ID NO:50)-(SEQ ID NO:82)- (SEQ ID NO:98)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO: 166) , (SEQ ID NO:35)-LL-(SEQ ID NO:51)-(SEQ ID NO:83)- (SEQ ID NO:99)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID 15 NO:166), (SEQ ID NO:36)-LL-(SEQ ID NO:52)-(SEQ ID NO:84)- (SEQ ID NO:100)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO: 166) , (SEQ ID NO:37)-LL-(SEQ ID NO:53)-(SEQ ID NO:85)- 20 (SEQ ID NO:101)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO: 166), (SEQ ID NO:38)-LL-(SEQ ID NO:54)-(SEQ ID NO:86)- (SEQ ID NO:102)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO: 166), 25 (SEQ ID NO:39)-LL-(SEQ ID NO:55)-(SEQ ID NO:87)- (SEQ ID NO:103)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO: 166), (SEQ ID NO:40) -LL- (SEQ ID NO:56) - (SEQ ID NO: 88) - (SEQ ID NO:104)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID 30 NO:166),
(SEQ ID NO:41)-LL-(SEQ ID NO:57)-(SEQ ID NO:89)- (SEQ ID NO:105)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO: 166),
(SEQ ID NO:42)-LL-(SEQ ID NO:58)-(SEQ ID NO:90)-
5 (SEQ ID NO:106)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO: 166),
(SEQ ID NO:43)-LL-(SEQ ID NO:59)-(SEQ ID NO:91)- (SEQ ID NO:107)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), 10 (SEQ ID NO:44)-LL-(SEQ ID NO:60)-(SEQ ID NO:92)-
(SEQ ID NO:108)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO: 166),
(SEQ ID NO:45)-LL-(SEQ ID NO:61)-(SEQ ID NO:93)- (SEQ ID NO:109)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID 15 NO:166),
(SEQ ID NO:46) -LL- (SEQ ID NO: 62) - (SEQ ID NO: 94) - (SEQ ID NO:110)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO: 166),
(SEQ ID NO:47)-LL-(SEQ ID NO:63)-(SEQ ID NO:95)- 20 (SEQ ID NO:111)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO: 166),
(SEQ ID NO:48)-LL-(SEQ ID NO:64)-(SEQ ID NO:96)-
(SEQ ID NO:112)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), e 25 (SEQ ID NO:49)-LL-(SEQ ID NO:65)-(SEQ ID NO:97)-
(SEQ ID NO:113)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO: 166),
em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um 30 ligante como descrito aqui.
Em particular, the segmentos C-
terminal HAl podem ser covalente ou não-covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, 5 Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala- Ser.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: (SEQ ID NO:177)-LL-(SEQ ID NC:226)-(SEQ ID NO:66), (SEQ ID NO:178)-LL-(SEQ ID NO:227)-(SEQ ID NO:66), (SEQ ID NO:179)-LL-(SEQ ID NO:228)-(SEQ ID NO:66), (SEQ ID NO:180)-LL-(SEQ ID NO:229)-(SEQ ID NO:67), 15 (SEQ ID NO:181)-LL-(SEQ ID NO:230)-(SEQ ID NO:67), (SEQ ID NO:182)-LL-(SEQ ID NO:231)-(SEQ ID NO:67), (SEQ ID NO:183)-LL-(SEQ ID NO:232)-(SEQ ID NO:68), (SEQ ID NO:184)-LL-(SEQ ID NO:233)-(SEQ ID NO:68), (SEQ ID NO:185)-LL-(SEQ ID NO:234)-(SEQ ID NO:68), 20 (SEQ ID NO:186)-LL-(SEQ ID NO:235)-(SEQ ID NO:69), (SEQ ID NO:187)-LL-(SEQ ID NO:236)-(SEQ ID NO:69), (SEQ ID NO:188)-LL-(SEQ ID NO:237)-(SEQ ID NO:69), (SEQ ID NO:189)-LL-(SEQ ID NO:238)-(SEQ ID NO:70), (SEQ ID NO:190)-LL-(SEQ ID NO:239)-(SEQ ID NO:70), 25 (SEQ ID NO:191)-LL-(SEQ ID NO:240)-(SEQ ID NO:70), (SEQ ID NO:192)-LL-(SEQ ID NO:241)-(SEQ ID NO:71), (SEQ ID NO:193)-LL-(SEQ ID NO:242)-(SEQ ID NO:71), (SEQ ID NO:194)-LL-(SEQ ID NO:243)-(SEQ ID NO:71), (SEQ ID NO:195)-LL-(SEQ ID NO:244)-(SEQ ID NO:72), 30 (SEQ ID NO:196)-LL-(SEQ ID NO:245)-(SEQ ID NO:72),
(SEQ ID NO:197)-LL-(SEQ ID NO:246)-(SEQ ID NO:72), (SEQ ID NO:198)-LL-(SEQ ID NO:247)-(SEQ ID NO:73), (SEQ ID NO:199)-LL-(SEQ ID NO:248)-(SEQ ID NO:73), (SEQ ID NO:200)-LL-(SEQ ID NO:249)-(SEQ ID NO:73), 5 (SEQ ID NO:201)-LL-(SEQ ID NO:250)-(SEQ ID NO:74), (SEQ ID NO:202)-LL-(SEQ ID NO:251)-(SEQ ID NO:74), (SEQ ID NO:203)-LL-(SEQ ID NO:252)-(SEQ ID NO:74), (SEQ ID NO:204)-LL-(SEQ ID NO:253)-(SEQ ID NO:75), (SEQ ID NO:205)-LL-(SEQ ID NO:254)-(SEQ ID NO:75), 10 (SEQ ID NO:206)-LL-(SEQ ID NO:255)-(SEQ ID NO:75),
(SEQ ID NO:207)-LL-(SEQ ID NO:256)-(SEQ ID NO:76), (SEQ ID NO:208)-LL-(SEQ ID NO:257)-(SEQ ID NO:76), (SEQ ID NO:209)-LL-(SEQ ID NO:258)-(SEQ ID NO:76), (SEQ ID NO:210)-LL-(SEQ ID NO:259)-(SEQ ID NO:77), 15 (SEQ ID NO:211)-LL-(SEQ ID NO:260)-(SEQ ID NO:77),
(SEQ ID NO:212)-LL-(SEQ ID NO:261)-(SEQ ID NO:77), (SEQ ID NO:213)-LL-(SEQ ID NO:262)-(SEQ ID NO:78),
(SEQ ID NQ:214)-LL-(SEQ ID NO:263)-(SEQ ID NO:78), (SEQ ID NO:215)-LL-(SEQ ID NO:264)-(SEQ ID NO:78), 20 (SEQ ID NO:216)-LL-(SEQ ID NO:265)-(SEQ ID NO:79),
(SEQ ID NO:217)-LL-(SEQ ID NO:266)-(SEQ ID NO:79), (SEQ ID NO:21B)-LL-(SEQ ID NO:267)-(SEQ ID NO:79), (SEQ ID NO:219)-LL-(SEQ ID NO:268)-(SEQ ID NO:80), (SEQ ID NO:220)-LL-(SEQ ID NO:269)-(SEQ ID NO:80), 25 (SEQ ID NO:221)-LL-(SEQ ID NO:270)-(SEQ ID NO:80),
(SEQ ID NO:222)-LL-(SEQ ID NO:271)-(SEQ ID NO:81), (SEQ ID NO:223)-LL-(SEQ ID NO:272)-(SEQ ID NO:81), (SEQ ID NO:224)-LL-(SEQ ID NO:273)-(SEQ ID NO:81), (SEQ ID NO:312)-LL-(SEQ ID NO:313)-(SEQ ID NO:66), 30 (SEQ ID NO:34)-LL-(SEQ ID NO:314)-(SEQ ID NO:66),
(SEQ ID NO:315)-LL-(SEQ ID NO:316)-(SEQ ID NO:66), (SEQ ID NO:308)-LL-(SEQ ID NO:52)-(SEQ ID NO:68), (SEQ ID NO:36)-LL-(SEQ ID NO:309)-(SEQ ID NO:68), e 5 (SEQ ID NO:310)-LL-(SEQ ID NO:311)-(SEQ ID NO:68), em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um ligante como descrito aqui.
Em particular, os segmentos C-
terminal HA1 podem ser covalente ou não-covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala- Ser.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em:
(SEQ ID NO:154)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:160),
(SEQ ID NO:155)-LL-(SEQ ID NO:159)-(SEQ ID NO:160), (SEQ ID NO:156)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:160), (SEQ ID NO:157)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:160),
(SEQ ID NO:550)-LL-(SEQ ID NO:553)-(SEQ ID NO:160),
(SEQ ID NO:551)-LL-(SEQ ID NO:554)-(SEQ ID NO:160), e
(SEQ ID NO:552)-LL-(SEQ ID NO:555)-(SEQ ID NO:160), em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um 5 ligante como descrito aqui. Em particular, os segmentos C- terminal HAl podem ser covalente ou não-covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala- Ser.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: (SEQ ID NO:154)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161), (SEQ ID NO:155)-LL-(SEQ ID NO:159)-(SEQ ID NO:161), (SEQ ID NO:156)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161), (SEQ ID NO:157)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161), (SEQ ID NO:550)-LL-(SEQ ID NO:553)-(SEQ ID NO:161), (SEQ ID NO:551)-LL-(SEQ ID NO:554)-(SEQ ID NO:161), (SEQ ID NO:552)-LL-(SEQ ID NO:555)-(SEQ ID NO:161), e
(SEQ ID NO:555)-LL-(SEQ ID NO:556)-LL-(SeQ ID NO:557)-(SEQ ID NO:161), em que caca sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um 5 ligante como descrito aqui. Em particular, os segmentos C- terminal HAl podem ser covalente ou não-covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, 10 Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala- Ser.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptïdeo de hemaglutinina de vírus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que 15 consiste em: (SEQ ID NO:154)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162), (SEQ ID NO:155)-LL-(SEQ ID NO:159)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162), 20 (SEQ ID NO:156)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162), (SEQ ID NO:157)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162), (SEQ ID NO:550)-LL-(SEQ ID NO:553)- )-(SEQ ID 25 NO:161)-(SEQ ID NO:162), (SEQ ID NO:551)-LL-(SEQ ID NO:554)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162), (SEQ ID NO:552)-LL-(SEQ ID NO:555)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID N0:162), e
(SEQ ID NO:555)-LL-(SEQ ID NO:556)-LL-(SeQ ID NO:557)- (SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162), em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um 5 ligante como descrito aqui. Em particular, os segmentos C- terminal HAI podem ser covalente ou não-covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Cly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala- Ser.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que 15 consiste em: (SEQ ID NO:154)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:155)-LL-(SEQ ID NO:159)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-SEQ ID NO:166), 20 (SEQ ID NO:156)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:157)-LL-(SEQ ID NO:159)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:550)-LL-(SEQ ID NO:553)- )-(SEQ ID 25 NO:161)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:551)-LL-(SEQ ID NO:554)-(SEQ ID NO:161)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:552)-LL-(SEQ ID NO:555)-(SEQ ID NO:161)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-SEQ ID NO:166), e
(SEQ ID NO:555)-LL-(SEQ ID NO:556)-LL-(SEQ ID NO:557)- )-(SEQ ID NO:161)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-SEQ ID NO:166), em que cada sequência acima está ligada à 5 sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um ligante como descrito aqui. Em particular, os segmentos C- terminal HA1 podem ser covalente ou não-covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação 10 direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala- Ser.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza que 15 possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: (SEQ ID N0:154)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)- SLQ I 2:166) 20 (SEQ ID NO:155)-LL-(SEQ ID NO:159)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)- (SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:156)-LL-(SEQ ID NO:158)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)- 25 (SEQ ID NO:166), e (SEQ ID NO:157)-LL-(SEQ ID NO:159)-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)- (SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:550)-LL-(SEQ ID NO:553)- )-(SEQ ID NO:161)-(SEQ ID NO:162)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)- (SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:551)-LL-(SEQ ID NO:554)-(SEQ ID 5 NO:161)- \(SEQ ID NO:162)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)- (SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:552)-LL-(SEQ ID NO:555)- )-(SEQ ID NO:161)- (SEQ ID NO:162)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID N©:167)- (SEQ ID NO:166), e 10 (SEQ ID NO:555)-LL-(SEQ ID NO:556)-LL-(SEQ ID NO:557)- (SEQ ID NO:161)- (SEQ ID NO:162)-(SEQ ID NO:168)- (SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um 15 ligante como descrito aqui. Em particular, os segmentos C- terminal HA1 podem ser covalente ou não-covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, 20 Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID N0:165) e Asn-Ala- Ser.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza descritos aqui não compreendem polipeptídeos que possuem a sequência de 25 aminoácido de Thr-Gly-Leu-Arg-Asn (SEQ ID NO:544) ou Gly- Ile-Thr-Asn-Lys-Val-Asn-Ser-Val-Ile-Glu-Lys (SEQ ID NO:545).
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza descritos aqui não compreendem polipeptídeos que possuem a sequência de 30 aminoácido de Thr-Gly-Leu-Arg-Asn (SEQ ID NO:544) e Gly-
Ile-Thr-Asn-Lys-Val-Asn-Ser-Val-Ile-Glu-Lys (SEQ ID NO:545).
Em- determinadas modalidades, os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza descritos aqui não compreendem polipeptídeos que possuem a sequência de 5 aminoácido de Thr-Giy-Met-Arg-Asn (SEQ ID NO:547) ou Gln- Ile-Asn-Gly-Lys-Leu-Asn-Arg--Leu-Ile-Glu-Lys (SEQ ID NO:548).
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza descritos aqui não compreendem polipeptídeos que possuem a sequência de aminoácido de Thr-Gly-Met-Arg-Asn (SEQ ID NO:547) e Gln- Ile-Asn-Gly-Lys-Leu-Asn-Arg-Leu-Ile-Glu-Lys (SEQ ID NO:548).
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza descritos aqui não compreendem polipeptideos que possuem a sequência de aminoácido de Thr-Gly-Met-Arg-Asn (SEQ ID NO:547) ou Gln- Ile-Asn-Gly-Lys-Leu-Asn-Arg-Val-Ile-Glu-Lys (SEQ ID NO:549).
Em determinadas modalidades, os polipeptïdeos de hemaglutinina de vírus influenza descritos aqui não compreendem polipeptídeos que possuem a sequência de aminoácido de Thr-Gly-Met-Arg-Asn (SEQ ID NO:547) e Gln- Ile-Asn-Gly-Lys-Leu-Asn-Arg-Val-Ile-Glu-Lys (SEQ ID NO:549).
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza descritos aqui não são reconhecidos pelo anticorpo CR6261, CR6325, CR6329, CR6307, CR6323, 2A, D7, D8, FIO, G17, H40, A66, D80, E88, E90, H98, C179 (produzido por hibridoma FERM BP-4517; clones vendidos por Takara Bio, Inc. (Otsu, Shiga, Japan)), A13C (FERM BP~ 4516), qualquer outro anticorpo descrito em Ekiert DC et a1. (2009) Antibody Recognition of a Highly Conserved Influenza Virus Epitope. Science (publicado em Science Express 26 de fevereiro de 2009); Kashyap eL a1. (2008), ou quaisquer outros anticorpos similares.
5.3.1 POLIPEPTÏDEOS DE DOMÌNIO DE TRONCO CURTO DE
HEMAGLUTININA DE INFLUENZA 5 Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza é um polipeptídeo de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza. A estrutura primária típica de um polipeptídeo de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza fornecido aqui compreende, na seguinte ordem: um segmento de tronco N-terminal HAI, um ligante, um segmento de tronco curto C-terminal HA1 e uma HA2. A sequência primária pode ser formada por um único polipeptídeo, ou essa pode ser formada por múltiplos polipeptídeos. Tipicamente, um único polipeptídeo é expresso por qualquer técnica considerada adequada por um elemento versado na técnica. Em modalidades de um único polipeptídeo, os segmentos HAl e a HA2 estão em associação terciária. Como conhecido por elementos versados na técnica, um único polipeptídeo HA pode ser clivado, por exemplo, por uma protease, sob condições de expressão apropriadas para produzir dois polipeptídeos em associação quaternária. A clivagem é tipicamente entre o segmento de tronco curto C- terminal HAl e a HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui múltiplos polipeptídeos. Em modalidades de múltiplos polipeptídeos, os segmentos HAl e HA2 estão em associação quaternária.
Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza fornecido aqui é monomérico. Em determinadas modalidades,
um polipeptídeo de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza fornecido aqui é multimérico. Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza fornecido 5 aqui é trimérico. Os elementos versados na técnica irão reconhecer que os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza nativos são capazes de trimerização in vivo e que alguns polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza fornecidos aqui são 10 capazes de trimerização. Em modalidades particulares descritas abaixo, os polipeptideos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza fornecidos aqui compreendem domínios de trimerização para facilitar a trimerização. 15 Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza compreende um peptídeo de sinal. Tipicamente, o peptídeo de sinal é clivado durante ou após a expressão e tradução de polipeptídeo para produzir um polipeptídeo de domínio de 20 tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza maduro. Q peptídeo de sinal pode ser vantajoso para a expressão dos polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza. Em determinadas modalidades, também proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco 25 curto de hemaglutinina de vírus influenza maduros que são desprovidos de um peptídeo de sinal.
A hemaglutinina HA2 de influenza compreende tipicamente um domínio de tronco, domínio de transmembrana e um domínio citoplásmico. Em determinadas modalidades, 30 proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem um domínio de tronco HA2, um domínio luminal HA2, um domínio de transmembrana HA2 e um domínio citoplásmico HA2.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui 5 polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem um domínio de tronco HA2, um domínio luminal HA2, e um domínio de transmembrana HA2, porém são desprovidos de algum ou todo o domínio citoplásmico típico. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem um domínio de tronco HA2 e um domínio luminal HA2, porém são desprovidos de um domínio de transmembrana HA2 e um domínio citoplásmico HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem um domínio de tronco HA2, porém são desprovidos de um domínio luminal HA2, um domínio de transmembrana HA2 e um domínio citoplásmico HA2. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza compreendem um domínio de tronco HA2 que possui pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% identidade de sequência de aminoácido a um domínio de tronco HA2 de influenza conhecido pelos elementos versados na técnica. Os domínios de tronco HA2 conhecidos exemplares de hemaglutininas de vírus influenza A e vírus influenza B são fornecidos nas tabelas acima.
Também, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas deletadas de domínios de tronco HA2 em que até 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduos de aminoácido são deletados de cada ou ambas as terminações do domínio de tronco HA2. Ademais, 5 proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas alteradas de domínios de tronco HA2 em que até 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduos de aminoácido são substituídos de maneira conservadora por outros aminoácidos. Ademais, proporcionam-se polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem domínios de tronco HA2 deletados e alterados. 15 0 segmento de tronco N-terminal HAl pode ser qualquer tronco N-terminal HA1 fornecido aqui. Os segmentos de tronco N-terminal HAl conhecidos exemplares são fornecidos nas tabelas abaixo.
O segmento de tronco curto C-terminal HAl pode ser qualquer segmento de tronco curto C-terminal HAl reconhecido por um elemento versado na técnica com base na definição fornecido aqui. Tipicamente, um segmento de tronco curto C-terminal HAl correspondo a um polipeptídeo que consiste no resíduo de cisteína localizado em sequência aproximadamente no 305 resíduo de uma HAl (utilizando a numeração H3) através do aminoácido C-terminal da HAl. Esse resíduo de cisteína, denominado Bq aqui, é capaz de se ligar a um resíduo de cisteina Ap no segmento de tronco N- terminal de HAI. As sequências de 17 hemaglutininas de influenza A representativas são apresentadas na Figura 1, e o resíduo Bq é identificado em cada uma.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco curto C-terminal HAl não começa em Bq (por exemplo, Cys305 5 de uma subunidade HA1 de uma hemaglutinina H3), porém em um resíduo em sequência e adjacências estruturais de Bq. Por exemplo, em determinadas modalidades, o segmento de tronco curto C-terminal HA1 começa em Bq _1, Bq_ , Bq _ 3i Bq_ 4 , Bq-5 , Bq_ 6i Bq-7, Bq, Bq-9, Bq-io, Bq-1i, Bq-12, Bq-13, Bq-14, Bq-15, Bq-20, Bq_25, Bq-30 , Bq-35 , Bq-40, Bq-45 , Bq-50, Bq-55, Bq-60, Bq-65r Bq-70r Bq-75 , OU B,.-80 . Em outras modalidades, o segmento de tronco curto C- terminal HA1 começa em Bq+1, Bq+2, Bq+3, Bq+4, Bq+5, Bq+6, B,,7 Bq+è, Bq+5, ou Bq+1o. C final de um segmento de tronco N- terminal HAl deve ser selecionado em conjunto com o início do segmento de tronco curto C-terminal HA1 e o ligante de modo que o domínio de tronco HA1 resultante seja capaz de formar uma estrutura tridimensional similar, como descrito abaixo, a uma hemaglutinina de vírus influenza.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza compreendem um segmento de tronco curto C-terminal HAl que possui pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% identidade de sequência de aminoácido a um segmento de tronco curto C-terminal HA1 de influenza conhecido pelos elementos versados na técnica. Os segmentos de tronco curtos C-terminal HAl conhecidos exemplares são fornecidos nas tabelas abaixo.
Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é Ap _1, e o início do segmento de tronco curto C-terminal é Bq_l. Em determinadas modalidades,
o final do segmento de tronco N-terminal é Ap_ 2 , e o início do segmento de tronco curto C-terminal é B.
Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N- terminal é A p_3i e o início do segmento de tronco curto C-
5 terminal é B.
Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é Ap_ 4 , e o início do segmento de tronco curto C-terminal é Bq_ 4 Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é AP_5 , e o início do segmento de tronco curto C-terminal é Bq_5 _ 10 Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é A,+i, e o início do segmento de tronco curto C-terminal é Bq+j . Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é Ap+2 , e o início do segmento de tronco curto C-terminal é Bq +2. Em 15 determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-
terminal é Ap+3, e o início do segmento de tronco curto C- terminal é Bq+3. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é A.+4i e o início do segmento de tronco curto C-terminal é Bq+9. Em determinadas
20 modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é Ap+5, e o início do segmento de tronco curto C-terminal
Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é Ap-1, e o início do segmento de tronco curto C-terminal é Bq+l.
Em determinadas modalidades,
25 o final do segmento de tronco N-terminal é AP_ 2 , e o início do segmento de tronco curto C-terminal é Bq +2. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N- terminal é Ap_3i e o início do segmento de tronco curto C- terminal é Bq+3. Em determinadas modalidades, o final do
30 segmento de tronco N-terminal é A p-1, e o início do segmento de tronco curto C-terminal é Bq+q.
Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é Ap _ 5i e o início do segmento de tronco curto C-terminal é Bq+ 5 _
Em determinadas modalidades, o final do segmento 5 de tronco N-terminal é A, (isto é, o final do segmento de tronco N-terminal é Cisteína), e o início do segmento de tronco C-terminal é Aq (isto é, o início do segmento de tronco C-terminal é Cisteína)_ Em determinadas modalidades,
o final do segmento de tronco N-terminal é Ap+l, e o início do segmento de tronco curto C-terminal é Bc _,. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N- terminal é AP +2 , e o início do segmento de tronco curto C- terminal é Bq _ Z.
Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é A,+3, e o inicio do segmento de tronco curto C-terminal é Bq _ 3. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N-terminal é Ap+4r e o início do segmento de tronco curto C-terminal é Bq_ 4. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco N- terminal é A,,5, e o início do segmento de tronco curto C- terminal é Bq _ 5
Também proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas deletadas de segmentos de tronco curtos C-terminal HA1 em que até 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7,
6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduo de aminoácido são deletados de cada ou ambas as terminações do segmento de tronco curto C- terminal HAl.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui os polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas expandidas de segmentos de tronco curtos C-terminal HAl em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos são adicionados à N-terminação dos segmentos de tronco curtos C-terminal HAl. Em particular modalidades, se ume resíduo 5 for adicionado ao segmento de tronco curto C-terminal, então um resíduo é adicionado ao segmento de tronco N- terminal; se dois resíduos forem adicionados ao segmento de tronco curto C-terminal, então dois resíduos são adicionados ao segmento de tronco N-terminal; se três resíduos forem adicionados ao segmento de tronco curto C- terminal, então três resíduos são adicionados ao segmento de tronco N-terminal. Ademais, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas alteradas de segmentos de tronco curtos C-terminal HAl em que até 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, Ì, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduo de aminoácido são substituídos de maneira conservadora por outros aminoácidos. Ademais, proporcionam-se polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem segmentos de tronco curtos C- terminal HA1 deletados e alterados.
Os polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza podem ser baseados (isto é, podem ter identidade de sequência, como descrito acima) em qualquer hemaglutinina de vírus influenza conhecida pelos elementos versados na técnica, descoberta mais tarde. Em determinadas modalidades, polipeptideos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do grupo que consiste em H1, H2, H3, 5 H4, H5, H6, H7, H$, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16,
e H17. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza B, como descrito em detalhes abaixo. 10 Os segmentos de tronco N-terminal HA1 podem ser baseados (isto é, podem ter identidade de sequência, como descrito acima) em quaisquer segmentos de tronco N-terminal HAl conhecidos pelos elementos versados na técnica, descobertos mais tarde.
Em dnrm; n~Ha segmentos de tronco N-terminal HAl são baseados em segmentos de tronco N-terminal HAl de influenza A.
Em determinadas modalidades, os segmentos de tronco N-terminal HA1 são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do grupo que consiste em Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H1Q, H11, H12, H13, H14, H15, H16,
e H17. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N- terminal HAl é selecionado a partir de SEQ ID NOS:34-49. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HAl é selecionado a partir de SEQ ID NOS:34-49, cada um tem um aminoácido deletado de sua C-terminação.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:34-49, cada um tem dois aminoácidos deletados de sua C-terminação.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HAl é selecionado a partir de SEQ ID NOS:34-49, cada um tem três aminoácidos deletados de sua C-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HAl é selecionado a partir de SEQ ID NOS:34-49, cada um tem quatro aminoácidos deletados de sua C-terminação. Em 5 determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HAl é selecionado a partir de SEQ ID NOS:34-49, cada um tem cinco aminoácidos deletados de sua C-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco N-terminal HAl é selecionado a partir de SEQ ID NOS:177-224. 10 Os segmentos de tronco curtos C-terminal HAl podem ser baseados (isto é, podem ter identidade de sequência, como descrito acima) em quaisquer segmentos de trãnco- curtos C-terminal HA1 conhecidos pelos elementos versados na técnica, descobertos mais tarde. Em 15 determinadas modalidades, os segmentos de tronco curtos C- terminal HAl são baseados em segmentos de tronco curtos C- • terminal HA1 de influenza A. Em determinadas modalidades, os segmentos de tronco curtos C-terminal HAl são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a 20 partir do grupo que consiste em Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e H17. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco curto C- terminal HAl é selecionado a partir de SEQ ID NOS:350-365.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco curto C- 25 terminal HAl é selecionado a partir de SEQ ID NOS:350-365, cada um tem um aminoácido deletado de sua N-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco curto C- terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS;350-365, que tem dois aminoácidos deletados de sua N-terminação. Em 30 determinadas modalidades, o segmento de tronco curto C-
terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:350-365, cada um tem três aminoácidos deletados de sua N-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco curto C- terminal HAI é selecionado a partir de SEQ ID NOS:350-365, 5 cada um tem quatro aminoácidos deletados de sua N- terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco curto C-terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS: 350-365, cada um tem cinco aminoácidos deletados de sua N-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco curto C-terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:366-413.
Os domínios de tronco HA2 podem ser baseados (isto é, podem ter identidade de sequência, como descrito acima) quaisquer domínios de tronco HA2 conhecidos pelos elementos versados na técnica, posteriormente descobertos ou descritos aqui. Em determinadas modalidades, os domínios de tronco HA2 são baseados em domínios de tronco HA2 de influenza A. Em determinadas modalidades, os domínios de tronco HA2 são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do grupo que consiste em Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e H17. Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA2 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:66-97.
Em modalidades que compreendem um peptídeo de sinal, o peptídeo de sinal pode ser baseado em qualquer peptídeo de sinal de influenza conhecido pelos elementos versados na técnica ou descrito aqui. Em determinadas modalidades, os peptïdeos de sinal são baseados em peptídeos de sinal de influenza A.
Em modalidades que compreendem um domínio luminal, o domínio luminal pode ser baseado em qualquer domínio luminal de influenza conhecido pelos elementos versados na técnica ou descrito aqui. 5 Em modalidades que compreendem um domínio de transmembrana, o domínio de transmembrana pode ser baseado em qualquer domínio de transmembrana de influenza conhecido pelos elementos versados na técnica ou descrito aqui.
Em modalidades que compreendem um domínio 10 citoplásmico, o domínio citoplásmico pode ser baseado em qualquer domínio citoplásmico de influenza conhecido pelos elementos versados na técnica ou descrito aqui.
Em determinadas modalidades, um ou mais sítios de glicosilação no domínio de tronco curto de hemaglutinina 15 são modificados (por exemplo, por adição, deleção ou substituição de aminoácido) de modo que a glicosilação nesses sítios não ocorra durante o processamento e maturação do polipeptídeo. Os elementos versados na técnica irão reconhecer que a HA de vírus influenza tipicamente 20 compreende um ou mais sítios de glicosilação (por exemplo Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido, ou, em determinadas modalidades, em que Xaa não é Pro). Em determinadas modalidades, um ou mais resíduos de aminoácido em uma sequência de glicosilação são substituídos de 25 maneira conservadora por um resíduo de aminoácido que interrompe o sítio de glicosilação. Em determinadas modalidades, um ou mais resíduos de aminoácido em um sítio de glicosilação são substituídos por qualquer resíduo de aminoácido que interrompe o sítio de glicosilação. Em 30 determinadas modalidades, um ou mais resíduos de asparagina em uma sequência de glicosilação são substituídos por alanina. Em uma modalidade particular, a asparagina na posição 38 de uma hemaglutinina H3 é alterada para uma alanina. Em determinadas modalidades, o domínio de tronco 5 curto de hemaglutinina compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados como discutido na Seção 5.4.1, infra.
A Tabela 6, abaixo, identifica os peptídeos de sinal, segmentos de tronco HAl terminal, segmentos de tronco curtos C-terminal HA1, e domínios HA2 de polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza A. Esses peptídeos de sinal, segmentos de tronco, e domínios são úteis nos polipeptídeos e métodos descritos aqui.
TABELA 6. Sequências de Peptideo de Domínio de 15 Tronco Curto de Hemntr1 i,ti ni na iic Subtipo HA Peptíde Segmento de Segmento de (Genbank o de Tronco N- Tronco Curto C-terminal DOnio HA2 No.) Sinal terminal HA1 HA1 Hl MKANLLV DTICIGYHANNST CPKYVRSAKLRMV GLFGAIAGFIEGGWTGM PR8-H1N1 LLCALAA DTVDTVLEKNVTV TGLRNNPSIQSR IDGWYGYHHQNEQGSGY
ADA THSVNLLEDSHNG AADQKSTQNAINGITNK (EF467821.1) KLC [SEQ ID VNTVIEKMNIQFTAVGK [SEQ ID NO:350] EFNKLEKRMENLNKKVD NO:18] [SEQ ID DGFLDIWTYNAELLVLL NO:34] ENERTLDFHDSNVKNLY
EKVKSQLKNNAKEIGNG CFEEYHKCDNECMESVR NGTYDYPKYSEESKLNR EKVDGVKLESMGIYQIL AIYSTVASSLVLLVSLG AISFWMCSNGSLQCRIC
I [SEQ ID NO:66] H2 MAIIYLI DQICIGYHSNNST CPKYVKSERLVLA GLFGAIAGFIEGGWQGM (L11136) LLFTAVR EKVDTILERNVTV TGLRNVPQIESR IDGWYGYHHSNDQGSGY
G THAQNILEKTHNG AADKESTQKAIDGITNR KLC [SEQ ID VNSVIEKMNTQFEAVGK [SEQ ID NO:351] EFSNLEKRLENLNKKME NO:19] [SEQ ID DGFLDVWTYNAELLVLM NO: 351 ENERTLDFHDSNVKNLY
Subtipo HA Peptide Segmento de Segmento de (Genbank o de Tronco Curto Tronco N- Domíni© HA2 No.) Sinal terminal HA1 C-termi nal HA1
DRVRMQLRDNAKELGNG CFEFYHKCDDECMNSVK NGTYDYPKYEEESKLNR NE IKGVKLSNMGVYQIL AIYATVAGSLSLAIMIA GISLWMCSNGSLQCRIC
I [SEQ ID NO:67J H3 MKTIIAL QDLPGNDNSTATL CPKYVKQNTLKLA GLFGAIAGFIENGWEGM HK68-H3N2 SYIFCLA CLGHHAVPNGTLV TGMRNVPEKQTR IDGWYGFRHQNSEGTGQ (EF409245) LG KTITDDQIEVTNA AADLKSTQAAIDQINGK PDB: 1HGJ TELVQSSSTGKIC [SEQ ID NO: LNRVIEKTNEKFI-IQIEK [SEQ ID 352] EFSEVEGRIQDLEKYVE NO:20] [SEQ ID DTKIDLWSYNAELLVAL NO:36] ENQHTIDLTDSEMNKLF
EKTRRQLRENAEDMGNG CFKIYHKCDNACIESIR NGTYDHDVYRDEALNNR FQIKGVELKSGYKDWIL WISFAISCFLLCVVLLG
FIMWACQRGNIRCNICI [SEQ ID NO:68] H4 MLSIVIL QNYTGNPVICMGH CPRYVKQGSLKLA GLFGAIAGFIENGWQGL (D90302) FLLIAEN HAVANGTMVKTLA TGMRNIPEKASR IDGWYGFRHQNAEGTGT
SS DDQVEVVTAQELV AADLKSTQAAIDQINGK ESQNLPELC [SEQ ID LNRLIEKTNDKYHQIEK [SEQ ID NO:353] EFEQVEGRIQDLENYVE NQ:21] [SEQ ID DTKIDLWSYNAELLVAL NO:37] ENQHTIDVTDSEMNKLF
ERVRRQLRENAEDKGNG CFEIFHKCDNNCIESIR NGTYDHDIYRDEAINNR FQIQGVKLTQGYKDIIL WISFSISCFLLVALLLA
FILWACQNGNIRCQICI [SEQ ID NO:69] H5 MERIVLL DQICIGYHANKST CPKYVKSDRLVLA GLFGAIAGFIEGGWQGM (X07826) LAIVSLV KQVDTIMEKNVTV TGLRNVPQRKKR VDGWYGYHHSNEQGSGY
KS THAQDILERTHNG AADKESTQKAIDGITNK KLC [SEQ ID VNSIIDKMNTRFEAVGK [SEQ ID NO:354] EFNNLERRVENLNKKME NO:22] [SEQ ID DGFLDVWTYNVELLVLM NO:38] ENERTLDFHDSNVNNLY
DKVRLQLKDNARELGNG CFEFYHKCDNECMESVR NGTYDYPQYSEEARLNR EEISGVKLESMGVYQIL
Subtipo HA Peptíde Segmento de $egmento de (Genbank o de Tronco N- Tronco Curto Domínio HA2 No.) Sinal terminal HA1 C-terminal iá3,1
SIYSTVASSLALAIMIA GLSFWMCSNGSLQCRIC
I [SEQ ID NO:70] H6 MIAIIVV DKICIGYHANNST CPKYVKSESLRLA GLFGAIAGFIEGGWTGM (D90303) AILATAG TQIDTILEKNVTV TGLRNVPQIETR IDGWYGYHHENSQGSGY RS THSVELLENQKEE AADRESTQKAVDGITNK RFC [SEQ ID VNSIIDKMNTQFEAVDH [SEQ ID NO:355] EFSNLERRIDNLNKRME NO:23] [SEQ ID DGFLDVWTYNAELLVLL NO:39] ENERTLDLHDANVKNLY
ERVKSQLRDNAMILGNG CFEFWHKCDDECMESVK NGTYDYPKYQDESKLNR QEIESVKLESLGVYQIL AIYSTVSSSLVLVGLII AVGLWMCSNGSMQCRIC
I [SEQ ID NO:71] H7 MNTQILV DKICLGHHAVSNG CPRYVKQESLLLA GLFGAIAGFIENGWEGL (M24457) FALVAVI TKVNTLTERGVEV TGMKNVPEPSKKR VDGWYGFRHQNAQGEGT ETNA VNATETVERTNIP KKR AADYKSTQSAIDQITGK
KIC LNRLIEKTNQQFELIDN [SEQ ID [SEQ ID EFTEVEKQIGNLINWTK NO:24] [SEQ ID NO:356] DSITEVWSYNAELIVAM NO:40] ENQHTIDLADSEMNRLY
ERVRKQLRENAEEDGTG CFEIFHKCDDDCMASIR NNTYDHSKYREEAMQNR IQIDPVKLSSGYKDVIL WFSFGASCFLLLAIAMG
LVFICVKNGNMRCTICI [SEQ ID NO:72] H8 MEKFIAI DRICIGYQSNNST CPKYVKKASLRLA GLFGAIAGFIEGGWSGM ( 1i D9030 ) FyTLTSTN TV NTT TL~ilTT~1FV Dl v+vlLiiy¿ivyt y VGLiRivTCJVEPR
FSV !DGS+YYGr - HHSNSEGTGM AY TQTMELVETEKHP AADQKSTQEAIDKITNK AYC [SEQ ID VNNIVDKMNREFEVVNH [SEQ ID NO:357] EFSEVEKRINMINDKID NO:25] [SEQ ID DQIEDLWAYNAELLVLL NO:41] ENQKTLDEHDSNVKNLF
DEVKRRLSANAIDAGNG CFDILHKCDNECMETIK NGTYDHKEYEEEAKLER SKINGVKLEENTTYKIL SIYSTVAASLCLAILIA GGLILGMQNGSCRCMFC I
Subtipo HA Peptide Segmento de Segmento de (Genbank o de Tronco N- Tronco Curto C-terminal domínio HA2 No.) Sinal terminal HAl HAl [SEQ ID NO:73] H9 METKAII DKICIGYQSTNST CPKYVGVKSLKLP GLFGAIAGFIEGGWPGL (D90305) AALLMVT ETVDTLTESNVPV VGLRNVPAVSSR VAGWYGFQHSNDQGVGM
AANA THTKEILHTEHNG AADKGSTQKAIDKITSK MLC [SEQ ID VNNIIDKMNKQYEVIDH [SEQ ID NO:358] EFNELEARLNMINNKID NO:26] [SEQ ID DQIQDIWAYNAELLVLL NO:42] ENQKTLDEHDANVNNLY
NKVKRALGSNAVEDGNG CFET,YHKCDDQCMETIR NGTYDRQKYQEESRLER QKIEGVKLESEGTYKIL TIYSTVASSLVLAMGFA AFLFWAMSNGSCRCNIC
I [SEQ ID NO:74] H10 MYKVVVI LDRICLGHHAVAN CPKYVNQRSLLLA GLFGAIAGFIENGWEGM (M21647) IALLGAV GTIVKTLTNEQEE TGMRNVPEVVQGR VDGWYGFRHQNAQGTGQ
KG VTNATETVESTNL AADYKSTQAAIDQITGK NKLC [SEQ ID LNRLIEKTNTEFESIES [SEQ ID NO:359] EFSETEHQIGNVINWTK NO:27] [SEQ ID DSITDIWTYNAELLVAM NO:43] ENQHTIDMADSEMLNLY
ERVRKQLRQNAEEDGKG CFEIYHTCDDSCMESIR NNTYDHSQYREEALLNR LNINPVKLSSGYKDIIL WFSFGESCFVLLAVVMG
LVFFCLKNGNMRCTICI [SEQ ID NO:75] }ill MEKTLLF DEICIGYLSNNST CPKYVNVKSLKLA GLFGAIAGFIEGGWPGL (D90306) AAIFLCV DKVDTIIENNVTV TGPRNVPAIASR INGWYGFQHRDEEGTGI KA TSSVELVETEHTG AADKESTQKAIDQITSK,' SFC [SEQ ID VNNIVDRMNTNFESVQH [SEQ ID NO:360] EFSEIEERINQLSKHVD NO:20] [SEQ ID DSVVD1wSYNAQLLVLL NO:44] ENEKTLDLHDSNVRNLH
EKVRRMLKDNAKDEGNG CFTFYHKCDNKCIERVR NGTYDHKEFEEESKINR QEIEGVKLDSSGNVYKI LSIYSCIASSLVLAALI MGFMFWACSNGSCRCTI
CI [SEQ ID NO:76] H12 MEKFIIL DKICIGYQTNNST CPKYIPSGSLKLA GLFGAIAGFIEGGWPGL (D90307) STVLAAS ETVNTLSEQNVPV IGLRNVPQVQDR VAGWYGFQHQNAEGTGI
Subtipo HA Peptíde Segmento de Segmento de (Genbank o de Tronco Curto Tronco N- Domínio HA2 No.) Sinal terminal HAl C_ter~n►inal HA1
FAY TQVEELVHRGIDP AADRDSTQRAIDNMQNK ILC [SEQ ID LNNVIDKMNKQFEVVNH [SEQ ID NO:361] EFSEVESRINMINSKID NO:291 [SEQ ID DQITDIWAYNAELLVLL NO:45] ENQKTLDEHDANVRNLH
DRVRRVLRENAIDTGDG CFEILHKCDNNCMDTIR NGTYNHKEYEEESKIER QKVNGVKLEENSTYKIL SIYSSVASSLVLLLMII GGFIFGCQNGNVRCTFC
I [SEQ ID NO:77] H13 MALNVIA DRICVGYLSTNSS CPKYIKSGQLKLA GLFGAIAGFIEGGWPGL (D90308) TLTLISV ERVDTLLENGVPV TGLRNVPAISNR INGWYGFQHQNEQGTGI
CVHA TSSIDLIETNHTG AADKESTQKAIDQITTK TYC [SEQ ID INNIIDKMNGNYDSIRG [SEQ ID NO:362] EFNQVEKRINMLADRID NO:30] [SEQ ID DAVTDIWSYNAKLLVLL NO:46] ENDKTLDMHDANVKNLH
EQVRRELKDNAIDEGNG CFELLHKCNDSCMETIR NGTYDHTEYAEESKLKR QEIDGIKLKSEDNVYKA LSIYSCIASSVVLVGLI LSFIMWACSSGNCRFNV
CI [SEQ ID NO:78] H14 MIALILV QITNGTTGNPIIC CPKYVKQGSLMLA GLFGAIAGFIENGWQGL (M35997) ALALSHT LGHHAVENGTSVK TGMRNIPGKQAK IDGWYGFRHQNAEGTGT
AYS TLTDNHVEVVSAK AADLKSTQAAIDQINGK ELVETNHTDELC [SEQ ID LNRLIEKTNEKYHQIEK [SEQ ID NO:363] EFEQVEGRIQDLEKYVE NO:31] [SEQ ID DTKIDLWSYNAELLVAL NO:47] ENQHTIDVTDSEMNKLF
ERVRRQLRENAEDQGNG CFEIFHQCDNNCIESIR NGTYDHNIYRDEAINNR IKINPVTLTMGYCDIIL WISFSMSCFVFVALILG
FVLWACQNGNIRCQICI [SEQ ID NO:79] H15 MNTQIIV DKICLGHHAVANG CPRYVKQSSLPLA GLFGAIAGFIENGWEGL (L43917) ILVLGLS TKVNTLTERGVEV LGMKNVPEKIRTR IDGWYGFRHQNAQGQGT
MVKS VNATETVEITGID AADYKSTQAAIDQITGK KVC [SEQ ID LNRLIEKTNKQFELIDN [SEQ ID NO:364] EFTEVEQQIGNVINWTR
Subtipo HA Peptide Segmento de Segmento de (Genbank o de Tronco N- Tronco Curto Domínio HA2 No.) Sinal terminal HA1 C-terminal RA1 NO:32] [SEQ ID DSLTEIWSYNAELLVAM NO:48] ENQHTIDLADSEMNKLY
ERVRRQLRENAEEDGTG CFEIFHRCDDQCMESIR NNTYNHTEYRQEALQNR IMINPVKLSSGYKDVIL WFSFGASCVMLLAIAMG
LIFMCVKNGNLRCTICI [SEQ ID NO:80] H16 MMIKVLY DKICIGYLSNNSS CPKYIKSGQLKLA GLFGAIAGFIEGGWPGL (EU293865) FLIIVLG DTVDTLTENGVPV TGLRNVPSIGER INGWYGFQHQNEQGTGI
RYSKA TSSVDLVETNHTG AADKASTQKAINEITTK TYC [SEQ ID INNIIEKMNGNYDSIRG [SEQ ID NO:365] EFNQVEKRINMLADRVD NO:331 [SEQ ID DAVTDIWSYNAKLLVLL NO:49] ENDRTLDLHDANVRNLH
DQVKRALKSNAIDEGDG CFNLLHKCNDSCMETIR NGTYNHEDYREESQLKR QE IEGIKLKTEDNVYKV LSIYSCIASSIVLVGLI LAFIMWACSNGSCRFNV
CI [SEQ ID NO:81] H17 MELIVLL DRICIGYQANQNN CPKYVKATSLMLA GLFGAIAGFIEGGWQGM (CY103876) ILLNPYT QTVNTLLEQNVPV TGLRNNPQMEGR IDGWYGYHHENQEGSGY
FVLG TGAQEILETNHNG AADKEATQKAVDAITNK KLC VNSIIDKMNSQFESNIK EFNRLELRIQHLSDRVD DALLDIWSYNTELLVLL ENERTLDEH DAN VKNLF EKVKAQLKDNAIDEGNG CFLLLHKCNNSCMDDIK NGTYKYMDYREESHIEK QKIDGVKLTDYSRYYIM TLYSTIASSVVLGSLII AAFLWGCQKGSIQCKIC
I A Tabela 6A, abaixo, identifica os segmentos de tronco N-terminal HAl e segmentos de tronco curtos C- terminal HA1 úteis nos polipeptídeos e métodos descritos aqui.
TABELA 6A.
Sequências de Peptídeo de Domínio de Tronco Curto de Hemaglutinina de Influenza A Exemplares Subtipo HA (Genbank $egmento de tronco N- terminal HAl Segmento de tronco C-terminal HA1 No . ) H1. DTICIGYHANNSTDTVDTVLEK PKYVRSAKLRMVTGLRNNPSIQSR PR8-H1N1 NVTVTHSVNLLEDSHNGKL (EF467821.1) [SEQ ID NO:366] No Cys [SEQ ID NO:177] H1 DTICIGYHANNSTDTVDTVLEK KYVRSAKLRMVTGLRNNPSIQSR PR8-H1N1 NVTVTHSVNLLEDSHNGKL (EF467821.1) [SEQ ID NO:367] No Cys Al [SEQ ID NO:178] H1 DTICIGYHANNSTDTVDTVLEK YVRSAKLRMVTGLRNNPSIQSR PRB-H1N1 NVTVTHSVNLLEDSHNGK (EF467821.1) [SEQ ID NO:368] No Cys A3 [SEQ ID NO:179]
H2 DQICIGYHSNNSTEKVDTILER PKYVKSERLVLATGLRNVPQIESR (L11136) NVTVTHAQNILEKTHNGKL No Cys [SEQ ID NO:369] [SEQ ID N0:180] H2 DQICIGYHSNNSTEKVDTILER KYVKSERLVLATGLRNVPQIESR (L11136) NVTVTHAQNILEKTHNGKL No Cys d1 [SEQ ID NO:370] [SEQ ID NO:181] H2 DQICIGYHSNNSTEKVDTILER YVKSERLVLATGLRNVPQIESR (L11136) NVTVTHAQNILEKTHNGK No Cys A3 [SEQ ID NO:371] [SEQ ID NO:182]
H3 QDLPGNDNSTATLCLGHHAVPN PKYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTR HK68-H3N2 GTLVKTITDDQIEVTNATELVQ (EF409245) SSSTGKI [SEQ ID NO:372] PDB: 1HGJ No Cys [SEQ ID NO:183] H3 QDLPGNDNSTATLCLGHHAVPN KYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTR HK68-H3N2 GTLVKTITDDQIEVTNATELVQ (EF409245) SSSTGKI [SEQ ID NO:3731 PDB: 1HGJ No Cys Al [SEQ ID NO:184] H3 QDLPGNDNSTATLCLGHHAVPN YVKQNTLKLATGMRNVPEKQTR HK68-H3N2 GTLVKTITDDQIEVTNATELVQ (EF409245) SSSTGK [SEQ ID NO:374] PDB: 1HGJ No Cys Q3 [SEQ ID NO:185]
H4 QNYTGNPVICMGHHAVANGTMV PRYVKQGSLKLATGMRNIPEKASR (D90302) KTLADDQVEVVTAQELVESQNL No Cys PEL [SEQ ID NO:3751
[SEQ ID NO:186]
Subtipo HA ~ btipank Segmento de tronco N- terminal HA1 Segmento de tronco C-terminal HA1 No.' H4 QNYTGNPVICMGHHAVANGTMV RYVKQGSLKLATGMRNIPEKASR (D90302) KTLADDQVEVVTAQELVESQNL No Cys Al PEL [SEQ ID NC:376]
[SEQ ID NO:187] H4 QNYTGNPVICMGHHAVANGTMV YVKQGSLKLATGMRNIPEKASR (D90302) KTLADDQVEVVTAQELVESQNL No Cys A3 PE [SEQ ID NO:3771
[SEQ ID NO:188]
H5 DQICIGYHANKSTKQVDTIMEK PKYVKSDRLVLATGLRNVPQRKKR (X07826) NVTVTHAQDILERTHNGKL No Cys [SEQ ID NO:3781 [SEQ ID NO:189] H5 DQICIGYHANKSTKQVDTIMEK KYVKSDRLVLATGLRNVPQRKKR (X07826) NVTVTHAQDILERTHNGKL No Cys Al [SEQ ID NO:379] [SEQ ID NO:190] H5 DQICIGYHANKSTKQVDTIMEK YVKSDRLVLATGLRNVPQRKKR (X07826) NVTVTHAQDILERTHNGK No Cys A3 [SEQ ID NO:380] [SEQ ID NO:191]
H6 DKICIGYHANNSTTQIDTILEK PKYVKSESLRLATGLRNVPQIETR (D90303) NVTVTHSVELLENQKEERF No Cys [SEQ ID N0:381] [SEQ ID NO:192] H6 DKICIGYHANNSTTQIDTILEK KYVKSESLRLATGLRNVPQIETR (D90303) NVTVTHSVELLENQKEERF No Cys Al [SEQ ID N0:382] [SEQ ID N0:193] 56 DKICIGYHANNSTTQIDTILEK YVKSESLRLATGLRNVPQIETR {D90303) NVTVTHSVELLENQKEER No Cys A3 [SEQ ID N0:383] [SEQ ID N0:194]
H7 DKICLGHHAVSNGTKVNTLTER PRYVKQESLLLATGMKNVPEPSKKRKKR (M24457) GVEVVNATETVERTNIPKI No Cys [SEQ ID N0:384] [SEQ ID N0:195] H7 DKICLGHHAVSNGTKVNTLTER RYVKQESLLLATGMKNVPEPSKKRKKR (5244.57) GVEVVNATETVERTNIPKI No Cys Al [SEQ ID N0:385] [SEQ ID N0:196] H7 DKICLGHHAVSNGTKVNTLTER YVKQESLLLATGMKNVPEPSKKRKKR (M24457) GVEVVNATETVERTNIPK No Cys A3 [SEQ ID N0:386] [SEQ ID N0:197]
Subtipo HA (Genbank Segmento de tronco N- terminal HA1 Segmento de tronco C-terminal HA1 No.) H8 DRICIGYQSNNSTDTVNTLIEQ PKYVKKASLRLAVGLRNTPSVEPR (D90304) NVPVTQTMELVETEKHPAY No Cys [SEQ ID NO:387] [SEQ ID NO:198] H8 DRICIGYQSNNSTDTVNTLIEQ KYVKKASLRLAVGLRNTPSVEPR (D90304) NVPVTQTMELVETEKHPAY No Cys Al [SEQ ID NO:388] [SEQ ID NO:199] H8 DRICIGYQSNNSTDTVNTLIEQ YVKKASLRLAVGLRNTPSVEPR (D90304) NVPVTQTMELVETEKHPA No Cys A3 [SEQ ID N0:389] [SEQ ID NO:200]
H9 DKICTGYQSTNSTETVDTLTES PKYVGVKSLKLPVGLRNVPAVSSR (D90305) NVPVTHTKELLHTEHNGML No Cys [SEQ ID NO:390] (SEQ ID NO:201) H9 DKICIGYQSTNS'TETVDTLTES KYVGVKSLKLPVGLRNVPAVSSR (D90305) NVPVTHTKELLHTEHNGML No Cys Al [SEQ ID N0:391] [SEQ ID N0:202] H9 DKICIGYQSTNSTETVDTLTES YVGVKSLKLPVGLRNVPAVSSR (D90305) NVPVTHTKELLHTEHNGM No Cys A3 [SEQ ID NO:392] [SEQ ID N0:2031
H10 LDRICLGHHAVANGTTVKTLTN PKYVNQRSLLLATGMRNVPEVVQGR (M21647) EQEEVTNATETVESTNLNKL No Cys [SEQ ID N0:393] [SEQ ID NO:204] HiO LDRICLGHHAVANGTIVKTLTN KYVNQRSLLLATGMRNVPEVVQGR (M21647) EQEEVTNATETVESTNLNKL No Cys Al [SEQ ID N0:394] [SEQ ID N0:205] HiO LDRICLGHHAVANGTIVKTLTN YVNQRSLLLATGMRNVPEVVQGR (M21647) EQEEVTNATETVESTNLNK No Cys 83 [SEQ ID N0:395] [SEQ ID NO:206]
H11 DEICIGYLSNNSTDKVDTIIEN PKYVNVKSLKLATGPRNVPAIASR (D90306) NVTVTSSVELVETEHTGSF No Cys (SEQ ID NO:396) [SEQ ID NO:207] H11 DEICIGYLSNNSTDKVDTIIEN KYVNVKSLKLATGPRNVPAIASR (D90306) NVTVTSSVELVETEHTGSF No Cys Al [SEQ ID NO:397] [SEQ ID N0:20B] H11 DEICIGYLSNNSTDKVDTIIEN YVNVKSLKLATGPRNVPAIASR (D90306) NVTVTSSVELVETEHTGS No Cys A3 [SEQ ID NO:398]
24 8 / 6 48
5ubtipo HA Segmento de tronco N- (Genbank Segmento de tronco C-terminal HA]. No.) terminal HA1
[SEQ ID N0:209]
H12 DKICIGYQTNNSTETVNTLSEQ PKYIPSGSLKLAIGLRNVPQVQDR (D90307) NVPVTQVEELVHRGIDPIL No Cys [SEQ ID NO:399] [SEQ ID NO:210] H12 DKICIGYQTNNSTETVNTLSEQ KYIPSGSLKLAIGLRNVPQVQDR (D90307) NVPVTQVEELVHRGIDPIL No Cys Al [SEQ ID N0:400] [SEQ ID NO:211] H12 DKICIGYQTNNSTETVNTLSEQ YIPSGSLKLAIGLRNVPQVQDR (D90307) NVPVTQVFELVHRGIDPI No Cys 63 [SEQ ID NO:401] [SEQ ID NO:212]
H13 DRICVGYLSTNSSERVDTLLEN PKYIKSGQLKLATGLRNVPAISNR (D90308) GVPVTSSIDLIETNHTCTY No Cys [SEQ ID NO:402] [SEQ ID NO:213] H13 DRICVGYLSTNSSERVDTLLEN KYIKSGQLKLATGLRNVPAISNR (D90308) GVPVTSSIDLIETNHTGTY No Cys S1 [SEQ ID NO:403] [SEQ ID NO:214] H13 DRICVGYLSTNSSERVDTLLEN YIKSGQLKLATGLRNVPAISNR (D90308) GVPVTSSIDLIETNHTGT No Cys ó3 [SEQ ID N0:404] [SEQ TD NO:215]
H14 QITNGTTGNPIICLGHHAVENG PKYVKQGSLMLATGMRNIPGKQAK [M35997) TSVKTLTDNHVEVVSAKELVET No Cys NHTDEL [SEQ ID NO:405J
[SEQ ID N0:216] H14 QITNGTTGNPIICLGHHAVENG KYVKQGSLMLATGMRNIPGKQAK (M35997) TSVKTLTDNHVEVVSAKELVET No Cys a1 NHTDEL [SEQ ID NO:406]
[SEQ ID NO:217] H14 QITNGTTGNPIICLGHHAVENG YVKQGSLMLATGMRNIPGKQAK (M35997) TSVKTLTDNHVEVVSAKELVET No Cys 63 NHTDE [SEQ ID NO:407]
[SEQ ID N0:218]
H15 DKICLGHHAVANGTKVNTLTER PRYVKQSSLPLALGMKNVPEKIRTR (L43917) GVEVVNATETVEITGIDKV No Cys [SEQ ID NO:408] [SEQ ID NO:219] H15 DKICLGHHAVANGTKVNTLTER RYVKQSSLPLALGMKNVPEKIRTR (L43917) GVEVVNATETVEITGIDKV
Subtipo HA ~~e a~ Segmento de tronco N- k Segmento de tronco C-terminal HA1 No.) terminal i~A1 No Cys Si [SEQ ID N0:409] [SEQ ID NO:220] H15 DKICLGHHAVANGTKVNTLTER YVKQSSLPLALGMKNVPEKIRTR (L43917) GVEVVNATETVEITGIDK No Cys 43 [SEQ ID N0:410] [SEQ ID NQ:221] H16 DKICIGYLSNNSSDTVDTLTEN PKYIKSGQLKLATGLRNVPSIGER (EU293865) GVPVTSSVDLVETNHTGTY No Cys [SEQ ID N0:411] [SEQ ID NO:2221 H16 DKICIGYLSNNSSDTVDTLTEN KYIKSGQLKLATGLRNVPSIGER (EU293865) GVPVTSSVDLVETNHTGTY No Cys 51 [SEQ ID N0:412] [SEQ ID NO:223[ H16 DKICIGYLSNNSSDTVDTLTEN YIKSGQLKLATGLRNVPSIGER (EU293865) GVPVTSSVDLVETNHTGT No Cys 53 [SEQ ID NO:4131 [SEQ ID N0:224] H17 DRICIGYQANQNNQTVNTLLEQ PKYVKATSLNLATGLRNNPQMEGR (CY103876) NVPVTGAQEILETNHNGKL No Cys Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza compreendem um ou mais epítopos imunogênicos na estrutura terciária ou quaternária de uma polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza.
Em determinadas modalidades, the segmento de tronco N-terminal HA1 compreende the sequência de aminoácido A17-Al8 - (Xaa) a -A38 (SEQ ID NO:146) , em que A17 é Y ou H; 10 A18 é H, L, ou Q; (Xaa)n representa uma sequência de 18-20 resíduos de aminoácido; e A38 é H, S, Q, T ou N.
Em determinadas modalidades, o domínio HA2 compreende a sequência de aminoácido Ale-Alg-A20 -A21 (SEQ ID NO:148), em que Ala é V ou I; 5 A19 é D, N ou A; At a é G, e A21 é W.
Em determinadas modalidades, o domínio HA2 compreende a sequência de aminoácido A38 -A39-A40-A41-A42--A 43 - 10 A44-A45 -A96-A47-A4 8 -A 49-AS ©- A51-A52 -A53-A5 4 - A55-A56 (SEQ ID NO: 14 9) , em que A38 é K, Q, R, L ou Y; A39 é qualquer resíduo de aminoácido; A40 é qualquer resíduo de aminoácido; 15 A41 é T; A42 é Q; X43 é qualquer resíduo de aminoácido; A44 é A, A45 é I; 20 A46 é D; A47 é qualquer resíduo de aminoácido; A43 é I, V ou M; A49 é T, Q ou N; A50 é qualquer resíduo de aminoácido; 25 A51 é K; A52 é V ou L; A53 é N; A54 é qualquer resíduo de aminoácido; A55 é V, I ou L; e 30 A56 é V ou I.
Como ilustrado nas Figuras 1 e 2, os segmentos de tronco N-terminal HA1 compartilham a identidade de sequência entre influenza A e influenza B e adicionalmente através de subtipos de influenza A. Similarmente, os 5 segmentos de tronco curtos C-terminal HAl também compartilham identidade de sequência entre influenza A e influenza B e adicionalmente através de subtipos de influenza A. Ademais, os domínios HA2 também compartilham identidade de sequência entre influenza A e influenza B e 10 adicionalmente através de subtipos de influenza A.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza é um polipeptïdeo híbrido que compreende ou consiste essencialmente em segmentos e/ou domínios de uma 15 pldralidade de cepas ou subtipos de influenza. Por exemplo, um polipeptídeo de domínio de tronco curto de hemaglutinina • de vírus influenza pode compreender segmentos de tronco curtos N-terminal HAl e C-terminal HA1 de subtipos de HA de vírus influenza A diferentes. Em algumas modalidades, o 20 segmento de tronco N-terminal HAl pertence ao vírus influenza B enquanto o segmento de tronco curto C-terminal HA1 pertence ao vírus influenza A. Similarmente, HA2 e o segmento de tronco curto C-terminal HA1 também podem pertencer ao vírus influenza A enquanto o N-terminal HA1 25 pertence ao vírus influenza B.
Será entendido que qualquer combinação dos elementos de sequência listados nas Tabelas 2, 4, 5 e as sequências listadas sob as colunas "Peptídeo de sinal", "segmento de tronco N-terminal HA1," e "Domínio HA2" da 30 Tabela 3 ou as variantes dessas podem ser usadas para formar. os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina HA da present invenção.
Em um polipeptídeo de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza fornecido aqui, um ligante 5 covalentemente conecta o segmento de tronco N-terminal HAl ao segmento de tronco curto C-terminal HAl. O ligante pode ser qualquer ligante considerado adequado por um elemento versado na técnica inclusive, mas sem se limitar a, aqueles ligantes descritos aqui. Em determinadas modalidades, o ligante é uma cabeça globular, ou um fragmento dessa, de um heterólogo de vírus influenza ao domínio de tronco de influenza.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza são capazes de formar um estrutura tridimensional que é similar à estrutura tridimensional do domínio de tronco de uma hemaglutinina de vírus influenza nativa. A similaridade estrutural pode ser avaliada com base em qualquer técnica considerada adequada pelos elementos versados na técnica inclusive, mas sem se limitar, aquelas técnicas descritas aqui.
Em determinadas modalidades, qualquer polipeptídeo de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza fornecido aqui pode compreender ainda um ou mais domínios polipeptídeo de polipeptídeo considerados adequados para os elementos versados na técnica. Os domínios de polipeptídeo úteis incluem domínios que facilitam a purificação, enovelamento e clivagem de porções de um polipeptídeo. Por exemplo, um tag de His (His-His- His-His-His-His, SEQ ID NO:166), epítopo FLAG ou outro tag de purificação pode facilitar a purificação de um polipeptídeo fornecido aqui. Em algumas modalidades, o tag de purificação é um tag de His, que possui a sequência, (His)n, em que n é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 5 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais.
Qualquer domínio de trimerização, inclusive um foldon de fibritina de bacteriófago T4 pode facilitar a trimerização de polipeptídeos fornecidos aqui. Em algumas modalidades, o domínio de trimerização compreende uma 10 repetição de trimerização heptavalente GCN4pII tipo selvagem ou uma repetição de trimerização heptavalente GCN4pII modificada que permite a formação de bobinas enroladas triméricas ou tetraméricas. Veja, por exemplo, Weldon et ai., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. 0 domínio foldon 15 pode ter qualquer sequência foldon conhecida pelos • elementos versados na técnica (veja, por exemplo, • Papanikolopoulou et a1., 2004, J. Biol. Chem. 279(10):8991- 8998, cujos conteúdos estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade. Exemplos incluem 20 GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO:167). Um domínio foldon pode ser útil para facilitar a trimerização de polipeptídeos solúveis fornecidos aqui. Os sítios de clivagem podem ser usados para facilitar a clivagem de uma porção de um polipeptídeo, por exemplo, a clivagem de um 25 tag de purificação ou domínio foldon ou ambos. Os sítios de clivagem úteis incluem um sítio de clivagem de trombina, por exemplo, um com a sequência LVPRGSP (SEQ ID NO:168). Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem é urn sítio de clivagem reconhecido por protease de Vírus Etch do Tabaco
(TEV) (por exemplo, a sequência de aminoácido Glu-Asn-Leu- Tyr-)he-Gln-(ula/Ser)).
Em determinadas modalidades, proporcionam-se polipeptideos de domínio de tronco curto de hemaglutinina 5 de vírus influenza que compreendem um sítio de clivagem de elastase como descrito aqui. Em particular modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem qualquer SEQ ID NOS:350-365 em que o resíduo de aminoácido 10 C-terminal, por exemplo, arginina ou usina, de SEQ ID NOS:350-365 é substituído por um resíduo de valina.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que são resistentes à clivagem de 15 protease na junção entre HAl e HA2. Em determinadas modalidades, proporciona-se qualquer polipeptídeo de • domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui em que o sitio de protease que abrange HAl e HA2 é modificado para uma sequência que é resistente à 20 clivagem de protease. Em determinadas modalidades, proporciona-se qualquer polipeptideo de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui em que o resíduo C-terminal do segmento de tronco curto C- terminal HAl é qualquer resíduo exceto Lys ou Arg. Em 25 determinadas modalidades, proporciona-se qualquer polipeptídeo de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui em que o resíduo N-terminal do domínio HA2 é prolina. Em determinadas modalidades, proporciona-se qualquer polipeptídeo de domínio de tronco 30 curto de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui em que o resíduo C-terminal do segmento de tronco curto C- terminal HA1 é Ala e o resíduo N-terminal do domínio HA2 também é Ala.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui 5 polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco curto C- terminal HAl em associação de ligação com um domínio de tronco HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco curto C-terminal HAl, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco curto C-terminal HAl, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a urn segmento de tronco curto C- terminal HA1 em associação de ligação com um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal
HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua 5 vez- covaléhtemente ligado a um segmento de tronco curto C-
terminal HA1, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco 10 curto de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco curto C-terminal HAI, por sua vez covalentemente ligado a 15 um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2. • Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco 20 N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco curto C- terminal HA1 em associação de ligação com um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado, em sequência, a um sítio de clivagem, um domínio de trimerização e um tag de
25 purificação.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento 30 de tronco curto C-terminal HA1, por sua vez covalentemente
257 / 6 48 ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado, em sequência, a um sítio de clivagem, um domínio de tr±itterização e um tag de purificação.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptdeos de domínio
5 de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco N-terminal HAI covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco curto C-terminal HAl, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado, em sequência, a um sítio de clivagem, um domínio de trimerização e um tag de purificação.
Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem de protease é um sítio de clivagem de trombina.
Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem possui a sequência de aminoácido LVPRGSP (SEQ ID NO:168). Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem é um sítio de clivagem reconhecido por protease de Vírus Etch do Tabaco (TEV) (por exemplo, sequência de aminoácido Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-
(Gly/Ser)). Em determinadas modalidades, o domínio de trimerização é um domínio foldon.
Em algumas modalidades, o domínio de trimerização compreende uma repetição de trimerização heptavalente GCN4pII tipo selvagem ou uma repetição de trimerização heptavalente GCN4pII modificada que permite a formação de bobinas enroladas triméricas ou tetraméricas.
Veja, por exemplo, Weldon et a1., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. Em algumas modalidades, o tag de purificação é um tag de His, que possui a sequência, (His)n, em que n é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 30 16, 17, 18, 19, 20 ou mais.
-Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua 5 vez covalentemente ligado a um segmento de tronco curto C-
terminal HAl em associação de ligação com um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é covalentemente ligado, em sequência, a um sítio de clivagem, um domínio de trimerização e um tag de 10 purificação.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento 15 de tronco curto C-terminal HAl, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente • ligado a um domínio luminal HA2 que é covalentemente ligado,
em sequência, a um sítio de clivagem, um domínio de trimerização e um tag de purificação.
Em determinadas 20 modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um 25 segmento de tronco curto C-terminal HAl, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é covalentemente ligado, em sequência, a um sítio de clivagem, um domínio de trimerização e um tag de purificação.
Em
30 determinadas modalidades, o sítio de clivagem de protease é um sítio de clivagem de trombina. Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem possuí a sequência de aminoácido LVPRGSP (SEQ ID NO:168). Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem é um sítio de clivagem 5 reconhecido por protease de Vírus Etch do Tabaco (TEV) (por exemplo, sequência de aminoácido Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln- (Gly/Ser)). Em determinadas modalidades, o domínio de trimerização é um domínio foldon. Em algumas modalidades, o domínio de trimerização compreende uma repetição de trimerização heptavalente GCN4pII tipo selvagem ou uma repetição de trimerização heptavalente GCN4pII modificada que permite a formação de bobinas enroladas triméricas ou tetraméricas. Veja, por exemplo, Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. Em algumas modalidades, o tag de purificação é um tag de His, que possui a sequência, (His)n, e, que n é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco curto C- terminal HA1 em associação de ligação com um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio de transmembrana HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco curto C-terminal HA1, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio de transmembrana 5 HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez 10 covalentemente ligado a um segmento de tronco curto C-
terminal HA1, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio de transmembrana HA2. 15 Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptideos de domínio de tronco curto de hemaglutinina • de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco curto C- 20 terminal HAl em associação de ligação com um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio de transmembrana HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio citoplásmico HA2. Em determinadas modalidades, 25 proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que consiste em um segmento de tronco N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco curto C-terminal HA1, por sua vez 30 covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio de transmembrana HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio citoplásmico HA2. Em determinadas modalidades,
5 proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante,
por sua vez covalentemente ligado um segmento de tronco 10 curto C-terminal HA1, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio de transmembrana HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio citoplásmico HA2. 15 Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de tronco curto de hemaglutinina de vírus • influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em:
(SEQ ID NO:34)-LL-(SEQ ID NO:350)-(SEQ ID NO:66), 20 (SEQ ID NO:35)-LL-(SEQ ID NC:351)-(SEQ ID NO:67), (SEQ ID NO:36)-LL-(SEQ ID NO:352)-(SEQ ID NO:68), (SEQ ID NO:37)-LL-(SEQ ID NO:353)-(SEQ ID NO:69), (SEQ TD NO:38)-LL-(SEQ ID NO:354)-(SEQ ID NO:70), (SEQ ID NO:39)-LL-(SEQ ID NO:355)-(SEQ ID NO:71), 25 (SEQ ID NO:40)-LL-(SEQ ID NO:356)-(SEQ ID NO:72),
(SEQ ID NO:41)-LL-(SEQ ID NO:357)-(SEQ ID NO:73), (SEQ ID NO:42)-LL-(SEQ ID NO:358)-(SEQ ID NO:74), (SEQ ID NO:43)-LL-(SEQ ID NO:359)-(SEQ ID NO:75), (SEQ ID NO:44)-LL-(SEQ ID NO:360)-(SEQ ID NO:76), 30 (SEQ ID NO:45)-LL-(SEQ ID NO:361)-(SEQ ID N0:77),
(SEQ ID NO:46)-LL-(SEQ ID NO:362)-(SEQ ID NO:78), (SEQ ID NO:47)-LL-(SEQ ID NO:363)-(SEQ ID NO:79), (SEQ ID NO:48)-LL-(SEQ ID NO:364)-(SEQ ID NO:80), e 5 (SEQ ID NO:49)-LL-(SEQ ID NO:365)-(SEQ ID NO:81), em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um ligante como descrito aqui. Em particular, os segmentos C- terminal HAl podem ser covalente ou não-covalentemente 10 ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n (em que n é qualquer número de resíduos de Glicina desde que haja flexibilidade no ligante de peptídeo; em 15 determinadas modalidades, n é 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 resíduos de Glicina), Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala-Ser.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de tronco curto de hemaglutinina de vírus 20 influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: (SEQ ID NO:34)-LL-(SEQ ID NO:350)-(SEQ ID NO:82), (SEQ ID NO:35)-LL-(SEQ ID NO:351)-(SEQ ID NO:83), (SEQ ID NO:36)-LL-(SEQ ID NO:352)-(SEQ ID NO:84), 25 (SEQ ID NO:37)-LL-(SEQ ID NO:353)-(SEQ ID NO:85), (SEQ ID NO:38)-LL-(SEQ ID NO:354)-(SEQ ID NO:86), (SEQ ID NO:39)-LL-(SEQ ID NO:355)-(SEQ ID NO:87), (SEQ ID NO:40)-LL-(SEQ ID NO:356)-(SEQ ID NO:88), (SEQ ID NO:41)-LL-(SEQ ID NO:357)-(SEQ ID NO:89), 30 (SEQ ID NO:42)-LL-(SEQ ID NO:358)-(SEQ ID NO:90),
(SEQ ID NO:43)-LL-(SEQ ID NO:359)-(SEQ ID NO:91), (SEQ ID NO:44)-LL-(SEQ ID NO;360)-(SEQ ID NO:92), (SEQ ID NO:45)-LL-(SEQ ID NO:361)-(SEQ ID NO:93), (SEQ ID NO:46)-LL--(SEQ ID NO:362)-(SEQ ID NO:94), 5 (SEQ ID NO:47)-LL-(SEQ ID NO:363)-(SEQ ID NO:95), (SEQ ID NO:48)-LL-(SEQ ID NO:364)-(SEQ ID NO:96), e (SEQ ID NO:49)-LL-(SEQ ID NO:365)-(SEQ ID NO:97), em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um ligante como descrito aqui. Em particular, os segmentos C- terminal HAl podem ser covalente ou não-covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPEQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala- Ser.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: (SEQ ID NO:34)-LL-(SEQ ID NO:350)-(SEQ ID NO:82)- (SEQ ID NO:98), (SEQ ID NO:35)-LL-(SEQ ID NO:351)-(SEQ ID NO:83)- 25 (SEQ ID NO, 99) , (SEQ ID NO:36)-LL-(SEQ ID NO:352)-(SEQ ID NO:84)- (SEQ ID NO: 100) , (SEQ ID NO:37)-LL-{SEQ ID NO:353)-(SEQ ID NO:85)- (SEQ ID NO: 101) ,
i
(SEQ ID NO:38)-LL-(SEQ ID NO:354)-(SEQ ID NO:86)- (SEQ ID NO:102),
(SEQ ID NO:39)-LL-(SEQ ID NO:355)-(SEQ ID NO:87)- (SEQ ID NO:103),
5 (SEQ ID NO:40)-LL-(SEQ ID NO:356)-(SEQ ID NO:88)- (SEQ ID NO:104),
(SEQ ID NO:41)-LL-(SEQ ID NO:357)-(SEQ ID NO:89)- (SEQ ID NO:105),
(SEQ ID NO:42)-LL-(SEQ ID NO:358)-(SEQ ID NO:90)- 10 (SEQ ID NO:106),
(SEQ ID NO:43)-LL-(SEQ ID NO:359)-(SEQ ID NO:91)- (SEQ ID NO:107),
(SEQ ID NC:44)-LL-(SEQ ID NO:360)-(SEQ ID NO:92)- (SEQ ID NO:108),
15 (SEQ ID NO:45)-LL-(SEQ ID N0:361)-(SEQ ID NO:93)- (SEQ ID NO:109),
(SEQ ID NO:46)-LL-(SEQ ID NO:362)-(SEQ ID NO:94)- (SEQ ID NO:110),
(SEQ ID NO:47)-LL-(SEQ ID NO:363)-(SEQ ID NO:95)- 20 (SEQ ID NO:111),
(SEQ ID NO:48)-LL-(SEQ ID NO:364)-(SEQ ID NO:96)- (SEQ ID NO:112), e
(SEQ ID NO:49)-LL-(SEQ ID NO:365)-(SEQ ID NO:97)- (SEQ ID NO:113), 25 em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um ligante como descrito aqui.
Em particular, os segmentos de tronco curtos C-terminal HA1 podem ser covalente ou não- covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas 30 modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala-Ser.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui 5 um polípeptídeo de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em:
(SEQ ID NO:34)-LL-(SEQ ID NO:350)-(SEQ ID NO:82)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), 10 (SEQ ID NO:35)-LL-(SEQ ID NO:351)-(SEQ ID NO:83)-
(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:36)-LL-(SEQ ID NO:352)-(SEQ ID NO:84)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:37)-LL-(SEQ ID NO:353)-(SEQ ID NO:85)- 15 (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:38)-LL-(SEQ ID NO:354)-(SEQ ID NO:86)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:39)-LL-(SEQ ID NO:355)-(SEQ ID NO:87)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), 20 (SEQ ID NO:40)-LL-(SEQ ID NO:356)-(SEQ ID NO:88)-
(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:41)-LL-(SEQ ID NO:357)-(SEQ ID NO:89)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:42)-LL-(SEQ ID NO:358)-(SEQ ID NO:90)- 25 (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:43)-LL-(SEQ ID NO:359)-(SEQ ID NO:91)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:44)-LL-(SEQ ID NO:360)-(SEQ ID NO:92)- (SEQ ID NO: 168) - (SEQ ID NO:167) - (SEQ ID NO:166) ,
A (SEQ ID NO:45)-LL-(SEQ ID NO:361)-(SEQ ID NO:93)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:46)-LL-(SEQ ID NO:362)-(SEQ ID NO:94)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), 5 (SEQ ID NO:47)-LL-(SEQ ID NO:363)-(SEQ ID NO:95)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), - (SEQ ID NO:48)-LL-(SEQ ID NO:364)-(SEQ ID NO:96)- (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), e (SEQ ID NO:49)-LL-(SEQ ID NO:365)-(SEQ ID NO:97)- 10 (SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um ligante como descrito aqui. Em particular, os segmentos de tronco curto C-terminal HA1 podem ser covalente ou não- 15 covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala-Ser.
20 Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: (SEQ ID NO:34)-LL-(SEQ ID NO:350)-(SEQ ID NO:82)- 25 (SEQ ID NO:98)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:35)-LL-(SEQ ID NO:351)-(SEQ ID NO:83)- (SEQ ID NO:99)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:36)-LL-(SEQ ID NO:352)-(SEQ ID NO:84)- (SEQ ID NO:100)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID
NO:166),
(SEQ ID NO:37)-LL-(SEQ ID NO:353)-(SEQ ID NO:85)- 5 (SEQ ID NO:101)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:38)-LL-(SEQ ID NO:354)-(SEQ ID NO:86)-
(SEQ ID NO:102)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), 10 (SEQ ID NO:39)-LL-(SEQ ID NO:355)-(SEQ ID NO:87)-
(SEQ ID NO:103)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:40)-LL-(SEQ ID NO:356)-(SEQ ID NO:86)- (SEQ ID NO:104)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID 15 NO:166),
(SEQ ID NO:41)-LL-(SEQ ID NO:357)-(SEQ ID NO:89)- (SEQ ID NO:105)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:42)-LL-(SEQ ID NO:358)-(SEQ ID NO:90)- 20 (SEQ ID NO:106)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:43)-LL-(SEQ ID NO:359)-(SEQ ID NO:91)- (SEQ ID NO:107)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), 25 (SEQ ID NO:44)-LL-(SEQ ID NO:360)-(SEQ ID NO:92)-
(SEQ ID NO:108)-(SEQ ID N0:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:45)-LL-(SEQ ID NO:361)-(SEQ ID NO:93)-
(SEQ ID NO:109)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID 30 NO:166),
(SEQ ID NO:46)-LL-(SEQ ID NO:362)-(SEQ ID NO:94)- (SEQ ID NO:110)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:47)-LL-(SEQ ID NO:363)-(SEQ ID NO:95)- 5 (SEQ ID NO:111)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:48)-LL-(SEQ ID NO:364)-(SEQ ID NO:96)- (SEQ ID N0:112)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), e 10 (SEQ ID NO:49)-LL-(SEQ ID NO:365)-(SEQ ID NO:97)- (SEQ ID NO:113)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um ligante como descrito aqui. Em particular, os segmentos de tronco curto C-terminal HAl podem ser covalente ou não- covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNNITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala-Ser.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de tronco curto de hemaglutinina de vírus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: (SEQ ID NO:177)-LL-(SEQ ID NO:366)-(SEQ ID NO:66), (SEQ ID NO:178)-LL-(SEQ ID NO:367)-(SEQ ID NO:66), (SEQ ID NO:179)-LL-(SEQ ID NO:368)-(SEQ ID NO:66), (SEQ ID NO:180)-LL-(SEQ ID NO:369)-(SEQ ID NO:67), 30 (SEQ ID NO:181)-LL-(SEQ ID NO:370)-(SEQ ID NO:67),
(SEQ ID NO:182)-LL-(SEQ ID NO:371)-(SEQ ID NO:67), (SEQ ID NO:183)-LL-(SEQ ID NQ:372)-(SEQ ID NO:68), (SEQ ID NO:184)-LL-(SEQ ID NO:373)-(SEQ ID NO:68), (SEQ ID NO:185)-LL-(SEQ ID NO:374)-(SEQ ID NO:68), 5 (SEQ ID NO:186)-LL-(SEQ ID NO:375)-(SEQ ID NO:69), (SEQ ID NO:187)-LL-(SEQ ID NO:376)-(SEQ ID NO:69), (SEQ ID NO:188)-LL-(SEQ ID NO:377)-(SEQ ID NO:69), (SEQ ID NO:189)-LL-(SEQ ID NO:378)-(SEQ ID NO:70), (SEQ ID NO:190)-LL-(SEQ TD NO:379)-(SEQ ID NO:70), (SEQ ID NO:191)-LL-(SEQ ID NO:380)-(SEQ ID NO:70), (SEQ ID NO:192)-LL-(SEQ ID NO:381)-(SEQ ID NO:71), (SEQ ID NO:193)-LL-(SEQ ID NO:382)-(SEQ ID NO:71), (SEQ ID NO:194)-LL-(SEQ ID NO:383)-(SEQ ID NO:71), (SEQ ID NO:195)-LL-(SEQ ID NO:384)-(SEQ ID NO:72), (SEQ ID NO:196)-LL-(SEQ ID NO:385)-(SEQ ID NO:72), (SEQ ID NO:197)-LL-(SEQ ID NO:386)-(SEQ ID NO:72), (SEQ ID NO:198)-LL-(SEQ ID NO:387)-(SEQ ID NO:73), (SEQ ID NO:199)-LL-(SEQ ID NO:388)-(SEQ ID NO:73), (SEQ ID NO:200)-LL-(SEQ ID NO:389)-(SEQ ID NO:73), (SEQ ID NO:201)-LL-(SEQ ID NC:390)-(SEQ ID NO:74), (SEQ ID NO:202)-LL-(SEQ ID NO:391)-(SEQ ID NO:74), (SEQ ID NO:203)-LL-(SEQ ID NO:392)-(SEQ ID NO:74), (SEQ ID NO:204)-LL-(SEQ ID NO:393)-(SEQ ID NO:75), (SEQ ID NO:205)-LL-(SEQ ID NO:394)-(SEQ ID NO:75), (SEQ ID NO:206)-LL-(SEQ ID NO:395)-(SEQ ID NO:75), (SEQ ID NO:207)-LL-(SEQ ID NO:396)-(SEQ ID NO:76), (SEQ ID NO:208)-LL-(SEQ ID NO:397)-(SEQ ID NO:76), (SEQ ID NO:209)-LL-(SEQ ID NO:398)-(SEQ ID NO:76), (SEQ ID NO:210)-LL-(SEQ ID NO:399)-(SEQ ID NO:77), (SEQ ID NO:211)-LL-(SEQ ID NO:400)-(SEQ ID NO:77),
(SEQ ID NO:212)-LL-(SEQ ID NO:401)-(SEQ ID NO:77), (SEQ ID NO:213)-LL-(SEQ ID NO:402)-(SEQ ID NO:78), (SEQ ID NO:214)-LL-(SEQ ID NO:403)-(SEQ ID NO:78), (SEQ ID NO:215)-LL-(SEQ ID NO:404)-(SEQ ID NO:78), 5 (SEQ ID NO:216)-LL-(SEQ ID NO:405)-(SEQ ID NO:79), (SEQ ID NO:217)-LL-(SEQ ID NO:406)-(SEQ ID NO:79), (SEQ ID NO:218)-LL-(SEQ ID NO:407)-(SEQ ID NO:79), (SEQ ID NO:219)-LL-(SEQ ID NO:408)-(SEQ ID NO:80), (SEQ ID NO:220)-LL-(SEQ ID NO:409)-(SEQ ID NO:80), 10 (SEQ ID NO:221)-LL-(SEQ ID NO:410)-(SEQ ID NO:80), (SEQ ID NO:222)-LL-(SEQ ID NO:411)-(SEQ ID NO:81), (SEQ ID NO:223)-LL-(SEQ ID NO:412)-(SEQ ID NO:81), e (SEQ ID NO:224)-LL-(SEQ ID NO:413)-(SEQ ID NO:81), 15 e em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um ligante como descrito aqui. Em particular, os segmentos de tronco curtos C-terminal HA1 podem ser covalente ou não- 20 covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala-Ser. 25 5.3.2. POLIPEPTÍDEOS DE DOMÍNIO DE TRONCO DE
HEMAGLUTININA DE INFLUENZA Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza é um polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de 30 vírus influenza. A estrutura primária típica de um polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza fornecido aqui compreende, na seguinte ordem: um segmento de tronco longo N-terminal HA1, um ligante, um segmento de tronco longo C-terminal HAl e uma
5 HA2. A sequência primária pode ser formada por um único polipeptídeo, ou essa pode ser formada por múltiplos polipeptídeos.
Tipicamente, um único polipeptídeo é expresso por qualquer técnica considerada adequada por um elemento versado na técnica.
Em modalidades de único 10 polipeptídeo, os segmentos HA1 e a HA2 estão em associação terciária.
Como conhecido pelos elementos versados na técnica, um único polipeptídeo HA pode ser clivado, por exemplo, por uma protease, sob condições de expressão apropriadas para produzir dois polipeptídeos em associação 15 quaternária.
A clivagem é tipicamente entre o segmento de tronco curto C-terminal HAl e a HA2. Em determinadas • modalidades, proporcionam-se aqui múltiplos polipeptideos.
Em modalidades de polipeptideo múltiplo, os segmentos HAl e HA2 estão em associação quaternária. 20 Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza fornecido aqui é monomérico.
Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza fornecido aqui é multimérico.
Em 25 determinadas modalidades, um polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza fornecido aqui é trimérico.
Os elementos versados na técnica irão reconhecer que os polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza nativos são capazes de 30 trimerização in vivo e que alguns polipeptideos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza fornecidos aqui são capazes de trimerização. Em modalidades particulares descritas abaixo, os polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza 5 fornecidos aqui compreendem domínios de trimerização para facilitar a trimerização.
Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza compreende a peptídeo de sinal. Em determinadas modalidades, 10 também proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza maduros que são desprovidos de um peptídeo de sinal.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina 15 de vírus influenza que compreendem um domínio de tronco HA2, um domínio luminal HA2, um domínio de transmembrana HA2 e • um domínio citoplâsmico HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem 20 um domínio de tronco HA2, um domínio luminal HA2, e um domínio de transmembrana HA2, porem são desprovidos de algum ou todo o domínio citoplásmico típico. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina 25 de vírus influenza que compreendem um domínio de tronco HA2 e um domínio luminal HA2, porém são desprovidos de um domínio de transmembrana HA2 e um domínio citoplásmico HA2.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina 30 de vírus influenza que compreendem um domínio de tronco HA2,
porém são desprovidos de um domínio luminal HA2, um domínio de transmembrana HA2 e um domínio citoplásmico HA2. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza 5 compreendem um domínio de tronco HA2 que possui pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% identidade de sequência de aminoácido a um domínio de tronco HA2 de influenza conhecido pelo elemento versado na técnica. Domínios de tronco HA2 conhecidos exemplares de hemaglutininas de influenza A conhecidas são fornecidos nas tabelas abaixo.
Também, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas deletadas de domínios de tronco HA2 15 em,que_ até 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduo de aminoácido são deletados de cada ou ambas as terminações do domínio de tronco HA2. Ademais, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas alteradas de domínios de tronco HA2 em que até 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduos de aminoácido são substituídos de maneira conservadora por outros aminoácidos. Ademais, proporcionam-se polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza - que compreendem domínios de tronco HA2 deletados e alterados.
O segmento de tronco longo N-terminal HAl pode ser qualquer segmento de tronco longo N-terminal HA1 reconhecido por um elemento versado na técnica com base na definição fornecida aqui. Tipicamente, um segmento de tronco longo N-terminal HAl corresponde a um polipeptídeo que consiste no aminoácido N-terminal de uma HAl madura 5 (isto é, uma HA1 desprovida de um peptídeo de sinal) através do resíduo de cisteína localizado em sequência aproximadamente no 97 resíduo da HA1(utilizando a numeração H3). Esse resíduo de cistina, denominado Cp aqui, é geralmente capaz de ser ligado a um resíduo de cisteína Cq no segmento de tronco longo C-terminai de HAl. As sequências de 17 hemaglutininas de influenza A representativas são apresentadas na Figura 1, e o resíduo C~, é identificado em cada uma.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo N-terminal HAl não termina exatamente em Cp (por exemplo, Cys97 de uma subunidade HA1 de uma hemaglutinina H3), porém em um resíduo em sequência e adjacências estruturais a C. Por exemplo, em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo N-terminal HAl termina em C p_1, 20 Cp_ 2 , Cp_ 3 , ou Cp _.~ . Em outras modalidades, o segmento de tronco longo N-terminal HAl termina em C,+1, Cp+2, Cp+3, Cp+4 ou Cp+5 . O final de um segmento de tronco longo N-terminal HA1 deve ser selecionado em conjunto com o final do segmento de tronco longo C-terminal HAl e o ligante de modo que o domínio de tronco HAl ligado resultante seja capaz de formar uma estrutura tridimensional similar, como descrito abaixo, a um domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza compreendem um segmento de tronco longo N-terminal HAl que possui pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% de identidade de sequência de aminoácido a um segmento de tronco longo N-terminal HAl de influenza conhecido pelos 5 elementos versados na técnica. Segmentos de tronco longos N-terminal HA1 conhecidos exemplares são fornecidos nas tabelas abaixo.
Também proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas deletadas de segmentos de tronco longos N-terminal HAl em que até 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduo de aminoácido são deletados de cada ou ambas as terminações do segmento de tronco longo N- terminal HAl. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas expandidas de segmentos de tronco longos N-terminal HAl em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos são adicionados à C-terminação dos segmentos de tronco longos N-terminal HAl; esses resíduos adicionados podem ser derivados da sequência de aminoácido de um domínio de cabeça glõbular adjacente a um segmento de tronco longo N- terminal HAl. Ademais, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas alteradas de segmentos de tronco longos N-terminal HAl em que até 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduo de aminoácido são substituídos de maneira conservadora por outros aminoácidos.
Ademais, proporcionam-se polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem segmentos de tronco longos N-terminal HA1 deletados e alterados.
5 0 segmento de tronco longo C-terminal HAl pode ser qualquer segmento de tronco longo C-terminal HA1 reconhecido por um elemento versado na técnica com base na definição fornecida aqui. Tipicamente, um segmento de tronco longo C-terminal HAl corresponde a um polipeptídeo que consiste no resíduo de alanina localizado em sequência aproximadamente no 252° resíduo de um HAl (utilizando a numeração H3) através do aminoácido C-terminal de HAI. Esse resíduo de alanina, denominado Cq aqui é geralmente capaz de ser ligado a um resíduo de cisteína C, no segmento de tronco longo N-terminal de HAl. As sequências de 16 hemaglutininas de influenza A representativas são apresentadas na Figura 1, e o resíduo Cq é identificado em cada uma Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo C-terminal HAl não começa em Cq (por exemplo, Ala252 de uma subunidade HA1 de uma hemaglutinina H3), porém em um resíduo em sequência e adjacências estruturais de Cq. Por exemplo, em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo C-terminal HA1 começa em C,_1r Cq _ 2 , Cq _ 3 , OU Cq _ 4 Em outras modalidades, o segmento de tronco longo C-terminal HA1 começa em Cq+l, Cq +2, Cq+3, Cq +4 OU Cq+5. O final de um segmento de tronco longo N-terminal HAl deve ser selecionado em conjunto com o início do segmento de tronco longo C-terminal HA1 e o ligante de modo que o domínio de tronco HAl resultante seja capaz de formar uma estrutura tridimensional similar, como descrito abaixo, a uma hemaglutinina de vírus influenza.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza 5 compreendem um segmento de tronco longo C-terminal HAl que possui pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% ou 98% de identidade de sequência de aminoácido a um segmento de tronco longo C-terminal HAl de influenza conhecido pelo elemento versado na técnica. Segmentos de tronco longos C- terminal HA1 exemplares conhecidas sãn fnrnPr•,rins rPR tabelas abaixo.
Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é CP _1, e o início do segmento de tronco longo C-terminal é Cq _1. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é Ap _ 2 , e o início do segmento de tronco longo C-terminal é Cq _ 2. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é CP _ 3, e o início do segmento de tronco longo C-terminal é Cq _ 3. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é CP _ 4 , e o início do segmento de tronco longo C-terminal é Cq _ 4 _ Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é Cp _5i e o início do segmento de tronco longo C-terminal Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é Cp+1 , e o início do segmento de tronco longo C-terminal é Cq+l. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é C12, e o início do segmento de tronco longo C-terminal é Cq + 2. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é Cp+3, e o início do segmento de tronco longo C-terminal é Cq+3. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é CP+4, e o início do segmento de tronco longo C-terminal é Cq +4_ Em 5 determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é Cp+s, e o início do segmento de tronco longo C-terminal é Cq+5.
Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é Cp _1, e o inicio do segmento de tronco longo C-terminal é Cq +i. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é C 2 , e o início do segmento de tronco longo C-terminal é Cq+2. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é Cp _ 3i e o início do segmento de tronco longo C-terminal é Cq+3. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é C i e o início do segmento de tronco longo C-terminal é C. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é Cp _ 5 , e o início do segmento de tronco longo C-terminal é Cq + 5 .
Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é Cp+1, e o início do segmento de tronco longo C-terminal é C. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é Cp+z, e o início do segmento de tronco longo C-terminal é Cq-2. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é CP +3, e o início do segmento de tronco longo C-terminal é Cq_a. Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é Cp+Q, e o início do segmento de tronco longo C-terminal é Cq _ 4 _ Em determinadas modalidades, o final do segmento de tronco longo N-terminal é CP+s, e o início do segmento de tronco longo C-terminal é C.
Também proporcionam-se aqui polipeptídeos de 5 domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas deletadas de segmentos de tronco longos C-terminal HAl em que até 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduo de aminoácido são deletados de cada ou ambas as terminações do segmento de tronco longo C- terminal HA1. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem formas expandidas de segmentos de tronco longos C-terminal HAl em que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos são adicionados à N-terminação dos segmentos de tronco longos C-terminal HA1; esses resíduos adicionados podem ser derivados da sequência de aminoácido de um domínio de cabeça globular adjacente a um segmento de tronco longo C- terminal HAl. Em particular modalidades, se um resíduo é adicionado ao segmento de tronco longo C-terminal, então um resíduo é adicionado ao segmento de tronco longo N-terminal; se dois resíduos forem adicionados ao segmento de tronco longo C-terminal, então dois resíduos são adicionados ao segmento de tronco longo N-terminal; se três resíduos forem adicionados ao segmento de tronco longo C-terminal, então três resíduos são adicionados ao segmento de tronco longo N-terminal. Ademais, proporcionam-se aqui polipeptideos de domínio de tronco longo de hemaglutinína de vírus influenza que compreendem formas alteradas de segmentos de tronco longos C-terminal HAl em que até 100, 95, 90, 85, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 resíduo de aminoácido são substituídos de maneira conservadora por outros aminoácidos. Ademais, 5 proporcionam-se polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem segmentos de tronco longos C-terminal HA1 deletados e alterados.
Os polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza podem ser baseados (isto é, 10 podem ter identidade de sequência, como descrito acima) qualquer hemaglutinina de vírus influenza conhecida pelos elementos versados na técnica, descobertos mais tarde. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza são 15 baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do grupo que consiste em H1, H2, H3, 20 H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e H17. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza B, como descrito em detalhes abaixo. 25 0 segmentos de tronco longos N-terminal HAl pode ser baseado (isto é, podem ter identidade de sequência, como descrito acima) em qualquer segmentos de tronco longos N-terminal HAl conhecidos pelos elementos versados na técnica, descobertos mais tarde. Em determinadas 30 modalidades, os segmentos de tronco longos N-terminal HA1 são baseados em segmentos de tronco longos N-terminal HAl de influenza A. Em determinadas modalidades, os segmentos de tronco longos N-terminal HAl são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do 5 grupo que consiste em H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e H17. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo N-terminal HAl é selecionado a partir de SEQ ID NOS:414-429. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo N-terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:414-429, cada um tem um aminoácido deletado de sua C-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo N-terminal HAl é selecionado a partir de SEQ ID NOS:414-429, cada um tem dois aminoácidos deletados de sua C-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo N- terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:414-429, cada um tem três aminoácidos deletados de sua C-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo N- terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:414-429, cada um tem quatro aminoácidos deletados de sua C- terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo N- terminal HAl é selecionado a partir de SEQ ID NOS:414-429, cada um tem cinco aminoácidos deletados de sua C-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo N-terminal HAl é selecionado a partir de SEQ ID NOS:446-493.
Os segmentos de tronco longos C-terminal HA1 podem ser baseados (isto é, podem ter identidade de sequência, como descrito acima) em quaisquer segmentos de tronco longos C-terminal HA1 conhecidos pelos elementos versados na técnica, descobertos mais tarde. Em determinadas modalidades, os segmentos de tronco longos C- terminal HA1 são baseados em segmentos de tronco longos C- terminal HA1 de influenza A. Em determinadas modalidades, 5 os segmentos de tronco longos C-terminal HAl são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do grupo que consiste em Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e H17. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo C- terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:430-445.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo C- terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS: 430-445, cada um tem um aminoácido deletado de sua N-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo C- terminal HAl é selecionado a partir de SEQ ID NOS: 430-445, cada um tem dois aminoácidos deletados de sua N-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo C- terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS: 430-445, cada um tem três aminoácidos deletados de sua N-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo C- terminal HA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS: 430-445, cada um tem quatro aminoácidos deletados de sua N- terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo C-terminal HAl é selecionado a partir de SEQ ID NOS: 430-445, cada um tem cinco aminoácidos deletados de sua N-terminação. Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo C-terminal HAA1 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:494-541.
Os domínios de tronco HA2 podem ser baseados 30 (isto é podem ter identidade de sequência, como descrito acima) em quaisquer domínios de tronco HA2 conhecidos pelos elementos versados na técnica, descobertos mais tarde, ou descritos aqui. Em determinadas modalidades, os domínios de tronco HA2 são baseados em domínios de tronco HA2 de 5 influenza A. Em determinadas modalidades, os domínios de tronco HA2 são baseados em uma hemaglutinina de vírus influenza A selecionada a partir do grupo que consiste em H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e H17. Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA2 é selecionado a partir de SEQ ID NOS:66-97.
Em modalidades que compreendem um peptídeo de sinal, o peptídeo de sinal pode ser baseado em qualquer peptídeo de sinal de influenza conhecido pelos elementos versados na técnica ou descrito aqui. Em determinadas modalidades, o peptídeo de sinal é selecionado a partir de SEQ ID NOS:18-33.
Em modalidades que compreendem um domínio luminal, o domínio luminal pode ser baseado em qualquer domínio luminal de influenza conhecido pelos elementos versados na técnica ou descrito aqui. Em determinadas modalidades, o domínio luminal é selecionado a partir de SEQ ID NOS:98-113.
Em modalidades que compreendem um domínio de transmembrana, o domínio de transmembrana pode ser baseado em qualquer domínio de transmembrana de influenza conhecido pelos elementos versados na técnica ou descrito aqui. Em determinadas modalidades, o domínio de transmembrana é selecionado a partir de SEQ Ia NOS:114-129.
Em modalidades que compreendem um domínio citoplásmico, o domínio citoplásmico pode ser baseado em qualquer domínio citoplásmico de influenza conhecido pelos elementos versados na técnica ou descrito aqui. Em determinadas modalidades, o domínio citoplásmico é selecionado a partir de SEQ ID NOS:130-145.
Em determinadas modalidades, um ou mais sítios de 5 glicosilação no domínio de tronco de hemaglutinina são modificados (por exemplo, por adição, deleção ou substituição de aminoácido) de modo que a glicosilação nesses sítios não ocorra durante o processamento e maturação do polipeptídeo. Os elementos versados na técnica irão reconhecer que a HA de influenza compreende tipicamente um ou mais sítios de glicosilação (por exemplo Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer outro aminoácido, ou, em determinadas modalidades, em que Xaa é qualquer aminoácido exceto Pro). Em determinadas modalidades, um ou mais resíduos de aminoácido em um sítio de glicosilação são substituídos de maneira conservadora por um resíduo de aminoácido que interrompe o sítio de glicosilação. Em determinadas modalidades, um ou mais resíduos de aminoácido em um sítio de glicosilação são substituídos por qualquer resíduo de aminoácido que interrompe a sequência de glicosilação. Em determinadas modalidades, um ou mais resíduos de asparagina em uma sequência de glicosilação são substituídos por alanina. Em uma modalidade particular, a asparagina na posição 38 de uma hemaglutinina H3 é alterada para uma alanina. Em determinadas modalidades, o domínio de tronco de hemaglutinina compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados como discutido na Seção 5.4.1, infra.
A Tabela 7, abaixo, identifica os peptídeos de sinal, segmentos de tronco longo N-terminal HA1, segmentos de tronco longos C-terminal HAl e domínios HA2 de polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza A. Esses peptídeos de sinal, segmentos de tronco e domínios são úteis nos polipeptídeos e métodos descritos aqui. 5 TABELA 7. Sequências de Peptídeo de Domínio de Tronco Longo de Hemaalutinina dP Tnflnonw= a RvemYa ~re~ Subtipo HA Segmento de Segmento de Peptídeo Tronco Longo Tronco Longo (Genbank Domini© HA2 de Sinal N-terminal C-terminal No.) HAl HAl Hl MKANLLVLLC DTICIGYHANNST APMYAFALSRGFG GLFGAIAGFIEGGWTGM PR8-H1N1 ALAAADA DTVDTVLEKNVTV SGIITSNASMHEC IDGWYGYIHHQNEQGSGY (EF467821.1) THSVNLLEDSHNG NTKCQTPLGAINS AADQKSTQNAINGITNK [SEQ ID KLCRLKGIAPLQL SLPYQNIHPVTIG VNTVIEKMNIQFTAVGK NO:18] GKCNIAGWLLGNP ECPKYVRSAKLRM EH'NKLEKRMENLNKKVD
ECDPLLPVRSWSY VTGLRNNPSIQSR DGFLDIWTYNAELLVLL
IVETPNSENGIC ENERTLDFHDSNVKNLY [SEQ ID EKVKSQLKNNAKEIGNG • [SEQ ID NO:430] CFEFYHKCDNECMESVR NO:414] NGTYDYPKYSEESKLNR
EKVDGVKLESMGIYQIL AIYSTVASSLVLLVSLG
AISFWMCSNGSLQCRIC 1 [SEQ ID NO:66] H2 MAIIYLILLF DQICIGYHSNNST APEYGFRISKRGS GLFGAIAGFIEGGWQGM (L11136) TAVRG EKVDTILERNVTV SGIMKTEGTLEN IDGWYGYHHSNDQGSGY
THAQNILEKTHNG CETKCQTPLGAIN AADKESTQKAIDGITNR [SEQ ID KLCKLNGIPPLEL TTLPFHNVHPLTI VNSVIEKMNTQFEAVGK NO:19] GDCSIAGWLLGNP GECPKYVKSERLV EFSNLEKRLENLNKKME
ECDRLLTVPEWSY LATGLRNVPQIES DGFLDVWTYNAELLVLM IMEKENPRNGLC R ENERTLDFHDSNVKNLY
DRVRMQLRDNAKELGNG [SEQ ID [SEQ ID CFEFYHKCDDECMNSVK NO:415] NC:431] NGTYDYPKYEEESKLNR
NEIKGVKLSNMGVYQIL AIYATVAGSLSLAIMIA GISLWMCSNGSLQCRIC
I [SEQ ID N0:67] H3 MKTIIALSYI QDLPGNDNSTATL APRGYFKMRTGKS GLFGAIAGFIENGWEGM HK68-H3N2 FCLALG CLGHHAVPNGTLV SIMSSDAPIDTCI IDGWYGFRHQNSEGTGQ (EF409245) KTITDDQIEVTNA SECITPNGSIPND AADLKSTQAAIDQINGK PDB: 1HGJ [SEQ ID TELVQSSSTGKIC KPFQNVNKITYGA LNRVIEKTNEKFHQIEK NO:20] NNPHRILDGIDCT CPKYVKQNTLKLA EFSEVEGRIQDLEKYVE
LIDALLGDPHCDV TGMRNVPEKQTR DTKIDLWSYNAELLVAL FQNETWDLFVERS ENQHTIDLTDSEMNKLF KAFSNC [SEQ ID EKTRRQLRENAEDMGNG
Subtipo HA Segmento de Segmento de (Genbank Peptídeo Tronco Longo Tronco Longo de Sinal N-terminal C-terminal D°m nio HA2 No -1 HA1 HA1 NO:432] CFKIYHKCDNACIESIR [SEQ ID NGTYDHDVYRDEALNNR NO:416] FQIKGVELKSGYKDWIL
WISFAISCFLLCVVLLG
FIMWACQRGNIRCNICI [SEQ ID NO:68] H4 MLSIVILFLL QNYTGNPVICMGH APRGHYKLNNQKK GLFGAIAGFIENGWQGL (D903O2) IAENSS HAVANGTMVKTLA STILNTAIPIGSC IDGWYGFRHQNAEGTGT
DDQVEVVTAQELV VSKCHTDKGSLST AADLKSTQAAIDQINGK [SEQ ID ESQNLPELCPSPL TKPFQNISRIAVG LNRLIEKTNDKYHQIEK NO:21] RLVDGQTCDIING DCPRYVKQGSLKL EFEQVEGRIQDLENYVE
ALGSPGCDHLNGA ATGMRNIPEKASR DTKIDLWSYNAELLVAL EWDVFIERPNAVD ENQHTIDVTDSEMNKLF TC [SEQ ID ERVRRQLRENAEDKGNG NO:433] CFEIFHKCDNNCIESIR [SEQ ID NGTYDHDIYRDEAINNR NO:417] FQIQGVKLTQGYKDIIL
WISFSISCFLLVALLLA
FILWACQNGNIRCQICI [SEQ ID NO:69] H5 MERIVLLLAI DQICIGYHANKST APRYAYKIVKKGD GLFGAIAGFIEGGWQGM (X07826) VSLVKS KQVDTIMEKNVTV SAIMKSGLAYGNC VDGWYGYHHSNEQGSGY
THAQDILERTHNG DTKCQTPVGEINS AADKESTQKAIDGITNK [SEQ ID KLCSLNGVKPLIL SMPFHNIHPHTIG VNSIIDKMNTRFEAVGK NO:22] RDCSVAGWLLGNP ECPKYVKSDRLVL EFNNLERRVENLNKKME
MCDEFLNLPEWLY ATGLRNVPQRKKR DGFLDVWTYNVELLVLM IVEKDNPINSLC ENERTLDFHDSNVNNLY [SEQ ID DKVRLQLKDNARELGNG [SEQ ID N{á:434] CFEFYHKCDNECMESVR NO:418] NGTYDYPQYSEEARLNR
EEISGVKLESMGVYQIL SIYSTVASSLALAIMIA GLSFWMCSNGSLQCRIC
I [SEQ ID NO:70] H6 MIAIIVVAIL DKÌCIGYHANNST APWYAFRFVSTSN GLFGAIAGFIEGGWTGM (D90303) ATAGRS TQIDTILEKNVTV KGAVFKSNLPIEN IDGWYGYHHENSQGSGY
THSVELLENQKEE CDATCQTVAGVLR AADRESTQKAVDGITNK [SEQ ID RFCKILKKAPLDL TNKTFQNVSPLWI VNSIIDKMNTQFEAVDH NO:23] KGCTIEGWILGNP GECPKYVKSESLR EFSNLERRIDNLNKRME
QCDLLLGDQSWSY LATGLRNVPQIET DGFLDVWTYNAELLVLL IVERPTAQNGIC R ENERTLDLHDANVKNLY
ERVKSQLRDNAMILGNG [SEQ ID [SEQ ID CFEEWHKCDDECMESVK NO:419] NO:435] NGTYDYPKYQDESKLNR
QEIESVKLESLGVYQIL AIYSTVSSSLVLVGLII
Subtipo I3A Segmento de Segmento de (Genbank Peptídeo Tronco Longo Tronco Longo No.) de Sinal N-terinal m C-termnal i Domínio HA2 EiA1 HAl
AVGLWMCSNGSMQCRIC
I [SEQ ID NO:71] H7 MNTQILVFAL DKICLGHHAVSNG APNRASFLRGKSM GLFGAIAGFIENGWEGL (M24157) VAVIPTNA TKVNTLTERGVEV GIQSDVQVDANCE VDGWYGFRHQNAQGEGT
VNATETVERTNIP GECYHSGGTITSR AADYKSTQSAIDQITGK [SEQ ID KICSKGKRTTDLG LPFQNINSRAVGK LNRLIEKTNQQFELIDN NO:24] QCGLLGTITGPPQ CPRYVKQESLLLA EFTEVEKQIGNLINWTK
CDQFLEFSADLII TGMKNVPEPSKKR DSITEVWSYNAELIVAM ERREGNDVC KKR ENQHTIDLADSEMNRLY
ERVRKQLRENAEEDGTG [SEQ ID [SEQ ID CFEIFHKCDDDCMASIR NO:420] NO:436] NNTYDHSKYREEAMQNR
IQIDPVKLSSGYKDVIL WFS FGASC FLLLAIAMG
LVFICVKNGNMRCTICI [SEQ ID NO:72] H8 MEKFIAIATL DRICIGYQSNNST APEFGYLLKGESY GLFGAIAGFIEGGWSGM (D90304) ASTNAY DTVNTLIEQNVPV GRIIQNEDIPIGN IDGWYGFHHSNSEGTGM
TQTMELVETEKHP CNTKCQTYAGAIN AADQKSTQEAIDKITNK [SEQ ID AYCNTDLGAPLEL SSKPFQNASRHYM VNNIVDKMNREFEVV'NH NO:25] RDCKIEAVIYGNP GECPKYVKKASLR EFSEVEKRINMINDKID
KCDIHLKDQGWSY LAVGLRNTPSVEP DQIEDLWAYNAELLVLL IVERPSAPEGMC R ENQKTLDEHDSNVKNLF
DEVKRRLSANAIDAGNG [SEQ ID [SEQ ID CFDILHKCDNECMETIK NO:421] NO:437] NGTYDHKEYEEEAKLER
SKINGVKLEENTTYKIL SIYSTVAASLCLAILIA GGLILGMQNGSCRCMFC
I [SEQ ID NO:73] H9 METKAIIAAL DKICIGYQSTNST APWYGHVLTGESH GLFGAIAGFIEGGWPGL (D90305) LMVTAANA ETVDTLTESNVPV GRILKTDLNNGNC VAGWYGFQHSNDQGVGM
THTKELLHTEHNG VVQCQTEKCGLNT AADKGSTQKAIDKITSK [SEQ ID MLCATDLGHPLIL TLPFHNISKYAFG VNNIIDKMNKQYEVIDH NO:26] DTCTIEGLIYGNP NCPKYVGVKSLKL EFNELEARLNMINNKID.
SCDILLGGKEWSY PVGLRNVPAVSSR DQIQDIWAYNAELLVLL IVERSSAVNGMC ENQKTLDEHDANVNNLY [SEQ ID NKVKRALGSNAVEDGNG [SEQ ID NO:438] CFELYHKCDDQCMETIR NO:422] NGTYDRQKYQEESRLER
QKIEGVKLESEGTYKIL TIYSTVASSLVLAMGE'A AFLFWAMSNGSCRCNIC I
Subtipo HA Segmento de Segmento de (Genbank Peptídeo Tronco Longo Tronco Longo No .} de Sinal N-terminal C-terminal Domínio HA2 HA1 FIAI [SEQ ID NO:74] H10 MYKVVVIIAL LDRICLGHHAVAN APSRVSKLTGRDL GLFGAIAGFIENGWEGM (M21647) LGAVKG GTIVKTLTNEQEE GIQSEALIDNSCE VDGWYGFRHQNAQGTGQ
VTNATETVESTNL SKCFWRGGSINTK AADYKSTQAAIDQITGK [SEQ ID NKLCMKGRSYKDL LPFQNLSPRTVGQ LNRLIEKTNTEFESIES NO:27] GNCHPVGMLIGTP CPKYVNQRSLLLA EFSETEHQIGNVINWTK
VCDPHLTGTWDTL TGMRNVPEVVQGR DSITDIWTYNAELLVAM IERENAIAHC ENQHTIDMADSEMLNLY [SEQ ID ERVRKQLRQNAEEDGKG [SEQ ID NO:439] CFEIYHTCDDSCMESIR NO:423] NNTYDHSQYREEALLNR
LNINPVKLSSGYKDIIL WFSFGESCFVLLAVVMG
LVFFCLKNGNMRCTICI [SEQ ID NO:75] Hll MEKTLLFAAI DEICÍGYLSNNST APRYAFEIVSVGN GLFGAIAGFIEGGWPGL (D90306) FLCVKA DKVDTIIENNVTV GKLFRSELNIESC INGWYGFQHRDEEGTGI
TSSVELVETEHTG STKCQTEIGGINT AADKESTQKAIDQITSK [SEQ ID SFCSINGKQPISL NKSFHNVHRNTIG VNNIVDRMNTNFESVQH NO:28] GDCSFAGWILGNP DCPKYVNVKSLKL EFSEIEERINQLSKHVD
MCDELIGKTSWSY ATGPRNVPAIASR DSVVDIWSYNAQLLVLL IVEKPNPTNGIC ENEKTLDLHDSNVRNLH [SEQ ID EKVRRMLKDNAKDEGNG [SEQ ID NO:440] CFTFYHKCDNKCIERVR NO:4241 NGTYDHKEFEEESKINR
QEIEGVKLDSSGNVYKI LSIYSCIASSLVLAALI MGFMFWACSNGSCRCTI
CI [SEQ ID NO:76J H12 MEKFIILSTV DKICIGYQTNNST APEYGHLITGKSH GLFGAIAGFIEGGWPGL (D90307) LAASFAY ETVNTLSEQNVPV GRILKNNLPMGQC VAGWYGFQHQNAEGTGI
TQVEELVHRGIDP VTECQLNEGVMNT AADRDSTQRAIDNMQNK [SEQ ID ILCGTELGSPLVL SKPFQNTSKHYIG LNNVIDKMNKQFEVVNH NO:29] DDCSLEGLILGNP KCPKYIPSGSLKL EFSEVESRINMINSKID
KCDLYLNGREWSY AIGLRNVPQVQDR DQITDIWAYNAELLVLL IVERPKEMEGVC ENQKTLDEHDANVRNLH [SEQ ID DRVRRVLRENAIDTGDG [SEQ ID NO:441] CFEILHKCDNNCMDTIR NO:425] NGTYNHKEYEEESKIER
QKVNGVKLEENSTYKIL SIYSSVASSLVLLLMII GGFIFGCQNGNVRCTFC
I [SEQ ID NO:77] H13 MALNVIATLT DRICVGYLSTNSS APRYGYIIEEYGK GLFGAIAGFIEGGWPGL (D90308) LISVCVHA ERVDTLLENGVPV GRIFQSRIRMSRC INGWYGFQHQNEQGTGI
Subtipo HA Segmento de Segmento de (Genbank Pegtídeo Tronco Longo Tronco Longo No.) de Sinal N-terminal C-terminal Dominic HA2 HAl HA1
TSSIDLIETNHTG NTKCQTSVGGINT AADKESTQKAIDQITTK [SEQ ID TYCSLNGVSPVHL NRTFQNIDKNALG INNIIDKMNGNYDSIRG NO:30] GDCSFEGWIVGNP DCPKYIKSGQLKL EFNQVEKRINMLADRID
ACTSNFGIREWSY ATGLRNVPAISNR DAVTDIWSYNAKLLVLL LIEDPAAPHGLC ENDKTLDMHDANVKNLH [SEQ ID EQVRRELKDNAIDEGNG [SEQ ID N0:442] CFELLHKCNDSCMETIR NO:426] NGTYDHTEYAEESKLKR
QEIDGIKLKSEDNVYKA LSIYSCIASSVVLVGLI LSFIMWACSSGNCRFNV
CI [SEQ ID NO:78] H14 MIALILVALA QITNGTTGNPIIC APRGHYKISKSTK GLFGAIAGFIENGWQGL (M35997) LSHTAYS LGHHAVENGTSVK STVLKSDKRIGSC IDGWYGFRHQNAEGTGT
TLTDNHVEVVSAK TSPCLTDKGSIQS AADLKSTQAAIDQINGK [SEQ ID ELVETNHTDELCP DKPFQNVSRIAIG LNRLIEKTNEKYHQIEK NO: 3l SPLKLVDGQDCHL NCPKYVKQGSLML EFEQVEGRIQDLEKYVE
INGALGSPGCDRL ATGMRNIPGKQAK DTKIDLWSYNAELLVAL QDTTWDVFIERPT ENQHTIDVTDSEMNKLF AVDTC [SEQ ID ERVRRQLRENAEDQGNG N0:443] CFEIFHQCDNNCIESIR [SEQ ID NGTYDHNIYRDEAINNR NO:427] IKINPVTLTMGYKDIIL
WISFSMSCFVFVALILG
FVLWACQNGNIRCQICI [SEQ ID NO:79] H15 MNTQIIVILV DKICLGHHAVANG APDRATFLRSNAP GLFGAIAGFIENGWEGL (L43917) LGLSMVKS TKVNTLTERGVEV SGIEYNGKSLGIQ IDGWYGFRHQNAQGQGT
VNATETVEITGID SDAQIDESCEGEC AADYKSTQAAIDQITGK [SEQ ID KVCTKGKKAVDLG FYSGGTINSPLPF LNRLIEKTNKQFELIDN NO:32] SCGILGTIIGPPQ QNIDSRAVGKCPR EFTEVEQQIGNVINWTR
CDLHLEFKADLII YVKQSSLPLALGM DSLTEIWSYNAELLVAM ERRNSSDIC KNVPEKIRTR ENQHTIDLADSEMNKLY
ERVRRQLRENAEEDGTG [SEQ ID [SEQ ID CFEIFHRCDDQCMESIR NO:428] NO:444] NNTYNHTEYRQEALQNR
IMINPVKLSSGYKDVIL WFSFGASCVMLLAIAMG
LIFMCVKNGNLRCTICI [SEQ ID NO:80] H16 MMIKVLYFLI DKICIGYLSNNSS'APRYGYIIEKYGT GLFGAIAGFIEGGWPGL (EÚ293865) IVLGRYSKA DTVDTLTENGVPV GRIFQSGVRMARC INGWYGFQHQNEQGTGI
TSSVDLVETNHTG NTKCQTSLGGINT AADKASTQKAINEITTK [SEQ ID TYCSLNGISPIHL NKTFQNIERNALG INNIIEKMNGNYDSIRG NO:33] GDCSFEGWIVGNP DCPKYIKSGQLKL EFNQVEKRINMLADRVD
SCATNINIREWSY ATGLRNVPSIGER DAVTDIWSYNAKLLVLL
Subtipo HA Segmento de Segmento de (Genbank peptíde o Tronco Longo Tronco Longo de Sinal N-terminal C-terminal Domínio HA2 No.) HAl HAs
LIEDPNAPNKFC ENDRTLDLHDANVRNLH [SEQ ID DQVKRALKSNAIDEGDG [SEQ ID N0:445] CFNLLHKCNDSCMETIR NO:429] NGTYNHEDYREESQLKR
QEIEGIKLKTEDNVYKV LSIYSCIASSIVLVGLI LAFIMWACSNGSCRFNV
CI [SEQ ID NO:811 H17 MELIVLLILL DRICIGYQANQNN APEYGFYYKRKEG GLFGAIAGFIEGGWQGM (CY103876) NPYTFVLG QTVNTLLEQNVPV KGGLMKSKLPISD IDGWYGYHHENQEGSGY
TGAQEILETNHNG CSTKCQTPLGALN AADKEATQKAVDAITNK KLCSLNGVPPLDL STLPFQNVHQQTI VNSIIDKMNSQFESNIK QSCTLAGWLLGNP GNCPKYVKATSLM EFNRLELRIQHLSDRVD NCDSLLEAEEWSY LATGLRNNPQMEG DALLDIWSYNTELLVLL IKINESAPDDLC R ENERTLDFHDANVKNLF, EKVKAQLKDNAIDEGNG CFLLLHKCNNSCMDDIK NGTYKYMDYREESHIEK QKIDGVKLTDYSRYYIM TLYSTIASSVVLGSLII AAFLWGCQKGSIQCKIC
I A Tabela 7A, abaixo, identifica os segmentos de tronco longo N-terminal HA1 úteis e os segmentos de tronco longos C-terminal HA1 dos polipeptídeos e métodos descritos aqui.
5 TABLE 7A. Sequências de Domínio de Tronco Longas de Hemaalutinina dt- TnfI „mn7= Subtipo HA Segmento de Tronco Longo N- Segmento de Tronco Longo C- (uannank Na.) terminal HA1 terminal HA1 H1 DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVT PMYAFALSRGFGSGIITSNASMHECNT PR8-H1N1 HSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGK KCQTPLGAINSSLPYQNIHPVTIGECP (EF467821.1) CNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVE KYVRSAKLRMVTGLRNNPSIQSR NÓ'Cys, Ala TPNSENGI [SEQ ID NO:494] [SEQ ID NO:446] H1 DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVT MYAFALSRGFGSGIITSNASMHECNTK PR8-H1N1 HSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGK CQTPLGAINSSLPYQNIHPVTIGECPK (EF467821.1) CNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVE YVRSAKLRMVTGLRNNPSIQSR No Cys, Ala TPNSENGI Al [SEQ ID Na:495] [SEQ ID NO:447]
291 / 6 48 Subtipo HA Segmento de Tronco Longo N- Segmento de Tronco Longo C- (Genbank No.) terminal HA1 terminal HAI Hl DTICIGYHANNSTDTVDTVLEKNVTVT YAFALSRGFGSGI1TSNASMHECNTKC PR8-H1N1 HSVNLLEDSHNGKLCRLKGIAPLQLGK QTPLGAINSSLPYQNIHPVTIGECPKY (EF467821.1) CNIAGWLLGNPECDPLLPVRSWSYIVE VRSAKLRMVTGLRNNPSIQSR No Cys, Ala TPNSENG 63 [SEQ ID NO:496] [SEQ ID NO:448] H2 DQICIGYHSNNSTEKVDTILERNVTVT PEYGERISKRGSSGIMKTEGTLENCET (L11136) HAQNILEKTHNGKLCKLNGIPPLELGD KCQTPLGAINTTLPFHNVHPLTIGECP No Cys, Ala CSIAGWLLGNPECDRLLTVPEWSYIME KYVKSERLVLATGLRNVPQIESR
KENPRNGL [SEQ ID NO:4971 [SEQ ID NO:449] H2 DQICIGYHSNNSTEKVDTILERNVTVT EYGF'RISKRGSSGIMKTEGTLENCETK )L11136) HAQNILEKTHNGKLCKLNGIPPLELGD CQTPLGAINTTLPFHNVHPLTIGECPK No Cys, Ala CSIAGWLLGNPECDRLLTVPEWSYIME YVKSERLVLATGLRNVPQIESR Al KEN PRNGL [SEQ ID NO:498) [SEQ ID NO:450] H2 DQICIGYHSNNSTEKVDTILERNVTVT YGFRISKRGSSGIMKTEGTLENCETKC (L11136) HAQNILEKTHNGKLCKLNGIPPLELGD QTPLGAINTTLPFHNVHPLTIGECPKY No Cys, Ala CSIAGWLLGNPECDRLLTVPEWSYIME VKSERLVLATGLRNVPQIESR A3 KENPRNG [SEQ ID NO:499] [SEQ ID NO:45I] H3 QDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVK PRGYFKMRTGKSSIMSSDAPIDTCISE HK68-H3N2 TI TDDQIEVTNATELVQSSSTGKI CNN CITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPK (EF409245) PHRILDGIDCTLIDALLGDPHCDVFQN YVKQNTLKLATGMRNVPEKQTR PDB: 1HGJ ETWDLFVERSKAFSN No Cys, Ala [SEQ ID NO:500] [SEQ ID NO:4521 H3 QDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVK RGYFKMRTGKSSIMSSDAPIDTCISEC HK68-H3N2 TITDDQIEVTNATELVQSSSTGKICNN ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPKY (EF409245) PHRILDGIDCTLIDALLGDPHCDVFQN VKQNTLKLATGMRNVPEKQTR PDB: 1HGJ ETWDLFVERSKAFSN No Cys, Ala [SEQ ID NO:501] Al [SEQ ID NC:453] H3 QDLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTLVK GYFKMRTGKSSIMSSDAPIDTCISECI HK68-H3N2 TITDDQIEVTNATELVQSSSTGKICNN TPNGSIPNDKPFQNVNKITYGACPKYV (5F'409245) PHRILDGIDCTLIDALLGDPFICDVFQN KQNTLKLATGMRNVPEKQTR PDB: 1HGJ ETWDLFVERSKAFS No Cys, Ala [SEQ ID NO:502] 13 [SEQ ID NO:454] H4 QNYTGNPVICMGHHAVANGTMVKTLAD PRGHYKLNNQKKSTILNTAIPIGSCVS (D90302) DQVEVVTAQELVESQNLPELCPSPLRL KCHTDKGSLSTTKPFQNISRIAVGDCP No Cys, Ala VDGQTCDIINGALGSPGCDHLNGAEWD RYVKQGSLKLATGMRNIPEKASR
VFIERPNAVDT [SEQ ID NO:503] [SEQ ID NO:455] H4 QNYTGNPVICMGHHAVANGTMVKTLAD RGHYKLNNQKKSTILNTAIPIGSCVSK
Subtipo HA Segmento de Tronco Longo N- Segmento de Tronco Longo C- (Genbank No.) terminal HAl terminal HA1 [D90302) DQVEVVTAQELVESQNLPELCPSPLRL CHTDKGSLSTTKPFQNISRIAVGDCPR No Cys, Ala VDGQTCDIINGALGSPGCDHLNGAEWD YVKQGSLKLATGMRNIPEKASR All VFIERPNAVDT [SEQ ID N0:5041 [SEQ ID NO:456] H4 QNYTGNPVICMGHHAVANGTMVKTLAD GHYKLNNQKKSTILNTAIPIGSCVSKC (D90302) DQVEVVTAQELVESQNLPELCPSPLRL HTDKGSLSTTKPFQNISRIAVGDCPRY No Cys, Ala VDGQTCDIINGALGSPGCDHLNGAEWD VKQGSLKLATGMRNIPEKASR a3 VFIERPNAVD [SEQ ID NO:505] [SEQ ID NO:4571 H5 DQICIGYHANKSTKQVDTIMEKNVTVT PRYAYKIVKKGDSAIMKSGLAYGNCDT (X07826) HAQDILERTHNGKLCSLNGVKPLILRD KCQTPVGEINSSMPFHNIHPHTIGECP No Cys, Ala CSVAGWLLGNPMCDEFLNLPEWLYIVE KYVKSDRLVLATGLRNVPQRKKR
KDNPINSL [SEQ ID NO:506} [SEQ ID NO:458] H5 DQICIGYHANKSTKQVDTIMEKNVTVT RYAYKIVKKGDSAIMKSGLAYGNCDTK {X07826) HAQDILERTHNGKLCSLNGVKPLILRD CQTPVGEINSSMPFHNIHPHTIGECPK No Cys, Ala CSVAGWLLGNPMCDEFLNLPEWLYIVE YVKSDRLVLATGLRNVPQRKKR Al KDNPINSL [SEQ ID NO:507] [SEQ ID NO:459] H5 DQICIGYHANKSTKQVDTIMEKNVTVT YAYKIVKKGDSAIMKSGLAYGNCDTKC (X07826) HAQDILERTHNGKLCSLNGVKPLILRD QTPVGEINSSMPFHNIHPHTIGECPKY No Cys, Ala CSVAGWLLGNPMCDEFLNLPEWLYIVE VKSDRLVLATGLRNVPQRKKR 63 KDNPINS [SEQ ID NO:508] [SEQ ID NO:460] H6 DKICIGYHANNSTTQIDTILEKNVTVT PWYAFRFVSTSNKGAVFKSNLPIENCD (D90303) HSVELLENQKEERFCKILKKAPLDLKG ATCQTVAGVLRTNKTFQNVSPLWIGEC No Cys, Ala CTIEGWILGNPQCDLLLGDQSWSYIVE PKYVKSESLRLATGLRNVPQIETR
RPTAQNGI [SEQ ID NO:509] [SEQ ID N0:461] H6 DKICIGYHANNSTTQIDTILEKNVTVT WYAFRFVSTSNKGAVFKSNLPIENCDA (D90303) HSVELLENQKEERFCKILKKAPLDLKG TCQTVAGVLRTNKTFQNVSPLWIGECP No Cys, Ala CTIEGWILGNPQCDLLLGDQSWSYIVE KYVKSESLRLATGLRNVPQIETR Al RPTAQNGI [SEQ ID NO:510] [SEQ ID NO:462] H6 DKICIGYHANNSTTQIDTILEKNVTVT YAFRFVSTSNKGAVFKSNLPIENCDAT (D90303) HSVELLENQKEERFCKILKKAPLDLKG CQTVAGVLRTNKTFQNVSPLWIGECPK No Cys, Ala CTIEGWILGNPQCDLLLGDQSWSYIVE YVKSESLRLATGLRNVPQIETR A3 RPTAQNG [SEQ ID NO:511] [SEQ ID NO:463] H7 DKICLGHHAVSNGTKVNTLTERGVEVV PNRASFLRGKSMGIQSDVQVDANCEGE (M24457) NATETVERTNIPKICSKGKRTTDLGQC CYHSGGTITSRLPFQNINSRAVGKCPR
293 / 6 48 Subtipo HA Segmento de Tronco Longo N- Segmento de Tronco Longo C- (Genbank No.) terminal HA]. terminal HAl No Cys, Ala GLLGTITGPPQCDQFLEFSADLIIERR YVKQESLLLATGMKNVPEPSKKRKKR
EGNDV [SEQ ID NO:512] [SEQ ID NO:464] H7 DKICLGHHAVSNGTKVNTLTERGVEVV NRASFLRGKSMGIQSDVQVDANCEGEC [M24457) NATETVERTNIPKICSKGKRTTDLGQC YHSGGTITSRLPFQNINSRAVGKCPRY, No Cys, Ala GLLGTITGPPQCDQFLEFSADLIIERR VKQESLLLATGMKNVPEPSKKRKKR Al EGNDV [SEQ ID NQ:513] [SEQ ID NC:4651 H7 DKICLGHHAVSNGTKVNTLTERGVEVV RASFLRGKSMGIQSDVQVDANCEGECY (M24457) NATETVERTNIPKICSKGKRTTDLGQC HSGGTITSRLPFQNINSRAVGKCPRYV No Cys, Ala GLLGTITGPPQCDQFLEFSADLIIER.R KQESLLLATGMKNVPEPSKKRKKR A3 EGND [SEQ ID NO:514] [SEQ ID N0:466] H8 DRICIGYQSNNSTDTVNTLIEQNVPVT PEFGYLLKGESYGRIIQNEDIPIGNCN (D90304) QTMELVETEKHPAYCNTDLGAPLELRD TKCQTYAGAINSSKPFQNASRHYMGEC No Cys, Ala CKIEAVIYGNPKCDIHLKDQGWSYIVE PKYVKKASLRLAVGLRNTPSVEPR
RPSAPEGM [SEQ ID N0:515] [SEQ ID NO:467] H8 DRICIGYQSNNSTDTVNTLIEQNVPVT EFGYLLKGESYGRIIQNEDIPIGNCNT [D90304) QTMELVETEKHPAYCNTDLGAPLELRD KCQTYAGAINSSKPFQNASRHYMGECP No Cys, Ala CKIEAVIYGNPKCDIHLKDQGWSYIVE KYVKKASLRLAVGLRNTPSVEPR Al RPSAPEGM [SEQ ID NO:516] [SEQ ID N0:4681 H8 DRICIGYQSNNSTDTVNTLIEQNVPVT FGYLLKGESYGRIIQNEDIPIGNCNTK [D90304) QTMELVETEKHPAYCNTDLGAPLELRD CQTYAGAINSSKPFQNASRHYMGECPK No Cys, Ala CKIEAVIYGNPKCDIHLKDQGWSYIVE YVKKASLRLAVGLRNTPSVEPR
RPSAPEG [SEQ ID NO:517] [SEQ ID NO:469] H9 DKICIGYQSTNSTETVDTLTESNVPVT PWYGHVLTGESHGRILKTDLNNGNCVV (D90305) HTKELLHTEHNGMLCATDLGHPLILDT QCQTEKGGLNTTLPFHNISKYAFGNCP No Cys, Ala CTIEGLIYGNPSCDILLGGKEWSYIVE KYVGVKSLKLPVGLRNVPAVSSR
RSSAVNGM [SEQ ID NO:518] [SEQ ID NO:470] H9 DKICIGYQSTNSTETVDTLTESNVPVT WYGHVLTGESHGRILKTDLNNGNCVVQ (D90305) HTKELLHTEHNGMLCATDLGHPLILDT CQTEKGGLNTTLPFHNISKYAFGNCPK No Cys, Ala CTIEGLIYGNPSCDILLGGKEWSYIVE YVGVKSLKLPVGLRNVPAVSSR Al RSSAVNGM [SEQ ID NO:519] [SEQ ID NO:471] H9 DKICIGYQSTNSTETVDTLTESNVPVT YGHVLTGESHGRILKTDLNNGNCVVQC [D903C5) HTKELLHTEHNGMLCATDLGHPLILDT QTEKGGLNTTLPFHNISKYAFGNCPKY No Cys, Ala CTIEGLIYGNPSCDILLGGKEWSYIVE VGVKSLKLPVGLRNVPAVSSR 63 RSSAVNG fSEO ID NC:5201
Subtipo HA Segmento de Tronco Longo N- Segmento de Tronco Longo C- (Genbank No.) terminal HA1 terminal HA1 [SEQ ID N0:4721 H10 LDRICLGHHAVANGTIVKTLTNEQEEV PSRVSKLTGRDLGIQSEALIDNSCESK (M21647) TNATETVESTNLNKLCMKGRSYKDLGN CFWRGGSINTKLPFQNLSPRTVGQCPK No Cys, Ala CHPVGMLIGTPVCDPHLTGTWDTLIÉR YVNQRSLLLATGMRNVPEVVQGR
ENAIAH [SEQ ID NO:521] [SEQ ID NO:473] H10 LDRICLGHHAVANGTIVKTLTNEQEEV SRVSKLTGRDLGIQSEALIDNSCESKC (M21647) TNATETVESTNLNKLCMKGRSYKDLGN FWRGCSINTKLPFQNLSPRTVGQCPKY No Cys, Ala CHPVGMLIGTPVCDPHLTGTWDTLIER VNQRSLLLATGMRNVPEVVQGR Al ENAIAH [SEQ ID NO:522] [SEQ ID NO:474] H10 LDRICLGHHAVANGTIVKTLTNEQEEV RVSKLTGRDLGIQSEALIDNSCESKCF (M21647) TNATETVESTNLNKLCMKGRSYKDLGN WRGGSINTKLPFQNLSPRTVGQCPKYV No Cys, Ala CHPVGMLIGTPVCDPHLTGTWDTLIER NQRSLLLATGMRNVPEVVQGR 63 ENAIA [SEQ ID NO:523] [SEQ ID NO:475] H11 DEICIGYLSNNSTDKVDTIIENNVTVT PRYAFEIVSVGNGKLFRSELNIESCST [D90306) SSVELVETEHTGSFCSINGKQPISLGD KCQTEIGGINTNKSFHNVHRNTIGDCP No Cys, Ala CSFAGWILGNPMCDELIGKTSWSYIVE KYVNVKSLKLATGPRNVPAIASR
KPNPTNGI [SEQ ID NO:524] [SEQ ID NO:476] flu I DEICIGYLSNNSTDKVDTIIENNVTVT RYAFEIVSVGNGKLFRSELNIESCSTK (D90306) SSVELVETEHTGSFCSINGKQPISLGD CQTEIGGINTNKSFHNVHRNTIGDCPK No Cys, Ala CSFAGWILGNPMCDELIGKTSWSYIVE YVNVKSLKLATGPRNVPAIASR Al KPNPTNGI [SEQ ID N0:525] [SEQ ID NO:477] H11 DEICIGYLSNNSTDKVDTIIENNVTVT YAFEIVSVGNGKLFRSELNIESCSTKC (D90306) SSVELVETEHTGSFCSINGKQPISLGD QTEIGGINTNKSFHNVHRNTIGDCPKY No Cys, Ala CSFAGWILGNPMCDELIGKTSWSYIVE VNVKSLKLATGPRNVPAIASR ~3 KPNPTNG [SEQ ID NO:526] [SEQ ID NO:478] H12 DKICIGYQTNNSTETVNTLSEQNVPVT PEYGHLITGKSHGRILKNNLPMGQCVT (D90307) QVEELVHRGIDPILCGTELGSPLVLDD ECQLNEGVMNTSKPFQNTSKHYIGKCP No Cys, Ala CSLEGLILGNPKCDLYLNGREWSYIVE KYIPSGSLKLAIGLRNVPQVQDR
RPKEMEGV [SEQ IID NO:527] [SEQ ID NO:479] H12 DKICIGYQTNNSTETVNTLSEQNVPVT EYGHLITGKSHGRILKNNLPMGQCVTE (D90307) QVEELVHRGIDPILCGTELGSPLVLDD CQLNEGVMNTSKPFQNTSKHYIGKCPK No Cys, Ala CSLEGLILGNPKCDLYLNGREWSYIVE YIPSGSLKLAIGLRNVPQVQDR Al RPKEMEGV [SEQ ID NO:528] [SEQ ID NO:480
Subtipo HA Segmento de Tronco Longo N- ' Segmento gmento de Tronco Longo C- (Genbank No.) terminal HA1 terminal HAl H12 DKICIGYQTNNSTETVNTLSEQNVPVT YGHLITGKSHGRILKNNLPMGQCVTEC (D90307) QVEELVHRGIDPTLCGTELGSPLVLDD QLNEGVMNTSKPFQNTSKHYIGKCPKY No Cys, Ala CSLEGLILGNPKCDLYLNGREWSYIVE IPSGSLKLAIGLRNVPQVQDR d3 RPKEMEG [SEQ ID NO:529] [SEQ ID NC:481] H13 DRICVGYLSTNSSERVDTLLENGVPVT PRYGYIIEEYGKGRIFQSRIRMSRCNT (D90308) SSIDLIETNHTGTYCSLNGVSPVHLGD KCQTSVGGINTNRTFQNIDKNALGDCP No Cys, Ala CSFEGWIVGNPACTSNFGIREWSYLIE KYIKSGQLKLATGLRNVPAISNR
DPAAPHGL [SEQ ID N0:530] [SEQ ID NO:482] H13 DRICVGYLSTNSSERVDTLLENGVPVT RYGYIIEEYGKGRIFQSRIRMSRCNTK (D90308) SSIDLIETNHTGTYCSLNGVSPVHLGD CQTSVGGINTNRTFQNIDKNALGDCPK No Cys, Ala CSFEGWIVGNPACTSNFGIREWSYLIE YIKSGQLKLATGLRNVPAISNR 61 DPAAPHGL [SEQ ID N0:531] [SEQ ID NO:483] H13 DRICVGYLSTNSSERVDTLLENGVPVT YGYIIEEYGKGRIFQSRIRMSRCNTKC (D90308} SSIDLIETNHTGTYCSLNGVSPVHLGD QTSVGGINTNRTFQNIDKNALGDCPKY No Cys, Ala CSFEGWIVGNPACTSNFGIREWSYLIE IKSGQLKLATGLRNVPAISNR A3 DPAAPHG [SEQ ID NO:532] [SEQ ID NO:4841 H14 QITNGTTGNPIICLGHHAVENGTSVKT PRGHYKISKSTKSTVLKSDKRIGSCTS (M35997) LTDNHVEVVSAKELVETNHTDELCPSP PCLTDKGSIQSDKPFQNVSRIAIGNCP No Cys, Ala LKLVDGQDCHLINGALGSPGCDRLQDT KYVKQGSLMLATGMRNIPGKQAK
TWDVFIERPTAVDT [SEQ ID NO:533] [SEQ ID NO:485] H14 QITNGTTGNPIICLGHHAVENGTSVKT RGHYKISKSTKSTVLKSDKRIGSCTSP (M35997) LTDNHVEVVSAKELVETNHTDELCPSP CLTDKGSIQSDKPFQNVSRIAIGNCPK No Cys, Ala LKLVDGQDCHLINGALGSPGCDRLQDT YVKQGSLMLATGMRNIPGKQAK 61 TWDVFIERPTAVDT [SEQ ID N0:534] [SEQ ID NO:486[ H14 QITNGTTGNPIICLGHHAVENGTSVKT GHYKISKSTKSTVLKSDKRIGSCTSPC (M35997) LTDNHVEVVSAKELVETNHTDELCPSP LTDKGSIQSDKPFQNVSRIAIGNCPKY No Cys, Ala LKLVDGQDCHLINGALGSPGCDRLQDT VKQGSLMLATGMRNIPGKQAK 15 3 TWDVFIERPTAVD [SEQ ID NC:535] [SEQ ID NO:487] H15 DKICLGHHAVANGTKVNTLTERGVEVV PDRATFLRSNAPSGIEYNGKSLGIQSD (L43917) NATETVEITGIDKVCTKGKKAVDLGSC AQIDESCEGECFYSGGTINSPLPFQNI No Cys, Ala GILGTIIGPPQCDLHLEFKADLIIERR DSRAVGKCPRYVKQSSLPLALGMKNVP
NSSDI EKIRTR [SEQ ID N0:488] [SEQ ID N0:536] H15 DKICLGHHAVANGTKVNTLTERGVEVV DRATFLRSNAPSGIEYNGKSLGIQSDA
Subtipo HA Segmento de Tronco Longo N- Segmento de Tronco Longo C- (Genbank No_) terminal HA1 terminal HA1 (L43917) NATETVEITGIDKVCTKGKKAVDLGSC QIDESCEGECFYSGGTINSPLPFQNID No Cys, Ala GILGTIIGPPQCDLHLEFKADLIIERR SRAVGKCPRYVKQSSLPLALGMKNVPE 61 NSSDI KIRTR [SEQ ID NO:489] [SEQ ID NO:537] H15 DKICLGHHAVANGTKVNTLTERGVEVV RATFLRSNAPSGIEYNGKSLGIQSDAQ (L43917) NATETVEITGIDKVCTKGKKAVDLGSC IDESCEGECFYSCGTINSPLPFQNIDS No Cys, Ala GILGTIIGPPQCDLHLEFKADLIIERR RAVGKCPRYVKQSSLPLALGMKNVPEK a3 NSSD IRTR [SEQ ID N0:490] [SEQ ID NO:538] H16 DKICIGYLSNNSSDTVDTLTENGVPVT PRYGYIIEKYGTGRIFQSGVRMARCNT (EÚ293865) SSVDLVETNHTGTYCSLNGISPIHLGD KCQTSLGGINTNKTFQNIERNALGDCP No Cys, Ala CSFEGWIVGNPSCATNINIREWSYLIE KYIKSGQLKLATGLRNVPSIGER
DPNAPNKF [SEQ ID NO:539] [SEQ ID NO 491] H16 DKICIGYLSNNSSDTVDTLTENGVPVT RYGYIIEKYGTGRIFQSGVRMARCNTK {EÚ293865) SSVDLVETNHTGTYCSLNGISPIHLGD CQTSLGGINTNKTFQNIERNALGDCPK No Cys, Ala CSFEGWIVGNPSCATNINIREWSYLIE YIKSGQLKLATGLRNVPSIGER ©1 DPNAPNKF [SEQ ID NO:540] [SEQ ID NO:492] H16 DKICIGYLSNNSSDTVDTLTENGVPVT YGYIIEKYGTGRIFQSGVRMARCNTKC (E0293865) SSVDLVETNHTGTYCSLNGISPIHLGD QTSLGGINTNKTFQNIERNALGDCPKY No Cys, Ala CSFEGWIVGNPSCATNINIREWSYLIE IKSGQLKLATGLRNVPSIGER 63 DPNAPNK [SEQ ID N0:541] [SEQ ID N0:493] H17 DRICIGYQANQNNQTVNTLLEQNVPVT PEYGFYYKRKEGKGGLMKSKLPISDCS (CY103876) GAQEILETNHNGKLCSLNGVPPLDLQS TKCQTPLGALNSTLPFQNVHQQTIGNC No Cys, Ala CTLAGWLLGNPNCDSLLEAEEWSYIKI PKYVKATSLMLATGLRNNPQMEGR
NESAPDDL Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco longo de herimagluLiiiiná de vírus influenza compreendem um ou mais ep topos imunogênicos na estrutura terciária ou quaternária de um polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo N-terminal HA1 compreende o sequência de aminoácido A17-AI g-•(Xaa) ,,-A38 (SEQ ID NO: 146), em que
A17 é Y ou H; A1e é H, L, ou Q; (Xaa)„ representa uma sequência de 18-20 resíduos de aminoácido; e 5 A38 é H, S, Q, T ou N.
Em determinadas modalidades, o segmento de tronco longo C-terminal HAl compreende a sequência de aminoácido A291-A292 (SEQ ID NO: 147) , em que A291 é T, S, N, D, P ou K; e l0 A292 é L, H, K ou R.
Em determinadas modalidades, o domínio HA2 compreende a sequência de aminoácido A18 -A19-A20 -A 21 (SEQ ID NO:148), em que Ale é V ou I; 15 A19 é D, N ou A; A20 é G, e A21 é W. Em determinadas modalidades, o domínio HA2 compreende a sequência de aminoácido A39 -A39-A4 0-A41-A42 -A43-- 20 A44 -A45-A46-A97-A48-A49-Aso-Asl-A52-AS3-AS4-Ass -A56 (SEQ ID NO: 14 9) , em que A3e é K, Q, R, L ou Y; A39 é qualquer resíduo de aminoácido; A40 é qualquer resíduo de aminoácido; 25 A41 é T; A42 é Q; A43 é qualquer resíduo de aminoácido; A94 é A; A45 é I; 30 A 46 é D;
A47 é qualquer resíduo de aminoácido; A48 é I, V ou M; A49 é Tr Q ou N; A50 é qualquer resíduo de aminoácido; 5 Asp. é N; A52 é V ou L; A53 é N; A54 é qualquer resíduo de aminoácido; A55 é V, 1 ou L; e 10 A56 é V ou I.
Em determinadas modalidades, os polipeptideos de domínio de tronco de influenza compreendem duas sequências de aminoácido selecionadas a partir de SEQ ID NOS:146-149.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de 15 tronco de influenza compreendem três sequências de A aminoácido selecionadas a partir de SEQ ID NOS:146-149. Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco de influenza compreendem quatro sequências de aminoácido selecionadas a partir de SEQ ID NOS:146-149. 20 Como ilustrado nas Figuras 1 e 2, os segmentos de tronco longo N-terminal HAl compartilham a identidade de sequência entre influenza A e influenza B e adicionalmente através de subtipos de influenza A. Similarmente, os segmentos de tronco longos C-terminal HAl também 25 compartilham a identidade de sequência entre influenza A e influenza B e adicionalmente através de subtipos de influenza A. Ademais, os domínios HA2 também compartilham a identidade de sequência entre influenza A e influenza B e adicionalmente através de subtipos de influenza A.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza é um polipeptídeo híbrido que compreende ou consiste essencialmente em segmentos e/ou domínios de uma 5 pluralidade de cepas ou subtipos de influenza. Por exemplo, um polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza pode compreender segmentos de tronco longos N-terminal HA1 e C-terminal HAl de subtipos de HA de vírus influenza A diferentes. Em algumas modalidades, o segmento de tronco longo N-terminal HAl pertence ao vírus influenza A enquanto o segmento de tronco longo C-terminal HAl pertence ao vírus influenza B. Similarmente, HA2 também pode pertencer ao vírus influenza A enquanto o segmento de tronco longo N-terminal e/ou C-terminal HA1 pertence ao vírus influenza B.
Será entendido que qualquer combinação dos elementos de sequência listados nas Tabelas 2-4, 6, 6a ou os 'variantes desses podem ser usados para formar os polipeptídeos de domínio de tronco longos HA de hemaglutinina da presente invenção.
Em um polipeptídeo de domínio de tronco de influenza fornecido aqui, um ligante conecta covalentemente o segmento de tronco longo N-terminal HAl ao segmento de tronco longo C-terminal HAl. b ligante pode ser qualquer ligante considerado adequado por um elemento versado na técnica que inclui, mas sem se limitar a, aqueles ligantes descritos aqui.
Em determinadas modalidades, os polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza são capazes de formar uma estrutura tridimensional que é similar à estrutura tridimensional do domínio de tronco de uma hemaglutinina de vírus influenza nativa. A similaridade estrutural pode ser avaliada com base em qualquer técnica considerada adequada pelos elementos versados na técnica 5 inclusive, mas sem se limitar a, aquelas técnicas descritas aqui.
Em determinadas modalidades, qualquer polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza fornecido aqui pode compreender ainda um ou mais domínios de polipeptídeo considerados adequados para os elementos versados na técnica. Os domínios de polipeptídeo úteis incluem domínios que facilitam a purificação, enovelamento e clivagem de porções de um polipeptídeo. Por exemplo, um tag de His (His-His-His-His- His-His, SEQ ID NO:166), epítopo FLAG ou outro tag de purificação pode facilitar a purificação de um polipeptídeo fornecido aqui. Em algumas modalidades, o tag de purificação é um tag de His, que possui a sequência, (His)n, em que n é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 16, 17, 18, 19, 20 ou mais.
Qualquer domínio de trimerização, inclusive um foldon de fibritina do bacteriófago T4 pode facilitar a trimerização de polipeptídeos fornecidos aqui. Em algumas modalidades, o domínio de trimerização compreende uma repetição de trimerização heptavalente GCN4pII tipo selvagem ou uma repetição de trimerização heptavalente GCN4pII modificada que permite a formação de bobinas enroladas triméricas ou totraméricas. Veja, por exemplo, Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. 0 domínio foldon pode ter qualquer sequência de foldon conhecida pelos elementos versados na técnica (veja, por exemplo, Papanikolopoulou et ai., 2004, J. Biol. Chem. 2i9(10):8991- 8998, cujos conteúdos estão aqui incorporados a título de referência em sua totalidade. Exemplos incluem 5 GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL (SEQ ID NO:167). Um domínio foldon pode ser útil para facilitar a trimerização de polipeptídeos solúveis fornecidos aqui. Os sítios de clivagem podem ser usados para facilitar a clivagem de uma porção de um polipeptídeo, por exemplo, a clivagem de um tag de purificação ou domínio foldon ou ambos. Os sítios de clivagem úteis incluem um sítio de clivagem de trombina, por exemplo, um com a sequência LVPRGSP (SEQ ID NO:168). Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem é um sítio de clivagem reconhecido por protease de Vírus Etch do Tabaco (TEV) (por exemplo, sequência de aminoácido Glu-Asn-Leu- Tyr-Phe-Gln-(Gly/Ser)).
Em determinadas modalidades, proporcionam-se polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem um sítio de clivagem de elastase como descrito aqui. Em particular modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que compreendem qualquer uma das SEQ ID NOS:430-445 em que o resíduo de aminoácido C-terminal, por exemplo arginina ou usina, de SEQ ID NOS:430-445 é substituído por um resíduo de valina.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que são resistentes à clivagem de protease na junção entre HA1 e HA2. Os elementos versados na técnica devem reconhecer que a Arg-Gly sequência que abrange HAl e HA2 é um sítio de reconhecimento de tripsina e é tipicamente clivado para a ativação de hemaglutinina. Visto que os polipeptídeos de domínio de tronco descritos aqui não precisam ser ativados, proporcionam-se aqui 5 polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que são resistentes à clivagem de protease. Em determinadas modalidades, proporciona qualquer polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui em que o sítio de protease que abrange HA1 e HA2 é modificado para uma sequência que é resistente à clivagem de protease. Em determinadas modalidades, proporciona-se qualquer polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui em que o resíduo C-terminal do segmento de tronco longo C-terminal HA1 é qualquer resíduo exceto Lys ou Arg. Em determinadas modalidades, proporciona-se qualquer polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui em que o resíduo N-terminal do domínio HA2 é prolina. Em determinadas modalidades, proporciona-se qualquer polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui em que o resíduo C-terminal do segmento de tronco longo C-terminal HAl é Ala e o resíduo N-terminal do domínio HA2 também é Ala. Em determinadas modalidades, proporciona-se qualquer polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza descrito aqui em que o resíduo N-terminal do domínio HA2 é qualquer resíduo exceto glicina.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptideos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco longo N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante,
por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C-terminal HA1 em associação de ligação com um
5 domínio de tronco HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco longo N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C-terminal HA1, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco longo N- terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C - terminal HA1, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2. Em determinadas modalidades, o ligante é uma cabeça globular, ou um fragmento dessa, a partir de um virus influenza heterólogo ao domínio de tronco de influenza.
Em determinadas modalidades, o ligante é uma cabeça globular, ou um fragmento dessa, a partir de um vírus influenza heterólogo ao domínio de tronco da subunidade HA2 do polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico.
Em determinadas modalidades, o ligante é uma cabeça globular, ou um fragmento dessa, a partir de um vírus influenza heterólogo ao domínio de tronco da subunidade HA1 e/ou HA2 da hemaglutinina de vírus influenza quimérico.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco longo N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, 5 por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C-terminal HA1 em associação de ligação com um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptideos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco longo N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C-terminal HAl, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco longo N- terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C-
terminal HAl, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2. Em determinadas modalidades, o ligante é uma cabeça globular, ou um fragmento dessa, a partir de um vírus influenza heterólogo ao domínio de tronco de influenza.
Em determinadas modalidades, o ligante é uma cabeça globular, ou um fragmento dessa, a partir de um vírus influenza heterólogo ao domínio de tronco da subunidade HA2 da hemaglutinina.
Em determinadas modalidades, o ligante é uma cabeça globular, ou um fragmento dessa, a partir de um vírus influenza heterólogo ao domínio de tronco da subunidade HAl e/ou HA2 da hemaglutinina. 5 Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco longo N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C-terminal HA1 em associação de ligação com um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado, em sequência, a um sítio de clivagem, um domínio de trimerização e um tag de purificação.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco longo N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C-
terminal HAl, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado, em sequência, a um sítio de clivagem, um domínio de trimerização e um tag de purificação.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptideos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco longo N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C-terminal HA1, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado, em sequência, a um sítio de clivagem,
um domínio de trimerização e um tag de purificação.
Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem de protease é um sítio de clivagem de trombina.
Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem possui a sequência de 5 aminoácido LVPRGSP (SEQ ID NO:168). Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem é um sítio de clivagem reconhecido por protease de Vírus Etch do Tabaco (TEV) (por exemplo, sequência de aminoácido Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-
(Gly/Ser)). Em determinadas modalidades, o domínio de trimerização é um domínio foldon, Em algumas modalidades, o domínio de trimerização compreende uma repetição de trimerização heptavalente GCN4pII tipo selvagem ou uma repetição de trimerização heptavalente GCN4pII modificada que permite a formação de bobinas enroladas triméricas ou tetraméricas.
Veja, por exemplo, Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. Em algumas modalidades, o tag de purificação é um tag de His, que possui a sequência, (His)n,
em que n é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais. 20 Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptideos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco longo N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C-terminal HA1 em associação de ligação com um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é covalentemente ligado, em sequência, a um sítio de clivagem, um domínio de trimerização e um tag de purificação.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco longo N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C- 5 terminal HA1, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é covalentemente ligado, em sequência, a um sítio de clivagem, a domínio de trimerização e um tag de purificação.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptideos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco longo N-terminal HA1 covalentemente ligado a uni ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C-terminal HAl, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é covalentemente ligado, em sequência, a um sítio de clivagem, a domínio de trimerização e um tag de purificação.
Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem de protease é um sítio de clivagem de trombina.
Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem de possui a sequência de aminoácido LVPRGSP (SEQ ID ND:168). Em determinadas modalidades, o sítio de clivagem é um sítio de clivagem reconhecido por protease de Vírus Etch do Tabaco (TEV) (por exemplo, sequência de aminoácido Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-
(Gly/Ser)). Em determinadas modalidades, o domínio de trimerização é um domínio foldon.
Em algumas modalidades, o domínio de trimerização compreende uma repetição de trimerização heptavalente GCN4pII tipo selvagem ou uma repetição de trimerização heptavalente CCN4pII modificada que permite a formação de bobinas enroladas triméricas ou tetraméricas. Veja, por exemplo, Weldon et al., 2010, PLoSONE 5(9): e12466. Em algumas modalidades, o tag de 5 purificação é um tag de His, que possui a sequência, (His)n, em que n é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco longo N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C-terminal HAl em associação de ligação com um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio de transmembrana HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco longo N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C- terminal HAl, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio de transmembrana HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco longo N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C-terminal HAl, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio de transmembrana 5 HA2.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco longo N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, 10 por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C-terminal HAl em associação de ligação com um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio de transmembrana HA2 que é por sua vez 15 covalentemente ligado a um domínio citoplásmico HA2. Em • determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consistem em um segmento de tronco longo N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, 20 por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C-terminal HAl, por sua vez covalen-emente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio de transmembrana HA2 que é por sua vez 25 covalentemente ligado a um domínio citoplásmico HA2. Em determinadas modalidades, proporcionam-se aqui polipeptídeos de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que consiste em um peptídeo de sinal covalentemente ligado a um segmento de tronco longo N- 30 terminal HAl covalentemente ligado a um ligante, por sua vez covalentemente ligado a um segmento de tronco longo C- terminal HA1, por sua vez covalentemente ligado a um domínio de tronco HA2 que é covalentemente ligado a um domínio luminal HA2 que é por sua vez covalentemente ligado 5 a um domínio de transmembrana HA2 que é por sua vez covalentemente ligado a um domínio citoplásmico HA2.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: (SEQ ID NO:414)-LL-(SEQ ID NO:430)-(SEQ ID NO:66), (SEQ ID NO:415)-LL-(SEQ ID NO:431)-(SEQ ID NO:67), (SEQ ID NO:416)-LL-(SEQ ID NO:432)-(SEQ ID NC:68), (SEQ ID NO:417)-LL-(SEQ ID NO:433)-(SEQ ID NO:69), 15 (SEQ ID NO:418)-LL-(SEQ ID NC:434)-(SEQ ID NO:70), (SEQ ID NO:419)-LL-(SEQ ID NO:435)-(5EQ ID N0:71), (SEQ ID NO:420)-LL-(SEQ ID NO:436)-(SEQ ID NO:72), (SEQ ID NO:421)-LL-(SEQ ID NO:437)-(SEQ ID NO:73), (SEQ ID NO:422)-LL-(SEQ ID NO:438)-(SEQ ID NO:74), 20 (SEQ ID NO:423)-LL-(SEQ ID NO:439)-(SEQ ID NO:75), (SEQ ID NO:424)-LL-(SEQ ID NO:440)-(SEQ ID NO:76), (SEQ ID NO:425)-LL-(SEQ ID NO:441)-(SEQ ID NO:77), (SEQ ID NO:426)-LL-(SEQ ID NO:442)-(SEQ ID NO:78), (SEQ ID NO:427) -LL- (SEQ ID NO:443) - (SEQ ID NO:79) , 25 (SEQ ID NO:428)-LL-(SEQ ID NO:444)-(SEQ ID NO:80), e (SEQ ID NO:429)-LL-(SEQ ID NO:445)-(SEQ ID NO:81), em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um ligante como descrito aqui. Em particular, os segmentos de tronco longos C-terminal HAl podem ser covalente ou não- covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly,
5 Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n (em que n é qualquer número de resíduos de Glicina desde que haja flexibilidade no ligante peptídico; em determinadas modalidades, n é 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 resíduos de Glicina), Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA
(SEQ ID NO:165) e Asn-Ala-Ser. 10 Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em:
(SEQ ID NO:414)-LL-(SEQ ID NO:430)-(SEQ ID N0:82), 15 (SEQ ID NO:415)-LL-(SEQ ID NO:431)-(SEQ ID NO:83),
(SEQ ID NO:416)-LL-(SEQ ID NO:432)-(SEQ ID NO:84), (SEQ ID NO:417)-LL-(SEQ ID NO:433)-(SEQ ID NO:85), (SEQ ID NO:418)-LL-(SEQ ID NO:434)-(SEQ ID NO:86), (SEQ ID NO:419)-LL-(SEQ ID NO:435)-(SEQ ID NO:87), 20 (SEQ ID NO:420)-LL-(SEQ ID NO:436)-(SEQ ID NO:88),
(SEQ ID NO:421)-LL-(SEQ ID NO:437)-(SEQ ID NO:89), (SEQ ID NO:422)-LL-(SEQ ID N0:438)-(SEQ ID NO:90), (SEQ ID NO:423)-LL-(SEQ ID NO:439)-(SEQ TD NO:91),
(SEQ ID NO:424)-LL-(SEQ ID NO:440)-(SEQ ID NO:92), 25 (SEQ ID NO:425)-LL-(SEQ ID NO:441)-(SEQ ID NO:93),
(SEQ ID NO:426)-LL-(SEQ ID NO:442)-(SEQ ID NO:94),
(SEQ ID NO:427)-LL-(SEQ ID NO:443)-(SEQ ID NO:95), (SEQ ID NO:428)-LL-(SEQ ID NO:444)-(SEQ ID NO:96), e 30 (SEQ ID NO:429)-LL-(SEQ ID NC:445)-(SEQ ID NO:97),
em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um ligante como descrito aqui.
Em particular, os segmentos de tronco longos C-terminal HA1 podem ser covalente ou não- 5 covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala-Ser.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: (SEQ ID NO:414)-LL-(SEQ ID NO:430)-(SEQ ID N©:82)-(SEQ ID NO:98),
(SEQ ID NO:415)-LL-(SEQ ID NO:431)-(SEQ ID NO:83)-(SEQ ID NO:99),
(SEQ ID NO:416)-LL-(SEQ ID NO:432)-(SEQ ID NO:84)-(SEQ ID NO:100), (SEQ ID NO:417)-LL-(SEQ ID NO:433)-(SEQ ID NO:85)-(SEQ ID NO:101),
(SEQ ID NO:418)-LL-(SEQ ID NO:434)-(SEQ ID NO:86)-(SEQ ID NO:102),
(SEQ ID NO:419)-LL-(SEQ ID NO:435)-(SEQ ID NO:87)-(SEQ ID NO:103),
(SEQ ID NO:420)-LL-(SEQ ID NO:436)-(SEQ ID NO:88)-(SEQ ID NO:104),
(SEQ ID NO:421)-LL-(SEQ ID NO:437)-(SEQ ID NO:89)-(SEQ ID N0:105),
(SEQ ID NO:422)-LL-(SEQ ID NO:438)-(SEQ ID NO:90)-(SEQ ID NO:106), (SEQ ID NO:423)-LL-(SEQ ID NO:439)-(SEQ ID NO:91)-(SEQ ID NO:107), 5 (SEQ ID NO:424)-LL-(SEQ ID NO:440)-(SEQ ID NO:92)-(SEQ ID NO:108), (SEQ ID NO:425)-LL-(SEQ ID NO:441)-(SEQ ID NO:93)-(SEQ ID NO:109), (SEQ ID NO:426)-LL-(SEQ ID NO:442)-(SEQ ID NO:94)-(SEQ ID NO:110), (SEQ ID NO:427)-LL-(SEQ ID NO:443)-(SEQ ID NO:95)-(SEQ ID NO:111), (SEQ ID NO:428)-LL-(SEQ ID NO:444)-(SEQ ID NO:96)-(SEQ ID NO:112), e (SEQ ID NO:429)-LL-(sEQ ID NO:445)-(SEQ ID NO:97)-(SEQ ID NO:113), em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um ligante como descrito aqui. Em particular, os segmentos de tronco longos C-terminal HA1 podem ser covalente ou não- covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly) n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala-Ser.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em:
(SEQ ID NO:414)-LL-(SEQ ID NO:430)-(SEQ ID NO:82)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:415)-LL-(SEQ ID NO:431)-(SEQ ID NO:83)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), 5 (SEQ ID NO:416)-LL-(SEQ ID NO:432)-(SEQ ID
NO:84)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:417)-LL-(SEQ ID NO:433)-(SEQ ID NO:85)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:418)-LL-(SEQ ID NO:434)-(SEQ ID 10 NO:86)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:419)-LL-(SEQ ID NO:435)-(SEQ ID NO:87)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:420)-LL-(SEQ ID NO:436)-(SEQ ID NO:88)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), 15 (SEQ ID NO:421)-LL-(SEQ ID NO:437)-(SEQ ID NO:89)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:422)-LL-(SEQ ID NO:438)-(SEQ ID NO:90)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:423)-LL-(SEQ ID NO:439)-(SEQ ID 20 NO:91)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:424)-LL-(SEQ ID NO:440)-(SEQ ID NO:92)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:425)-LL-(SEQ ID NO:441)-(SEQ ID NO:93)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), 25 (SEQ ID NO:426)-LL-(SEQ ID NO:442)-(SEQ ID
NO:94)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:427)-LL-(SEQ ID NO:443)-(SEQ ID NO:95)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:428)-LL-(SEQ ID NO:444)-(SEQ ID 30 NO:96)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), e
(SEQ ID NO:429)-LL-(SEQ ID NO:445)-(SEQ ID NO:97)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um 5 ligante como descrito aqui. Em particular, os segmentos de tronco longos C-terminal HA1 podem ser covalente ou não- covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, 10 Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala-Ser.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de vírus influenza que possui uma sequência selecionada a 15 partir do grupo que consiste em: (SEQ ID NO:414)-LL-(SEQ ID NO:430)-(SEQ ID NO:82)-(SEQ ID NO:98)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:415)-LL-(SEQ ID NO:431)-(SEQ ID 20 NO:83)-(SEQ ID NO:99)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:416)-LL-(SEQ ID NO:432)-(SEQ ID NO:84)-(SEQ ID NO:100)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), 25 (SEQ ID NO:417)-LL-(SEQ ID NO:433)-(SEQ ID NO:85)-(SEQ ID NO:101)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), (SEQ ID NO:418)-LL-(SEQ ID NO:434)-(SEQ ID NO:86)-(SEQ ID NO:102)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ 30 ID NO:166),
(SEQ ID NO:419)-LL-(SEQ ID NO:435)-(SEQ ID NO:87)-(SEQ ID NO:103)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:420) -LL- (SEQ ID NO: 436) -(SEQ ID 5 N0:88)-(SEQ ID NO:104)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:421)-LL-(SEQ ID NO:437)-(SEQ ID NO:89)-(SEQ ID NO:105)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ
ID NO:166), (SEQ ID NO:422)-LL-(SEQ ID NO:438)-(SEQ ID NO:90)-(SEQ ID NO:106)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:423)-LL-(SEQ ID NO:439)-(SEQ ID NO:91)-(SEQ ID NO:107)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID N0:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:424)-LL-(SEQ ID NO:440)-(SEQ ID NO:92)-(SEQ ID NO:108)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:425)-LL-(SEQ ID NO:441)-(SEQ ID NO:93)-(SEQ ID NO:109)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166),
(SEQ ID NO:426)-LL-(SEQ ID NO:442)-(SEQ ID NO:94)-(SEQ ID NO:110)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ
ID NO:166), (SEQ ID NO:427)-LL-(SEQ ID NO:443)-(SEQ ID NO:95)-(SEQ ID NO:111)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ
ID NO:166),
(SEQ ID NO:428)-LL-(SEQ ID NO:444)-(SEQ ID NO:96)-(SEQ ID NO:112)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ T , ID NO:166), e
(SEQ ID NO:429)-LL-(SEQ ID NO:445)-(SEQ ID NO:97)-(SEQ ID NO:113)-(SEQ ID NO:168)-(SEQ ID NO:167)-(SEQ ID NO:166), em que cada sequência acima está ligada à 5 sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um ligante como descrito aqui. Em particular, os segmentos de tronco longos C-terminal HAI podem ser covalente ou não- covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPEQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala-Ser.
Em determinadas modalidades, proporciona-se aqui um polipeptídeo de domínio de tronco longo de hemaglutinina de virus influenza que possui uma sequência selecionada a partir do grupo que consiste em: (SEQ ID NO:446)-LL-(SEQ ID NO:494)-(SEQ ID NO:66), (SEQ ID NO:447)-LL-(SEQ ID NO:495)-(SEQ ID NO:66), (SEQ ID NO:448)-LL-(SEQ ID NO:496)-(SEQ ID NO:66), 20 (SEQ ID NO:449)-LL-(SEQ ID NO:497)-(SEQ ID NO:67), (SEQ ID NO:450)-LL-(SEQ ID NO:498)-(SEQ ID NO:67), (SEQ ID NO:451)-LL-(SEQ ID NO:499)-(SEQ ID NO:67), (SEQ ID NO:452)-LL-(SEQ ID NO:500)-(SEQ ID NO:68), (SEQ ID NO:453)-LL-(SEQ ID NC:501)-(SEQ ID NO:68), 25 (SEQ ID NO:454)-LL-(SEQ ID NO:502)-(SEQ ID NO:68), (SEQ ID NO:455)-LL-(SEQ ID NO:503)-(SEQ ID NO:69), (SEQ ID NO:456)-LL-(SEQ ID NO:504)-(SEQ ID NO:69), (SEQ ID NO:457)-LL-(SEQ ID NO:505)-(SEQ ID NO:69), (SEQ ID NO:458)-LL-(SEQ ID NO:506)-(SEQ ID NO:70), 30 (SEQ ID NO:459)-LL-(SEQ ID NO:507)-(SEQ ID NO:70),
(SEQ ID NO:460)-LL-(SEQ ID NO:508)-(SEQ ID NO:70), (SEQ ID NO:461)-LL-(SEQ ID NO:509)-(SEQ ID NO:71), (SEQ ID NO:462)-LL-(SEQ ID NO:510)-(SEQ ID NO:71), (SEQ ID NO:463)-LL-(SEQ ID N0:511)-(SEQ ID NO:71), 5 (SEQ ID NO:464)-LL-(SEQ ID NO:512)-(SEQ ID NO:72), (SEQ ID NO:465)-LL-(SEQ ID NO:513)-(SEQ ID NO:72), (SEQ ID NO:466)-LL-{SEQ ID N0:514)-(SEQ ID NO:72), (SEQ ID NO:467)-LL-(SEQ ID NO:515)-(SEQ ID NO:73), (SEQ ID NO:468)-LL-(SEQ ID NO:516)-(SEQ ID NO:73), (SEQ ID NO:469)-LL-(SEQ ID NO:517)-(SEQ ID NO:73), (SEQ ID NC:470)-LL-(SEQ ID NO:518)-(SEQ ID NO:74), (SEQ ID NO:471)-LL-(SEQ ID NO:519)-(SEQ ID NO:74), (SEQ ID NO:472)-LL-(SEQ ID NO:520)-(SEQ ID NO:74), (SEQ ID NO:473)-LL-(SEQ ID NO:521)-(SEQ ID NO:75), (SEQ ID NO:474)-LL-(SEQ ID NO:522)-(SEQ ID NO:75), (SEQ ID NO:475)-LL-(SEQ ID NO:523)-(SEQ ID NO:75), (SEQ ID NO:476)-LL-(SEQ ID NO:524)-(SEQ ID NO:76), (SEQ ID NO:477)-LL-(SEQ ID NO:525)-(SEQ ID NO:76), (SEQ ID NO:478)-LL-(SEQ ID NO:526)-(SEQ ID NO:76), (SEQ ID NO:479)-LL-(SEQ ID NO:527)-(SEQ ID NO:77), (SEQ ID NO:480)-LL-(SEQ ID NO:528)-(SEQ ID NO:77), (SEQ ID NO:481)-LL-(SEQ ID NO:529)-(SEQ ID NO:77), (SEQ ID NO:482)-LL-(SEQ ID NO:530)-(SEQ ID NO:78), (SEQ ID NO:483)-LL-(SEQ ID NO:531)-(SEQ ID NO:78), (SEQ ID NO:484)-LL-(SEQ ID NO:532)-(SEQ ID NO:78), (SEQ ID NO:485)-LL-(SEQ ID NO:533)-(SEQ ID NO:79), (SEQ ID NO:486)-LL-(SEQ ID NO:534)-(SEQ ID NO:79), (SEQ ID NO:487)-LL-(SEQ ID NO:535)-(SEQ ID NO:79), (SEQ ID NO:488)-LL-(SEQ ID NO:536)-(SEQ ID N0:80), (SEQ ID NO:489)-LL-(SEQ ID NO:537)-(SEQ ID NO:80),
(SEQ ID NO:490)-LL-(SEQ ID NC:538)-(SEQ ID NO:80), (SEQ ID NO:491)-LL-(SEQ ID NO:539)-(SEQ ID NO:81), (SEQ ID NO:492)-LL-(SEQ ID NO:540)-(SEQ ID NO:81), e 5 (SEQ ID NO:493)-LL-(SEQ ID NO:541)-(SEQ ID NO:81), em que cada sequência acima está ligada à sequência adjacente como descrito aqui e em que LL é um ligante como descrito aqui. Em particular, os segmentos de tronco longo C-terminal HAl podem ser covalente ou não- lo covalentemente ligados aos domínios HA2. Em determinadas modalidades, LL é selecionado a partir do grupo que consiste em uma ligação direta, Gly, Gly-Gly, Gly-Gly-Gly, Gly-Gly-Gly-Gly, (Gly)n, Gly-Pro, ITPNGSIPNDKPFQNVNKITYGA (SEQ ID NO:165) e Asn-Ala-Ser.
15 5.4 VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO Em outro aspecto, proporcionam-se aqui polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) que compreendem um ou mais sítios de glicosilação modificados e/ou um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não- 20 natural. Em modalidades específicas, o polipeptídeo HA de gripe é um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico que compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados e/ou um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural. Como mostrado nas Figuras 19C e B, 25 a glicosilação de hemaglutinina tipo selvagem ocorre nos domínios de cabeça e tronco globulares. Acredita-se que a glicosilação dentro desses domínios possa mascarar as regiões antigênicas, permitindo assim que um vírus influenza evada uma resposta imunológica de hospedeiro. Por 30 exemplo, cepas de vírus influenza sazonal (por exemplo,
H1H1 e H3N2) são conhecidas por adquirir sítios de glicosilação adicionais ao longo do tempo em regiões antigênicas imunodominantes do domínio de cabeça globular. Dentro do contexto de um polipeptídeo HA do vírus influenza 5 descrito aqui, entretanto, a glicosilação dentro do domínio de tronco do polipeptídeo pode impedir ou evitar as respostas imunológicas desejadas contra as regiões antigênicas conservadas encontradas nesse domínio.
Sem se ater a qualquer teoria particular de operação, acredita-se que uma resposta imunológica a regiões antigênicas conservadas dentro do domínio de tronco do polipeptídeo HA do vírus influenza fornecido aqui possa ser aumentada ao modificar um ou mais sítios de glicosilação dentro do domínio de tronco de maneira que interrompa a glicosilação (isto é a ligação de um glicano) nos sítios sites. Ademais, acredita-se que o mascaramento das regiões antigênicas imunodominantes do domínio de cabeça globular HA pela adição de um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural nessas regiões imunodominantes também possa aumentar a imunogenicidade de regiões antigênicas sub-imunodominantes conservadas dentro do domínio de tronco. Veja a Figura 19C.
Os polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) que compreendem um ou mais sítios de glicosilação modificados e/ou um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural podem ser usados de acordo com os métodos de vacinação descritos aqui, isto é, esses polipeptídeos HA mutantes podem ser administrados a um indivíduo para obter anticorpos específicos de domínio de caule/tronco de vírus influenza no indivíduo. Para avaliar a capacidade de os polipeptídeos HA mutantes obterem esses anticorpos caule-dirigido, os indivíduos (por exemplo,
camundongos) podem ser imunizados com os polipeptideos HA mutantes descritos aqui, ou virus (por exemplo, vírus 5 influenza) que expressa os polipeptídeos HA mutantes descritos aqui, e a capacidade de esses polipeptídeos HA mutantes ou vírus que expressam esses polipeptídeos HA mutantes obterem os anticorpos específicos de domínio de caule/tronco de produção pode ser avaliada e comparada com a capacidade de os vírus HA tipo selvagem ou tipo selvagem de contraparte obterem os anticorpos específicos de domínio de caule/tronco de produção no indivíduo.
Por exemplo, para avaliar a capacidade de os polipeptídeos HA mutantes obterem anticorpos caule-dirigidos, os camundongos podem ser imunizados com uma cepa ou subtipo de vírus influenza tipo selvagem, vírus influenza que expressa mutantes HA que possuem sítios de glicosilação adicionados ao domínio de cabeça, e o vírus influenza que expressa os mutantes HA com os sítios de glicosilação removidos do domínio de caule, e combinações desses.
Esses camundongos podem ser então preparados com o DNA do vírus influenza ou inoculados com proteína viral.
Três semanas depois, esses camundongos podem ser estimulados com proteína viral.
Três semanas depois de serem estimulados com proteína viral, os camundongos podem ser desafiados com várias cepas de vírus influenza e monitorados quanto à perda de peso e sobrevivência.
Os títulos de soro de anticorpos anti-cabeça e anti-caule em camundongos infectados podem ser avaliados por ELISA como descrito abaixo.
- 5.4.1. SÍTIOS DE GLICOSILAÇé MODIFICADOS NO
DOMÍNIO DE TRONCO Em uma modalidade, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) fornecido aqui compreende um 5 domínio de tronco HA que compreende pelo menos um sítio de glicosilação modificado, em que o sítio de glicosilação modificado compreende a modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural que interfere na capacidade um glicano se ligar ao sítio de glicosilação 10 modificado. Sem se ater a qualquer teoria particular de operação, acredita-se que as regiões antigênicas conservadas dentro do domínio de tronco do polipeptídeo HA da gripe sejam protegidas contra o sistema imunológico do indivíduo (por exemplo, uma resposta de anticorpo) por 15 glicanos que se ligam a essas regiões antigênicas. Portanto, acredita-se que a imunogenicidade e acessibilidade a regiões antigênicas dentro do domínio de tronco possam ser aumentadas ao modificar um ou mais sítios de glicosilação dentro do domínio de tronco de tal maneira que interrompe a 20 glicosilação (isto é a ligação de um glicano) nos sítios.
Os sítios de glicosilação modificados em que um sítio de glicosilação de ocorrência natural é modificado de tal maneira que interfere na capacidade de um glicano se ligar ao sítio de glicosilação modificado podem ser 25 realizados por qualquer técnica evidente para um elemento versado na técnica, inclusive os métodos descritos aqui, inclusive, por exemplo, as técnicas de mutagênese sítio- dirigida discutidas no Exemplo 5, infra.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de 30 hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de tronco
HA que compreende pelo menos um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, ouvinte ou mais sítios de glicosilação modificados, em que o sítio de glicosilação modificado compreende a 5 modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural que interfere na capacidade de um glicano se ligar ao sítio de glicosilação modificado.
Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, 10 13-15, 16-18, 19-21 sítios de glicosilação modificados.
Em outras modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende 1-5, 6-10, 11-15,
16-20, 21-25 sítios de glicosilação modificados.
Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do 15 polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação modificado.
Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende dois sítios de glicosilação modificados.
Em determinadas modalidades, o
20 domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende três sítios de glicosilação modificados.
Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende quatro sítio de glicosilação modificado.
Em 25 determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende cinco sítios de glicosilação modificados.
Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende seis sítios de 30 glicosilação modificados.
Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende sete sítios de glicosilação modificados.
Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) 5 compreende oito sítios de glicosilação modificados.
Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende nine sítios de glicosilação modificados.
Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de 10 hemaglutinina de gripe (HA) compreende dez sítios de glicosilação modificados.
Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende onze sítios de glicosilação modificados.
Em determinadas modalidades, o domínio de 15 tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) • compreende doze sítios de glicosilação modificados.
Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende treze sítios de glicosilação modificados.
Em determinadas 20 modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende quatorze sítios de glicosilação modificados.
Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende quinze sítios de glicosilação 25 modificados.
Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA)
compreende dezesseis sítios de glicosilação modificados.
Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende 30 dezessete sítios de glicosilação modificados.
Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende dezoito sítios de glicosilação modificados. Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de 5 hemaglutinina de gripe (HA) compreende dezenove sítios de glicosilação modificados. Em determinadas modalidades, o domínio de tronco HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende vinte ou mais sítios de glicosilação modificados.
10 Os sítios de glicosilação modificados incluem, mas sem se limitarem a, sítios de glicosilação ligados a N e ligados a 0. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação modificado é um sítio de glicosilação ligado a N. Em outras modalidades, o sítio de glicosilação modificado é um sítio de glicosilação ligado a 0. Em algumas modalidades, o sítio de glicosilação modificado é um sítio de glicosilação modificado ligado a N que possui o motivo de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido ou, em determinadas modalidades, em que Xaa é qualquer aminoácido exceto Pro.
O sítio de glicosilação modificado pode compreender qualquer modificação que pode interferir na capacidade de um glicano se ligar ao sítio de glicosilação modificado. Em modalidades preferidas, a modificação não interfere no enovelamento adequado do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) e/ou na capacidade de o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) obter uma resposta imunológica em um indivíduo. Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma deleção de um ou mais resíduos de aminoácido em um sítio de glicosilação de r ocorrência natural. Em outras modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural.
Em determinadas modalidades, o sítio de 5 glicosilação modificado compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Xaa-Seer/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido ou, em determinadas modalidades, em que Xaa é qualquer 10 aminoácido exceto Pro, e em que a modificação interfere na capacidade de um glicano para ligação ao sítio de glicosilação modificado. 0 sítio de glicosilação modificado pode compreender qualquer substituição de aminoácido conhecida por um elemento versado na técnica que pode 15 interferir na capacidade de um glicano para ligação ao sítio de glicosilação modificado. Em modalidades preferidas, uma ou mais substituições de aminoácido não interferem na capacidade de o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) se enovelar adequadamente ou obter uma resposta imunológica 20 em um indivíduo. Em determinadas modalidades, um ou mais aminoácidos de um sítio de glicosilação de ocorrência natural são substituídos por um resíduo de aminoácido Asn (N), Ser (S), Thr (T) ou Asp (D). As substituições de aminoácido exemplares incluem, mas sem se limitarem a, a 25 substituição de uma Asn (N) por um resíduo de aminoácido Lys (K) a substituição de uma Ser (S) por um resíduo de Asn (N) e a substituição de uma Thr (T) por um resíduo de Asp (D). Em modalidades específicas, o sítio de glicosilação modificado compreende uma substituição de um 30 resíduo Asn (N) de um sítio de glicosilação de ocorrência d natural por um resíduo de Lys (K). Em outras modalidades, o sítio de glicosilação modificado compreende uma substituição de um resíduo Ser (S) de um sítio de glicosilação de ocorrência natural por um resíduo de 5 aminoácido Asn (N). Ainda em outras modalidades, o sítio de glicosilação modificado compreende uma substituição de um resíduo Thr (T) de um sítio de glicosilação de ocorrência natural por um resíduo de aminoácido Asp (D).
Em determinadas modalidades, a modificação 10 compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Ala-Ser. Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de 15 ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido i Asn-Asp-Ser. Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Arg-Ser. Em outras 20 modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Asn-Ser. Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um 25 sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Cys-Ser. Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido 30 Asn-Glu-Ser. Em outras modalidades, a modificação
I ta compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Gln-Ser.
Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ou mais 5 substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Gly-Ser.
Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende 10 a sequência de aminoácido Asn-His-Ser.
Em outras modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido
Asn-lle-Ser.
Em algumas modalidades, a modificação 15 compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um • sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Lys-Ser.
Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de 20 ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido
Asn-Leu-Ser.
Em outras modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Met-Ser.
Em outras 25 modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocokrêficia natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Phe-Ser, Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um 30 sitio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Pro-Ser. Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sitio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido 5 Asn-Ser-Ser. Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Thr-Ser. Em outras modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Trp-Ser. Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Tyr-Ser. Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Val-Ser.
20 Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Ala-Thr. Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Asp-Thr. Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Arg-Thr. Em outras
4 modalidades, a modificação compreende uma ou mais a substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Asn-Thr.
Em determinadas modalidades, a modificação 5 compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Cys-Thr.
Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de 10 ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido
Asn-Glu-Thr.
Em outras modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Gln-Thr.
Em algumas 15 modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Gly-Thr.
Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um 20 sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-His-Thr.
Em outras modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido 25 Asn-Ile-Thr.
Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Lys-Thr.
Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais 30 substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de f
• ocorrencia natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Leu-Thr.
Em outras modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende 5 a sequência de aminoácido Asn-Met-Thr.
Em outras modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Phe-Thr.
Em determinadas modalidades, a modificação
10 compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Pro-Thr.
Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de 15 ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Ser-Thr.
Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Thr-Thr.
Em outras 20 modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Trp-Thr.
Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um
25 sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Tyr-Thr, Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido 30 Asn-Val-Thr.
r Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Ala-Cys.
Em determinadas 5 modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Asp-Cys.
Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um
10 sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Arg-Cys.
Em outras modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido 15 Asn-Asn-Cys.
Em determinadas modalidades, a modificação • compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sitio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Cys-Cys.
Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais 20 substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido
Asn-Glu-Cys.
Em outras modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende
25 a sequência de aminoácido Asn-Gln-Cys.
Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Gly-Cys.
Em determinadas modalidades, a modificação 30 compreândé uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-His-Cys.
Em outras modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de 5 ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Ile-Cys.
Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Lys-Cys.
Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido
Asn-Leu-Cys.
Em outras modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende á sequêzicia de aminoácido Asn-Met-Cys.
Em outras modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Phe-Cys.
Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Pro-Cys.
Em algumas modalidades, uma modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Ser-Cys.
Em determinadas modalidades, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Thr-Cys.
Em outras
1' 4 modalidades, uma modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Trp-Cys. Em determinadas modalidades, a modificação 5 compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Tyr-Cys. Em determinadas modalidades, uma modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de 10 ocorrência natural que compreende a sequência de aminoácido Asn-Val-Cys.
Os sítios de glicosilação de ocorrência natural conservados no domínio de tronco HA incluem aqueles mostrados na Figura 20. Os sítios de N-glicosïlação de 15 ocorrência natural exemplares em hemaglutininas de grupo 1 (H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, e H16) podem ser encontrados, mas sem se limitarem a, nas posições de aminoácido 20-22 (ausentes em H9), 21-23, 33-35 (ausentes em H8, H9, H12, H13, H16), 46-48 (ausentes em Hl, H2, H5, 20 H6, H8, H9, H11, H12), 289-291 (ausentes em H6, H11, H13, H16), 290-292 (ausentes em Hl, H2, H5, H8, H9, H12), 296- 298 (ausentes em Hl, H2, H5, Hit, H13, H16) e 481-483, em que as posições de aminoácido estão de acordo com a numeração H3. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo 25 de hemaglutinina (HA) compreende um sítio de glicosilação modificado nas posições de aminoácido 20-22, de acordo com a numeração H3, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado. Em determinadas 30 modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA)
compreende um sítio de glicosilação modificado nas posições de aminoácido 21-23, de acordo com a numeração H3, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação 5 modificado.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação modificado nas posições de aminoácido 33-35, de acordo com a numeração H3, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação modificado nas posições de aminoácido 46-48, de acordo com a numeração H3, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação modificado nas posições de aminoácido 289-291, de acordo com a numeração H3, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação modificado nas posições de aminoácido 290-292, de acordo com a numeração H3, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação modificado nas posições de aminoácido 296-298, de acordo com a numeração H3, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação 5 modificado. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação modificado nas posições de aminoácido 481-483, de acordo com a numeração H3, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende dois sítios de glicosilação modificados nas posições de aminoácido selecionadas a partir do grupo que consiste em posições de aminoácido 20-22, 21-23, 33-35, 46-48, 289-291, 290-292, 296-298 e 481-483, de acordo com a numeração H3, em que cada sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado. Em outras modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende três sítios de glicosilação modificados nas posições de aminoácido selecionadas a partir do grupo que consiste em posições de aminoácido 20-22, 21~23, 33-35, 46-48, 289-291, 290-292, 296-298 e 481-483, de acordo com a numeração H3, em que cada sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende quatro sítios de glicosilação modificados nas posições de aminoácido selecionadas a partir do grupo que consiste em posições de aminoácido 20-22, 21-23, 33-35, 46-48, 289-291, 290-292, 296-298 e 481-483, de acordo com a numeração H3, em que cada sítio de glicosilação modificado compreende uma 5 modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Em algumas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende cinco sítios de glicosilação modificados nas posições de aminoácido selecionadas a partir do grupo que consiste em 10 posições de aminoácido 20-22, 21-23, 33-35, 46-48, 289-291,
290-292, 296-298 e 481-483, de acordo com a numeração H3, em que cada sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende seis sítios de glicosilação modificados nas posições de aminoácido selecionadas a partir do grupo que consiste em posições de aminoácido 20-22, 21-23, 33-35, 46-48, 289-291,
290-292, 296-298 e 481-483, de acordo com a numeração H3, em que cada sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Em outras modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende sete sítios de glicosilação modificados nas posições de aminoácido selecionadas a partir do grupo que consiste em posições de aminoácido 20-22, 21-23, 33-35, 46-48, 289-291,
290-292, 296-298 e 481-483, de acordo com a numeração H3, em que cada sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Ainda em outras modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende sítios de glicosilação modificados nas posições de aminoácido 20-22, 21-23, 33-35, 46-48, 289-291, 290-292, 296-298 e 481-483, de acordo com a numeração H3, em que 5 cada sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Os sítios de N-glicosilação conservados exemplares em hemaglutininas de grupo 2 (H3, H4, H7, H10, H14, H15), podem ser encontrados, porém sem se limitarem a, nas posições de aminoácido, 8-10, 22-24, 38-40 (ausentes em H4, H14), 46-48 (ausentes em H3, H4, H7, H10, H14) 285-287 (ausentes em H4, H7, H10, H14, H15), 296-298 (ausentes em H3, H7, H15), 410-412 (ausentes em H3, H4, H14) e 481-483, em que as posições de aminoácido estão de acordo com a numeração H3. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglTutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação modificado nas posições de aminoácido 8-10, de acordo com a numeração H3, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação modificado nas posições de aminoácido 22-24, de acordo com a numeração H3, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação modificado nas posições de aminoácido 38-40, de acordo com a numeração H3, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de 5 glicosilação modificado nas posições de aminoácido 46-48,
de acordo com a numeração H3, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de 10 hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sitio de glicosilação modificado nas posições de aminoácido 285-287, de acordo com a numeração H3, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação 15 modificado.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de • hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação modificado nas posições de aminoácido 296-298, de acordo com a numeração H3, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que 20 interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação modificado nas posições de aminoácido 410-412, de acordo com a numeração H3, em que o sítio de 25 glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação modificado nas posições de aminoácido 481-483, 30 de acordo com a numeração H3, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende dois sítios de glicosilação modificados nas posições de aminoácido selecionadas a partir do grupo que consiste em posições de aminoácido 8-10, 22-24, 38-40, 46-48, 285-287, 296-298, 410-412 e 481-483, de acordo com a numeração H3, em que cada um dos sítios de glicosilação modificados compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado. Em determinadas modalidades, o polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende três sítios de glicosilação modificados nas posições de aminoácido selecionadas a partir do grupo que consiste em posições de aminoácido 8-10, 22-24, 38-40, 46-48, 285-287, 296-298, 410-412 e 481-483, de acordo com a numeração H3, em que cada um dos sítios de glicosilação modificados compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sitio de glicosilação modificado. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende quatro sítios de glicosilação modificados nas posições de aminoácido selecionadas a partir do grupo que consiste em posições de aminoácido 8-10, 22-24, 38-40, 46- 48, 285-287, 296-298, 410-412 e 481-483, de acordo com a numeração H3, em que cada um dos sítios de glicosilação modificados compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende cinco sítios de glicosilação
-1 341/648 modificados nas posições de aminoácido selecionadas a partir do grupo que consiste em posições de aminoácido 8-10, 22-24, 38-40, 46-48, 285-287, 296-298, 410-412 e 481-483, de acordo com a numeração H3, em que cada um dos sítios de 5 glicosilação modificados compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende seis sítios de glicosilação modificados nas posições de aminoácido selecionadas a partir do grupo que consiste em posições de aminoácido 8-10, 22-24, 38-40, 46-48, 285-287, 296-298, 410-412 e 481-483, de acordo com a numeração H3, em que cada um dos sítios de glicosilação modificados compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Em determinadas modalidades, o polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende sete sítios de glicosilação modificados nas posições de aminoácido selecionadas a partir do grupo que consiste em posições de aminoácido 8~10, 22-24, 38-40, 46-48, 285-287, 296-298, 410-412 e 481-483, de acordo com a numeração H3,
em que cada um dos sítios de glicosilação modificados compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende sítios de glicosilação modificados nas posições de aminoácido 8-10, 22-24, 38-40, 46-48, 285-287, 296-298,
410-412 e 481-483, de acordo com a numeração H3, em que cada um dos sítios de glicosilação modificados compreende uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de 30 glicosilação modificado.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um, dois ou mais sítios de glicosilação modificados nos resíduos de aminoácido 20-23, 33-35, 289-291 e 483-485, de acordo com a 5 numeração H3, em que os sítios de glicosilação modificados compreendem uma modificação que interrompe a glicosilação nos sítios de glicosilação modificados. Em outras modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende dois sítios de glicosilação modificados nos resíduos de aminoácido 33-35 e 289-291, de acordo com a numeração H3, em que os sítios de glicosilação modificados compreendem uma modificação que interrompe a glicosilação nos sítios de glicosilação modificados.
0 polipeptídeo de hemaglutinina de gripe que compreende um domínio de tronco HA que compreende pelo menos um sítio de glicosilação modificado pode ser qualquer polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) que compreenda um domínio de tronco HA descrito no presente documento, incluindo, mas sem limitar-se a, um polipeptideo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza não-quimérico (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza que compreende um domínio de tronco HA e um domínio de cabeça HA a partir do mesmo subtipo ou cepa), e um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) é um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico. Em modalidades específicas, o polipeptideo de hemaglutinina (HA) de vírus influenza quimérico compreende um domínio de tronco HA e um domínio de cabeça globular HA, em que o domínio de cabeça globular HA é heterólogo ao domínio de tronco HA, e em que o domínio de tronco HA compreende pelo menos um sítio de glicosilação modificado, em que o sítio de glicosilação 5 modificado compreende uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural que interfere a capacidade de um glicano de se ligar ao sítio de glicosilação modificado. Em modalidades específicas, a modificação compreende uma ou mais substituições de 10 aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural tendo a sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido ou, em determinadas modalidades, em que Xaa é qualquer aminoácido exceto Pro.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de 15 hemaglutinina de gripe (HA) é um polipeptídeo de • hemaglutinina de vírus influenza não-quimérico. Em modalidades específicas, o polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza não-quimérico compreende um domínio de tronco HA e um domínio de cabeça globular HA, em que o 20 domínio de cabeça globular HA é homólogo ao domínio de tronco HA (isto é, o domínio de cabeça globular e o domínio de tronco são provenientes da mesma cepa ou subtipo de vírus influenza), e em que o domínio de tronco HA compreende pelo menos um sítio de glicosilação modificado, 25 em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural que interfere a capacidade de um glicano de se ligar ao sítio de glicosilação modificado. Em modalidades específicas, a modificação compreende uma ou mais 30 substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural tendo a sequência de aminoácido Asn-Xaa- Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido ou, em determinadas modalidades, em que Xaa é qualquer aminoácido exceto Pro. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de 5 hemaglutinina de vírus influenza não-quimérico compreende um domínio de tronco HA e um domínio de cabeça globular HA provenientes do mesmo subtipo de vírus influenza. Em modalidades específicas, o subtipo de vírus influenza é um subtipo Hl, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17. Em modalidades específicas, o polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza não- quimérico compreende um domínio de tronco HA e um domínio de cabeça globular HA provenientes da mesma cepa de vírus influenza. Em determinadas modalidades, a cepa de vírus influenza é A/Netherlands/602/2009.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) é um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza. Os polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza exemplificadores são revelados na Seção 5.2, supra.
Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreende: (a) um domínio HA1 de hemaglutinina de influenza que compreende um segmento de tronco N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante de 1 a 50 resíduos heteró.logos que, sucessivamente, sejam covalentemente ligados a um segmento de tronco curto C--terminal HAl; o dito domínio HA1 em associação terciária ou quaternária com 30 (b) um domínio HA2 de hemaglutinina de influenza, em que o polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreende, ainda, pelo menos um sítio de glicosilação modificado, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação de um sítio de 5 glícosilação de ocorrência natural que interfere a capacidade de um glicano de se ligar ao sítio de glicosilação modificado. Em uma modalidade específica, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência 10 natural tendo a sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido ou, em determinadas modalidades, em que Xaa é qualquer aminoácido exceto Pro.
Em outra modalidade, o polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreende: (a) um domínio 15 HA1 de hemaglutinina de influenza que compreende um • segmento de tronco longo N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante de 1 a 50 resíduos heterólogos que, sucessivamente, sejam colaventemente ligados a um segmento de tronco longo C-terminal HA1; o dito domínio HAl em 20 associação terciária ou quaternária com (b) um domínio HA2 de hemaglutinina de influenza, em que o polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreende, ainda, pelo menos um sítio de glicosilação modificado, em que o sítio de glicosilação modificado 25 compreende uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural que interfere a capacidade de um glicano de se ligar ao sítio de glicosilação modificado. Em outra modalidade, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de 30 ocorrência natural tendo a sequência de aminoácido Asn-Xaa-
Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido ou, em determinadas modalidades, em que Xaa é qualquer aminoácido exceto Pro. Em outra modalidade, o polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreende: 5 (a) um domínio HA1 de hemaglutinina de influenza que compreende um segmento de tronco N-terminal HAl covalentemente ligado a um ligante de 1 a 50 resíduos heterólogos que, sucessivamente, sejam colaventemente ligados a um segmento de tronco C-terminal HAl; o dito domínio HAl em associação terciária ou quaternária com (b) um domínio HA2 de hemaglutinina de influenza, em que o polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreende, ainda, pelo menos um sítio de glicosilação modificado, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural que interfere a capacidade de um glicano de se ligar ao sítio de glicosilação modificado. Em uma modalidade específica, a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural tendo a sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido ou, em determinadas modalidades, em que Xaa é qualquer aminoácido exceto Pro.
Em outra modalidade, o polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreende: (a) um domínio HAl de hemaglutinina de influenza que compreende, ligado na ordem a seguir: um segmento de tronco N-terminal HAI, um primeiro ligante de 1 a 50 resíduos heterólogos, um segmento de tronco intermediário HAl, um segundo ligante de 1 a 50 resíduos heterólogos e um segmento de tronco C-
terminal HAI; o dito domínio HA1 em associação terciária ou quaternária com (b) um domínio HA2 de hemaglutinina de influenza, em que o polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de vírus influenza compreende, ainda, pelo 5 menos um sítio de glicosilação modificado, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural que interfere a capacidade de um glicano de se ligar ao sítio de glicosilação modificado. Em uma modalidade específica, a 10 modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido em um sítio de glicosilação de ocorrência natural tendo a sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido, ou, em determinadas modalidades, em que Xaa é qualquer aminoácido exceto Pro. 15 5.4.2 SÍTIOS DE GLICOSILAÇÃC DE OCORRÊNCIA NÃO-
NATURAL NO DOMÍNIO DE CABEÇA GLOBULAR Em outra modalidade, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) aqui proporcionado compreende um domínio de cabeça globular HA que compreende pelo menos 20 um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural. Sem se àter a nenhuma teoria particular de operação, acredita-se que o mascaramento das regiões antigênicas imunodominantes do domínio de cabeça globular HA pela adição de um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural nessas 25 regiões imunodominantes também pode aumentar a imunogenicidade às regiões antigênicas sub- imunodominantes conservadas no domínio de tronco do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA).
Os sítios de glicosilação de ocorrência não- 30 natural podem ser adicionados ao domínio de cabeça globular
HA do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito aqui usando qualquer técnica conhecida a um indivíduo versado na técnica, incluindo, por exemplo, as técnicas de mutagênese sítio-direcionada descritas no Exemplo 5, infra. 5 Em modalidades preferenciais/específicas, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural não interfere no enovelamento apropriado do polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) e/ou interfere na capacidade do domínio de tronco do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) em produzir uma resposta imune (por exemplo, uma resposta de anticorpo) em um indivíduo.
Em determinadas modalidades, os sítios de glicosilação de ocorrência não-natural podem ser adicionados a um domínio de cabeça globular HA com base no domínio de cabeça de uma hemaglutinina de influenza A. Em determinadas modalidades, o domínio de cabeça globular HA se baseia no domínio de cabeça de uma hemaglutinina de influenza A selecionada a partir do grupo que consiste em H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e H17. Em determinadas modalidades, os sítios de glicosilação de ocorrência não-natural podem ser adicionados a um domínio de cabeça globular HA com base no domínio de cabeça de uma hemaglutinina de influenza B. Em algumas modalidades, o domínio de cabeça globular HA se baseia no domínio de cabeça de B/Seal/Netherlands/1/99. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende a sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido, ou, em determinadas modalidades, em que Xaa é qualquer aminoácido exceto Pro. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não- natural compreende a sequência de aminoácido Asn-Ala-Ser.
Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Asp-Ser.
Em algumas 5 modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não- natural compreende Asn-Arg-Ser.
Em outras modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Asn-Ser.
Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Cys- Ser.
Em determinadas modalidades, o sítio de gliccsilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Glu-Ser.
Em outras modalidades, o sitio de glicosilação de ocorrência não-
natural compreende Asn-Gln-Ser.
Em algumas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Gly-Ser.
Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-His- Ser.
Em outras modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Ile-Ser.
Em algumas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não- natural compreende Asn-Lys-Ser.
Em determinadas modalidades,
o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Leu-Ser.
Em outras modalidades, o sitio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Met- Ser.
Em outras modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Phe-Ser.
Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Pro-Ser.
Em algumas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não- natural compreende Asn-Ser-Ser.
Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Thr-Ser. Em outras modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Trp- Ser. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Tyr-Ser. Em 5 determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Aso-Val-Ser.
Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende a sequência de aminoácido Asn-Ala-Thr. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não- natural compreende Asn-Asp-Thr. Em algumas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Arg-Thr. Em outras modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Asn-Thr. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Cys-Thr. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Glu-Thr. Em outras modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não- natural compreende Asn-Gln-Thr. Em algumas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Gly-Thr. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-His- Thr. Em outras modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Ile-Thr. Em algumas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não- natural compreende Asn-Lys-Thr. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Leu-Thr. Em outras modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Met-
Thr. Em outras modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Phe-Thr. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Pro-Thr. Em algumas 5 modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não- natural compreende Asn-Ser-Thr. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Thr-Thr. Em outras modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Trp- Thr. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Tyr-Thr. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Val-Thr.
Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende a sequência de aminoácido Asn-Ala-Cys. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não- natural compreende Asn-Asp-Cys. Em algumas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Arg-Cys. Em outras modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Asn-Cys. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Cys-Cys. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Glu-Cys. Em outras modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não- natural compreende Asn-Gln-Cys. Em algumas modalidades, o sitio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Gly-Cys. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-His-
Cys. Em outras modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Ile-Cys. Em algumas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não- natural compreende Asn-Lys-Cys. Em determinadas modalidades, 5 o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Leu-Cys. Em outras modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Met- Cys. Em outras modalidades, o sítio de glicosílação de ocorrência não-natural compreende Asn-Phe-Cys. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não- natural compreende Asn-Pro-Cys. Em algumas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não- natural compreende Asn-Ser-Cys. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Thr-Cys. Em outras modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Trp- Cys. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Tyr-Cys. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural compreende Asn-Val-Cys.
O polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) pode compreender um domínio de cabeça globular HA com um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze, quinze, dezesseis, dezessete, dezoito, dezenove, ou vinte ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural. Em algumas modalidades, o polipeptídeo HA de gripe compreende 2 a 5, 4 a 6, 5 A 10, ou 10 a 15 sítios de glicosilação de ocorrência não-natural. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com um sítio de glicosilação de ocorrência não- natural.
Em outras modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com dois sítios de glicosilação de ocorrência 5 não-natural.
Em modalidades específicas, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com três sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
Em outras modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com quatro sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com cinco sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
Em outras modalidades, o polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com seis sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
Em outras modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com sete sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
Em outras modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com oito sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
Em outras modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com nove sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
Em outras modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com dez sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
Em outras modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) um domínio de cabeça globular
HA com onze sítios de glicosilação de ocorrência não- natural.
Em outras modalidades, o polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com doze sítios de glicosilação de ocorrência 5 não-natural.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com treze sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com quatorze sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
Em outras modalidades, o polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com quinze sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
Em outras modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA)
compreende um domínio de cabeça globular HA com dezesseis sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com dezessete sítios de glicosilação de ocorrência não- natural, Em outras modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com dezoito sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
Em outras modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com dezenove sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
Em outras modalidades, o polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um domínio de cabeça globular HA com vinte ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural.
Um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural podem estar localizados em quaisquer posições de aminoácido em um domínio de cabeça globular onde um sítio de glicosilação de ocorrência natural não esteja 5 localizado em relação a um subtipo ou cepa de vírus influenza particular.
As mutações exemplificadoras que introduzem sítios de glicosilação de ocorrência não-natural em um domínio de cabeça globular são mostradas na Figura
21B.
Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural se encontra nas posições de aminoácido 59-61, 128-130, 130-132, 158-160, e/ou 163-165 de acordo com o sistema de numeração H3. Em determinadas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não- natural se encontra nas posições de aminoácido 59-61, 81-83, 129-131, 143-145, 158-160, 165-167, 170-172, 187-189, 193-
195, 197-199, e/ou 208-210 de acordo com o sistema de numeração H3. Em algumas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural se encontra nas posições de aminoácido 59-61, de acordo com a numeração H3. Em outras modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural se encontra na posição de aminoácido 129-131, de acordo com a numeração H3. Em outras modalidades, os sítios de glicosilação de ocorrência não-
natural se encontram nas posições de aminoácido 129-131 e 158-160, de acordo com a numeração H3. Em algumas modalidades, os sítios de glicosilação de ocorrência não- natural se encontram nas posições de aminoácido 59-61, 129-
131 e 165-167, de acordo com a numeração H3. Em algumas modalidades, os sítios de glicosilação de ocorrência não- natural se encontram nas posições de aminoácido 59-61, 129-
131, 158-160 e 165-167, de acordo com a numeração H3. Em algumas modalidades, os sítios de glicosilação de ocorrência não-natural se encontram nas posições de aminoácido 81-83, 129-131, 158-160, 165-167, 170-172, 187- 5 189 e 208-210, de acordo com a numeração H3. Em outras modalidades, os sítios de glicosilação de ocorrência não- natural se encontram nas posições de aminoácido 81-83, 129- 131, 158-160, 170-172, 187-189 e 208-210, de acordo com a numeração H3. Ainda em outras modalidades, os sítios de glicosilação de ocorrência não-natural se encontram nas posições de aminoácido 129-131, 158-160, 165-167, 170-172, 187-189 e 208-210, de acordo com a numeração H3.
Em modalidades preferenciais, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural está localizado em uma região antigênica no domínio de cabeça globular, protegendo, assim, a região antigênica contra a produção de uma resposta imune. As regiões antigênicas exemplificadoras no domínio globular incluem, mas não se limitam a, sítio antigênico Sa, Sb, Ca e Cb da Figura 21A no subtipo H1 e as regiões antigênicas A, B, C, D no subtipo H3. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não- natural localizado na região antigênica Sa de um domínio de cabeça globular de subtipo H1. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural localizado na região antigênica Sb de um domínio de cabeça globular de subtipo H1. Em outras modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural localizado na região
` 357/648 antigênica Ca de um domínio de cabeça globular de subtipo Hl.
Ainda em outras modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural localizado na região 5 antigênica Cb de um domínio de cabeça globular de subtipo Hl.
Em outra modalidade, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural localizado nas regiões antigênicas
Sa e Sb de um domínio de cabeça globular de subtipo Hl.
Em outra modalidade, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não- natural localizado nas regiões antigênicas Sa e Ca de um domínio de cabeça globular de subtipo Hl.
Em outra modalidade, o polipeptídeo de hemaglutiniria de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não- natural localizado nas regiões antigênicas Sa e Cb de um domínio de cabeça globular de subtipo Hl.
Em outra modalidade, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA)
compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não- natural localizado nas regiões antigênicas Sb e Ca de um domínio de cabeça globular de subtipo Hl.
Em outra modalidade, o polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não- natural localizado nas regiões antigênicas Sb e Cb de um domínio de cabeça globular de subtipo Hl.
Em outra modalidade, o polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA)
compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não- natural localizado nas regiões antigênicas Ca e Cb de um domínio de cabeça globular de subtipo Hl.
Em outra modalidade, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA)
compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não- natural localizado nas regiões antigênicas Sa, Sb, e Ca de um domínio de cabeça globular de subtipo Hí. Em outra modalidade, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) 5 compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não- natural localizado nas regiões antigênicas Sb, Ca e Cb de um domínio de cabeça globular de subtipo M. Em outra modalidade, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não- natural localizado nas regiões antigênicas Sa, Sb, Ca e Cb de um domínio de cabeça globular de subtipo H1.
Em algumas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural se encontra na região antigênica A de um domínio de cabeça globular de subtipo H3. Em algumas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural se encontra na região antigênica B de um domínio de cabeça globular de subtipo H3. Em algumas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não- natural se encontra na região antigênica C de um domínio de cabeça globular de subtipo H3. Em algumas modalidades, o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural se encontra na região antigênica D de um domínio de cabeça globular de subtipo H3. Em outra modalidade, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural localizado nas regiões antigênicas A e B de um domínio de cabeça globular de subtipo H3. Em outra modalidade, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural localizado nas regiões antigênicas A e C de um domínio de cabeça globular de subtipo H3. Em outra modalidade, o polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural localizado nas regiões antigênicas A e D de um domínio de cabeça globular 5 de subtipo H3. Em outra modalidade, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural localizado nas regiões antigênicas B e C de um domínio de cabeça globular de subtipo H3. Em outra modalidade, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural localizado nas regiões antigênicas B e D de um domínio de cabeça globular de subtipo H3. Em outra modalidade, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural localizado nas regiões antigênicas C e D de um domínio de cabeça globular de subtipo H3. Em outra modalidade, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural localizado nas regiões antígênícas A, B, e C de um domínio de cabeça globular de subtipo H3. Em outra modalidade, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural localizado nas regiões antigênicas B, C, e D de um domínio de cabeça globular de subtipo H3. Em outra modalidade, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um sítio de glicosilação de ocorrência não-natural localizado nas regiões antigênicas A, B, C, e D de um domínio de cabeça globular de subtipo H3.
Em outras modalidades, a polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) compreende um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural em uma ou mais regiões antigênicas de um domínio de cabeça globular Hl, H2, 5 H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 ou H17.
Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) que compreende um domínio de cabeça globular HA com um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural é um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) que compreende um domínio de cabeça globular HA com um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural é um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza não- quimérico.
5.4.3 SÍTIOS DE GLICOSILAÇÃO DE OCORRÊNCIA NÃO-
NATURAL NO DOMÍNIO DE CABEÇA GLOBULAR E SÍTIOS DE
GLICOSILAÇÃO MODIFICADOS NO DOMÍNIO DE TRONCO 20 Em outra modalidade, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) proporcionado no presente documento compreende um domínio de tronco HA com um, dois ou mais sítios de glicosilação modificados e uma cabeça globular HA com um, dois ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural, em que os sítios de glicosilação modificados compreendem uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural que interfere a capacidade de um glicano de se ligar ao sítio de glicosilação modificado. Os sítios de glicosilação modificados e os sítios de glicosilação de ocorrência não-
natural podem ser produzidos usando técnicas conhecidas na técnica e/ou descritas no presente documento. Em modalidades específicas, o(s) sítio(s) de glicosilação modificado(s) e o(s) sítio(s) de glicosilação de ocorrência 5 não-natural não interferem com o enovelamento apropriado do polipeptídeo HA de gripe e/ou interferem na capacidade do domínio de tronco polipeptídeo HA de gripe produzir uma resposta imune (por exemplo, uma resposta de anticorpo) em um indivíduo. Vide as Seções 5.4.1 e 5.4.2, supra, para uma 10 descrição de sítios de glicosilação modificados e sítios de glicosilação de ocorrência não-natural. Os sítios de glicosilação modificados e os sítios de glicosilação de ocorrência não-natural descritos nas Seções 5.4.1 e 5.4.2, supra, podem ser ambos incorporados em um polipeptídeo HA 15 de gripe.
Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) proporcionado no presente documento compreende um domínio de tronco HA com sítios de glicosilação modificados nas posições 33-35 e 289-291 de 20 acordo com a numeração H3; e um domínio de cabeça globular HA que compreende sítios de glicosilação de ocorrência não- natural em um, dois, três, quatro, cinco, seis ou sete das posições a seguir: 129-131, 158-160, 165-167, 170-172, 187- 189, e 208-210 de acordo com a numeração H3. 25 Em uma modalidade específica, proporciona-se um polipeptídeo de hemaglutinina de influenza quimérico que compreende um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural no domínio de cabeça globular e um ou mais sítios de glicosilação modificados no domínio de tronco, em 30 que os ditos sítios de glicosilação modificados no domínio de tronco compreendem uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado.
Em outra modalidade específica, proporciona-se um polipeptídeo de hemaglutinina de influenza quimérico que compreende um ou 5 mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural no domínio de cabeça globular e um ou mais sítios de glicosilação modificados no domínio de tronco, em que os ditos sítios de glicosilação modificados no domínio de tronco compreendem uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado, e em que
(i) os sítios de glicosilação de ocorrência não-natural estão em uma, duas, três, quatro, cinco, seis, sete, ou mais posições de aminoácido 81-83, 129-131, 158-160, 165- 167, 170-172, 187-189 e 208-210, de acordo com a numeração H3 e (ii) os sítios de glicosilação modificados estão em uma, duas, três, ou mais posições de aminoácido 20-23, 33- 35, 271-273, 289-291, e/ou 483-485 de acordo com a numeração H3. Em outra modalidade específica, proporciona-
se um polipeptídeo de hemaglutinina de influenza quimérico que compreende um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural no domínio de cabeça globular e que compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados no domínio de tronco, em que os ditos sítios de glicosilação modificados no domínio de tronco compreendem uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado, e em que (i) os sítios de glicosilação de ocorrência não-natural se encontram nas posições de aminoácido 81-83, 129-131, 158-160, 170-172, 187-189 e 208-210, de acordo com a numeração H3 e (ii) os sítios de glicosilação modificados se encontram nas posições de aminoácido 33-35 e 289-291, de acordo com a numeração H3. Em outra modalidade específica, proporciona- Se um polipeptídeo de hemaglutinina de influenza quimérico que compreende um ou mais sítios de glicosilação de 5 ocorrência não-natural no domínio de cabeça globular que compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados no domínio de tronco, em que os ditos sítios de glicosilação modificados no domínio de tronco compreendem uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado, e em que (i) os sítios de glicosilação de ocorrência não-natural se encontram nas posições de aminoácido 81-83, 129-131, 158-160, 165-167,
170-172, 187-189 e 208-210, de acordo com a numeração H3 e (ii) os sítios de glicosilação modificados se encontram nas posições de aminoácido 33-35 e 289-291, de acordo com a numeração H3. Em outra modalidade específica, proporciona- se um polipeptídeo de hemaglutinina de influenza quimérico que compreende um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural no domínio de cabeça globular que compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados no domínio de tronco, em que os ditos sítios de glicosilação modificados no domínio de tronco compreendem uma modificação que interrompe a glicosilação no sítio de glicosilação modificado, e em que (i) os sítios de glicosilação de ocorrência não-natural se encontram nas posições de aminoácido 129-131, 158-160, 165-167, 170-172, 187-189 e 208-210, de acordo com a numeração H3 e (ii) os sítios de glicosilação modificados se encontram nas posições de aminoácido 33-35 e 289-291, de acordo com a numeração H3. Polipeptídeos de hemaglutinina de influenza
36 4 / 6 48 quiméricos exemplificadores que compreendem os sítios de glicosilação modificados são descritos na Seção 6.11 (Exemplo 11).
5.5 ÁCIDOS NUCLËICOS QUE CODIFICAM O 5 POLIPEPTÍDEO DE HEMAGLUTININA DE GRIPE (HA) Proporcionam-se ácidos nucléicos que codificam os polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descritos no presente documento. Devido à degeneração do 10 código genético, qualquer ácido nucléico que codifique um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito aqui ser abrangido no presente documento. Em determinadas modalidades, os ácidos nucléicos correspondentes a ácidos nucléicos de vírus influenza de ocorrência natural que 15 codificam um segmento de tronco N-terminal HA1, um segmento de tronco C-terminal HAI, um domínio HA2, um domínio luminal, um domínio transmembranar, e/ou um domínio citoplásmico são usados para produzir um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo 20 de hemaglutinina de vírus influenza quimérico).
Proporcionam-se, também, ácidos nucléicos capazes de se hibridizarem em um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza 25 quimérico). Em determinadas modalidades, proporcionam-se ácidos nucléicos capazes de se hibridizarem em um fragmento de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico). Em outras 30 modalidades, proporcionam-se ácidos nucléicos capazes de se hibridizarem em comprimento completo de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de virus influenza quimérico). Os parâmetros gerais para condições 5 de hibridização para ácidos nucléicos são descritos em Sambrook et a1., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2nd Ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova York (1989), e em Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Current Protocols Publishing, Nova York (1994). A hibridização pode ser realizada sob condições de estringência alta, condições de estringência média, ou condições de estringência baixa, Os indivíduos versados na técnica compreenderão que as condições de estringência baixa, média e alta são contingentes mediante vários fatores, sendo que todos esses interagem e também dependem dos ácidos nucléicos em questão.
Por exemplo, as condições de estringência alta podem incluir temperaturas dentro da temperatura de fusão de 5°C do ácido nucléico(s), uma concentração salina baixa (por exemplo, menor que 250 mM), e uma concentração de co- solvente alta (por exemplo, 1 a 20% de co-solvente, por exemplo, DMSO). As condições de estringência baixa, por outro lado, podem incluir temperaturas maiores que 10°C abaixo da temperatura de fusão do(s) ácido(s) nucléico(s), uma concentração salina alta (por exemplo, maior que 1000 mM) e a ausência de co-solventes.
Em algumas modalidades, um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) é isolado. Em determinadas modalidades,
um ácido nucléico "isolado" se refere a uma molécula de ácido nucléico que seja separada de outras moléculas de ácido nucléico que estejam presentes na fonte natural do ácido nuc].éico.
Em outras palavras, o ácido nucléico 5 isolado pode compreender ácidos nucléicos heterólogos que não sejam associados ao mesmo na natureza.
Em outras modalidades, um ácido nucléico "isolado", tal como uma molécula de cDNA, pode ser substancialmente isento de outro material celular, ou meio de cultura quando produzido por técnicas recombinantes, ou substancialmente isento de precursores químicos ou outros produtos químicos quando quimicamente sintetizado. 0 termo "substancialmente isento de material celular" inclui preparações de ácido nucléico nas quais o ácido nucléico é separado dos componentes celulares das células a partir das quais este é isolado ou recõmbinantemente produzido.
Portanto, o ácido nucléico que seja substancialmente isento de material celular inclui preparações de ácido nucléico tendo menos de cerca de 30%,
20%, 10%, ou 5% (em peso seco) de outros ácidos nucléicos. 0 termo "substancialmente isento de meio de cultura" inclui preparações de ácido nucléico nas quais o meio de cultura representa menos de cerca de 50%, 20%, 10%, ou 5% do volume da preparação. 0 termo "substancialmente isento de precursores químicos ou outros produtos químicos" inclui preparações nas quais o ácido nucléico é separado dos precursores químicos ou outros produtos químicos que estejam envolvidos na síntese do ácido nucléico.
Em modalidades específicas, essas preparações do ácido nucléico têm menos de cerca de 50%, 30%, 20%, 10%, 5% (em peso seco) de precursores químicos ou compostos além do ácido nucléico de interesse.
Além disso, proporcionam-se ácidos nucléicos que codificam os componentes individuais de um polipeptídeo de 5 domínio de tronco de hemaglutinina de influenza. Em modalidades específicas, proporcionam-se ácidos nucléicos que codificam um segmento de tronco N-terminal HA1, um segmento de tronco C-terminal HA1 e/ou um domínio HA2. Os ácidos nucléicos que codificam componentes de um polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina de influenza podem ser montados usando técnicas de biologia molecular padrão conhecidas pelos indivíduos versados na técnica.
5.6 EXPRESSÃO DE PGLIPEPTÌDEO DE HEMAGLUTININA 15 DE GRIPE (HA) Proporcionam-se vetores, incluindo vetores de expressão, contendo um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito aqui. Em uma modalidade específica, o vetor é um vetor de expressão que seja capaz de dirigir a expressão de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico). Exemplos não-limitantes de vetores de expressão incluem, mas não se limitam a, plasmídeos e vetores virais, tais como retrovírus de replicação defectiva, adenovírus, vírus adeno-associados e baculovírus. Os vetores de expressão também podem incluir, sem limitação, animais transgenicos e células/organismos não-mamíferos, por exemplo,
células/organismos de mamíferos que tenham sido modificados por engenharia genética para realizar uma glicosilação ligada a N em mamíferos.
Em algumas modalidades, proporcionam-se vetores 5 de expressão que codificam componentes de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, o domínio de tronco e o domínio de cabeça, ou porções de qualquer domínio). Esses vetores podem ser usados para expressar os componentes em uma ou mais células hospedeiras e os componentes podem ser isolados e conjugados juntos a um ligante usando técnicas conhecidas pelos indivíduos versados na técnica.
Um vetor de expressão compreende um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito aqui em uma forma adequada para expressão do ácido nucléico em uma célula hospedeira. Em uma modalidade específica, um vetor de expressão inclui uma ou mais sequências regulatórias, selecionadas com base nas células hospedeiras a serem usadas para expressão, que seja operacionalmente ligada ao ácido nucléico a ser expresso.
Em um vetor de expressão, pretende-se que "operacionalmente ligado" signifique que um ácido nucléico de interesse seja ligado à(s) sequência(s) regulatória(s) de modo que permita a expressão do ácido nucléico (por exemplo, em um sistema de transcrição/translação in vitro ou em uma célula hospedeira quando o vetor for introduzido na célula hospedeira). As sequências regulatórias incluem promotores, acentuadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação). As sequências regulatórias incluem aquelas que dirigem a expressão constitutiva de um ácido nucléico em muitos tipos de células hospedeiras, aquelas que dirigem a expressão do ácido nucléico somente em determinadas células hospedeiras (por exemplo, sequências regulatórias tecido-específicas),
5 e aquelas que dirigem a expressão do ácido nucléico mediante um estímulo com um agente particular (por exemplo,
sequências regulatórias induzíveis). Os indivíduos versados na técnica avaliarão que o design do vetor de expressão pode depender de fatores como a escolha da célula 10 hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, etc.
Pretende-se que o termo "célula hospedeira" inclua uma célula em questão particular transformada ou transfectada por um ácido nucléico e a progênie ou a progênie potencial de tal célula.
A progênie 15 de tal célula pode não ser idêntica à célula pai transformada ou transfectada pelo ácido nucléico devido a mutações ou influências ambientais que possam ocorrer em gerações sucessoras ou integração do ácido nucléico no genoma da célula hospedeira. 20 Os vetores de expressão podem ser projetados para expressão de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito aqui usando células procarióticas (por exemplo, E. coli) ou eucaridticas (por exemplo, células de insetos (usando vetores de expressão de baculovírus, vide, por 25 exemplo, Treanor et al., 2007, JAMA, 297(14):1577-1582 aqui incorporado em sua totalidade a título de referência), células de levedura, células vegetais, algas ou células de mamíferos). Exemplos de células hospedeiras de levedura incluem, mas não se limitam a, S. pombe e S. cerevisiae e
30 os exemplos, infra.
Exemplos de células hospedeiras de mamíferos incluem, mas não se limitam a, células Crucell Per.C6, células Vero, células CHO, células VERY, células BHK, células HeLa, células COS, células MDCK, células 293, células 3T3 ou células W138. Em determinadas modalidades, 5 as células hospedeiras são células de mieloma, por exemplo, células NSO, células 45.6 TG1.7, células AF-2 clone 9B5, células AF-2 clone 9B5, células J558L, células MCPC 315, células MPC-11, células NCI-H929, células NP, células NSO/l, células P3 NS1 Ag4, células P3/NS1/1-Ag4-1, células P3U1, 10 células P3X63AgB, células P3X63Ag8.653, células P3X63Ag8U.1, células RPMI 8226, células Sp20-Agl4, células U266B1, células X63AG8.653, células Y3.Ag.1.2.3, e células YO. Exemplos não-limitantes de células de insetos incluem Sf9, Sf21, Trichoplusia ni, Spodoptera frugiperda e Bombyx mori.
15 Em uma modalidade particular, um sistema de cultura de célula de mamíferos (por exemplo, células de ovário de hamster chinês ou células de rim de hamster bebê) é usado para expressão de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). Em outra modalidade, um sistema de cultura de célula 20 vegetal é usado para expressão de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). Vide, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 7.504.560; 6.770.799; 6.551.820; 6.136.320;
6.034.298; 5.914.935; 5.612.487; e 5.484.719, e Publicações de Pedido de Patente U.S. Nos. 2009/0208477, 2009/0082548, 25 2009/0053762, 2008/0038232, 2007/0275014 e 2006/0204487 para células vegetais e métodos para a produção de proteínas que utilizam sistemas de cultura de célula vegetal. Em modalidades específicas, os sistemas de cultura de célula vegetal não são usados para expressão de um 30 polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). As células hospedeiras que compreendem os ácidos nucléicos que codificam os polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descritos aqui podem ser isoladas, 5 isto é, as células estão fora do corpo de um indivíduo. Em determinadas modalidades, as células são modificadas por engenharia genética para expressar ácidos nucléicos que codifiquem os polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descritos aqui.
Um vetor de expressão pode ser introduzido nas células hospedeiras através de técnicas de transformação ou transfecção convencionais. Essas técnicas incluem, mas não se limitam a, co-precipitação de fosfato de cálcio ou cloreto de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano, lipofecção, e eletroporação. Métodos adequados para transformada ou transfectar células hospedeiras podem ser encontrados em Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2a Edição, Cold Spring Harbor Press, Nova York, e outros manuais laboratoriais. Em determinadas modalidades, uma célula hospedeira é transientemente transfectada por um vetor de expressão contendo um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). Em outras modalidades, uma célula hospedeira é estavelmente transfectada por um vetor de expressão contendo um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA).
Para uma transfecção estável de células de mamíferos, sabe-se que, dependendo do vetor de expressão e da técnica de transfecção usada, somente uma pequena fração de células pode integrar o DNA estranho em seu genoma. A fim de identificar e selecionar esses integrantes, um ácido nucléico qbe codifica um marcador selecionável (por exemplo, para resistência a antibióticos) é genericamente 5 introduzido nas células hospedeiras junto com o ácido nucléico de interesse. Exemplos de marcadores selecionáveis incluem aqueles que conferem resistência a fármacos, como G418, higromicina e metotrexato. As células estavelmente transfectadas pelo ácido nucléico introduzido podem ser identificadas por seleção de fármacos (por exemplo, as células que incorporaram o gene marcador selecionável sobreviverão, enquanto as outras células morrerão).
Como uma alternativa à expressão recombinante de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) que usa uma célula hospedeira, um vetor de expressão contendo um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) pode ser transcrito e transladado in vitro usando, por exemplo, sequências regulatórias de promotor T7 e polimerase T7. Em uma modalidade específica, um sistema de transcrição/translação acoplado, tal como Promega TNT®, ou um lisato celular ou um extrato celular que compreende os componentes necessários para transcrição e translação podem ser usados para produzir um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). 25 Uma vez que um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), tiver sido produzido, este pode ser isolado ou purificado através de qualquer método conhecido na técnica para isolamento ou purificação de uma proteína, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, troca iõnica, afinidade, particularmente por afinidade pelo antígeno específico, por
Proteína A, e cromatografia em coluna de dimensionamento), centrifugação, solubilidade diferencial, ou através de qualquer outra técnica padrão para o isolamento ou purificação de proteínas. Em determinadas modalidades, um 5 polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) pode ser conjugado a proteínas heterólogas, por exemplo, um complexo de histocompatibilidade principal (MHC) com ou sem proteínas de choque térmico (por exemplo, HsplO, Hsp20, Hsp30, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, ou Hsp100). Em. determinadas modalidades, um polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) pode ser conjugado a moléculas imunomodulatórias, tais como proteínas que direcionariam o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) a células imunes, tais como células B (por exemplo, C3d) ou células T. Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) pode ser conjugado a proteínas que estimulam o sistema imune inato, tal como interferon tipo 1, alfa, beta, ou gama interferon, fatores de estímulo de colônia, tal como o fator de estímulo de colônia de granulócito-macrôfago (GM-CSF), interleucina (IL)-I, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, fator de necrose tumoral (TNF)-0, TNFa, B7.1, B7.2, 4-1BB, ligante CD40 (CD4OL), e CD40 induzível por fármaco (iCD40).
De modo correspondente, proporcionam-se métodos para produzir um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina (HA) de vírus influenza quimérico). Em uma modalidade, o método compreende culturar uma célula hospedeira contendo um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo em um meio adequado de modo que o polipeptídeo seja produzido. Em algumas modalidades, o método compreende, ainda, isolar o polipeptídeo a partir do meio ou da célula hospedeira.
5.7 VETORF„J lF t77 znc Tnrrr.nw117n Em um aspecto, proporcionam-se vírus influenza 5 contendo um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito aqui. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) é incorporado nos vírions do vírus influenza. Os vírus 10 influenza podem ser conjugados a porções que direcionam os vírus a tipos celulares particulares, como células imunes. Em algumas modalidades, os vírions do vírus influenza se incorporaram nestes ou expressam um polipeptídeo heterólogo além de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). O • 15 polipeptídeo heterólogo pode ser um polipeptídeo que tenha • atividade de imunopotenciação, ou que direcione o vírus influenza a um tipo celular particular, como um anticorpo que se ligue a um antígeno em um tipo celular específico ou um ligante que ligue um receptor específico em um tipo 20 celular específico.
Os vírus influenza contendo um polipeptídeo de hemaglutinína de gripe (HA) podem ser produzidos fornecendo-se em trans o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) durante a produção de virions usando técnicas 25 conhecidas pelos indivíduos versados na técnica, tal como genética reversa e resgate de plasmídeo desprovido de auxiliar. Alternativamente, a replicação de um vírus influenza parental que compreende um genoma modificado por engenharia genética para expressar um polipeptídeo de 30 hemaglutinina de gripe (HA) em células suscetíveis à infecção com o vírus em que a função de hemaglutinina é proporcionada em trans produzirá vírus influenza de progênie contendo o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) .
5 Em outro aspecto, proporcionam-se vírus influenza que compreendem um genoma modificado por engenharia genética para expressar um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). Em uma modalidade específica, o genoma de um vírus influenza parental é modificado por engenharia 10 genética para codificar um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), que seja expresso por vírus influenza de progênie. Em outra modalidade específica, o genoma de um vírus influenza parental é modificado por engenharia genética para codificar um polipeptídeo de hemaglutinina de 15 gripe (HA), que seja expresso e incorporado nos vírions de vírus influenza de progênie. Portanto, o vírus influenza de progênie resultante da replicação do vírus influenza parental contém um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). Os vírions do vírus influenza parental podem ter 20 incorporado nestes um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) que contém um domínio de tronco ou cabeça a partir do mesmo tipo, subtipo ou cepa ou diferentes de vírus influenza. Alternativamente, os vírions do vírus influenza parental podem ter incorporado nestes uma porção 25 que seja capaz de substituir funcionalmente uma ou mais atividades de polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza (por exemplo, a ligação de receptor e/ou atividades fusogênicas de hemaglutinina de vírus influenza). Em determinadas modalidades, uma ou mais das atividades do 30 polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza são proporcionadas por uma proteína de fusão que compreende (i) um ectodomínio de um polipeptídeo heterólogo a vírus influenza fundido a (ii) um domínio de transmembrana, ou um domínio de transmembrana e um domínio citoplásmico de um 5 polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza. Em uma modalidade específica, os virions do vírus influenza parental podem ter incorporado nestes uma proteína de fusão que compreende (i) um ectodomínio de uma ligação de receptor/polipeptídeo fusogênico de um agente infeccioso 10 além do vírus influenza fundido a (ii) um domínio de transmembrana, ou um domínio de transmembrana e um domínio citoplásmico de uma hemaglutinina de vírus influenza. Para uma descrição de proteínas de fusão que proporcionam uma ou mais atividades de um polipeptídeo de hemaglutinina de 15 vírus influenza e métodos para a produção de vírus influenza modificados por engenharia genética para expressar tais proteínas de fusão, vide, por exemplo, A Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 2007/064802, publicado em 7 de junho de 2007 e no Pedido de 20 Patente U.S. no. 11/633.130, depositado em 1 de dezembro de 2006; estando cada um desses aqui incorporado em sua totalidade a título de referência.
Em determinadas modalidades, os vírus influenza modificados por engenharia genética para expressar um ou 25 mais dos polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) descritos aqui compreendem uma neuraminidase (NA), ou fragmento desta, que seja proveniente da mesma fonte (por exemplo, cepa ou subtipo de vírus influenza) que aquela a partir da qual a cabeça globular do polipeptídeo de 30 hemaglutinina de gripe (HA) é derivada. Em determinadas modalidades, os vírus influenza modificados por engenharia genética para expressar um ou mais dos polipeptzdeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descritos aqui compreendem uma neuraminidase (NA), ou fragmento desta, que 5 seja proveniente da mesma fonte (por exemplo, cepa ou subtipo de vírus influenza) que aquela a partir da qual a cabeça globular do polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico é derivada, em que a cabeça globular é heteróloga ao domínio de tronco das subunidades HAl e/ou HA2 do polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico.
Em algumas modalidades, os virions do vírus influenza parental incorporaram neles um polipeptídeo heterólogo. Em determinadas modalidades, o genoma de um víThs -influénza parental é modificado por engenharia genética para codificar um polipeptídeo heterólogo e um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), que são expressos pelo vírus influenza de progênie. Em modalidades específicas, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), o polipeptídeo heterólogo ou ambos são incorporados em vírions do vírus influenza de progênie. o polipeptídeo heterólogo pode ser um polipeptídeo que direcione o vírus influenza a um tipo celular particular, tal como um anticorpo que reconheça um antígeno em um tipo celular específico ou um ligante que ligue um receptor específico em um tipo celular específico. Em algumas modalidades, o direcionamento de polipeptídeo substitui a função de reconhecimento de célula alvo do vírus. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo heterólogo direciona o vírus influenza aos mesmos tipos celulares que o vírus influenza infecta na natureza. Em outras modalidades específicas, o polipeptídeo heterólogo direciona o vírus influenza de progênie a células imunes, tais como células B, células T, macrófagos ou células 5 dendríticas. Em algumas modalidades, o polipeptídeo heterólogo reconhece e se liga a marcadores célula- específicos de células que apresentam antígeno, tais como células dendríticas (por exemplo, como CD44). Em uma modalidade, o polipeptídeo heterólogo é DC-SIGN que direciona o vírus a células dentríticas. Em outra modalidade, o polipeptídeo heterólogo é um anticorpo (por• exemplo, um anticorpo de cadeia única) que direciona o vírus a uma célula imune, que pode ser fundida a um domínio de transmembrana a partir de outro polipeptídeo de modo que seja incorporado no vírion do vírus influenza. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo CD20, um anticorpo CD34, ou um anticorpo contra DEC-205. Técnicas para modificar por engenharia genética vírus para expressar polipeptídeos com funções de direcionamento são conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Yang et al., 2006, PNAS 103: 11479-11484 e a Publicação de Pedido de Patente Norte- Americana No. 20080019998, publicada em 24 de janeiro de 2008, e No. 20070020238, publicada em 25 de janeiro de 2007, estando os conteúdos destas aqui incorporados em sua totalidade a título de referência.
Em outra modalidade, o polipeptídeo heterólogo é uma proteína de fixação viral. Exemplos não-limitantes de virus cuja(s) proteína(s) de fixação pode(m) ser usada(s) neste aspecto são vírus selecionados a partir do grupo de: vírus da febre de Lassa, vírus da Hepatite B, vírus da
Raiva, vírus da doença de Newcastle (NDV), um retrovírus, como vírus da imunodeficiência humana, vírus da encefalite do carrapato, vírus da vaccinia, herpes-vírus, pólio-vírus, alfavírus, como vírus da Floresta de Semliki, vírus do Rio 5 de Ross, e vírus Aura (que compreende glícoproteínas de superfície, como El, E2, e E3), vírus da doença de Borna, vírus Hantaan, espumavírus, e vírus SARS-CoV.
Em uma modalidade, uma glicoproteína superficial de flavivirus pode ser usada, como a proteína E do vírus da Dengue (DV). Em algumas modalidades, uma glicoproteína do vírus Sindbis a partir da família de alfavírus é usada (K. S. Wang, R. J. Kuhn, E. G. Strauss, S. Ou, J. H. Strauss, J. Virol. 66, 4992 (1992)). Em determinadas modalidades, o polipeptídeo heterólogo é derivado a partir de um NDV HN ou proteína F; um vírus da imunodeficiência humana (HIV) gp160 (ou um produto deste, como gp41 ou gp120); um antígeno superficial do vírus da hepatite B (HBsAg); uma glicoproteína de herpes-vírus (por exemplo, gD, gE); ou VP1 de pólio-vírus. 20 Em outra modalidade, o polipeptídeo heterólogo é derivado a partir de qualquer sistema de direcionamento não-viral conhecido na técnica. Em determinadas modalidades, utiliza-se uma proteína de um patágeno não-viral, tal como uma bactéria intracelular ou protozoário. Em algumas modalidades, o polipeptídeo bacteriano é proporcionado, por exemplo, por Chlamydia, Rikettsia, Coxelia, Listeria, Brucella, ou Legionella. Em algumas modalidades, o polipeptídeo protozoário é proporcionado, por exemplo, pela espécie Plasmodia, Leishmania spp., Toxoplasma gondii, ou Trypanosoma crazï. Outros sistemas de direcionamento exemplificadores são descritos em Waehler at al., 2007, "Engineering targeted viral vectors for gene therapy," Nature Reviews Genetics 8: 573-587, que se encontra aqui incorporado em sua totalidade.
5 Em determinadas modalidades, o polipeptídeo heterólogo expresso por um vírus influenza tem uma atividade de imunopotenciação (estímulo imune). Exemplos não-limitantes de polipeptídeos de imunopotenciação incluem, mas não se limitam a, moléculas de estímulo, citocinas, 10 quimiocinas, anticorpos e outros agentes, como ligantes Flt-3. Exemplos específicos de polipeptídeos com atividade de imunopotenciação incluem: interferon tipo 1, alfa, beta, ou gama interferon, fatores de estímulo de colônia, como fator de estímulo de colônia de granulócito-macrófago (GM- 15 CSF), interleucìna {IL) -1, IL -2, IL -4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12, IL-15, IL -18, IL-21, IL-23, fator de necrose tumoral (TNF)-13, TNFa., 87.1, B7.2, 4-1BB, ligante CD40 (CD40L), e CD40 induzível por fármaco (iCD40) (vide, por exemplo, Hanks, B. A., et a1. 2005. Nat Med 11:130-137, que se 20 encontra aqui incorporado em sua totalidade a título de referência.) Visto que o genoma de vírus influenza A e B consistem em oito (8) segmentos de sentido negativo de filamento único (vírus influenza C consistem em sete (7) 25 segmentos de sentido negativo de filamento único), o genoma de um vírus influenza parental pode ser modificado por engenharia genética para expressar um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (e qualquer outro polipeptídeo, tal como um polipeptídeo heterólogo) usando um segmento 30 recombinante e técnicas conhecidas por um indivíduo versado na técnica, tal como uma genética reversa e resgate de plasmídeo isento de auxiliar.
Em uma modalidade, o segmento recombinante compreende um ácido nucléico que codifica o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) bem corno os 5 sinais de incorporação 3' e 5' que são necessários para uma reel cação, transcrição e empacotamento apropriados dos vRNAs (Fujii et a1., 2003, Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 100:2002-2007; Zheng, et ai., 1996, Virology 217:242-251,
ambos se encontram aqui incorporados em suas totalidades a título de referência). Em uma modalidade específica, o segmento recombinante usa as sequências não-codificadas e/ou não-transladadas 3' e 5' de segmentos de vírus influenza que são provenientes do mesmo tipo, subtipo ou cepa ou diferentes como o vírus influenza parental.
Em algumas modalidades, o segmento recombinante compreende a região não-codificada 3' de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza, as regiões não- transladadas de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza, e a região não-codificada 5' de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza.
Em modalidades específicas, o segmento recombinante compreende as sequências não-codificadas e/ou não-transladadas 3' e 5' do segmento HA de um vírus influenza que seja do mesmo tipo, subtipo ou cepa que o tipo, subtipo ou cepa do vírus influenza como o segmento de tronco N-terminal HA1, o segmento de tronco C-terminal HA1, o domínio de cabeça globular, e/ou o HA2 de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). Em determinadas modalidades, o segmento recombinante que codifica o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) pode substituir o segmento HA de um vírus influenza parental. Em algumas modalidades, o segmento recombinante que codifica o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) pode substituir o gene NSl do vírus influenza parental. Em algumas modalidades, o segmento recombinante 5 que codifica o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) pode substituir o gene NA do vírus influenza parental. Cepas de vírus influenza exemplificadoras que podem ser usadas para expressar os polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) incluem Ann Arbor/1/50, A/Ann Arbor/6/60, A/Puerto Rico/8/34, A/South Dakota/6/2007, A/Uruguay/716/2007, A/California/07/2009, A/Perth/16/2009, A/Brisbane/59/2007, A/Brisbane/10/2007, e B/Brisbane/60/2008.
Em algumas modalidades, um segmento de gene de hemaglutinina de gripe codifica um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). Em modalidades específicas, o segmento de gene de hemaglutinina de gripe (HA) e pelo menos outro segmento de gene de vírus influenza compreendem sinais de empacotamento que permitem que o segmento de gene de hemaglutinina de gripe (HA) e pelo menos outro segmento de gene se segreguem durante a replicação de um vírus influenza recombinante (vide, Gao & Palese 2009, PNAS 106:15891-15896; e a Publicação de Pedido Internacional No. W011/014645).
25 Em algumas modalidades, o genoma de um vírus influenza parental pode ser modificado por engenharia genética para expressar um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) usando um segmento recombinante que seja bicistrônico. As técnicas bicistrônicas permitem a modificação por engenharia genética de sequências de codificação de múltiplas proteínas em um único mRNA através do t usd de sequências de sítio de entrada de ribossomo interno (IRES). As sequências IRES dirigem o recrutamento interno de ribossomos à molécula de RNA e permitem a 5 translação de maneira independente de terminação. Em resumo, uma região de codificação de uma proteína é inserida na estrutura de leitura aberta (ORF) de uma segunda proteína. A inserção é flanqueada por um IRES e quaisquer sequências de sinal não-transladadas necessárias para uma expressão e/ou função apropriadas. A inserção não deve interromper a ORF, poliadenilação ou promotores transcricionais da segunda proteína (vide, por exemplo, Garcia-Sastre et a1., 1994, J. Virol. 68:6254-6261 e García-Sastre et al., 1994 Dev. Biol. Stand. 82:237-246, estando cada um desses aqui incorporados em sua totalidade a título de referência). Vide também, por exemplo, a Patente U.S. No. 6.887.699, Patente U.S. No. 6.001.634, Patente U.S. No. 5.854.037 e Patente U.S. No. 5.820.871, sendo que cada uma dessas se encontra aqui incorporada em sua totalidade a título de referência. Qualquer IRES conhecido na técnica ou descrito no presente documento pode ser usado de acordo com a invenção (por exemplo, o IRES de gene BiP, nucleotídeos 372 a 592 da entrada de banco de dados GenBank HUMGRP78; ou o IRES do vírus da encefalomiocardite (EMCV), nucleotídeos 25 1430-2115 da entrada de banco de dados GenBank CQ867238.).
Portanto, em determinadas modalidades, um vírus influenza parental é modificado por engenharia genética para conter um segmento RNA bicistrônico que expressa o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) e outro polipeptídeo, tal como um gene expresso pelo vírus influenza parental. Em algumas modalidades, o gene do vírus influenza parental é o gene HA.
Em algumas modalidades, o gene do vírus influenza parental é o gene NA.
Em algumas modalidades, o gene do vírus influenza parental é o gene NS1. 5 As técnicas conhecidas pelos indivíduos versados na técnica podem ser usadas para produzir um vírus influenza contendo um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) e um vírus influenza que compreende um genoma modificado por engenharia genética para expressar um 10 polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA). Por exemplo,
podem-se usar técnicas de genética reversa para gerar tal vírus influenza.
Em resumo, as técnicas de genética reversa envolvem a preparação de RNAs virais recombinantes sintéticos que contenham as regiões não-codificadas do RNA 15 vital de filamento negativo que são essenciais para o • reconhecimento por polimerases virais e para empacotar sinais necessários para gerar um vírion maduro.
Os RNAs recombinantes são sintetizados a partir de um modelo de DNA recombinante e reconstituídos in vitro com complexo de 20 polimerase viral purificada para formar ribonucleoproteínas recombinantes (RNPs) que podem ser usadas para transfectar células.
Obtém-se uma transfecção mais eficiente se as proteínas de polimerase viral estiverem presentes durante a transcrição dos RNAs sintéticos seja in vitro ou in vivo. 25 Os RNPs recombinantes sintéticos são resgatados em partículas de vírus infeccioso.
As técnicas anteriores são descritas na Patente U.S.
No. 5.166.057 emitida em 24 de novembro de 1992; na Patente U.S.
No. 5.854.037 emitida em 29 de dezembro de 1998; na Publicação de Patente Europeia 30 EP 0702O85A1, publicada em 20 de fevereiro de 1996; no
Pedido de Patente U.S. com Número de Série 09/152.845; nas Publicações de Patente Internacional PCT WO 97/12032 publicada em 3 de abril de 1997; WO 96/34625 publicada em 7 de novembro de 1996; na Publicação de Patente Europeia EP 5 A780475; WO 99/02657 publicada em 21 de janeiro de 1999;
WO 98/53078 publicada em 26 de novembro de 1998; WO 98/02530 publicada em 22 de janeiro de 1998; WO 99/15672 publicada em 1 de abril de 1999; WO 98/13501 publicada em 2 de abril de 1998; WO 97/06270 publicada em 20 de fevereiro de 1997; 10 e em EPO 780 475A1 publicada em 25 de junho de 1997, estando cada uma dessas aqui incorporada em sua totalidade a título de referência.
Alternativamente, pode-se usar uma tecnologia de plasmídeo isento de auxiliar para produzir um vírus 15 influenza contendo um polipeptídeo de hemaglutinina de • gripe (HA) e um vírus influenza que compreende um genoma modificado por engenharia genética para expressar um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). Em resumo, os cDNAs de comprimento completo de segmentos virais são 20 amplificados usando PCR com iniciadores que incluem sítios de restrição exclusivos, que permitem a inserção do produto PCR no vetor de plasmídeo (Flandorfer et al., 2003, J. Virol. 77:9116-9123; Nakaya et a1., 2001, J. Virol.
75:11868-11873; ambos se encontram aqui incorporados em 25 suas totalidades a título de referência). 0 vetor de plasmídeo é projetado de modo que uma transcrição negativa exata (sentido vRNA) seja expressa. Por exemplo, o vetor de plasmídeo pode ser projetado para posicionar o produto de PCR entre um promotor de polimerase I de RNA humano 30 truncado e uma sequência de ribozima de vírus da hepatite delta de modo que uma transcrição negativa exata (sentido vRNA) seja produzida a partir do promotor de polimerase I.
Os vetores de plasmídeo separados que compreendem cada segmento viral, bem como os vetores de expressão que 5 compreendem proteínas virais necessárias podem ser transfectados em células levando à produção de partículas virais recombinantes. Em outro exemplo, podem-se usar os vetores de plasmídeo a partir dos quais tanto o RNA como o mRNA genômicos virais que codificam as proteínas virais 10 necessárias são expressos. Para uma descrição detalhada da tecnologia de plasmídeo isento de auxiliar vide, por exemplo, a Publicação Internacional No. wO 01/04333; as Patentes U.S. Nos. 6.951.754, 7.384.774, 6.649.372, e
7.312.064; Fodor et a1., 1999, J. Virol. 73:9679-9682; 15 Quinlivan et a1., 2005, J. Virol. 79:8431-8439; Hoffmann et a1., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6108-6113; e Neumann et a1., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:9345- 9350, que se encontram aqui incorporadas em suas totalidades a título de referência. 20 Os vírus influenza descritos no presente documento podem ser propagados em qualquer substrato que permita que o vírus cresça em títulos que permitam seu uso de acordo com os métodos descritos no presente documento. Em uma modalidade, o substrato permite que os vírus cresçam 25 em títulos comparáveis àqueles determinados para os vírus tipo selvagem correspondentes. Em determinadas modalidades, o substrato é aquele que é biologicamente relevante ao vírus influenza ou ao vírus a partir do qual a função HA é derivada. Em uma modalidade específica, um vírus influenza 30 atenuado, por exemplo, em virtude de uma mutação no gene
NS1, pode ser propagado em um substrato deficiente de IFN. Por exemplo, um substrato deficiente de IN adequado pode ser aquele que seja defectivo em sua capacidade de produzir ou } responder ao interferon, ou é aquele que um substrato 5 deficiente de IFN pode ser usado para o crescimento de qualquer número de vírus que possam requerer um ambiente de crescimento deficiente de interferon. Vide, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 6.573.079, emitida em 3 de junho de 2003,
6.852.522, emitida em 8 de fevereiro de 2005, e 7.494.808, emitida em 24 de fevereiro de 2009, estando os conteúdos destas aqui incorporados em suas totalidades a título de referência. Em uma modalidade específica, o vírus é propagado em ovos embrionados (por exemplo, ovos de galinha). Em uma modalidade específica, o vírus é propagado em ovos embrionados com 8 dias de idade, 9 dias de idade, 8 a 10 dias de idade, 10 dias de idade, 11 dias de idade, 10 a 12 dias de idade, ou 12 dias de idade (por exemplo, ovos de galinha). Em determinadas modalidades, o vírus é propagado em células MDCK, células Vero, células 293T, ou outras linhagens celulares conhecidas na técnica. Em determinadas modalidades, o vírus é propagado em células derivadas a partir de ovos embrionados.
Os vírus influenza descritos no presente documento podem ser isolados e purificados através de qualquer método conhecido pelos indivíduos versados na técnica. Em uma modalidade, o vírus é removido da cultura celular e separado dos componentes celulares, tipicamente, através de procedimentos de clarificação bem conhecidos, por exemplo, como centrifugação gradiente e cromatografia em coluna, e pode ser purificado, ainda, conforme desejado
U f usando procedimentos bem conhecidos pelos indivíduos versadc3s na técnica, por exemplo, ensaios de placas.
Em determinadas modalidades, os vírus influenza, ou polipeptídeos de vírus influenza, genes ou segmentos de 5 genoma para uso conforme descrito no presente documento são obtidos ou derivados a partir de um vírus influenza A. Em determinadas modalidades, os vírus influenza, ou polipeptídeos de vírus influenza, genes ou segmentos de genoma para uso conforme descrito no presente documento são obtidos ou derivados a partir de um único subtipo ou cepa de vírus influenza A. Em outras modalidades, os vírus influenza, ou polipeptideos de vírus influenza, genes ou segmentos de genoma para uso conforme descrito no presente documento são obtidos ou derivados a partir de dois ou mais subtipos ou cepas de vírus influenza A. Em determinadas modalidades, os vírus influenza para uso conforme descrito no presente documento compreendem um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito no presente documento e uma neuraminidase (NA), ou fragmento desta, em que a NA é proveniente da mesma fonte (por exemplo, cepa ou subtipo de virus influenza) a partir da qual a cabeça globular do polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico é derivada. Em determinadas modalidades, os vírus influenza modificados por engenharia genética para expressar um ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descritos no presente documento compreendem uma neuraminidase (NA), ou fragmento desta, que seja proveniente da mesma fonte (por exemplo, cepa ou subtipo de vírus influenza) a partir da qual a cabeça globular do polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico é derivada, em que a cabeça globular é heteróloga ao domínio de tronco das subunidades HAl e/ou HA2 do polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico. 5 Em algumas modalidades, os vírus influenza, ou polipeptídeos de vírus influenza, genes ou segmentos de genoma para uso conforme descrito no presente documento são obtidos ou derivados a partir de um vírus influenza B. Em determinadas modalidades, os vírus influenza, ou polipeptídeos de vírus influenza, genes ou segmentos de genoma para uso conforme descrito no presente documento são obtidos ou derivados a partir de um único subtipo ou cepa de vírus influenza B. Em outras modalidades, os vírus influenza, ou polipeptídeos de vírus influenza, genes ou segmentos de genoma para uso conforme descrito no presente documento são obtidos ou derivados a partir de dois ou mais subtipos ou cepas de vírus influenza B. Em outras modalidades, os vírus influenza, ou polipeptídeos de vírus influenza, genes ou segmentos de genoma para uso conforme descrito no presente documento são obtidos ou derivados a partir de uma combinação de subtipos ou cepas de vírus influenza A e B.
Em algumas modalidades, os vírus influenza, ou polipeptídeos de vírus influenza, genes ou segmentos de genoma para uso conforme descrito no presente documento são obtidos ou derivados a partir de um vírus influenza C. Em determinadas modalidades, os vírus influenza, ou polipeptídeos de vírus influenza, genes ou segmentos de genoma para uso conforme descrito no presente documento são obtidos ou derivados a partir de um único subtipo ou cepa de vírus influenza C. Em outras modalidades, os vírus influenza, ou polipeptídeos de vírus influenza, genes ou segmentos de genoma para uso conforme descrito no presente documento são obtidos ou derivados a partir de dois ou mais 5 subtipos ou cepas de vírus influenza C. Em outras modalidades, os vírus influenza, ou polipeptídeos de vírus influenza, genes ou segmentos de genoma para uso conforme descrito no presente documento são obtidos ou derivados a partir de uma combinação de subtipos ou cepas de vírus influenza C e virus influenza A e/ou vírus influenza B.
Exemplos não-limitantes de vírus influenza A incluem subtipo H10N4, subtipo H10N5, subtipo H10N7, subtipo H1ON8, subtipo H10N9, subtipo H11N1, subtipo H11N13, subtipo H11N2, subtipo H11N4, subtipo H11N6, subtipo H11N8, subtipo H11N9, subtipo H12N1, subtipo H12N4, subtipo H12N5, subtipo H12N8, subtipo H13N2, subtipo H13N3, subtipo H13N6, subtipo H13N7, subtipo H14N5, subtipo H14N6, subtipo H15N8, subtipo H15N9, subtipo H16N3, subtipo H1N1, subtipo H1N2, subtipo H1N3, subtipo H1N6, subtipo H1N9, subtipo H2N1, subtipo H2N2, subtipo H2N3, subtipo H2N5, subtipo H2N7, subtipo H2N8, subtipo H2N9, subtipo H3N1, subtipo H3N2, subtipo H3N3, subtipo H3N4, subtipo H3N5, subtipo H3N6, subtipo H3N8, subtipo H3N9, subtipo H4N1, subtipo H4N2, subtipo H4N3, subtipo H4N4, subtipo H4N5, subtipo H4N6, subtipo H4N8, subtipo H4N9, subtipo H5N1, subtipo H5N2, subtipo H5N3, subtipo H5N4, subtipo H5N6, subtipo H5N7, subtipo H5N8, subtipo H5N9, subtipo H6N1, subtipo H6N2, subtipo H6N3, subtipo H6N4, subtipo H6N5, subtipo H6N6, subtipo H6N7, subtipo H6N8, subtipo H6N9, subtipo H7N1, subtipo H7N2, subtipo H7N3, subtipo H7N4, subtipo H7N5,
subtipo H7N7, subtipo H7N8, subtipo H7N9, subtipo H8N4, subtipo H8N5, subtipo H9N1, subtipo H9N2, subtipo H9N3, subtipo H9N5, subtipo H9N6, subtipo H9N7, subtipo H9N8, e subtipo H9N9.
5 Exemplos específicos de cepas de vírus influenza A incluem, mas não se limitam a: A/Victoria/361/2011 (H3N2); A/California/4/2009 (H1N1); A/California/7/2009 (H1N1); A/Perth/16/2009 (H3N2); A/Brisbane/59/2007 (H1N1); A/Brisbane/10/2007 ((H3N2); A/sw/Iowa/15/30 (H1N1); 10 A/WSN/33 (H1N1); A/eq/Prague/1/56 (H7N7); A/PR/8/34; A/mallard/Potsdam/178-4/83 (H2N2); A/herring gull/DE/712/88 (H16N3); A/sw/Hong Kong/168/1993 (H1N1); A/mallard/Alberta/211/98 (H1N1); A/shorebird/Delaware/168/06 (H16N3); A/sw/Netherlands/25/80 15 (H1N1); A/sw/Germany/2/81 (H1N1); A/sw/Hannover/1/81 (H1N1); A/sw/Potsdam/1/81 (H1N1); A/sw/Potsdam/15/81 (H1N1); A/sw/Potsdam/268/81 (H1N1); A/sw/Finistere/2899/82 (H1N1); A/sw/Potsdam/35/82 (H3N2); A/sw/Cote d'Armor/3633/84 (H3N2); A/sw/Gent/1/84 (H3N2); A/sw/Netherlands/12/85 (H1N1); 20 A/sw/Karrenzien/2/87 (H3N2); A/sw/Schwerin/103/89 (H1N1); A/turkey/Germany/3/91 (H1N1); A/sw/Germany/8533/91 (H1N1); A/sw/Belgium/220/92 (H3N2); A/sw/Gent/V230/92 (H1N1); A/sw/Leipzig/145/92 (H3N2); A/sw/Re220/92hp (H3N2); A/sw/Bakum/909/93 (H3N2); A/sw/Schleswig.-Holstein/1/93 25 (H1N1); A/sw/Scotland/419440/94 (H1N2); A/sw/Bakum/5/95 (H1N1); A/sw/Best/5C/96 (H1NI); A/sw/England/17394/96 (H1N2); A/sw/Jena/5/96 (H3N2); A/sw/Oedenrode/7C/96 (H3N2); A/sw/Lohne/1/97 (H3N2); A/sw/Cote d'Armor/790/97 (HIN2); A/sw/Bakum/1362/98 (H3N2); A/sw/Italy/1521/98 (H1N2); 30 A/sw/Italy/1553-2/98 (H3N2); A/sw/Italy/1566/98 (H1N1);
A/sw/Italy/1589/98 (H1N1); A/sw/Bakum/8602/99 (H3N2); A/sw/Cotes d'Armor/604/99 (HIN2); A/sw/Cote d'Armor/1482/99 (H1N1); A/sw/Gent/7625/99 (H1N2); A/Hong Kong/1774/99 (H3N2); A/sw/Hong Kong/5190/99 (H3N2); A/sw/Hong
5 Kong/5200/99 (H3N2); A/sw/Hong Kong/5212/99 (H3N2);
A/sw/Ille et Villaine/1455/99 (H1N1); A/sw/Italy/1654-1/99 (H1N2); A/sw/Italy/2034/99 (H1N1); A/sw/Italy/2064/99
(H1N2); A/sw/Berlin/1578/00 (H3N2); A/sw/Bakum/1832/00 (H1N2); A/sw/Bakum/1833/00 (H1N2); A/sw/Cote d'Armor/800/00 10 (H1N2) ; A/sw/Hong Kong/7982/00 (H3N2); A/sw/Italy/1081/00
(H1N2); A/sw/Belzig/2/01 (H1N1); A/sw/Belzig/54/01 (H3N2);
A/sw/Hong Kong/9296/01 (H3N2); A/sw/Hong Kong/9745/01 (H3N2); A/sw/Spain/33601/01 (H3N2); A/sw/Hong Kong/1144/02 (H3N2); A/sw/Hong Kong/1197/02 (H3N2); A/sw/Spain/39139/02 15 (H3N2); A/sw/Spain/42386/02 (H3N2); A/Switzerland/8808/2002
(H1N1); A/sw/Bakum/1769/03 (H3N2);
A/sw/Bissendorf/IDT1864/03 (H3N2); A/sw/Ehren/IDT2570/03 (H1N2); A/sw/Gescher/IDT2702/03 (H1N2);
A/sw/Haselünne/2617/03hp (H1N1); A/sw/Loningen/IDT2530/03 (H1N2); A/sw/IVD/IDT2674/03 (H1N2);
A/sw/Nordkirchen/IDT1993/03 (H3N2); A/sw/Nordwalde/IDT2197/03 (H1N2); A/sw/Norden/IDT2308/03 (H1N2); A/sw/Spain/50047/03 (H1N1); A/sw/Spain/51915/03 (H1N1) ; A/sw/Vechta/2623/03 (H1N1) ; A/sw/Visbek/IDT2869/03 (H1N2); A/sw/Waltersdorf/IDT2527/03 (H1N2);
A/sw/Damme/IDT2890/04 (H3N2); A/sw/Geldern/IDT2888/04 (H1N1); A/sw/Granstedt/IDT3475/04 (HlN2);
A/sw/Greveri/IDT2889/04 (H1N1); A/sw/Gudensberg/IDT2930/04 (H1N2); A/sw/Gudensberg/IDT2931/04 (H1N2);
A/sw/Lohne/IDT3357/04 (H3N2); A/sw/Nortrup/IDT3685/04
(H1N2) ; A/sw/Seesen/IDT3055/04 (H3N2); A/sw/Spain/53207/04 (HINT); A/sw/Spain/54008/04 (H3N2); A/sw/Stolzenau/IDT3296/04 (H1N2); A/sw/Wedel/IDT2965/04 (H1N1); A/sw/Bad Griesbach/IDT4191/05 (H3N2); 5 A/sw/Cloppenburg/IDT4777/05 (H1N2); A/sw/Ddtlzngen/IDT3780/05 (H1N2); A/sw/DStingen/IDT4735/05 (H1N2); A/sw/Egglham/IDT5250/05 (H3N2); A/sw/Harkenblek/IDT4097/05 (H3N2); A/sw/Hertzen/IDT4317/05 (H3N2); A/sw/Krogel/IDT4192/05 (H1N1); A/sw/Laer/IDT3893/05 10 (H1N1); A/sw/Laer/IDT4126/05 (H3N2); A/sw/Merzen/IDT4114/05 (H3N2); A/sw/Muesleringen-S./IDT4263/05 (H3N2); A/sw/Osterhofen/IDT4004/05 (H3N2); A/sw/Sprenge/IDT3805/05 (H1N2); A/sw/Stadtlohn/IDT3853/05 (H1N2); A/sw/Voglarn/IDT4096/05 (H1N1); A/sw/Wohlerst/IDT4093/05 15 (H1N1); A/sw/Bad Griesbach/IDT5604/06 (H1N1); A/sw/Herzlake/IDT5335/06 (H3N2); A/sw/Herzlake/IDT5336/06 (H3N2); A/sw/Herzlake/IDT5337/06 (H3N2); e A/wild boar/Germany/R169/2006 (H3N2).
Outros exemplos específicos de cepas de vírus 20 influenza A incluem, mas não se limitam a: A/Toronto/3141/2009 (H1N1); A/Regensburg/D6/2009 (H1N1); A/Bayern/62/2009 (H1N1); A/Bayern/62/2009 (H1N1); A/Bradenburg/19/2009 (H1N1); A/Bradenburg/20/2009 (H1N1); A/Distrito Federal/2611/2009 (HINT); A/Mato 25 Grosso/2329/2009 (H1N1); A/Sao Paulo/1454/2009 (H1N1); A/Sao Paulo/2233/2009 (H1N1); A/Stockholm/37/2009 (H1N1); A/Stockholm/41/2009 (H1N1); A/Stockholm/45/2009 (HINT); A/swine/Alberta/OTH-33-1/2009 (H1N1); A/swine/Alberta/OTH- 33-14/2009 (HIN1); A/swine/Alberta/OTH-33-2/2009 (H1N1); 30 A/swine/Alberta/OTH-33-21/2009 (HINT); A/swine/Alberta/OTH-
33-22/2009 (H1N1) ; A/swine/Alberta/OTH-33-23/2009 (H1N1); A/swine/Alberta/OTH-33-24/2009 (H1N1); A/swine/Alberta/OTH- 33-25/2009 (H1N1); A/swine/Alberta/OTH-33-3/2009 (H1N1); A/swine/Alberta/OTH-33-7/2009 (H1N1); A/Beijing/502/2009 5 (H1N1); A/Firenze/10/2009 (H1N1); A/Hong Kong/2369/2009 (H1N1) ; A/Italy/85/2009 (H1N1); A/Santo Domingo/572N/2009 (H1N1); A/Catalonia/385/2009 (H1N1); A/Catalonia/386/2009 (H1N1); A/Catalonia/387/2009 (H1N1); A/Catalonia/390/2009 (H1N1); A/Catalonia/394/2009 (H1N1) ; A/Catalonia/397/2 009 (H1N1); A/Catalonia/398/2009 (H1N1); A/Catalonia/399/2009 (H1N1); A/Sao Paulo/2303/2009 (H1N1); A/Akita/1/2009 (H1N1); A/Castro/JXP/2009 (H1N1); A/Fukushima/1/2009 (H1N1); A/Israel/276/2009 (H1N1); A/Israel/277/2009 (H1N1) ; A/Israel/70/2009 (H1N1); A/Iwate/1/2009 (H1N1); A/Iwate/2/2009 (H1N1); A/Kagoshima/1/2009 (H1N1); A/Osaka/180/2009 (H1N1); A/Puerto Montt/Bio87/2009 (H1 Nl); A/Sao Paulo/2303/2009 (H1N1); A/Sapporo/1/2009 (H1N1) ; A/Stockholm/30/2009 (H1N1); A/Stockholm/31/2009 (H1N1) ; A/Stockholm/32/2009 (H1N1); A/Stockholm/33/2009 (H1N1); A/Stockholm/34/2009 (H1N1); A/Stockholm/35/2009 (H1N1); A/Stockholm/36/2009 (H1N1); A/Stockholm/38/2009 (H1N1); A/Stockholm/39/2009 (H1N1); A/Stockholm/40/2009 (H1N1;) A/Stockholm/42/2009 (H1N1); A/Stockholm/43/2009 (H1N1); A/Stockholm/44/2009 (H1N1); A/Utsunomiya/2/2009 (H1N1); A/WRAIR/0573N/2009 (H1N1); e A/Zhejiang/DTID-ZJU01/2009 (H1N1).
Exemplos não-limitantes de vírus influenza B incluem cepa Aichi/5/88, cepa B/Brisbane/60/2008; Akita/27/2001, cepa Akita/5/2001, cepa Alaska/16/2000, cepa Alaska/1777/2005, cepa Argentina/69/2001, cepa
Arizona/146/2 005, cepa Arizona/148/2005, cepa Bangkok/163/90, cepa Bangkok/34/99, cepa Bangkok/460/03, cepa Bangkok/54/99, cepa Barcelona/215/03, cepa
Beijing/15/84, cepa Beijing/184/93, cepa Beijing/243/97, 5 cepa Beijing/43/75, cepa Beijing/5/76, cepa Beijing/76/98,
cepa Belgium/WV106/2002, cepa Belgium/WV107/2002, cepa Belgium/WVl09/2002, cepa Belgium/WV114/2002, cepa
Belgium/WV122/2002, cepa Bonn/43, cepa Brazil/952/2001, cepa Bucharest/795/03, cepa Buenos Aires/161/00), cepa Buenos Aires/9/95, cepa Buenos Aires/SW16/97, cepa Buenos
Aires/VL518/99, cepa Canada/464/2001, cepa Canada/464/2002,
cepa Chaco/366/00, cepa Chaco/R113/00, cepa Cheju/303/03, cepa Chiba/447/98, cepa Chongqing/3/2000, isolado clínico de cepa SA1 Thailand/2002, isolado clínico de cepa SA10 Thaïland/2002, isolado clínico de cepa SA100 Philippïnes/2002, isolado clínico de cepa SAIOl
Philippines/2002, isolado clínico de cepa SA110
Philippines/2002), isolado clínico de cepa SA112 Philippines/2002, isolado clínico de cepa SA113 Philippines/2002, isolado clínico de cepa SA114
Philippines/2002, isolado clínico de cepa SA2 Thailand/2002,
isolado clínico de cepa SA20 Thailand/2002, isolado clínico de cepa SA38 Philippines/2002, isolado clínico de cepa SA39 Thailand/2002, isolado clínico de cepa SA99 Philippines/2002, cepa CNIC/27/2001, cepa Colorado/2597/2004, cepa Cordoba/VÁ418/99, cepa
Czechoslovakia/16/89, cepa Czechoslovakia/69/90, cepa Daeku/10/97, cepa Daeku/45/97, cepa Daeku/47/97, cepa Daeku/9/97, cepa B/Du/4/78, cepa B/Durban/39/98, cepa Durban/43/98, cepa Durban/44/98, cepa B/Durban/52/98, cepa
Durban/55/98, cepa Durban/56/98, cepa England/1716/2005, cepa England/2054/2005), cepa England/23/04, cepa Finland/154/2002, cepa Finland/159/2002, cepa Finland/160/2002, cepa Finland/161/2002, cepa
5 Finland/162/03, cepa Finland/162/2002, cepa Finland/162/91, cepa Finland/164/2003, cepa Finland/172/91, cepa Finland/173/2003, cepa Finland/176/2003, cepa Finland/184/91, cepa Finland/188/2003, cepa Finland/190/2003, cepa Finland/220/2003, cepa
Finland/WV5/2002, cepa Fujian/36/82, cepa Geneva/5079/03, cepa Genoa/11/02, cepa Genoa/2/02, cepa Genoa/21/02, cepa Genova/54/02, cepa Genova/55/02, cepa Guangdong/05/94, cepa Guangdong/08/93, cepa Guangdong/5/94, cepa Guangdong/55/89, cepa Guangdong/8/93, cepa Guangzhou/7/97, cepa
Guangzhou/86/92, cepa Guangzhou/87/92, cepa
Gyeonggi/592/2005, cepa Hannover/2/90, cepa Harbin/07/94, cepa Hawaii/10/2001, cepa Hawaii/1990/2004, cepa
Hawaii/38/2001, cepa Hawaii/9/2001, cepa Hebei/19/94, cepa
Hebei/3/94) , cepa Henan/22/97, cepa Hiroshima/23/2001, cepa Hong Kong/110/99, cepa Hong Kong/1115/2002, cepa Hong
Kong/112/2001, cepa Hong Kong/123/2001, cepa Hong Kong/1351/2002, cepa Hong Kong/1434/2002, cepa Hong Kong/147/99, cepa Hong Kong/156/99, cepa Hong Kong/157/99, cepa Hong Kong/22/2001, cepa Hong Kong/22/89, cepa Hong Kong/336/2001, cepa Hong Kong/666/2001, cepa Hong Kong/9/89,
cepa Houston/1/91, cepa Houston/1/96, cepa Houston/2/96, cepa Hunan/4/72, cepa Ibaraki/2/85, cepa ncheon/297/2005, cepa India/3/89, cepa India/77276/2001, cepa Israel/95/03, cepa Israel/WV187/2002, cepa Japan/1224/2005, cepa Jiangsu/10/03, cepa Johannesburg/1/99, cepa
It 397 /64 8 s
Johannesburg/96/01, cepa Kadoma/1076/99, cepa Kadoma/122/99, cepa Kagoshima/15/94, cepa Kansas/22992/99, cepa
Khazkov/224/91, cepa Kobe/1/2002, cepa, cepa Kouchi/193/99, cepa Lazio/1/02, cepa Lee/40, cepa Leningrad/129/91, cepa 5 Lissabc>n/2/90) , cepa Los Angeles/1/02, cepa Lusaka/270/99, cepa Lyon/1271/96, cepa Malaysia/83077/2001, cepa
Maputo/1/99, cepa Mar del Plata/595/99, cepa Maryland/1/01, cepa Memphis/1/01, cepa Memphis/12/97-MA, cepa
Michigan/22572/99, cepa Mie/1/93, cepa Milano/1/O1, cepa
10 Minsk/318/90, cepa Moscow/3/03, cepa Nagoya/20/99, cepa
Nanchang/1/00, cepa Nashville/107/93, cepa Nashville/45/91, cepa Nebraska/2/01, cepa Netherland/801/90, cepa
Netherlands/429/98, cepa Nova York/1/2002, cepa NIB/48/90, cepa Ningxia/45/83, cepa Norway/1/84, cepa Oman/16299/2001, 15 cepa Osaka/1059/97, cepa Osaka/983/97-V2, cepa
Oslo/1329/2002, cepa Oslo/1846/2002, cepa Panama/45/90, cepa Paris/329/90, cepa Parma/23/02, cepa Perth/211/2001, cepa Peru/1364/2004, cepa Philippines/5072/2001, cepa Pusan/270/99, cepa Quebec/173/98, cepa Quebec/465/98, cepa 20 Quebec/7/01, cepa Roma/1/03, cepa Saga/S172/99, cepa
Seoul/13/95, cepa Seoul/37/91, cepa Shangdong/7/97, cepa
Shanghai/361/2002) , cepa Shiga/T30/98, cepa Sichuan/379/99, cepa Singapore/222/79, cepa Spain/WV27/2002, cepa Stockholm/10/90, cepa Switzerland/5441/90, cepa
25 Taiwan/0409/00, cepa Taiwan/0722/02, cepa Taiwan/97271/2001, cepa Tehran/80/02, cepa Tokyo/6/98, cepa Trieste/28/02, cepa Ulan Ude/4/02, cepa United Kingdom/34304/99, cepa USSR/100/83, cepa Victoria/103/89, cepa Vienna/1/99, cepa Wuhan/356/2000, cepa WV194/2002, cepa Xuanwu/23/82, cepa 30 Yamagata/1311/2003, cepa Yamagata/K500/2001, cepa
Alaska/12/96, cepa GA/86, cepa NAGASAKI/1/87, cepa Tokyo/942/96, cepa B/Wisconsin/1/2010 e cepa Rochester/02/2001.
Exemplos não-limitantes de vírus influenza C 5 incluem cepa Aichi/1/81, cepa Ann Arbor/l/50, cepa Aomori/74, cepa California/78, cepa England/83, cepa Greece/79, cepa Hiroshima/246/2000, cepa Hiroshima/252/2000, cepa Hyogo/1/83, cepa Johannesburg/66, cepa Kanagawa/1/76, cepa Kyoto/1/79, cepa Mississippi/80, cepa Miyagi/1/97, cepa Miyagi/5/2000, cepa Miyagi/9/96, cepa Nara/2/85, cepa NewJersey/76, cepa pig/Beijing/115/81, cepa Saitama/3/2000) , cepa Shizuoka/79, cepa Yamagata/2/98, cepa Yamagata/6/2000, cepa Yamagata/9/96, cepa BERLIN/1/85, cepa ENGLAND/892/8, cepa GREAT LAKES/1167/54, cepa JJ/50, cepa PIG/BEIJING/10/81, cepa PIG/BEIJING/439/82) , cepa TAYLOR/1233/47, e cepa C/YAMAGATA/10/81.
Em determinadas modalidades, os vírus influenza aqui proporcionados têm um fenótipo atenuado. Em modalidades específicas, o vírus influenza atenuado se 20 baseia em vírus influenza A. Em outras modalidades, o vírus influenza atenuado se baseia em vírus influenza B. Ainda em outras modalidades, o vírus influenza atenuado se baseia em vírus influenza C. Em outras modalidades, o vírus influenza atenuado pode compreender genes ou segmentos de genoma a partir de uma ou mais cepas ou subtipos de vírus influenza A, influenza B, e/ou influenza C. Em algumas modalidades, o vírus de cadeia principal atenuado compreende genes a partir de um vírus influenza A e um vírus influenza B.
Em modalidades específicas, a atenuação de vírus influenza é desejada de modo que o vírus permaneça, pelo r 399/648
4. k menos parcialmente, contagioso e pode replicar in vivo, mas gere somente títulos baixos resultando de níveis subclínicos de infecção que sejam não-patogênicos. Esses vírus atenuados são especialmente adequados para 5 modalidades descritas no presente documento em que o vírus ou uma composição imunogênica deste é administrado a um indivíduo para induzir uma resposta imune. A atenuação do vírus influenza pode ser realizada de acordo com qualquer método conhecido na técnica, tal como, por exemplo, 10 selecionar mutantes virais gerados por mutagênese química, mutação do genoma por engenharia genética, selecionar vírus reassortantes que contenham segmentos com função atenuada, ou seleciona mutantes de vírus condicional (por exemplo, vírus adaptados ao frio). Alternativamente, podem-se usar 15 virus influenza atenuados de ocorrência natural como cadeias principais de vírus influenza para os vetores de vírus influenza.
Em ulna modalidade, um virus influenza pode ser atenuado, pelo menos em parte, em virtude da substituição 20 do gene HA do vírus influenza parental por um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento. Em algumas modalidades, um vírus influenza pode ser atenuado, pelo menos em parte, modificando-se por engenharia genética o vírus influenza para expressar um 25 gene NS1 mutado que confira a capacidade do vírus de antagonizar a resposta de interferon celular (IFN). Exemplos dos tipos de mutações que podem ser introduzidas no gene de vírus influenza NS1 incluem deleções, substituições, inserções e combinações destes. Uma ou mais 30 mutações podem ser introduzidas em qualquer parte do gene
• 400/648 4 NS1 (por exemplo, terminação N, terminação C ou em algum lugar entre estas) e/ou o elemento regulatório do gene NS1.
Em uma modalidade, um vírus influenza atenuado compreende um genoma tendo uma mutação em um gene de vírus influenza 5 NS1 resultando em uma deleção que consiste em 5, de preferência, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 126, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170 ou 175 resíduos de aminoácido da terminação C de NS1, ou uma deleção entre 10 5-170, 25-170, 50-170, 100-170, 100-160, ou 105-160 resíduos de aminoácido a partir da terminação C. Em outra modalidade, um vírus influenza atenuado compreende um genoma tendo uma mutação em um gene de vírus influenza NS1 de modo que codifique uma proteína NS1 de resíduos de 15 aminoácido 1-130, resíduos de aminoácido 1-126, resíduos de aminoácido 1-120, resíduos de aminoácido 1-115, resíduos de aminoácido 1-110, resíduos de aminoácido 1-100, resíduos de aminoácido 1-99, resíduos de aminoácido 1-95, resíduos de aminoácido 1-85, resíduos de aminoácido 1-83, resíduos de 20 aminoácido 1-80, resíduos de aminoácido 1-75, resíduos de aminoácido 1-73, resíduos de aminoácido 1-70, resíduos de aminoácido 1-65, ou resíduos de aminoácido 1-60, em que o aminoácido de terminação N seja número 1. Para exemplos de mutações NS1 e vírus influenza que compreendem um NS1 25 mutado, vide, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 6.468.544 e 6.669.943; e Li et a1., 1999, J. Infect. Dis. 179:1132- 1138, estando cada uma dessas aqui incorporada em sua totalidade a título de referência.
5.8 VETORES TlP VTRfiq T\TÃn-T1~TFT.TTWr,T7b a 401/648 Em um aspecto, proporcionam-se vírus não- influenza contendo um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina (HA) de vírus influenza quimérico). Em uma modalidade 5 específica, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) é incorporado aos vírions do vírus não-influenza. Em uma modalidade específica, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) está contido/expresso por um 10 vírus purificado (por exemplo, purificado por placa) ou isolado. Os vírus não-influenza podem ser conjugados em porções que direcionem os vírus a tipos celulares particulares, como células imunes. Em algumas modalidades, os vírions do vírus não-influenza incorporaram neles ou 15 expressam um polipeptideo heterólogo além de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). O polipeptídeo heterólogo pode ser um polipeptídeo que tenha uma atividade de imunopotenciação, ou que direcione o vírus não-influenza a um tipo celular particular, tal como um anticorpo que 20 reconheça um antígeno em um tipo celular específico ou um ligante que ligue um receptor específico em um tipo celular específico. Vide a Seção 5.4 supra para exemplos de tais polipeptídeos heterólogos.
Os vírus não-influenza contendo/expressando um 25 polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) podem ser produzidos usando técnicas conhecidas pelos indivíduos versados na técnica. Os vírus não-influenza contendo um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) podem ser produzidos fornecendo-se em trans o polipeptídeo de 30 hemaglutinina de gripe (HA) durante a produção de vírions usando técnicas conhecidas pelos indivíduos versados na técnica. Alternativamente, a replicação de um vírus não- influenza parental que compreende um genoma modificado por engenharia genética para expressar um polipeptídeo de 5 hemaglutinina de gripe (HA) em células suscetíveis a infecções com o vírus, em que a função de hemaglutinina é proporcionada em trans produzirá virus de progênie contendo o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA).
Qualquer tipo, subtipo ou cepa de vírus que incluem, mas não se limitam a, cepas de ocorrência natural, variantes ou mutantes, vírus mutagenizados, reassortantes e/ou vírus geneticamente modificados podem ser usados como um vetor de vírus não-influenza. Em uma modalidade específica, o vírus não-influenza parental não é um vírus de ocorrência natural. Em outra modalidade específica, o vírus não-influenza parental é um vírus modificado por engenharia genética. Em determinadas modalidades, um vírus envelopado é preferencial para a expressão de uma polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) ligado à membrana descrito no presente documento.
Em uma modalidade exemplificadora, o vetor de vírus não-influenza é um vírus da doença de Newcastle (NDV).
Em outra modalidade, o vetor de vírus não-influenza é um vírus da vaccinia. Em outras modalidades exemplificadoras não-limitantes, o vetor de vírus não-influenza é adenovírus, vírus adeno-associado (AAV), vírus da hepatite B, retrovírus (tal como, por exemplo, um gamaretrovírus, como o genoma do Vírus de Célula-Tronco de Camundongos (MSCV) ou um Vírus da Leucemia de Murinos (MLV), por exemplo, vírus da leucemia de merino Maloney, oncorretrovirus, ou lentivírus), um alfavírus (por exemplo, vírus da encefalite equina venezuelana), um rabdovírus, tal como o vírus da estomatite vesicular ou papilomavírus, poxvírus (como, por exemplo, vírus da vaccinia, um vetor MVA-T7, ou varíola de 5 galinha), metapneumovírus, vírus do sarampo, herpesvírus, tal como o vírus da herpes simples, ou espumavírus. Vide, por exemplo, Lawrie and Tumin, 1993, Cur. Opin. Genet. Develop. 3, 102-109 (vetores retrovirais); Bett et a1., 1993, J. Virol. 67, 5911 (vetores adenovirais); Zhou et a1., 1994, J. Exp. Med. 179, 1867 (vetores de vírus adeno- associado); Dubensky et a1., 1996, J. Virol, 70, 508-519 (vetores virais da família da varíola incluindo o vírus da vaccinia e os vírus da varíola aviária e vetores virais do gênero de alfavírus, como aqueles derivados a partir de Vírus Sindbis e Vírus da Floresta de Semliki); Patente U.S.
No. 5.643.576 (vírus da encefalite equina venezuelana); WO 96/31625 (VSV); Ohe et a1., 1995, Human Gene Therapy 6, 325-333; Woo et a1., WO 94/12629; Xiao & Brandsma, 1996, Nucleic Acids. Res. 24, 2630-2622 (papilomavirus); e Bukreyev and Collins, 2008, Curr Opin Moi Ther. 10:46-55 (NDV), estando cada um desses aqui incorporado em sua totalidade a título de referência.
Em uma modalidade específica, o vetor de vírus não-influenza é NDV. Qualquer tipo, subtipo ou cepa de NDV pode servir como a cadeia principal que é modificada por engenharia genética para expressar um polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA), que inclui, mas não se limita a, cepas de ocorrência natural, variantes ou mutantes, vírus mutagenizados, reassortantes e/ou vírus modificados por engenharia genética. Em uma modalidade específica, o
NOV que serve como a cadeia principal para engenharia genética é uma cepa de ocorrência natural. Em determinadas modalidades, o NDV que serve como a cadeia principal para engenharia genética é uma cepa lítica. Em outras 5 modalidades, o NOV que serve como a cadeia principal para engenharia genética é uma cepa não-lítica. Em determinadas modalidades, o NOV que serve como a cadeia principal para engenharia genética é uma cepa lentogênica. Em algumas modalidades, oNDV que serve como a cadeia principal para 10 engenharia genética é uma cepa mesogênica. Em outras modalidades, o NOV que serve como a cadeia principal para engenharia genética é uma cepa velogênica. Exemplos específicos de cepas de NDV incluem, mas não se limitam a, cepa 73-T, cepa Ulster, cepa MTH-68, cepa Italien, cepa 15 Hickman, cepa PV701, cepa Hitchner BI, cepa La Sota, cepa • YG97, cepa MET95, e cepa F48E9. Em uma modalidade específica, o NOV que serve como a cadeia principal para engenharia genética é a cepa Hitchner S1. Em outra modalidade específica, o NOV que serve como a cadeia 20 principal para engenharia genética é a cepa La Sota.
Em uma modalidade, o NDV usado como a cadeia principal para um vetor de vírus não-influenza é modificado por engenharia genética para expressar uma proteína F modificada ná qual o sítio de clivagem da proteína F é 25 substituído por um contendo um ou dois resíduos de arginina adicionais, permitindo que o sítio de clivagem mutante seja ativado por proteases simultaneamente expressas da família (urina. Exemplos específicos de NDVs que expressam tal proteína F modificada incluem, mas não se limitam a, 30 rNDV/F2aa e rNDV/F3aa. Para uma descrição de mutações introduzidas em uma proteína NDV para produzir uma proteína F modificada com um sítio de clivagem mutado, vide, por exemplo, Park et al. (2006) "Engineered viral vaccine constructs with dual specificity: Avian influenza and 5 Newcastle disease." PNAS USA 103: 8203-2808, que se encontra aqui incorporado em sua totalidade a título de referência.
Em uma modalidade, o vetor de vírus não-influenza é um poxvírus. Um vetor de poxvírus pode se basear em 10 qualquer membro da família poxviridae, em particular, um vírus da vaccinia ou um vírus da varíola aviária (por exemplo, tal como varíola de canário, varíola de galinha, etc.) que fornece sequências adequadas para vetores da vaccine. Em uma modalidade específica, o vetor poxviral é 15 um vetor de vírus da vaccinia. Os vírus da vaccinia adequados incluem, mas não se limitam a, cepa Copenhagen (VC-2) (Goebel, et a1., Virol 179: 247-266, 1990; Johnson, et ai., Virol. 196: 381-401, 1993), cepa Copenhagen modificada (NYVAC) (Patente U.S. No. 6.265.189), a cepa 20 WYETH e a cepa Ankara modificada (MVA) (Antoine, et a1., Virol. 244: 365-396, 1998). Outros poxvírus adequados incluem cepas da varíola de galinha, como os vetores ALVAC e TROVAC que fornecem propriedades desejáveis que sejam altamente atenuadas (vide, por exemplo, a Patente U.S. No. 25 6,265,189; Tartaglia et a1., In AIDS Research Reviews, Koff, et a1., eds., Vol. 3, Marcel Dekker, N.Y., 1993; e Tartaglia et a1., 1990, Reviews in Immunology 10: 13-30, 1990) .
Os métodos de modificar por engenharia genética 30 vírus não-influenza para expressar polipeptídeos de influenza são bem conhecidos na técnica, assim como os métodos para atenuar, propagar, e isolar e purificar tais vírus. Para tais técnicas em relação a vetores NDV, vide, por exemplo, a Publicação Internacional No. WO 01/04333; as 5 Patentes U.S. Nos. 7.442.379, 6.146.642, 6.649.372,
6.544.785 e 7.384.774; Swayne et a1. (2003). Avian Dis. 47:1047-1050; e Swayne et a1. (2001). J. Virol. 11868-11873, estando cada um desses aqui incorporado em sua totalidade a título de referência. Para tais técnicas em relação a poxvírus, vide, por exemplo, Piccini, et ai., Methods of Enzymology 153: 545-563, 1987; Publicação Internacional No. WO 96/11279; Patente U.S. No. 4.769.330; Patente U.S. No.
4.722.848; Patente U.S. No. 4.769.330; Patente U.S. No.
4.603.112; Patente U.S. No. 5.110,587; Patente Ü.S. No. 15 5.174.993; EP 83 286; EP 206 920; Mayr et ai., Infection 3: 6-14, 1975; e Sutter and Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10847-10851, 1992. Em determinadas modalidades, o vírus não-influenza é atenuado.
Considerações exemplificadoras para a seleção de um vetor de vírus não-influenza, particularmente para uso em composições para administração a um indivíduo, são seguras, tem baixa toxicidade, estabilidade, especificidade de tipo celular, e imunogenicidade, particularmente, antigenicidade do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe 25 (HA) expresso pelo vetor de vírus não-influenza.
5.9 PARTICULAS TTPO víris R \.TTRncc(Mnc Os polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descritos no presente documento podem ser incorporados em vetores de partícula tipo vírus (VLP),
por exemplo, VLPs purificados/isolados. Em geral, os VLPs compreendem um polipeptídeo viral tipicamente derivado a partir de uma proteína estrutural de um vírus. Em algumas modalidades, os VLPs não são capazes de replicação. Em 5 determinadas modalidades, os VLPs podem ser desprovidos de um genoma completo de um vírus ou compreender uma porção do genoma de um vírus. Em algumas modalidades, os VLPs não são capazes de infectar uma célula. Em algumas modalidades, os VLPs expressam em sua superfície uma ou mais porções de 10 direcionamento viral (por exemplo, glicoproteína de superfície de vírus) ou não-viral (por exemplo, anticorpo ou proteína) conhecidas pelos indivíduos versados na técnica ou descritas no presente documento. Em algumas modalidades, os VLPs compreendem um polipeptídeo de 15 hemaglutinina de gripe (HA) e uma proteína estrutural viral, como HIV gag. Em uma modalidade específica, os VLPs compreendem um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) e um polipeptídeo de HIV gag.
Métodos para produção e caracterização de VLPs 20 recombinantemente produzidos foram descritos com base em vários vírus, incluindo vírus influenza (Bright et a1. (2007) Vaccine. 25:3871), vírus do papiloma humano tipo 1 (Hagnesee et a1. (1991) J. Virol. 67:315), vírus do papiloma humano tipo 16 (Kirnbauer et a1. Proc. Natl. Acad. 25 Sci. (1992)89:12180), HIV -1 (Haffer et al., (1990) J. Virol. 64:2653), e hepatita A (Winokur (1991) 65:5029), sendo que cada um desses encontra aqui incorporado em sua totalidade. Os métodos para expressar VLPs que contêm proteínas NOV são proporcionados por Pantua et a1. (2006) J. Virol. 80:11062- 30 11073, e na Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana
No. 20090068221, publicada em 12 de março de 2009, sendo que cada um desses se encontra aqui incorporado em sua totálidadë. Em uma modalidade específica, os VLPs que compreendem o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) 5 descrito no presente documento são gerados usando baculovírus, conforme descrito na seção dos Exemplos abaixo. Em outras modalidades, os VLPs que compreendem os polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) descritos no presente documento são gerados usando células 293T, conforme descrito na seção dos Exemplos abaixo.
Em modalidades específicas, VLPs, por exemplo, VLPs que compreendem um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), são expressos em células (por exemplo, células 293T). Em determinadas modalidades, os VLPs são expressos em células que expressem glicoproteinas de superfície que compreendem ácido siálico. De acordo com tais modalidades, as células são culturadas na presença de neuraminidase (por exemplo, viral de neuraminidase bacteriana). Em determinadas modalidades, VLPs, por exemplo, VLPs que compreendem um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), são expressas em células que não expressem glicoproteínas de superfície que compreendem ácido siálico.
Em uma modalidade específica, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) pode ser incorporado em uma virossoma. Uma virossoma contendo um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) pode ser produzida usando técnicas conhecidas pelos indivíduos versados na técnica. Por exemplo, uma virossoma pode ser produzida interrompendo-se um vírus purificado, extraindo o genoma, e remontando as partículas com as proteínas virais (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA)) e lipídeos para formar partículas de lipídeo contendo prçteiras_virais.
5.10 VETORES BACTERIANOS 5 Em uma modalidade específica, as bactérias podem ser modificadas por engenharia genética para expressar um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito no presente documento. As bactérias adequadas para 10 expressão de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) incluem, mas não se limitam a, Listeria, Salmonella, Shigella sp., Mycobacterium tuberculosis, E. soli, Neisseria meningitides, Brucella abortus, Brucella melitensis, Borrelia burgdorferi, Lactobacillus, 15 Canpylóbacter, Lactococcus, Bifidobacterium, e Francisella tularensis. Em uma modalidade específica, as bactérias modificadas por engenharia genética para expressar um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) são atenuadas.
As técnicas para a produção de bactérias modificadas por 20 engenharia genética para expressar um polipeptídeo heterólogo são conhecidas na técnica e podem ser aplicadas à expressão de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). Vide, por exemplo, a Publicação de Pedido de Patente Norte-Americana No. 20080248066, publicada em 9 de outubro 25 de 2008, e a Publicação de Pedido de Patente Norte- Americana No. 20070207171, publicada em 6 de setembro de 2007, estando cada uma dessas aqui incorporada em sua totalidade a título de referência. Em determinadas modalidades, os vetores bacterianos usados possuem a 30 capacidade de realizar uma glicosilação N-ligada, por exemplo, tais bactérias possuem naturalmente um mecanismo de N-glicosilação (por exemplo, Campylobacter) ou foram geneticamente modificadas para possuírem um mecanismo de N- glicosilação. 5 5.11 VETORES DE PLANTAS E ALGAS
Em determinadas modalidades, plantas (por exemplo, plantas do gênero Nícotiana) podem ser modificadas por engenharia genética para expressar um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento.
Em modalidades específicas, as plantas são modificadas por engenharia genética para expressar um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito no presente documento através de um procedimento de agroinfiltração usando métodos conhecidos na técnica.
Por exemplo, os ácidos nucléicos que codificam um gene de interesse, por exemplo, um gene que codifica um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, são introduzidos em uma cepa de Agrobactéria.
De modo subsequente, a cepa é desenvolvida em uma cultura líquida e as bactérias resultantes são lavadas e suspensas em uma solução tampão.
As plantas são, então, expostas (por exemplo, através de injeção ou submersão) à Agrobactéria que compreende os ácidos nucléicos que codificam um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento de modo que a Agrobactéria transforme o gene de interesse em uma porção das células vegetais. a polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) é, então, transientemente expresso pela planta e pode ser 30 isolado usando métodos conhecidos na técnica e descritos no presente documento. (Para exemplos específicos, vide Shoji et al., 2008, Vaccine, 26(23) :2930-2934; e D'Aoust et al., 2008, J. Plant Biotechnology, 6(9):930-940). Em uma modalidade específica, a planta é uma planta de tabaco 5 (isto é, Nicotiana tabacum). Em outra modalidade específica, a planta é um parente da planta de tabaco (por exemplo, Nicotiana benthamiana). Em outra modalidade específica, os polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) descritos no presente documento são expressos em uma espécie de soja. Em outra , modalidade específica, os polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) descritos no presente documento são expressos em uma espécie de milho. Em outra modalidade específica, os polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) descritos no presente documento são expressos em uma espécie de arroz.
Em outras modalidades, as algas (por exemplo, Chiamydomonas reinhardtíi) podem ser modificadas por engenharia genética para expressar um polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento (vide, por exemplo, Rasala et al., 2010, Plant Biotechnology Journal (Publicado online em 7 de março de 2010)).
Em determinadas modalidades, as plantas usadas para expressar os polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento são modificadas por engenharia genética para expressar componentes de um sistema de N-glicosilação (por exemplo, um sistema de N- glicosilação de bactérias ou mamíferos), isto é, as plantas podem realizar N-glicosilação.
As células vegetais que podem ser usadas para expressar os polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) e métodos para a produção de proteínas usando sistemas de cultura de célula vegetal são descritos, por exemplo, nas 5 Patentes U.S. Nos. 5.929.304; 7.504.560; 6.770.799;
6.551.820; 6.136.320; 6.034.298; 5.914.935; 5.612.487; e
5.484.719, Publicações de Pedido de Patente U.S. Nos. 2009/02.08477, 2009/0082548, 2009/0053762, 2008/0038232, 2007/0275014 e 2006/0204487, e Shoji et al., 2008, Vaccine, 10 26(23):2930-2934, e D'Aoust et al., 2008, 1. Plant Biotechnology, 6(9):930-940 (que se encontram aqui incorporados em suas totalidades a título de referência).
5.12 GERAÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA POLIPEPTÌDEOS DE HEMAGLUTININA DE GRIPE (HA) 15 Os polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA), ácidos nucléicos que codificam tais polipeptídeos, ou vetores que compreendem tais ácidos nucléicos ou polipeptídeos descritos no presente documento podem ser usados para produzir anticorpos de neutralização contra 20 influenza, — por exemplo, contra a região de caule de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza. Em uma modalidade específica, os polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA), ácidos nucléicos que codificam tais polipeptídeos, ou vetores que compreendem tais ácidos 25 nucléicos ou polipeptídeos descritos no presente documento podem ser administrados a um indivíduo não-humano (por exemplo, um camundongo, coelho, rato, porquinho-da-índia, etc.) para induzir uma resposta imune que inclui a produção de anticorpos que podem ser isolados usando técnicas 30 conhecidas pelos indivíduos versados na técnica (por exemplo, cromatografia por imunoafinidade, centrifugação, precipitação, etc.).
Alternativamente, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento pode ser usado 5 para triar os anticorpos a partir de bibliotecas de anticorpos. Por exemplo, urn polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) isolado pode ser imobilizado em um suporte sólido (por exemplo, um gel de silica, uma resina, um filme de plástico derivado, uma microesfera de vidro, algodão, uma microesfera de plástico, uma microesfera de poliestireno, um gel de alumina, ou um polissacarídeo, uma microesfera magnética), e triados para ligação a anticorpos. Como uma alternativa, os anticorpos podem ser imobilizados em um suporte sólido e triados para ligação a polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) isolados. Qualquer ensaio de triagem, tal como um ensaio de posicionamento, ELISA, ressonância plasmônica superficial, ou outro ensaio de triagem de anticorpo conhecido na técnica pode ser usado para triar os anticorpos que se ligam a polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). A biblioteca de anticorpos triada pode ser uma biblioteca de anticorpos comercialmente disponível, uma biblioteca gerada in vitro, ou uma biblioteca obtida identificando-se e clonando-se ou isolando-se anticorpos a partir de um indivíduo infectado com influenza. Em modalidades particulares, a biblioteca de anticorpos é gerada a partir de um sobrevivente de uma epidemia de vírus influenza. As bibliotecas de anticorpos podem ser geradas de acordo com métodos conhecidos na técnica. Em uma modalidade particular, a biblioteca de anticorpos é gerada clonando-se os anticorpos e usando-os em bibliotecas de exibição de faço ou em uma biblioteca de exibição de fagemida.
Os anticorpos identificados nos métodos descritos no presente documento podem ser testados para atividade de 5 neutralização e falta de autorreatividade usando os ensaios biológicos conhecidos na técnica ou descritos no presente documento. Em uma modalidade, um anticorpo isolado de um animal não-humano ou uma biblioteca de anticorpo neutraliza um polipeptídeo de hemaglutinina a partir de mais de um 10 subtipo influenza. Em algumas modalidades, um anticorpo produzido ou identificado usando um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), um ácido nucléico que codifica tal polipeptideo, ou um vetor que codifica tal ácido nucléico ou polipeptídeo neutraliza um vírus influenza H3. 15 Em algumas modalidades, um anticorpo produzido ou identificado usando um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, ou um vetor que compreende tal ácido nucléico ou polipeptídeo neutraliza 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 20 12, 13, 14, 15, ou 16 ou mais subtipos ou cepas de vírus influenza. Em uma modalidade, o anticorpo de neutralização neutraliza um ou mais vírus influenza A e um ou mais vírus influenza B. Em modalidades particulares, o anticorpo de neutralização não é, ou não se liga ao mesmo epítopo que 25 CR6261, CR6325, CR6329, CR6307, CR6323, 2A, D7, D8, FiO, G17, H40, A66, D80, E88, E90, H98, C179 (produzido por hibridoma FERM BP-4517; clones vendidos por Takara Bio, Inc.
(Otsu, Shiga, Japão)), e/ou AI3C (FERM BF-4516); ou qualquer outro anticorpo descrito em Ekiert DC et a1. (2009) 30 Antibody Recognition of a Highly Conserved Influenza Virus
Epitope. Science (publicado em Science Express, 26 de fevereiro de 2009); Kashyap et a1. (2008) Combinatorial antibody libraries from survivors of the Turkish H5N1 avian influenza outbreak reveal virus neutralization strategies. 5 Proc Natl Acad Sci U S A 105: 5986-5991; Sui et al. (2009) Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses. Nat Struct Mol Biol 16: 265-273; Patentes U.S. Nos. 5.589.174,
5.631.350, 6.337.070, e 6.720.409; Pedido Internacional No. PCT/US2007/068983 publicado como uma Publicação Internacional No. WO 2007/134237; Pedido Internacional No. PCT/US2008/075998 publicado como uma Publicação Internacional No. WO 2009/036157; Pedido Internacional No. PCT/EP2007/059356 publicado como uma Publicação Internacional No. WO 2008/028946; e Pedido Internacional No.
PCT/US2008/085876 publicado como uma Publicação Internacional No. WO 2009/079259. Em outras modalidades, o anticorpo de neutralização não é um anticorpo descrito em Wang et a1. (2010) "Broadly Protective Monoclonal Antibodies against H3 Influenza Viruses following Sequential Immunization with Different Hemagglutinins," PLOS Pathogens 6(2):1-9. Em modalidades particulares, o anticorpo de neutralização não usa o segmento Ig VH1-69. Em algumas modalidades, a interação do anticorpo de neutralização com o antígeno não é mediada exclusivamente pela cadeia pesada.
Os anticorpos identificados ou produzidos usando um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), um ácido nucléicc que codifica tal polipeptídeo, ou um vetor que compreende tal ácido nucléico ou polipeptídeo incluem moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um sítio de ligação a antígeno que se liga especificamente a um polipeptídeo de hemaglutinina. As 5 moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2 , IgG3, IgG4, IgAl e IgA2 ) ou subclasse de molécula de imunoglobulina. Os anticorpos incluem, mas não se limitam a, anticorpos monoclonais, anticorpos multi- específicos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos quiméricos, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), Fvs ligados a dissulfeto (sdFv), e anticorpos anti- idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id a anticorpos produzidos ou identificados usando um método descrito no presente documento), e fragmentos de ligação a epítopo de qualquer um dos anteriores.
Os anticorpos produzidos ou identificados usando polipeptideos de hemaglutinina de gripe (HA), ácidos nucléicos que codificam tal polipeptídeo ou um vetor que compreende tal ácido nucléico ou polipeptídeo podem ser usados em imunoensaios diagnósticos, imunoterapia passiva, e geração de anticorpos antiidiotípicos. Os anticorpos antes de serem usados em imunoterapia passiva podem ser modificados, por exemplo, os anticorpos podem ser quimerizados ou humanizados. Vide, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 4.444.887 e 4.716.111; e Publicações Internacionais Nos. WO 98/46645, WO 98/5 0433, WO 98/24893, W© 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, e WO 91/10741, estando cada uma dessas aqui incorporada em sua totalidade a título de referência, para revisões sobre a geração de anticorpos quiméricos e humanizados. Além disso, a capacidade dos anticorpos de neutralizarem polipeptídeos de hemaglutinina e a especificidade dos anticorpos para os 5 polipeptídeos podem ser testadas antes de usar os anticorpos em imunoterapia passiva. Vide a Seção 5.11 infra para uma discussão referente ao uso de anticorpos de neutralização para a prevenção ou tratamento de doenças causadas por infecção de vírus influenza. 10 Os anticorpos produzidos ou identificados usando um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, ou um vetor que compreende tal ácido nucléico ou polipeptídeo podem ser usados para monitorar a eficiência de uma progressão de 15 terapia e/ou doença. Qualquer sistema de imunoensaio conhecido na técnica pode ser usado para este propósito incluindo, mas sem limitar-se a, sistemas de ensaio competitivos e não-competitivos usando técnicas como radioimunoensaios, ELISA (ensaios imunoabsorventes ligados 20 a enzimas), imunoensaios de "sanduíche", reações de precipitina, reações de gel precipitina por difusão de gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinação, ensaios de fixação de complemento, ensaios imunorradiométricos, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios de proteína A e 25 ensaios de imunoeletroforese, para citar alguns.
Os anticorpos produzidos ou identificados usando um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, ou um vetor que compreende tal ácido nucléico ou polipeptídeo podem ser 30 usados na produção de anticorpo antiidiotípicos. O anticorpo antiidiotípico pode, então, ser usado para imunização, a fim de produzir uma subpopulação de anticorpos que ligam um antígeno particular de influenza, por exemplo, um epítopo de neutralização de um polipeptídeo 5 de hemaglutinina (Jerne, 1974, Ann. Immunol. (Paris) 125c:373; Jerne et ai., 1982, EMBO J. 1:234, aqui incorporado em sua totalidade a título de referência).
5.13 ESTIMULO DE nF'T,11TAC OOM POTTD~timTnwnc nL- HEMAGLUTININA DE GRIPE (HA) 10 Em outro aspecto, proporcionam-se métodos para estimular células ex vivo com um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito no presente documento. Essas células, por exemplo, células 15 dentríticas, podem ser usadas in vitro para gera anticorpos contra o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) ou podem ser administrados a um indivíduo, por exemplo, através de uma técnica de transferência adotiva conhecida na técnica. Vide, por exemplo, a Publicação de Pedido de 20 Patente Norte-Americana No. 20080019998, publicada em 24 de janeiro de 2008, que se encontra aqui incorporada em sua totalidade a título de referência, para uma descrição de técnicas de transferência adotiva. Em determinadas modalidades, quando as células que foram estimuladas ex 25 vivo com um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento forem administradas a um indivíduo, as células não são células de mamíferos (por exemplo, células CB-1).
Em um exemplo não-limitante, um vetor, por 30 exemplo, um vetor de vírus influenza, modificado por engenharia genética para expressar um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento pode ser usado para gera células dentríticas (DCs) que expressam o polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) e 5 exibem propriedades imunoestimulantes dirigidas contra um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza. Essas DCs podem ser usadas para expandir a memória de células T e são estimulantes potentes de células T, incluindo clones de linfócito T citotóxico específicos a polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). Vide Strobel at a1., 2000, Human Gene Therapy 11:2207-2218, que se encontra aqui incorporado em sua totalidade a título de referência.
Um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento pode ser distribuído a uma célula alvo de modo que permita que o polipeptídeo contate a célula alvo, por exemplo, um DC, e distribui o polipeptídeo à célula alvo. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglut nina de gripe (HA) é distribuído a um indivíduo, conforme descrito no presente documento. Em algumas modalidades, as células contatadas com o polipeptídeo podem ser isoladas e propagadas.
Em determinadas modalidades, um polipept`.deo de hemaglutinina de gripe (HA) é distribuído a uma célula alvo in vitro. As técnicas conhecidas pelos indivíduos versados na técnica podem ser usadas para distribuir o polipeptídeo a células alvo. Por exemplo, as células alvo podem ser contatadas pelo polipeptídeo em uma placa, tubo ou outro recipiente de cultura de tecido. 0 polipeptídeo pode ser suspenso em um meio e adicionado aos poços de uma placa, tubo ou outro recipiente de cultura. O meio contendo o polipeptideo pode ser adicionado antes de revestir as células ou após as células terem sido revestidas. De preferência, as células alvo são incubadas com o polipeptídeo durante um período de tempo suficiente para 5 permitir que o polipeptídeo contate as células. Em determinadas modalidades, as células são incubadas com o polipeptídeo durante cerca de 1 hora ou mais, cerca de 5 horas ou mais, cerca de 10 horas ou mais, cerca de 12 horas ou mais, cerca de 16 horas ou mais, cerca de 24, horas ou mais, cerca de 48 horas ou mais, cerca de 1 hora a cerca de 12 horas, cerca de 3 horas a cerca de 6 horas, cerca de 6 horas a cerca de 12 horas, cerca de 12 horas a cerca de 24 horas, ou cerca de 24 horas a cerca de 48 horas. Em determinadas modalidades, quando o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) estiver em um vírus, o contato das células alvo compreende infectar as células com o vírus.
As células alvo podem ser provenientes de qualquer espécie, incluindo, por exemplo, seres humanos, camundongos, ratos, coelhos e parquinhos-da-índia. Em algumas modalidades, as células alvo são DCs obtidas a partir de um indivíduo saudável ou de um indivíduo em necessidade de tratamento. Em determinadas modalidades, as células alvo são DCs obtidos a partir de um indivíduo no qual é desejado estimular uma resposta imune ao polipeptídeo. Os métodos de obter células a partir de um indivíduo são bem conhecidos na técnica.
5.14 COMPOSIÇÕES Os ácidos nucléicos, vetores, polipeptídeos, bactérias, anticorpos, ou células descritos no presente documento (algumas vezes referidos como "compostos ativos")
podem ser incorporados em composições. Em uma modalidade específica, as composições são composições farmacêuticas, como composições imunogênicas (por exemplo, formulações de vacina). As composições farmacêuticas proporcionadas no 5 presente documento podem estar em qualquer forma que permita que a composição seja administrada a um indivíduo. Em uma modalidade específica, as composições farmacêuticas são adequadas para administração veterinária e/ou humana.
As composições podem ser usadas em métodos de prevenir ou tratar uma doença de vírus influenza.
Em urna modalidade, uma composição farmacêutica compreende urn polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico), em uma mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, uma composição farmacêutica compreende um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, em uma mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, uma composição farmacêutica compreende um vetor de expressão que compreende um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), em uma mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, uma composição farmacêutica compreende um vírus influenza ou um vírus não-influenza contendo um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), em uma mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, uma composição farmacêutica compreende um vírus influenza ou um vírus não-influenza tendo um genoma modificado por engenharia genética para expressar um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), em mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável.
Em outra modalidade, uma composição farmacêutica compreende uma partícula tipo vírus ou virossoma contendo um polipeptídeo 5 de hemaglutinina de gripe (HA) , em uma mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável.
Em outra modalidade,
uma composição farmacêutica compreende uma bactéria expressa ou modificada por engenharia genética para expressar um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), 10 em uma mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável.
Em outra modalidade, uma composição farmacêutica compreende células estimuladas com um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), em uma mistura com um carreador farmaceuticamente aceitável. 15 Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica pode compreender uma ou mais outras terapias além de uma terapia que utiliza um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento.
Conforme o uso em questão, o termo 20 "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência regulatória do Governo Federal ou de um governo estadual ou listado na Farmacopeia Norte-Americana ou outra farmacopeia genericamente reconhecida para uso em animais, e, mais particularmente, em seres humanos.
O termo 25 "carreador" se refere a um diluente, adjuvante, excipiente,
ou veículo com o qual a composição farmacêutica é administrada.
Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser empregadas como carreadores líquidos, particularmente para soluções 30 injetáveis.
Os excipientes adequados incluem amido, glicose,
lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propileno, glicol, água, etanol e similares.
5 Exemplos de carreadores farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. A formulação deve se adequar ao modo de administração.
Em uma modalidade específica, as composições farmacêuticas são formuladas de modo que sejam adequadas para a rota pretendida de administração a um indivíduo Por exemplo, a composição farmacêutica pode ser formulada de modo que seja adequada para administração parenteral, oral, intradérmica, transdérmica, colorretal, intraperìtoneal, e retal. Em uma modalidade específica, a composição farmacêutica pode ser formulada para administração intravenosa, oral, intraperitoneal, intranasal, intratraqueal, subcutânea, intramuscular, tópica, intradérmica, transdérmica ou pulmonar. 20 Em determinadas modalidades, polímeros biodegradáveis, como acetato de vinil etileno, polianidridos, polietileno glicol (PEGuilação), polzemros de metacrilato de polimetil, polilactidas, poli(lactida-co- glicolidas), ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, e ácido polilático, podem ser usados como carreadores. Em algumas modalidades, os compostos ativos são preparados com carreadores que aumentam a proteção do composto contra uma eliminação rápida a partir do corpo, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes e 30 sistemas de distribuição microencapsulados. Os métodos para preparação de tais formulações ficarão aparentes aos indivíduos versados na técnica. Os lipossomos ou micelas também podem ser usados como carreadores farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com 5 métodos conhecidos pelos indivíduos versados na técnica, por exemplo, conforme descrito na Patente Ü.S. No.
4.522.811. Em determinadas modalidades, as composições farmacêuticas compreendem um ou mais adjuvantes.
Em modalidades específicas, as composições imunogênicas descritas no presente documento são formulações monovalentes. Em outras modalidades, as composições imunogênicas descritas no presente documento são formulações multivalentes. Em um exemplo, uma formulação multivalente compreende mais de um vetor que expressa um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). Em
V determinadas modalidades, uma formulação multivalente pode compreender um ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) diferentes expressos usando um único vetor.
Em determinadas modalidades, as composições farmacêuticas descritas no presente documento compreendem, ainda, um preservativo, por exemplo, timerosal derivado de mercúrio. Em uma modalidade específica, as composições farmacêuticas descritas no presente documento compreende timerosal a 0,001% a 0,01%. Em outras modalidades, as composições farmacêuticas descritas no presente documento não compreendem um preservativo. Em uma modalidade específica, utiliza-se timerosal durante a fabricação de uma composição farmacêutica descrita no presente documento e o timerosal é removido através de etapas de purificação seguindo a produção da composição farmacêutica, isto é, a composição farmacêutica contém quantidades residuais de tirnerosal (<0,3 pg de mercúrio por dose após purificação; tais composições farmacêuticas são consideradas produtos isentos de timerosal). 5 Em determinadas modalidades, as composições farmacêuticas descritas no presente documento compreendem, ainda, proteínas do ovo (por exemplo, ovalbumina ou outras proteínas do ovo). A quantidade de proteína do ovo nas composições farmacêuticas descritas no presente documento 10 pode variar de cerca de 0,0005 a cerca de 1,2 pg de proteína do ovo a 1 ml de composição farmacêutica. Em outras modalidades, as composições farmacêuticas descritas no presente documento não compreendem proteínas do ovo.
Em determinadas modalidades, as composições 15 farmacêuticas descritas no presente documento compreendem, ainda, um ou mais agentes antimicrobianos (por exemplo, antibióticos) que incluem, mas não se limitam a, gentamicina, neomicina, polimixina (por exemplo, polimixina B), e canamicina, estreptomicina. Em outras modalidades, as 20 composições farmacêuticas descritas no presente documento não compreendem antibióticos.
Em determinadas modalidades, as composições farmacêuticas descritas no presente documento compreendem, ainda, um ou mais componentes usados para inativar um vírus, 25 por exemplo, formalina ou formaldeído ou um a detergente, tal como deoxicolato de sódio, octoxinol 9 (Triton X-100), e octoxinol 10. Em outras modalidades, as composições farmacêuticas descritas no presente documento não compreendem componentes usados para inativar um vírus.
Em determinadas modalidades, as composições farmacêuticas descritas no presente documento compreendem, ainda, gelatina. Em outras modalidades, as composições farmacêuticas descritas no presente documento não 5 compreendem gelatina.
Em determinadas modalidades, as comtosições farmacêuticas descritas no presente documento compreendem, ainda, um ou mais tampões, por exemplo, tampão de fosfato e tampão de glutamato de fosfato de sacarose. Em outras modalidades, as composições farmacêuticas descritas no presente documento não compreendem tampões.
Em determinadas modalidades, as composições farmacêuticas descritas no presente documento compreendem, ainda, um ou mais sais, por exemplo, cloreto de sódio, cloreto de cálcio, fosfato de sódio, glutamato monossódico, e sais de alumínio (por exemplo, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, alume (sulfato de alumínio e potássio), ou uma mistura desses sais). Em outras modalidades, as composições farmacêuticas descritas no presente documento não compreendem sais.
Em modalidades específicas, as composições farmacêuticas descritas no presente documento são vacinas de vírus influenza com baixo teor de aditivo, isto é, as composições farmacêuticas não compreendem um ou mais aditivos comumente encontrados em vacinas de vírus influenza. As vacinas de influenza com baixo teor de aditivo foram descritas (vide, por exemplo, Publicação Internacional No. PCT/IB2008/002238 publicada como Publicação Internacional No. WO 09/001217 que se encontra aqui incorporada em sua totalidade a título de referência).
As composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser incluídas em um recipiente, pacote, ou dispensador junto com instruções para administração.
5 As composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser armazenadas antes do uso, por exemplo, as composições farmacêuticas podem ser armazenadas congeladas (por exemplo, em cerca de -20°C ou em cerca de - 70°C); armazenadas em condições refrigeradas (por exemplo, 10 em cerca de 4°C); ou armazenadas em temperatura ambiente (vide o Pedido Internacional No. PCT/IB2007/001149 publicado como Publicação Internacional No. WQ 07/110776, que se encontra aqui incorporado em sua totalidade a título de referência, para métodos de armazenar composições que 15 compreendem vacinas de influenza sem refrigeração).
Em determinadas modalidades, quando o composto ativo em uma composição farmacêutica descrita no presente documento for uma célula modificada por engenharia genética para expressar um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe 20 (HA), as células na composição farmacêutica não são células de mamíferos (por exemplo, células CB-1).
5.14.1 VACINAS SUB-UNITÁRIAS Em uma modalidade específica, proporcionam-se no presente documento vacinas sub-unitárias que compreendem um 25 polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito no presente documento. Em algumas modalidades, Uma vacina sub-unitária compreende um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) e uma ou mais 30 glicoproteínas de superfície (por exemplo, neuraminidase de virus influenza), outras porções de direcionamento, ou adjuvantes.
Em modalidades específicas, uma vacina sub- unitária compreende um único polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). Em outras modalidades, uma vacina sub- 5 unitária compreende dois, três, quatro ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA). Em modalidades específicas, os polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) usados em uma vacina sub-unitária não são ligados à membrana, isto é, são solúveis. 10 Em determinadas modalidades, proporcionam-se no presente documento vacinas sub-unitárias que compreendem cerca de 10 pg a cerca de 60 pg de um ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) descritos no presente documento, cerca de 0,001% a 0,01% de timerosal, cerca de 15 0,1 pg a cerca de 1,0 pg de proteína de ovo de galinha, cerca de 1,0 pg a cerca de 5,0 pg de polimixina, cerca de 1,0 pg a cerca de 5,0 pg de neomicina, cerca de 0,1 pg a cerca de 0,5 pg de betapropiolactona, e cerca de 0,001 a cerca de 0,05 % em p/v de etoxilado de nonilfenol por dose. 20 Em uma modalidade específica, uma vacina sub- unitária proporcionada no presente documento compreende ou consiste em uma dose de 0,5 ml que compreende 45 pg de polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) proporcionados no presente documento, S 1,0 pg de mercúrio (do timerosal),
25 <- 1,0 pg de proteína de ovo de galinha (isto é, ovalbumina), 3,75 pg de polimixina, e < 2,5 pg de neomiciria.
Em algumas modalidades, uma vacina sub-unitária proporcionada no presente documento compreende, ainda, ou consiste em não mais de 0,5 pg de betapropiolactona, e não mais de 0,015 30 em % p/v de etoxilado de nonilfenol por dose.
Em algumas modalidades, a vacina sub-unitária de dose de 0,5 ml é embalada em uma seringa pré-carregada.
Em uma modalidade específica, uma vacina sub- unitária proporcionada no presente documento consiste em um 5 frasco de múltiplas doses de 5,0 ml (0,5 ml por dose) que compreende 45 pg de polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) proporcionados no presente documento, 25,0 pg de mercúrio (do timerosal), 1,0 pg de proteína de ovo de galinha (isto é, ovalbumina), -< 3,75 pg de polimixina, 10 2,5 pg de neomicina. Em algumas modalidades, uma vacina sub-unitária proporcionada no presente documento compreende, ainda, ou consiste em não mais de 0,5 pg de betapropiolactona, e não mais de 0,015 em p/v de etoxilato de nonilfenol por dose. 15 Em uma modalidade específica, a vacina sub- • unitária é preparada usando vírus influenza que foi propagado em ovos de galinha embrionados (isto é, os componentes da vacina sub-unitária (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA)) são isolados 20 do vírus que foi propagado em ovos de galinha embrionados). Em outra modalidade especifica, a vacina sub-unitária é preparada usando vírus influenza que não foi propagado em ovos de galinha embrionados (isto é, os componentes da vacina sub-unitária (por exemplo, um polipeptídeo de 25 hemaglutinina de gripe (HA)) são isolados do vírus que não foi propagado em ovos de galinha embrionados). Em outra modalidade específica, a vacina sub-unitária é preparada usando vírus influenza que foi propagado em células de mamíferos, por exemplo, células humanas imortalizadas (vide, 30 por exemplo, o Pedido Internacional No. PCT/EP2006/067566 publicado como uma Publicação Internacional No. NO 07/045674 que se encontra aqui incorporada em sua totalidade a título de referência) ou células do rim de cães, como células MDCK (vide, por exemplo, o Pedido 5 Internacional No. PCT/IB2007/003536 publicado como uma Publicação Internacional No. WO 08/032219 que se encontra aqui incorporada em sua totalidade a título de referência) (isto é, os componentes da vacina sub-unitária (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA)) são isolados do vírus que foi propagado em células de mamíferos). Em outra modalidade específica, os polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) em uma vacina sub-unitária são preparados usando um vetor de expressão, por exemplo, um vetor viral, um vetor vegetal ou um vetor bacteriano (isto é, os polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) na vacina sub-unitária são obtidos/isolados de um vetor de expressão).
5.14.2 VACINAS DE VÌRUS VIVO Em uma modalidade, proporcionam-se no presente documento composições imunogénicas (por exemplo, vacinas) que compreendem vírus vivo contendo um polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico). Em outra modalidade, proporcionam-se no presente documento composições imunogênicas (por exemplo, vacinas) que compreendem vírus vivo que seja modificado por engenharia genética para codificar um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), que seja expresso por um vírus de progênie produzido nos indivíduos administrados com as composições. 30 Em modalidades específicas, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) é ligado à membrana. Em outras modalidades específicas, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) não é ligado à membrana, isto é, é solúvel. Em modalidades particulares, o vírus vivo é um vírus influenza, tal como 5 descrito na Seção 5.7, supra. Em outras modalidades, o vírus vivo é um vírus não-influenza, tal como descrito na Seção 5.8, supra. Em algumas modalidades, o vírus vivo é atenuado. Em algumas modalidades, uma composição imunogénica compreende dois, três, quatro ou mais vírus vivos contendo ou modificado por engenharia genética para expressar dois, três, quatro ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) diferentes.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se no presente documento composições imunogênicas (por exemplo, vacinas) que compreendem cerca de 105 a cerca de 1010 unidades de foco fluorescente (FFU) de vírus influenza atenuado vivo contendo um ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) descritos no presente documento, cerca de 0,1 a cerca de 0,5 mg de glutamato monossódico, cerca de 1,0 a cerca de 5,0 mg de gelatina de porcino hidrolisada, cerca de 1,0 a cerca de 5,0 mg de arginina, cerca de 10 a cerca de 15 mg de sacarose, cerca de 1,0 a cerca de 5,0 mg de fosfato de potássio dibásico, cerca de 0,5 a cerca de 2,0 mg de fosfato de potássio monobásico, e cerca de 0,001 a cerca de 0,05 dag/ml de sulfato de gentamicina por dose. Em algumas modalidades, as composições imunogênicas (por exemplo, vacinas) são embaladas como aspersores pré-carregados contendo doses únicas de 0,2 ml.
Em uma modalidade específica, proporcionam-se no presente documento composições imunogênicas (por exemplo, vacinas) que compreendem 1065 a 10' 7 ' S de FFU de vírus influenza atenuado vivo contendo um ou mais polipeptídeos 5 de hemaglutinina de gripe (HA) descritos no presente documento, 0,188 mg de glutamato monossódico, 2,0 mg de gelatina de porcino hidrolisada, 2,42 mg de arginina, 13,68 mg de sacarose, 2,26 mg de fosfato de potássio dibásico, 0,96 mg de fosfato de potássio monobásico, e < 0,015 pg/ml de sulfato de gentamicina por dose. Em algumas modalidades, as composições imunogênicas (por exemplo, vacinas) são embaladas como aspersores pré-carregados contendo doses únicas de 0,2 ml.
Em uma modalidade específica, o vírus vivo que contém um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) é propagado em ovos de galinha embrionados antes de seu uso em uma composição imunogênica descrita no presente documento. Em outra modalidade específica, o vírus vivo que contém um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) não é propagado em ovos de galinha embrionados antes de seu uso em uma composição imunogênica descrita no presente documento. Em outra modalidade específica, o vírus vivo que contém um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) é propagado em células de mamíferos, por exemplo, células humanas imortalizadas (vide, por exemplo, o Pedido Internacional No. PCT/EP2006/067566 publicado como uma Publicação Internacional No. WO 07/045674 que se encontra aqui incorporada em sua totalidade a título de referência) ou células do rim de cães, tais como células MDCK (vide, por exemplo, o Pedido Internacional No. PCT/IB2007/003536 publicado como uma Publicação Internacional No. WO 08/032219 que se encontra aqui incorporada em sua totalidade a título de referência) antes de seu uso em uma composição imunogênica descrita no presente documento. 5 Uma composição imunogênica que compreende um vírus vivo para administração a um indivíduo pode ser preparada porque a multiplicação do vírus no indivíduo pode levar a um estímulo prolongado de tipo e magnitude similar ao que ocorre em infecções naturais, e, portanto, conferem 10 uma imunidade duradoura substancial.
5.14.3 VACINAS DE VÍRUS INATIVADO Em uma modalidade, proporcionam-se no presente documento composições imunogênicas (por exemplo, vacinas) que compreendem um vírus inativado contendo um polipeptídeo 15 de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico). Em modalidades específicas, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) é ligado à membrana. Em modalidades particulares, o vírus inativado é um vírus influenza, tal 20 como descrito na Seção 5.7, supra. Em outras modalidades, o vírus inativado é um vírus não-influenza, tal como descrito na Seção 5.8, supra. Em algumas modalidades, uma composição imunogênica compreende dois, três, quatro ou mais vírus inativados contendo dois, três, quatro ou mais 25 polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) diferentes. Em determinadas modalidades, as composições imunogênicas de vírus inativado compreendem um ou mais adjuvantes.
Podem-se usar técnicas conhecidas pelos indivíduos versados na técnica para motivar vírus contendo 30 um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). Os métodos comuns usam formalina, calor, ou detergente para inativação. Vide, por exemplo, a Patente U.S. No. 6.635.246, que se encontra aqui incorporada em sua totalidade a título de referência. Outros métodos incluem aqueles descritos nas 5 Patentes U.S. Nos. 5.891.705; 5.106.619 e 4.693.981, que se encontram aqui incorporadas em suas totalidades a título de referência.
Em determinadas modalidades, proporcionam-se no presente documento composições imunogênicas (por exemplo, 10 vacinas) que compreendem vírus influenza inativado de modo que cada dose da composição imunogênica compreenda cerca de 15 a cerca de 60 pg de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, cerca de 1,0 a cerca de 5,0 mg de cloreto de sódio, cerca de 20 a cerca de 15 100 pg de fosfato de sódio monobásico, cerca de 100 a cerca de 500 pg de fosfato de sódio dibásico, cerca de 5 a cerca de 30 pg de fosfato de potássio mornobásico, cerca de 5 a cerca de 30 pg de cloreto de potássio, e cerca de 0,5 a cerca de 3,0 pg de cloreto de cálcio. Em algumas 20 modalidades, as composições imunogênicas (por exemplo, vacinas) são embaladas como doses únicas de 0,25 ml ou 0,5 ml. Em outras modalidades, as composições imunogênicas (por exemplo, vacinas) são embaladas como formulações de múltiplas doses. 25 Em determinadas modalidades, proporcionam-se no presente documento composições imunogênicas (por exemplo, vacinas) que. compreendem vírus influenza inativado de modo que cada dose da composição imunogênica compreenda cerca de 15 a cerca de 60 pg de um polipeptídeo de hemaglutinina de 30 gripe (HA) descrito no presente documento, cerca de 0,001%
a 0,01 de timerosal, cerca de 1,0 a cerca de 5,0 mg de cloreto de sódio, cerca de 20 a cerca de 100 pg de fosfato de sódio monobásico, cerca de 100 a cerca de 500 pg de fosfato de sódio dibásico, cerca de 5 a cerca de 30 pg de 5 fosfato de potássio monobásico, cerca de 5 a cerca de 30 pg de cloreto de potássio, e cerca de 0,5 a cerca de 3.0 pg de cloreto de cálcio por dose. Em algumas modalidades, as composições imunogênicas (por exemplo, vacinas) são embaladas como doses únicas de 0,25 ml ou 0,5 ml. Em outras 10 modalidades, as composições imunogênicas (por exemplo, vacinas) são embaladas como formulações de múltiplas doses.
Em uma modalidade específica, as composições imunogênicas (por exemplo, vacinas) proporcionadas no presente documento são embaladas como doses únicas de 0,25 15 ml e compreendem 22,5 pg de um polipeptídeo de • hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento,
2.05 mg de cloreto de sódio, 40 pg de fosfato de sódio monobásico, 150 pg de fosfato de sódio dibásico, 10 pg de fosfato de potássio monobásico, 10 pg de cloreto de 20 potássio, e 0,75 pg de cloreto de cálcio por dose.
Em uma modalidade específica, as composições imunogênicas (por exemplo, vacinas) proporcionadas no presente documento são embaladas como doses únicas de 0,5 ml e compreendem 45 pg de um polipeptídeo de hemaglutinina 25 de gripe (HA) descrito no presente documento, 4,1 mg de cloreto de sódio, 80 pg de fosfato de sódio monobásico, 300 pg de fosfato de sódio dibásico, 20 pg de fosfato de potássio monobásico, 20 pg de cloreto de potássio, e 1,5 pg de cloreto de cálcio por dose.
Em uma modalidade específica, as composições imunogênicas (por exemplo, vacinas) são embaladas como formulações de múltiplas doses que compreendem ou consistem em 5,0 ml de vacina (0,5 ml por dose) e compreendem 24,5 pg 5 de mercúrio (do timerosal), 45 pg de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente docunlenLo, 4,1 mg de cloreto de sódio, 80 pg de fosfato de sódio monobásico, 300 pg de fosfato de sódio dibásico, 20 pg de fosfato de potássio monobásico, 20 pg de cloreto de potássio, e 1,5 pg de cloreto de cálcio por dose.
Em uma modalidade específica, o vírus inativado que contém um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) foi propagado em ovos de galinha embrionados antes da sua inativação e uso subsequente em uma composição imunogenica descrita no presente documento. Em outra modalidade específica, o vírus inativado que contém um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) não foi propagado em ovos de galinha embrionados antes de sua inativação e uso subsequente em uma composição imunogénica descrita no presente documento. Em outra modalidade específica, o vírus inativado que contém um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) foi propagado em células de mamíferos, por exemplo, células humanas imortalizadas (vide, por exemplo, o Pedido Internacional No. PCT/EP2006/067566 publicado como uma Publicação Internacional No. WC 07/045674 que se encontra aqui incorporada em sua totalidade a título de referência) ou células do rim de cães, tais como células MDCK (vide, por exemplo, o Pedido Internacional No. PCT/1B2007/003536 publicado como uma Publicação Internacional No. WO 08/032219 que se encontra aqui incorporada em sua totalidade a título de referência) antes de sua inativação e uso subsequente em uma composição imunogênica descrita no presente documento.
5.14.4 VACINA DE VÌRUS DIVIDIDO 5 Em uma modalidade, uma composição imunogênica que compreende um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) é uma vacina de vírus dividido. Em algumas modalidades, a vacina de vírus dividido contém dois, 10 três, quatro ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) diferentes. Em determinadas modalidades, o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) é/foi ligado à membrana. Em determinadas modalidades, as vacinas de vírus dividido compreendem um ou mais adjuvantes. 15 As técnicas para produzir vacinas de vírus • dividido são conhecidas pelos indivíduos versados na técnica. A título de exemplo não-limitante, uma vacina de vírus influenza dividido pode ser preparada usando partículas inativadas interrompidas por detergentes. Um 20 exemplo de uma vacina de vírus dividido que pode ser adaptada para uso de acordo com os métodos descritos no presente documento é a fluzone®, Vacina de Vírus Influenza (Zonal Purified, Subvirion) para uso intramuscular, que é formulada como uma suspensão estéril preparada a partir de 25 vírus influenza propagados em ovos de galinha embrionados.
Os fluidos contendo vírus são colhidos e inativados com formaldeído. 0 vírus influenza é concentrado e purificado em uma solução de gradiente de densidade de sacarose linear usando uma centrífuga de fluxo contínuo. O vírus é, então, 30 quimicamente interrompido usando um tensoativo não-iónico,
octoxinol-9, (Triton® X-100 - Uma marca registrada de Union Carbide, Co.) que produz um "vírus dividido." 0 vírus dividido é, então, purificado por meios químicos e suspenso em uma solução de cloreto de sódio isotônico tamponada com 5 fosfato de sódio.
Em determinadas modalidades, proporcionam--se no presente documento vacinas de vírus dividido que compreendem cerca de 10 pg a cerca de 60 pg de um ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) descritos no presente documento, cerca de 0,01 a cerca de 1,0 mg oetoxinol-10 (TRITON X-l00Ú, cerca de 0,5 a 0,5 mg de succinato de hidrogênio a-tocoferil, cerca de 0,1 a 1,0 mg de polisorbato 80 (Tween 80), cerca de 0,001 a cerca de 0,003 pg de hidrocortisona, cerca de 0,05 a cerca de 0,3 pg de sulfato de gentamcina, cerca de 0,5 a cerca de 2,0 pg de proteína de ovo de galinha (ovalbumina), cerca de 25 a 75 pg de formaldeído, e cerca de 25 a 75 pg de deoxicolato de sódio.
Em uma modalidade específica, uma vacina de vírus dividido proporcionada no presente documento compreende ou consiste em uma dose de 0,5 ml q eu compreende 45 pg de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (s) proporcionado no presente documento, 0,085 mg de octoxinol-10 (TRITON X-100®, - 0,1 mg de succionato de hidrogênio a-tocoferil, <- 0,415 mg de polisorbato 80 (Tween 80), 5 0,0016 pg de hidrocortisona, ~ 0,15 pg de sulfato de gentamcina, < 1,0 de proteína de ovo de galinha (ovalbumina), < 50 pg de formaldeído, e < 50 pg de deoxicolato de sódio. Em algumas modalidades, a vacina sub-
unitária de dose de 0,5 ml é embalada em uma seringa pré- carregada.
Em uma modalidade específica, a vacina de vírus dividido é preparada usando vírus influenza que foi 5 propagado em ovos de galinha embrionados. Em outra modalidade específica, a vacina de vírus dividido é preparada usando vírus influenza que não foi propagado em ovos de galinha embrionados. Em outra modalidade específica, a vacina de vírus dividido é preparada usando vírus 10 influenza que foi propagado em n células de mamíferos, por exemplo, células humanas imortalizadas (vide, por exemplo, PCT/EP2006/067566 publicado como WO 07/045674 que se encontra aqui incorporado em sua totalidade a título de referência) ou células do rim de cães, tais como células 15 MDCK (vide, por exemplo, PCT/IB2007/003536 publicado como • W 08/032219 que se encontra aqui incorporado em sua totalidade a título de referência).
5.14.5 ADJUVANTES Em determinadas modalidades. a.. rnrnn~,~; (-? R 20 descritas no presente documento compreendem, ou são administradas em combinação com um adjuvante. 0 adjuvante para administração em combinação com uma composição descrita no presente documento pode ser administrado antes, simultaneamente, ou após a administração da dita composição. 25 Em algumas modalidades, o termo 'adjuvante" se refere a um composto que quando administrado em conjunto ou como parte de uma composição descrita no presente documento aumenta, aprimora e/ou estimula a resposta imune a um polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um 30 polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico),
mas quando o composto por administrado sozinho não gera uma resposta imune ao polipeptídeo. Em algumas modalidades, o adjuvante gera uma resposta imune ao polipeptídeo e não produz uma alergia ou outra reação adversa. Os adjuvantes 5 podem aprimorar uma resposta imune por vários mecanismos incluindo, por exemplo, recrutamento de linfócito, estímulo de células B e/ou T, e estímulo de macrófagos.
Em determinadas modalidades, um adjuvante aumenta a resposta intrínseca ao polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) sem causar alterações conformaciona s no polipeptídeo que aferem a forma qualitativa da resposta. Exemplos específicos de adjuvantes incluem, mas não se limitam a, sais de alumínio (alume) (tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, e sulfato de alumínio), 3 lipídeo A de monofosforil De-©-aci ado (MPL) (vide GB 2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), ASO4 (GlaxoSmithKline), polisorbato 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), compostos de imidazopiridina (vide o Pedido Internacional No. PCT/US2007/064857, publicado como uma Publicação Internacional No. W02007/109812), compostos de imidazoquinoxalina (vide o Pedido Internacional No. PCT/US2007/064858, publicado como uma Publicação Internacional No. W02007/109813) e saponinas, como QS21 (vide Kensil et a1., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); Patente U.S. No. 5.057.540). Em algumas modalidades, o adjuvante é um adjuvante de Freund (completo ou incompleto). Outros adjuvantes são emulsões de óleo em água (como esqualeno ou óleo de amendoim), opcionalmente em combinação com estimulantes imunes, como lipídeo A de monofosforil (vide Stoute et a1., N. Engl. J. Med. 336, 86- 91 (1997)). Outro adjuvante é CpG (Bioworld Today, 15 de novembro de 1998). Esses adjuvantes podem ser usados com ou sem outros agentes imunoestimulantes específicos, como MPL 5 ou 3-DMP, QS21, aminoácidos poliméricos ou monoméricos, como ácido poliglutâmico ou polilisina, ou outros agentes de imunopotenciação descritos na Seção 5.4, supra. Deve-se compreender que formulações diferentes de polipeptideos de hemaglutinina de gripe (HA) podem compreender adjuvantes 10 diferentes ou podem compreender o mesmo adjuvante.
5.15 USOS PROFILÁTICOS E TERAPËUTICOS Em um aspecto, proporcionam-se no presente documento métodos para induzir uma resposta imune em um indivíduo utilizando um composto ativo (isto é, um 15 polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no • presente documento, um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal polipeptídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo) au uma composição 20 descrita no presente documento. Em uma modalidade específica, um método para induzir uma resposta imune a um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza em um indivíduo - compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma quantidade eficaz de um polipeptídeo 25 de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento ou uma composição imunogênica deste. Em outra modalidade, um método para induzir uma resposta imune a um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza em um indivíduo compreende administrar a um indivíduo em 30 necessidade deste uma quantidade eficaz de um ácido nucléico que codifica um polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento ou urna composição imunogênica deste. Em outra modalidade, um método para induzir uma resposta imune a um polipeptídeo de 5 hemaglutinina de vírus influenza em um indivíduo compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma quantidade eficaz de um vetor viral contend© ou expressando um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento ou uma composição imunogênica deste. 10 Ainda em outra modalidade, um método para induzir uma resposta imune a um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza em um indivíduo compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma quantidade eficaz de células estimuladas por um polipeptídeo de hemaglutinina de 15 gripe (HA) descrito no presente documento ou uma composição • farmacêutica deste. Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento usado no método é um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) purificado descrito no presente 20 documento derivado a partir de uma célula de mamífero, uma célula vegetal, ou uma célula de inseto.
Em uma modalidade específica, um método para induzir uma resposta imune a um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza em um indivíduo compreende 25 administrar a um indivíduo em necessidade deste uma vacina sub-unitária descrita no presente documento. Em outra modalidade, um método para induzir uma resposta imune a um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza em um indivíduo compreende administrar a um indivíduo em 30 necessidade deste uma vacina de vírus vivo descrita no presente documento.
Em modalidades particulares, a vacina de vírus vivo compreende um vírus atenuado.
Em outra modalidade, um método para induzir uma resposta imune a um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza em um 5 indivíduo compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma vacina de vírus inativado descrita no presente documento.
Em outra modalidade, um método para induzir uma resposta imune a um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza em um indivíduo compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma vacina de vírus dividido descrita no presente documento.
Em outra modalidade, um método para induzir uma resposta imune a um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza em um indivíduo compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma vacina de partícula tipo vírus descrita no presente documento.
Em outra modalidade, um método para induzir uma resposta imune a um polipeptídeo de hemàglútininà de influenza compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma virossoma descrita no presente documento.
Em outra modalidade, um método para induzir uma resposta imune a um polipeptídeo de hemaglutinina de influenza compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma bactéria que expressa ou modificada por engenharia genética para expressar um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento ou uma composição deste.
Em determinadas modalidades, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento usado no método é um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) purificado descrito no presente documento derivado a partir de uma célula de mamífero, uma célula vegetal, OU uma chula de inseto.
Em algumas modalidades, a resposta imune induzida por um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de 5 hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal polipeptídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo) ou uma composição descrita no presente 10 documento é eficaz para prevenir e/ou tratar urna infecção por vírus influenza causada por qualquer subtipo ou cepa de vírus influenza. Em determinadas modalidades, a resposta imune induzida por um composto ativo ou uma composição descrita no presente documento é eficaz para prevenir e/ou • 15 tratar uma infecção por vírus influenza causada por um subtipo de vírus influenza que pertence a um grupo HA (por exemplo, Grupo 1, que compreende Hl, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, e H16) e não o outro grupo HA (por exemplo, Grupo 2, que compreende H3, H4, H7, HID, H14, e H15) . Por 20 exemplo, a resposta imune induzida pode ser eficaz para prevenir e/ou tratar uma infecção por vírus influenza causada por um vírus influenza que pertence ao grupo HA que consiste em H11, H13, H16, H9, H8, H12, H6, Hl, H5 e H2. Alternativamente, a resposta imune induzida por ser eficaz 25 para prevenir e/ou tratar uma infecção por vírus influenza causada por um vírus influenza que pertence ao grupo HA que consiste em H3, H4, H14, HID, H15 e H7. Em algumas modalidades, a resposta imune induzida por um composto ativo ou uma composição descrita no presente documento é 30 eficaz para prevenir e/ou tratar uma infecção por vírus influenza causada por um, dois, três, quatro ou cinco subtipos de vírus influenza. Em determinadas modalidades, a resposta imune induzida por um composto ativo ou uma composição descrita no presente documento é eficaz para 5 prevenir e/ou tratar uma infecção por vírus influenza causada por seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze subtipos de vírus influenza. Em algumas modalidades, a resposta imune induzida por um composto ativo ou uma composição descrita no presente documento é eficaz para prevenir e/ou tratar uma infecção por vírus influenza causada por uma ou mais variantes dentro do mesmo subtipo de vírus influenza.
Em algumas modalidades, a resposta imune cduzida por um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal polipeptídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo) ou uma composição descrita no presente documento é eficaz para prevenir e/ou tratar uma infecção por vírus influenza causada por ambos os subtipos H1N1 e H2N2. Em outras modalidades, a resposta imune induzida por um composto ativo ou uma composição descrita no presente documento não é eficaz para prevenir e/ou tratar uma infecção por vírus influenza causada por ambos os subtipos H1N1 e H2N2. Em algumas modalidades, a resposta imune induzida por um composto ativo ou uma composição descrita no presente documento é eficaz para prevenir e/ou tratar uma infecção por vírus influenza causada por subtipos H1N1, H2N2, e H3N2. Em algumas modalidades, a resposta imune induzida por um composto ativo ou uma composição descrita no presente documento é eficaz para prevenir e/ou tratar uma infecção por vírus influenza causada por subtipos H3N2. Em outras modalidades, a resposta imune induzida por um 5 composto ativo ou uma composição descrita no presente documento não é eficaz para prevenir e/ou tratar uma infecção por vírus influenza causada por subtipos H3N2.
Em algumas modalidades, a resposta imune induzida por um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de 10 hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal polipeptídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo) ou uma composição descrita no presente 15 documento é eficaz para prevenir e/ou tratar uma doença de vírus influenza causada por qualquer subtipo ou cepa de vírus influenza. Em determinadas modalidades, a resposta imune induzida por um composto ativo ou uma composição descrita no presente documento é eficaz para prevenir e/ou 20 tratar uma doença de vírus influenza causada por um subtipo de vírus influenza que pertence a um grupo HA e não ao outro grupo HA. Por exemplo, a resposta imune induzida pode ser eficaz para prevenir e/ou tratar uma doença de vírus influenza causada por um vírus influenza que pertence ao 25 grupo HA que consiste em H11, H13, H16, H9, H8, H12, H6, H1, H5 e H2. Alternativamente, a resposta imune induzida pode ser eficaz para prevenir e/ou tratar uma doença de vírus influenza causada por um vírus influenza que pertence ao grupo HA que consiste em H3, H4, Hl4, HiC, Hl5 e H7. Em 30 algumas modalidades, a resposta imune induzida por um composto ativo ou uma composição descrita no roresente documento é eficaz para prevenir e/ou tratar uma doença de vírus influenza causada por qualquer um, dois, três, quatro ou cinco subtipos de vírus influenza. Em determinadas 5 modalidades, a resposta imune induzida por um composto ativo ou uma composição descrita no presente documento é eficaz para prevenir e/ou tratar uma doença de vírus influenza causada por quaisquer seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze, treze, quatorze ou quinze subtipos de vírus 10 influenza. Em algumas modalidades, a resposta imune induzida por um composto ativo ou uma composição descrita no presente documento é eficaz para prevenir e/ou tratar uma doença de vírus influenza causada por uma ou mais variantes dentro do mesmo subtipo de vírus influenza. é 15 Em algumas modalidades, a resposta imune induzida por um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou 20 expressando tal polipeptídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo) ou uma composição descrita no cresente documento é eficaz para reduzir sintomas resultantes de uma doença/infecção de vírus influenza. Os sintomas da doença/infecção de vírus influenza incluem, mas não se 25 limitam a, dores no corpo (especialmente articulações e garganta), febre, náuseas, dores de cabeça, irritação nos olhos, cansaço, dor de garganta, olhos ou pele avermelhados, e dores abdominais.
Em algumas modalidades, a resposta imune induzida 30 por um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente doc, imento, um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal polipeptídeo, células estimuladas ror tal 5 polipeptídeo) ou uma composição descrita no presente documento é eficaz para reduzir a hospitalização de um indivíduo que esteja sofrendo de uma doença/infecção de vírus influenza. Em algumas modalidades, a resposta imune induzida por um composto ativo ou uma composição descrita no presente documento é eficaz para reduzir a duração da hospitalização de um indivíduo que esteja sofrendo de uma doença/infecção de vírus influenza.
Em outro aspecto, proporcionam-se no presente documento métodos para prevenir e/ou tratar uma infecção por vírus influenza em um indivíduo utilizando um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal polipeptídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo) ou uma composição descrita no presente documento. Em uma modalidade, um método para prevenir ou tratar uma infecção por vírus influenza em um indivíduo compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste a polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, um vetor contendo ou expressando tal polipeptídeo, ou uma composição de qualquer um dos anteriores. Em uma modalidade específica, um método para prevenir ou tratar uma infecção por vírus influenza em um indivíduo compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma vacina sub-unïtária, uma vacina de vírus vivo, uma vacina de vírus inativado, uma vacina de vírus dividido ou uma vacina de partícula tipo vírus.
Em outro aspecto, proporcionam-se no presente 5 documento métodos para prevenir e/ou tratar uma doença de vírus influenza em um indivíduo utilizando um polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, um vetor contendo ou expressando tal polipeptídeo, ou células estimuladas por tal polipeptídeo. Em uma modalidade específica, um método para prevenir ou tratar uma doença de vírus influenza em um indivíduo compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma quantidade eficaz de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) ou uma composição imunogênica deste. Em outra modalidade, um método para prevenir ou tratar uma doença de vírus influenza em um indivíduo compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma quantidade eficaz de um ácido nucléico que codifica um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) ou uma composição imunogênica deste. Em outra modalidade, um método para prevenir ou tratar uma doença de vírus influenza em um indivíduo compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma quantidade eficaz de um vetor viral contendo ou expressando um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) ou uma composição imunogênica deste. Ainda em outra modalidade, um método para prevenir ou trocar urna doença de vírus influenza em um indivíduo compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma quantidade eficaz de
450/6'B çélulas estimuladas por um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) ou uma composição farmacêutica deste.
Em uma modalidade específica, um método para prevenir ou tratar uma doença de vírus influenza em um 5 indivíduo compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma vacina sub-unitária descrita no presente documento. Em outra modalidade, um método para prevenir ou tratar uma doença de vírus influenza em um indivíduo compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma vacina de vírus vivo descrita no presente documento. Em modalidades particulares, a vacina de vírus vivo compreende um vírus atenuado. Em outra modalidade, úm método para prevenir ou travar uma doença de vírus influenza em um indivíduo compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma vacina de vírus inativado descrita no presente documento. Em outra modalidade, um método para prevenir ou tranar uma doença de vírus influenza em um indivíduo compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma vacina de vírus dividido descrita no presente documento. Em outra modalidade, um método para prevenir ou tratar uma doença de vírus influenza compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma vacina de partícula tipo vírus descrita no presente documento. Em outra modalidade, um método para prevenir ou tratar uma doença de vírus influenza em um indivíduo, que compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma virossoma descrita no presente documento. Em outra modalidade, um método para prevenir ou tratar uma doença de vírus influenza em um indivíduo que compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma bactéria que expressa ou modificada por engenharia genética para expressar un polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) ou uma composição deste.
Em outro aspecto, proporcionam-se no presente 5 documento métodos de imunizar um indivíduo contra uma doença ou infecção de vírus influenza que compreende expor a hemaglutinina de um vírus influenza ao qual o indivíduo seja virgem, isto é, o indivíduo não foi previamente exposto ao vírus influenza e/ou à hemaglutinina do vírus influenza.
Em uma modalidade, proporciona-se um mé`.odo de imunizar um indivíduo contra uma doença ou infecção de vírus influenza que compreende administrar ao dito indivíduo um ou mais vírus influenza, em que cada do dito um ou mais vírus influenza compreende um polipeptidec de hemaglutinina ao qual o indivíduo seja virgem, isto é, o indivíduo não foi previamente exposto a um ou mais vírus influenza. Em uma modalidade específica, um ou mais vírus influenza consistem em um vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e/ou H17. Em outra modalidade específica, o método compreende (i) uma primeira administração de um vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17 e (ii) uma segunda administração de um vírus 25 influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H1D, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que o vírus influenza da primeira administração é de um subtcpo diferente do vírus influenza da segunda administração. A primeira e a segunda administrações podem ser separadas por ao menos 1 30 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses, ou pelo menos 6 meses. Em outra modalidade específica, o método compreende (i) uma primeira administração de um vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17; (ii) uma segunda administração de um vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17; e (iii) uma terceira administração de um vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que os vírus influenza da primeira, segunda, e terceira administrações são de subtipos diferentes. A -primeira, segunda, e terceira administrações podem ser separadas por ao menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 r.Eesos, o pelo menos 15 6 meses.
Em outra modalidade, proporciona-se um método de imunizar um indivíduo contra uma doença ou infecção de vírus influenza que compreende administrar ao dito indivíduo um ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza aos quais o indivíduo seja virgem, isto é, o indivíduo não foi previamente exposto a um ou mais polipeptideos de hemaglutinina de vírus influenza. Em determinadas modalidades, os ditos um ou mais polipeptideos de hemaglutinina de vírus influenza aosquais o indivíduo seja virgem se encontram em uma composição (por exemplo, uma composição que compreende uma vacina). Em determinadas modalidades, um ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza aos quais o indivíduo seja vi-gem se encontram em um vetor, por exemplo, um vetor de vírus influenza. Em determinadas modalidades, um ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza aos quais o indivíduo seja virgem se encontram em um VLP.
Em determinadas modalidades, um ou mais _aolipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza aos quais o indivíduo seja 5 virgem se encontram em uma virossoma.
Em uma modalidade específica, um ou mais vírus polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza consistem em um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza a parti de um vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, Fi8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, e/ou H17. Em outra modalidade específica, o método compreende (i) uma primeira administração de um polipeptídeo de hemag_utinina de vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17 e (ii) uma segunda administração de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que a polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza da primeira administração é de um subtipo diferente do polipeptídeo de hernaglutinina de vírus influenza da segunda administração.
A primeira e a segunda administrações podem ser separadas por ao menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses, ou pelo menos 6 meses.
Em outra modalidade específica, o método compreende i) uma primeira administração de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H71, A8, H9,
H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17; (ii) uma segunda administração de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, HO, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17; e (i=:_i) uma terceira administração de um polipeptideo de hemaglutinina de vírus influenza de subtipo H2, H4, H5, H6, H7, H8, HO, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17, em que os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza da primeira, segunda, e 5 terceira administrações são provenientes de subtipos de vírus influenza diferentes.
A primeira, segunda, e terceira administrações podem ser separadas por ao menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses, ou pelo menos 6 meses. 10 Em outra modalidade, o método compreende ;i) uma primeira administração de um primeiro polipeptídeo HA de gripe descrito no presente documento (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico), um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, um vetor ii contendo ou expressando tal polipeptideo, e (ii) uma segunda administração de um segundo polipeptídeo HA de gripe descrito no presente documento (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico),
em que o primeiro e o segundo polipeptídeos HA de gripe têm 20 o mesmo domínio de tronco.
Em determinadas modalidades, o domínio de cabeça globular do primeiro e segundo polipeptideos HA de gripe são diferentes.
Em determinadas modalidades, o domínio de cabeça globular do primeiro e segundo polipeptideos HA de gripe são provenientes da mesma
25 cepa.
A primeira e a segunda administrações podem ser separadas por ao menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses, ou pelo menos 6 meses.
Em determinadas modalidades, podem- se administrar inoculações estimulantes ao indivíduo em 30 intervalos de 6 a 12 meses após a segunda inoculação.
Em outra modalidade, o método compreende 'i) uma primeira administração de um vírus influenza; e (ii) uma segunda administração de um polipeptídeo HA de gripe descrito no presente documento (por exemplo, um 5 polipeptídeo de hemaglutínina de vírus influenza quimérico), em que o vírus influenza e os polipeptídeo,3 HA de gripe têm o mesmo domínio de tronco. Em determinadas modalidades, o domínio de cabeça globular do vírus influenza e os polipeptídeos HA de gripe são diferentes, A primeira e a segunda administrações podem ser separadas por ao menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses, ou pelo menos 6 meses. Em determinadas modalidades, podem-se administrar inoculações estimulantes ao indivíduo em intervalos de 6 a 12 meses após a segunda inoculação.
Em outro aspecto, proporcionam-se no presente documento métodos para prevenir e/ou tratar uma doença de vírus influenza em um indivíduo administrando-se os anticorpos de neutralização descritos no presente documento. Em uma modalidade específica, um método para prevenir ou tratar uma doença de vírus influenza em um indivíduo compreende administrar a um indivíduo em necessidade deste uma quantidade eficaz de um anticorpo de neutralização descrito no presente documento, ou uma composição farmacêutica deste. Em modalidades particulares, o anticorpo de neutralização é um anticorpo monoclonal. Em determinadas modalidades, o anticorpo de neutralização não é CR6261, CR6325, CR6329, CR6307, CR6323, 'A, L7, D8, F10, G17, H40, A66, D80, E88, E90, H98, C179 (FERN BP-4517), AI3C (FERN BP-4516) ou qualquer outro anticorpo descrito em
456./648 Ekiert DC et ai. (2009) Antibody Recogni_ion of a Highly Conserved Influenza Virus Epitope. Science (publicado em Science Express, 26 de fevereiro de 2009); Kashyap at al. (2008) Combinatorial antibody libraries from survivors of 5 the Turkish H5N1 avian influenza outbreak reveal virus neutralization strategies. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 5986-5991; Sui et a1. (2009) Structural and fin_tional bases for broad-spectrum neutralization of avian and human influenza A viruses. Nat Struct Moi Biol 16: 265-273; 10 Patentes U.S. Nos. 5.589.174, 5.631.350, 6.337.070, e
6.720.409; Pedido Internacional No. ?CT/US2007/068983 publicado como uma Publicação Internacional No. WO 2007/134237; Pedido Internacional No. 8CT/US2008;'075998 +W publicado como uma Publicação Internacional "'ç_ WO M4& 15 2009/036157; Pedido Internacional No. PCT/EP2007/059356 publicado como uma Publicação Internacional Na. WO 2008/028946; e Pedido Internacional No. ?CT/U32008/08.5876 publicado como uma Publicação Internacional No. WO 2009/079259. Em outras modalidades, _ anticorpo de 20 neutralização não é um anticorpo descrito em Wang et a1. (2010) "Broadly Protective Monoclonal Antibodies against H3 Influenza Viruses following Sequential Immunization with Different Hemagglutinins," PLOS Pathogens 6(2):1-9.
Em determinadas modalidades, os métodos para 25 prevenir ou tratar uma doença ou infecção de vírus influenza em um indivíduo (por exemplo, um ser human„ ou um animal não-humano) proporcionados no presente documento resultam em uma redução na replicação do vírus influenza no indivíduo conforme medido por ensaios in vivo e in vitro 30 conhecidos pelos indivíduos versados na técnica e descritos no presente documento. Em algumas modalidades, a replicação do vírus influenza é reduzida em aproximadamente 1 log ou mais, aproximadamente 2 logs ou mais, aproximadamente 3 logs ou mais, aproximadamente 4 logs ou mais, 5 aproximadamente 5 logs ou mais, aproximadamente 5 logs ou mais, aproximadamente 7 logs ou mais, aproximadamente 8 logs ou mais, aproximadamente 9 logs ou mais, aproximadamente 10 logs ou mais, 1 a 3 locas, 1 a 5 logs, 1 a 8 logs, 1 a 9 logs, 2 a 10 logs, 2 a 5 l - ogs, 2 a 7 logs, 10 2 logs a 8 logs, 2 a 9 logs, 2 a 10 logs 3 a 5 logs, 3 a 7 logs, 3 a 8 logs, 3 a 9 logs, 4 a 6 logs, 4 a 8 logs, 4 a 9 logs, 5 a 6 logs, 5 a 7 logs, 5 a 8 logs, S a g logs, 6 a 7 logs, 6 a 8 logs, 6 a 9 logs, 7 a 8 logs, ? a 9 logs, ou 8 a 9 logs. 15 0 Exemplo 9, abaixo, apresenta coma po ineutídeos HA de vírus influenza quimérico podem ser usados para vacinar indivíduos contra infecção de víru,.
5.15.1 TERAPIAS DE COMBINIAÇ.ÃO 20 Em várias modalidades, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito no presente documento, um ácido nucléico cue codifica tal polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral ou uma 25 bactéria) contendo ou expressando tal polipeptídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo, au urn anticorpo de neutralização pode ser administrado a um indivíduo em combinação com uma ou mais outras terapias (por exemplo, terapias antivirais, antibacterianas, ou imunomodulatórias). 30 Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica (por exemplo, uma composição imunogênica) descrita no presente documento pode ser administrada a um indivíduo em combinação com uma ou mais terapias.
Uma ou mais outras terapias podem ser benéficas no tratamento ou prevenção de uma doença de vírus influenza ou pode aliviar um sintoma ou condição associada a uma doença de vírus influenza.
Em algumas modalidades, uma ou mais outras terapias são analgésicos, medicações antitérmicas, cu teracias que melhorem ou auxiliem a respiração.
Em determinadas modalidades, as terapias são administradas com menos de 5 minutos de intervalo, menos de 30 minutos de intervalo, 1 hora de intervalo, em cerca de 1 hora de intervalo, em cerca de 1 a cerca de 2 horas de intervalo, em cerca de 2 horas a cerca de 3 horas de intervalo, em cerca de 3 horas a cerca de 4 horas de intervalo, em cerca de 4 horas a cerca de 5 horas de intervalo, em cerca de> 5 horas a cerca de 6 horas de intervalo, em cerca de 6 horas a cerca de 7 horas de intervalo, em cerca de 7 horas a cerca de 8 horas de intervalo, em cerca de 8 horas a cerca de 9 horas de 20 intervalo, em cerca de 9 horas a cerca de 10 horas de intervalo, em cerca de 10 horas a cerca de 11 horas de intervalo, em cerca de 11 horas a cerca de 12 horas de intervalo, em cerca de 12 horas a 18 horas de intervalo, 18 horas a 24 horas de intervalo, 24 horas a 36 horas de 25 intervalo, 36 horas a 48 horas de intervalo, 48 horas a 52 horas de intervalo, 52 horas a 60 horas de intervalo, 60 horas a 72 horas de intervalo, 72 horas a 84 horas de intervalo, 84 horas a 96 horas de intervalo, ou 96 horas a 120 horas de intervalo.
Em modalidades específicas, duas ou 30 mais terapias são administradas na mesma visita do paciente.
Quaisquer agentes antivirais bem conhecidc.- nelas indivíduos versados na técnica podem ser usados em combinação com um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente 5 documento, um ácido nucléico que codifica cal polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, coo uma bactéria) contendo ou expressando tal polipetídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo) ou uma composição farmacêutica descrita no presente documento. Exemplos não- limitantes de agentes antivirais incluem proteínas, polipeptídeos, peptídeos, anticorpos de proteína de fusão, moléculas de ácido nucléico, moléculas orgânicas, moléculas inorgânicas, e pequenas moléculas que inibem e/ou reduzem a fixação de um vírus a seu receptor, a internalização de um vírus em uma célula, a replicação de um vírus, ou a liberação de um vírus a partir de uma célula. Em par-icular, os agentes antivirais incluem, mas não se limitam a, análogos de nuclosídeo (por exemplo, zidov- idina, aciclovir, gangciclovir, vidarabina, idoxuridina, trifluridina, e ribavirina), foscarnet, amantadina, peramivir, rimantadina, saquinavir, indinavir, ritonavir, alfa-interferons e outros interferons, AZT, zanamivir (Relenza®®), e oseltamivir (Tamiflu®). Outros agentes antívirais incluem vacinas de vírus influenza, por exemplo, Fluarix® (GlaxoSmithKlirle), FluMist« (MedImmune Vaccines), Fluvirin® (Chiron Corporation), Flulaval® (GlaxoSmithKline), Afluria~a (CSL Bioterapias Inc.), Agriflur (Novartis) ou =luzone-l` (Aventis Pasteur).
Em modalidades específicas, o agente anti~riral é um agente imunomodulatório que seja específico para um antígeno viral. Em modalidades particuic yes, _, _.Otigeno viral é um polipeptideo de vírus influenza; diferente de um polipeptídeo de hemaglutinina. Em outras modalidades, o antígeno viral é um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus 5 influenza.
Quaisquer agentes antibacteri_._:os c:r c,_ i dos pelos indivíduos versados na técnica podem ser usados em combinação com um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descri-to no presente documento, um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, u uma bactéria) contendo ou expressando tal polipeutideo, células estimuladas por tal polipeptídeo) ou uma composição farmacêutica descrita no presente documento. Exemplos não- limitastes de agentes antibacterianos incluem Amicacina, Amoxicilina, ácido clavulãnico de Amoxicilina, Anfotericina-B, Ampicilina, Ampiclina-sulbactam, Apramicina, Azitromicina, Aztreonamo, Bacitracina, 3enzilpenicilina, Caspofungina, Cefaclor, Cefadroxil, Cefalexina, Cefalotina, Cefazolina, Cefdinir, Cefepima, Cefixiria, Cefnenoxima, Cefoperazona, Cefoperazona-sulbactam, Cefco,t:ax'_ma, Cefoxitina, Cefpiroma, Cefpodoxima, acido clavulá =ou de Cefpodoxima, Cefpodoxima-sulbactam, Cefprozil, Cefqu_noma, Ceftazidima, Ceftibutina, Ceftiofur, Ceftobiprola, Ceftriaxon, Cefuroxima, Cloranfenicola, Florfenicola, Ciprofloxacina, Claritromicina, Clinafloxac-na, Clindamicina, Cloxacilina, Colistina, Cotrirnoxazol (Trimetoprima/sulfametoxazola), Dalbavancina, Dalfopristina/Quinopristina, Daptomicina, Dibecacina, Dicloxacilina, Doripenemo, Doxiciclina, Enrofloxacina,
Ertapenemo, Eritromicina, Flucloxacili~a, F uconazol, Flucitosina, Fosfornicina, ácido Fusídicoo, Garenoxacina, Gatifloxacina, Gemifloxacina, Gentamici a, Imipenemo, Itraconazola, Kanamicina, Cetoconazola, Levofloxacina, 5 Lincomicina, Linezolida, I,oracarbef, 11 cilnam (amdinocïlina), Meropenemo, Metronidazo]a, Mezic---it-na, Mezlocilina-sulbactam, Minociclina, Moxifloxac'_na, Mupirocina, ácido Nalidíxico, Neomicina, Netilmicina, Nitrofurantoina, Norfloxacina, Ofloxac.ina, Oxacil__na, 10 Pefloxacina, Penicilina V. Piperacilir.ai, Piperauilina- sulbactam, Piperacilina-tazobactam, Pifampicina, Roxitromicina, Esparfloxacina, Espectinomic'i_na, Espiramicina, Estreptomicina, Sulbacrarr, Sulfametoxazola, Teicoplanina, Telavancina, Telitromicina, Temocilina, $ 15 Tetraciclina, Ticarcilina, ácido clavulânico de Ticarcilina, Tigeciclina, Tobramicina, Trimetoprima, Trovafloxacina, Tilosina, Vancomicina, Virginiamicina, e Voriconazola. Em algumas modalidades, uma terapia de combinação compreende uma imunização ativa com um polipeptdeo de 20 hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, ou um ou mais vetores descritos nas Seções 5.2-5.7 e imunização passiva com um ou mais anticorpos de
1.
neutralização descritos na Seção 5.9. Em algumas modalidades, uma terapia de combinação compreende uma 25 imunização com um ou mais vetores descritos nas Seções 5.2-
5.7 e uma administração de células (por exemplo, por transferência adotiva) descrita na Seção 5.9.
Em algumas modalidades, uma terapia de combinação compreende a administração de dois eu mais vetores 30 diferentes descritos nas Seções 5.2-5.7.
Em algumas modalidades, uma terapia de combinação compreende uma imunização ativa com um composto ativa (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de grape (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica tal 5 polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal polineptídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo) que induz uma resposta imune a um, dois, três, ou mais subtipos HA em um grupo HA (por exemplo, Grupo 1) em combinação com um composto ativo (isto é, um polipeptídec de hemaglutinira de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal polipeptídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo) que induz uma resposta imune a um, dois, três, ou mais subtipos HA no outro grupo HA (por exemplo, Grupo 2).
Em algumas modalidades, uma terapia de combinação compreende uma imunização ativa com dois ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) descritos no presente documento.
5.15.2 POPULAÇÕES DE PACIENTES Em determinadas modalidades, urn composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal polipeptídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo) ou uma composição descrita no presente documento pode ser administrado a um indivíduo virgem, isto
4 63j 646 é, um indivíduo que não tem uma doença cr.usada através de infecção por vírus influenza ou que não foi e não está atualmente infectado com uma infecção por vírus influenza. Em uma modalidade, um composto ativc ou composição 5 descritos no presente documento são administrados a um indivíduo virgem que esteja em risco de contrair uma infecção por vírus influenza. Em uma modalidaie, um composto ativo ou composição descritos no presente documento são administrados a um indivíduo que não tenha 10 uma doença causada pelo vírus influenza específico, ou que não foi e nem está infectado com o vírus influenza específico ao qual o polipeptídeo de hemag-Lutinina de gripe (HA) induz uma resposta imune. Um composto ativo ou composição descritos no presente documento também podem ser 15 administrados a um indivíduo que esteja e/ou tern. sido infectado com o vírus influenza ou outro tipo, subtipo ou cepa do vírus influenza ao qual o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) induz uma resposta imune.
Em determinadas modalidades, um composto ativo 20 (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinira de gri-e (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléi.co que codifica tal polipeptídeo, um vetor (por e-empío, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal polipeptídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo) ou 25 uma composição descrita no presente documento é administrado a um paciente que foi diagnosticado com uma infecção por vírus influenza. Em algumas modalidades, um composto ativo ou composição descritos no presente documento são administrados a um paciente infectado com um 30 vírus influenza antes de os sintomas se manifestarem ou após os sintomas se tornarem graves ; por ex ,;npi: , -r. _ es que o paciente necessite de hospitalização). Em algumas modalidades, um composto ativo ou composição descritos no presente documento são administrados a um paciente que 5 esteja infectado ou tenha sido diagnosticado com um tipo diferente de vírus influenza em relação ao vírus influenza a partir do qual o domínio de cabeça do polipept.deo de hemaglutinina de gripe (HA) do composto ativo ou com. ,osição foi derivado. 10 Em determinadas modalidades, urn composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinir.a de gripe (HA) descrito no presente documento, urn ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal 15 polipeptídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo ou uma composição descrita no presente documento são administrados a um paciente que possa estar ou esteja infectado com um vírus influenza que pertença ao mesmo grupo HA que o domínio de cabeça do polipeptídeo de 20 hemaglutinina de gripe (HA). Em determinadas modalidades, um composto ativo ou composição descr.ifLos no r:_ esente documento são administrados a um paciente que possa estar ou esteja infectado com um vírus influenza do mesmo subtipo que o domínio de cabeça do polipeptídeo de hemaglutinina de 25 gripe (HA).
Em algumas modalidades, um indivíduo a ser administrado com um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica _al poliperstídeo, 30 um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria)
465/54B contendo ou expressando tal polipe~tideo, ad lulas estimuladas por tal polipeptïdeo) ou uma composição descrita no presente documento é um animal. Em determinadas modalidades, o animal é uma ave. Em determinadas 5 modalidades, o animal é um canino. Em determinadas modalidades, o animal é um felino. Em determinadas modalidades, o animal é um cavalo. Em determinadas modalidades, o animal é uma vaca. Em determinadas modalidades, o animal é um mamífero, por exemplo, um cavalo, um suíno, um camundongo, ou um primata, de preferência, um ser humano.
Em determinadas modalidades, um J ndivíduca a ser administrado com um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica _al polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal polipeatídec, células estimuladas por tal polipeptídeo) ou uma comnosição descrita no presente documento é um ser humano adulto. Em determinadas modalidades, um indivíduo a ser administrado com um composto ativo ou composição descritos no presente documento é um ser humano adulto com mais de 50 anos de idade. Em determinadas modalidades, um indivíduo a ser administrado com um composto ativo ou composição descritos no presente documento é um indivíduo humano idoso.
Em determinadas modalidades, um -indivíduo a ser administrado com um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica _al polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria)
contendo ou expressando tal polipeutídeo, células estimuladas por tal polipeptideo) ou uma c_r..;osição descrita no presente documento é um ser humano crianca. Em determinadas modalidades, um indivíduo a ser administrado 5 com um composto ativo ou composição descritos no presente documento é um ser humano bebê. Em determinadas modalidades, um indivíduo ao qual um composto ativo ou -coni~osição descritos no presente documento é administrado: n_a é um bebê menor que 6 meses de idade. Em uma modalidade específica, um indivíduo a ser administrado com um composto ativo ou composição descritos no presente docurnar. = - ter.. 2 anos de idade ou mais novo.
Em modalidades específicas, um individuc a ser administrado com um composto ativo (isto é, um polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no eresente documento, um ácido nucléico que codifica áa1 polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, au uma bactéria) contendo ou expressando tal polipeotídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo) ou uma composição descrita no presente documento é qualquer bebê ou criança maior que 6 meses de idade e qualquer adulto acima de 50 anos de idade. Em outras modalidades, o indivíduo é uma pessoa que esteja grávida. Em outra modalidade, o indivíduo é uma pessoa que pode estar ou que estará grávida durante a temporada de influenza (por exemplo, novembro a abril). Em modalidades específicas, um indivíduo a ser administrado com um composto ativo ou composição descritos no presente documento é uma mulher que pariu 1, 2, 3, 4, 5, e, , ou 8 meses antes.
Em algumas moda l idades, o i[iai vi _ — 0 f_., ,. a ser administrado com um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica gal polipeptídeo, 5 um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal polipeotídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo) ou uma composição descrita rio presente documento é qualquer indivíduo em risco aumentado de infecção ou doença por Viruiluenza 10 resultante de uma infecção por vírus influenza o_ : inplo, um indivíduo imunocomprometido ou imunodeficiente). Em algumas modalidades, o indivíduo humano a ser administrado com um composto ativo ou composição descritos no presente documento é qualquer indivíduo em contato íntimo com um 15 indivíduo com um risco aumentado de infecção ou doença por vírus influenza resultante de infecção por vírus influenza (por exemplo, indivíduos imunocorlprometid_c:= ou imunodeficientes).
Em algumas modalidades, o indivíduo humano a ser 20 administrado com um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, au urna bactéria) contendo ou expressando tal polipeotïdeo, células 25 estimuladas por tal polipeptídeo) ou uma composição descrita no presente documento é um indivíduo afetado por qualquer condição que aumente a suscetibilidade à infecção por vírus influenza ou complicações ou doença resultantes da infecção por vírus influenza. Em outras modalidades, um 30 composto ativo ou composição descritos no presente documento é administrado a um indivíduo no qual uma infecção por vírus influenza tem o potenc-_al para aumentar as complicações ou outra condição que o indivíduo esteja sendo afetado, ou à qual eles se encontram em risco. Em 5 modalidades particulares, essas condições que aumentam a suscetibilidade a complicações de vírus influenza ou às quais o vírus influenza aumenta as complicações associadas à condição são, por exemplo, condições que afetam os pulmões, tal como fibrose cística, enfisema, asma, ou infecções bacterianas (por exemplo, infecções causadas por Haernophilus ínfluenzae, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, e Chlamydia trachomatus) ; doenças cardiovasculares (por exemplo, doença cardíaca congênita, insuficiência cardíaca congestiva, e doença arterial coronariana); distúrbios endócrinos (por exemplo, diabetes), condições neurológicas e desenvolvimento neural ,por exemplo, distúrbios do cérebro, medula espinhal, nervo periférico, e músculos (tal como paralisia cerebral, epilepsia (distúrbios de convulsão), derrame, def ciência intelectual (por exemplo, retardo mental), d_-'_~trofia muscular, e lesões à medula espinhal)).
Em algumas modalidades, o indivíduo humano a ser administrado com um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente 25 documento, um ácido nucléico que codifica -nal polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, su uma bactéria) contendo ou expressando tal polipeotídeo, células estimuladas por tal polipeptideo) ou uma composição descrita no presente documento é um indivíduo que resida em uma casa grupal, tal como uma casa de enfermagem. Em
469 /648 algumas modalidades, o indivíduo humano a ser admi-_-strado com um composto ativo ou composição descritos no presente documento trabalha, ou fica um período de tempo significativo em uma casa grupal, por exemplo, uma casa de
5 enfermagem.
Em algumas modalidades, o indivíduo humano a ser administrado com um composto ativo ou composição descritos no presente documento é um funcionário da área de saúde (por exemplo, um médico ou urna enfermeira). Em algumas modalidades, o indivíduo humano a ser administrado 10 com um composto ativo ou composição descritos no presente documento é um fumante.
Em urna modalidade específica, o indivíduo humano a ser administrado com um composto ativo ou composição descritos no presente documento é imunocomprometido ou imunossuprimido. 15 Além disso, os indivíduos em risco aumentado de desenvolver complicações a partir de influenza que podem ser administrados com um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica tal 20 polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal policeptídeo, élalas estimuladas por tal polipeptídeo) ou uma composição descrita no presente documento include: qualquer indivíduo que possa transmitir vírus influenza àqueles em alto risco 25 de complicações, tal como, por exemplo, membros da família com indivíduos de alto risco, incluindo membros da família que incluirão bebês mais novos que 6 meses, indivíduos em contato com bebês menores de 6 meses de idade, ou indivíduos que entrarão em contato com indivíduos que moram 30 em casas de enfermagem ou outras instituições de longa permanência; indivíduos com distúrbios a longo prazo dos pulmões, coração, ou circulação; indivíduos com doenças metabólicas (por exemplo, diabetes); indivíduos com insuficiência renal; indivíduos com distúrbios sanguíneos (incluindo anemia ou doença de célula falciforrne); indivíduos com sistemas imunes enfraquecidos (incluindo imunossupressão causada por medicamentos, malignidades, como câncer, transplante de órgãos, ou infecção do HIV);
crianças que recebem terapia à base de espirina a longo prazo (e, portanto, têm uma chance maior de desenvolver a síndrome de Reye caso sejam infectadas com i.nfluenza;. Em outras modalidades, os indivíduos cara administração de um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica r_al polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, on uma bactéria)
contendo ou expressando tal polipentídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo) ou urna comoos_:_áo descrita no presente documento incluem indivíduos saudáveis com seis meses de idade ou mais velhos, que: manejem viajar para países estrangeiros e áreas code epidemias de gripe podem estar ocorrendo, como, por exemplo, nos trópicos e rio hemisfério sul de abril a setembro; viajem como parte de grandes grupos de turistas em excursão que podem incluir pessoas de áreas do mundo onde os vírus influenza estão circulando; curse escola ou racuul_dade e resida em dormitórios, ou resida em sraoientes institucionais; ou desejem reduzir seulimo d, Hoarem doentes com influenza.
• Em algumas modalidades, um indivíduo ao qual a administração de um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica -a1 polipeptídeo, 5 um vetor (por exemplo, um vetor viral, cu uma bactéria) contendo ou expressando tal polipeatidec, células estimuladas por tal polipeptídeo) ou uma co uos.-ção descrita no presente documento é contra-indicada inclui qualquer indivíduo ao qual a vacinação centra influenza é 10 contra-indicada, como: bebés menores de seis meses de idade; e indivíduos que tenham tido uma reação anafilática (reações alérgicas que causem dificuldade de respirar, que geralmente são seguidas por choque) a ovos, produtos à base • de ovos, ou outros componentes usados na Vir, 3 da 15 formulação imunogênica. Em determinadas modalidaio~-;, quando a administração de um composto ative ou composição descritos no presente documento for contra-indicada devido a um ou mais componentes usados na produção da formulação imunogênica (por exemplo, devido à presen;a de ovos ou de 20 produtos à base de ovos), o composto ativo ou composição podem ser produzidos de modo que não inclua o componente que faz com que a administração de um composto ativo ou composição seja contra-indicada (por exemplo, o composto ativo ou composição podem ser produzidos sem o uso de ovos 25 ou de produtos à base de ovos).
Em algumas modalidades, pode ter prudente não administrar uma vacina de vírus vivo a urra co mais populações de pacientes a seguir: seres humanos idosas; bebês menores de 6 meses de idade; indivíduos grávidos; 30 bebês menores de 1 ano de idade; crianças menos de 2 anos de idade; crianças menores de 3 anos de idade; crianças menores de 4 anos de idade; crianças menores de 5 anos de idade; adultos menores de 20 anos de idade; adultos menores de 25 anos de idade; adultos menores de 30 anos de idade; adultos menores de 35 anos de idade; adultos menores de 40 anos de idade; adultos menores de 45 anos de idade; adultos menores de 50 anos de idade; humanos idosos maiores de 70 anos de idade; humanos idosos maiores de 75 anos de idade; humanos idosos maiores de 80 anos de idade; humanos idosos maiores de 85 anos de idade; humanos idosos maiores de 90 anos de idade; humanos idosos maiores de 005 anos de idade; crianças ou adolescentes (2 a 17 de idade) aue tomem aspirina ou medicações contendo aspirina, por causa das complicações associadas à aspirina e à infecção por vírus influenza tipo selvagem nesta faixa etária; indivíduos com um histórico de asma ou outras doenças de vias aéreas reativas; indivíduos com condições médicas fundamentais crõnicas que possam predispô-los a infecções de influenza graves; indivíduos com um histórico de síndrome de Guillain-Barre; indivíduos com doenças graves agudas com febre; ou indivíduos que estejam moderada ou gravemente doentes.
Para esses indivíduos, a administração de vacinas de vírus inativado, vacinas de vírus dividido, vacinas sub- unitárias, virossomas, partículas tipo vírus ou vetores não-virais descritos no presente documento pode ser preferencial.
Em determinadas modalidades, os i?idi.vTiduos preferencialmente administrados com uma vacina de vírus vivo podem incluir crianças e adolescentes saudáveis, com 2 a 17 anos de idade, e adultos saudáveis, com 16 a •1 anos de idade.
Em determinadas modalidades, uma formulação imunogênica que compreende um vetor de vírus vi.-o, não é fornecida simultaneamente com outras vacinas de vías vivo.
5.16 MODOS DE ADMINISTRAÇÃO 5 5.16.1 ROTAS DE DISTRIBUIÇÃO Um composto ativo (isto é, um polipeptidec de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no poesente documento (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de v-_rus influenza quimérico), um ácido nucléico que codifica tal 10 polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um ve_or viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal poliDeptídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo) ou uma composição descrita no presente documento pode ser distribuído a um indivíduo por uma variedade de rotas. Estas incluem, mas 15 não se limitam a, rotas intranasais, infra }_aque s, orais, intradérmicas, intramusculares, Lntraperitoneais, transdérmicas, intravenosas, conjuntivais e subcutâneas. Em algumas modalidades, uma composição é formulada para administração tópica, por exemplo, para aplicação C3 pele. 20 Em modalidades específicas, a rota de administração é nasal, por exemplo, como parte de um spray nasal. Em determinadas modalidades, uma composição é formulada para administração intramuscular. Em algumas modalidades, uma composição é formulada para administração subcutânea. Em determinadas 25 modalidades, uma composição não é formulada cara administração por injeção. Em modalidades específicas for vírus vivo vacinas, a vacina é formulada para administração por uma rota diferente de injeção. Em casos onde o antígeno é um vetor viral, um 30 vetor de partícula tipo vírus, ou um vetor bacteriano, por exemplo, pode ser preferível introduzir uma cornoosição imunogênica através da rota natural de ìrfecção da cadeia principal de vírus ou bactéria a partir da qual o vetor foi derivado. Alternativamente, pode ser preferível introduzir 5 um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) através da rota natural de infecção do vírus influenza a partir do qual o polipeptídeo é derivado. A capacidade de um antígeno, particularmente um vetor viral, de induzir uma resposta imune secretária e celular vigorosa pode ser usada de modo 10 vantajoso. Por exemplo, a infecção do trato respiratório por um vetor viral pode induzir uma resposta imune secretária forte, por exemplo, no sistema urogenital, com uma proteção concomitante contra um vírus influenza. Além disso, em uma modalidade preferencial, pede ser desejável 15 introduzir as composições farmacêuticas nos pulmões através de qualquer rota adequada. A administração pulmonar também pode ser empregada, por exemplo, através do uso de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente de aerossol para uso como um spray.
20 Em uma modalidade específica, uma Jaci~?a sub- unitária é administrada intramuscularmente. Em outra modalidade, uma vacina de vírus influenza vivo é administrada intranasalmente. Em outra modalidade, uma vacina de vírus influenza inativado, ou uma vacina de vírus 25 influenza dividido é administrada intramuscularmente. Em outra modalidade, uma partícula tipo vírus ou composição desta é administrada intramuscularmente. Em algumas modalidades, as células estimuladas por um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito 30 no presente documento in vitro podem ser. introduzidas (ou re-introduzidas) em um indivíduo usando técnicas conhecidas pelos indivíduos versados na técnica. Em algumas modalidades, as células podem ser introduzidas ria derme, sob a derme, ou no fluxo sanguíneo periférico. Em algumas 5 modalidades, as células introduzidas em um indivíduo são, de preferência, células derivadas a partir de tal indivíduo, para evitar uma resposta imune adversa. Em outras modalidades, também podem ser usadas células que se am derivadas de um hospedeiro doador tendo um antecedente 10 imune similar. Outras células também podem ser asadas, incluindo aquelas projetadas para evitar urrt_, •spesta imunogênica adversa.
5.16.2 DOSAGEM E FREQUÊNCIA DE ADMINIET7.ACÃO A quantidade de um composto ativo (isto é, um 15 polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal poli'~eptídeo, células • estimuladas por tal polipeptídeo) ou uma composição que 20 será eficaz no tratamento e/ou prevenção de uma infecção por vírus influenza ou uma doença de vírus influenza dependerá da natureza da doença, e pode se.r determinada por técnicas clínicas padrão. A dose precisa a ser empregaca na formulação 25 também dependerá da rota de administração, e da gravidade da infecção ou doença causada pela mesma, e deve ser decidida de acordo com o julgamento do profissional e das circunstâncias de cada indivíduo. Por exemplo, as doses eficazes também podem variar dependendo dos meios de 30 administração, sítio alvo, estado fisiológico do paciente
(incluindo idade, peso corporal, saúdo; , s pa~—i_~i O um ser humano ou um animal, outras medicações administradas, e se o tratamento é profilático ou terapêutico. Geralmente, o paciente é um ser humano, mas mamíferos não-humanos 5 incluindo mamíferos transgênicos também podem ser tratados. As dosagens de tratamento são otimamente tituladas para otimizar a segurança e a eficácia. Em determinadas modalidades, lm í:..sair ,, -tro é empregado para ajudar a identificar faixas de dosarem 10 ótimas. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir das curvas de resposta de dose in vitro ou animal.
As doses exemplificadoras para ácidos _7uclélcos que codificam um polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento variam de cerca de 10 no a 1 15 g, 100 ng a 100 mg, 1 pg a 10 mg, ou 30 a 300 _q do ácido nucléico, por exemplo, DNA, por paciente. Em determinadas modalidades, as doses exemplificadoras para um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documen':o (por exemplo, 20 conforme proporcionado em vacinas de vírus dividido e vacinas sub-unitárias) variam de cera de pg a 100 mg, 15 pg a 50 mg, 15 pg a 25 mg, 15 pg a 10 mg, 15 pg a 5 mg, 15 pg a 1 mg, 15 pg a 100 pg, 15 pg a 75 pg, 5 pg a 50 up, 10 pg a 50 pg, 15 pg a 45 jig, 20 pg a 40 pg, ou 25 a 35 up por 25 quilograma do paciente. Em outras modalidades, doses exemplificadoras de polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) variam de cerca de 1 pg a cerca de 50 mg, cerca de 5 pg a cerca de 50 mg, cerca de 1 4g a cerca dc 100) r1q, cerca de 5 pg a cerca de 100 mg, cerca de 15 pg a cerca de 50 mg, 30 cerca de 15 pg a cerca de 25 mg, cerca de 15 po a cerca de
10 mg, cerca de 15 pg a cerca de 5 mg, cerca de 15 pg a cerca de 1 mg, cerca de 15 pg a cerca de 100 pg, cerca de 15 pg a cerca de 75 pg, cerca de 5 ug a cerca de 50 ig, cerca de 10 pg a cerca de 50 dag, cerca de 15 pg a cerca de 5 45 ug, cerca de 20 pg a cerca de 40 pg, ou cerca de 25 a cerca de 35 pg de polipeptídeo de hemaglutinina de gripe {HA) por dose, e podem ser administradas a un ind_..-`;.zc uma, duas, três ou mais vezes com interva'. nz> tão f _ :l1uo , u-_es quanto necessário. 10 As doses para vetores virais infect -0s0.- podem variar de 10 a 100, ou mais, vírions por dose. Em algumas modalidades, as dosagens adequadas de um vetor viral são 102, 5 x 102 , 103, 5 x 103, 104 , 5 x 10' x , 101 ', 5 x 10 5 , 10', 5 x 106, 107, 5 x 107 , 108, 5 x loa , 1 x 109, 5 x 10, 1 x 1010 , 5 x 1010, 1 x 1012 , 5 x 1011 ou 1012 pfu, e podem ser administradas a um indivíduo uma, duas, três ou ruis vezes com intervalos tão frequentes quanto necessário. Em determinadas modalidades, as doses exemplificadora ou VLPs variam de cerca de 0,01 ug a cerca de 100 mg, cerca de 0,1 pg a cerca de 100 mg, cerca de 5 pg a cerca de 100 mg, cerca de 15 pg a cerca de 50 mg, cerca de 15 pg a cerca de 25 mg, cerca de 15 pg a cerca de 10 mg, cerca de 15 pg a cerca de 5 mg, cerca de 15 pg a cerca dc 1 mg, cerca de 15 pg a cerca de 100 pig, cerca de 15 pc a cerca de 75 pg, cerca de 5 pg a cerca de 50 pg, cerca de 10 pg a cerca de 50 pg, cerca de 15 pg a cerca de 45 pg, cerca de 20 ug a cerca de 40 dag, ou cerca de 25 a cerca de 35 pg por quilograma do paciente.
Em uma modalidade, uma vacina inativada é formulada de modo que contenha cerca de 5 pg a cerca de 50 pg, cerca de 10 }gig a cerca de 50 pg, cerca de 15 pp <y cerca de 100 pg, cerca de 15 pg a cerca de 75 pg, cerca da 15 pg a cerca de 50 pg, cerca de 15 pg a cerca de 30 }ig, cerca de 20 pg a cerca de 50 pg, cerca de 25 pg a cerca de 40 pg, 5 cerca de 25 pg a cerca de 35 pg de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA).
Em determinadas modalidades, um composto ativo, isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que 10 codifica tal polipeptideo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal polipeptídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo, ou composição é administrado a urn indiv-.d -.in urna vez _:mo uma dose única.
15 Em determinadas modalidades, um composto ativo ou composição é administrado a um indivíduo come, uma dose única seguida por uma segunda dose 3 a 6 semanas depois. Em determinadas modalidades, um composto ativo ou composição e administrado a um indivíduo como uma dose unica seguida por 20 uma segunda dose 3 a 6 semanas depois, que é seguida pela administração de uma terceira dose 3 a 6 semanas depois. Em determinadas modalidades, a segunda e/ou terceira administrações podem utilizar um com,nosto ativo ou composição diferente. De acordo com essas modalidades, as 25 inoculações estimulantes podem ser administradas ao indivíduo em intervalos de 6 a 12 meses após a segunda inoculação. Em determinadas modalidades, as inoculações estimulantes podem utilizar um composto ativo ou composição diferente. Em determinadas modalidades, a primeira 30 administração (preparação) compreende uma hemaglutinina de
47 c / 6 LI 8 comprimento completo ou fragmento de.si-. (ou i*.. ácido nucléico que codifica a mesma) e a segunda administração (estimulante) compreende a administração de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente 5 documento (ou um ácido nucléico que codifica o mesmo, um VLP que compreende o mesmo, ou um vírus ou bactéria que expressa o mesmo). Em algumas modalidades, a administração do mesmo composto ativo ou composição pode ser repetida e as administrações podem ser separadas por ao menos 1 dia, 2 10 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, 75 dias, 3 meses, ou pelo menos 6 meses. Em determinadas modalidades, um composto ativo ou composição é administrado a um indivíduo como uma dose árrica Lmr ver: ao ano.
15 Em modalidades específicas para administração em crianças, duas doses de um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica tal • polipeptídeo, um vetor (por exemplo, urn vetor viral, ou uma 20 bactéria) contendo ou expressando tal poli?eptídeo, células estimuladas por tal polipeptídeo) ou uma compos-.a=so, com pelo menos um mês de intervalo, são administradas a uma criança. Em modalidades específicas para administração em adultos, uma única dose é dada. Em outra modalidade, duas 25 doses de um composto ativo ou composição, com pelo menos um mês de intervalo, são administradas a um adulto. Em outra modalidade, uma criança nova (seis meses a nove anos de idade) pode ser administrada com um composto ativo ou. composição pela primeira vez em duas doses com um mês de 30 intervalo. Em uma modalidade particular, urna crir-:ça que
480/ 648 recebeu somente uma dose em seu primeiro ano de inação deve receber duas doses no ano seguiate. in algumas modalidades, duas doses administradas com 4 semanas de intervalo são preferenciais para crianças de 2 a 8 anos de 5 idade que são administradas com urna vacina contra influenza, por exemplo, uma formulação imunogênica descrita no presente documento, pela primeira vez. Em determinadas modalidades, para crianças de 6 a 35 meses de idade, uma meia dose (0,25 ml) pode ser preferencial, em contraste a 10 0,5 ml que pode ser preferencial para indivíduos unem mais de três anos de idade.
Em uma modalidade específica, parai administração em bebês humanos, duas doses de polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento 15 (vide a Seção 5.1, infra) ou uma composição desta e/ou um ou mais dos ácidos nucléicos, vetores, VLPs, ou virossomas descritos no presente documento, são administrados a um bebê, em que o domínio de cabeça de hemag=_utinina de vírus influenza do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) 20 usado na primeira dose é proveniente de uma cepa ou subtipo diferente do domínio de cabeça de hemaglutinina de vírus influenza do polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) usado na segunda dose. A primeira e a segunda administrações podem ser separadas por ao menos 1 dia, 2 25 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 -'.ias, 2 meses, 75 dias, 3 meses, ou pelo menos 6 meses. Em uma modalidade específica, para admira~.etração em bebês humanos, três doses de poli_peptídoos de hemaglutinina de gripe (HA) descritos no presente documento 30 (vide a Seção 5.1, infra) ou uma composição destes e/ou um ou mais dos ácidos nucléicos, vetores, VT Ps, ou v_ í- ssomas descritos no presente documento, são administrados a um bebê, em que os domínios de cabeça de hemaglutinina de virus influenza dos polipeptideos de hemagLutinina de gripe (HA) usados na primeira, segunda, e terceira doses são provenientes de cepas ou subtipos diferentes de vírus influenza. A primeira, segunda, e terceira administra:_-ões podem ser separadas por ao menos 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 10 dias, 15 dias, 30 dias, 45 dias, 2 meses, "-. dias, 3 meses, ou pelo menos 6 meses.
Em modalidades particulares, i„ romposm ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinira de gripe !HA) descrito no presente documento, um ácido nucléico que codifica tal polipeptídeo, um vetor (por exemplo, um vetor viral, ou uma bactéria) contendo ou expressando tal polipeptídeo, células estimuladas por tal polipeptïdec ou uma composição é administrado em um indivíduo no outono ou inverno, isto é, antes ou durante da temporada de influenza em cada hemisfério. Em uma modalidade, as crianoas são administradas com sua primeira dose no ir.ício da estação, por exemplo, final de setembro ou início de outubro no hemisfério norte, de modo que a segunda dose possa sor dada antes do pico da temporada de influenza. Para uma imunização passiva com um anticorpo, a dosagem varia de cerca de 0,0001 a 100 mg/kc, e, mais geralmente, 0,01 a 5 mg/kg, do peso oo rp Y _.l dc i ente .
Por exemplo, as dosagens podem ser 1 mg/kq_ he peso rp; ral ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1 a 10 mg/kg ou, em outras palavras, 70 mg ou 70Cí mg ou dentro da 30 faixa de 70 a 700 mg, respectivamente, para um pa, conte de
70 kg. Um regime de tratamento erempli t__cadcr o.:ige a administração uma vez a cada duas semanas ou uma vez ao mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses durante o período de um ano ou vários anos, ou em intervalos de vários anos. Err; alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de ligação são administrados simultaneamente, sendo que neste caso a dosagem _;. cada anticorpo administrado se encontra nas faixas indicadas. Geralmente, o anticorpo é administrado em várias ocasiões. Intervalos entre dosagens únicas pedem ser semanais, mensais ou anuais. Os intervalos também podem ser irregulares conforme indicado medindo-se os níveis sanguíneos de anticorpo ao polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) no paciente. 15 5.17 ENSAIOS BIOLÓGICOS
5.17.1 ENSAIOS PARA TESTE DE, ATIVIDADE DE POLIPEPTÍDEOS DE HEMAGLUTININA DE VÍRUS INFLUENZA QU.MÉR.'CO Os ensaios para testar a expressão de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) em on vetor revelado no presente documento podem ser conduzidos usando qualquer ensaio conhecido na técnica. Por exemplo, um ensaio para incorporação em um vetor viral compreende o crescimento do vírus conforme descrito nesta seção ou nas Seções 5.4 ou 5.5, a purificação das part__culas virais por centrifugação através de um colchão de sacarose, e uma análise subsequente para expressão de nolipept...H eo de hemaglutinina de gripe (HA) por um imunoensaío, tal. corno Western blotting, usando métodos bem cc}nhe,zi_dos na tecoi.ca. Os métodos para determinar se um polipeptídeo de hemaglutinina é quimérico são conhecidos pelos indivíduos
483/8 z F ! versados na técnica e descritos no presente documeni-_, (vide, por exemplo, os Exemplos 3 e 4 abaixo).
Em uma modalidade, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) revelado no presente documento 5 é ensaiado para um enovelamento e funcionalidade apropriados testando-se sua capacidade de se ligar especificamente a um anticorpo de neutralização dirigido a um polipeptídeo de hemaglutini.na de vírus influenza, tal como a região de caule do polipeptídeo, usando qualquer 10 ensaio para interação anticorpo-antígeno conhecido na técnica. Os anticorpos de neutralização para uso em tais ensaios incluem, por exemplo, os anticco pos de neutralização descritos em Ekiert et a1., 2009, Science • Express, 26 de fevereiro de 2009; Kashyap at a1., 2008, 15 Proc Nat1 Acad Sc.i U S A 105: 5986-5991; Sul et a1. 2009, Nature Structural and Molecular. Biology, 1.6:265-273; Wang et a1., 2010, PLOS Pathogens 6(2):1-9; Patentes U.S. Nos.
5.589.174, 5.631.350, 6.337.070, e 6.720.409; Pedido Internacional No. PCT/US2007/068983 publicado como uma 20 Publicação Internacional No. WO 2007/134237; Pedido Internacional No. PCT/US2008/075998 publicado como uma Publicação Internacional No. WO 2009/036157; Pedido Internacional No. PCT/EP2007/059356 publicado como uma Publicação Internacional No. WO 2008/0.28946; = Pedido 25 Internacional No. PCT/0S2008/Q85876 publicado como uma Publicação Internacional No. WO 2009/079259. Esses anticorpos incluem CR6261, CR6325, CR6329, CR6307, CR63'3, 2A, D7, D8, FIO, G17, H40, A66, D80, P88, E90, H98, C179 (FERN BP -4517), AI3C (FERN BP-4516), dentre outros.
484/1. J 8 c Em outra modalidade, um polipepr.ideo de hemaglutinina de gripe (HA) revelado no p::esente documento é ensaiado para um enovelamento apropriado pela determinação da estrutura ou conformação do polipeptideo de 5 hemaglutinina de gripe (HA) usando qualquer método conhecido na técnica como, ror exemplo, NMR., métodos cristalográficos de raios X, ou métodos de predição de estrutura secundária, por exemplo, dicroísmo circular.
5.17.2 ENSAIOS PARA TESTAR A ATIVIDADE DE 10 ANTICORPOS GERADOS USANDO POLIPEPTÍDEOS DEHEMAGLUTIPIN1 DE
VÍRUS INFLUENZA QUIMÉRICO Os anticorpos descritos no pr_osente documento podem ser caracterizados em uma variedade de formas conhecidas pelos indivíduos versados na técnica (por 15 exemplo, ELISA, tela de ressonãncia plasmãnica superficial (BlAcore), Western blot, imunofluorescência, imunocoloração e/ou ensaios de microneutralização). Em a1qumas modalidades, os anticorpos são ensaiados para determinado da capacidade de se ligar especificamente a um polipeptideo de 20 hemaglutinina de gripe (HA), ou o um vetor que compreende do dito polipeptídeo. Esse ensaio pode ser realizado em solução (por exemplo, Houghten, 1992, Bio/Arts 13:412 42;, em microesferas (Lam, 1991, Nature 354:82 84), ern chips (Fodor, 1993, Nature 364:555 556), em bacteria (Patente U.S.
25 No. 5,223,409), em esporos (Patentes U.S. Nos. 5.571.698;
5.403.484; e 5.223.409) , em plasmídeos (Cull et ai., J592, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865 1869) ou em facto (Scott and Smith, 1990, Science 249:386 390; Cwirla et a1 . , 1990, Proc. Natl. Aced. Sei. USA 87:6378 6382; e Felici, 1991, J.
30 Mel. Biol. 222:301 310) (estando cada una dessas referências aqui incorporadas em suas totalidades Liculo de referência).
A ligação específica de um anticorpo ao polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HAS e a reatividade 5 cruzada com outros antígenos podem ser avaliadas através Ed qualquer método conhecido na técnica. Os imunoensaios cue podem ser usados para analisar a ligação específica e a reatividade cruzada incluem, ;na, não se limitam a, sistemas de ensaio competitivo e não-competitivo usando nces, 10 como western blots, radioimunoensaios, ELIS» en-,. ;a io imunoabsorvente ligado à enzima), imunoensaios de "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, reações de precipitina, reações de precipitina em difusão de el, ensaios de imunodifusão, ensaios de acluti_,. -- ão, ensaios de 15 fixação complementar, ensaios ireaneradiométr cns, imunoensaios fluorescentes, imunoensaios :fie ;ca A, para citar alguns. Esses ensaios são otine - e bem conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Ausuhel et a1., eds., 1994, Current Protocols ir. Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nova York, que se encontra aqui incorporado em sua totalidade a título de rreferêncie').
A afinidade de ligação de um anticorpo a um polipeptídeo de hemagiutinina de gripe HA) e a dissociação de uma interação anticorpo-antígeno podem ser determinadas por ensaios de ligação competitivos. Uri exemplo de um ensaio de ligação competitivo é um radioimunoensaio que compreende a incubação de um antígeno marcado (por exemplo, 3H ou 125 1) ao anticorpo de interesse na presença de quantidades crescentes de antígenos não-marcados, e a detecção do anticorpo ligado ao antígeno mato d•, A afinidade do anticorpo por um polipeptídeo de hemau_1_utirina de gripe (HA) e as dissociações de ligação podem ser determinadas a partir de dados por análise de gráfico de Scatchard.
A competição com um segundo anticorpo também 5 pode ser determinada usando radioimunoensEtios.
Neste caso, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe WA) é incubado com o anticorpo de teste conjugado a um composto marcado (por exemplo, 3H ou 125:) na presença de quantidades crescentes de um segundo anticorpo não-marcado. 10 Em determinadas modalidades, a afinidade de ligação ao anticorpo e as constante de taxa são medidas usando o sistema KinExA 3000 (Sapi.dyne Instruments, Boise, ID). Em algumas modalidades, utiliza-se a anál'_se de ressonância plasmônica superficial (por exemplo, cinética
BlAcore) para determinar a ligação e as dissociacces dos anticorpos a um polipeptídeo de hemaglutinina de v-jus influenza.
A análise de cinética BlAcore compreende analisar a ligação e a dissociação de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) de chips mom anticorpos imobilizados a um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) em sua superfície.
Um estudo cinético BlAcore típico envolve a injeção de 250 pL de um reagente de an- corpo (mAb, Fab) em uma concentração variável em tampão HBS contendo 0,005% de Tween~20 ao longo de uma superfície de chip de sensor, sobre a qual imobilizou-se o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA). A taxa de fluxo é mantida constante em 75 pL/min.
Os dados de dissociarão são coletados durante 15 minutos ou mais, conforme a necessidade.
Após cada ciclo de injeção/dissociação, o anticorpo ligado é removido da superfície do plireíd.o
487/ 64 8 de hemaglutinina de vírus influenza usando pulsos b;_eves de 1 minuto de ácido diluído, tipicamente 13-100 mM -,= HC1, embora outros regenerantes sejam empregados à medi-ie ue as circunstâncias autorizam. De modo mais específico, para a 5 medição das taxas de associação, ko,, e dissociação, kof r, o polipeptídeo é diretamente imobilizado sobre a auperfície de chip de sensor através do uso de químicas de a ,lamento de amine padrão, isto é, o método EDC/NHS (EDC= N- dietilaminopropil)--carbodiimida). Em resumo, .ima solução de 5-100 nM do polipeptídeo em 10 mM de NaOAc, pH 4 ou pH 5 é preparada e passada pela superfície ativada com EDC/NHS até aproximadamente 30-50 RU's de polipeptídeo estejam imobilizados. Após isso, os ésteres ativos não-rear -dos são "terminados" com uma injeção de 1M de E".-NH . Uma superfície vazia, não contendo polipeptídeos, e orepar,eda sob condições de imobilização idênticas para propósitos de referência. Uma vez que uma superfície apropriada tiver sido preparada, uma série de diluição adequada de cada um dos reagentes de anticorpo é preparada err. HBS/Tween-20, e passada tanto pelo polipeptídeo como pelas superfícies de célula de referência, que são conectadas em série. A faixa de concentrações de anticorpo que são preparados varia, dependendo de qual constante de ligação em equilíbrio, K D , é estimada. Conforme descrito anteriormente, o anticorpo ligado é removido após cada ciclo de injeção/dissociação usando um regenerante apropriado.
A atividade de neutralização de um anticorpo pode ser determinada usando qualquer ensaio conhecido pelos indivíduos versados na técnica. Os anticorpos descritos no 30 presente documento podem ser ensaiados pare sua ~:_r_-).acicade
488/rá,:?
de inibir a ligação de urn vírus influenza, ou •r.i:-i:! g er outra composição que compreenda um polipeptícico de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, urn VLP, lipossomo, ou extrato de detergente), a seu receptor de célula 5 hospedeira (isto é, ácido siálico) usando técnicas conhecidas pelos indivíduos versados n-. técnica.
Por exemplo, as células que expressam receptores de vírus influenza podem ser colocadas em contato com uma comoosição que compreende um polipeptídeo de hemaglutinina de culpe 10 (HA) na presença ou ausência do anticorpo e da capacidade do anticorpo de inibir a ligação do anti_cgeno podem ser medidas, por exemplo, por citometria de fluxo ou por um ensaio de cintilação.
A composição que compreende um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (H7.) ou _, a icorpo pode ser marcada com um composto detectável, tal - om.o um rótulo radioativo (por exemplo, ?` =, j5S, e ou um rótulo fluorescente (por exemplo, fïczoresceína isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficoc_anina,
aloficocianina, o-- ftaldeído e fluorescam.ir.a) para permitir a detecção de uma interação entre a composição que compreende um polipeptídeo de hemaglutinina de gr_ipç1 (HA) e um receptor celular.
Alternativamente, a capacidade de os anticorpos inibirem um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) de se ligar a seu receptor pode ser determinada em ensaios isentos de células.
Por exemplo, uma composição que compreende um polipeptídeo de hemaglutirnina de vírus influenza pode ser colocada em contato com um anticorpo e a capacidade de o anticorpo em inibir a composição que compreende um polipeptídeo de heraglutinina de gripe (HA) de se ligar a um receptor celular pode ser determinada.
Em
489/6,18 uma modalidade específica, o anticorpo é :mobil ;,,. ;c em um suporte sólido e a composição que compreende um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza é marcada com um composto detectável. Alternativamente, uma 5 composição que compreende um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) é imobilizada em urn suporte sólido a o anticorpo é marcado com um composto detectável. Em determinadas modalidades, a capacidade de um anticorpo em inibir um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) de se ligar a um receptor celular é determinada avaliando-se a porcentagem de inibição de ligação do anticorpo em relação a um controle (por exemplo, um anticorpo conhecido por inibir o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HAS de se ligar ao receptor celular). 15 Em outras modalidades, um anticorpo adequado para uso nos métodos descritos no presente documento no inibir a ligação de receptor de vírus influenza, ainda é encontrado se neutralizando em um ensaio descrito no presente documento. Em algumas modalidades, um anticorpo adequado para uso de acordo com os métodos descritos no presente documento reduz ou inibe a fusão de membrana vírus-hospedeiro em um ensaio conhecido na técnica ou descrito no presente documento.
Em uma modalidade, a fusão de membrana vírus- hospedeiro é ensaiada em um ensaio in vitro usando um vírus influenza contendo a repórter e uma célula hospedeira capaz de ser infectada com o vírus. Um anticorpo inibe a fusão se a atividade de repórter for inibida ou reduzida comparada a um controle negativo (por exemplo, atividade de repórter na presença de um anticorpo de controle ou na ausência de anticorpo).
Em uma modalidade, a fusão de membrana vírus- hospedeiro é detectada usando um sistema de modelo de fusão 5 celular. Em um ensaio de fusão celular exemplificador, as células (por exemplo, células HeLa) são transfectadas com um plasmídeo que codifica um polipeptídeo de hemagutinina de gripe (HA) e contraídas e expostas a urn tampão que permite a função de fusão de polipeptídeo de hemaglutiisina de gripe (HA) (por exemplo, tampão com pH 5,0) na presença de um anticorpo. Um anticorpo está neutralizando se ele reduzir ou inibir a formação de sincícic, comparada a um controle negativo (por exemplo, a formação de sincício na presença de um anticorpo de controle ca na =, ia de anticorpo).
Em outras modalidades, a fust,_. :emb. -.u. '. iL ìs- hospedeiro é ensaiada usando um ensaio à base de linossoma in vitro. Em um ensaio exemplificador, o receptor de célula hospedeira é reconstituído em lipossomas contendo mer.ade de 20 um repórter. Um polipeptídeo de hemaglutin.ina de gripe (HA) é reconstituído em outro conjunto de lipossomas contendo outra metade de um repórter. Quando as duas populações de lipossoma forem misturas entre si, a fusão é detectada pela reconstituição do repórter, por exemplo, uma reação enzimática que pode ser detectada de modo colorimétrico. 0 anticorpo inibe a fusão se a atividade de repórter for reduzida ou inibida comparada à atividade de repórter em um ensaio conduzido na ausência de anticorpo ou na presença de um anticorpo de controle. Em determinadas modalidades, a capacidade de um anticorpo de inibir a fusão é de—c minada
Q avaliando-se a porcentagem de fusão na presence do anticorpo em relação à porcentagem de fusão na oresnoca de um controle.
5.17.3 ENSAIOS PASA TES FAP, = AI= -.- i_ -Í)E DE 5 CÉLULAS ESTIMULADAS As células estimuladas de acord, com os métodos descritos no presente documento podem ser analisadas, por exemplo, para integração, transcrição e/ou expressão do polinucleotídeo ou gene(s) de interesse, número de cóp:_as do gene integrado, e localização da integração. Essa análise pode ser realizada em qualquer momento e pode ser realizada através de quaisquer métodos conhecidos na técnica. Em outras modalidades, a simulação bem sucedida da célula alvo com um polipeptíden de hemegiutinina de gripe (HA) descrita no presente documento é determinada detectando-se a produção de anticorpos de ne'JIanão contra o polipeptideo de hemaglutinina de gripe - cando métodos conhecidos na técnica ou de s_ r i o isonte documento. 20 Em determinadas modalidades, os indiv í c cos nos quais as células estimuladas, por exemplo, Dc:, são administradas podem ser analisados para localizec-lo das células, expressão de um polinucleotídeo de ven.or distribuído ou gene que codifica o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA), estímulo de uma resposta imune (por exemplo, produção de anticorpos de neutralização contra o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA;), e/ou monitorado para sintomas associados influenza ou uma doença associada a _ -1t_,x -, , :.._: de
49'/648 quaisquer métodos conhecidos na técnica cc descu` os no presente documento.
Os ensaios de repórter podem ser usados -para determinar a especificidade do dir-ecïonamento do 5 polipeptidea de hemaglutinina de gripe (HA). Por exemplo, uma população misturada de células de medula óssea pode ser obtida a partir de um indivíduo e cultura in vitro. O polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) pode ser administrado à população misturada de células de medula óssea, e a expressão de um gene repórter associado ao polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) pode ser ensaiada nas células culturadas. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 50%, com mais preferência, colo menos cerca de 60%, 70%, 80% ou 90%, ainda com mais preferência, pelo menos cerca de 95% de células estimuladas na população de células misturas são células dentríticas.
5.17.4 ENSAI1w DF ATTvTnan 1Xr'r~TTD\J Os anticorpos descritos no presente documento ou composições destes podem ser avaliados in vitro rara atividade antiviral. Em uma modalidade, ca anticorpos ou composições destes são testados in vitro para seu efeito no crescimento de um vírus influenza. O crescimento de vírus influenza pode ser avaliado através de qualquer método conhecido na técnica ou descrito no presence documento (por exemplo, em cultura celular). Em uma modalidade específica, as células são infectadas em um MOT de 0,0005 e 0,001, 0,001 e 0, 01, 0,01 e 0, 1, 0,1 e 1, ou 1 e 10, ou um MOI de 0, 0005, 0,001, 0,005, 0, 01, 0, 05, 0, 1, 0, 5, 1, ScL. 10 e incubadas com um meio isento de soro supl eme ,>.,_, o , Os 30 títulos virais são determinados no sodreraadante o.-r. placas de hemaglutinina ou qualquer outro ensaio ,Tical deco Lito no presente documento. As células nas quais os títulos virais podem ser avaliados incluem, mas não se limitam a, células EFK-2, células Vero, células MDCK, células endoteliais da 5 veia umbilical humana primárias (HUVEC), linhagem de célula epitelial humana H292 e células HeLa. Os ensaios in vitro incluem aqueles que medem a replicação vira_ alterada (conforme determinado, por exemplo, através da formação de placas) ou a produção de proteínas virais (--.;nforme 10 determinado, por exemplo, através de uma análise Western blot) ou RNAs virais (conforme determinado, por exemplo, por análise RT-PCR ou Northern blot) em células culr_uredas in vitro usando métodos que sejam bem conhecidos na rénnica ou descritos no presente document©. 15 Em um exemplo não-limitante, uma monocamada da linhagem de célula alvo de mamífero é infectada com quantidades diferentes (por exemplo, mulriplicidaçP de 3 unidades de formação de placa (pfu) ou 5 pfu) de vírus (por exemplo, influenza) e subsequentemente culturada na 20 presença ou ausência de várias diluições do anticorpos por exemplo, 0,1 pg/ml, 1 pg/ml, 5 pg/mi, cu 10 uq/ml). As culturas infectadas são colhidas 98 horas ou 72 horas pós- infecção e tituladas por ensaios de placa padrão conhecidos na técnica na linhagem de célula alvo apropr iada or 25 exemplo, células Vero).
Em um exemplo não-lim tan:e do um Ofl io de hemaglutinação, as células são colocadas em, contar}to com um anticorpo e são simultânea ou subsequentemente infectadas com o vírus (por exemplo, em um MOI de 1) e o vírus é 30 incubado sob condições para permitir a replicação de vírus
44 y 6 ,
(por exemplo, 20 a 24 horas) . lio preferênc:L , os anticorpos estão presentes ao longo do curso da infecção.
A replicação viral e a liberação de partículas virais são, então, determinada por ensaios de hemaglutinação usando U,5% de 5 hemácias de galinha.
Vide, por exemplo, Kashyap et ai., PNAS USA 105: 5986-5991. Em algumas modalidades, um composto é considerado um inibidor de replicação tira_ se este reduzir a replicação viral em pelo menos 2 poços de HA,
que se iguala aproximadamente a uma redução de 75%, no 10 título viral.
Em modalidades especificas, um inibidor reduz o título viral neste ensaio em 50% ou mais, 55% ou mais, em
60% ou mais, em 65% ou mais, em 70% ou mais, em 7.5% ou mais,
em 80% ou mais, em 85% ou mais, em 90% ou mais, ou em 95% ou mais.
Em outras modalidades específicas, um inibidor 15 resulta em uma redução de aproximadamente 1 log o,' méis, aproximadamente 2 logs ou mais, aproximadamente ao ou mais, aproximadamente 4 logs ou mais, aproxima_:-- -_nte 5 logs ou mais, aproximadamente 6 logs ou mais, • aproximadamente 7 logs ou mais, aproxïmadamente 8 logo ou 20 mais, aproximadamente 9 logs ou mais, aproximadamente 10 logs ou mais, 1 a 3 logs, 1 a 5 logs, 1 a 8 logs, 1 a 9 logs, 2 a 10 logs, 2 a 5 logs, 2 a 7 logs, 2 logs a 8 l cis, 2 a 9 logs, 2 a 10 logs 3 a 5 logs, 3 a 7 loas, 3 a 8 logs, 3 a 9 logs, 4 a 6 logs, 4 a 8 logs, 4 a 9 logs, 5 a 6 logs, 25 5 a 7 logs, 5 a 8 logs, 5 a 9 logs, 6 a 7 .tags, 6 a. 8 logs, 6 a 9 logs, 7 a 8 logs, 7 a 9 logs, ou 8 a 9 logs em título de vírus influenza no indivíduo.
A redução de loa em título de vírus influenza pode ser comparada a um controle negativo, conforme comparado a outro tratamento, ou conforme comparado ao título no paciente antes da administração de anticorpo.
5.17.5. ENSAIOS DE CITOTOXICIDADE Muitos ensaios bem conhecidos na técnica podem 5 ser usados para avaliar a viabilidade de células (infectadas ou não- infectadas) ou linhagens celulares após a exposição a um composto ativo ou a uma composição deste e, portanto, determinar a citotoxicidade do composto ou composição. Por exemplo, a proliferação celular pode ser 10 ensaiada medindo-se a incorporação de Bromodeoxiuridina (BrdU) (Vide, por exemplo, Hoshino et al., 1986, Int. J. Cancer 38, 369; Campana et al., 1988, J. Immunol. Meth. 107:79), incorporação de timidina (3H) (Vide, por exemplo, • Chen, J., 1996, Oncogene 13:1395-403; Jeoung, J., 1995, J. 15 Biol. Chem. 270:18367 73), por contagem celular direta, ou detectando-se alterações na transcrição, translação ou atividade de genes conhecidos, tais como proto-oncogenes (por exemplo, fos, myc) ou marcadores de ciclo celular (Rb, cdc2, ciclina A, Dl, D2, D3, E, etc). Os níveis de tal 20 proteína e mRNA e atividade podem ser determinados através de qualquer método bem conhecido na técnica. Por exemplo, a proteína pode ser quantificada por métodos imunodiagnósticos conhecidos, como ELISA, Western blotting ou imunoprecipitação usando anticorpos, incluindo 25 anticorpos comercialmente disponíveis. C) mRNA pode ser quantificado usando métodos que sejam bem conhecidos e rotineiros na técnica, por exemplo, usando uma análise Northern blot, proteção RNase, ou reação em cadeia de polimerase em conexão com uma transcrição reversa. A 30 viabilidade celular pode ser avaliada utilizando-se uma coloração tripano-azul ou outra morte celular ou marcadores de viabilidade conhecidos na técnica. Em uma modalidade específica, o nível de ATP celular é medido para viabilidade celular determinada. 5 Em modalidades específicas, a viabilidade celular é medida em períodos de três dias e sete dias usando um ensaio padrão na técnica, tal como o Kit de Ensaio CeliTiter-Glo (Promega) que mede os níveis de ATP intracelular. Uma redução no ATP celular é indicativa de um 10 efeito citotóxico. Em outra modalidade específica, a viabilidade celular pode ser medida no ensaio de absorção do vermelho neutro. Em outras modalidades, a observação visual para alterações morfológicas pode incluir dilatação, granularidade, células com bordas irregulares, uma 15 aparência membranosa, arredondamento, separação da superfície do poço, ou outras alterações. Fornecem-se a essas alterações uma designação de T (1.30 tóxica), PVH (parcialmente tóxica muito pesada - 80%), PH (parcialmente .~ tóxica pesada - 60%) , P (parcialmente tóxica - 40%) , Ps a 20 (parcialmente tóxica leve - 20%), ou 0 (sem toxicidade - 0%), conformando-se ao grau de citotoxidade observado. Uma concentração inibitória celular de 50% (citotóxica) (ICsa) é determinada por uma análise de regressão desses dados.
Em uma modalidade específica, as células usadas 25 no ensaio de citotoxidade são células animais, incluindo células primárias e linhagens celulares. Em algumas modalidades, as células são células humanas. Em determinadas modalidades, a citotoxicidade é avaliada em uma ou mais das seguintes linhagens celulares: U937, uma 30 linhagem celular de monócito humano; células mononucleares sanguíneas periféricas primárias (PBMC); Huh7, uma linhagem celular de hepatoblastoma humano; 2937, uma linhagem celular renal embriõnica humana; e THP-1, células monociticas. Em determinadas modalidades, a citotoxicidade 5 é avaliada em uma ou mais linhagens celulares a seguir: MDCK, MEF, Huh 7.5, Detroit, ou células epiteliais traqueobronquiais humanas (HTBE).
Os compostos ativos ou composições destes podem ser testados para toxicidade ín vivo em modelos animais.
Por exemplo, os modelos animais, descritos no presente documento e/ou outros conhecidos na técnica, usados para testar as atividades de compostos ativos também podem ser usados para determinar a toxicidade in vivo desses compostos. Por exemplo, os animais são administrados com uma faixa de concentrações de compostos ativos. De modo subsequente, os animais são monitorados com o passar do tempo para letalidade, perda de peso ou falha em ganhar peso, e/ou níveis de marcadores séricos que possam ser indicativos de lesões aos tecidos (por exemplo, nível de fosfoquinase de creatina como um indicador de lesões genéricas aos tecidos, nível de transaminase de ácido oxálico glutâmico ou transaminase de ácido pirúvico como indicadores para possíveis lesões ao fígado). Esses ensaios in vivo também podem ser adaptados para testar a toxicidade de vários modos e/ou regimes de administração além das dosagens.
A toxicidade e/ou eficácia de um composto ativo podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrão em culturas celulares ou animais experimentais, por exemplo, para determinar o LD50 (a dose letal a 50% da população) e o ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A razão de dose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão LD50 /ED50 . Um composto ativo que exibe grandes 5 índices terapêuticos é preferencial. Embora um composto ativo que exibe efeitos colaterais tóxicos possa ser usado, deve-se tomar cuidado para projetar um sistema de distribuição que direcione tais agentes ao sitio de tecido afetado a fim de minimizar as lesões potenciais a células não-infectadas e, desse modo, reduzir os efeitos colaterais.
Os dados obtidos a partir de ensaios de cultura celular e estudos animais podem ser usados na formulação de Uma faixa de dosagem de um composto ativo para uso em seres humanos. A dosagem desses agentes se situa, de preferência, em uma faixa de concentrações de circulação que incluem o ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta faixa dependendo da forma de dosagem empregada e da rota de administração utilizada. Para qualquer composto ativo usado em um método descrito no presente documento, a dose eficaz pode ser estimada inicialmente a partir de ensaios de culturas celulares. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para alcançar uma faixa de concentração de plasma de circulação que inclui o IC50 (isto é, a concentração do composto de teste alcança uma inibição quase máxima de sintomas) conforme determinado em cultura celular. Essas informações podem ser usadas para determinar mais precisamente doses úteis em seres humanos. os níveis em plasma podem ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alto desempenho. Informações adicionais referentes à determinação de dosagem são proporcionadas no presente documento.
Ademais, quaisquer ensaios conhecidos pelos indivíduos versados na técnica podem ser usados para 5 avaliar a utilidade profilática e/ou terapêutica dos compostos ativos e composições descritos no presente documento, por exemplo, medindo-se a infecção viral ou uma condição ou sintomas associados ã mesma.
5.17.6 ATIVIDADE ANTIVIRAL IN VIVO 10 De preferência, os compostos ativos e composições destes são ensaiados in vivo para a atividade terapêutica ou profilática desejada antes do uso em seres humanos. Por exemplo, podem-se usar ensaios in vivo para determinar se é preferível administrar um composto ativo ou composição 15 deste e/ou outra terapia. Por exemplo, para avaliar o uso de um composto ativo ou composição deste para prevenir uma doença de vírus influenza, a composição pode ser administrada antes de o animal ser infectado com vírus influenza. Alternativa, ou adicionalmente, um composto 20 ativo ou composição deste pode ser administrado ao animal ao mesmo tempo em que o animal é infectado com vírus influenza. Para avaliar o uso de um composto ativo ou composição deste para tratar uma infecção por vírus influenza ou doença associada a esta, o composto ou 25 composição pode ser administrado após infectar o animal com vírus influenza. Em uma modalidade específica, um composto ativo ou composição deste é administrado ao animal mais de uma vez.
Os compostos ativos e composições destes podem 30 ser testados para atividade antiviral em sistemas de modelo animal que incluem, mas não se limitam a, ratos, camundongos, galinhas, vacas, macacos, porcos, furões, cabras, ovelhas, cães, coelhos, porquinhos-da-índia, etc.
Em uma modalidade específica, os compostos ativos e 5 composições destes são testados em um sistema de modelo de camundongo. Esses sistemas de modelo são amplamente usados e bem conhecidos pelos artesãos versados na técnica. Em uma modalidade específica, os compostos ativos e composições destes são testados em um sistema de modelo de camundongo. Exemplos não-limitantes de modelos animais para vírus influenza são proporcionados nesta seção.
Em geral, os animais são infectados com vírus influenza e simultânea ou subsequentemente tratados com um composto ativo ou composição deste, ou placebo. Alternativamente, os animais são tratados com um composto ativo ou composição deste ou placebo e subsequentemente infectados com vírus influenza. As amostras obtidas a partir desses animais (por exemplo, soro, urina, cuspe, sêmen, saliva, plasma, ou amostra de tecido) podem ser testadas para replicação viral através de métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, aqueles que medem os títulos virais alterados (conforme determinado, por exemplo, através da formação de placas), a produção de proteínas virais (conforme determinado, por exemplo, por Western blot, ELISA, ou análise de citometria de fluxo) ou a produção de ácidos nucléicos virais (conforme determinado, por exemplo, por análise RT-PCR ou Northern blot). Para quantificação de vírus em amostras de tecido, as amostras de tecido são homogeneizadas em uma solução salina tamponada com fosfato (PBS), e as diluições de homogenatos clarificados são absorvidas durante 1 hora a 37°C sobre monocamada de células (por exemplo, células Vero, CEF ou MUCK). Em outros ensaios, realizam-se avaliações histopatológícas após a infecção, de preferência, avaliações de órgãos, onde sabe- 5 se que o vírus direciona a infecção. A imuno-histoquímica de vírus pode ser realizada usando um anticorpo monoclonal viral-específico.
0 efeito de um composto ativo ou composição deste sobre a virulência de um vírus também pode ser determinada usando ensaios in vivo nos quais o título do vírus em um indivíduo infectado é administrado como um composto ativo ou composição deste, o comprimento de sobrevivência de um indivíduo infectado administrado com um composto ativo ou composição deste, a resposta imune em um indivíduo infectado administrado com um composto ativo ou composição deste, o número, duração e/ou gravidade dos sintomas em um indivíduo infectado administrado com um composto ativo ou composição deste, e/ou o período de tempo antes do princípio de um ou mais sintomas em um indivíduo infectado administrado com um composto ativo ou composição deste, é avaliada. As técnicas conhecidas pelos indivíduos versados na técnica podem ser usadas para medir tais efeitos. Em determinadas modalidades, um composto ativo ou composição deste resulta em uma redução de 0,5 vez, 1 vez, 2 vezes, 4 25 vezes, 6 vezes, 8 vezes, 10 vezes, 15 vezes, 20 vezes, 25 vezes, 50 vezes, 75 vezes, 100 vezes, 125 vezes, 150 vezes, 175 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 750 vezes, ou 1.000 vezes ou maior em título de vírus influenza em relação a um indivíduo não-tratado. Em algumas modãlidades, um composto ativo ou composic.ão deste resulta em uma redução em título de vírus influenza em relação a um indivíduo não-tratado de aproximadamente 1 log ou mais, aproximadamente 2 logs ou mais, aproximadamente 3 logs ou mais, aproximadamente 4 logs ou mais, aproximadamente 5 5 logs ou mais, aproximadamente 6 logs ou mais, aproximadamente 7 logs ou mais, aproximadamente 8 logs ou mais, aproximadamente 9 logs ou mais, aproximadamente 10 logs ou mais, 1 a 3 logs, 1 a 5 logs, 1 a 8 logs, 1 a 9 logs, 2 a 10 logs, 2 a 5 logs, 2 a 7 logs, 2 logs a 8 logs, 10 2 a 9 logs, 2 a 10 logs 3 a 5 logs, 3 a 7 Logs, 3 a 8 logs, 3 a 9 logs, 4 a 6 logs, 4 a 8 logs, 4 a 9 Logs, 5 a 6 logs, 5 a 7 logs, 5 a 8 logs, 5 a 9 logs, 6 a 7 logs, 6 a 8 logs, 6 a 9 logs, 7 a 8 logs, 7 a 9 logs, ou 8 a 9 logs.
Descreveram-se modelos animais de vírus influenza, 15 tais como furões, camundongos, porquinhos-da-índïa, macacos-esquilo, macacos, e galinhas, desenvolvidos para uso para testar agentes antivirais contra vírus influenza. Vide, por exemplo, Sidwell et a1., Antiviral Res., 2000, 48:1-16; Lowen A.C. et ai. PNAS., 2006, 103: 9988-92; e 20 McCauley et a1., Antiviral Res., 1995, 27:179-186 e Rimmelzwann et al., Avian Diseases, 2003, 47:931-933. Para modelos de camundongos de influenza, exemplos não- limitantes de parâmetros que podem ser usados para ensaiar a atividade antiviral de compostos ativos administrados aos 25 camundongos infectados com influenza incluem morte associada à pneumonia, aumento de glicoproteína de al-ácido sérico, peso do animal, vírus nos pulmões ensaiado por hemaglutinina, vírus nos pulmões ensaiados por ensaios de placas, e alteração histopatológica nos pulmões. Realiza-se uma análise estatística para calcular a s:gnificãncia (por exemplo, um P valor de 0,05 ou menor). Em outros ensaios, realizam-se avaliações histopatológicas após a infecção de um indivíduo de modelo 5 animal.
Os turbinados nasais e a traqueia podem ser examinados para alterações epiteliais e inflação sub- epitelial.
Os pulmões podem ser examinados para alterações epiteliais bronquiolares e inflamação peribronquiolar em bronquíolos grandes, médios, e pequenos ou bronquíolos 10 terminais.
Os alvéolos também são avaliados para alterações inflamatórias.
Os bronquíolos médios são classificados em uma escala de 0 a 3+ da seguinte forma: © (normal: revestidos por células epiteliais colunares médias a altas com bordas ápicas ciliadas e núcleos pseudo-estratificados 15 basais; inflamação mínima); 1+ (camada epitelial colunar e uniforme em contorno com uma proliferação somente ligeiramente aumentada; cílios ainda visíveis em muitas células); 2+ (alterações proeminentes na camada epitelial variando de atenuação a proliferação marcada; células 20 desorganizadas e contorno de camada irregular na borda luminal); 3+ (camada epitelial consideravelmente rompida e desorganizada com células necróticas visíveis no lúmen;
alguns bronquíolos atenuados e outros em proliferação reativa marcada). 25 A traqueia é classificada em uma escala de 0 a
2,5+ da seguinte forma: 0 (normal: Revestida por células epiteliais colunares médias a altas com borda apical ciliada, núcleos pseudo-estratificados besais.
Citoplasma evidente entre a borda apical e o núcleo.
Foco pequeno 30 ocasional com células escamosas); 1+ (metaplasia escamosa focal da camada epitelial); 2+ (metaplasia escamosa difusa da maior parte da camada epitelial, cí=_ios podem estar focalmente evidentes); 2,5+ (metaplasia escamosa difusa com muito poucos cílios evidente). 5 Realiza-se uma imuno-histoquímica viral usando um monoclonal anticorpo viral-específico (por exemplo, monoclonal anticorpos NP-, N- ou HN-específicos). A coloração é classificada de 0 a 3+ da seguinte forma: 0 (sem células infectadas); 0,5+ (poucas células infectadas);
10 1+ (poucas células infectadas, como células individuais amplamente separadas); 1,5+ (poucas células infectadas,
como únicas amplamente separadas e em pequenos agrupamentos); 2+ (números moderados de células infectadas, geralmente afetando os agrupamentos de células adjacentes 15 em porções da camada epitelial que reveste os bronquíolos, ou em focos sublobulares pequenos nos alvéolos); 3+ (várias células infectadas, afetando a maioria da camada epitelial nos bronquíolos, ou espalhadas em grandes focos sublobulares nos alvéolos). 20 Em um exemplo, a capacidade de induzir lesões nos pulmões e causar infecção em um modelo animal de infecção viral é comparada usando um vírus tipo selvagem e um vírus simulado.
As lesões nos pulmões podem ser avaliadas como uma porcentagem de lóbulos pulmonares que são saudáveis por 25 inspeção visual.
Os animais são eutanasiados 5 dias p.i. por administração intravenosa de pentobarbital, e seus pulmões são removidos totalmente.
A porcentagem da superfície de cada lóbulo pulmonar que é afetado por lesões macroscópicas é estimada visualmente.
Calcula-se a média 30 das porcentagens para obter um valor médio para os 7 lóbulos pulmonares de cada animal. Em outros ensaios, cotonetes nasais podem ser testados para determinar a carga ou título viral. Os cotonetes nasais podem ser tomados durante a necropsia para determinar a carga viral pós- 5 infecção.
Em uma modalidade, o vírus é quantificado em amostras de tecido. Por exemplo, as amostras de tecido são homogeneizadas em uma solução salina tamponada com fosfato (PBS), e diluições de homogenatos clarificados absorvidos durante 1 hora a 37°C sobre monocamadas de células (por exemplo, células MDCK). As monocamadas infectadas são, então, sobrepostas com uma solução de meio essencial mínimo contendo 0,1% de albumina sérica bovina (BSA), 0,01% de DEAE-dextrano, 0,1% de NaHCO 3, e 1% de agar. As placas são incubadas 2 a 3 dias até que as mesmas possam ser visualizadas. Ensaios de dose infecciosa de cultura de tecidos (TCID) para titular o vírus a partir de amostras infectadas com PR8 são realizados da seguinte forma. As monocamadas confluentes de células (por exemplo, células MDCK) em placas com 96 poços são incubadas com diluições log de homogenatos de tecido clarificado em meio. Dois a três dias após a inoculação, alíquotas de 0,05 ml de cada poço são avaliadas para crescimento viral por um ensaio de hemaglutinação (ensaio HA). 25 5.17.6.1.1. ENSAIOS EM SERES HUMANOS Em uma modalidade, um composto ativo ou composição deste que modula a replicação de um vírus influenza é avaliado em indivíduos humanes infectados. De acordo com esta modalidade, um composto ativo ou composição deste é administrado ao indivíduo humano, e o efeito do composto ativo ou composição em replicação viral é determinado, por exemplo, analisando-se o nível do vírus ou ácidos nucléicos virais em uma amostra biológica (por exemplo, soro ou plasma). Um composto ativo ou composição 5 deste que altera a replicação viral pode ser identificado comparando-se o nível de replicação viral em um indivíduo ou grupo de indivíduos tratados com um controle àquele em um indivíduo ou grupo de indivíduos tratado com um composto ativo ou composição deste. Alternativamente, podem-se identificar alterações em replicação viral comparando-se o nível da replicação viral em um indivíduo ou grupo de indivíduos antes e após a administração de um composto ativo ou composição deste. As técnicas conhecidas pelos indivíduos versados na técnica podem ser usadas para obter a amostra biológica e analisar o mRNA ou expressão de proteína.
Em outra modalidade, os efeitos de um composto ativo ou composição deste sobre a gravidade de um ou mais sintomas associados a uma infecção/doença por vírus influenza são avaliados em um indivíduo infectado. De acordo com esta modalidade, um composto ativo ou composição deste ou um controle é administrado a um indivíduo humano que sofre de infecção por vírus influenza e o efeito do composto ativo ou composição em um ou reais sintomas da infecção viral é determinado. Um composto ativo ou composição deste que reduz um ou mais sintomas pode ser identificado comparando-se os indivíduos tratados com um controle aos indivíduos tratados com o composto ativo ou composição. Em uma modalidade específica, a administração de um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento) ou composição deste resulta em urra redução na hospitalização de um ser humano ou população de seres humanos causada por doença ou infecção de vírus influenza. 5 Em outra modalidade específica, a administração de um composto ativo (isto é, um polipeptideo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento) ou composição deste resulta em uma necessidade reduzida por assistência respiratória/respiração em um ser humano ou população de 10 seres humanos com uma doença ou infecção de vírus influenza.
Em outra modalidade específica, a administração de um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento) ou composição deste resulta em um comprimento reduzido de doença de um 15 ser humano ou população de seres humanos com uma doença ou infecção de vírus influenza.
Em outra modalidade específica, administração de um composto ativo (isto é, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento) ou composição deste resulta no aperfeiçoamento 20 (por exemplo, um aumento) no volume dos pulmões conforme avaliado, por exemplo, por pletismografia no corpo todo ou pulmonar.
Em outra modalidade, um composto ativo ou composição deste é administrado a um indivíduo humano saudável e monitorado para eficácia como uma vacina (por
25 exemplo, o indivíduo é monitorado para o princípio dos sintomas de infecção por vírus influenza; a capacidade de o vírus influenza infectar o indivíduo; e/ou uma reduçãó/ausência de um ou mais sintomas associados à infecção por vírus influenza). As técnicas conhecidas por 30 médicos familiarizados com doenças infecciosas podem ser usadas para determinar se um composto ativo ou composição deste reduz um ou mais sintomas associados à doença de vírus influenza.
5.18 AVALIAÇÃO DE ANTICORPOS EM 'JM TNDTVÏDUO 5 Em outro aspecto, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito no presente documento, ou vírus que expressa um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um 10 polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito no presente documento, pode ser usado para avaliar a resposta de anticorpo de um indivíduo (por exemplo, um indivíduo virgem ou um indivíduo imunizado/vacinado) ou uma população de indivíduos a um polipeptídeo de hemaglutinina 15 de vírus influenza (por exemplo, um polipeptídeo HA de gripe, tal como um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico (vide, por exemplo, Ex-mplo 8, abaixo). Em modalidades específicas, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico ou um a vírus 20 que expressa um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico pode ser usado para avaliar a presença de anticorpos tronco-específicos no indivíduo ou em uma população de indivíduos. Em modalidades específicas, o polipeptídeo HA de vírus influenza quimérico compreende um 25 ou mais sítios de glicosilação modificados no domínio de tronco HA e/ou um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural no domínio de cabeça globular.
Em uma modalidade específica, a resposta de anticorpo de um indivíduo ou uma população de indivíduos 30 que foram imunizados/vacinados com um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HJS(s) descrito no presente documento, tal como um oolipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico, ou um vírus que 5 expressa um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) descrito no presente documento, tal como urn polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico), é avaliado para identificar os tipos de anticorpos ,asile-específicos no indivíduo ou população de indivíduos. Essa avaliação 10 pode permitir a identificação de marcadores/pontos finais substitutos importantes na determinação da resposta clínica à administração de um polipeptídeo HA de vírus influenza (por exemplo, um polipeptídeo HA de gripe, tal como um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) 15 descrito no presente documento, ou um vírus que expressa um polipeptídeo HA de vírus influenza (por exemplo, um polipeptídeo HA de gripe, tal como um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) descrito no • presente documento. Nessa abordagem, uma amostra biológica, 20 por exemplo, sangue, do indivíduo ou população de indivíduos pode ser isolada e testada diretamente para a determinação da presença de anticorpos, ou pode ser processada (por exemplo, para obter soro) e subsequentemente testada para a determinaç,yo da presença de 25 anticorpos.
Em outra modalidade específicz3, o perfil de anticorpo de um indivíduo virgem (isto é, um indivíduo que não foi imunizado/vacinado com um polipeptídeo HA de vírus influenza (por exemplo, um polipeptídeo ITA de gripe, tal 30 como um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito no presente documento), ou um vírus que expressa um polipeptídeo HA de vírus influenza (por exemplo, um polipeptídeo HA de gripe, tal como um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico)) ou uma 5 população de indivíduos virgens é avaliado para determinar se o dito indivíduo ou população de indivíduos possui anticorpos cabeça globular-específicos e/ou anticorpos caule-específicos contra várias cepas ou subtipos de vírus influenza. Essa avaliação pode permitir - geração de um polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico), ou vírus que expressam o polipeptídeo de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico) , que sejam adequados para a administração ao dito indivíduo ou população de indivíduos, por exemplo, nolipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA), tal como um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico, que compreende um domínio de cabeça ao qual o dito indiv¡iuo ou população de indivíduos é virgem (não tem anticorpos!. Essa avaliação pode determinar uma estratégia de imunização para o paciente.
Em outra modalidade específica, proporciona-se um método para avaliar/detectar a presença de anticorpos em um indivíduo que sejam específicos para um domínio de tronco de uma cepa ou subtipo de vírus influenza particular que compreende contatar in vitro uma amostra biológica (por exemplo, sangue,soro) do dito indivíduo corn um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito no presente documento, em que o dito polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico compreende um domínio de tronco a partir da cepa ou subtipo de interesse. Vide os Exemplos 6 a 8, infra, para métodos de avaliar/detectar a presença de anticorpos específicos para 5 um domínio de tronco de uma cepa ou subtipo de vírus influenza particular. Em outra modalidade específica, proporciona-se um método para avaliar/detectar a presença de anticorpos em um indivíduo que sejam específicos para um domínio de tronco de uma cepa ou subtipo de vírus influenza particular que compreende contatar in vitro uma amostra biológica (por exemplo, sangue, soro) do dito indivíduo com um vírus expressando/contendo um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito no presente documento, em que o dito polipeptdeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico compreende um domínio de tronco da cepa ou subtipo de interesse.
5.19 KITS Proporciona-se no presente documento um pacote ou kit farmacêutico que compreende um ou mais recipientes preenchidos com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas/imunogênicas descritas no pr -ente documento, tal como um ou mais compostos ativosr:norcionados no presente documento. Opcionalmente associada a tais recipientes, encontra-se uma advertência na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biol gicos, sendo que tal advertência reflete a aprovação pela agência de fabricação, uso ou venda para adminis_ração em seres humanos.
Os kits abrangidos no presente documento podem ser usados de acordo com os métodos descritos no presente documento. Em uma modalidade, um kit compreende um composto ativo descrito no presente documento, de preferência, um ou 5 mais polipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) (por exemplo, um ou mais polipeptideos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico), em um ou mais recipientes. Em determinadas modalidades, um kit compreende urna vacina descrita no presente documento, por exemplo, uma vacina de 10 vírus dividido, uma vacina sub-unitária, uma vaccine vírus influenza inativado, ou uma vacina de vírus influenza vivo, em que a dita vacina compreende um ou mais oolipeptídeos de hemaglutinina de gripe (HA) descritos no presente documento (por exemplo, um ou mais polipeptídeos de hemaglutinina de 15 vírus influenza quimérico). Em uma modalidade específica, proporcionam-se no presente documento kits que compreendem um" polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito no presente documento e instruções para • utilização do polipeptídeo de hemaglutinina de vírus 20 influenza quimérico para avaliar os anticorpos presentes em um indivíduo. Em outra modalidade específica, proporcionam- se no presente documento kits que compreendem um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico descrito no presente documento para uso em métodos para 25 avaliar a presença de anticorpos específic_:s HA de domínio de tronco em urna amostra.
6. EXEMPLOS
6.1 EXEMPLO 1: Polipeptídeos de domínio de tronco de hemaglutinina de influenza
TABELA 8. Sumário das Construcaes Segmento de Segmento de Nome tronco N- Ligante tronco C- Domínio HA2 terminal HA]. terminal HA1~ PR8-2G SEQ ID NO:34 Gly-Gly SEQ II) NO:50 SEQ ID NO:66 PR8-4G SEQ ID NO:34 Gly-Gly-Gly- SEQ ID NO:50 SEQ ID Gly NO:66 PRB-PG SEQ ID NO:34 Pro-Gly SEQ ID NO:50 SEQ ID NO:66 PR8-No Cys-1G SEQ ID Gly SEQ ID SEQ ID NO:177 NO:226 NO:66 PR8-No Cys 2G SEQ ID Gly-Gly SEQ ID SEQ ID NO:177 NO.226 NO:66 PR8-No Cys 3G SEQ ID Gly-Gly-Gly SEQ ID SEQ ID NO:177 NO:226 NO:66 PR8-No Cys SEQ ID ligação SEQ TD SEQ ID NO:177 direta NO:226 NO:66 PR8-No Cys ãl SEQ ID ligação SEQ ID SEQ ID NO:178 direta NO:227 NO:66 PR8-No Cys 63 SEQ ID ligação SEU ID SEQ ID NO:179 direta NO:228 N0:66 PR8-No Cys SEQ ID Asn-Ala-Ser SEQ ID SEQ ID NAS NO:177 NO:226 NO:66 PR8-CON-A SEQ ID Gly-Gly-Gly- SEQ ID SEQ ID N0:312 Gly N0:313 NO:66 PR8-CON-B SEQ ID NO:34 Gly-Gly SE(.; ID SEQ ID NO:H14 NO:66 PR8-CON-C SEQ ID Gly-Gly SEQ ID SEQ ID NO:315 NO.316 NO:66 HK68-2G SEQ ID NO:36 Gly-Gly SEQ ID NO:52 SEQ ID NO:68 HK68-4G SEQ ID NO:36 Gly-Gly-Gly- SEQ IID NO:52 SEQ ID Gly N0:68 HK68-PG SEQ ID NO:36 Pro-Gly SEQ 1I; NO:52 SEQ ID NO: 68 HK68-No Cys SEQ ID ligação SE() ID SEQ ID NU :183 direta NU .: 13L IHK68-No Cys SEQ ID ligação SEU ID f SEQ ID r11 NO:184 direta NO:233 NO:68 HK68-No Cys SEQ ID ligação SEQ ID SEQ ID _ A,3 NO:185 direta NO1234 NO:68 HK68-No Cys SEQ ID Asn-Ala-Ser SE() ID SEQ ID NAS NO:183 NO:232 NO:68 HK68-CON-A SEQ ID Gly-Gly-Gly -- SEQ IL) NO: 52 SEQ ID NO:308 Gly NO:68 HK68-CON-B SEQ ID NO:36 Gly-Gly SEQ ID SEQ ID NO:309 NO:68
Segmento de Segmento de Nome tronco N- Ligante tronco C- (Domínio HA2 terminal HA1 terminal HA1 HK68-CON-C SEQ ID Gly-Gly-Gly- SE(_ ID SEQ ID NO:310 Gly NO: 311 I NO:68 O exemplo instantâneo proporcicria polipeptídeos úteis na Tabela 8 que podem ser preparados rye acordo com os métodos descritos no presente documento.
6.2 EXEMPLO 2: POLIPEPTÍDEOS DE HEMAGLUTININA DE 5 VÍRUS INFLUENZA QUIMÉRICO Este exemplo descreve polipeptídeos de hemaglutinina de virus influenza quimérica. e métodos para induzir altos níveis de anticorpos d,_ caule HA de neutralização cruzada em um indivíduo que compreende a administração dos ditos polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico. Conforme descri--o neste exemplo, gerou-se a hemaglutinina de vírus influen'a quimérico que foi expressa com sucesso por vírus influer%a e por células modificadas por engenharia genética pr.r.a expressar a hemaglutinina de vírus influenza quimérico. A hemaglutinina de vírus influenza quimérico foi recuperada com sucesso em sua conformação apropriada, conforme evidenciado por reconhecimento de anticorpo tanto do domínio de caule como do domínio de cabeça da hemaglutinina de vírus influenza quimérico.
A Figura 7 descreve hemaglutinin~zs (HAs) de vírus influenza quimérico, que compreendem o domínio de tronco/caule de um subtipo H1 de vírus influenza e dos domínios de cabeça globular heterólogos dc outros subtipos de vírus influenza (H2, H3, e H5). Seguindo a estratégia esboçada na Figura 7, gerou-se um vírus influenza que compreende uma HA quimérica composta por um domínio de tronco derivado a partir de um vírus influenza H1N1 (PR8- H1N1) e domínio de cabeça globular da HA Hl pandêmica de 2009 (Cal/09). Os domínios de cabeça globular das HAs dos 5 dois vírus são bastante distintos (-70% de identidade de aminoácido) enquanto os domínios de tronco são altamente conservados, mas ainda divergentes H89ó de identidade de aminoácido). Conforme demonstrado na Figura 8, as HAs quiméricas com o mesmo domínio de tronco, rias cabeças de HA bastante diferentes dentro do mesmo subtipc foram expressas.
Além disso, uma HA quimérica que- consiste em um domínio de caule de HA A/PR8/34 e o domínio de cabeça globular de HK/68 (H3 quimérico) bem como ;IAs tipo selvagem (PR8-HA e HA HK68) foram expressas em células 293T. A Figura 10 demonstra que também é posslv-J1 expressar HAs quiméricas estáveis com o mesmo domínio de -ronco (derivado a partir da HA subtipo Hl) e com uma cabeça globular a parti de um a subtipo diferente (H3).
Portanto, imunogenes HA que compartilham completamente o domínio de tronco HA, mas são altamente divergentes em suas cabeças globulares foram projetados. Imunizaç©es repetidas com essas construções devem resultar em altos níveis de anticorpos de neutralização cruzada contra o domínio de tronco comum da HA. Uma estratégia de vacina aperfeiçoada usa HAs quiméricas corm um domínio de tronco/caule constante e uma alteração de cabeça globular para induzir anticorpos de domínio anti-tronco de neutralização cruzada robustos. Um dorinio de tronco constante, por exemplo, da HA Hl a partir de A/PR/8/34 pode ser usado junto com as cabeças globulares a partir de HAs grupo 1 diferentes (H1, H2, H5, H9) para produzir um painel de vírus recombinantes inativados, vírus recombinantes atenuados ou HAs recombinantes (Figura 9). Um painel similar para HAs grupo 2 com base no domínio de tronco, por 5 exemplo, de H3 HA de um vírus X31, em combinação com cabeças globulares H3, H4 e H7 pode pro-;orcionar a base para uma vacina universal HA grupo 2. Os vírus recombinantes podem ser resgatados em uma _•adeia principal de vacina de vírus influenza, tal como. PR/8 ou vírus influenza adaptados ao frio, desenvolvidos por técnicas padrão como vacinas inativadas ou atenuadas. HAs recombinantes podem ser expressas em célul,os de insetos que sejam capazes de realizar uma glicosilação tipo mamífero (MIMIC Sf9) ou por transfecção transiente, por exemplo, de células 293 T ou Vero, e, então, podem ser purificadas por cromatografia Ni-quelato com a ajuda de um tag his C- terminal. Outras estratégias podem incluir o uso de vacinas de DNA que expressam as HAs quiméricas oL. outros vetores, tais como vetores de adenovírus, expressando as HAs quiméricas.
6.3 EXEMPLO 3: VÍRUS QUE EXPRESIAM POLIPEPTÍDEOS
DE HEMAGLUTININA DE VÍRUS INFLUENZA QUIMÉRICO Este exemplo descreve várias hemaglutininas de vírus influenza quimérico que abrangem u-ma variedade de combinações de cabeça globular e caule- de diferentes subtipos de hemaglutinina bem como vírus influenza recombinantes que expressam essas hemaglut-ninas quiméricas, que tinham propriedades de crescimento sim Pares àquelas de vírus influenza tipo selvagem. 30 6.3.1 MATERIAIS E MÉTODOS
6.3.1.1 CÉLULAS E VÌRUS As células 293T e MDCK foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA) e foram mantidas em um meio essencial mínimo da Dulbecco 5 (UNEM) ou em NEM (Gibco, Invitrogen) suplementado com 10% de soro bovino fetal (HyClone; Thermo Scientific) e penicilina-estreptomicina (Gibco, Invitrogen).
Todos os vírus recombinantes A/PR/8/34 foram desenvolvidos em ovos de galinha embrionad--s com 10 dias de 10 idade a 37°C durante 2 dias.
6.3.1.2 CONSTRUÇÁO DE PLASMÍDE(',::~ Os plasmídeos que codificam as diferentes hemaglutininas quiméricas foram construídos por uma estratégia similar adaptada a partir da construção de 15 plasmídeos de genética reversa para gerar vírus recombinantes conforme previamente descrito (vide, por exemplo, Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682; e Hai et ai., 2008, J Virol 82:10580-10590). Em resumo, os segmentos diferentes de HA quimérica foram amplificados por PCR com 20 iniciadores contendo sítios SapI, digeridos com SapI, e clonados em sítios SapI do vetor pDZ que contém o promotor de polimerase I de RNA humano e o terminador de polimerase I de RNA de camundongos (vide, por exemplo, Quinlivan et al., 2005, J Virol 79:8431-8439), através-, de uma ligação 25 multi-segmental.
6.3.1.3 ANÁLISE CITOMÉTRICA DEFLUXO Para avaliar os níveis de proteínas de hemaglutinina na superfície celular, células 293T foram transfectadas com 1 jig do plasmídeo apropriado usando 30 Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo ::,om as instruções do fabricante. Em 24 horas pós-transfec,zão, as células foram tripsinizadas e ressuspensas em PB" contendo 2% de FBS antes de tingi-las com o anticorpo oonoclonal (mAb) 6F12 contra HAs H1 em uma diluição 1/1000 ou com o mAb 1201 5 contra HAs H3 (vide Wang et al., 2010, PL0S Pathog 6:e1000796) em uma diluição 1/400. As células tingidas foram enumeradas em um citômetro de fluxc Beckman Coulter Cytomics PC 500, e os resultados foram analisados usando o software FlowJo. 10 6.3.1.4 ENSAIO DE GERAÇÃO E EE?'RADA DE PSEUDO- O procedimento para a produção de pseudo- partículas foi adaptado a partir de estudos anteriores (vide, por exemplo, Evans et al., 2007, Na:ure 446:501-805; e Sul et al., 2011, Clin Infect Dis 52:1003-1009). Em resumo, as células 293-T foram co-transfectadas com quatro plasmídeos que codificam (i) um pro-vírus contendo o repórter desejado (V1-GLuc), (ii) HIV Crag-Pal, (iii) a proteína de hemaglutinina quimérica diferente e (iv) neuraminidase PRO de influenza A (NA). :Is sobrenadantes foram coletados 72 horas pós-i.ransfecção e, subsequentemente, filtrados (0,45 pm de tamanho de poro).
Todas as transduções e ensaios de infecção usando pseudo- partículas foram realizados na presença de 1 pg/ml de polibreno (Sigma, St. Louis, MO, EUA) (vide Sul et al., 2011, Clin Infect Dis 52:1003-1009).
O ensaio de entrada foi realizado através da infecção de células MOCK com pseudo-pazticulas com uma hemaglutinina quimérica diferente contendo o repórter G-Luc. Vinte e quatro horas após a infecção, as células foram lavadas três vezes com um meio fresco para remover a proteína G-Luc que estava presente no inoculo de pseudo- partícula. Quarenta e oito horas apes a infecção, realizaram-se ensaios de luciferase (vide Evans et al., 5 2007, Nature 446:801-805).
6.3.1.5 RESGATE DE VÍRUS INFLU MZA A QUIMÉRICOS
RECOMBINANTES O resgate de vírus influenza A a partir do DNA de plasmídeo foi realizado conforme descrito _previamente (vide, 10 por exemplo, Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682; e Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590). Para gerar um vírus PR8 tipo selvagem (rWT) recombinante, as células 293T foram co-transfectadas com 1 pg de cada um dos 8 plasmídeos de resgate PR8 pDZ usando Lipofectamina 2)00 (Invitrogen, 15 Carlsbad, CA, EUA). Os vírus que expressam ima HA quimérica diferente foram gerados da mesma forma, porém, substituindo o plasmídeo de HA pela HA quimérica correspondente para recuperar os vírus quiméricos correspondentes. Em 6 horas após a transfecção, o meio foi substi°ruído por DMEM 20 contendo 0,3% de albumina sérica bovina BSA), 10 mM de HEPES, e 1,5 pg/ml de tripsina tratada com TPCK (L-1- tosilamida-2-feniletil clorometil cetona). Após 24 horas pós-transfecção, o sobrenadaste contendo vírus foi inoculado em ovos de galinha embrionadon com 8 dias de 25 idade. 0 fluido alantóico foi colhido após 2 dias de incubação a 37°C e ensaiado para a presença de vírus por hemaglutinação de hemácias de galinha e por formação de placas em células MDCK.
6.3.1.6 ENSAIO CINÉTICO DE CRESCIMENTO DE VÍRUS
Para analisar as características de replicação de vírus recombinantes, ovos de galinha emlérionados com 10 dias de idade foram inoculados com 100 pfuu de cada vírus respectivo. O fluido alantóico f, _:i colhido e 5 subsequentemente ensaiado para crescimento viral em 0, 9, 24, 48, e 72 horas pós-infecção (hpi). Os vítulos de vírus presentes no fluido alantóico foram determinados por ensaio de placas em células MDCK.
6.3.1.7 IMUNOCOLORAÇÃO DE PLAC. 10 As placas foram visualizadas pcr. imunocoloração com mAb (HT103) contra a proteína NP de inE --uenza A.
6.3.1.8 WESTERN BLOT E ANÁLISE DE
IMUNOFLORESCÊNCIA INDIRETA Um poço de uma placa com 12 poço de células MDCK 15 confluentes foi infectado (multiplicidade de infecção [MOI] de 2) com vírus influenza recombinantes indicados ou vírus simulado infectado com uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 1 hora a 37°C. Er, 12 horas pós- infecção (hpi), as células foram usadas em tampão de 20 carregamento de proteína 1X conforme descrito previamente (vide, por exemplo, Hai et al., 2008, J Virol 82:10580- 10590) . Os lisatos celulares reduzidos foram analisados por análise Western blot utilizando-se mAbs contra, A/NP (HT103), A/PR8/HA (PY102), A/Cal/09/HA (291-1), A/VN/HA (M08) 25 (20), A/H3/HA (12D1). A detecção de Perth-.cH7 usou um soro policlonal de cabra, NR-3152, cont ma um virus A/FPV/Dutch/27 (H7), que foi obtido a junta a BEI Resources.
O anticorpo de controle de carregamento de rrLAb anti- gliceraldeído 3-fosfato deidrogenase (GAPDH) foi obtido 30 junto a Abcam. Todas as proteínas de interesse foram visualizadas usando um sistema de detecçê-- de proteína de quimioluminescência aprimorado (PerkinElmc:- Life Sciences, Boston, MA, EUA).
Para uma análise de imunoflorescência, as 5 monocamadas confluentes de células MDCK cm coberturas de vidro de 15-mm foram infectadas com vírus recombinantes em um MCI de 2. Em 15 hpi, as células foram fixadas e permeabilizadas com metanol-acetona (razão, 1:1) a -20°C durante 20 minutos. Após serem bloque,jddas com 1% de 10 albumina sérica bovina em PBS contendo 0,1= de Tween 20, as células foram incubadas durante 1 hora com o anticorpo dirigido contra vírus A/NP (HT103), P/H1/HA (6F12), A/PR8/HA (PY102), A/Cal/09/HA (29C1), A/VN/HA (M08) (20), A/H3/HA (12D1), e A/H7 (NR-3152) conforme mencionado 15 anteriormente. Após trés lavagens com PBS contendo 0,1% de Tween 20, as células foram incubadas durante 1 hora com imunoglobulina G anti-camundongo conjugada com Alexa Fluor 594 (IgG; Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) CO imunoglobulina • G anti-cabra conjugada com Alexa Fluor 594 IgG, Invitrogen, 20 Carlsbad, CA, EUA). Após as três lavagens finais, as células infectadas foram analisadas por microscopic de fluorescência com um microscópio Olympus IX70.
6.3.2 RESULTADOS
6.3.2.1 GERAÇÃO DE HEMAGLUTININAS QUIMÉRICAS 25 A fim de obter informaçõe-c referentes à conservação dos resíduos de cisteína que formam a ligação de dissulfeto Cys52-Cys277, um alinhamento das sequências HA de vírus influenza A dos subtipos H1, H3, H5 e H7 foi gerada (vide a Figura 11). As sequências das subunidades 30 HAI são menos conservadas que aquelas das subunidades HA2,
principalmente devido à presença de sítios antigênicos imuno-dominantes no domínio de cabeça globular. As cadeias HA2 mais conservadas compreendem as regiões de caule que ancoram as moléculas HA ao envelope vira --. O alinhamento 5 demonstra que Cys52 e Cys277 e os aminoácidos em direção a ambas as extremidades são conservados atre~vés dos subtipos selecionados. Daqui em diante, as sequências de hemaglutinina N-terminais a Cys52 e C-terminais a Cys277 são definidas como o domínio de caule (Figura 11). A sequência interveniente é considerada ne-te exemplo como sendo o domínio de cabeça.
Uma construção de hemaglutinina quimérica (PR8- cHl) contendo a HA de domínio de cabeça globular H1 Cal/09 pandêmica com a região de caule a partir da HA PR8 (H1) foi primeiramente gerada (Figura 12A). Uma HP quimérica (PR8- cH5) contendo a cabeça globular a partir cl-- HA VN1203 (H5) com o caule da HA PR8 (H1) também foi gerara (Figura 123) Visto que todos os 16 subtipos de HA do influenza são agrupados em dois grupos filogenéticos (grupos 1 e 2) (vide, por exemplo, Sui et al., 2009, Nat Struct Mol Biol 16:265- 273) e HAs H1 e H5 pertencem ao grupo 1, aplicou-se uma estratégia similar para gerar uma HA quimérica portando o domínio de cabeça A/Alberta/24/01 (H7) -om a região de caule de HA A/Perth/16/2009 (H3) (Perth-cH7) (Figura 123). Tanto H7 como H3 são membros do grupo filocenético 2 (vide, por exemplo, Sui et al., 2009, Nat Struct HIol Biol 16:265- 273).
A seguir, testou-se se as +dife es construções de HA quimérica estavam sendo expressas e transportadas à superfície celular. A análise de classificação de célula ativada por fluorescência (FACS) de células 293T transientemente transfectadas foi realizada após a coloração superficial com anticorpos específicos de domínio de caule PR8 e H3, respectivamente (Figura 13A). Conforme 5 mostrado na Figura 13A, a expressão de todas as três construções quiméricas foi detectada. Este detecção indica que o transporte das HAs quiméricas atravË:as do complexo de Golgi até a superfície celular não é inter.::>mpido. A seguir, as características de entrada das diferentes HAs quiméricas foram examineecdas através de infecção de células MDCK com partículas pseudo-tipificadas por HA retroviral contendo a HA quiméi ca, PR8 NA de influenza A tipo selvagem e luciferase b,lseada em HIV. A eficiência de entrada mediada pelas psoteinas de HA quimérica foi detectada por leitura de luciferase. Os níveis comparáveis de distribuição de lu_-iferase mediada por partícula pseudo-tipificada foram observados para PR8- cR5 e HAs quiméricas Perth-cH7 e as proteí:as tipo selvagem correspondentes (Figura 13B). A HA PR8-cHl mostrou um nível de luciferase inferior comparado a outras ,onstruções HA.
6.3.3 GERAÇÃO DE VÏRUS INFLUENZA RECOMBINANTES PORTANDO HEMAGLUTININAS QUIMÉRICAS.
Tendo em vista os resultains anteriores, confirmou-se se uma HA quimérica é funcional no contexto de uma partícula de vírus completa e, em última análise, permitiria o resgate de um vírus influenza. A recombinante expressando somente uma HA quimérica. Usando os protocolos previamente publicados (vide, por exemplo, Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682; e Hai et al., 2008, J Virol 30 82:10580-10590), os vírus contendo todas as diferentes HAs quiméricas foram gerados com sucesso. Os iLrus resultantes foram purificados por placas, amplificados em ovos embriónicos com 10 dias de idade e os segmentos quiméricos foram analisados por RT-PCR e sequenciacHs. Em todos os 5 caos, constatou-se que o vírus tem o segmento de HA quimérica esperado e nenhum outro segmento HA.
A identidade dos vírus cuimérïcos foi adicionalmente demonstrada por Weste-n blotting e imunoflorescência indireta de células infectadas (Figuras 10 14A e 14B). As células MDCK foram infectadas com vírus rWT A/PR8, A/Perth tipo selvagem, PR8-cHI, PR8 - iH5, e Perth-cH7 (Figuras 14A e 14B). As proteínas de HA quimérica PR.8-cHl e PR8-cH5 foram detectadas nas amostras correspondentes • usando anticorpos contra Cal/09 HA (2901) ou VN/04 HA (M08) 15 (vide Steel et a1., 2009, J Virol 83:1742-1753), respectivamente (Figura 14A). Usando 12D1, um mAb de caule pan-H3 (vide Wang et al., 2010, PLoS Patho,,a 6:e1000796), os níveis de expressão comparáveis entre Perth cH7-HA e Perth HA tipo selvagem foram observados. Uma banda positiva foi 20 detectada somente para a amostra de infec._ão Perth-cH7 ao usar anticorpos anti-H7 (NR-3152).
Para o estudo de imunoflorescência, as condições de infecção foram similares àquelas para a análise Western. As células infectadas foram tingidas com os anticorpos 25 correspondentes conforme indicado na Figura 14P. Todas as células infectadas mostraram a expressão esperada das HAs, bem como da proteína A/NP (Figura 14B).
6.3.4 CARACTERÍSTICAS DE REPLI iÇÃC DE VÍRUS
RECOMBINANTES
As propriedades de crescimento ios vírus foram avaliadas em ovos de galinha embrionados com 10 dias de idade a 37°C (Figura 15A). 0 vírus PR8 rWT foi inoculado para comparação da cinética de crescimento dos vírus 5 recombinantes que expressam HAs quiméricas. Considerando o vírus PR8-cH5, um padrão de replicação similar comparado ao vírus PR8 foi observado. Quanto ao vírus Perth-cH7, teve uma redução de 2 vezes em título viral c:,mparado a outro vírus PR8 rWT em 9 hpi. Todavia, este alca:,cou um titulo de pico similar como o vírus tipo selvagem ;1X109 PFU/ml) em 48 hpi. 0 vírus PR8-cHl foi atenuado quando comparado ao vírus PR8 rWT, conforme mostrado pela redução em títulos através de todos os pontos de tempo. TodsTia, mesmo este vírus quimérico alcançou um título de pico respeitável de aproximadamente 108 PFU/ml. 0 fenótipo cc placa de cada vírus quimérico também foi avaliado em células MDCK. Todos os vírus formaram placas com tamanhos comparáveis conforme mostrado na Figura 15B. Esses resultados confirmam que as construções de HA quimérica se enovelaram. in vivo e são biologicamente funcionais.
6.3.5 CONCLUSÃO Desenvolveu-se uma estratégia inovadora para gerar vírus influenza com proteínas de HA quimérica portando diferentes HAs de domínio de cabeça globular levando-se vantagem da ligação de dissulfeto conservada Cys52-Cys277 que demarca a borda entre os domínios de cabeça e caule. Portanto, através da substituição do domínio de cabeça parental pelo domínio de cabeça de outra HA, um painel de HAs quiméricas com o mesrlc caule, mas com cabeças globulares diferentes foi gerado. 0 design foi
.- 526/648 testado em múltiplos subtipos, incluindo o domínio de caule com Cal/09 e cabeças globulares VN H5. Além disso, uma cabeça globular H7 foi colocada em um domínio de caule H3. Essas construções cobrem ambos os grupos tilogerléticos da 5 proteína de HA de influenza. Cada constrt,cão foi expressa sobre a superfície celular e reteve a atividade de fusão conforme mostrado na Figura 12. A geração de vírus recombinantes portando as HAs quiméricas valido., ainda, que as HAs se enovelaram corretamente retiveram as 10 funções biológicas.
6.4 EXEMPLO 4: APLICAÇÕES DE DIAGNÓSTICO DE POT,TPRP'PÍfl1 O nF - M7\ (-- rT7mTMTn7T IL T7 -r, T TI _ --
E VACINAÇÃO DE CAMUNDONGOS COM PCCLIPEPTÍDECS DE
HEMAGLUTININA DE VÍRUS INFLUENZA QUIMÉRICO 15 Este exemplo demonstra que os polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quimÉcico podem ser utilizados para propósitos de diagnósticc e que os vírus que expressam polipeptideos de hemaglu-inina de vírus influenza quimérico podem ser utilizados em vacinas. 20 6.4.1 MATERIAIS E MÉTODOS
6.4.1.1 CÉLULAS E PLASMÌDEOS As células 293T e MDCK foram obtidas junto a ATCC e mantidas em um meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) e em um Meio Essencial Mínimo (ambo junto a Gibco), 25 respectivamente, cada uma suplementada com 10% de soro bovino fetal (HyClone), e 100 unidades/ml á.7e penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Pen/Strep, Gibco). TNM-FH (Sigma- Aldrich) suplementado com 10% de soro bovino feLal e meio de cultura de inseto SFX Hyclone (ThermoS'cientific) foram usados para uma cultura celular Sf9 e ETI-TNSBl-4 (High Five) .
As construções de hemaglutinina quimérica com o caule de A/Puerto Rico/8/1 934 (PR8) contendo o domínio de 5 cabeça globular do vírus A/Mallard/Sweden,"41/02 ("cH6") ou vírus A/Guinea fowl/Hong Kong/WF10/99 ("cH 9") foram geradas usando técnicas similares. Para a ccnstrução de H6 quimérica, diferentes componentes foram ;_nplificados por PCR e clonados em plasmídeo pDZ usando un,e_ estratégia de clonagem previamente descrita (vide, por Eï-semplo, Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-82; e Hai et a- ., 2008, Journal of Virology 82:10580-90). Em resumo, diferentes componentes da hemaglutinina quimérica (cHA) foram amplificados por PCR com iniciadores contendo sítios Sap I sites, digeridos com Sap I, e clonados nos sítios Sap I de plasin deo pDZ. Para a geração do plasmídeo de báculo-transfe,ência, cH6 foi amplificada por PCR, cortada com BamHI e N, _, rl, e clonada em armação em um vetor de báculo-transferência pBacPAK8 modificado (Gentech) que aloja um foldon de fago T4 C- terminal e um tag 6-his (vide Meier et y`_., 2004, J Moi Biol 344:1051-69). As sequências de modos os foram confirmadas por seqüenciamento de Sanger.
6.4.1.2 RESGATE DE VÍRUS CH9 R;DMBINANTF A fim de resgatar o vírus de vacina recombinante, oito plasmídeos de genética reversa que codificam vRNA e mRNA dos sete segmentos virais tipo seluagqem de PR8 e a foram usados, conforme previamente descrito (Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-82; e Pleschka et a]., 1996, J Virol 70:4188-92). Em resumo, as células 293T focam transfectadas com 1 pg de cada um dos oito plasmídeos usando
Lipofectamina 2000 (Invitrocjen). Em 2 :-.oros pos- transfecção, o meio foi substituído por DP'hM contendo 0,3% de albumina sérica bovina, 10 mM de HEPES, o 1,5 pg de TPCK tripsina tratada com (1-1- tosilamida-2-feniletil clorometil 5 cetona)/mL. Em dois dias após a transfecção, o sobrenadante contendo vírus foi inoculado em ovos de gaLLnha embrionados com 10 dias de idade. O fluido alantáico fc- colhido após 2 dias de incubação a 37° C e ensaiado par_-. a presença de vírus pela hemaglutinação de hemácias de galinha. O vírus cH9 resgatado foi, então, propagado em oves com 10 dias de idade após uma incubação de 48 horas a 37 °c. os estoques de vírus foram titulados por ensaio de placas conforme previamente descrito (vide, por exemplo, Seel et al., 2009, Journal of Virology 83:1742-53). A sequê-_cia da cH9 foi confirmada pelo sequenciamento de produtos de POR por transcrição reversa.
6.4.1.3 GERAÇÃO DE BACULOV Rhh`O. RECOMBINANTE,
EXPRESSÃO DE PROTEÍNA E EXPRESSÃO A fim de gerar baculovírus recombinantes (rBV) carregando a cH6, plasmídeos e DNA Baculogold (BDBioschiences) foram co-traisfeçtados err células Sf9 com Celfectina II (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Os baculovírus recombinante foi amplificado em células Sf9 desenvolvidas em um meio TNM-FH (Gemini Bioproducts, West Sacramento, CA, EUA) e os títulos foram determinados por um ensaio de placas conforme previamente descrito (vide, por exemplo, Steel et al., 2009, Journal of Virology 83:1742-53), Células High Five (vide Krammer of: ai., 2010, Mol Biotechnol 45:226-34) desenvolvidas em um meio celular de inseto SEX HyClone (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) foram infectadas com rBV que expressa cH6 em uma multiplicidade de infecções (MOI) de 10 e uma densidade celular de 1 x 106 células/ml em frascos agitadores de 500 5 ml. As células foram colhidas 96 horas pós-infecção e separadas do sobrenadante por centrifu ação de baixa velocidade durante 10 minutos a 2000 x em temperatura ambiente. Para purificação da proteína cH6, o sobrenadante foi coletado e incubado com resina Ni-NTA Qiagen) durante 10 2 horas a 4°C. A pasta fluida foi carregada nas colunas e lavada três vezes com um tampão de la'7sgem (50 mM de Na2HCO3, 300 mM de NaCl, 20 mM de Imidszola, pH 8). A proteína foi eluída em etapas de 0,5 ml com um tampão de eluição (50 mM de Na2HCO3, 300 mM de IJaCI, 250 mM de 15 Imidazola, pH 8), testada para determina.cão do teor de proteína com reagente de Bradford e as frações contendo proteínas foram agrupadas. A pureza e a identidade da proteína foram testadas por SDS-PAGE, coloração Coomassie e • Western blot. A concentração de proteína foi determinada 20 com reagente de Bradford.
6.4.1.4 EXPERIMENTOS EM CAMUNDC.NCOS Para todos os procedimentos, os a_xmundongos foram anestesiados com injeções intraperitoneai-s de 0,1 mL de misturas de cetamina/xilazina (1,5 mg de cet amina e 0,3 mg 25 de xilazina).
Doses letais em 50% dos camundon-fos (LD 50) foram determinadas em camundongos BALB/c Charles River Laboratories) infectando-se grupos de qu..tro camundongos com diluições seriais de 10 vezes de vírus influenza. Os 30 pesos corporais foram monitorados durante um período de duas semanas. Considerou-se que os camundongos que perderam mais de 25% de seu peso corporal alcançaram o ponto final experimental e foram eutanasiados. Os valores LD50 foram calculados pelo método de Reed e Meunch (vide Reed and 5 Meunch. 1938, Am. J. Hyg. 27:493-497).
Para que os experimentos avaliem os anticorpos de tronco produzidos após uma infecção com vírus A/California/04/09 (Cal/09), camundongos BALB/c fêmeas com 8 a 10 semanas de idade foram primeiramente preparados com uma administração intramuscular de 80 ug de um plasmídeo de expressão que codifica uma HA de comprimento completo a partir do vírus PR8, acoplado à aplicação de um estímulo elétrico conforme previamente descrito (sistema de distribuição TriGrid, Ichor Medical Systems) (vide, por exemplo, Luxembourg et al., 2007, Expert Opinion on Biological Therapy 7:1647-64). Três semanas depois, os camúndongo`s foram estimulados com uma dose sub-letal de 104 de PFU Cal/09 em um volume de 50 pl, intranasalmente. Os animais de controle receberam somente DNA ou somente vírus Cal/09, ou uma injeção intramuscular da vacina 2009-2010 (vacina dividida Cal/09). Três semanas após o estímulo, ou o ponto de tempo equivalente para animais de controle, camundongos foram coletadas amostras de sangue e soro para testar a reatividade a cH6 por imunoflorescência conforme descrito abaixo.
Para experimentos que testam a eficácia de vírus cH9 como uma construção de vacina, o DNA de comprimento completo PR8 foi administrado conforme descrito anteriormente. Três semanas após a preparação, os camundongos foram inoculados com 103 de PFU de vírus cH9 instilado intranasalmente. Os animais de controle receberam somente DNA ou somente vírus Cal/09 ou vírus PR8 inativado purificado intramuscularmente. Três semanas após o estímulo, ou o ponto de tempo equivalente para animais de controle, 5 os camundongos foram desafiados com uma inoculação intranasal de 5 x 104 de LD50 de vírus PR8. Os camundongos foram pesados durante 14 dias após o desafio. Os animais que perderam mais de 27,5% de seu peso corporal inicial foram eutanasiados e classificados como mortos. 10 6.4.1.5 IMUNOFLORESCÉNCIA PARA CONFIRMAR A
EXPRESSÃO DE HEMAGLUTININA QUIMÉRICA As monocamadas confluentes de células 293T foram transfectadas com 1 }ig de plasmídeo cH6 pDZ. Em 48 horas após a transfecção, as células foram fixadas e bloqueadas 15 com 1% de albumina sérica bovina em PBS contendo 0,1% de Tween 20. As células foram, então, incubadas com soros agrupados dos animais de cada um dos quatro grupos experimentais descritos acima (DNA PR8 somente, Cal/09 somente, DNA PR8 e infecção de Cal/09, ou vacina dividida 20 Cal/09 somente). Após três lavagens com PBS contendo 0,1% de Tween 20, as células foram incubadas durante 1 hora com IgG anti-camundongo conjugado por Alexa Fluor 488 (Invitrogen). As células infectadas foram analisadas por microscopia de fluorescência com um microscópio Olympus 25 1X70.
6.4.1.6 ELISA Placas ELISA com 96 poços (Nunc, MaxiSorp) foram revestidas com 50 ml de cH6 expresso com baculovírus e incubadas de um dia para o outro a 4°C. As placas foram 30 bloqueadas com 3% de leite/PBS e, então, lavadas com
PBS/0,1% de Tween (PBST). O soro dos camundongos vacinados foi serialmente diluído em PBS e adicionado à placa, seguido por uma incubação de 1 hora a 37° C. As placas foram, então, lavadas com PBST e incubadas com uma diluição 1:2500 5 de IgG anti -camundongo ligado à peroxidase de rábano silvestre (GE Healthcare). Após uma lavagem adicional com PBST, o substrato SigmafastOPD (Sigma) foi adicionado. A reação foi interrompida com 3M de H2SO4 e medições de densidade óptica foram tomadas em 490 nm. 10 6.4.2 RESULTADOS
6.4.2.1 OS POLIPEPTÏDEOS DE HEMAGLUTININA DE
VÍRUS INFLUENZA QUIMÉRICO PODEM SER USADOS EM APLICAÇÕES
DIAGNÓSTICAS Uma construção de hemaglutinina quimérica que 15 compreende o domínio de cabeça globular a partir da hemaglutinina de um subtipo de vírus influenza H6 e domínio de tronco/caule a partir da hemaglutinina do vírus PR8 foi gerada para servir como uma ferramenta analítica para • ensaiar a produção de anticorpos pelos camundongos 20 imunizados contra o domínio de tronco H6. Devido ao fato de os camundongos imunizados terem sido expostos somente à cabeça globular de vírus Hl, os anticorpos que foram gerados nos animais experimentais seriam reativos somente a hemaglutinina H6 quimérica (cHE) se eles fossem dirigidos 25 em direção a seu tronco H1. Conforme mostrado nas Figuras 16A e 16D, o tratamento com DNA somente ou vacina dividida pandêmica não produziu anticorpos reativos de tronco nos camundongos vacinados. De modo oposto, a infecção com Cal/09 somente 30 gerou anticorpos reativos de tronco (Figura 16B), embora não até o ponto produzido por eletroporação de DNA e infecção (Figura 16C). Um anticorpo de tronco Hl reativo cruzado, C179, foi usado como um controle para a transfecção (Figura 16E). Conforme esperado, PY102, um 5 anticorpo dirigido contra a cabeça globular de PR8, não reage com a HA cH6 transfectada (Figura l6F).
Conforme mostrado na Figura 18, a utilidade do polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza quimérico cH6 como uma ferramenta na qual se detecta a ligação de 10 anticorpo de tronco foi confirmada por ELISA.
6.4.2.2 POLIPEPTÍDEOS DE HEMAGLUTININA DE VÍRUS
INFLUENZA QUIMÉRICO PODEM SER USADOS EM VACINAS Conforme mostrado na Figura 17, os animais que foram vacinados com vírus PR8 inativados foram protegidos 15 contra o desafio letal, enquanto os animais que receberam DNA somente sucumbiram completamente à infecção até o dia 5 após o desafio. Os animais que receberam vírus cH9 somente também não foram protegidos contra infecção, com uma taxa de sobrevivência de somente 25%. Em contrapartida, os 20 animais que foram primeiramente preparados com DNA e, então, estimulados com vírus cH9 foram protegidos contra o desafio, com uma taxa de sobrevivência que foi estatisticamente igual à dos animais vacinados com a preparação de vírus inativado. 25 6.5 EXEMPLO 5: A GLICOSILAÇÃO NO DOMÍNIO DE
CABEÇA GLOBULAR DE UM POLIPEPTÍDEO DE HEMAGLUTININA DE VÍRUS INFLUENZA MODULA AS PROPRIEDADES VIRULENTAS E
ANTIGÊNICAS DOS VÍRUS INFLUENZA Este exemplo demonstra os efeitos da glicosilação 30 do domínio de cabeça globular de um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza sobre a reatividade cruzada virulenta e antigênica de vírus influenza.
6.5.1 MATERIAIS E MÉTODOS
6.5.1.1 SEQUÊNCIAS DE VÍRUS HA H1N1 E 5 ALINHAMENTO As sequências de HA a partir de todos os vírus humanos H1N1 disponíveis através do Influenza Research Database (www.fludb.org) foram transferidas por download e alinhadas utilizando-se ClustalW e editadas manualmente com 10 o software BioEdit Sequence Alignment Editor. As sequências HAl contendo padrões de glicosilação representativos com base em pelo menos dois isolados originais por ano foram selecionadas para análise adicional. Os números de acessão GenBank das HAS descritas e na Figura 22A são: AF117241.1, 15 CY034132, AF389118, CY009324, CY020445, CY013271, CY020285, CY021709, CY009612, 0Y019947, CY019971, CY009332, CY021821, CY009340, CY021053, DQ508897, C1011296, CY021909, CY020181, CY021029, CY01.0364, 0Y020437, CY021725, DQ508873, CY019779, CY033655, CY012872, CY017011, DQ415317, EU103824, CY025026, 20 CY010332, CY006675, CY019883, CY007467, CY016675, CY027875, CY058487.1, CY040114, FJ984355, GQ150342, GQ149654, GQ117044, FJ966974, CY039527.2. Os sítios de glicosilação foram previstos pelo motivo N-X-S/T.
6.5.1.2 LINHAGENS CELULARES E VÍRUS 25 As células renais embriônicas humanas (293T) foram mantidas em DMEM suplementado com 10% de FBS e 1000 U/ml de penicilina/estreptomicina. As células renais caninas Madin-Darby (MDCK) foram mantidas em MEN suplementado com 10% de FBS e penicilina/estreptomicina. Os 30 reagentes para cultura celular foram adquiridos junto a
Gibco Life Technologies. As cepas de vírus A/Texas/36/1991 H1N1 (Texas/91), A/Brisbane/59/2007 H1N1 (Bris/59) e A/Brisbane/10/2007 H3N2 (Bris/10) foram desenvolvidas em ovos embrionados com 10 dias de idade. Os isolados A/California/04/2009 (Cal/09) e A/Netherlands/602/2009 (Neth/09) e todos os estoques de vírus recombinantes foram desenvolvidos em células MDCK.
6.5.1.3 GERAÇÃO DE VÍRUS RECOMBINANTES
6.5.1.3.1 PLASMÍDEOS DE RESGATE DE ISOLADO A/NETHERLANDS/602/2009 A análise de sequência mostrou que os segmentos que codificam as proteínas PB2, PB1, M e NS foram idênticas entre os isolados A/California/04/2009 e A/Netherlands/602/2009. Portanto, os plasmídeos pDZ-PB1, - PB2, -M e -NS de cepa A/California/04/2009 descritas previamente (Hai et al., 2010, Journal of Virology 84: 4442-4450; Quinlivan at al., 2005, Journal of Virology 79, 8431-8439) foram usados. Os segmentos restantes foram clonados isolando-se RNA viral dos sobrenadantes obtidos a partir de células MDCK infectadas com o isolado de vírus A/Netherlands/602/2009 usando o mini kit de RNA viral QIAamp (Qiagen, Hilden, Alemanha) e foram usados iniciadores segmento-específicos contendo os sítios de restrição SapI ao clone NP, HA e NA no plasmídeo pPoll conforme previamente descrito (Quinlivan et a1., 2005, Journal of Virology 79, 8431-8439). Para PA, realizou-se uma mutagênese sítio-dirigida usando o plasmídeo A/California/04/2009 pPoll-PA como modelo e 3 nt mutado para obter o gene WT Neth/09 PA. A seguir, os segmentos PA e NP foram sub-clonados a partir do vetor pPolI no vetor bidirecional pDZ usando sítios de restrição Sapl. As construções que codificam os mutantes de glicosilação foram geradas por mutagênese sítio-dirigida do WT Neth/09 pPol-HA usando o Kit de Mutagênese Sítio-Dirigida Quick Change 5 (Stratagene, La Jolla, CA, EUA). As alterações de aminoácido feitas em cada caso para adicionar sítios de glicosilação foram as seguintes: K71N e N73S para o sítio 71, D144T para o sítio 142, D144N e N146T para o sítio 144, 01725 para o sítio 172, e K177N para o sítio 177. 10 6.5.1.3.2 RESGATE DE WT A/NETHERLANDS/602/2009 E
RESPECTIVOS VÍRUS MUTANTES DE GLICOSILAÇÁO Os vírus influenza A recombinantes baseados em Neth/09 foram gerados transfectando-se as células 293T com 0,5 tg de cada um dos dez plasmídeos utilizando-se 15 Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A mistura de plasmídeo continha os seis vetores pDZ que codificam os genes PB2, PB1, PA, NP, M e NS e dois vetores pPolI que codificam os genes HA e NA. Os plasmídeos de expressão 20 A/WSN/33 pCAGGS-HA e pCAGGS-NA foram incluídos para aumentar a eficiência de resgate. Em 16 a 20 horas pós- transfecção, as células MDCK foram adicionadas nas células 293T e o meio foi alterado para DMEM com penicilina/estreptomicina, 0,3% de albumina bovina e lug/ml 25 de tripsina tratada com TPCK (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). Os sobrenadantes foram colhidos 24 a 36 horas após a adição das células MDCK. Os vírus resgatados foram purificados por placas e desenvolvidos novamente nas células MDCK durante 48 horas para produzir os estoques de 30 passagem 1, que foram usados para todos os experimentos mostrados. Os títulos de estoques de vírus foram determinados em trincas por ensaio de placas em células MDCK. As sequências corretas de cada vírus recombinante foram confirmadas seqüenciando-se todo o genoma. 5 6.5.1.3.3 GERAÇÃO E RESGATE DE VÍRUS DE SUPRESSÃO DE GLICOSILAÇÃO HÁ A/PR8/34 7:1 TX/91 Realizou-se PCR de fusão para gerar plasmídeos pDZ-HA contendo mutantes de glicosilação do Tx/91 HA para suprimir 1, 2 ou 3 sítios de glicosilação localizados na 10 cabeça globular deste HA H1N1 sazonal contemporâneo. As alterações de aminoácido a seguir foram feitas para suprimir cada sítio de glicosilação para corresponder aos resíduos encontrados no isolado Neth/09: N71K e S73N para suprimir o sítio 71, T144D para suprimir o sítio 142, e 15 N177K para suprimir o sítio 177. Os 7 genes restantes de A/PR8/34 (PR/34) foram clonados no plasmideo pDZ para resgatar HA PR/34 7:1 TX/91 tipo selvagem e vírus recombinantes mutantes conforme descrito anteriormente.
6.5.1.4 FENÓTIPO DE PLACA E ANÁLISE DE 20 CRESCIMENTO DE VÍRUS IN VITRO 0 fenótipo de tamanho de placa foi avaliado realizando-se um ensaio de placas após infectar as células MDCK com -100 pfu de cada vírus recombinante conforme mostrado. Em 48 horas p.i, as células foram fixadas com 4% 25 de formaldeído e as placas foram visualizadas por imunocoloração com o anticorpo monoclonal de camundongo, E10, que reconhece o peptídeo amino-terminal que é comum às proteínas M1 e M2. As curvas de crescimento foram realizadas em diferentes células epiteliais 30 traqueobronquiais humanas primárias diferenciadas (HTBE)
(Lonza, MD, EUA). Aproximadamente 1X105 células HTBE foram semeadas em inserções de transwell com membrana permeável de 12 mm revestidos com colágeno (0,4 im) em uma placa de 12 poços (Corning, MA, EUA). As células foram desenvolvidas
5 submersas em um Meio de Crescimento de Células Epiteliais Bronquiais BEGM (Lonza, MD, EUA) durante 4 dias até que uma confluência fosses alcançada e, então, uma diferenciação foi estabelecida removendo-se os meios da superfície apical e, ainda, culturando-se as células durante 4 semanas nesta interface de ar-líquido.
Durante este tempo, os meios no lado basolateral foram substituídos a cada 2 dias.
Antes da infecção por vírus, as monocamadas celulares foram lavadas vigorosamente com PBS para remover o muco acumulado no lado apical das células.
Os poços triplicados foram inoculados com cada vírus mostrado em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0,001 pfu/célula. 0 vírus foi coletado nos pontos de tempo indicados adicionando-se 100 pl de PBS a cada poço durante 30 minutos a 37°C.
Os títulos virais foram realizados por ensaios de placa comuns usando células MDCK. 20 6.5.1.5 ENSAIOS WESTERN BLOT
As células MDCK infectadas em um MOI de 5 durante 12 horas com os vírus indicados foram usadas em um tampão de lise NP-40 (50 nM de Tris, 150 nM de NaCl, 5 mM de EDTA, 30 mM de NaF, 40 mM de (3-glicerofosfato, 10 % de glicerol e 0,25% de NP-40) contendo um inibidor de protease Complete Mini (Roche, IN, EUA). Os lisatos clarificados foram fervidos durante 5 minutos e as proteínas foram separadas em um gel de gradiente Bis-Tris com 4 a 12% de NuPAGE (Invitrogen, CA, EUA) sob condições não-redutoras para o WT e vírus Neth/09 mutantes, ou sob condições redutoras para o
Tx/91 WT e os respectivos vírus mutantes de supressão de glicosilação. Western blots foram realizados para detectar as proteínas transferidas a membranas PVDF, por incubação com anticorpo policlonal de coelho 3951 elevado contra um 5 vírus PRO desprovido de Hl, que foi removido por ácido e tratamento DTT (Steel et a1., 2010, maio 1).
6.5.1.6 EXPERIMENTOS COM CAMUNDONGOS
6.6.1.6.1 INFECÇÕES, PERDA DE PESO CORPORAL E
SOBREVIVFNCIA 10 Todos os experimentos com camundongos foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais do Comitê de Ética no Uso e Cuidados de Animais (IACUC), e foram aprovados pelo IACUC da Faculdade de Medicina Mount Sinai. Camundongos C57BL/6 fêmeas com 7 a 9 semanas de 15 idade (Jackson Laboratories, ME, EUA) foram anestesiados por injeção intraperitoneal de cetamina-xilaxina e foram infectados intranasalmente com o vírus indicado em doses de 1X102, 1X103, 1X104, 1X105, 1X106 pfu do vírus diluído em 50 sul de PBS. O peso corporal e a sobrevivência foram 20 monitorados diariamente durante 14 dias. Considerou-se que os camundongos que mostraram uma perda de peso corporal maior que 25% alcançaram o ponto final e foram humanamente eutarnaslados.
6.5.1.6.2 TÍTULOS VIRAIS PULMONARES 25 Os pulmões dos camundongos infectados foram excisados assepticamente nos dias indicados pós-infecção e foram armazenados a -80°C até um processamento adicional.
Para títulos, os tecidos foram homogeneizados em 1 ml de PBS usando um homogeneizador mecânico (MP Biochemicals, OH, 30 EUA). Os títulos virais nos homogenados de sobrenadante clarificado foram quantificados por ensaios de placa padrão nas células MDCK.
6.5.1.6.3 DESAFIO NETH/09 Camundongos com 8 semanas de idade foram 5 infectados com os vírus rTx/91 indicados. Permitiu-se que os camundongos se seroconvertessem durante 27 dias, sendo que neste período tempo eles foram desafiados com 100 vezes a dose letal a 50% (LD50á) de A/Netherlands/602/2009. A sobrevivência e a perda de peso corporal foram monitorados 10 durante 13 dias p.i.
6.5.1.7 EXPERIMENTOS EM FURÕES A pesquisa em animais foi conduzida Animal sob as diretrizes do Comitê Institucional de Ética no Uso e Cuidados de Animais dos Centros de Controle e Prevenção de 15 Doenças em uma instalação para animais credenciada pelo Credenciamento Internacional de Cuidados de Animais Laboratoriais.
6.5.1.7.1 INFECÇÕES, PERDA DE PESO CORPORAL E
TÍTULOS DE LAVAGEM NASAL 20 Furões Fitch machos com 8 a 12 meses de idade (Triple F Farms, PA, EUA) que eram serologicamente negativos por inibição de hemaglutinação para os vírus H3N2 sazonal atualmente em circulação, vírus H1N1 sazonal previamente em circulação e vírus influenza A H1N1 2009 25 pandêmico, foram usados para avaliar a virulência dos vírus indicados. Três furões por grupo foram anestesiados com uma injeção intramuscular de um coquetel de cloridrato de cetamina (24 mg/kg)-xilazina (2 mg/kg)-atropina (0,05 mg/kg) e foram infectados intranasalmente com vírus mutante de 30 glicosilação HA WT Neth/09 ou HA 144-172 em 106 pfu em um volume final de 500 pl de PBS. Os pesos corporais foram medidos diariamente durante 12 dias e são representados como um peso percentual comparado ao peso inicial. As cavidades nasais dos furões foram lavadas com 1 ml de PBS 5 em dias alternados a partir dos dias 1 a 7. Os títulos virais nas lavagens nasais foram determinados por ensaios de placa padrão em n células MDCK.
6.5.1.7.2 TÍTULOS VIRAIS DE TECIDOS Três furões por grupo indicado foram infectados l0 com 106 pfu de cada vírus conforme descrito anteriormente.
No dia 3 p.i. os furões foram eutanasiados e os pulmões, a traqueia, os turbinados nasais e o bulbo olfativo foram assepticamente coletados. Os espécimes de tecido foram imediatamente congelados em gelo seco e armazenados a -70°C até que foram processados. Os espécimes de tecido congelados foram descongelados, pesado, e, em seguida, homogeneizados em PBS frio usando moedores de tecido estéreis descartáveis (Kendall, MA, EUA). Os homogenatos de tecido foram clarificados e os títulos virais nos sobrenadantes claros foram determinados por ensaios de placa padrão nas células MDCK.
6.5.1.8 ESPÉCIMES HUMANOS Os estudos que envolvem o uso de espécimes de soros humanos foram revisados e aprovados pelo Conselho de Revisão Institucional tanto da Faculdade de Medicina da Universidade de Saint Louis como da Faculdade de Medicina Mount Sinai. Amostras de soros pré- e pós-vacinação obtidas de +'indivíduos que tinha 18 anos de idade ou mais velhos (adultos) e de indivíduos com 1 a 17 de idade (pediátricos), que foram arrolados em testes clínicos foram usados para testar a segurança e a imunogenicidade de uma cepa de vacina de influenza A H1N1 2009 inativada realizada no Instituto Nacional de Unidade de Avaliação de Vacina e Tratamento para Alergias e Doenças Infecciosas na 5 Universidade de Saint Louis. Os experimentos conduzidos para avaliar a reatividade desses soros humanos contra H3N2 sazonal, H1N1, H1N1 2009 e as HAs mutantes de glicosilação foram realizados incógnitos.
6.5.1.9 ENSAIO DE INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO 10 (HAI) DE SOROS DE CAMUNDONGOS E HUMANOS Os soros de camundongos foram obtidos a partir de animais infectados com os vírus indicados no dia 28 p.i. Os experimentos realizados com soros de camundongos foram realizados com soros agrupados de 3 animais infectados por vírus que foram selecionados por conterem pelo menos 160 HI unidades contra o virus homólogo. Os ensaios HAI foram conduzidos essencialmente conforme descrito previamente (Manicassainy et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1000745; Medina et al., 2010, Nat Commun 1, doi: 10,1038). Em resumo, o tratamento com tripsina-calor-periodato foi usado para inativar os soros de camundongos, furões e humanos misturando-se metade de um volume de tripsina 8 mg/ml (Sigma-Aldrich) em 0,1 M de tampão de fosfato, pH 8,2, com um volume de soros e as amostras foram incubadas durante 30 minutos a 56°C. As amostras foram resfriadas até a temperatura ambiente, misturadas com três volumes de 0,11 M de periodato de metapotássio e adicionalmente incubadas em temperatura ambiente durante 15 minutos. As amostras foram, então, misturadas com três volumes de 1 de uma solução salina de glicerol e incubadas durante 15 minutos em temperatura ambiente. As amostras foram finalmente misturadas e incubadas com 2,5 volumes de 85 de uma solução salina para diluir as amostras a uma concentração de 1:10. Os ensaios HAI de soros foram realizados seguindo 5 os protocolos padrão (Yu et a1., 2008, Nature 455, 532-536).
Em resumo, diluições seriais dobradas de soros de camundongos e humanos foram misturadas e pré-incubadas em placas de 96 poços com 8 unidades de HA de vírus por poço durante 30 minutos a 4°C. Hemácias de peru (para Bris/10 e 10 Neth/09) ou galinha (para Bris/59) foram adicionadas em uma concentração final de 0,25 %, e a placa foi incubada a 4 °C durante 30 minutos. Os títulos HAT foram determinados como a diluição mais alta que exibiu uma atividade de hemaglutinação. 15 6.5.1.10 ANÁLISE ESTATÍSTICA Para estudos com camundongos, as diferenças de significância estatística (P < 0,05) na perda de peso corporal foram avaliadas usando um teste t de Student não- pareado bi-caudal, e para estabelecer as diferenças 20 estatísticas para curvas de sobrevivência, utilizou-se o teste de Log-Rank. Para os experimentos com furões, a significância estatística (P < 0,05) da perda de peso corporal com o passar do tempo foi realizada pela análise da área sob a curva (AUC) , interpretada como a perda de 25 peso corporal do grupo animal (n=3) como uma função de tempo, usando o teste de pares correspondidos de Wilcoxon.
6.5.2 INTRODUÇÃO As infecções de vírus influenza A permanecem sendo uma questão principal causadora de um grande fardo à 30 saúde pública (Molinari et a1., 2007, Vaccine 25, 5086-
5096). 0 surgimento do vírus H1N1 pandêmico de 2009 (pH1N1) forneceu a primeira evidência direta que os subtipos previamente em circulação, dado tempo suficiente, podem causar uma nova pandemia devido a grande proporção da população humana sendo virgem à hemaglutinina (HA) desta nova cepa (Medina & Garcia-Sastre, 2011, Nature Reviews 9, 590-603). Portanto, o nível e a qualidade dos anticorpos HA protetores cruzados representam um papel importante na determinação do potencial pandêmico de uma nova cepa de vírus influenza A.
Previamente, demonstrou-se que a HA da cepa pH1N1 de 2009 compartilha similaridades antigênicas à HA de vírus H1N1 humanos que circularam antes de 1950, incluindo uma grande homologia ao vírus de 1918 (Kash et al., 2010, Influenza and other respiratory viruses 4, 121-127; Manicassamy et a1., 2010, PLOS Pathog 6, e1000745; Skountzou et al., 2010), especificamente ao redor do sítio antigênico Se (Krause et al., 2010, J Virol 84, 3127-3130; Manicassamy et a1., 2010, PLoS Pathog 6, e1000745; Xu at a1., 2010). Em contrapartida, a vacinação (Mancassamy et a1., 2010, PLoS Pathog 6, e1000745) ou infecção (Kash et a1., 2010, Influenza and other respiratory viruses 4, 121- 127) com cepas HINT sazonais contemporâneas induziram pouca ou nenhuma reatividade cruzada ao vírus pH1N1 de 2009, que se correlaciona com uma diferença maior no nível de aminoácido visto em ou próximo aos sítios antigênicos conhecidos que estão localizados na cabeça globular da HA (Manicassamy et al., 2010, PLoS Pathog 6, e1000745).
Mostrou-se que os vírus influenza H1N1 e H3N2 sazonais anteriores em circulação em seres humanos se submetem à deriva antigênica (um acúmulo gradual de alterações de aminoácido em ou ao redor dos sítios antigênicos HA com o passar do tempo) devido à pressão de seleção imune. Algumas dessas alterações residuais resultam 5 na aquisição de sítios de glicosilação na HA, algumas dessas são mantidas, enquanto outras são substituídas ou desaparecem com o passar do tempo, sugerindo que a glicosilação de HA representa um papel evolucional importante em vírus influenza A de seres humanos (Das et 10 ai., 2010, PLoS Pathog 6, e1001211; Igarashi et ai., 2008, Virology 376, 323-329; Sun at al., 2011, P1oS one 6, e22844). Estudos recentes mostraram que a glicosilação de HA afeta as propriedades de ligação antigênicas e receptoras desta proteína viral (Wang et a1., 2009, Proc 15 Nall Acad Sci U S A 106, 18137-18142), bem como a virulência de vírus influenza (Tate et a1., 2011a, J Immunol 187, 1884-1894; Tate at a1., 2011b, Virology 413, 84-92). De interesse, uma série de sítios de glicosilação na cabeça globular da HA foram temporariamente adquiridos 20 de 1918 a 2009 pelos vírus H1N1 sazonais e a maioria desses estão localizados dentro ou próximo ao sítio antigênico Sa (Das at ai., 2010, (Das et ai., 2010, PLoS Pathog 6, e1001211; Igarashi et a]., 2008, Virology 376, 323-329; Sun et a1., 2011, PIOS one 6, e22844). Em contrapartida, o 25 vírus pHIN1 de 2009 é desprovido dessas glicosilações adicionais e compartilha o mesmo status de glicosilação que o vírus pandêmico H1N1 de 1918.
0 papel específico que cada um dos sítios de glicosilação H1 tem nas propriedades virulentas e 30 antigênicas do pHlN1 de 2009 não foi atribuído.
A cepa pH1N1 de 2009 foi espalhada globalmente desde sua epidemia original na América do Norte, e agora está circulando sazonalmente nos hemisférios norte e sul, substituindo os vírus H1N1 prévios. Então, é provável que o 5 vírus pH1N1 comece a submeter uma deriva antigênica conduzida pela pressão de seleção imune. A aquisição de glicosilações pode contribuir para o surgimento de variantes de deriva de H1N1. Neste exemplo, os efeitos específicos da aquisição de glicosilações na cabeça 10 globular da HA H1N1 nas propriedades virulentas e antigênicas de vírus H1N1 foram investigados. Os resultados indicam que a glicosilação HA representa um papel crucial tanto na patogênese como no escape de imunidade preexistente, bem como na indução de respostas de anticorpo 15 policlonal reativo cruzado.
6.5.3 RESULTADOS
6.5.3.1 VÍRUS HUMANOS H1N1 ADQUIRIDOS EM SÍTIOS
DE GLICOSILAÇÃO NA CABEÇA GLOBULAR DA PROTEÍNA HA COM O
PASSAR DO TEMPO 20 Uma análise geral da sequência de aminoácido dos vírus pandêmicos H1N1 de 1918 e 2009 revelou que a HAl desses vírus é glicosilada nos mesmos sítios. Para compreender melhor as diferenças que podem ser responsáveis pelas propriedades antigênicas distintas da proteína HA 25 H1N1 de 2009 comparada às cepas de vírus H1N1 sazonal em circulação logo antes da pandemia, deu-se atenção particular às sequências de aminoácidos ao redor dos sítios antigênicos conhecidos. Os alinhamentos de sequência revelaram que desde a introdução em 1918 dos vírus H1N1 em 30 seres humanos, uma série de sítios de glicosilação conforme predito pelo motivo N-X-S/T, foi adquirida na cabeça globular HA com o passar do tempo (Figuras 22A e 22B) . De interesse, esses sítios de glicosilação apareceram predominantemente próximos ou dentro do sítio antigênico Sa 5 (Figura 22A). Embora não existam sequências disponíveis de vírus influenza humanos entre 1918 e 1933, e com a condição que a maioria das sequências dos vírus H1N1 anteriores é proveniente de cepas que foram passadas extensivamente em ovos, parece que durante os anos entre 1935 e 1957, três glicosilações HA diferentes foram adquiridas sequencialmente (nos resíduos de aminoácido 144, 172 e 177 [numeração H3 130, 158 e 163, respectivamente]) e foram consistentemente encontrados em isolados humanos. surgimento do vírus influenza pandêmico H2N2 em 1957 desalojou os vírus H1N1, que desapareceram da circulação humana.
A cepa de vírus H1N1 ressurgiu em seres humanos em 1977 e continha os mesmos sítios de glicosilação que os vírus H1N1 em circulação nos anos 1950. Em 1986, o sitio de glicosilação 144 foi substituído por uma glicosilação na posição 142 (numeração H3: 128; esses sítios de glicosilação são incompatíveis), e uma glicosilação adicional no sítio 71 (numeração F-i3: 59) foi adquirida quase simultaneamente.
No entanto, em 1987, o sítio de glicosilação 172 foi perdido, e desde então os vírus H1N1 contemporâneos, incluindo os vírus sazonais em circulação logo antes do surgimento de pH1N1 de 2009, continham os sítios de glicosilação 71, 142 e 177 na cabeça globular de HA (Figuras 22B e 22C). Visto que o status de glicosilação do pH1N1 de 2009 é igual àquele do vírus pandêmico H1N1 de 1918, o vírus pH1Nl de 2009 pode adquirir glicosilações iguais ou similares com o passar do tempo como resultado da pressão de seleção imune (Wei et ai., 2010, Sci Transi Med 2, 24ra21). O efeito específico de glicosilações adicionais sobre as propriedades virulentas e antigênicas do vírus 5 pH1N1 de 2009 foi, então, avaliado.
6.5.3.2 GLICOSILAÇÕES ADICIONAIS NA CABEÇA GLOBULAR DO HA ATENUAM O VÍRUS PH1N1 IN VIVO, MAS NÃO IN Os vírus recombinantes pH1Nl de 2009 (cepa Neth/09) foram gerados, diferindo somente pela adição sequencial de glicosilações HA para imitar a aparência temporal desses sítios nos HINls sazonais. Apensar de várias tentativas, o resgate de um vírus contendo os sítios de glicosilaçáo HA 144, 172 e 177 nos antecedentes Neth/09 não foi possível, sugerindo que a combinação dessas glicosilações específicas pode requerer mutações compensatórias adicionais. Todavia, todos os outros vírus mutantes foram resgatados com sucesso. Uma análise fenotipica in vitro desses vírus recombinantes mostrou que somente o vírus contendo 4 glicosilações adicionais (Neth/09 HA 71-142-172-177) tinha um fenótipo de placa menor em MDKCs (Figura 23A.). A adição de sítios de glicosilação HA resultou em uma mobilidade mais lenta da HA em SDS-PAGE, de acordo corn o uso desses sítios (Figura 23B).
Realizaram-se cinéticas de crescimento para avaliar os efeitos de glicosilações na capacidade do vírus de se replicar em células epiteliais traqueobronquiais humanas diferenciadas primárias (HTBE). Todos os vírus se replicaram em altos níveis (>10v pfu/ml), similares àqueles do vírus isolado WT Neth/09 original (Figura 23C),
indicando que essas glicosilações adicionais não afetam a infecção de células humanas. 0 potencial patogênico dos vírus glicosilados recombinantes foi avaliado em camundongos C57BL/6. A partir deste exemplo, constatou-se 5 uma atenuação dependente de glicosilação na virulência dos vírus em camundongos (isto é, quanto mais sítios de glicosilação na HA, menos patogênicos), conforme avaliado pela perda de peso corporal (Figuras 24A-24E). Somente o sítio de glicosilação contendo vírus 144 mostrou padrões de 10 perda de peso similares àqueles vistos em camundongos infectados com vírus WT Neth/09 (Figura 24B). Todos os vírus com dois ou more sítios de glicosilação adicionais foram rigorosamente atenuados (Figuras 24C-24E). A morbidez foi correlacionada a títulos virais pulmonares em 15 camundongos durante os 7 dias iniciais de infecção.
Os animais infectados com 144-172, 71-142-177 e 71-142-172-177 apresentaram títulos significativamente menores comparados a WT Neth/09. Para determinar se este também é o caso em um modelo animal diferente, avaliou-se a virulência do vírus 20 glicosilado 144-172 comparada ao virus WT em furões, que é amplamente aceito como um dos melhores modelos animais para estudar patogênese de vírus influenza.
Houve uma redução estatisticamente significante na perda de peso total observada nos animais infectados com o vírus 144-172 25 (Figura 240). De modo interessante, os títulos de lavagem nasal obtidos a partir de ambos os grupos ao longo do dia 7, e os títulos dos turbinados nasais no dia 3 não mostraram diferenças (Figuras 24H e 241). No entanto, a traqueia e os pulmões dos furões no dia 3 apresentaram uma infecção 30 reduzida no vírus 144-172 comparado ao WT Neth/09 (Figura
24I). Isto sugere que embora os vírus H1N1 glicosilados possam se replicar em níveis similares no trato respiratório superior (no nariz) , estes não menos aptos a infectarem e se replicarem no trato respiratório inferior 5 (traqueia e pulmões).
6.5.3.3 0 SITIO DE GLICosTT,AcÃn OP ua 1 P\7anP
A RESPOSTA DE ANTICORPO POLICLONAL CONTRA WT HA ENQUANTO
INDUZ UMA RESPOSTA POLICLONAL MAIS AMPLA EM CAMUNDONGOS Para se obter uma visão dos efeitos de glicosilação sobre as propriedades antigênicas dos vírus H1N1, testou-se a atividade de HAT de soros obtidos a partir de camundongos infectados com cada um dos vírus mutantes de glicosilação uns em relação aos outros (Tabela 9, infra). A infecção de camundongos com vírus rWT ou vírus glicosilados 71-142-177 ou 71-142-172-177 resultou em pouco ou nenhum HAI de soros detectável aos vírus glicosilados 144 e 144-172, embora um determinado nível de reatividade cruzada permaneça contra os outros vírus. De modo surpreendente, a infecção com vírus contendo as glicosilações 144 ou 144-172 produziu respostas de anticorpo capazes de reagir de modo cruzado com todos os vírus mutantes de glicosilação HA e com o vírus WT Neth/09. Tomando-se todos juntos, isto indica que a maioria da atividade HAI policlonal induzida pelos vírus, com a exceção dessas contendo o sítio de glicosilação 144, é dirigida contra um sítio, provavelmente Sa, eficientemente mascarado pela glicosilação 144. Em contrapartida, a glicosilação na posição 144 altera o padrão de indução das respostas de anticorpo policlonal, que aparece como sendo contra as múltiplas regiões antigênicas na HA e não é mascarada por um único evento de glicosilação ou por múltiplos eventos de glicosilação. Em contrapartida, a infecção com vírus contendo glicosilações nas posições 71- 142-177 ou 71-142-172-177 induziu um padrão de reatividade 5 cruzada mais estreito, sugerindo que a resposta humoral policlonal é ligeiramente alterada, mas permanece concentrada, possivelmente, ao redor do sítio Sa. TABELA 9. Títulos de HAI de soros de camundongos após a infecção com mutantes de glicosilações pH1N1 de 2009 Soros 71-142- 71-142- Espécie Infecção rWT 144 144-172 177 172-177 rWT HA 320 10 20 80 160 144 HA 323 160 83 160 160 • Camun- 144-172 HA 160 83 160 160 320 dongo 71-142-177 HA 40 <13 <10 160 16) 71-142-172- 177 HA 20 <10 90 160 160 10 a Os camundongos foram infectados com o vírus recombinante Neth/99 contendo o segmento HA indicado. b Os títulos HAI representam a maior diluição que exibiu uma atividade inibitória de hemaglutinação.
C Os títulos homólogos estão em negrito. 15 6.5.3.4 0 SÍTIO DE GLICOSILAÇÃO DE HA 144 EVADE A RESPOSTA DE ANTICORPO POLICLONAL CONTRA A VACINA INATIVADA DE PH1N1 EM SERES HUMANOS A capacidade da vacina inativada de pH1N1 de 2009 em produzir respostas de anticorpo em seres humanos com uma 20 atividade inibitória contra vírus H1N1 de 2009 portando Has glicosilado foi testada a seguir.
Constatou-se que a maioria dos indivíduos adultos que recebeu a vacina monovalente pH1N1 de 2009 apresentou respostas de anticorpos detectáveis a todos os vírus mutantes de 5 glicosilação (Tabela 10, infra). Todavia, a menor reatividade cruzada foi observada com vírus contendo os sítios de glicosilação 144 (e 144-172), com um dos indivíduos mostrando níveis de atividade de HAI indetectáveis quando testado contra esses dois vírus.
Isto está em estrito entendimento com os resultados de sorologia de camundongos, enfatizando os efeitos de mascaramento da glicosilação no sítio 144. Conforme esperado, a vacina sazonal trivalente de 2009 contendo um vírus H1N1 sazonal previamente em circulação, não induziu títulos de HAI significativos contra vírus pH1N1, independentemente de seu nível de glicosilação (Tabela 10, infra). Visto que o nível de exposição prévia ao vírus influenza em seres humanos poderia impactar suas respostas de anticorpo policlonal, também realizou-se uma avaliação dos títulos de HAI de soros em uma população mais virgem (crianças <18 anos de idade) que foi imunizada com a vacina inativada pHlNl de
2009 monovalente.
A atividade de soros desses indivíduos apresentou um padrão de reatividade cruzada similar àqueles de adultos, mostrando uma atividade de HAI menor contra os vírus mutantes de glicosilação 144 e 144-172 (Tabela 11, infra). Em contrapartida, alguns soros pediátricos e adultos mostraram uma atividade considerável contra os vírus glicosilados 71-142-177 e 71-142-172-177 (Tabelas 10 e 11, infra).
TABELA. 10. Títulos de HAI de soros de seres humanos adultos após a vacinação com a vacina inativada pH1N1 de 2009.
Vïrusa Vacina ida Soros 144- 71-142- 71-142- Bris/ Bris/ 2009 2009 rWT 144 de 172 177 172-177 59 10 H1N1 TIVd Pré 20 <10 <10 20 -0 <10 <1I 1 19" Sim Sim Pós 160 40 20 160 160 80 320 Pré 10 10 <10 20 20 80 80 2 21h Sim Sim Pós 640 320 160 1280 1280 80 160 Pré <10 <10 <10 <10 <10 20 10 3 33b Sim Não Pós 80 20 40 20 80 20 20 Pré <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 4 34 b Sim Sim Pós 2560 1280 1280 80 640 20 10 Pré 10 10 10 20 10 <10 40 34 D Sim Sim Pós 160 <10 <10 320 640 160 1280 Pré 20 10 10 20 20 10 20 6 42b Sim Sim Pós 640 320 160 320 640 20 40 Pré 10 10 10 <10 10 10 80 7 432 Sim Sim Pós 640 320 160 640 640 20 40
Pré <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 8 49b Sim Sim Pós 40 20 20 40 160 10 20
Pré <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 9 55h Sim Sim Pós 640 320 640 320 640 80 <10
Pré 20 10 20 20 20 <10 <10 Sim Sim 10 60c Pós 1280 320 320 320 160 <10 10
Pré 10 <10 <10 20 10 20 40 Sim Sim 11 67c Pós 1280 640 320 640 320 40 80
Pré 20 <10 20 20 20 10 40 Sim Sim 12 6.7C Pós 640 40 320 640 2560 10 320
Pré 40 40 40 40 40 10 40 Sim Sim 13 82c Pós 2560 2560 160 1280 160 20 160
Pré <10 <10 <10 <10 <10 40 <10 14 51' - Não Sim Pós <10 <10 <10 <10 <10 20 40
Pré <10 <10 <10 <10 <10 <10 20 15 74 Não Sir.
Pós 10 <10 10 <10 10 320 80
As caixas em negrito indicam o menor título de reatividade cruzada para cada indivíduo. b Amostras de soro humano obtidas nos dias 0 (Pré) e 21 (Pós) após a vacinação, respectivamente. 5 c Amostras de soro humano obtidas nos dias 0 (Pré) e 63 (Pós) após a vacinação, respectivamente.
555 / 6 48 à 2009 TIV: vacina de vírus influenza inativado trivalente que incluía as cepas A/Brisbane/57/2007 (H1N1), A/Brisbane/10/2007 (H3N2) e B/Brisbane/60/2008.
TABELA 11. Títulos de HAI de soros humanos 5 pediátricos após a vacinação com a vacina inativada pH1N1 de 2009. Virus' ida vacina Soros rWT 144 144-172 71-142- 71-142- Bris Eris/ de 2009 2009 177 172-177 /59 10 H1N1 TIV Pré <:10 <10 <10 <10 <10 0.0 00 1 1 Sim Não Pós 20 10 10 20 90 20 20 Pré <10 <10 <10 <10 <10 80 <10 8 Sim Não Pós <10 <10 <10 10 10 80 <10 Pré 10 10 10 10 10 10 <10 3 12 Sim Não Pós 80 80 40 160 160 10 10 Pré <10 <10 <10 <10 <10 <10 10 4 13 Sim Não Pós 80 40 40 160 320 10 10 Pré <10 <10 <10 <10 <10 80 10 5 14 Sim Não Pós 10 <10 <10 10 20 80 10 Pré <10 <10 <.:10 10 20 <10 10 6 14 Sim Sim Pós 160 160 80 640 640 40 40 Pré <10 <10 <10 <10 <10 160 20 7 16 Sim Não Pós 10 <10 <10 20 10 160 20
Pré <10 <10 <10 <10 <10 10 10 8 16 Sim Sim Pós 20 10 <10 20 40 80 80 Pré <13 <10 <10 20 20 10 <10 9 17 Sim Não Pós 40 10 10 160 160 20 <10 Pré <10 <10 <10 <10 <10 20 <10 10 17 Sim Sim Pós 160 40 40 640 640 20 <10 a Amostras de soro humano obtidas nos dias 0 (Pré) e 42 (Pós) após a vacinação, respectivamente. h Caixas em negrito destacam o menor título de reatividade cruzada para cada indivíduo. A vacina inativada de H1N1 2009 foi administrada no dia 0 e no dia 21. '2009 TIV: vacina de virus influenza inativado trivalente que incluía as cepas A/Brisbane/57/2007 (H1N1), A/Brisbane/10/2007 (H3N2) e B/Brisbane/60/2008, foi dada no dia 0 e a vacina de H1N1 de 2009 foi dada no dia 21.
10 6.5.3.5 AS EXCLUSÕES DE GLICOSILAÇÃO EM UM VÏRUS H1N1 SAZONAL RECENTE AUMENTAM SUA VIRULÊNCIA IN VIVO
E PRODUZ UMA PROTEÇÃO CRUZADA CONTRA O DESAFIO DE VÍRUS PH1N1 DE 2009 Para elucidar o papel de glicosilações de HA nas propriedades patogênicas e antigênicas de vírus H1N1, gerou-se um conjunto de vírus de exclusão de glicosilação, com base na cepa sazonal Tx/91 contemporânea que contém três sítios de glicosilação adicionais em sua HA, nos sítios 71, 142 e 177. A eliminação de sítios de glicosilação de HA resultou em uma mobilidade de HA mais rápida em SDS-PAGE, conforme esperado (Figura 25A). A infecção com uma dose sub-letal de vírus WT Tx/91 (em 1X103 pfu) não resultou em uma morbidez em camundongos, no entanto; a infecção com vírus contendo exclusões de 2 ou 3 glicosilações (A71-177 e a71-142-177) resultou em um nível significativo de perda de peso comparado ao vírus rWT 5 (Figura 25B). A maior morbidez foi observada no vírus ã71- 142-177, um vírus que se parece com o pHlNl de 2009 pelo fato de não ter sítios de glicosilação na cabeça globular de HA.
Isto novamente confirmou que a glicosilação de HA afeta negativamente o potencial patogênico in vivo de vírus 10 H1N1. Para investigar se a infecção com esses virus de exclusão de glicosilação poderia produzir respostas protetoras cruzadas ao vírus H1N1 de 2009 WT antigênica e altamente diverso, esses animais foram desafiados no dia 27 p.i. com 100 vezes a dose letal a 50% (LD50) de vírus WT 15 Neth/09. Todos os camundongos previamente infectados com • rWT Tx/91 sucumbiram ao desafio de Neth/09, e os camundongos infectados com o vírus contendo uma única glicosilação excluída no sítio 71 (471) mostraram perda de • peso substancial e uma taxa de sobrevivência de somente 20% 20 (Figuras 25 C e 25D). Em contrapartida, embora os animais infectados com vírus com exclusões de glicosilação nos sítios 71-177 (12,71-177) e 71-142-177 (A71-142-177)
mostrassem uma perda substancial de peso corporal (até -20%) todos sobreviveram ao desafio letal com Neth/09 (Figura 25D) 25 com animais infectados com ã71-142-177 mostrando um nível de morbidez geral inferior (Figura 25C). Esses dados mostram que as glicosilações de HA representam um papel importante em mascarar os sítios antigênicos e em produzir respostas imunes protetoras contra cepas de vírus influenza 30 H1N1 antigenicamente diversas.
6.5.4 DISCUSSÃO Neste exemplo, o efeito de glicosilações na proteína de HA sobre a virulência e a reatividade cruzada antigênica no contexto da cepa pHlNl de 2009 atual foram 5 avaliados. Utilizando-se um conjunto de vírus pH1N1 de 2009 recombinantes modificados por engenharia genética para imitar a aquisição temporal de glicosilações na proteína de HA como aquela observada para os virus H1N1 sazonais no passado, demonstrou-se que as glicosilações representam um papel importante na modulação da patogênese e nas propriedades antigênicas desses vírus.
A análise de sequência inicial do vírus pHlNl de 2009 revelou uma diferença drástica comparada aos vírus H1N1 sazonais (tipo Bris/59) que estavam circulando mundialmente no momento da epidemia (Dawood et al., 2009, N Eng1 J Med 360, 2605-2615; Garten et al., 2009, Science 325, 197-201; Smith et al., 2009, Nature 459, 1122-1125). A análise íntima da proteína de HA, e estudos experimentais de nós e de terceiros (Kash et al., 2010, Influenza and other respiratory viruses 4, 121-127; Manicassamy et al., 2010, PLoS Pathog E, e1000745; Skountzou et a1., 2010, J.
Immunoi. 1895(3), 1642-1649), mostraram que o vírus pandêmico de 2009 estava mais estritamente relacionado aos vírus H1N1 mais antigos que circularam em seres humanos antes dos anos 1950. A HA dos vírus H1N1 sazonais adquiriu sítios de glicosilação durante sua evolução em seres humanos, provavelmente como resultado da pressão de seleção imune. De interesse, surgiu uma série de glicosilações, mas desapareceram eventualmente e algumas foram fixadas no tempo (Figura 22). Isto sugere que durante a evolução viral,
algumas dessas glicosilações podem ser prejudiciais para o vírus, enquanto outras podem proporcionar aptidão e/ou uma vantagem de escape imune para o surgimento de variantes de deriva em seres humanos.
Devido ao fato de os vírus 5 pandêmicos pHlNl de 2009 e H1N1 de 1918 terem o mesmo padrão de glicosilação em HA1, há uma possibilidade que a cepa pH1N1 de 2009 possa ser submetida a um padrão evolucionário similar e pode adquirir glicosilações similares na HA com o tempo conforme observado previamente com o H1N1 sazonal (Figura 22). Portanto, os vírus pH1N1 de 2009 foram modificados por engenharia genética com motivos de glicosilações adicionais que ocorreram naturalmente em vírus H1N1 humanos desde seu surgimento em 1918. Isto também permitiu o estudo da significância potencial de tais mutações no contexto de respostas de anticorpo protetoras produzidas pela vacina de pH1N1 de 2009 em seres humanos.
Os vírus Neth/09 recombinantes contendo sítios de glicosilação adicionais na HA foram atenuados em camundongos e furões (Figura 24). Todavia, a infecção e a capacidade de replicação dos vírus glicosilados em MDCK e das células HTRE primárias não foram significativamente afetadas (Figura 23). Entre WT e os vírus 144-172, observaram-se diferenças em carga viral nos pulmões e na traqueia dos animais infectados com 144-172, mas não nos turbinados nasais.
A infecção nesses modelos animais com vírus pH1N1 glicosilados é consideravelmente recordativa de infecção com vírus H1N1 sazonais, que não produzem genericamente doença em modelos de camundongos (Bouvier & Lowen, 2010, Viruses 2, 1530-1563; Pica et al., 2011, Journal of Virology 85(23), 12825-9) e em furões se replicam em altos títulos no trato respiratório superior, mas não no trato respiratório inferior (Maines et a1., 2009, Science 325, 484-487; Munster et a1., 2009, Science 325,
481-483). Não somente a virulência foi reduzida 5 adicionando-se sítios de glicosilação nos vírus pH1N1, mas também a virulência foi aumentada excluindo-se glicosilações no contexto do vírus H1N1 Tx/91. Portanto, a aquisição de glicosilações na HA parece reduzir a virulência dos vírus H1N1. 10 A caracterização antigênica dos vírus mutantes de glicosilação Neth/09 sugeriu que o sítio Se na HA é uma região antigênica predominante para camundongos, furões (dados não mostrados) e seres humanos, visto que a adição de 1 ou 2 glicosilações nos resíduos ao redor deste sítio 15 (por exemplo, sítios 144 e 144-172) foi suficiente para reduzir significativamente a atividade de HAI da resposta policlonal produzida pelo vírus não-glicosilado WT.
Dentre esses dois sítios, 144 parece ser aquele responsável por • este efeito, visto que uma redução dramática em HAI não foi 20 observada no vírus 71-142-172-177. A imunização de seres humanos com a cepa de vacina pH1N1 de 2009 inativada atual induziu uma resposta imune geral de anticorpo policlonal recordativa daquele em camundongos e furões imunizados com pH1N1 (Tabela 10, supra), visto que a glicosilação no sítio 25 144 foi a mais eficiente em evadir a reatividade de HAI.
De modo similar, os soros pós-vacinação pediátricos analisados mostram uma atividade considerável contra os vírus 71-142- 177 e 71-142-172-177, porém, menor contra os vírus 144 e
144-172. Em geral, isto indica que a glicosilação de vírus 30 H1N1 humanos afeta consideravelmente suas propriedades antigênicas. Como consequência da pressão antigênica mediada imune, também é possível que novas alterações em HA evoluam e conduzam a aparência de novos sítios de glicosilações na cepa pH1Nl de 2009 modulando suas 5 propriedades antigênicas à medida que continua a circular sazonalmente ao redor do mundo. Se este for o caso, será interessante analisar seu impacto em virulência e antigenicidade.
De modo importante, a infecção com vírus que hospedam sítios de glicosilação 144 e 144-172 induziu uma resposta policlonal mais ampla capaz de reagir de modo cruzado com todos os vírus glicosilados WT e Neth/09 gerados (Tabela 9, supra). O fôlego aumentado da resposta policlonal ocorre provavelmente devido à blindagem do sítio imunodominante Sa, resultando em uma alteração do foco antigênico que redireciona a resposta humoral a outros epítopos. De modo considerável, a proteção cruzada contra o vírus WT Neth/09 observada nos camundongos infectados com uma dose sub-letal dos mutantes de exclusão Tx/91 £71-177 e A71-142-177 enfatiza a importância em "distrair" ou redirecionar a resposta humoral. Esses resultados também apontam para um papel evolutivo crucial da aparência de glicosilações ao redor do sítio Sa, visto que a exclusão de glicosilações dentro ou próximas a esta região tem um efeito profundo na reatividade cruzada. No geral, essas constatações destacam os efeitos imunomodulatórios de glicosilações específicas nas propriedades antigênicas de HA, e também os efeitos de glicosilações sobre o fôlego da resposta imune à infecção e vacinação.
6.6 EXEMPLO 6: ANTICORPOS DE CAULE DE
HEMAGLUTININA PRODUZIDOS PELA INFECÇÃO COM VÍRUS INFLUENZA H1N1 PANDÊMICO DE 2009 Este exemplo descreve polipeptídeos de 5 hemaglutinina de vírus influenza quimérico que foram usados para estudar anticorpos específicos de domínio de tronco. Usando esses polipeptídeos, determinou-se que a infecção com o vírus H1N1 pandêmico de 2009 produziu um estímulo em título de anticorpos de neutralização de vírus dirigidos contra o tronco de hemaglutinina. Além dos polipeptídeos de hemaglutinina de vírus influenza quimérico, os ensaios que podem ser usados para medir os anticorpos de neutralização de vírus influenza que não são detectados no ensaio de inibição de hemaglutinação tradicional também são descritos.
6.6.1 MATERIAIS E MÉTODOS
6.6.1.1 CÉLULAS E PLASMÏDEOS As células 293T e MDCK foram obtidas junto a ATCC e foram mantidas em um meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) e em um Meio Essencial Mínimo (ambos junto a Gibco), respectivamente, cada uma suplementada com 10% de soro bovino fetal (HyClone), e 100 unidades/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Pen/Strep, Gibco). TNM-FH (Sigma-Aldrich) suplementado com 10% de soro bovino fetal e meio de cultura de inseto SFX Hyclone (ThermoScientific) foram usados para uma cultura celular Sf9 e BTI-TN5B1-4 (High Five).
As construções de hemaglutinina quimérica (cHA) com o caule de A/Puerto Rico/8/1934 (PRO) contendo o domínio de cabeça globular do vírus A/Mallard/Sweden/81/02 (cH6/1) ou vírus A/Guinea fowl/Hong Kong/WF10/99 (cH9/1)
foram geradas usando métodos previamente descritos (Hai et ai., 2008, J Viroi 82, 10580; Fodor et ai., 1999, J Virol 73, 9679). Em resumo, diferentes componentes da hemaglutinina quimérica (cHA) foram amplificados por PCR 5 com iniciadores contendo sítios Sap I sites, digeridos com Sap I, e clonados nos sítios Sap I de plasmídeo pDZ (Quinlivan et ai., 2005, J Viroi 79, 8431) . Para a geração de plasmídeos de báculo-transferência, cH6/1 e cH9/1 foram amplificados por PCR, cortados com BamHI e NotI, e clonados 10 em armação em um vetor de báculo-transferência pFastBac (Invitrogen) modificado que aloja um foldon de fago T4 C- terminal e um tag 6-his (Meier et al., 2004, J Moi Biol 344, 1051). As sequências de todos os foram confirmadas por seqüenciamento de Sanger.
15 6.6.1.2 GERAÇÃO DE BACULOVÍRUS RECOMBINANTE,
EXPRESSÃO DE PROTEÌNA E PURIFICAÇÃO A fim de gerar uma proteína cH6/1 e cH9/1 recombinante, os vetores de báculo-transferência foram transformados em cepa E. colt DH1OBac (Invitrogen) de 20 acordo com as instruções do fabricante. As colônias DH1OBac mostrando o fenótipo certo foram escolhidas, desenvolvidas e as bacmidas foram preparadas usando um Plasmid Midi Kit (Qiagen).
As bacmidas que transportam os genes cH6/1 ou 25 cH9/1 foram transfectadas em células Sf9 com Celfectina. II (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. O baculovírus recombinante foi amplificado nas células Sf9 desenvolvidas em um meio TNM-FH (Gemini Bioproducts, West Sacramento, CA, EUA) e os títulos foram determinados por ensaios de placa (King et al., 2007, Methods Moi Biol 388, 77) .
Células High Five desenvolvidas em um meio celular de inseto SFX HyClone (Thermo Fisher Scientific) 5 foram infectadas com baculovírus recombinante que expressa cH6/1 ou cH9/1 em uma multiplicidade de infecções (MOI) de 10 e uma densidade celular de 1 x 10 6 células/ml em frascos agitadores de 500 ml (Krammer et a1., 2010, Moi Biotechnol 45, 226). As células foram colhidas 96 horas pós-infecção e separadas do sobrenadante por centrifugação de baixa velocidade durante 10 minutos a 2000g em temperatura ambiente. Para purificação de proteínas cHA, o sobrenadante foi coletado e incubado com resina Ni-NTA (Qiagen) durante 2 horas a 4°C. A pasta fluida foi carregada nas colunas e lavada três vezes com um tampão de lavagem (50 mM de Na2HCO3, 300 mM de NaCl, 20 mM de Imidazola, pH 8) . A proteína foi eluída em etapas de 0,5 ml com um tampão de eluição (50 mM de Na9HCO 3 , 300 mM de NaCI, 250 mM de Imidazola, pH 8), testada para determinação do teor de proteína com reagente de Bradford e as frações contendo proteínas foram agrupadas. As frações agrupadas foram trocadas por tampão em PBS e concentradas usando uma unidade de filtro centrífugo Amicon Ultra (Millipore) com um corte de peso molecular de 10 kD em um rotor com cesta oscilante. A pureza e a e a identidade da proteína foram testadas por SDS-PAGE, coloração Coomassie e Western blot.
Os anticorpos a seguir foram usados para confirmar a expressão de cHA: Anti-soro de cabra anti-H6 (BEI, #NR -663), Gl-26 (anti-H9, camundongo; BEI# NR-9485), 3951 (coelho, anti-HA2 PR8) (Graves et a1., 1983, Virology 126, 106),
PY102 (cabeça anti-PR8, camundongo), e 12D1 (caule anti-H3, camundongo) (Wang et a1., 2010, PLoS Pathog 6, e1000796).
As concentrações de proteína finais foram determinadas com reagente de Bradford. 5 6.6.1.3 RESGATE DE VÍRUS DE EXPRESSÃO DE cHA
RECCMBINANTES A fim de resgatar os vírus recombinantes que expressam cH9/1, plasmídeos de genética revessa que codificam vRNA e mRNA dos seis segmentos virais tipo 10 selvagem de PR8, bem como plasmídeos que codificam N3 NA a partir do vírus A/mallard/Alberta/24/01 e cH9/1 foram usados, conforme descrito previamente (Hai et a1., 2008, J Virol 82, 10580; Fodor et a1., 1999, J Virol 73, 9679, 27) . Em resumo, as células 293T foram transfectadas com 1 pg de 15 cada um dos oito plasmídeos usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Em 12 horas após a transfecção, o meio foi substituído por DMEM contendo 0,3% de albumina sérica bovina, 10 mM de HEPES, e 1,5 pg de TPCK tripsina tratada com (1-1- 20 tosilamida-2-feniletil clorometil cetona)/mL (Sigma T1426).
Em dois dias após a transfecção, o sobrenadante contendo vírus foi inoculado em ovos de galinha embrionados com 1 dias de idade. Q fluido alantóico foi colhido após 2 dias de incubação a 37° C e ensaiado para a presença de vírus 25 pela hemaglutinação de hemácias de galinha. O vírus cH9/1 resgatado foi, então, propagado em ovos com 10 dias de idade após uma incubação de 48 horas a 37°C. os estoques de vírus foram titulados por ensaios de placa conforme previamente descrito em células MOCK na presença de 30 tripsina TPCK (Steel et a1., 2009, J Virol 83, 1742). A sequência do RNA cH9/1 foi confirmada pelo sequenciamento de produtos de PCR por transcrição reversa.
6.6.1.4 IMUNOFT,ORF2CFNMA PARA rrn\MWTPM7\D n
EXPRESSÃO DE HEMAGLUTININA QUIMÉRICA 5 Monocamadas confluentes de células MOCK foi infectada com vírus cH9/1N3 em um MOI de 2. Em 48 horas após a infecção, as células foram fixadas e bloqueadas com 1% de albumina sérica bovina em PBS contendo 0,1% de Tween
20. As células foram, então, incubadas com mAbs de 10 camundongo: anticorpo anti-NP HT103, PY102, anti-H9 (BEI NR#9485), ou um anticorpo caule-específico pan-H1 (6F12). Após três lavagens com PBS contendo 0,1% de Tween 20, as células foram incubadas durante 1 hora com IgG anti- camundongo conjugado com Alexa Fluor 488 (Invitrogen). As 15 células infectadas foram analisadas por microscopia de fluorescência com um microscópio Olympus IX70.
6.6.1.5 AMOSTRAS DE SORO HUMANO Amostras de soro humano foram coletadas e usadas de acordo com os protocolos institucionais. Os soros foram 20 coletados a partir de coortes de três pacientes: adultos não infectados com pHlNl, crianças não infectadas com pH1N1, e adultos infectados com vírus pH1N1. Os soros foram coletadas a partir de pacientes infectados com pH1N1 dentro das primeiras 3 semanas da infecção sintomática. Para 25 experimentos usando soro agrupado, um volume igual de cada amostra foi misturado para gerar um agrupamento. A confirmação da infecção foi realizada por Wrammert et al. por RT-PCR e por ensaios sorológicos (Wrarrimert et al., 2011, J Exp Med 208, 181-193) 30 6.6.1.6 ENSAIOS DE INIBIÇÃO DE HEMAGLUTININA
Os soros coletados foram primeiramente inativados por um tratamento de tripsina-calor-periodato ou por um tratamento RDE a fim de remover inibidores não-específicos de hemaglutinação (Coleman, Dowdle, 1969, Bull World Health 5 Organ 41, 415 (1969). Realizaram-se ensaios de inibição de hemaglutinação (HI) para testar a reatividade com vírus cH9/lN3 e A/duck/France/MB42/76 (H6 HA) (Desselberger et a1., 1978, Proc Natl Acad Scí U S A 75, 3341 (Jul, 1978) ) conforme previamente descrito (Lowen et a1., 2009,. J Virol 10 83, 2803). Uma amostra é considerada negativa se a atividade HI não for observada com uma diluição 1:10 do soro.
6.6.1.7 ELISAs Placas ELISA com 96 poços (Qiagen HisSorb ou Nunc 15 Immulon 2) foram revestidas com 50 ul de proteínas cH6/1, cH9/1 ou hemaglutinina de comprimento completo expressos por baculovirus (H5 HA, BEI NR#660; H3 HA, BEI 1NR#15171) ou alfa hélice longa (LAH) de sequência Hl (PRO) (Wang et a1., 2010, Proc Natl Acad Scí U S A 107, 18979) diluída em PBS e 20 incubadas de um dia para o outro a 4°C. As placas foram bloqueadas com 0,5% leite/2% de soro de cabra/PBS e, então, lavadas 3X com PBS/0,1% de Tween (PBST)_ Os anticorpos monoclonais, soros de indivíduos humanos, e soros de camundongos usados como controles foram serialmente 25 diluídos em PBS ou tampão de bloqueio e, então, adicionados à placa, seguidos por uma incubação de uma hora em temperatura ambiente. As placas foram, então, lavadas 3X com PBST e incubadas com uma diluição 1:5000 de IgG de cabra anti-humano [Fc] acoplado à fosfatase alcalina (AP) 30 (Meridian Life Science) ou AP anti-camundongo (Invitrogen)
durante uma hora adicional.
Após uma lavagem 3X com PEST,
adicionou-se um substrato de fosfato de p-nitrofenil (Sigma). A reação foi interrompida com NaOH após 10 minutos e medições de densidade óptica foram tomadas em 405 nm. 5 6.6.1.8 ENSAIO DE REDUÇÃO DE PLACAS
Os soros de pacientes adultos infectados e virgens (não infectados com vírus pH1N1) foram primeiramente agrupados e carregados em uma coluna de fluxo de gravidade com sefarose de proteína G (GE Healthcare)
10 para purificação de proteínas IgG.
A coluna foi lavada com PBS.
Os anticorpos policlonais foram eluídos com um tampão de glicina a 0,1 M (pH 2, 7) . Um tampão de Tris-HC1 a 2 M (pH 10) foi imediatamente adicionado em uma razão 1:10 para restaurar o pH. 0 eluado foi trocado por tampão em PBS e
15 concentrado usando uma unidade de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 (Millipore) com um corte de 50 kD MW em um rotor de balde oscilante.
As concentrações de proteína foram medidas em um espectrofotõmetro NanoDrop 2000 usando o método A280. A remoção de inibidores de soro não-específico 20 foi confirmada por testes HI usando múltiplas cepas de vírus que demonstraram uma ausência de atividade HI nas preparações de IgG purificadas (dados não mostrados). A capacidade de neutralização de anticorpos caule-reativos foi avaliada conforme previamente descrito (Wang et al., 25 2010, 'PLoS Pathog 6, e1000796) . 0 vírus foi primeiramente diluído em uma concentração que renderia 100 unidades de formação de placa por PCO.
Concentrações diferentes de IgG de soros agrupados foram, então, co-incubadas com vírus em temperatura ambiente durante uma hora.
Placas com seis 30 poços semeadas com células MDCK foram lavadas com PBS e,
então, infectadas com 200 ul de misturas de vírus-IgG. Após uma incubação de quarenta e cinco minutos a 37°C, vírus e IgG foram aspirados das células e uma camada de agar contendo uma concentração apropriada de anticorpo e tripsina TPCK foi adicionada a cada poço. As placas foram incubadas durante 2 dias a 37°C. As placas foram visualizadas por imunocoloração (Bouvier et a1., 2008, J Vïrol 82, 10052) usando um anticorpo G1-26 anti-H9.
6.6.1.9 ENSAIO DE NEUTRALIZACÃO DE PARTÍCULAS DE PSEUDO-TIPO O procedimento para produção de partículas de pseudo-tipo foi adaptado a partir de escudos anteriores (Evans et a1., 2007, Nature 446, 801). Em resumo, as células 293-T foram co-transfectadas com quatro plasmídeos codificando (i) um pró-vírus contendo o repórter desejado (V1-GLuc), (ii) HIV Gag-Pol, (iii) a proteína de hemaglutinina cH9/l quimérica e (iv) neuraminidase (NA) influenza B/Yamagata/16/88 (Tscherne et al., 2010, J Virei Methods 163, 336). O plasmídeo V1-GLuc codifica uma proteína luciferase que é secretada a partir das células e pode ser detectada no sobrenadante celular. Os sobrenadantes foram coletados 48 horas pós-transfecção e subsequentemente filtrados (tamanho de poro de 0,45 pm) a fim de purificar as preparações de partícula cH9/1. As partículas foram, então, incubadas (em uma quantidade determinada para fornecer uma atividade de luciferase dentro da faixa linear após a infecção) com concentrações diferentes (50µg/ml, 10íg/ml e 2pg/ml) de IgGs humanos purificados e foram adicionadas às células MDCK. As infecções procederam durante 6 horas antes de as células serem lavadas e um sobrenadante fresco ser colocado sobre as células. Todas as infecções que usam partículas de pseudo-tipo foram realizadas na presença de 1 pg/ml de polibreno (Sigma, St. Louis, MO, EUA) (Tscherne et aí., 5 2010, J Virol Methods 163, 336). Quarenta e oito horas pós- infecção, realizaram-se ensaios de luciferase.
6.6.2 RESULTADOS
6.6.2.1 DESENVOLVIMENTO DE REAGENTES BASEADOS
EM HEMAGLUTININA QUIMÉRICA 10 As construções de hemaglutinina quimérica (cHA) foram geradas para servir como ferramentas analíticas para avaliar a presença de anticorpos de caule em soros humanos. Levando-se vantagem de uma ligação de dissulfeto que existe entre C52 e 0277, e que demarca a borda entre os domínios 15 de cabeça e caule de HA, os plasmídeos de expressão foram modificados por engenharia genética que codificam o domínio de cabeça globular de uma hemaglutinina H6 ou H9 em cima do domínio de caule a partir da HA de vírus PR8 (Figura 26A) Criou-se uma hipótese de que as amostras de soro humano 20 contendo anticorpos de caule provavelmente seriam negativas para atividade de inibição de hemaglutinação (HI) contra vírus H6 ou H9 (devido à falta de exposição anterior a esses subtipos de vírus), ainda seriam reativas com as construções cH6/1 ou cH9/1 devido à exposição anterior ao 25 caule de H1 hemaglutinina. Essas ferramentas, proteínas cHA recombinantemente expressas e vírus que expressam as cHAs poderiam ser usados para avaliar as quantidades relativas de anticorpos de caule em amostras de soro humano e medir qualquer atividade de neutralização mediada pelos 30 anticorpos caule-específicos.
A fim de gerar proteínas cH6/1 e cH9/1 para ensaios analíticos, os plasmídeos que codificam para as HAs quiméricas foram gerados e expressos como proteínas solúveis em um sistema de expressão de baculovírus. A 5 coloração de coomassie de 2pg de proteína total sugere um alto grau de pureza nessas preparações (Figura 29A).
Imagina-se que a migração ligeiramente retardada de cH9/1 seja o resultado de um número aumentado de sítios de glicosilação ocupados na cabeça cH9/1. As proteínas cHA foram adicionalmente caracterizadas por uma análise western blot usando anticorpos reativos com várias partes da HA.
Conforme mostrado na Figura 29B, somente cH6/1, cH9/1 e HA de comprimento completo de PR8 reagiram com um anti-soro policlonal de coelho para o caule PR8. Os anticorpos monoclonas contra os domínios de cabeça de H6, H9, e PR8 confirmaram que as construções quiméricas estavam expressando cabeças exóticas em cima de um caule PR8. A proteína H3 foi usada como um controle negativo, e foi somente detectada ao usar o anticorpo 12D1 pan-H3 (Wang et 20 a1., 2010, PLeS Pathog 6, e1000796).
Os vírus recombinantes que expressam as moléculas quiméricas também foram resgatados para o propósito de detectar anticorpos de caule de neutralização. Devido ao fato de todos os vírus influenza humanos ao longo do último século terem NA codificado do subtipo Ni ou N2, argumentou- se que o resgate do vírus reassortante cH9/1N3 permitiria a avaliação da capacidade de neutralização de anticorpos caule-específicos, embora não meça qualquer atividade de anticorpo de neuraminidase (Ni ou N2). 0 vírus cH9/1N3 (que expressa o caule Hl com HA de cabeça globular H9 com uma neuraminidase N3 subtipo) foi resgatado usando genética reversa e desenvolvidos em altos títulos em ovos de galinha embrionados. O fenótipo de ensaios de placa deste vírus foi similar àquele do vírus PR8 tipo selvagem (Figura 260). 5 Para confirmar a presença da cabeça H9 após a passagem do vírus, as células foram infectadas com vírus cH9/1N3. As células infectadas foram, então, provadas com mAb Gl-26 de camundongo, um anticorpo específico para proteínas de hemaglutinina subtipo H9. Um anticorpo caule-específico pan-Hl, 6F12, foi usado para detectar células infectadas com vírus PR8 tipo selvagem e cH9/1N3 (Figura 26B).
6.6.2.2 ANTICORPOS CAULE-ESPECÌFICOS LIGAM E NEUTRALIZAM cHA A fim de confirmar que as proteínas cH6/1 e cH9/1 poderiam ser usadas como ferramentas para detectar anticorpos de caule, o uso desses cHAs foi primeiramente validado com um anticorpo conhecido por reagir com o caule HA. De fato, mAb 0179 de camundongo, um anticorpo reativo com o caule de H1 HA (Okuno et a1., 1993, J Virol 67, 2552), ligado ao baculovírus expressou a proteína cH6/1 e cH9/1 por ELISA de maneira dose-dependente (Figuras 30A e B). A seguir, confirmou-se se a replicação do vírus cH9/1N3 poderia ser inibida por anticorpo 6F12 monoclonal, que tem uma atividade de neutralização contra vírus influenza H1 (dados não mostrados). O anticorpo 6F12 era capaz de ligar e neutralizar vírus cH9/1N3 em um ensaio de redução de placas (Figuras 30C e 30D), de maneira dose- dependente, com cem por cento de inibição observada em concentrações acima de 4pg/ml. Esses resultados validaram a hipótese que as proteínas quiméricas e o vírus cH9/1N3 recombinante poderiam ser usados para detectar anticorpos de caule com atividade de neutralização.
6.6.2.3 PACIENTES INFFCTAnn4 rnM pu1M1 TM ALTOS TÍTULOS DE ANTICORPOS QUE LIGAM E NEUTRALIZAM cHA 5 Antes do uso de proteínas solúveis cH6/1 e cH9/1 para quantificar anticorpos caule-reativos em amostras de sangue de pacientes, os soros para atividade de HI foi testado contra vírus que expressam esses dois subtipos HA. Usando vírus A/duck/France/MB42/76 (H6) e cH9/1N3, 10 confirmou-se que todas as amostras de soro adulto e pediátrico coletadas foram HI negativas (resultados não mostrados) A seguir, a reatividade dos soros com proteínas cH6/1 e cH9/1 foi testada por ELISA. Os soros coletados de 15 indivíduos adultos e pediátricos não infectados com os vírus pH1N1 mostraram pouca reatividade com qualquer proteína. No entanto, os soros coletados de pacientes infectados com vírus influenza pH1N1 mostraram uma ligação aprimorada a ambas as construções cHA, com uma diferença 30 20 vezes maior em reatividade IgG (comparando diluições que rendem leituras de densidade óptica equivalentes) ao comparar agrupamentos de soro infectado com pH1N1 com aqueles de adultos e crianças não-infectados (Figuras 27A e 27B). Portanto, considerou-se, levando-se dados HI 25 negativos em consideração, que a reatividade com proteínas cHA está ocorrendo no domínio de caule.
Usando amostras agrupadas de soros humanos, IgG que se liga a uma porção do tronco HA, a alfa-hélice longa (LAH) , também foi testado. Esses IgGs foram previamente 30 mostrados mediando a imunidade protetora em camundongos
(Wang et ai., 2010, Proc Natl Acad Sci U S A 107, 18979) .
Os soros de pacientes infectados com pH1N1 continham um anticorpo reativo com Hl LAH, enquanto pacientes não- expostos ao vírus pandêmico apresentaram um anticorpo de 5 soro LAH-específico mínimo (Figura 27C).
Q subtipo de hemaglutinina H5 está dentro do mesmo grupo filogenético que a H1 HA, e compartilha uma estrutura de caule bastante similar (Ekiert et a1., 2009, Science 324, 246). De modo interessante, os pacientes expostos ao pH1N1 apresentaram especificidades de anticorpo de soro estimuladas reativas com a proteína H5 (Figura 27D), embora não tenha nenhuma atividade HI de soro contra o vírus de subtipo H5 homólogo (dados não mostrados). Este resultado sugeriu que a exposição ao vírus pH1N1 pode ter conferido um grau de imunidade anti-H5 mediado por anticorpos caule-específicos.
De modo importante, os pacientes infectados com pH1N1 não tinham um anticorpo de soro estimulado específico para uma proteína de hemaglutinina H3 (H3 estando em um grupo filogenético separado de HAs H1 e H5) (Figura 27E).
Este resultado demonstra que o título aprimorado de anticorpos caule-específicos em soros de pacientes infectados com pHiN1 não é uma função de estímulo imune geral; de preferência, as especificidades de anticorpo de caule H1 foram seletivamente estimuladas por infecção com a cepa de vírus pandêmico.
A seguir, avaliou-se se esses anticorpos reativos de caule encontrados nessas amostras humanas tinham uma capacidade de neutralização. As amostras de soro de adultos infectados e não-infectados foram agrupadas e o IgG total foi purificado a fim de remover os inibidores não- específicos (por exemplo: moléculas e lectinas contendo ácido siálico) que se ligariam à cabeça de hemaglutinina.
Usando essas preparações de IgG puras, alcançou-se a 5 formação de placas por inibição completa em concentrações de anticorpo acima de 55,5 ug/mL de IgG de soro total (Figuras 28A e 28B). De acordo com os dados ELISA, uma diferença de aproximadamente 30 vezes na capacidade de neutralização foi observada ao comparar os soros de infectados com pH1Nl com aqueles de adultos não-infectados. Usando mAb 6F12 como um padrão, foi possível realizar uma comparação entre as atividades de neutralização mediadas por 6F12 e a preparação de IgG humana policlonal. Comparando-se as concentrações de 6F12 e IgGs humanos que renderam uma neutralização de 100% do vírus cHA, estimou-se que 7% do IgG humano total de pacientes infectados com pH1N1 durante os últimos 30 dias compreendiam anticorpos de caule de neutralização.
Finalmente, a capacidade de neutralização de anticorpos caule-reativos foi avaliada, usando um ensaio de infecção de partícula de pseudo-tipo que tem uma leitura de atividade de luciferase que é gerada mediante a entrada de vírus nas células hospedeiras. As partículas pseudo- tipificadas que expressam a proteína cH9/1 foram incubadas com IgG humano purificado e a atividade de neutralização foi medida pela inibição da entrada de partícula resultando na ausência de atividade enzimática de luciferase em sobrenadantes celulares (vide os métodos). De acordo com o ensaio de redução de placas, o ensaio de partículas pseudo- tipificadas também mostrou uma neutralização de 100% de
57 6 / 6 48 partículas nas concentrações de IgG totais excedendo 10pg/ml (Figura 28C).
6.6.3 CONCLUSÃO Desenvolveram-se ferramentas analíticas 5 inovadoras, sob a forma de proteínas de hemaglutinina quiméricas e vírus que expressam essas proteínas quiméricas, que permitissem a detecção seletiva de anticorpos caule- específicos em preparações que também incluem anticorpos que se ligam à cabeça globular de proteínas de hemaglutinina. Essas construções de hemaglutinina inovadoras têm um caule de subtipo Hl constante, com. domínios de cabeça globular de subtipos de hemaglutinina distintos (ex: caule Hl com cabeça H6). Isto foi realizado levando-se vantagem de uma ligação de dissulfeto que existe entre as cisteínas 52 e 277 na proteína de hemaglutinina (19) para trocar a sequência interveniente por aquela de um subtipo HA diferente.
Usando essas construções de hemaglutinina quimérica (eRA), demonstrou-se que um pequeno coorte de humanos com infecção de vírus pHlNl confirmada gerou um alto título de anticorpos de neutralização caule- específicos comparados a controles adultos e pediátricos não-infectados com vírus pHIN1. Essas constatações suportam a hipótese que os anticorpos reativos com o caule de hemaglutinina, gerados em resposta à infecção pH1Nl, provavelmente contribuíram para a extinção de vírus HIN1 sazonais que estavam circulando antes da pandemia de influenza de 2009.
6.7 EXEMPLO 7: VÍRUS INFLUENZA QUE EXPRESSAM HEMAGLUTININAS QUIMÉRICAS: DOMÍNIOS DE CABEÇA GLOBULAR E
CAULE DERIVAD©S A PARTIR DE SUBTIPGS DIFERENTES E GRUPOS
FILOGÊNICOS Este exemplo descreve várias hemaglutininas de vírus influenza quimérico funcionais que abrangem uma 5 variedade de combinações de cabeça globular e caule de diferentes subtipos de hemaglutinina e diferentes grupos filogênicos, bem como vírus influenza recombinantes que expressam essas hemaglutininas quiméricas, que tinham propriedades de crescimento similares àquelas de vírus 10 influenza tipo selvagem. Esses vírus recombinantes quiméricos possuem propriedades de crescimento similares àquelas de vírus influenza tipo selvagem e podem ser usados como reagentes para medir anticorpos domínio-específicos em • ensaios virológicos e imunológicos. 15 6.7.1 MATERIAIS E MÉTODOS
6.7.1.1 CÉLULAS E VÌRUS As células 293T e MDCK foram obtidas a partir da American Type Culture Collection e foram mantidas em um meio essencial mínimo da Dulbecco (DMEM) ou em NEM (Gibco, 20 Invitrogen) suplementado com 10% de soro bovino fetal (HyClone; Thermo Scientific) e penicilina-estreptomicina (Gibco, Invitrogen). Os vírus A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) e A/Perth/16/2009 (Perth/09) tipo selvagem (gentilmente cedidos por Alexander Klimov, CDC) e vírus recombinantes 25 foram desenvolvidos em ovos de galinha embrionados isentos de patógenos específicos com 10 dias de idade (Charles River) a 37°C durante 2 dias.
6.7.1.2 CONSTRUÇÃO DE PLASMÍDEOS. os plasmideos que codificam as diferentes 30 hemaglutininas quiméricas foram construídos usando uma estratégia similar àquela previamente descrita (vide, por exemplo, Fodor et a1., 1999, J Virol 73:9679-9682; e Hai et a1., 2008, J Virei 82:10580-10590). Em resumo, os segmentos diferentes de HA quimérica foram amplificados por PCR com 5 iniciadores contendo sítios SapI, digeridos com Sapl, e clonados em sítios SapI do vetor de expressão pDZ ambisentido no qual a transcrição vRNA é controlada pelo promotor de polimerase I de RNA humano e pelo terminador de polimerase I de RNA de camundongos, e a transcrição de 10 mRNA/cRNA é controlada pelo promotor de polimerase II beta- actina de galinhas (vide, por exemplo, Quinlivan et al., 2005, J Virei 79:8431-8439), através de uma ligação multi- segmental. Agradecemos gentilmente a Daniel Perez (Universidade de Maryland) pelo plasmídeo HA H7 (Genbank ID: 15 DQ017504). Os plasmídeos que codificam genes A/Puerto Rica/8/1934 (PR8) foram usados conforme previamente descrito (Hai et a1., 2008, J Virol 82:10580-10590).
6.7.1.3 NÚMERO DE ACESSÃO DE SEQUÊNCIA DE
NUCLEOTÍDEO 20 Todos os genes cHA construídos usados neste estudo foram depositados no Influenza Research Database sob o número de acessão IRD-RG-684014, IRD-RG-684022, IRD-RG- 684030, e IRD-RG-684038. cH1/1, r_H5/1, cH7/3 e cH5/3 quiméricos são listados como A/Puerto Rico/8-RGcH1-1/34, 25 A/Puerto Rico/8-RGcH5-1/34, A/Perth/16-RGcH7-3/09, e A/Perth/16-RGcH5-3/09, respectivamente.
6.7.1.4 ANÁLISE CITOMÉTRICA DE FLUXO Para avaliar os níveis de expressão de proteína de hemaglutinina na superfície celular, as células 293T 30 foram transfectadas com 1 pg do plasmídeo apropriado usando
Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante ou as células MDCK foram infectadas com vírus recombinantes de expressão de cHA. Em 48 horas pós- transfecção, as células 293T foram tripsinizadas e 5 ressuspensas em PBS contendo 2% de FBS antes da coloração com o anticorpo monoclonal (mAb) 6F12 (Spg/ml), um mAb gerado em nosso laboratório que seja amplamente reativo ao domínio de caule de HAs grupo 1 (dados não mostrados) ou com o mAb 12D1 (5pg/mL) contra HAs H3 (vide Wang et a1., 10 2010, PLoS Pathog 6:e1000796). Em 12 horas pós-infecção, as células MDCK foram ressuspensas por tripsinização e tingidas com o mAb 12D1. As células tingidas foram analisadas em um citômetro de fluxo Beckman Coulter Cytomics FC 500, e os resultados foram analisados usando o 15 software FlowJo.
6.7.1.5 ENSAIO DE GERAÇÃO E ENTRADA DE PSEUDO- O procedimento para a produção de pseudo- partículas foi adaptado a partir de estudos anteriores 20 (vide, por exemplo, Evans et a1., 2007, Nature 446:801-805 e Tscherne et a1, 2010, J Virol Methods 163:336-43). Em resumo, as células 293-T foram co-transfectadas com quatro plasmídeos que codificam (i) um pro-vírus contendo o repórter desejado (Vl-Gaussia luciferase) (Evans et a1., 25 2007, Nature 446:801-805), (ii) HIV Gag-Pol (Evans et a1., 2007, Nature 446:801-805), (iii) a proteína de hemaglutinina quimérica e (iv) neuraminidase (NA) de vírus B/Yamagata/16/88. Os sobrenadastes foram coletados 72 horas pós-transfecção e, subsequentemente, filtrados (0,45 pm de 30 tamanho de poro). A presença de partículas tipo vírus de pseudo-tipo (VLPs) foi avaliada através de um ensaio de hemaglutinação. Diferentes preparações VLP foram ajustadas às mesmas 4 unidades de hemaglutinação antes da inoculação de células MDCK. Todos os ensaios a seguir que usam pseudo- 5 partículas foram realizados na presença de 1 pg/mL de polibreno (Sigma) para aumentar a eficiência de transdução (vide, por exemplo, Evans et al., 2007, Nature 446:801-805 e Tscherne et al, 2010, J Virol Methods 163:336-43). 0 ensaio de entrada foi realizado através da transdução de 10 células MDCK com pseudo-partículas que expressaram diferentes hemaglutininas quiméricas e continham o repórter Gaussia luciferase. Vinte e quatro horas pós-transdução, as células foram lavadas três vezes com um meio fresco para remover qualquer proteína de Gaussia luciferase residual 15 presente no inoculo. Quarenta e oito horas pós-transdução, realizaram-se ensaios de luciferase (Evans et a1., 2007, Nature 446:801-805).
6.7.1.6 RESGATE DE VÍRUS INFLUENZA A QUIMÉRICOS
RECOMBINANTES 20 0 resgate de vírus influenza A a partir do DNA de plasmídeo foi realizado conforme descrito previamente (vide, por exemplo, Fodor et al., 1999, J Virol 73:9679-9682; e Hai et al., 2008, J Viral 82:10580-10590). Para gerar um vírus PR8 tipo selvagem (rWT) recombinante, as células 293T 25 foram co-transfectadas com 1 pg de cada um dos 8 plasmídeos de resgate PR8 pDZ usando Lipofectamina 2000 (Invitrogen). 0 plasmídeo HA tipo selvagem foi substituído por um plasmídeo que codifica a HA quimérica desejada a fim de gerar vírus recombinantes de expressão de cHA. Em 6 horas 30 pós-transfecção, o meio foi substituído por DMEM contendo
0,3% de albumina sérica bovina (BSA), 10 mM de HEPES, e 1,5 pg/ml de tripsina tratada com TPCK (L-1-tosilamida-2- feniletil clorometil cetona). Após 24 horas pós-transfecção, ovos de galinha embrionados com 8 dias de idade foram 5 inoculados com sobrenadante contendo vírus. 0 fluido alantóico foi colhido após 2 dias de incubação a 37 °C e ensaiado para a presença de vírus por hemaglutinação de hemácias de galinha. Os estoques de vírus foram titulados por ensaios de placa em células MDCK conforme previamente 10 descrito (Fodor et a1., 1999, J Virei 73:9679-9682, Hai et a1., 2008, J Viro] 82:10580-10590),
6.7.1.7 ENSAIO CINÉTICO DE CRESCIMENTO DE VÍRUS Para analisar as características de replicação de vírus recombinantes, ovos de galinha embrionados com 10 15 dias de idade foram inoculados com 100 unidades de formação de placa (pfu) de vírus recombinantes tipo selvagem ou de expressão de cHA. O fluido alantóico foi colhido e subsequentemente ensaiado para crescimento viral em 0, 9, 24, 48, e 72 horas pós-infecção (hpi). Os títulos de vírus 20 presentes no fluido alantóico foram determinados por ènsaios de placa em células MDCK conforme referenciado acima.
6.7.1.8 IMUNOCOLORAÇÃO DE PLACAS As placas foram visualizadas por imunocoloração 25 com mAb HT103 contra a nucleoproteína de influenza A (NP), usando um protocolo que foi previamente descrito (Bouvier et a1., 2008, Journal of Virology 82:10052-8; e Steel et a.i, 2009, J Vírol 83:1742-53).
6.7.1.9 WESTERN BLOT E ANÁLISE DE 30 IMUNOFLORESCÉNCIA INDIRETA
As células confluentes MDCK foram infectadas (multiplicidade de infecção [MOI] de 2) com vírus influenza recombinantes indicados ou vírus simulado infectado com uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 1 hora a 5 37°C. Em 12 horas hpi, as células foram usadas em tampão de carregamento de proteína 1X conforme descrito previamente (vide, por exemplo, Hai et a1., 2008, J Virol 82:10580-10590). Os lisatos celulares reduzidos foram analisados por análise Western blot utilizando-se anticorpos monoclonais (mAbs) contra nucleoproteína de vírus influenza A (NP) (HT103), domínio de cabeça HA PRO (PY102), domínio de cabeça HA Cal/09 (29E3), domínio de cabeça HA VN/04 (mAb #8) e 12D1, um anticorpo reativo pan- H3 contra o caule de HA. A fim de detectar os domínios de cabeça H7, utilizaram-se soros de cabra policlonal NR-3152 (elevados contra vírus A/FPV/Dutch/27 (H7), BEI Resources).
Um anticorpo anti-gliceraldeído 3-fosfato deidrogenase (GAPDH) (Abeam) foi usado para o controle de carregamento.
As proteínas foram visualizadas usando um sistema de detecção de proteína de quimioluminescéncia aprimorado (PerkinElmer Life Sciences). Para uma análise de imunoflorescência, as monocamadas confluentes de células MDCK em coberturas de vidro de 15-mm foram infectadas com vírus recombinantes em um MOI de 2. Em 15 hpi, as células foram fixadas e permeabilizadas com metanol-acetona (razão, 1:1) a -20°C durante 20 minutos. Após serem bloqueadas com 1% de albumina sérica bovina em PBS contendo 0,1% de Tween 20, as células foram incubadas durante 1 hora com os anticorpos descritos acima, bem como mAb 6F12. Após três lavagens com PBS contendo 0,1% de Tween 20, as células foram incubadas durante 1 hora com IgG anti-camundongo conjugada com Alexa Fluor 594 (Invitrogen) ou IgG anti- cabra conjugada com Alexa Fluor 594 (Invitrogen). Após as três lavagens finais, as células infectadas foram 5 analisadas por microscopia de fluorescência com um microscópio Olympus IX70.
6.7.1.10 ENSAIO DE REDUÇÃO DE PLACAS 0 ensaio de redução de placas foi realizado conforme descrito previamente (vide Wang et a1., 2010, PLoS Pathog 6:e1000796). Aproximadamente 60 a 80 pfu de vírus recombinantes que expressam cHA constituídos por domínios de cabeça globular Cal/09 ou VN/04 em cima de um caule PR8 foram incubados com ou sem concentrações diferentes (100, 20, 4, 0,8, 0,16 e 0,032 ug/ml) de mAb KB2, um anticorpo de caule anti-HA amplamente neutralizante gerado em nosso laboratório (dados não mostrados) durante 60 minutos em um volume total de 240 uL em temperatura ambiente. Uma camada confluente de células MDCK em placas de 6 poços foi lavada com PBS e, em seguida, incubada com a mistura de anticorpo- vírus durante 40 minutos a 37°C. Uma camada de agar de TPCK-tripsina suplementada com anticorpo nas concentrações descritas anteriormente ou sem anticorpos foi, então, adicionada a cada poço após o inoculo ter sido aspirado. AS placas foram incubadas durante 2 dias a 37°C. As placas foram visualizadas por imunocoloração (Bouvier et a1., 2008, Journal of Virology 82:10052-8; e Steel of a.l, 2009, J Virol 83:1742-53) com anticorpo NP anti-influenza A HT103.
6.7.1.11 ENSAIO DE NEUTRALIZAÇÃO DE PARTÍCULA DE PSEUDO-TIPO
0 procedimento para produção de partícula de pseudo-tipo foi o mesmo conforme descrito anteriormente, usando a construção cHA que é composta por um VN/04 (H5) ou uma cabeça Cal/09 (Hl) e um caule PR8 (H1) com o vírus 5 influenza B/Yamagata/16/88 NA. As partículas foram, então, incubadas com diferentes concentrações de mAb K82 em diluições de 5 vezes de 100 a 0,032 iig/mL. Então, essas misturas foram adicionadas às células MOCK. As transduções procederam durante 6 horas antes de as células serem lavadas e um meio fresco ser colocado sobre as células. Todas as transduções que usam partículas de pseudo-tipo foram realizadas na presença de 1 pg/mL de polibreno (Sigma, St. Louis, MO, EUA) (Tscherne et ai, 2010, J Virol Methods 163:336-43). Quarenta e oito horas pós-transdução, os ensaios de luciferase foram realizados a fim de ensaiar o grau no qual a entrada foi bloqueada por mAb KB2.
6.7.2 RESULTADOS:
6.7.2.1 GERAÇÃO DE HEMAGLUTININAS QUIMÉRICAS A fim de observar se os resíduos de cisteína que formam a ligação de dissulfeto Cys52-Cys277 foram conservados, um alinhamento de sequências de HA de vírus influenza A dos subtipos Hl, H3, H5 e H7 foi usado neste estudo. Devido ao fato desses resíduos de cisteína serem altamente conservados através dos subtipos HA, para HAs de grupo 1 e grupo 2, a ligação de dissulfeto Cys52-Cys277 foi usada como um ponto de delineação entre os domínios de cabeça e caule. Definindo-se a sequência entre Cys52 e Cys277 como a região de cabeça, e o restante da molécula como o caule, racionalizou-se que poderiam ser feitas construções que codifiquem as combinações de cabeça e caule inovadoras a partir de uma variedade de subtipos HA (Figuras 31A e 31B).
0 grau de identidade de aminoácido que existe entre as regiões de caule de subtipos de hemaglutinina nos 5 leva a creditar que a troca de domínios de cabeça pode ser possível. Porcentagens maiores de identidade de aminoácido foram observadas nos domínios de caule ao longo de todos os subtipos, comparados aos domínios de cabeça (Figura 32).
Todos os 16 subtipos de influenza HA são classificados em dois grupos filogenéticos (Palese e Shaw, 2006, Orthomyxoviridae: the viruses and their replication, Fields virology, 5a ed., 1647-1690). Devido ao fato de porcentagens maiores de identidade de aminoácido serem observadas dentro das regiões de caule de um grupo particular (Figura 32), e devido ao fato de um vírus cHA que contém os domínios de cabeça e caule de vírus de grupo 1 terem sido gerados com sucesso (Pica et a1., 2012, PNAS 109:2573-8), realizou-se uma tentativa de gerar cHAs de intra-grupo. Para o grupo 1, duas construções de hemaglutinina quimérica que codifica a HA pandêmica H1 Cal/09 ou domínio de cabeça globular VN/04 com a região de caule de HA PR8 (Hl) (cHl/1 e cH5/1, respectivamente) foram geradas (Figura 31B). Aplicou-se uma estratégia similar para gerar uma HA quimérica que expressou os domínios de cabeça e caule a partir de cepas de influenza de grupo 2 diferentes: a cabeça de Alb/01 (H7, grupo 2) e a região de caule de HA Perth/0P (H3, grupo 2) (cH7/3) (Figura 1B). Finalmente, avaliou-se se os domínios de cabeça e caule poderiam ser trocados para produzir uma HA quimérica de inter-grupo contendo o domínio de cabeça de VN/05 HA (H5,
grupo 1) em cima de um caule de HA Perth/09 (H3, grupo 2) (cH5/3) (Figura 31B).
Após a construção desses plasmídeos, realizaram- se experimentos para determinar se as construções de HA 5 quimérica diferentes poderiam ser expressas e transportadas às HAs tipo selvagem semelhante à superfície celular. A análise de classificação de célula ativada por fluorescência (FACS) de células 293T transientemente transfectadas foi realizada seguindo a coloração superficial com anticorpos específicos de domínio de caule H1 e H3, respectivamente. Usando este método, a expressão de superfície celular de todas as quatro construções quiméricas foi detectada (Figura 33). No entanto, comparado à HA PR8 tipo selvagem, menos expressão de proteína superficial foi detectada para a construção cHl/1, que poderia ser atribuída ao caráter inerente associado ao domínio de cabeça da HA Cal/09 ou uma eficiência de transfecção inferior para esta construção de DNA quimérico.
Além disso, nota-se que existem diferenças no padrão de expressão de superfície celular para as construções cH7/3 e cH5/3. Este padrão de expressão de "pico duplo" foi observado somente em condições de transfecção, e foi reproduzível. Este não foi detectado mediante uma infecção com vírus recombinantes de expressão de cH7/3 ou cH5/3 (Figura 33). Portanto, esses dados indicam que as cHAs podem ser transportadas através do complexo de Golgi até a superfície celular.
A seguir, as características de entrada das diferentes cHAs através da transdução de células MDCK foram examinadas usando partículas de pseudo-tipo retroviral que continham uma construção de repórter de luciferase e expressaram a cHA e o vírus B/Yamagata/16/88 NA tipo selvagem na superfície de partícula. A eficiência de entrada mediada pelas proteínas de cHA foi detectada pela 5 leitura de luciferase. Os níveis comparáveis de expressão de luciferase mediada por partículas de pseudo-tipo foram observados para HAs quiméricas cH5/l, cH7/3 e cH5/3 e as proteínas tipo selvagem correspondentes (Figura 34). As partículas que codificam a HA CHl/l expressaram níveis de luciferase inferiores comparados a outras construções de HA, que poderiam ocorrer devido à expressão inferior do cHl/l na linhagem celular produtora e, logo, menos trímeros de HA por partícula ou as propriedades de entrada menos eficientes da HA cHl/l. Também é possível que ao normalizar as partículas de pseudo-tipo para 4 unidades de hemaglutinina, a quantidade real de partículas de pseudo- tipo possa variar devido às diferenças em ligação a hemácias.
6.7.2.2 GERAÇÃO DE VÍRUS INFLUENZA
RECOMBINANTES PORTANDO HEMAGLUTININAS QUIMÉRICAS Devido ao fato de se ter determinado que nossas construções de cHA foram eficientemente expressas e transportadas à superfície celular, realizou-se um estudo para avaliar que um vírus influenza recombinante que codifica uma cHA poderia ser resgatado. Os vírus contendo as diferentes cHAs foram gerados com sucesso usando protocolos previamente publicados (vide, por exemplo, Fodor et a1., 1999, J Viral 73:9679-9682; e Hai eL a1., 2008, J Viral 82:10580-10590). Os vírus resultantes foram purificados por placas, amplificados em ovos embrionados com 10 dias de idade e os segmentos quiméricos foram analisados por RT-PCR e sequenciados. Em todos os casos, constatou-se que o vírus tem o segmento de HA quimérica esperado e nenhum outro segmento de HA (dados não 5 mostrados).
A presença das cHAs em vírus resgatados foi adicionalmenteconfirmada por Western blot e imunoflorescéncia indireta de células infectadas (Figuras 3A e 3B). As células MDCK foram infectadas com rWT PR8, vírus Perth/09, cHl/l, cH5/l, cH7/3 e cH5/3 tipo selvagem (Figuras 3A e 3B). As proteínas de HA quimérica cHl/l e cH5/1 foram detectadas nas amostras correspondentes usando anticorpos reativos contra os domínios de cabeça de HA (29E3) Cal/09 (H1) (Medina et a1., 2010, Nature 15 Communications 1:28) ou VN/04 (H5) HA (mAb #8) (Steel et a1., 2009, J Virei 83:1742-53) respectivamente (Figura 3A).
Os níveis de expressão comparáveis dentre cH7/3, cH5/3 e HA Perth HA tipo selvagem usando 12D1, um mAb anti-caule pan- H3 (vide Wang et a1., 2010, PLoS Pathog 6:e1000796) . A HA Perth tipo selvagem mostrou uma migração mais lenta no gel que ocorre provavelmente devido a um número maior de sítios de glicosilação no domínio de cabeça globular. Confirmou-se que a HA de domínio de cabeça correta foi expressa em cima de um caule H3 utilizando-se anticorpos policlonais anti-H7 25 (NR-3152) ou monoclonais anti-H5 (mAb #8) em amostras de infecção cH7/3 ou cH5/3, respectivamente. As bandas positivas foram detectadas em ambos os casos.
Para um estudo de imunoflorescéncia, as condições de infecção foram similares àquelas usadas para análise Western blot. As células infectadas foram tingidas com anticorpos correspondentes conforme usado na Figura 35. Todas as células infectadas mostraram a expressão esperada das HAs quimérica e tipo selvagem, bem como do vírus influenza A NP (Figura 36). 5 6.7.2.3. CARACTERÍSTICAS DE REPLICAÇÃO DE VÍRUS
RECOMBINANTES As propriedades de crescimento de vírus recombinantes tipo selvagem foram avaliadas em ovos de galinha embrionados com 10 dias de idade a 37°C (Figura 10 37A). 0 vírus PR8 rWT foi inoculado para comparação da cinética de crescimento dos vírus recombinantes que expressam HAs quiméricas. Os vírus cH5/1 e cH5/3 exibiram uma cinética de replicação comparável àquela do vírus PR8 rWT. 0 vírus cH7/3 cresceu em títulos de pico similares a 15 rWT PR8 em 48 hpi (1X109 PFU/mL), embora existisse uma redução de 2 log em título viral comparada ao vírus PR8 rWT em 9 hpi. 0 vírus cHl/1 foi atenuado comparado ao vírus PR8 rWT, conforme mostrado por títulos virais reduzidos em todos os pontos de tempo. Todavia, o vírus cHl/l alcançou 20 um título de pico respeitável de aproximadamente 10 8 PFU/mL.
0 vírus tipo selvagem. Perth/09 cresce em títulos de pico comparáveis em ovos embrionados (dados não mostrados).
0 fenótipo de placa de cada vírus quimérico também foi avaliado em células MDCK. Todos os vírus 25 formaram placas com tamanhos comparáveis conforme mostrado na Figura 37B. Esses resultados confirmam que as construções de HA quimérica se enovelaram in vivo e são biologicamente funcionais.
6.7.2.4 ANTICORPOS CAULE-ESPECÍFICOS PODEM 30 NEUTRALIZAR VÍRUS E PSEUDO-PARTÍCULAS DE EXPRESSÃO DE cHA
Finalmente, anticorpos caule-específicos foram testados para a capacidade de neutralizar vírus recombinantes recentemente gerados que expressam cHAs. Realizaram-se ensaios de redução de placas na presença de 5 mAb KB2, um anticorpo caule-específico HA com ampla reatividade de grupo 1 ou sem anticorpo. Mostrou-se que mAb KB2 neutraliza todos os vírus de expressão de cHA com eficiência similar e de maneira dose-dependente. Em 100ug/mL, mAb KB2 foi capaz de neutralizar completamente vírus cHl/l e cH5/1 com 100% de eficiência, com alguma atividade de neutralização em concentrações tão baixas quanto 4ug/mL (Figura 38Ay.
Par confirmar esses resultados, realizou-se um ensaio de inibição de partícula de pseudo-tipo cm mAb KB2. As partículas de pseudo-tipo que expressam cHl/1 ou cH5/1 e vírus influenza B NA foram adicionadas às células MDCK na presença de mAb KB2, ou sem anticorpo. Quarenta e oito horas pós-trasdução, o sobrenadante foi coletado e a atividade de luciferase foi analisada. Conforme esperado, mAb KB2 bloqueou a entrada de partículas de pseudo-tipo cHl/l e cH5/1 de maneira dose-dependente em concentrações acima de 4ug/mL. Embora uma concentração menor de mAb KB2 seja suficiente para inibir a entrada de partículas de pseudo-tipo comparadas a concentrações usadas no ensaio de redução de placas, este foi um resultado esperado devido à incorporação inferior presumida de trímeros HA sobre a superfície de partículas de pseudo-tipo (Corti et a1., 2010, The Journal of Clinical Investigation 120:1653-73). Este fenômeno de diferentes potências de neutralização de mAbs em ensaios que envolvem vírus completos versus partículas de pseudo-tipo foi apreciado em outros estudos (Corti et a1., 2010, The Journal of Clinical Investigation 120:1663- 7321; Sui et al., 2009, Nature Structural & Molecular Biology 16:265-73). 5 6.7.3 CONCLUSÃO Desenvolveu-se uma nova estratégia para gerar vírus influenza com proteínas de HA quimérica portando diferentes domínios de cabeça globular HA levando-se vantagem da ligação de dissulfeto conservada Cys52-Cys277 10 que demarca o limite entre os domínios de cabeça e caule. Portanto, através da substituição do domínio de cabeça parental pelo domínio de cabeça de outra HA, gerou-se um painel de HAs quiméricas com o mesmo caule, mas cabeças globulares diferentes. 0 design foi testado em múltiplos 15 subtipos, incluindo o domínio de caule PR8 com cabeças globulares Cal/09 e VN H5. Além disso, uma cabeça globular H7 foi colocada em um domínio de caule H3. Essas construções abrangem ambos os grupos filogenéticos da proteína de HA de influenza. Cada construção foi expressa 20 sobre a superfície celular e reteve a atividade de fusão conforme mostrado na Figura 12. A geração de vírus recombinantes portando as HAs quiméricas validou, ainda, que as HAs se enovelaram corretamente e retiveram as funções biológicas. 25 6.8 EXEMPLO 8: VACINAS DE VÍRUS INFLUENZA H1N1 DE 1976 E 2009 ESTIMULADAS COM ANTICORPOS DE CAULE ANTI-
HEMAGLUTININA EM HUMANOS Este exemplo demonstra que indivíduos que receberam a vacina de vírus influenza A/New Jersey/1976 30 mostraram títulos elevados de anticorpos de caule de hemaglutinina em relação a controles de idades correspondidas, Esses indivíduos de controle experimentaram um estímulo em anticorpos de caule anti-hemaglutinina após receber a vacina A/California/04/09, enquanto os indivíduos 5 tendo recebido a vacina A/New Jersey/1976 não. Este demonstra a utilidade de polipeptideos de hemaglutinina de vírus influenza quiméricos para detectar a presença de anticorpos anti-tronco/caule no soro.
6.8.1 MATERIAIS E MÉTODOS 10 6.8.1.1 AMOSTRAS DE SORO HUMANO Os soros humanos foram coletados em outubro de 2009 de indivíduos que receberam a vacina NJ/76 (n=20, idade média = 62) e de controles de idade correspondida (n=15, idade média = 57). Os indivíduos que experimentaram 15 uma doença tipo influenza dentro de quatro meses antes do início do estudo foram excluídos. Todos os indivíduos foram administrados com a vacina tipo Cal/09 monovalente entre outubro de 2009 e janeiro de 2010. Seis a oito meses após receberem a vacina Cal/09, os indivíduos retornaram para 20 fazer uma coleta de sangue pós-vacinação (5 de 20 vacinas NJ/76; 7 de 15 indivíduos de controle). Devido a quantidades limitadas de soro disponível, volumes iguais de soros de vacinação pré- e pós-Cal/09 foram agrupados a partir de indivíduos aos quais ambas as amostras estavam 25 disponíveis (vacinas NJ/76 = 5; indivíduos de controle = 7) e esses agrupamentos foram, testados, em múltiplos ensaios.
6.8.1.2 CÉLULAS E VÍRUS Células renais caninas Madin-Darby (MUCK) foram obtidas a partir de ATCC e foram mantidas em um meio de 30 Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco) suplementado
P, com 10 de soro bovino fetal (FCS, Hyclone) e 100 U/ml de penicilina e estreptomicina (Gibco). Cal/09 foi propagado em células MDCK em DMEM contendo 1 }ig/ml tripsina tratada com 1-1-tosilamida-2-feniletil clorometil cetona (TPCK) 5 (Sigma-Aldrich). Um vírus A/duck/France/MB42/1976 (França/76) foi propagado em ovos de galinha embrionados com 10 dias de idade, a vírus cH5/1 N3 foi gerado usando um sistema de genética reversa descrito previamente (vide, por exemplo, Fodor et al., J Virol 1999; 73:9679-82; Neumann et 10 al., Proc Natl Acad Sci U S A 1999; 96:9345-50). os plasmídeos de genética reversa que codificam vRNA e mRNA incluem os seis segmentos virais WT de A/Puerto Rico/8/34 (PR8) bem como plasmídeos que codificam cH5/1 HA e N3 NA a partir do vírus A/Swine/Missouri/4296424/06 (Miss/06). A 15 sequência do cH5/1 e N3 RNA foi confirmada pelo sequenciamento de produtos RT-PCR. Todas as infecções foram realizadas usando DMEM suplementado com 1 }ag/ml de tripsina (meio de infecção).
6.8.1.3 EXPRESSÃO DE PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS 20 DE VIRUS TNFTTUF.N7A RF(rnMRTNú.11TR Sequências de codificação para o ectodominio N- terminal de HAs a partir de PR8, vírus A/New Caledonia/20/99 (NC/99) e cH6/1 (vide, por exemplo, Pica et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2012; 109:2573-80). HAs foram 25 clonados em armação em um vetor pFastBac modificado (Invitrogen) com um tag de hexa-histidina C-terminal e domínio de trimerização T4. O baculovírus recombinante (rBV) foi gerado de acordo com as recomendações do fabricante. Células BTI-TN5B1-4 (High Five) (Krammer et al., Moi 30 Biotechnol 2010; 45:226-34) desenvolvidas em um meio
A * celular de inseto SFX HyClone (Thermo Fisher Scientific) foram infectadas com rBV que expressa HAs em uma multiplicidade de infecções (MOI) de 10 e uma densidade celular de 1 x 10 6 células/m1 em frascos agitadores de 500 5 ml. As células foram colhidas 72 a 96 horas pós-infecção e separadas do sobrenadante por centrifugação de baixa velocidade durante 10 minutos a 2000 x g em temperatura ambiente (RT). O sobrenadante (250 ml) foi coletado e incubado com 3 ml de resina Ni-NTA (Qiagen) durante 2 horas 10 a 4°C. A pasta fluida foi carregada nas colunas e lavada três vezes com um tampão de lavagem (50 mM de Na 2HCO3, 300 mM de NaC1, 20 mM de Imidazola, pH 8). A proteína foi eluida em etapas de 0,5 ml com um tampão de eluição (50 mM de Na2HCO3, 300 mM de NaCl, 250 mM de Imidazola, pH 8) e 15 testada para determinação do teor de proteína com reagente de Bradford. As frações contendo proteínas foram agrupadas e concentradas usando unidades de centrifugação Amicon Ultracell (Millipore) com um corte de 30 kDa e o tampão foi trocado para uma solução salina tamponada de fosfato (PBS) 20 de pH 7,4. A pureza e a identidade da proteína foram testadas por SDS-PAGE, coloração Coomassie e Western blot.
A concentração de proteína foi determinada com reagente de Bradford.
6.8.1.4 DETERMINAÇÃO DE TÍTULO FINAL DE 25 IMUNOGLOBULINA G (I G) Os títulos finais de IgO foram determinados por um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA). Em resumo, placas com 96 poços (Immulon 2; Nune) foram revestidas com 2 pg/ml de HA recombinante purificado ou com 30 albumina sérica bovina (BSA) em um tampão de r 1 carbonato/bicarbonato, pH 9, de um dia para o outro a 4°C.
As placas foram bloqueadas durante 1 hora em temperatura ambiente com 5% de leite desnatado e foram lavados três vezes com PBS/0,025% de Tween-20 (PBS-T). O soro foi 5 diluído serialmente em 5% de leite desnatado e adicionado aos poços. As placas foram incubadas durante 1 hora em temperatura ambiente, após este período de tempo, foram lavados três vezes com PBS-T. O anticorpo secundário de IgG de cabra anti-humano ligado à peroxidase de rábano 10 silvestre (HRP) (Meridian Life Science Inc.) foi diluído 1:5000 em 5% de leite desnatado antes da adição aos poços e incubação durante 1 hora em temperatura ambiente. As placas oram novamente lavadas três vezes com PBS-T antes da adição do substrato de peroxidase (SigmaFAST OPD, Sigma-Aldrich).
15 A incubação com substrato ocorreu durante 5 minutos em temperatura ambiente antes que as reações fossem interrompidas pela adição de 3M de HC1. Coletaram-se medições de densidade óptica em 490 nm. As densidades ópticas acumuladas contra HAs foram subtraídas daquelas 20 medidas contra BSA para cada diluição de soro individual, para normalizar contra um sinal não-específico. O sinal de fundo foi calculado para cada antígeno específico com base na reatividade de anticorpo secundário somente. os títulos finais T foram definidos como tendo uma densidade óptica pelo 25 menos três desvios padrão acima da base após a subtração do sinal não-específico (BSA).
6.8.1.5 ENSAIOS DE INIBIÇÃO DE HEMAGLUTINAÇÃO (HAI) Inibidores não-específicos de hemaglutinação 30 foram removidos tratando-se soros com 8 mg/ml de TPCK-
i tripsina a 0,5 volume (Sigma-Aldrich) a 56°C durante 30 minutos. As amostras foram, então, resfriadas até a temperatura ambiente antes da adição de três volumes de 11 mM de uma solução de periodato de potássio (Sigma-Aldrich). 5 Após a incubação de amostras corn periodato de potássio durante 15 minutos em temperatura ambiente, três volumes de uma solução salina de glicerol a 1% foram adicionados às amostras que foram novamente incubadas durante 15 minutos em temperatura ambiente. Finalmente, 1,5 volumes de uma 10 solução salina a 0,85% foram adicionados às amostras antes do uso. Todos os volumes estão em relação ao volume inicial de soro. Os ensaios de hemaglutinação foram primeiramente realizados em placas de 96 poços com fundo em V (Nunc) usando 0,5% de hemácias de galinha (cRBCs, Lampire 15 Biological Laboratories) para determinar a diluição de vírus que produziria três poços de hemaglutinação, O vírus e os anticorpos foram misturados e incubados durante 30 minutos em temperatura ambiente. cRBCs foram, então, adicionados aos poços e as placas foram incubadas em gelo 20 durante aproximadamente 30 minutos antes da leitura.
6.8.1.6 ENSAIOS DE MICRONEUTRALIZAÇÃO Em resumo, 50% de doses infecciosas de cultura de tecido (TCID50) foram determinadas para vírus cH5/1 N3 e Cal/09 por diluição serial em células MDCK. Após a infecção, 25 as células foram incubadas durante 20 horas a 37°C, 5% CO2. As células foram fixadas com 80% de acetona e bloqueadas com 3% de peróxido de hidrogênio e 5% de leite desnatado. As células foram provadas com uma diluição 1:2000 de anti- NP de camundongo conjugado com biotina (Millipore) seguida 30 por uma diluição 1:5000 de estreptavidina secundária conjugada com HRP (Millipore). Adicionou-se o substrato de peroxidase (SigmaFAST, Sigma-Aldrich) aos poços durante 20 minutos em temperatura ambiente antes que as reações fossem interrompidas com 3M de HC1. Para ensaios de 5 microneutralização, 200 TCID50/100 p1 foram adicionados aos poços de soro serialmente diluído (em meio de infecção) que foram pré-tratados com TPCK-tripsina conforme descrito anteriormente. O soro e os vírus (cH5/1 N3 ou Cal/09) foram incubados durante 1 hora a 37°C. As misturas de soro/virus foram transferidas em placas de 96 poços de células confluentes MDCK que foram incubadas durante 1 hora a 37 °C, 5% de CO2 para permitir a absorção. As placas foram lavadas duas vezes com PBS e foram re-incubadas durante 20 horas com um meio de infecção contendo concentrações equivalentes de soro diluído. Os tratamentos de fixação e anticorpo foram idênticos àqueles usados durante a determinação de TCID50 . Os títulos de neutralização foram definidos como a diluição de soro que resultou em pelo menos 50 % de inibição de infectividade. 20 6.8.2 RESULTADOS
6.8.2.1 VACINAS NJ/76 TINHAM TÏTULOS ELEVADOS DE ANTICORPOS DE CAULE DE HA ANTES DA VACINAÇÃO CAL/09 Imagina-se que os anticorpos de caule de HA sejam estimulados de modo mais eficiente no contexto de infecção quando indivíduos forem expostos a HAs cujos domínios de cabeça diferem substancialmente das exposições anteriores, mas cujos domínios de caule permaneçam conservados (vide, por exemplo, Palese and Wang, Maio 2011; 2). Uma comparação de sequência de aminoácido de HAO de A/Fort Warren/1/50 30 (FW/50, sazonal), NJ/76 (origem suína), NC/99 (sazonal) e
Cal/09 (origem suína) ilustra este ponto (Tabela 12). HAs Cal/09 e NJ/76 compartilham 79,9% e 82,5% de sequência de identidade de aminoácido, respectivamente, quando comparadas a HA de cepa NC/99 sazonal. De modo similar, o 5 grau de identidade entre NJ/76 e a cepa FW/50 sazonal em pré-circulação foi de 83,0%. No entanto, quando analisado adicionalmente, torna-se aparente que o maior grau de identidade dentre essas proteínas está presente no domínio de caule HA (Cal09 vs. NC/99 = 88,9% de identidade; NJ/76 10 vs. NC/99 = 91,6% de identidade; NJ/76 vs. FW/50 = 90,9% de identidade), enquanto os domínios de cabeça dos His de origem suína diferem substancialmente daqueles da H1 sazonal (Cal/09 vs. NC/99 = 67,1% de identidade; NJ/76 vs.
NC/99 = 69,7% de identidade; NJ/76 vs. FW/50 = 69,8% de 15 identidade). Apesar de um intervalo de mais de 30 anos de seu surgimento em seres humanos, as His de origem suína exibem um grau muito maior de identidade entre si do que as His sazonais (HAO = 91,0o de identidade; domínio de cabeça = 85,96 de identidade; domínio de caule = 94,6% de 20 identidade). Portanto, é possível que de maneira análoga à infecção Cal/09 (vide, por exemplo, Pica et al.,. Proc Natl Acad Sci U S A 2012; 109:2573-8) , os receptores da vacina NJ/76 pode ter passado por um estímulo em anticorpos de caule de HA antes da exposição de Cal/09. 25 TABELA 12: Comparação de sequência de aminoácido de hemaglutinina de cepas Cal/09, NJ/76, NC/99 e FW/50 Resíduos de Proteína cabeça globular Caule Comparação completa (HAO) 52-277 de (% de (% de numeração H3 identidade) (% de identidade) identidade) Cal/09 vs. NJ/76 91,0 85,9 94,6
599 /648
FA Cal/09 vs. NC/99 79,9 67,1 88,9 NJ/76 vs. NC/99 82,5 69,7 91,6 NJ/76 vs. FW/50 83, 0 69,8 90, 9 Dada a similaridade da HA NJ/76 àquela da HA Cal/09 (e o grau de diferença entre HA NJ/76 e HA FW/50) , determinou-se se os indivíduos que receberam a vacina NJ/76 teriam títulos maiores de anticorpos caule-reativos do que aqueles que não receberam, antes da vacinação com Cal/09. Os soros de indivíduos que receberam a vacina de 1976 (n=20) foram comparados aos soros de indivíduos com idade correspondida que não receberam a vacina (n=15). Os títulos de IgG finais contra cH6/1 e NC/99 foram determinados por ELISA. A proteína cH6/1 HA contém um caule Hl, mas uma cabeça H6. Visto que a exposição de seres humanos a H6 IAVs é improvável, esta proteína serve como uma ferramenta útil para a detecção dos anticorpos de ligação à caule de HA grupo 1, conforme foi recentemente mostrado (vide, por exemplo, Pica et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2012; 109:2573-8). Visivelmente, as vacinas NJ/76 elevaram significativamente os títulos finais de IgG comparados a indivíduos de controle contra HA cH6/1 (Figura 39A). Não existia nenhuma diferença significante entre os dois grupos em títulos fins de IgG contra a HA NC/99 sazonal, demonstrando que este fenômeno foi específico para anticorpos de caule de HA (Figura 39B). Devido à escassez de amostras disponíveis, agrupamentos de soro de vacinação pré- e pós-Cal/09 foram, então, gerados a partir de todos os pacientes em ambos os grupos aos quais ambas as amostras estavam disponíveis (vacinas NJ/76 = 5/20; indivíduos de controle = 7/15). Os títulos finais de IgG dos agrupamentos de vacinação pré-Cal/09 de cada grupo foram, então, determinados contra HAs cH6/l e NC/99, para garantir que reflitam precisamente os dados coletados de pacientes individuais (Figuras 39A e 39B) e poderiam ser usados para aplicações a jusante. De fato, o agrupamento de vacina NJ/76 exibiu um título final substancialmente elevado contra HA cH6/l comparado ao agrupamento de controle (Figura 39C). No entanto, não existiam diferenças em títulos finais de IgG contra HA NC/99 entre os dois grupos (Figura 39D). Esses dados demonstram que as vacinas NJ/76 elevaram os títulos de anticorpos de caule anti-HA antes de receber a vacina Cal/09.
6.8.2.2 VACINAS NJ/76 TINHAM TÌTULOS HAI PROTETORES CONTRA CAL/09 ANTES DA VACINAÇÃO CAL/09 Somente os receptores de vacina NJ/76 tinham títulos de HAI protetores contra Cal/09, enquanto 5 indivíduos não-vacinados não tinham (Figura 40A). Para garantir novamente a confiabilidade dos resultados de HAI agrupados, os ensaios de HAI foram realizados contra Cal/09 com soro de cada indivíduo incluído nos agrupamentos. Conforme foi o caso com os títulos finais, os resultados foram consistentes e significativos, demonstrando que o soro agrupado ferncceu uma representação precisa da população (Figura 40B). Nenhuma atividade de HAI foi observada contra o vírus France/76 (H6N4) em nenhuma amostra, confirmando que nenhum dos indivíduos teve exposição prévia aos vírus H6 (Figura 40A). Tomados juntos, estes resultados confirmam que as vacinas NJ/76 passaram por um estímulo em anticorpos HAI que se ligaram à cabeça globular de HA Cal/09 antes da vacinação Cal/09.
6.8.2.3 TÌTULOS DE ANTICORPO DE CAULE ANTI-HA
FORAM ESTIMULADOS EM INDIVÌDUOS DE CONTROLE SUBSEQUENTE À VACINAÇÃO CAL/09 A observação que os indivíduos infectados com 5 p2009 IAV tinham títulos elevados de anticorpos de caule anti-HA (vide, por exemplo, Pica et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2012; 109:2573-8), como aqueles imunizados com a vacina NJ/76, levou à investigação se a vacinação com Cal/09 também estimularia os títulos de anticorpo de caule anti-HA. Neste sentido, tanto os indivíduos de controle como as vacinas NJ/76 foram administrados como uma vacina Cal/09 monovalente entre outubro de 2009 e janeiro de 2010. Os indivíduos retornaram para coletar sangue pós-vacinação de seis a oito meses depois. Os títulos finais de IgG contra HA NC/99 e HA cH6/1 foram determinados para soro pós-vacinação agrupado a partir de ambos os grupos por ELISA. Estes foram comparados aos valores de pré-vacinação determinados nas Figuras 39B e 39D a fim de calcular a alteração de enovelamento em títulos de IgG contra cada vacinação pós-Cal/09 de proteína de HA (Tabela 13). Os títulos finais de IgG de indivíduos de controle se elevaram mais de duas vezes contra cH6/1, enquanto os títulos finais de IgO de vacinas NJ/76 não aumentaram. Não se observaram estímulos contra HA NC/99 em qualquer grupo, conforme seria esperado. Esses dados indicam que a vacinação Cal/09 também é capaz de estimular títulos de anticorpos de caule anti-HA, mas somente em indivíduos que não foram previamente expostos a NJ/76.
TABELA 13:Alterações de título final de IgG de vacinação pós-Cal/09 contra NC/99 HA e cH6/1 HA
Controle 1976 Vacinas Proteína HA Vacinação Vacinação Alteração de Vacinação Vacinação Alteração de Pré-Cal/09 Pós-Cal/09 enovelamento Pré-Cal/09 pós-Cal/09 enovelamento cH6/1 N.H. 200 >2 800 800 1 NC/99 1600 1600 1 1600 800 0,5 *N.D.= não detectado
6.8.2.4 VACINAÇÃO COM ANTICORPOS DE NEUTRALIZAÇÃO ESTIMULADOS NJ/76 OU CAL/09 CONTRA VÌRUS
CONTENDO UM CAULE DE HA HOMÓLOGO E UMA CABEÇA DE HA 5 HETERÔLOGA Determinou-se a seguir se o estímulo em anticorpos de caule anti-HA experimentado após a vacinação NJ/76 ou Cal/09 correspondia a títulos de neutralização aprimorados contra vírus contendo um caule de HA homólogo 10 um domínio de cabeça HA hetero-subtípico. Para testar isto, um ensaio de microneutralização foi realizado contra um vírus cH5/1 N3 usando os soros agrupados. O vírus cH5/l N3 foi usado para detectar a presença de anticorpos de neutralização de caule de HA, visto que este contém um 15 domínio de cabeça HA H5, um caule HA PRB, e um N3 de Miss/06. De acordo com os dados de título final de IgG contra cH6/1, os soros de vacinas NJ/76 também exibiam títulos de neutralização acentuadamente mais potentes contra cH5/1 N3 do que os indivíduos de controle exibiam 20 antes da vªcinarão com Cal/09 (2430 vs. 90). No entanto, somente os indivíduos de controle experimentaram um estímulo em anticorpos de neutralização subsequentes à vacinação (810, até 90) (Figura 41A). As vacinas NJ/76 tinham títulos de neutralização contra Cal/09 que eram 3 25 vezes mais potentes do que os indivíduos de controle antes da vacinação Cal/09 (90 vs. 30). Ambos os grupos experimentaram um estímulo em títulos de anticorpo de r neutralização contra Cal/09 subsequente à vacinação Cal/09 (Figura 41B). Tomados juntos, esses dados demonstram que os anticorpos de caule anti-HA estimulados com vírus H1N1 1976 e 2009 correspondem a uma capacidade aumentada de 5 neutralizar vírus que aloja um caule de HA homólogo e um domínio de cabeça HA hetero-subtípico.
6.8.3 CONCLUSÃO Este exemplo demonstra que as vacinas H1N1 de 1976 e 2009, ambas contendo HAs H1 suínas clássicas, são 10 capazes de estimular títulos de anticorpos de caule HA. Adicionalmente, os anticorpos de caule anti-HA produzidos pela vacinação parecem ter vida longa e podem proporcionar uma proteção parcial contra diversas cepas IAV.
6.9 EXEMPLO 9: CONSTRUÇÕES DE HEMAGLUTININA 15 QUIMÉRICA COMO UMA VACINA DE ÏNFLUENZA UNIVERSAL Este exemplo demonstra a eficácia protetora de uma resposta imune caule-específica que pode ser produzida através de vacinação com construções de hemaglutinina quimérica (cHA), proteínas que contêm combinações 20 exclusivas de cabeça e caule de hemaglutinina.
6.9.1 MATERIAIS E MÉTODOS
6.9.1.1 CÉLULAS E VÍRUS Células 293T e MDCK foram obtidas junto a ATCC e foram mantidas em um meio de Eagle Modificado por Dulbecco 25 (DMEM) e Meio Essencial Mínimo (ambos junto a Gibco). Cada uma dessas foi suplementada com 10% de soro bovino fetal (HyClone), e 100 unidades/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Pen/Strep, Gibco).
Os vírus influenza A/Fort Monmouth/1/1947 (FM1) e 30 A/Netherlands/602/2009 foram passados nos pulmões de camundongos e, então, desenvolvidos em ovos de galinha embrionados com 10 dias de idade durante 48 horas. Um vírus reassortante A/Vietnam/1203/04 (VNO4):PR8 2:6 com baixa patogenicidade com o sítio de clivagem polibásico removido 5 (vide, por exemplo, Steel et al., 2009, J Virol 83:1742- 1753) e o vírus B/Yamagata/16/1988 foram desenvolvidos em ovos embrionados com 10 dias de idade durante 48 horas a 37°C ou 72 horas a 33°C, respectivamente.
Os vírus influenza recombinantes foram produzidos por um sistema de genética reversa conforme descrito anteriormente (vide, por exemplo, Quinlivan et al., 2005, J Virol 79:8431-8439). O vírus cH9/1 Ni, um vírus que expressa o domínio de cabeça globular HA de um vírus H9 em cima de um caule Hl (do vírus PR8), e vírus cH5/1 (cabeça H5 (VN04), caule H1) Ni foram resgatados de maneira similar conforme previamente descrito (vide, por exemplo, Pica et al., 2012, PNAS USA 109:2573-2578) . A fim de gerar o vírus YAM -HA, o domínio extracelular da HA B/Yamagata/16/1988 (WT YAM) foi substituído pelo domínio correspondente de HA de vírus A/Puerto Rico/8/1934 (vide, por exemplo, Hai et al., 2011, Journal of virology 85:6832-6843). Os plasmideos de genética reversa que codificam os outros 7 segmentos virais WT YAM foram construídos em um estudo anterior (vide, por exemplo, Hai et al., 2008, J Virol 82:10580-10590). Após o resgate, os vírus recombinantes de expressão de cHA foram propagados em ovos de galinha embrionados com 10 dias de idade durante 48 horas a 37°C. 0 vírus YAM-HA foi desenvolvido em ovos de galinha embrionados com 8 dias de idade durante 72 horas a 33°C.
Os vírus recombinantes e tipo selvagem foram titulados em células MDCK (ATCC) na presença de tripsina TPCK conforme descrito anteriormente. O vírus cH5/1 Ni foi parcialmente purificado por um colchão de sacarose a 30% 5 para uso em ensaios de ELISA. Os vírus cH9/1 Ni, cH5/1 Ni e FM1 foram purificados através de centrifugação de gradiente e inativados com formaldeído diluído (1:4000) em PBS a ser usado como vacinas de controle positivo.
6.9.1.2 GERAÇÃO DE CONSTRUÇÕES DE PROTEÍNA 10 CH6/1 E CH9/1 As proteínas cH6/1 e cH9/1 solúveis foram geradas usando um sistema de expressão de baculovírus conforme descrito anteriormente (vide, por exemplo, Pica et al., 2012, PNAS USA 109:2573-2578). Em resumo, os vetores de báculo-transferência foram primeiramente gerados seguidos pela transfecção de bacmidas em células Sf9. Os baculovírus recombinantes foram, então, usados para infectar células High Five em um MOI de 10. Os sobrenadantes foram coletados 96 horas pós-infecção e, então, incubados com resina Ni-NTA 20 (Qiagen) durante 2 horas a 4°C para purificar as proteínas cHA recombinantes marcadas com His. A pasta fluida foi carregada nas colunas, e após lavagens, foi eluida em um tampão de eluição com pH 8 (50 mM de Na?HCO3i 300 mM de NaCl, 250 mM de imidazola). As frações agrupadas que continham proteínas foram trocadas por tampão em PBS e concentradas usando uma unidade de filtro centrífugo Amicon Ultra (Millipore) com um corte de peso molecular de 10 kD em um rotor com cesta oscilante. A pureza e a e a identidade da proteína foram testadas por SDS/PAGE,
coloração Coomassie e Western blot. As concentrações de proteína finais foram determinadas com reagente de Bradford.
6.9.1.3 AMIMAIS Permitiu-se que os animais tivessem acesso a 5 comida e água à vontade e mantidos em um ciclo de luz/escuro de 12 horas. Camundongos BALB/c fêmea com 6 a 8 semanas de idade (Jackson Laboratories) foram anestesiados para todos os procedimentos intranasais com uma injeção intraperitoneal (IP) de 0,1 ml de cetamina/xilazina (0,15 10 mg de cetamina e 0,03 mg de xilazina).
6.9.1.4 EXPERIMENTOS DE VACINAÇÃO E DESAFIO Camundongos BALB/c fêmea com 6 a 8 semanas de idade virgens foram vacinados com proteína cH9/l, intranasalmente (10 ug) na presença de R848 adjuvante 15 (Invitrogen) e intraperitonealmente (10 ug) com Addavax, um adjuvante tipo MF59 (Invitrogen). Os animais foram estimulados com proteína cH6/1, ou BSA (BioRad) três semanas após a preparação. As vacinações estimulantes também foram administradas intranasalmente (10 ug) e 20 intraperitonealmente (10 ug), apesar de poli I:C como um adjuvante (Invitrogen). 0 vírus FM1 inativado (1 ug) foi administrado intramuscularmente em um volume de 50 ul como um controle positivo. Três semanas pós-estímulo, os animais foram colhidas amostras de sangue e soro, e os animais 25 foram desafiados com 5 LD50 de vírus FM1. Os pesos foram monitorados durante 14 dias após o desafio.
Em outros experimentos, os animais foram preparados com DNA de plasmídeo de codificação de cH9/1 (80 ug, sistema de distribuição TriGrid; Ichor Medical Systems) 30 e, em seguida, estimulados três semanas depois com proteína cH6/l ou cH9/1 (controle) administrada com poli I:C intranasalmente (10 ug) e intramuscularmente (10 ug). O estímulo foi repetido três semanas depois com proteína cH5/1 ou cH9/1 (controle). Os animais de controle foram 5 eletroporados por DNA com DNA de codificação de cH9/1, mas foram estimulados duas vezes com BSA (de maneira similar ao grupo de tratamento). Os animais de controle positivo receberam vírus FM1 ou PR8 inativado (1 pg) ou 1 pg de vacina dividida monovalente pHINl intramuscularmente (BEI). 10 Os animais foram, então, desafiados 3 a 5 semanas após o estímulo com 5 LD50 de PR8 ou FM1 ou 10 LD50 de vírus pH1N1. Os animais usados para depleção de células T CD8+ T foram tratados 48 e 24 horas antes do desafio com 300 pg de um anticorpo de células T anti-CD8+ (vide, por exemplo, M.L. 15 Salem, 2000, Int.
J.
Immunopharmacol. 22:707) (da linha hibridoma 2.43, adquirido junto a ATCC) e desafiados com 5 LD50 de vírus PRO.
Os pesos foram monitorados durante 14 dias após o desafio.
Um corte de 20% foi usado para todos os vírus. 20 Para outros experimentos, os camundongos foram inoculados com vírus YAM-HA ou WT YAM, e, então, vacinados com BSA ou proteína cH6/1 na presença de poli I:C intramuscular e intraperitonealmente três semanas depois.
Os animais virgens serviram como um controle adicional. 25 Coletaram-se amostras de sangue de todos os animais e os mesmos foram desafiados 3 a 5 semanas após a vacinação com 250 LD50 de vírus cH9/1 Ni, ou 1OLD50 de vírus H5 reassortante 2:6 com o sítio de clivagem polibásico removido na base de PR8 (vide, por exemplo, Steel et al., 30 2009, J Virol 83:1742-1753). O vírus cH9/1 Ni inativado por r1: • I: formaldeído (1 ug) e o vírus cH5/1 Ni foram administrados intramuscularmente em um volume de 50 ul como um controle positivo para o desafio viral apropriado. Os animais foram eutanasiados se eles perdessem mais de 30% de seu peso 5 corporal inicial após o desafio, de acordo com as diretrizes institucionais. Um corte de 20% foi usado para infecção com os vírus cH9/1 Ni e A/Netherlands/602/2009 menos patogênicos. Para desafios usando esses dois vírus, usaram-se doses mais rigorosas a fim de avaliar a morte ou 10 perdas substanciais de peso de todos os controles (250 ou 10 LD5D) .
6.9.1.5 ENSAIO DE IMUNOABSORÇÃO LIGADO À ENZIMA Placas Immulon 4HBX (Thermo Scientific) foram revestidas de um dia para outro com vírus cH5/1 Ni 15 parcialmente purificado diluído em 5ug/mL em PBS. As placas foram bloqueadas por 1 hora com 0,1 % de Tween 20-PBS (TPBS) contendo 3% de pó de leite isento de gordura e, então, incubadas com soros de camundongo serialmente diluídos em TPBS contendo 1% de pó de leite por 1 hora a temperatura 20 ambiente. Após três lavagens, as placas foram incubadas por 1 hora a temperatura ambiente com IgG anti-camundongo ligado a fosfato alcalino (AP) (cadeia y específica, Invitrogen). As placas, então, foram lavadas três vezes com TPBS, desenvolvidas com substrato de p-nitrofenilfosfato 25 (PNPP) (Zymed), interrompidas com 0,5M de NaOH, e lidas na densidade óptica de 405nm. Para todos os experimentos, um leitor de placa Synergy 4 (BioTek) foi usado.
Os títulos de anticorpos caule-específicos foram detectados por ELISA, conforme descrito acima. Os antígenos 30 PRO foram usados para revestir as placas de ELISA, a fim de quantificar a reatividade caule-específica.
Para detectar a capacidade de neutralização dos anticorpos caule-
específicos em camundongos vacinados, os soros foram acumulados e o IgG total no soro foi purificado. 5 As pseudopartículas que expressam H5 HA foram usadas em um ensaio de entrada de pseudopartícula, conforme previamente descrito (vide, por exemplo, Hai et al., 2012, J.
Virol. 86:5774-5781 e N.
Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-2578). Mediante a entrada, as pseudopartículas 10 expressam um repórter luciferase.
A inibição desta entrada por IgG foi quantificada como a porcentagem de expressão comparada aos controles tratados não-IgG.
Devido ao fato de os animais não terem sido expostos aos domínios de cabeças globulares H5, estes ensaios determinaram o grau o grau em 15 que os anticorpos caule-específicos produzidos pela vacinação neutralizam o vírus. 0 anticorpo monoclonal CR6261 e o IgG purificado a partir de camundongos tipo selvagem infectado com influenza B foram usados como controles. 20 6.9.1.6 ENSAIO DE NEUTRALIZAÇÃO POR REDUCAO DE
PLACAS (PRNA)
As diluições de mAbs foram primeiro pré-incubadas com 60 a 80 unidades de formação de placas {pfu) de vírus (vírus influenza A cH9N1) por 1 hora a temperatura ambiente
25 em um agitador.
A mistura de vírus e IgG purificado foi, então, usada para infectar uma monocamada de células MDCK em duplicata em um formato de 12 poços e incubada a 37°C por 1 hora com agitação intermitente a cada 10 minutos.
A camada de agar foi suplementada com diluições de IgG 30 correspondentes.
Em dois dias pás-infecção (dpi), a monocamada foi fixada com 4% de PFA/1X PBS por 30 minutos.
As células foram bloqueadas com 5% de NF-leite/1X PBS por 30 minutos a temperatura ambiente e foram consequentemente incubadas com um anticorpo monoclonal específico H9 (5 5 pg/mL) por 1 hora a temperatura ambiente. Um anti- camundongo secundário conjugado em HRP foi usado como secundário em uma diluição de 1:1.000. As placas foram visualizadas usando substrato de peroxidase TrueBlue (KPL Inc.) e a reação foi interrompida com água da torneira. As placas foram contadas para cada anticorpo e porcentagem de inibição calculados ao longo do grupo mAb.
6.9.1.E TESTES ESTATÍSTICOS As análises estatísticas foram realizadas usando um teste de T-Student caudal (Prism4, GraphPad). Para a Figura 44C, todos os valores são representados como médias com erro padrão da média. As diferenças em sobrevivência foram calculadas com a análise de sobrevivência de Kaplan- Meier com teste de significância de log rank.
Para análises com valores-P, os valores-P em ou abaixo de 0,05 são considerados estatisticamente significativos. A correção de Welch foi usada se as variâncias foram determinadas como estatisticamente diferentes. Os valores-P em ou abaixo de 0,05 são considerados estatisticamente significativos. Comparando-se urna reatividade sérica do caule à perda de peso máxima na Figura 3, um valor foi detectado como um valor discrepante (pontuação-Z modificada > 3,5 desvios padrão acima da média), de acordo com os métodos de Iglewicz e Hoaglin (vide Iglewicz, B. a. H., D. 1993. Volume 16: How to detect and handle outliers. In E. Mykytka (ed.), The ASQC Basic
References in Quality Control: Statistical Techniques. American Society of Quality Control) , e foi omitido das análises.
6.9.2 RESULTADOS 5 6.9.2.1 VACINAÇÃO SEQUENTIAL COM CONSTRUÇÕES DE CHA PRODUZEM ANTICORPOS CAULE-ESPECÍFICOS HA E PROPORCIONAM
PROTEÇÃO DO DESAFIO DE INFLUENZA LETAL Argumentou-se que as construções que expressam domínios de cabeças globulares a partir de vírus com 10 antigenicidades diferentes podem estimular respostas policlonais em direção ao domínio do caule da HA. Para testar isto, os camundongos foram vacinados primeiro com proteína solúvel cH9/1 com adjuvante, de modo que o caule da HA seja a partir do vírus A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) e a 15 cabeça a partir de um H9 isolado. Três semanas pós-preparo, os camundongos foram estimulados com uma segunda cHA solúvel, cH6/1 (cabeça a partir do vírus H6, caule a partir do vírus PR8), com a intenção de estimular as respostas humorais em direção ao domínio do caule da molécula. 20 (Camundongos vacinados com vírus FM1 inativado servido como um controle positivo). Três semanas pós-estímulo, os camundongos foram sangrados para avaliar a reatividade sérica ao domínio H1 do caule e, então, desafiados com vírus A/Fort Mounmoth/1/1947 (FM1) adaptado ao camundongo.
25 Conforme mostrado na Figura 42A, os camundongos vacinados produziram respostas de anticorpos séricos em direção ao domínio do caule HA. Após o desafio com FM1, os animais perdem uma quantidade considerável de peso (Figura 42B), embora recuperado após 7 dias para uma taxa de 30 sobrevivência total de 90% (Figura 42C). Mesmo que os camundongos tenham sido expostos apenas aos domínios de cabeças globulares de vírus H9 e H6, verificou-se que todos os camundongos eram HI negativa ao vírus FM1 e, deste modo, confirmou-se que a proteção obtida a partir da vacinação 5 foi o resultado de uma resposta imune específica ao domínio do caule. Portanto, a vacinação com cHAs à base de PR8 proporciona imunidade caule-específica que é prctet5ora diante de um desafio de vírus FM1.
6.9.2.2 VACINAÇÃO COM PROTEÍNA CH6/1 PRODUZ IMUNIDADE CAULE- ESPECÍFICA QUE MEDIA A PROTEÇÃO A PARTIR DO DESAFIO DE VÍRUS CH9/1 Ni Embora as respostas de anticorpos tenham sido geradas em direção ao caule através da administração de duas construções de cHA solúvel diferentes, um grau substancial de morbidez foi obervado após o desafio FM1.
Devido ao fato de os camundongos serem imunologicamente virgens ao vírus influenza, foi possível que múltiplas exposições ao vírus influenza seguidas pela introdução de uma cabeça antigenicamente distinta fossem requeridas, a fim de induzir títulos de anticorpos séricos elevados contra o caule de HA. A estimulação aprimorada de títulos de anticorpos séricos com especificidade ao caule de hemaglutinina também pode requerer infecção, e pode explicar porque uma proteção robusta seguindo a preparação e o estímulo com proteínas cHA sozinha não foi observada. A fim de estimular as respostas imunes em direção à hemaglutinina viral, porém, não gerar imunidade protetora para outras proteínas virais, foi construído um vírus B/Yamagata/16/198$ recombinante que expressa o ectodomínio da HA a partir do vírus PR8 (YAM-HA) (vide, por exemplo,
Hai et al., 2011, Journal of virology 85:6832-6843). Os camundongos foram inoculados com YAM-HA, a fim de imitar as exposições anteriores ao vírus influenza e, então, vacinados 3 semanas depois com proteína BSA ou cH6/1. Como 5 um controle adicional, os camundongos foram infectados com vírus B/Yamagata/16/1988 (WT YAM) do tipo selvagem e vacinados com BSA. Um vírus influenza A que expressou a cH9/1 (cabeça H9, caule H1) foi, então, usado como o vírus de desafio, a fim de demonstrar definitivamente a natureza protetora de uma resposta imune voltada apenas em direção ao caule de HA. Novamente, devido ao fato de os animais serem expostos aos domínios de cabeças globulares a partir do vírus H1 e H6, a proteção observada após o desafio com um vírus que expressou a cH9/1 HA era mais provavelmente um resultado de imunidade em direção ao domínio do caule H1.
Conforme mostrado na Figura 43A, os animais que receberam a vacina de proteína cH6/1 seguindo a exposição de YAM-HA foram completamente protegidos a partir do desafio 250 LD50 com um vírus de expressão de cH9/1 na base PR8. Os animais vacinados com proteína solúvel cH6/1 perderam estatisticamente menos peso nos dias 3, 4 e 5 comparados aos animais que foram vacinados com BSA. Esta proteção a partir da perda de peso resultou em sobrevivência aumentada no grupo vacinado com cH6/1, comparado ao grupo vacinado com BSA (p = 0,038; Figura 43B). Os animais virgens e aqueles inoculados com WT YAM não foram protegidos da infecção, demonstrando que qualquer proteção que foi observada nos outros grupos de vacinação não foi um resultado de replicação viral, porém, em vez disso, foi uma resposta específica ao domínio do caule H1.
Devido ao fato de os animais terem sido expostos aos domínios de cabeças globulares a partir do vírus Hl e H6, e serem HI negativos ao vírus de desafio cH9/1, acredita-se que a proteção observada aqui seja um resultado de 5 imunidade em direção ao domínio do caule H1.
Deve-se notar que os anticorpos monoclonais com especificidades ao caule de HA foram isolados dos indivíduos infectados com ou vacinados contra o vírus H1N1 sazonal (vide, por exemplo, Corti et al., 2010, The Journal of clinical investigation 120:1663-1673; Corti et al., 2011, Science 333:850-856; Ekiert et al., 2011, Science 333:843-850; Sui et al., 2009, Nat Struct Moi Biol 16:265- 273; Throsby et al., 2008, PLoS One 3:e3942), e títulos de caule foram avaliados em indivíduos não infectados com o vírus pH1N1, embora em níveis mais baixos (vide, por exemplo, Pica et al., 2012, PNAS USA 109:2573-2578). Como tal, não é surpreendente que os animais inoculados com YAM- HA foram capazes de gerar algum grau de título de caule. A vacinação com a construção cH6/l, entretanto, aumentou os títulos de caule séricos em 4 vezes(diluições recíprocas que produziram valores OD equivalentes) (Figura 43C, e animais protegidos da perda de peso substancial e morte (Figuras 43A e 43B). A vacinação com a construção cH6/1 obteve a produção de IgG caule-específico que neutralizou o vírus com 100% de eficiência (YAM-HA +BSA) (Figura 43D) enquanto que no soro a partir de preparação os animais exibiram apenas níveis de neutralização quase acima da base (YAM-HA +BSA). De fato, os animais inoculados com YAM-HA e, então, vacinados com BSA tiveram taxas de sobrevivência estatisticamente similares aqueles que foram inoculados com virus WT YAM e vacinados com BSA (p = 0,058). Em contrapartida, o uso de proteína cH6/1 como uma vacina rendeu 100% de sobrevivência a partir do desafio, uma taxa que foi altamente significativa quando comparada àquela dos 5 animais inoculados com WT YAM (p < 0,0001). A sobrevivência também foi aprimorada quando comparada àquela dos camundongos inoculados com YAM-HA e vacinados com BSA (p = 0,038). Estas diferenças não refletiram no ensaio de entrada de pseudopartícula, como IgG a partir de camundongos YAM-HA + BSA e os camundongos YAM-HA + cH6/1 inibiram a entrada de pseudopartículas que codificam uma H5 HA com eficiência similar (Figura 43E). É importante notar que o último ensaio detecta apenas a capacidade de os anticorpos bloquearem a entrada de pseudopartículas. Portanto, os efeitos de anticorpos de caule a jusante da entrada e/ou sua interação com células infectadas (imunes) podem não ser detectados neste ensaio. Isto pode explicar porque as diferenças em neutralização não foram observadas entre os dois grupos e não refletiram nas descobertas in vivo. Todavia, os anticorpos produzidos por estes protocolos de infecção eram caule específicos e eram amplamente neutralizantes. Devido ao fato de o vírus de desafio codificar apenas o domínio do caule a partir de um vírus H1, pode-se concluir que a proteção observada foi o resultado da resposta imune do hospedeiro ao domínio do caule HA que foi estimulado através da vacinação cH6/1.
6.9.2.3 VACINAÇÃO COM PROTEÍNA CH6/1 PROTEGE OS CAMUNDONGOS DO DESAFIO DE VÍRUS INFLUENZA H5 LETAL Se a vacinação com proteína cH6/1 puder proteger os camundongos do desafio com um virus H5 foi verificado a seguir. Os camundongos foram inoculados e vacinados, conforme descrito acima, e desafiados com 10 LD50 de um 2:6 vírus reassortante que expressa a HA e NA a partir do vírus A/Vietnam/1203/2004 na base 9R8 (vide, por exemplo, Steel 5 et al., 2009, J Virol 83:1742-1753). Conforme esperado, os animais virgens e aqueles inoculados com vírus WT YAM não foram protegido do desafio e sucumbiram à infecção no oitavo dia. Os animais inoculados com vírus YAM-HA e vacinados com BSA foram marginalmente protegidos do 10 desafio, com uma taxa de sobrevivência de 40%. A proteção aumentada foi observada quando os animais foram vacinados com proteína cH6/1, com 90% de sobrevivência. A diferença nas taxas de sobrevivência entre os dois grupos de vacina se aproximou da significãncia estatística (p = 0,06), 15 embora os camundongos vacinados com a proteína cH6/1 tenham sobrevivido por um tempo estaticamente mais longo (p = 0,037) (Figuras 44A e 44B). Comparando-se a reatividade ao caule de HA à % de perda de peso máxima ao longo do período de monitoramento após o desafio H5, uma correlação inversa 20 foi detectada, de modo que os animais com títulos de caule séricos mais elevados tendiam a perder menos peso após o desafio (Figura 44C), sustentando a noção que a cH6/l pode estimular a imunidade à base de caule de HA.
Usando o vírus de desafio com os domínios de 25 cabeça globulares HA em que os camundongos vacinados eram imunologicamente virgens e HI negativos, os resultados indicam que a proteção do desafio após a vacinação se baseou unicamente em uma resposta imune em direção ao caule de HA. Para excluir a possibilidade de que os anticorpos de 30 reação cruzada em direção ao sítio de ligação de receptor possam desempenhar um papel na proteção observada aqui, todos os camundongos foram testados para HI e considerados HI negativos ao seu respectivo vírus de desafio.
6.9.2.4 VACINAÇÃO COM CHA PRODUZ IMUNIDADE 5 CAULE-ESPECÍFICA QUE MEDIA A PROTEÇÃO DOS DESAFIOS DE VÍRUS H1N1 Os anticorpos caule-específicos foram detectados nos soros humanos (vide, por exemplo, Figuras 27A e 27B; M. Thorsby et al., 2008, PLoS One 3:e3942, D.C. Ekiert et al., 2009, Science 324:246-251, D.C. Ekiert et al., 2011, Science 333:843-850, J. Wrammert et ai., 2011, J. Exp. Med.
208:181-193 e N. Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-2578).
Devido ao fato de que é possível que a exposição prévia ao vírus influenza HA seja crítica para a produção robusta de uma resposta imune caule-específica, verificou-se se a imunidade preexistente ao vírus influenza em camundongos pode ser recapitulada. Argumentou-se que isto pode proteger mais efetivamente contra morbidez após o vírus desafio. Para alcançar isto, os camundongos foram preparados com um vetor de expressão de DNA (vide, por exemplo, J. Steel et al, 2010, MBio 1(1), pii:e00018-10) que codifica cH9/1, então, foram estimulados com proteína cH6/1 solúvel, seguida pela proteína cH5/1 (cabeça H5, caule H1), e finalmente desafiados com um painel de vírus H1N1 (Figuras 45A-45F). Após a infecção com FM1 (Figuras 45A e 45B), A/Netherlands/602/2009 (pHlNl) (Figuras 45C e 45D) e o vírus PR8 (Figuras 45E e 45F), todos os animais vacinados com cHA foram protegidos do desafio e exibiram apenas quantidades mínimas de perda de peso, se houver alguma. Em contrapartida, os animais de controle negativo que receberam BSA após a preparação com DNA cH9/I perderam quantidades consideráveis de peso e, com a exceção de um animal, sucumbiram à infecção no nono dia (Figuras 45A- 45F). A sobrevivência dos animais vacinados com cHA em cada 5 um dos experimentos de desafio foi significativamente diferente daquela dos controles (Figuras 45B, 45D e 45F).
Para confirmar que a proteção produzida foi um resultado da imunidade humoral caule-específica, confirmou-se que todos os camundongos eram HI negativos para cada vírus de desafio embora os soros fossem capazes de ligar Hl HA a ELISA (Figura 45G), confirmando a produção de anticorpos caule- específicos através do protocolo de vacinação. Devido ao fato de que é possível que as células CDB T voltadas em direção aos epítopos dentro do caule de HA possam desempenham um papel na proteção observada aqui (vide, por exemplo, M. Tamura et al., J. Virol. 72:9404-9406), os camundongos foram vacinados e depletados de células CD8 T administrando-se o anticorpo monoclonal 2.43 antes do desafio PR8 (M.L. Salem, 2000, Int. J. Immunopharmacol. 22:707-718). A depleção não afetou a perda de peso nem os resultados de sobrevivência, implicando em uma resposta humoral na proteção produzida pela vacinação (Figuras 45H e 45I). Portanto, uma resposta imune humoral adaptável em direção ao caule de HA, e não à cabeça, proporcionou proteção contra os três vírus H1N1 diferentes.
A fim de validar adicionalmente que o protocolo de vacinação à base de cHA induziu os anticorpos caule- específicos com capacidade de neutralização contra outros subtipos, a capacidade de o IgG purificado a partir dos camundongos vacinados bloquear a entrada de pseudopartículas que hospedam uma H2 HA foi testada. Devido ao fato de as pseudoparticulas expressam um gene repórter luciferase após a entrada, a atividade de neutralização foi medida pela ausência da atividade enzimática de luciferase 5 nos sobrenadantes de células (R. Hai et al., 2012, J. Virol. 86:5774-5781 e N. Pica et al., 2012, PNAS 109:2573- 257 8) . Coerente com a proteção observada após o desafio, o IgG purificado a partir de camundongos vacinados inibiu a entrada de pseudopartículas de uma maneira dose-dependente e com eficácia similar àquela de CR6261, um anticorpo monoclonal com especificidade ao caule HA que foi usado como o controle positivo (Figura 45J). O protocolo de vacinação, portanto, produziu anticorpos de caule com ampla especificidades, capazes de neutralizar outras HAs do grupo 15 1 como H2.
6.9.3 CONCLuSÃo Este exemplo demonstra o efeito protetor de uma resposta imune caule-específica que pode ser produzida através da vacinação com HAs quiméricas. Demonstrou-se que uma resposta imune voltada em direção ao caule de HA foi suficiente para a proteção do desafio viral, e que este protocolo de vacinação proporcionou proteção hetero- subtípica. Uma estratégia pode ser desenvolvida em humanos para proporcionar proteção contra uma ampla faixa de vírus influenzas, eliminando a necessidade de vacinação anual, e aprimorando a preparação pandêmica.
6.10 EXEMPLO 10: OS ANTICORPOS REATIVOS DE CAULE
DE HEMAGLUTININA SÃO ESTIMULADOS APÓS A INFECÇÃO SEQUENCIAL DO VÍRUS INFLUENZA H1N1 SAZONAL E PANDÊMICO EM CAMUNDONGOS.
Este exemplo demonstra que a infecção com um vírus influenza sazonal seguida pela infecção com uma cepa de influenza pandêmica estimula a produção de anticorpos caule-específicos em camundongos, validando um modelo de 5 camundongo de infecção humana por influenza e uma resposta imune de anticorpo de caule concomitante.
6.10.1 MATERIAL E MÉTODOS
6.10.1.1 CÉLULAS E VÌRUS As células 293T e MDCK foram obtidas a partir de 10 ATCC e foram mantidas em meio Eagle modificado por Dulbecca (DMEM) e Meio Essencial Mínimo (ambos da Gibco), respectivamente, cada um suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (HyClone), e 100 unidades/ml de penicilina-100 pg/ml de estreptomicina (Pen/Strep, Gibco). As cepas de vírus influenza A/New Caledonia/20/99 (NC99) (H1N1), A/Solomon Islands/3/2006 (S106) (H1N1), A/Puerto Rico/8/1934 (PR8) (H1N1), A/Fort Monmouth/1/1947 (FM1) (H1N1), A/California/04/2009 (Cal09) (93 H1N1) e uma baixa patogenicidade, A/Vietnam/1203/04 (VN04):PR8 2:6 vírus reassortante (H5N1) (vide, por exemplo, J. Steel et al., 2009, J. Virol. 83:1742-1753) foram desenvolvidas em ovos embrionados de 10 dias de idade por 48 horas.
A fim de construir um vírus adaptado ao frio com antigenicidade PR8, um sistema de resgate à base de A/Ann Arbor/6/60 foi gerado pela transcrição reversa de genes virais (Transcriptor RT, Roche) a partir de RNA de vírion purificado, amplificação de POR (PFU turbo, Stratagene) e clonagem no vetor pPOL1 (vide, por exemplo, E. Fodor et al., 1999, J. Virol 73:9679-9682) seguindo o protocolo recombinacional descrito por Wang et al. (vide, por exemplo,
S. Wang et al., 2008, J. Virol. Methods 151:74-78). Os plasmídeos A/Ann Arbor/6/60 que codificam PB1, PB2, PA, NP, M e NS foram usados com aquelas HA e NA de codificação a partir da cepa PR8 para resgatar um vírus adaptado ao frio 5 à base de PRO. 0 vírus adaptado ao frio foi desenvolvido em ovos de galinha embrionados de 10 dias de idade por 48 horas. A fim de construir um vírus PR8 com uma deleção na proteína não estrutural 1 (NS1), um plasmídeo que codifica apenas os primeiros 73 aminoácidos de NS1 foi usado além dos sete outros plasmídeos de resgate à base de PRO. Após seu resgate, o vírus foi propagado em ovos de galinha embrionados por 48 horas (vide, por exemplo, S.A. Kopecky- Bromberg, 2009, Vaccine 27:3766-3774).
O vírus recombinante e do tipo selvagem foram titulados em células MDCK (ATCC) na presença de tripsina TPCK, conforme previamente descrito (6). Os vírus foram inativados seguindo o tratamento de formaldeído por 72 horas a 4°C.
6.10.1.2 GERAÇÃO DE BACULOVÏRUS RECOMBINANT,
EXPRESSÃO DE PROTEÍNA E PURIFICAÇÃO A fim de gerar NC99, Ca109, cHE/1 (domínio de cabeça globular a partir de H6N1 A/mallard/Sweden/81/02, domínio do caule a partir de PR8) ou VN04 HA e VN04 NA, um sistema de expressão à base de baculovirus foi empregado conforme previamente descrito (N. Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-2578). Em resumo, os vetores de báculo- transferência foram transformados em cepa de Escherichia coli DH10Bac (Invitrogen), onde colônias foram escolhidas e desenvolvidas. As bacmidas foram preparadas usando um Plasmídeo 116 Midi Kit (Qiagen) e, então, transfectadas em células Sf9 com Cellfectin II (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. O baculovírus recombinante foi amplificado em células Sf9 desenvolvidas em meio TNM-FH (Gemini Bioproducts) e, então, usado para infectar células 5 High Cinco desenvolvidas em meios de células de insetos HyClone SFX (Thermo Fisher Scientific) em urna MOI de 10. Os sobrenadantes foram colhidos 96 horas pós-infecção e, então, incubados com resina Ni-NTA (Qiagen) por 2 horas a 4°C para purificar as proteínas de HA recombinantes marcadas com 10 His122. A pasta fluida foi carregada em colunas e lavada três vezes com tampão de lavagem (50 mM de Na2HCO3, 300 mM de NaCl, 20 mM de imidazol, pH 8). A proteína foi eluída em etapas de 0,5-mL com tampão de eluição (50 mM de Na2HCO3, 300 mM NaCl, 250 mM de imidazol, pH 8) e testada para teor 15 de proteína com reagente de Bradford, e frações contendo proteína foram agrupadas. As frações agrupadas foram trocadas por tampão em PBS e concentradas usando uma unidade de filtro centrífugo Amicon Ultra (Millipore) com • um corte de massa molecular de 10-kDa em um rotor de 20 caçamba móvel. A pureza e identidade da proteína foram testadas por SDS/PAGE, coloração de Coomassie e Western blot. As concentrações de proteína finais foram determinadas com reagente de Bradford.
6.10.1.3 ANIMAIS 25 Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com as diretrizes da Mount Sinai School of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee. Os animais foram permitidos ao acesso a alimentos e água ad libitum e mantidos em um ciclo 30 claro/escuro de 12 horas. Camundongos fêmeas de 6 a 8 semanas de idade BALB/c (Jackson Laboratories) foram anestesiados para todos os procedimentos intranasais com injeção intraperitoneal (IP) de 0,1 ml de cetamina/xilazina (0,15 mg de cetamina e 0,03 mg de xilazina). 5 6.10.1.4 INFECÇÃO E VACINAÇÃO Os grupos de cinco camundongos fêmeas de 6 a 8 semanas de idade BALB/c foram anestesiados e inoculados intranasalmente com 50u1 de 10 4 PFU de vírus NC99, S106 ou Cal09, 103 ou 104 PFU de vírus PR8 adaptado ao frio ou 103 ou 1.04 PFU de um vírus PR8 NS1-truncado diluído em PBS. Os camundongos também receberam 1 pg de vírus PR8 ou FMI de formaldeído inativado ou uma vacina dividida trivalente comercial contendo 1 pg de A/Brisbane/57/07 (TIV) H1 HA (a dose também continha 1 pg do componente H3 A/Uruguay/716/07 e o componente B B/Brisbane/60/08) administrado intramuscularmente em um volume de 50u1. De maneira adicional, dois grupos de camundongos foram vacinados com 80 }gig de plasmídeo pCAGGS que codifica PR8 ou NC99 HA usando um dispositivo de eletroporação TriGrid (Ichor Medical Systems) (vide, por exemplo, J. Steel, 2010, MBio 1(1), pii:e00018-10). Quatro semanas após a infecção ou vacinação, os animais foram retro-orbitalmente sangrados e o soro foi colhido a partir do sangue integral.
Após a infecção com vírus NC99, os camundongos foram intranasalmente inoculados com 10S ou 106 PFU de vírus SI06 ou com 103 ou 104 PFU de virus Ca109 diluído em PBS. Três dias pós-estímulo, três animais por grupo foram eutanisiados com CO2 e os e os pulmões foram colhidos e homogeneizados com um homogeneizador FastPrep-24 (MP). Os títulos de vírus pulmonar foram medidos por titulação em células MDCK. Quatro semanas após a segunda infecção, os animais foram retro-orbitalmente sangrados e o soro foi colhido a partir do sangue integral.
6.10.1.5 ENSAIO DE IMUNOABSORçÃO LIGADO À ENZIMA 5 E ENSAIO DE ENTRADA DE PSEUDO-PARTÍCULA Placas Immulon 4HBX (Thermo Scientific) foram revestidas de um dia para outro com baculovirus purificado expresso NC99, Ca109, cH6/1 ou VN04 HA (todos com um foldon C-terminal T4) ou VN04 NA (com um domínio de tetramerização N-terminal) em tampão de revestimento (0,1 M de Na2CO3/NaHCO3 , pH 9, 2, 50 pl/poço) ou PBS (N. Pica et ai., 2012, PNAS 109:2573-2578). As placas foram bloqueadas por 1 hora com 0,1 % Tween 20-PBS (TPBS) contendo 3% de pó de leite isento de gordura e, então, incubadas com soros de camundongo serialmente diluídos em TPBS contendo 1% de pó de leite por 1 hora a temperatura ambiente. Após três lavagens, as placas foram incubadas por 1 hora a temperatura ambiente com um anticorpo IgG anti-camundongo conjugado com peroxidase de rábano secundária (HRP) (Sigma) ou um IgG anti-camundongo ligado ao fosfato alcalino (AP) (cadeia especifica y, Invitrogen). As placas, então, foram lavadas três vezes corn TPBS e desenvolvidas. Quando o HRP secundário foi usado, as placas foram desenvolvidas usando SïgmaFAST OPD substrato (Sigma) (100 ul/poço), interrompidas com 3M de HC1 e lidas a 490nm. Quando um anticorpo secundário ligado ao AP foi usado, as placas foram desenvolvidas com substrato de p-nitrofenilfosfato (PNPP) (Zymed) , interrompidas com 0, 5M de NaOH, e lidas na densidade óptica de 405nm. Para todos os experimentos, um leitor de placa Synergy 4 (BioTek) foi usado. Para experimentos de ELISA que detectam a reatividade em H5 HA, os soros dos camundongos infectados com 10` PFU de um NSl- vírus A/Vietnam/1203/2004 truncado foram usados como um controle positivo.
5 6.10.1.6 PURIFICAÇÃO DE IGG DE CAMUNDONGO A
PARTIR DE SOROS POLICLONAIS Os soros de camundongo foram diluídos em PBS (pH 7,4) e passaram através de uma unidade de filtro estéril de 0,45 um. Os soros filtrados foram carregados em uma coluna 10 contendo 3 ml de 4 FastFlow Sepharose G (GE Healthcare). A coluna foi lavada com 60 ml de PBS e o IgG total foi eluído com um tampão de glicina HC1 de 0,1 M (pH 2,7) e imediatamente neutralizados usando um tampão de TRIS-HC1 de 2M (pH 10) (A. Jungbauer et al., 1989, J. Chromatogr 15 476:257-268). 0 IgG eluído foi, então, concentrado e o tampao trocado (para PBS) usando unidades de centrifugação Amicon Ultracell (Millipore) com um corte de 30 kDa. A concentração de proteína foi medida em um espectrofotômetro NanoDrop 2000 usando o método A280. 20 6.10.1.7 ENSAIO DE NEUTRALIZAÇÃO DE PARTÍCULA
PSEUDOTIPADA 0 procedimento para produção de partícula pseudotipo foi adaptado 185 a partir de estudos anteriores e foi previamente descrito (vide, por exemplo, M.J. Evans, 25 2007, Nature 446:801-805, R. Hai et al., 2012, J. Virol.
86:5774-5781 eN. Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-2578). Em resumo, as células 293 T foram co-transfectadas com quatro plasmideos que codificar um pro-vírus contendo um gene de v, HIV Gag-Pol, a proteína de hemaglutinina ccH5/1 quimérica 30 (domínio de cabeça A/Viet Nam/1203/04 H5 e domínio do caule
PR8) e uma neuraminidase a partir do vírus influenza B B/Yamagata/16/88. Os sobrenadantes foram coletados 48 horas pós-transfecção e subsequentemente filtrados (0,45 pm de tamanho de poro), a fim de purificar as preparações de 5 partícula cH5/l. As partículas foram, então, incubadas com concentrações diferentes de IgGs de camundongo purificados e adicionadas às células MDCK. As transduções prosseguiram por 6 horas antes de as células serem lavadas e o meio fresco foi colocado ao longo das células. Todas as 10 transduções foram realizadas na presença de 1 ug/mL de polibreno (Sigma, St. Louis, MO). Os ensaios de luciferase foram realizados 48 horas após a transdução.
6.10.1.8 EXPERIMENTO DE TRANSFERÊNCIA PASSIVA Os camundongos (n=5 por grupo) foram 15 intraperitonealmente inoculados com 200 ul de soros a partir de grupos que foram infectados com vírus NC99, NC99 seguido pelo vírus Cal09 ou SI06, ou com soros a partir dos animais virgens. Duas horas pós-inoculação os camundongos foram anestesiados e desafiados com 5 MLD5O de VN04:PR8 2:6 20 reassortante (vide, por exemplo, J. Steel et al., 2009, J.
Virol. 83:1742-1753). A perda de peso foi monitorada diariamente por 14 dias e os camundongos que perderam mais 4 e30% de seu peso corporal inicial foram avaliados mortos ou eutanisados. As análises estatísticas foram realizadas 25 usando Prism4 (GraphPad). As diferenças em sobrevivência foram calculadas com a análise de sobrevivência de Kaplan- Meier com teste de significãncia de log rank. Os valores-P em ou abaixo de 0,05 são considerados estatisticamente significativos. 30 6.10.2 RESULTADOS
6.10.2.1 ANTICORPOS CAULE-REATIVOS SÃO INDUZIDOS MEDIANTE INFECÇÃO COM VÌRUS H1N1 SAZONAL OU PANDÊMICO, PORÉM, NÃO PELA VACINAÇÃO
Os grupos de cinco camundongos foram 5 subletalmente infectados com 10 4 PFU de vírus NC99, S106 ou
Ca109 e sangrados quatro semanas depois para a avaliação de título de anticorpo de caule de soro.
A fim de determinar o grau de anticorpos de caule induzidos pela infecção, proteína cH6/1, uma construção de HA solúvel que contém o caule de um vírus H1 e a cabeça de um vírus H6, foi usada (vide, por exemplo, N.
Pica et al., 2012, PNAS 109:2573-
257 8) . Este reagente permite a detecção direta de anticorpos caule-específicos em soros policlonais.
Todos os camundongos infectados com um vírus sazonal ou pandémico produziram anticorpos com reatividade ao caule de HA (Figura 46). Em contrapartida, os animais que foram preparados com codificação de DNA PR8 ou NC99 HA, ou aqueles que receberam vacina PR8 ou FM1 inativada ou a vacina dividida comercial intramuscularmente não apresentou nenhuma reatividade a cH6/1 por ELISA, apesar de sua soroconversão ao antígeno que eles foram vacinados.
Quando os animais foram vacinados com 103 ou 10§ de um vírus adaptado ao frio ou vivo atenuado através de truncamento NS1, os títulos de anticorpos caule-específicos se encontravam quase acima da base. os soros dos camundongos vacinados corn uma construção de hemaglutinina sem cabeça
(vide, por exemplo, J.
Steel et al., 2010, MBío 1(1), pii:e00018-10) e anticorpo monoclonal caule-específico 6F12 foram usados como controles positivos (vide, por exemplo, 30 G.S.
Tan et al., 2012, J.
Virol. 86:6179-6188). Uma vez que o nível de replicação do vírus atenuado era mais baixo que aquele do vírus do tipo selvagem, e as vacinas inativadas/DNA não induziram anticorpos caule-reativos, argumentou-se que a indução inicial destes anticorpos foi 5 muito aprimorada através do vírus capaz de replicação.
6.10.2.2 UM FSTTMTTT,n CfM 4411M11 p . ITfl rtTrn DDnnr,v TÍTULOS MAIS ALTOS DE ANTICORPOS CAULE-REATIVOS QUE COM UM H1N1 SAZONAL ENXERTADO ISOLADO Os animais preparados com 10 4 PFU de vírus NC99 foram estimulados quatro semanas pós-preparo com duas doses diferentes de SIO6 (105, 106 PFU; "NC/SI") ou Cal09 (10 3 , 104 PFU; "NC/Cal"). Quatro semanas depois, os camundongos foram terminalmente sangrados e os soros foram analisados para a presença de anticorpos caule-reativos usando proteína cH6/1 recombinante. Todos os animais que receberam uma segunda inoculação de vírus tiveram títulos de caule elevados comparados aos camundongos que _`oram infectados apenas com NC99 (Figura 47). De fato, o efeito foi dependente da dose, à medida que os animais que receberam a dose mais baixa (103 de vírus Ca109 ou 105 PFU de SI06) tiveram um estímulo mais fraco que aqueles que receberam uma dose mais alta (10 4 PFU de vírus Ca109 ou 10 6 de SI06).
Deve-se notar, entretanto, que os animais infectados com NC/Cal exibiram uma indução mais forte do título de caule comparado ao grupo infectado com NC/SI. De fato, a fim de gerar títulos de caule séricos comparáveis ao grupo NC/Cal, 1000 vezes mais do vírus sazonal 5106 foram requeridos. (Figura 47). A fim de confirmar a soroconversão para infecções primárias e secundárias, todos os soros foram testados para reatividade à proteína NC99 e Cal09 HA recombinante por ELISA.
Com base na descoberta que a replicação aprimora fortemente a elicitação de anticorpos caule direcionados, 5 verificou-se se o estímulo aumentado em título de anti- caule observado em animais infectados com Ca109 pode ser um resultado da capacidade de replicação aprimorada do vírus. Três dias pós-estímulo, os animais NC/Cal e NC/SI foram sacrificados e os tecidos pulmonares foram coletados. 10 Embora o vírus SI não tenha sido detectado nos pulmões de camundongos sequencialmente infectados, o vírus Ca109 se desenvolveu em 105 PFU/mL por este ponto de tempo.
6.10.2.3 OS ANTICORPOS CAULE-REATIVOS PRODUZIDOS
TÊM ATIVIDADE DE NEUTRALIZAÇÃO IN VITRO 15 A fim de avaliar a capacidade de neutralização destes anticorpos caule-específicos um ensaio de neutralização de partícula pseudotipado foi usado. As pseudopartículas que expressaram uma HA com um caule Hl e uma cabeça H5 (cH5/1) foram modificadas por engenharia 20 genética para hospedar um gene repórter luciferase que pode ser expresso após a entrada bem sucedida da pseudopartícula nas células. A entrada foi, portanto, medida como uma função da expressão de luciferase. Devido ao fato de os animais terem sido expostos apenas ao vírus H1N1, qualquer 25 inibição da entrada pode ser um resultado dos anticorpos de neutralização voltados em direção ao caule de HA (H1). Devido à quantidade limitada de soro disponível, apenas a eficiência de neutralização relativa das preparações de IgG purificado do soro dos camundongos que foram preparados com 30 vírus NC99, porém, foram, então, estimulados com vírus 103
Ca109 ou 105 SI06 foi testada. O soro dos camundongos que foram infectados com Ca109 sozinho foi usado como um ponto adicional de comparação. O anticorpo monoclonal 6F12 (vide, por exemplo, G.S. Tan et ai., 2012, J. Virol. 86:6179-6188), 5 um anticorpo caule-específico com especificidade de grupo ampla 1, foi usado como um controle positivo.
Mais de 90% de inibição foi observada com tão pouco quanto 50ug/mL do purificado a partir de camundongos NC/Cal ou NC/SI. Deve-se notar que o IgG isolado dos camundongos NC/Cal e camundongos NC/SI foi capaz de inibir a entrada de pseudopartículas de expressão de cH5/1 com eficiências similares a 50 ou 10 ug/mL. O IgG dos camundongos infectados apenas com vírus Ca109 exibiu baixos níveis de entrada inibição, que era similar aos níveis observados para camundongos virgens. Novamente, isto reflete os títulos de anticorpos de caule relativos neste grupo, conforme mostrado na Figura 47.
6.10.2.4 OS ANTICORPOS CAULE-REATIVOS PROTEGEM
DO DESAFIO HETEROLOGO EM UM EXPERIMENTO DE TRANSFERÊNCIA
PASSIVA A fim de avaliar a eficácia protetora in vivo de tais anticorpos, os soros a partir de animais sequencialmente infectados foram administrados intraperitonealmente aos camundongos virgens, seguido pelo desafio com um vírus H5N1 reassortante na base PR8 (VN04). Os animais que receberam soros dos camundongos sequencialmente infectados com vírus sazonal e pandêmico (NC99 10 PFU - Ca109 104 PFU) foram parcialmente protegidos do desafio, com uma taxa de 80% de sobrevivência. Os camundongos que foram apenas expostos às cepas sazonais enxertadas (NC99 10 4 PFU - SI06 106 PFU) também foram parcialmente protegidos do desafio (60% de sobrevivência). Os camundongos que receberam apenas uma única inoculação de vírus NC99 (10 4 PFU) não foram protegidos do desafio, e 5 todos sucumbiram à infecção no nono dia (Figura 48).
As diferenças na sobrevivência entre os dois grupos de preparo-estímulo não foram estatisticamente significativas (p=0,575). No entanto, a sobrevivência de camundongos sequencialmente infectados foi estatisticamente 10 diferente daquela apenas de preparo (NC99/SI06 p=0,018, NC99/Ca109 p=0.0023) e camundongos de controle (NC99/S106 p-0,0031, NC99/Cal09 p=0,0031), que indica que níveis elevados de anticorpos caule-reativos são capazes de proteger do desafio heterosubtípico. 15 Devido às descobertas bem correlacionadas com o grau de reatividade sérica ao caule HA para cada um dos grupos experimentais, a reatividade de HA a partir do vírus VN04 foi avaliada. Conforme esperado, a reatividade a H5 HA foi mais alta no grupo que experimentou tanto infecções por 20 vírus sazonal como pandémico. Embora os camundongos que foram infectados com cepas sazonais enxertadas tenham exibido um grau mais alto de reatividade a HA a partir do vírus VN04 comparados aos camundongos inoculados apenas uma vez com 104 PFU de vírus NC99, este título ainda foi mais 25 baixo que aquele do grupo NC99/Ca109, onde 100 vezes menos vírus foram usados para o estímulo. A fim de excluir a contribuição potencial de anticorpos N1-específicos para o grau de proteção observado aqui, os títulos de anticorpos séricos foram avaliados por ELISA. Os títulos eram 30 equivalentes independente do vírus usado para estimular a infecção por vírus NC99 inicial. 0 estímulo com um vírus H1N1 sazonal ou pandêmico aprimorou similarmente o título de anticorpo NA sobre a resposta observada após uma infecção por vírus. 5 6.10.3 CONCLUSÃO Este exemplo recapitula nos camundongos as descobertas que os indivíduos infectados com vírus pH1N1 têm títulos de anticorpos caule-específicos mais altos comparados aos indivíduos não infectados (vide, por exemplo, 10 Exemplo 6.8). Neste modelo de camundongo de infecção por influenza, a infecção de camundongos com um vírus H1N1 sazonal seguida pela exposição à cepa H1N1 pandêmica estimulou os títulos de anticorpos de caule de HA a uma extensão maior que a infecção sequencial com vírus H1N1 15 sazonal enxertado.
6.11 EXEMPLO 11: DIRECIONAR A RESPOSTA IMUNE
HUMORAL CONTRA INFLUENZA HEMAGLUTININA EM DIREÇÃO AO DOMÍNIO DO CAULE CONSERVADO ALTERANDO-SE A GLICOSILAÇÃO Este exemplo demonstra que o sistema imune pode 20 ser orientado a produzir anticorpos para o domínio do caule conservado de vírus influenzas mascarando-se os sítios antigênicos no domínio de cabeça de influenza através da introdução de sítios de glicosilação e tornando-se os sítios antigênicos mais acessíveis no domínio do caule 25 através da remoção de sítios de glicosilação.
6.11.1 MATERIAIS E MÉTODOS
6.11.1.1 GERAÇÃO E CLONAGEM DE MUTANTES DE DELEÇÃO E RIPER-GLICOSILAÇÃO A glicosilação N-ligada é programada pela pequena 30 sequência Asn-X-Ser/Thr dentro das proteínas, onde X pode ser qualquer aminoácido menos prolina. A remoção de sítios de glicosilaçáo individuais ou combinações destes de A/PR/8/34 HA, foi realizada através da mutação do resíduo Asn para Gin intimamente relacionada, usando mutagênese 5 sítio-direcionada (Stratagene, Santa Clara, CA). A estrategia reversa foi usada para introduzir sítios de glicosilaçáo N-ligados extras no domínio de cabeça globular de HA criando-se pequenas sequências Asn-X-Ser/Thr extras nos sítios antigênicos variáveis. Os genes mutados foram 10 introduzidos no plasmideo de proteína expressão pCAGGS ou plasmídeo pDZ para resgate de vírus (vide, por exemplo, E. Fodor et al., 1999, J. Virol. 73:9679-9682 e R. Hai et al., 2008, J. Virol, 82:10580-10590)
6.11.1.2 ENSAIOS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA 15 As células 293 T foram transfectadas com codificação de plasmídeo pCAGGS para mutantes do tipo selvagem e de glicosilação de hemaglutinina A/PR/8/34 ou cH5/1. Vinte e quatro horas pós-transfecção as células foram fixadas com 0,5% PFA/IX de PBS por 30 minutos a 20 temperatura ambiente (RT) e bloqueadas com 5% NE-leite/1X de PBS por 30 minutos a temperatura ambiente. MAbs foram diluídos em 5% NF-leite/lX de PBS e incubados a temperatura ambiente por 1 hora em uma concentração final de 5 pg/mL. Os soros de controle positivo foram diluídos 1:100. A 25 monocamada de célula foi lavada três vezes com 1X de PBS e, então, incubada com um IgG de burro anti-camundongo Alexa Fluor 488 (Invitrogen) em uma diluição de 1:1000 por 1 hora a temperatura ambiente. A reatividade de fluorescência foi visualizada usando um microscópio de fluorescência 30 invertido Olympus IX70.
6.11.1.3 WESTERN BLOT A análise SDS-PAGE (Biorad) e Western blot foram realizadas com usados celulares reduzidos de células transfectadas, usando o anticorpo NR-4539 e um anticorpo 5 secundário conjugado com peroxidase de rábano anti- camundongo (Santa Cruz Biotechnology). O anticorpo HA2 de vírus anti-influenza A monoclonal NR -4539 foi obtido através do NTH Biodefense and Emerging Infection Research Resources Repository, NIAID. 10 6.11.1.4 ENSAIOS DE HEMADSORÇÃO As células transfectadas foram incubadas com neuraminidase (Sialidase) a partir de Vibrio cholera (Roche) por 1 hora a 37°C e lavadas 3 vezes com 1X de PBS contendo 0,01% de CaCl2 e MgC12 . A seguir, a monocamada celular foi incubada por 30 minutos em gelo com uma suspensão de 2% de eritrócitos de galinha em PBS/CaC12/MgC12 e lavadas novamente 3 vezes com PBS/CaCl2 /MgCl2 . Os eritrócitos fixados foram lisados adicionando-se 50 mM de NH 4C1 e agitando as células por 15 minutos. 0 usado foi removido das células e a absorbância foi medida a 540 nm.
6.11.1.5 RESGATE DE VÌRUS 0 resgate do vírus influenza A a partir de plasmídeo DNA foi realizado conforme previamente descrito (vide, por exemplo, E. Fodor et al., 1999, J. Virol. 25 73:9679-9682, R. Hai et al., 2008, J. Virol. 82:10580-10590 and G. Neumann et al., 1999, PNAS 96:9345-9350). Para gerar o vírus PR8 do tipo selvagem (rWT) recombinante, as células 293T foram co-transfectadas com 1 pg de cada um dos 8 plasmídeos de resgate pDZ PR8 usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Os vírus que expressam HAs glicomutantes diferentes foram gerados do mesmo modo, porém, substituindo o plasmídeo de HA pela codificação de plasmideo correspondente para a sequência de HA mutante e para recuperar o vírus mutante correspondente. 24 horas 5 pós-transfecção, o sobrenadante contendo vírus foi inoculado em ovos de galinha embrionados de 8 dias de idade.
O fluido alantóide foi colhido após 2 dias de incubação a 37° C e avaliado para a presença de vírus através da hemaglutinaçao de eritrócitos de galinha e pela formação de 10 placa nas células MDCK (vide, por exemplo, E. Fodor et al., 1999, J. Virol. 73:9679-9682 e R. Hai et al., 2008, J. Virol. 82:10580-10590).
6.11.2 RESULTADOS
6.11.2.1 OS MUTANTES DE GLICOSILAÇÃO DE 15 INFLUENZA SÃO EXPRESSOS E APROPRIADAMENTE HIPER OU HIPO- GLIC©SILADOS Até 7 sítios de glicosilação extras foram introduzidos no domínio de cabeça globular de PR8 (vide Tabela 3). Além disso, as deleções para os sítios de 20 glicosilação 31 e 289 no domínio do caule de PR8 foram criadas. Os mutantes de HA contendo tais mutações de domínio de cabeça globular sozinhas, assim como, em combinação com as mutações de domínio do caule foram criadas e analisadas. 25 TABELA 3. Mutantes de glicosilação domínio de cabeça PR8 Glicanos de cabeça Clorie (resíduos de aminoácido, numeração H3) 81 131 142 158 165 172 189 195 199 210 42-1 X X X X X X X 42-4 X X X X X X
42-5 J X X X X x X A fim de determinar se as proteínas de HA mutadas foram expressas e os sítios de glicosilação introduzidos foram glicosilados ín vitro, as células 293 T foram transfectadas com as construções mutantes de HA e a análise 5 Western blot realizada nos usados celulares. A ponta de prova do Western blot com um anticorpo HA2 anti-influenza A mostrou que todas as construções virais foram expressas (Figura 49). A migração diferencial da proteína influenza no Western blot indicou que os glicanos foram adicionados de uma maneira que corresponde ao número de sítios de glicosilação introduzidos. As construções em que um sítio de glicosilação foi adicionado migraram com um peso molecular mais alto comparado ao PR8 do tipo selvagem, enquanto aquelas em que um sítio de glicosilação foi removido migraram com um peso molecular mais baixo em relação ao PR8 do tipo selvagem (Figura 49). A ligação de antissoro a partir de camundongos infectados com PR8 do tipo selvagem às construções foi reduzida, sugerindo que os sítios de ligação para os anticorpos no soro foram cobertos pelos sítios de glicanos adicionais.
A imunofluorescência foi usada para comparar os niveis áe expressão das construções de HA mutantes in vitro e para determinar se as proteínas de HA mutantes de glicosilação foram apropriadamente dobradas em sua conformação nativa. A introdução de sítios de glicosilação individuais no domínio de cabeça globular de HA em todos os quatro sítios antigênicos ainda permitiu a expressão de proteína e a ligação de anticorpo domínio-específico do caule de HA (Figura SOA). A adição de sítios de glicosilação no domínio de cabeça globular HA resultou em sinal de imunofluorescência de anti-domínio de cabeça específico reduzido (anticorpo PY102) comparado ao PR8 do 5 tipo selvagem HA, indicando que os sítios antigênicos no domínio de cabeça de HA foram na verdade mascarados pela glicosilação nos sítios introduzidos (Figura 50B e Tabela 4).
TABELA 4. Expressão e ligação de anticorpos aos mutantes de alicosilacão de influenza ligação de anticorpos Clone # Expressão Cabeça Caule PY102 6F12/C179/KB2 42-1 +/- +/- ++ 42-4 + + ++ 42-5 +/- +/- ++ A coloração de fluorescência do domínio do caule com anticorpos que ligam especificamente os epítopos conformacionais no caule (anticorpos KB2, C179 e 6F12) foi comparável àquela do PR8 do tipo selvagem, demonstrando que as proteínas virais mutantes foram apropriadamente dobradas em sua conformação nativa apesar da adição de sítios de glicosilação no domínio de cabeça (Figura 50C). A coloração rip imunofluorescência rÌá células tránsfeo ates com construções de PR8 HA mutantes em que os sítios de glicosilação foram introduzidos no domínio de cabeça (42-1, 42-4 e 42-5) e as células transfectadas com construções mutantes em que os sítios de glicosilação foram introduzidos no domínio de cabeça e em que os sítios de glicosilação foram removidos do domínio do caule (42-1,
A33/289; 42-4, t133/289; 42-5, 433/289) mostraram ligação reduzida ao anticorpo de anti-domínio de cabeça (PY102) comparada às células transfectadas com construções de HA de PR8 do tipo selvagem e as células transfectadas com 5 construções de HA de PR8 apenas com dois sítios de glicosilação no domínio do caule HA removidos (833/289) (Figura 50C). Em contrapartida, não existe diferença na capacidade de anticorpos anti-caule se ligarem ao domínio do caule de células que expressam estes mesmos mutantes quando comparadas ao PR8 do tipo selvagem e PR8 com os sítios de glicosilação removidos do domínio do caule (Figura 50C).
Para avaliar se o vírus mutante viável pode ser recuperado das células infectadas, um ensaio hemadsorção foi usado para determinar se os mutantes virais ainda eram capazes de ligar os receptores silaliados em eritrócitos de galinha. Os vírus mutantes que mantiveram uma capacidade de ligar os receptores silaliados podem indicar que os vírus podem entrar nas células através de seu receptor. Os mutantes de HA que expressam o vírus influenza em que determinados sítios de glicosilação foram removidos do caule de -HA foram capazes de ser resgatados (Figura 51). A seguir, a capacidade de o vírus ser resgatado foi avaliada usando um ensaio de hemaglutinina em ovos de galinha embrionados, conforme previamente descrito. Em particular, os mutantes de HA que expressam o vírus Influenza em que os sítios de glicosilação nas posições 289 e 483, ou 33, 289, e 483 foram removidos ligados aos eritrócitos, assim como, o vírus PR8 do tipo selvagem (Figura 51). Em contrapartida, a adição de sítios de glicosilação no domínio de cabeça de
HA pareceu interferir substancialmente na capacidade de o vírus que expressa as proteínas de HA mutantes ligar os eritrácitos (Figura 51).
6.12 EXEMPLO 12: UM DOMÍNIO DE TRIMERIZAÇÃO 5 CARBÓXI-TERMINAL ESTABILIZA OS EPÍTOPOS CONFORMACIONAIS NO
DOMÍNIO DO CAULE DE SUBSTRATOS DE HEMAGLUTININA
RECOMBINANTE SOLÚVEL Este exemplo demonstra que um domínio de trimerização carbóxi-terminal é importante para a 10 integridade estrutural de epítopos de caule em hemaglutinina de vírus influenza solúvel recombinante.
6.12.1 MATERIAIS E MÉTODOS
6.12.1.1 CÉLULAS As células de inseto Sf9 (ATCC # CRL-1711) foram 15 desenvolvidas em meio TMN-FH (Gemini Bio-Products) suplementadas com 10% de PBS (Atlanta Biologicals), 0,1% de Pluronic F68 (Sigma) e uma mistura de antibiótico Penicilina-Estreptomicina (Gibco). As células BTI-TN-5B1-4 (High Cinco - Vienna Institute of Biotechnology subclone) 20 foram desenvolvidas em meio isento de soro HyClone SEX (Fisher Scientific) suplementadas com mistura de antibiótico Penicilina-Estreptomicina (Gibco).
6.12.1.2 CLONAGEM E GERAÇÃO DE BACULOVÍRUS
RECOMBINANTE 25 A sequências que codificam HAs de cepas de H1 A/Puerto Rico/8/34 (PR8), A/California/04/09 (Ca109), H2 cepa A/Japan/305/57 (JAP57), cepas H3 A/Hong Kong/1/68 (HK68), A/Wisconsin/67/05 (Wisc05) e cepa H5 A/Viet Nam/1203/04 (VN04 - com o sítio de clivagem polibásico 30 removido; vide Steel et al., 2009, J Virol 83: 1742-1753)
foram amplificadas a partir de plasmídeos pCAGGS através da reação em cadeia da polimerase e clonados em um vetor pFastBac modificado (Invitrogen) usando endonucleases de restrição BamHI ou StuI e NotI (NEB). As sequências 5 iniciadoras são disponíveis mediante solicitação. Dois conjuntos de construções, HA sem e com domínio de trimerização, foram clonados: as construções de HA sem domínio de trimerização foram projetadas, de modo que a transmembrana C-terminal e o endodomínio da HA fossem substituídos por um tag de hexahistidina (a sequência de HA termina com 1509 para H1, V509 para H2 e H5 e 0508 para H3; numeração H3); o outro conjunto de construções, HA com um domínio de trimerização, também carece de transmembrana C- terminal e endodomínios (a sequência de HA termina com V503 - numeração H3), porém, inclui um sítio de clivagem de trombina e um domínio de trimerização de foldon T4 (vide, por exemplo, Meier et al., 2004, J Mol Biol 344: 1051-1069) além do tag de hexahistidina C-terminal (Figura 52). Os clones pFastBac recombinantes gerados foram transformados em bactéria DH1OBac (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante e as bacmidas recombinantes foram preparadas com um PureLink Plasmid Filter Midiprep kit (Invitrogen). As bacmidas recombinantes foram transformadas em células Sf9 usando Cellfectin II (Invitrogen) para resgate de baculovírus recombinante. Todas as sequências foram confirmadas através do sequenciamento de Sanger.
6.12.1.3 EXPRESSÃO, PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO
DE PROTEÍNA O baculovírus foi amplificado em células Sf9 até um estoque de passagem 3 e, então, usado para infectar células BTI-TN-5B1-4 (High Cinco) em 1x106 células/mi em meio isento de soro HyClone SFX (Fisher Scientific) em uma multiplicidade de 10 infecções.
A expressão foi realizada em frascos agitadores de 1.000 ml por 96 horas a 28 °C.
Após
5 96 horas, os sobrenadantes foram limpos em centrifugação de baixa velocidade (5000g, 4°C, 20 min.) e incubados com resina Ni-NTA (Qiagen) (3m1 de pasta fluída para 250 ml de sobrenadante de cultura) por duas horas a temperatura ambiente (RT). A mistura de resina-sobrenadante foi, então,
passada através de 10 ml de colunas de polipropileno (Qiagen). A resina retida foi lavada quatro vezes com 15 ml de tampão de lavagem (50 mM Na 2HCO3, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8) e a proteína foi eluída com tampão de eluição (50 mM de Na2HCO3 , 300 mM de NaC1, 300 mM de imidazol, pH 8). 0 eluato foi concentrado usando unidades de centrifugação Amicon Ultracell (Millipore) com um corte de 30 kDa e o tampão foi alterado para solução salina tamponada com fosfato (PBS) de pH 7,4. A concentração de proteína foi quantificada usando Quickstart Bradford Dye Reagent (Bio-Rad) com uma curva padrão de albumina de soro bovino.
A pureza, integridade e identidade da proteína foram avaliadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) (4 a 20% de poliacrilamida - géis Mini PROTEAN TGX, Bio-Rad), coloração de Coomassie e Western blot ou ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA). A extensão de trimerização e/ou multimerização foi testada através da reticulação de HA com bis-[sulfosuccinimidil]suberato (BS3 - Fisher Scientific) de acordo com as recomendações do fabricante.
Em resumo, 3 pg de HA foram incubados em 30 p1 de PBS na presença de um excesso molar de 25 de reticulador BS 3 . A mistura foi incubada a temperatura ambiente por 30 minutos e, então, BS3 foi arrefecida adicionando-se 1M de tampão de Tris-HC1 (pH 8) a uma concentração final de 50 mM.
Subsequentemente,
5 a análise SDS-PAGE e/ou.
Western blot com um anticorpo primário anti-his de camundongo (Sigma) e peroxidase de rábano anti-camundongo (Santa Cruz Biotechnology) ou anticorpo secundário conjugado com fosfatase alcalina (Santa Cruz Biotechnology) foi realizada. 10 6.12.1.4 ENSAIO DE IMUNOABSORÇÁO LIGADO À ENZIMA
As placas de immunolon 4HBX (Fisher Scientific)
foram revestidas com HA recombinante com e sem domínio de trimerização a uma concentração de 5 }gig/m1 em tampão de revestimento (0,1 M de Na2CO 3/NaHCO3i pH 9,2, 50 pl/poço) de 15 um dia para outro a 4°C.
As placas foram, então, bloqueadas por uma hora a temperatura ambiente com PBS (pH 7,4) contendo 1% de Tween 20 (TBPS) e 3% de pó de leite seco isento de gordura.
Após o bloqueio, as placas foram lavadas uma vez com TPBS e, então, incubadas com três diluições de 20 anticorpo monoclonal ou soros (100 p1 por poço em TPBS com
1% de pó de leite - concentração inicial de anticorpo monoclonal de 30 pg/ml; 1:100 diluições por soros) por uma hora a temperatura ambiente.
As placas foram, então, lavadas três vezes com 100 pl de TPBS e incubadas por outra 25 hora a temperatura ambiente com anticorpo IgG anti- camundongo conjugado com peroxidase de rábano (Santa Cruz Biotechnology) ou anticorpo secundário Fab anti-humano (Sigma) em uma diluição de 1:3.000 (50 p1 por poço) . Após mais três lavagens, as placas foram desenvolvidas usando 30 substrato SigmaFAST OPD (Sigma) (100 pl/poço),
.. 643/648 interrompidas com 3M de HC1 (50 pi/poço) e lidas com uma absorção de 490 nm em um leitor de placa Synergy 4 (BioTek).
A leitura obtida teve sua base subtraída com valores a partir de poços incubados apenas com anticorpo secundário. 5 Para estudos de estabilidade, a HA a partir do vírus PR8 com domínio de trimerização foi interrompida a 4°C por 60 dias, ou a -80°C e passou por um (padrão), dois, três ou quatro ciclos de congelamento e descongelamento. A estabilidade de anticorpos de ligação de cabeça versus 10 caule fio comparada usando anticorpos monoclonais PY102 e C179. As combinações de anticorpo-HA em ELISA foram efetuadas em triplicatas exceto para estudos de estabilidade onde duplicatas foram usadas.
6.12.2 RESULTADOS 15 6.12.2.1 UM DOMÍNIO DE TRIMERIZAÇÃO DE C-
TERMINAL ESTABILIZA E INDUZ A FORMAÇÃO DE TRÍMERO O domínio extracelular de diversas HAs de grupo 1 e grupo 2 foi expresso na forma solúvel com ou sem um C- domínio de trimerização de fogo T4 terminal (Figura 52) no 20 sistema de expressão baculoviral. As proteínas foram colhidas 96 horas pós-infecção e purificadas através de um tag de hexahistidina C-terminal usando uma coluna de Ni-NTA.
A proteína purificada foi concentrada usando colunas de centrifugação ultrafiltração, avaliada para integridade e 25 impurezas da proteína por SDS-PAGE e coloração de Coomassie e quantificada com reagente de Bradford. Com base na sequência de aminoácido e no fato de que o baculovírus expressou as HAs de comprimento total sem sítio de clivagem polibásico geralmente não é clivado, o domínio extracelular 30 de HA ode ter uma massa molecular esperada de aproximadamente 60 kDa por monômero (ou 180 kDa por trímero) sem levar a glicosilação em consideração. Ca109 (Hl), JAP57 (H2) e VN04 (H5 sem sítio de clivagem polibásico) HA sem domínio de trimerização pareceram ser parcialmente clivados 5 em HA1 e HA2, conforme indicado pela presença de bandas em aproximadamente 40 kDa (HAl) e 25 kDa (HA2) além da banda de HA não clivada a 60 kDa (HAO). Com base na presença exclusiva de uma banda de 60 kDa para Cal09, JAP57 e VN04 HAs com domínios de trimerização em SDS-PAGE de 10 desnaturação não redutora, pode-se supor que estes proteínas são predominantemente expressas como uma HAO não clivada (Figura 53A). De maneira adicional, as preparações de Wisc05 (H3) HA sem um domínio de trimerização mostraram um produto de degradação a 40 kDa que era reativo quando 15 sondado com um anticorpo anti-caule (12D1). Esta espécie, deste modo, provavelmente era um produto de clivagem não específica. Wisc05 HA com domínio de trimerização apareceu apenas como uma banda HAO (Figura 53A). PR8 e HK68 HA parecerem ser muito estáveis (presentes como HAO) mesmo na 20 ausência de um domínio de trimerização.
As HAs foram reticuladas com e sem domínio de trimerização T4 usando BS3, um reticulador químico de 11 Angstrom hidrofílico que foi recentemente usado para mostrar a trimerização para HAs (vide, por exemplo, Weldon 25 et al., 2010, PLoS One 5). Após a reticulação, as amostras foram diluídas em um corante de carga de desnaturação redutor e resolvidas em um gel SDS-PAGE de desnaturação redutor. As HAs de grupo 1 sem domínio de trimerização formaram oligômeros de peso molecular elevado que mal 30 passaram no gel de corrida e foram predominantemente retidas no gel de empilhamento (Figuras 53B e 53C). C fenótipo mais forte foi detectado para VN04 e JAP57; outras HAs de grupo 1 também formaram trímeros adicionais (aproximadamente 230 kDa), dímeros (130 a 150 kDa) e 5 monômeros (60 kDa) (Figuras 53B e 53C). As HAs de grupo 1 com domínio de trimerização formaram predominantemente trímeros que passaram a aproximadamente 230 kD no gel SDS- PAGE e formaram uma banda definida no gel de corrida. No entanto, elas também formaram dímeros (aproximadamente 130 10 a 150 kDa, mais fortes para Ca109) e monômeros (60 kDa). As HAs de grupo 2 se comportaram de maneira diferente: HK68 HA formou predominantemente trímeros e em algum grau dímeros independente da presença de um domínio de trimerização. Wisc05 HA mostrou principalmente a dimerização na ausência 15 de um domínio de trimerização, enquanto a HA com o domínio T4 foi predominantemente trimerizada.
6.12.2.2 UM DOMÍNIO DE TRIMERIZAÇÃO C-TERMINAL APRIMORA FORTEMENTE A LIGAÇÃO DE ANTICORPOS CAULE-REATIVOS
AOS SUBSTRATOS DE HA 20 A reatividade de um painel de anticorpos de neutralização amplamente reativos às construções de HA foi avaliada a fim de determinar a ligação diferencial destes anticorpos aos substratos HA com e sem domínio de trimerização. Os anticorpos caule-específicos mAb 0179, 25 camundongo mAb 6F12, humano mAb CR6261 (todo o grupo 1 específico); e camundongo mAb 12D1 e humano mAb CR8020 (ambos os grupos 2 específicos) foram usados no experimento.
Quatro outros anticorpos caule-reativos, KB2, BD3, GG3 e IB11, que foram recentemente isolados e caracterizados para 30 ter reatividade tanto para H1 como H5 Has também foram usados no experimento.
Como um controle, os anticorpos de cepa específicos que são conhecidos por se ligar ao domínio de cabeça globular de HA foram usados.
Como controles adicionais, os soros de camundongos sub-letalmente 5 infectados com cepas de vírus influenza (PR8, Ca109, H3, VN04) ou vacinados com VLPs (JAP57) foram usados.
Os anticorpos C179, CR6261 e 6F12 mostraram um fenótipo de ligação forte para ambas Hl HAs que foram testadas (Ca109 e PR8). Deve-se notar que eles se ligam exclusivamente às HAs 10 que tiveram um domínio de trimerização (Figuras 54A e 54B); nenhuma ligação foi observada nas HAs sem um domínio de trimerização.
As características de ligação similares foram observadas com os quatro outros anticorpos H1-H5 de neutralização amplamente caule-reativos.
Em contrapartida, 15 os antcorpos específicos de cabeça, tais como, 7B2 (Ca109)
e PY102 (PR8), reagiram com as HAs independente da expressão de um domínio de trimerização e estas descobertas foram confirmadas usando soros a partir de animais IN infectados com Ca109 ou PR8 (Figura 54A e 54B). 20 Este efeito não é específico ao subtipo Hl - ao testar a ligação de 0179 e CR6261 a JAP57 (H2) e VN04 (H5)
HAs com e sem um domínio de trimerização, um fenótipo similar foi observado, onde estes anticorpos reagiram apenas com formas trimerizadas da proteína (Figuras 55A e
25 55B). 0 mesmo resultado foi observado quando a reatividade dos quatro anticorpos Hl-H5 foi avaliada.
Os anticorpos específicos de cabeça 8F8 (JAP57) e mAb#8 (VN04) ou soros anti-H2 ou anti-H5 policlonal reconheceram ambas as formas de HA igualmente bem.
Para os anticorpos de ligação de HA de grupo 2 um padrão diferente surgiu. A fim de testar os efeitos de um domínio de trimerização sobre a reatividade de anticorpos de caule com HAs de grupo 2, os anticorpos amplamente 5 reativos CR8020 e 12D1 foram usados. CR8020 liga um epítopo conformacional nas HAs de grupo 2, enquanto imagina-se que 12D1 se ligue a um epítopo linear dentro da alfa-hélice longa (LAH) da subunidade de HA2. A ligação de CR8020 às HAs HK68 e Wisc05 com domínios de trimerização foi muito aprimorada através da ligação às HAs sem domínio de trimerização (Figuras 56A e 56B). No entanto, a ausência do domínio de trimerização não aboliu completamente a ligação, conforme observado nas HAs de grupo 1. 12D1 não distinguiu entre as HAs com ou sem o domínio de trimerização (Figura 15 56) .
6.12.3 CONCLUSÃO O domínio de trimerização T4 permite a trimerização bem sucedida de moléculas de HA solúveis e aumenta muito a estabilidade destas moléculas após a expressão de baculovírus.
Todas as publicações, patentes e pedidos de patente citados neste relatório descritivo são incorporados no presente documento a título de referência como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse específica e individualmente indicado como incorporado a título de referência. Embora a invenção precedente tenha sido descrito em alguns detalhes por meio de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de entendimento, será prontamente aparente para aqueles com conhecimento comum na técnica à luz dos ensinamentos da presente invenção que determinadas alterações e modificações podem ser efetuadas sem se afastar do espírito ou escopo das reivindicações em anexo.

Claims (22)

REIVINDICAÇÕES MODIFICADAS
1. Polipeptídeo de hemaglutinina (HA) de vírus influenza quimérico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um domínio de tronco HA e um domínio de cabeça globular HA, em que o domínio de cabeça globular HA é heterólogo ao domínio de tronco HA.
2. Polipeptídeo de hemaglutinina (HA) de vírus influenza quimérico, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio de tronco HA é de uma cepa de vírus influenza sazonal e o domínio de cabeça globular HA é de uma cepa de vírus influenza heterólogo.
3. Polipeptídeo HA de vírus influenza quimérico, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio de tronco HA mantém os resíduos de cisteína designados Ap e Aq na Figura
1.
4. Polipeptídeo HA de vírus influenza quimérico, de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio de tronco HA é o domínio de tronco HA de um vírus influenza de subtipo H1 ou subtipo H3.
5. Polipeptídeo HA de vírus influenza quimérico, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio de cabeça globular HA é o domínio de cabeça globular HA de um vírus influenza de subtipo H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, ou H17.
6. Polipeptídeo de hemaglutinina (HA) de vírus influenza quimérico, de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que: (a) o domínio de cabeça globular HA é heterólogo ao domínio de tronco HA, em que o domínio de tronco HA compreende pelo menos um sítio de glicosilação modificado, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural tendo uma sequência de aminoácido Asn-Xaa- Ser/Thr/Cys, e em que a modificação interfere na capacidade de um glicano de se ligar ao sítio de glicosilação modificado, e em que Xaa é qualquer aminoácido; e/ou (b) o domínio de cabeça globular HA compreende, um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural tendo uma sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido.
7. Polipeptídeo HA de vírus influenza quimérico, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que: (a) o sítio de glicosilação modificado fica localizado em posições de aminoácido selecionadas a partir do grupo que consiste em posições de aminoácido 20-22 21- 23, 33-35, 46-48, 289-291, 290-292, 296-298 e 481-483, de acordo com o sistema de numeração H3, em que o domínio de tronco HA é um domínio de tronco HA proveniente de um vírus influenza de subtipo H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, e H16; (b) o sítio de glicosilação modificado fica localizado em posições de aminoácido selecionadas a partir do grupo que consiste em posições de aminoácido 8-10, 22-
24, 38-40, 46-48, 296-298, 410-412,e 481-483, de acordo com o sistema de numeração H3, em que o domínio de tronco HA é um domínio de tronco HA proveniente de um vírus influenza de subtipo H3, H4, H7, H10, H14, ou H15; ou (c) a modificação compreende uma ou mais substituições de aminoácido do sítio de glicosilação de ocorrência natural.
8. Polipeptídeo de vírus influenza quimérico, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que: (a) o domínio de cabeça globular HA é o domínio de cabeça globular HA de um subtipo de vírus influenza H1 e em que o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural fica localizado em um sítio antigênico Sa, Sb, Ca, ou Cb; (b) o domínio de cabeça globular HA é um subtipo de vírus influenza H3 e em que o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural fica localizado em um sítio antigênico A, B, C, ou D; ou (c) o sítio de glicosilação de ocorrência não- natural se encontra nas posições de aminoácido de hemaglutinina 59-61, 129-131, 158-160 ou 165-167, de acordo com a numeração H3.
9. Polipeptídeo de hemaglutinina (HA) de vírus influenza não-quimérico, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um domínio de tronco HA e um domínio de cabeça globular HA, em que o domínio de cabeça globular HA é homólogo ao domínio de tronco HA, em que o domínio de tronco HA compreende um ou mais sítios de glicosilação modificados, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural tendo uma sequência de aminoácido Asn- Xaa-Ser/Thr/Cys, e em que a modificação interfere na capacidade de um glicano de se ligar ao sítio de glicosilação modificado, em que Xaa é qualquer aminoácido.
10. Polipeptídeo HA de vírus influenza não- quimérico, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio de cabeça globular HA compreende, ainda, um ou mais sítios de glicosilação de ocorrência não-natural tendo uma sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa é qualquer aminoácido.
11. Polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza não-quimérico, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que: (a) o domínio de cabeça globular HA é o domínio de cabeça globular HA de um subtipo de vírus influenza H1 e em que o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural fica localizado em um sítio antigênico Sa, Sb, Ca, ou Cb; (b) o domínio de cabeça globular HA é um subtipo de vírus influenza H3 e em que o sítio de glicosilação de ocorrência não-natural fica localizado em um sítio antigênico A, B, C, ou D; ou (c) o sítio de glicosilação de ocorrência não- natural se encontra em uma posição de aminoácido de hemaglutinina 59-61, 81-83, 129-131, 143-145, 158-160 e/ou 165-167, 170-172, 187-189, 193-195, 197-199, 208-210, de acordo com a numeração H3.
12. Polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina (HA) de vírus influenza, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:
(I) (a) um domínio HA1 de hemaglutinina de influenza que compreende um segmento de tronco N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante de 1 a 50 resíduos heterólogos que, sucessivamente, sejam covalentemente ligados a um segmento de tronco curto C-terminal HA1; sendo que o dito domínio HA1 está em associação terciária ou quaternária com (b) um domínio HA2 de hemaglutinina de influenza, em que o domínio de polipeptídeo HA de domínio de tronco de vírus influenza compreende, ainda, um ou mais sítios de glicosilação modificados, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural tendo uma sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que a modificação interfere na capacidade de um glicano de se ligar ao sítio de glicosilação modificado, e em que Xaa é qualquer aminoácido; (II) (a) um domínio HA1 de hemaglutinina de influenza que compreende um segmento de tronco longo N- terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante de 1 a 50 resíduos heterólogos que, sucessivamente, sejam covalentemente ligados a um segmento de tronco longo C- terminal HA1; sendo que o dito domínio HA1 está em associação terciária ou quaternária com (b) um domínio HA2 de hemaglutinina de influenza, em que o domínio de polipeptídeo HA de domínio de tronco de vírus influenza compreende, ainda, um ou mais sítios de glicosilação modificados, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural tendo uma sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que a modificação interfere na capacidade de um glicano de se ligar ao sítio de glicosilação modificado, e em que Xaa é qualquer aminoácido; (III) (a) um domínio HA1 de hemaglutinina de influenza que compreende um segmento de tronco N-terminal HA1 covalentemente ligado a um ligante de 1 a 50 resíduos heterólogos que, sucessivamente, sejam covalentemente ligados a um segmento de tronco C-terminal HA1; sendo que o dito domínio HA1 está em associação terciária ou quaternária com (b) um domínio HA2 de hemaglutinina de influenza, em que o domínio de polipeptídeo HA de domínio de tronco de vírus influenza compreende, ainda, um ou mais sítios de glicosilação modificados, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural tendo uma sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que a modificação interfere na capacidade de um glicano de se ligar ao sítio de glicosilação modificado, e em que Xaa é qualquer aminoácido; ou (IV) (a) um domínio HA1 de hemaglutinina de influenza que compreende, ligado na ordem a seguir: um segmento de tronco N-terminal HA1, um primeiro ligante de 1 a 50 resíduos heterólogos, um segmento de tronco intermediário HA1, um segundo ligante de 1 a 50 resíduos heterólogos e um segmento de tronco C-terminal HA1; sendo que o dito domínio HA1 está em associação terciária ou quaternária com
(b) um domínio HA2 de hemaglutinina de influenza, em que o domínio de tronco polipeptídeo de hemaglutinina (HA) de vírus influenza compreende, ainda, um ou mais sítios de glicosilação modificados, em que o sítio de glicosilação modificado compreende uma modificação de um sítio de glicosilação de ocorrência natural tendo uma sequência de aminoácido Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que a modificação interfere na capacidade de um glicano de se ligar ao sítio de glicosilação modificado, e em que Xaa é qualquer aminoácido.
13. Polipeptídeo de domínio de tronco de hemaglutinina (HA) de vírus influenza, de acordo com a reivindicação 12, CARACTERIZADO pelo fato de que: (a) o sítio de glicosilação modificado fica localizado em posições de aminoácido selecionadas a partir do grupo que consiste em posições de aminoácido 20-22, 21- 23, 33-35, 46-48, 289-291, 290-292, 296-298 e 481-483, de acordo com o sistema de numeração H3, em que o domínio de tronco HA é um domínio de tronco HA proveniente de um vírus influenza de subtipo H1, H2, H5, H6, H8, H9, H11, H12, H13, e H16; e/ou (b) o sítio de glicosilação modificado fica localizado em posições de aminoácido selecionadas a partir do grupo que consiste em posições de aminoácido 8-10, 22- 24, 38-40, 46-48, 296-298, 410-412, e 481-483, de acordo com o sistema de numeração H3, em que o domínio de tronco HA é um domínio de tronco HA proveniente de um vírus influenza de subtipo H3, H4, H7, H10, H14, H15.
14. Polipeptídeo HA, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o dito polipeptídeo é solúvel.
15. Ácido nucléico, CARACTERIZADO pelo fato de que codifica o polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
16. Célula hospedeira, CARACTERIZADA pelo fato de que expressa o ácido nucléico, conforme definido na reivindicação 15.
17. Vírus, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, ou um genoma modificado por engenharia genética para expressar o ácido nucléico, conforme definido na reivindicação 15, em que o vírus é opcionalmente inativado ou dividido, e em que o vírus é opcionalmente um vírus da influenza.
18. Partícula tipo vírus, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14.
19. Composição imunogênica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o polipeptídeo de hemaglutinina (HA) de vírus influenza quimérico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, o vírus definido na reivindicação 17 ou a partícula tipo vírus definida na reivindicação 18.
20. Uso de uma composição imunogênica, conforme definida na reivindicação 19, CARACTERIZADO por ser na preparação de um medicamento para imunizar um indivíduo contra a infecção de vírus influenza, prevenir ou tratar uma doença de vírus influenza em um sujeito ou tratar uma infecção de vírus influenza em um sujeito.
21. Uso de uma composição imunogênica compreendendo um polipeptídeo de hemaglutinina de vírus influenza ou um vírus influenza compreendendo um polipeptídeo de hemaglutinina CARACTERIZADO por ser na preparação de um medicamento para prevenir uma doença ou infecção de vírus influenza em um indivíduo, em que o indivíduo é virgem ao polipeptídeo de hemaglutinina.
22. Uso, de acordo com a reivindicação 20 ou 21, CARACTERIZADO pelo fato do indivíduo ser humano.
BR112014006694-9A 2011-09-20 2012-09-19 vacinas contra o vírus influenza e usos dessas BR112014006694A2 (pt)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161536924P 2011-09-20 2011-09-20
US201161565899P 2011-12-01 2011-12-01
US61/565,899 2011-12-01
US201261607526P 2012-03-06 2012-03-06
US61/607,526 2012-03-06
US201261648525P 2012-05-17 2012-05-17
US201261670108P 2012-07-10 2012-07-10
US61/670,108 2012-07-10
US201261684481P 2012-08-17 2012-08-17
PCT/US2012/056122 WO2013043729A1 (en) 2011-09-20 2012-09-19 Influenza virus vaccines and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
BR112014006694A2 true BR112014006694A2 (pt) 2020-11-17

Family

ID=47914828

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
BR112014006694-9A BR112014006694A2 (pt) 2011-09-20 2012-09-19 vacinas contra o vírus influenza e usos dessas

Country Status (17)

Country Link
US (2) US10131695B2 (pt)
EP (2) EP2758075B1 (pt)
JP (4) JP6498439B2 (pt)
KR (1) KR20140068205A (pt)
CN (3) CN116162175A (pt)
AR (1) AR090392A1 (pt)
AU (2) AU2012312529B2 (pt)
BR (1) BR112014006694A2 (pt)
CA (1) CA2849434A1 (pt)
EA (1) EA201490659A1 (pt)
ES (1) ES2953393T3 (pt)
HK (1) HK1200102A1 (pt)
IL (2) IL231547B (pt)
IN (1) IN2014CN02114A (pt)
MX (1) MX2014003308A (pt)
SG (1) SG11201400743VA (pt)
WO (1) WO2013043729A1 (pt)

Families Citing this family (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010117786A1 (en) 2009-03-30 2010-10-14 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Influenza virus vaccines and uses thereof
AU2010254136B2 (en) 2009-05-26 2016-09-29 Mount Sinai School Of Medicine Monoclonal antibodies against influenza virus generated by cyclical administration and uses thereof
US9597379B1 (en) 2010-02-09 2017-03-21 David Gordon Bermudes Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies
US8771669B1 (en) 2010-02-09 2014-07-08 David Gordon Bermudes Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria
US8524220B1 (en) 2010-02-09 2013-09-03 David Gordon Bermudes Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria
EP2536425B1 (en) 2010-02-18 2019-06-19 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Vaccines for use in the prophylaxis and treatment of influenza virus disease
AU2011235220B2 (en) 2010-03-30 2016-03-10 Mount Sinai School Of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
US10183069B2 (en) 2011-03-21 2019-01-22 Altimmune Inc. Rapid and prolonged immunologic-therapeutic
US10131695B2 (en) 2011-09-20 2018-11-20 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
JP2016508133A (ja) 2012-12-18 2016-03-17 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ インフルエンザウイルスワクチン及びその使用
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
CN105848722B (zh) 2013-10-02 2021-09-03 免疫医疗有限责任公司 中和抗甲型流感抗体及其用途
US9737592B1 (en) 2014-02-14 2017-08-22 David Gordon Bermudes Topical and orally administered protease inhibitors and bacterial vectors for the treatment of disorders and methods of treatment
WO2015184272A2 (en) * 2014-05-30 2015-12-03 Sanofi Pasteur Biologics Llc Expression and conformational analysis of engineered influenza hemagglutinin
IL249704B (en) * 2014-07-10 2021-03-25 Janssen Vaccines & Prevention Bv Influenza virus vaccines and their uses
US10294292B2 (en) 2014-07-15 2019-05-21 Medimmune, Llc Neutralizing anti-influenza B antibodies and uses thereof
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
JP2018504412A (ja) 2015-01-23 2018-02-15 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ インフルエンザウイルスワクチン接種レジメン
WO2016179099A1 (en) * 2015-05-04 2016-11-10 Epivax, Inc. Modified h7 hemagluttinin glycoprotein of the influenza a/shanghai/2/2013 h7 sequence
HUE056407T2 (hu) 2015-06-01 2022-02-28 Medimmune Llc Neutralizáló influenzaellenes kötõmolekulák és alkalmazásaik
WO2016205347A1 (en) * 2015-06-16 2016-12-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
EP3402513A4 (en) 2016-01-13 2019-10-23 Medlmmune, LLC METHOD OF TREATING A FLU
RU2022108149A (ru) * 2016-02-03 2022-05-05 СиДжи ДИСКАВЕРИ, ИНК. Композиции гемагглютинина гриппа с гетерологичными эпитопами и/или измененными сайтами расщепления при созревании
JP6868763B2 (ja) * 2016-04-01 2021-05-12 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 インフルエンザウィルスに結合する抗体
EP3463447A4 (en) * 2016-06-03 2020-05-27 Icahn School of Medicine at Mount Sinai INFLUENZA VIRUSES
AU2017275663B2 (en) 2016-06-03 2021-12-09 Sanofi Pasteur Inc. Modification of engineered influenza hemagglutinin polypeptides
CA3023143A1 (en) * 2016-06-15 2017-12-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof
EP3506938A1 (en) 2016-09-02 2019-07-10 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Stabilized group 2 influenza hemagglutinin stem region trimers and uses thereof
WO2018085488A1 (en) 2016-11-02 2018-05-11 Iowa State University Research Foundation, Inc. Universal mammalian influenza vaccine
US20180128545A1 (en) * 2016-11-08 2018-05-10 Berry Metal Company Modular furnace cooling wall
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
WO2018175560A1 (en) * 2017-03-22 2018-09-27 The Scripps Research Institute Nanoparticle immunogens to elicit responses against the influenza receptor binding site on the hemagglutinin head domain
WO2018187706A2 (en) 2017-04-07 2018-10-11 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Anti-influenza b virus neuraminidase antibodies and uses thereof
JP2021519596A (ja) 2018-04-03 2021-08-12 サノフイＳａｎｏｆｉ フェリチンタンパク質
MX2020010199A (es) * 2018-04-03 2021-01-08 Sanofi Sa Polipeptidos antigenicos del virus sincitial respiratorio.
US20210139542A1 (en) * 2018-05-18 2021-05-13 Chan Zuckerberg Biohub, Inc. Epitope restriction for antibody selection
WO2020014675A1 (en) * 2018-07-13 2020-01-16 University Of Georgia Research Foundation Methods for generating pan-epitopic immunogens of influenza h3 virus, compositions and methods of use thereof
CN109096376A (zh) * 2018-09-20 2018-12-28 扬州大学 流感病毒ha多肽、klh偶联多肽及多克隆抗体的制备方法
KR102098585B1 (ko) * 2018-11-21 2020-04-08 고려대학교 산학협력단 교차 면역원성을 갖는 h2 아형 인플루엔자 바이러스 및 이를 포함하는 백신
CA3132697A1 (en) * 2019-04-06 2020-10-15 Scot ROBERTS Broad and long-lasting influenza vaccine
EP4031558A4 (en) * 2019-09-20 2023-05-31 Academia Sinica CHIMERIC HEMAGGLUTININ PROTEIN AND VACCINE COMPOSITION COMPRISING THEM
CA3158145A1 (en) * 2019-10-15 2021-04-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Influenza virus vaccines and uses thereof
IL298035A (en) 2020-05-08 2023-01-01 Academia Sinica Chimeric influenza vaccines
CN112111503B (zh) * 2020-08-24 2023-04-07 河北省动物疫病预防控制中心 同时预防禽流感h5和h9亚型的腺病毒载体二价苗及其制备方法
US20240050551A1 (en) * 2021-01-12 2024-02-15 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Herpes simplex virus type 1 derived influenza vaccine
CN113082187B (zh) * 2021-04-09 2023-06-27 北京红太阳药业有限公司 小柴胡提取物与阿奇霉素联合在治疗病毒性肺炎中的应用
TW202334429A (zh) 2021-10-01 2023-09-01 中央研究院 Sars-cov-2棘蛋白特異性抗體及其用途

Family Cites Families (169)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US5174993A (en) 1981-12-24 1992-12-29 Health Research Inc. Recombinant avipox virus and immunological use thereof
US5833975A (en) 1989-03-08 1998-11-10 Virogenetics Corporation Canarypox virus expressing cytokine and/or tumor-associated antigen DNA sequence
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US5110587A (en) 1981-12-24 1992-05-05 Health Research, Incorporated Immunogenic composition comprising synthetically modified vaccinia virus
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
ZA836080B (en) 1982-08-23 1984-04-25 Scripps Clinic Res Broad spectrum influenza antisera
US4693981A (en) 1983-12-20 1987-09-15 Advanced Genetics Research Institute Preparation of inactivated viral vaccines
US5106619A (en) 1983-12-20 1992-04-21 Diamond Scientific Co. Preparation of inactivated viral vaccines
FR2583429B1 (fr) 1985-06-18 1989-11-03 Transgene Sa Vecteur d'expression de l'interferon u dans les cellules de mammifere, procede pour sa mise en oeuvre et produit obtenu et composition pharmaceutique contenant l'interferon u
US5182192A (en) 1987-03-27 1993-01-26 The Wistar Institute Monoclonal antibodies against glycolipid antigens, methods of producing these antibodies, and use therefor
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
US5166057A (en) 1989-08-28 1992-11-24 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand rna virus expression-systems
US6001634A (en) 1989-08-28 1999-12-14 Palese; Peter Recombinant negative strand RNA viruses
US5854037A (en) 1989-08-28 1998-12-29 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
EP1690935A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US6887699B1 (en) 1990-05-22 2005-05-03 Medimmune Vaccines, Inc. Recombinant negative strand RNA virus expression systems and vaccines
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
FR2664905B1 (fr) 1990-07-18 1994-08-12 Agronomique Inst Nat Rech Baculovirus modifie, son procede d'obtention, et vecteurs d'expression obtenus a partir dudit baculovirus.
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DK0546073T3 (da) 1990-08-29 1998-02-02 Genpharm Int Frembringelse og anvendelse af transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
US5484719A (en) 1991-08-26 1996-01-16 Edible Vaccines, Inc. Vaccines produced and administered through edible plants
US6034298A (en) 1991-08-26 2000-03-07 Prodigene, Inc. Vaccines expressed in plants
US5612487A (en) 1991-08-26 1997-03-18 Edible Vaccines, Inc. Anti-viral vaccines expressed in plants
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
JP3037554B2 (ja) 1993-04-20 2000-04-24 寳酒造株式会社 免疫原性人工ポリペプチド
US6337070B1 (en) 1993-04-29 2002-01-08 Takara Shuzo Co., Ltd. Polypeptides for use in generating anti-human influenza virus antibodies
US5589174A (en) 1992-09-17 1996-12-31 Takara Shuzo Co., Ltd. Anti-human influenza virus antibody
EP0621339B1 (en) 1992-09-17 2001-10-24 Takara Shuzo Co. Ltd. Immunogenic human influenza A virus haemagglutinin polypeptides
GB9221654D0 (en) 1992-10-15 1992-11-25 Scotgen Ltd Recombinant human anti-cytomegalovirus antibodies
WO1994012629A1 (en) 1992-12-02 1994-06-09 Baylor College Of Medicine Episomal vectors for gene therapy
WO1994016109A1 (en) 1993-01-15 1994-07-21 Whitehead Institute For Biomedical Research Membrane fusion events and means for altering same
WO1994017826A1 (en) 1993-02-01 1994-08-18 Smithkline Beecham Corporation Vaccinal polypeptides
US5573916A (en) 1994-05-19 1996-11-12 Coretech, Inc. Immunogenic constructs comprising b-cell and t-cell epitopes on common carrier
US5505947A (en) 1994-05-27 1996-04-09 The University Of North Carolina At Chapel Hill Attenuating mutations in Venezuelan Equine Encephalitis virus
US5622701A (en) 1994-06-14 1997-04-22 Protein Design Labs, Inc. Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin
EP1394259A3 (en) 1994-07-18 2004-04-14 Karl-Klaus Prof. Dr. Conzelmann Recombinant infectious non-segmented negative strand RNA virus
AU712714B2 (en) 1994-10-03 1999-11-11 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Enhanced immune response by introduction of cytokine gene and/or costimulatory molecule B7 gene in a recombinant virus expressing system
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US7153510B1 (en) 1995-05-04 2006-12-26 Yale University Recombinant vesiculoviruses and their uses
DE69510207T3 (de) 1995-08-09 2007-02-15 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Verfahren zur Herstellung von infektiösen minussträngigen RNA-Viren
EP0865499B1 (en) 1995-09-14 2009-03-18 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. Production of lysosomal enzymes in plant-based expression systems
WO1997012032A1 (en) 1995-09-27 1997-04-03 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Production of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
JP2820106B2 (ja) 1996-02-29 1998-11-05 日本電気株式会社 トラヒックシェーパ装置
DE69736226T2 (de) 1996-04-19 2006-11-09 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Verfahren zur anregung einer immunantwort durch verabreichung von nutzorganismen, die intimin allein oder als fusionsprotein mit einem oder mehreren anderen antigenen exprimieren
WO1997040161A1 (en) 1996-04-19 1997-10-30 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medecine Histidine-tagged intimin and methods of using intimin to stimulate an immune response and as an antigen carrier with targeting capability
KR100894670B1 (ko) 1996-07-15 2009-04-22 더 가번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카, 에즈 레프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비시즈 클론닝된 뉴클레오타이드 서열로부터 약독화된 호흡기 세포융합 바이러스 백신의 생산
US20050032211A1 (en) 1996-09-26 2005-02-10 Metabogal Ltd. Cell/tissue culturing device, system and method
IL155588A0 (en) 2003-04-27 2003-11-23 Metabogal Ltd Methods for expression of enzymatically active recombinant lysosomal enzymes in transgenic plant root cells and vectors used thereby
CN1232504A (zh) 1996-09-27 1999-10-20 美国氰胺公司 在单链负义病毒目病毒内引起减毒的3'基因组启动子区和聚合酶基因中的突变
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
ATE387495T1 (de) 1996-12-03 2008-03-15 Amgen Fremont Inc Vollkommen humane antikörper die egfr binden
US5891705A (en) 1997-04-08 1999-04-06 Pentose Pharmaceuticals, Inc. Method for inactivating a virus
TR199902553T2 (xx) 1997-04-14 2000-03-21 Micromet Gesellschaft F�R Biomedizinische Forschung Mbh �nsan v�cuduna kar�� antijen resept�rlerinin �retimi i�in yeni metod ve kullan�mlar�.
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
KR100702523B1 (ko) 1997-05-23 2007-04-04 더 가번먼트 오브 더 유나이티드 스테이츠 오브 아메리카, 에즈 레프리젠티드 바이 더 디파트먼트 오브 헬쓰 앤드 휴먼 서비시즈 클로닝된 뉴클레오타이드 서열로부터 약독화된파라인플루엔자 바이러스를 제조하는 방법
US6165476A (en) 1997-07-10 2000-12-26 Beth Israel Deaconess Medical Center Fusion proteins with an immunoglobulin hinge region linker
PT1012244E (pt) 1997-07-11 2007-08-21 Univ Yale ''rabdovírus com revestimentos remanipulados''
KR20010030630A (ko) 1997-09-19 2001-04-16 윌리암 에이취 캘넌, 에곤 이 버그 약독화 호흡 신시티아 바이러스
KR20060080249A (ko) 1998-06-12 2006-07-07 마운트 시나이 스쿨 오브 메디신 오브 뉴욕 유니버시티 변형된 인터페론 길항물질을 보유하고, 백신 및 약제로사용되는 약독화된 네거티브 가닥 바이러스
CA2334857C (en) 1998-06-12 2012-03-20 Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Interferon inducing genetically engineered attenuated viruses
US6544785B1 (en) 1998-09-14 2003-04-08 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Helper-free rescue of recombinant negative strand RNA viruses
US6146642A (en) 1998-09-14 2000-11-14 Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines
EP1230257A4 (en) 1998-12-23 2003-08-13 Thompson Boyce Plant Res EXPRESSION OF IMMUNOGENOUS HEPATITIS B SURFACE ANTIGEN IN TRANSGENIC PLANTS
AT407958B (de) 1999-02-11 2001-07-25 Immuno Ag Inaktivierte influenza-virus-vakzine zur nasalen oder oralen applikation
IL146062A0 (en) 1999-04-29 2002-07-25 Marlow Foods Ltd Herbicide resistant plants
DK1194580T4 (da) 1999-07-14 2011-01-03 Sinai School Medicine In-vitro rekonstitution af segmenterede negativstrengede RNA-virus
CA2383105C (en) 1999-09-24 2010-01-26 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Intranasal influenza virus vaccine
US7521220B2 (en) 1999-11-26 2009-04-21 Crucell Holland B.V. Production of vaccines
WO2001071014A2 (en) 2000-03-17 2001-09-27 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Expression of recombinant human acetylcholinesterase in transgenic plants
US6951754B2 (en) 2000-04-28 2005-10-04 St. Jude Children's Research Hospital DNA transfection system for the generation of infectious influenza virus
US6632620B1 (en) 2000-06-22 2003-10-14 Andrew N. Makarovskiy Compositions for identification and isolation of stem cells
IL153290A0 (en) * 2000-06-23 2003-07-06 American Cyanamid Co Assembly of wild-type and chimeric influenza virus-like particles (vlps)
ES2563402T3 (es) 2002-02-13 2016-03-15 Wisconsin Alumni Research Foundation Señal para el empaquetamiento de vectores del virus de la gripe
WO2007095318A2 (en) 2006-02-13 2007-08-23 Fraunhofer Usa, Inc. Influenza antigens, vaccine compositions, and related methods
US20040091503A1 (en) 2002-08-20 2004-05-13 Genitrix, Llc Lectin compositions and methods for modulating an immune response to an antigen
CA2514177A1 (en) 2003-01-29 2004-08-12 Josef Michl Tolerance-induced targeted antibody production
EP1594536B1 (en) 2003-01-30 2009-03-25 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Adjuvanted influenza vaccine
US7695725B2 (en) 2003-02-06 2010-04-13 Aduro Biotech Modified free-living microbes, vaccine compositions and methods of use thereof
JP4368594B2 (ja) 2003-02-24 2009-11-18 株式会社インシリコサイエンス タンパク質構造予測装置、タンパク質構造予測方法、プログラム、および、記録媒体
US7951557B2 (en) 2003-04-27 2011-05-31 Protalix Ltd. Human lysosomal proteins from plant cell culture
AU2004235813B2 (en) 2003-05-05 2010-07-29 Boyce Thompson Institute For Plant Research Vectors and cells for preparing immunoprotective compositions derived from transgenic plants
WO2005018539A2 (en) 2003-06-16 2005-03-03 Medimmune Vaccines, Inc. Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
US8592197B2 (en) 2003-07-11 2013-11-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (VLPs)
US8551756B2 (en) 2003-07-11 2013-10-08 Novavax, Inc. Avian influenza chimeric VLPS
ES2392891T3 (es) 2003-11-04 2012-12-14 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Procedimiento de prevención de la fusión virus célula inhibiendo la función de la región de iniciación de fusión de virus de ARN que tienen proteínas de envoltura fusogénicas de membrana de clase I
EP1771552B1 (en) 2004-05-25 2012-08-01 MedImmune Vaccines, Inc. Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
KR20070085291A (ko) 2004-10-13 2007-08-27 프로탈릭스 리미티드 식물 세포 배양에서 항체를 생산하는 시스템 및 방법
WO2006104615A2 (en) 2005-02-24 2006-10-05 University Of Massachusetts Influenza nucleic acids, polypeptides, and uses thereof
EP2963118B1 (en) 2005-06-01 2017-08-09 California Institute of Technology Method of targeted gene delivery using viral vectors
JP4758148B2 (ja) 2005-06-14 2011-08-24 泰三 宇田 インフルエンザウイルスのヘマグルチニンに対する抗体酵素
KR20070000554A (ko) 2005-06-27 2007-01-03 삼성전자주식회사 이종 망에서 복합 서비스를 위한 자원 관리방법
PE20070171A1 (es) 2005-06-30 2007-03-08 Boehringer Ingelheim Int GLICINAMIDAS SUSTITUIDAS CON EFECTO ANTITROMBOTICO E INHIBIDOR DEL FACTOR Xa
US7951384B2 (en) 2005-08-05 2011-05-31 University Of Massachusetts Virus-like particles as vaccines for paramyxovirus
ES2377884T3 (es) 2005-11-04 2012-04-02 Novartis Vaccines And Diagnostics S.R.L. Vacunas contra la gripe que incluyen combinaciones de adyuvantes particulados e inmunopotenciadores
PT2529747T (pt) 2005-12-02 2018-05-09 Icahn School Med Mount Sinai Vírus da doença de newcastle quiméricos que apresentam proteínas de superfície não nativas e suas utilizações
US7914797B2 (en) 2005-12-06 2011-03-29 Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science Influenza vaccine
US10183986B2 (en) 2005-12-15 2019-01-22 Industrial Technology Research Institute Trimeric collagen scaffold antibodies
US20070207171A1 (en) 2006-03-01 2007-09-06 Cerus Corporation Engineered listeria and methods of use thereof
TW200745158A (en) 2006-03-07 2007-12-16 Vaxinnate Corp Compositions that include hemagglutinin, methods of making and methods of use thereof
ES2376492T3 (es) 2006-03-23 2012-03-14 Novartis Ag Compuestos de imidazoquinoxalina como inmunomoduladores.
CA2646891A1 (en) 2006-03-23 2007-09-27 Novartis Ag Immunopotentiating compounds
CA2646349A1 (en) 2006-03-24 2007-10-04 Novartis Vaccines And Diagnostics Gmbh & Co Kg Storage of influenza vaccines without refrigeration
US9101578B2 (en) 2006-05-01 2015-08-11 Technovax, Inc. Polyvalent influenza virus-like particle (VLP) compositions
US20070262178A1 (en) 2006-05-12 2007-11-15 Ultradent Products, Inc. Syringe delivery tip including an enlarged flocked wing element adjacent a distal delivery end
US20080014205A1 (en) 2006-05-15 2008-01-17 Lawrence Horowitz Neutralizing Antibodies to Influenza Viruses
US8148085B2 (en) 2006-05-15 2012-04-03 Sea Lane Biotechnologies, Llc Donor specific antibody libraries
AU2007314550A1 (en) 2006-05-18 2008-05-08 Pharmexa Inc. Inducing immune responses to influenza virus using polypeptide and nucleic acid compositions
JP2009542313A (ja) 2006-06-27 2009-12-03 アドビオ・アクチボラゲット 骨表面の術中局所薬物処置のための薬物送達デバイス、キット及び方法
EP2035565A4 (en) 2006-06-30 2010-07-21 Novavax Inc METHODS OF ENHANCING THE INCORPORATION OF PROTEINS IN VIRUS-LIKE PARTICLES (VLPs)
EP2526774A3 (en) 2006-07-21 2013-03-06 California Institute of Technology Targeted gene delivery for dendritic cell vaccination
EA017203B1 (ru) 2006-09-07 2012-10-30 Круселл Холланд Б.В. Связывающие молекулы человека, способные нейтрализовать вирус гриппа h5n1, и их применение
ES2694805T7 (es) 2006-09-11 2021-10-21 Seqirus Uk Ltd Fabricación de vacunas contra virus de la gripe sin usar huevos
EP2716656B1 (en) 2007-06-15 2016-10-12 Xiamen University Monoclonal antibodies binding to avian influenza virus subtype H5 haemagglutinin and uses thereof
EP2014279A1 (en) 2007-06-22 2009-01-14 Pevion Biotech AG Virosomes comprising hemagglutinin derived from an influenza virus produced in a cell line, compositions, methods of manufacturing, use thereof
EP2185191B1 (en) 2007-06-27 2012-09-12 Novartis AG Low-additive influenza vaccines
CA2615372A1 (en) 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
PL2540312T3 (pl) 2007-07-19 2015-10-30 Novavax Inc Chimeryczne VLP ptasiej grypy
US20090092635A1 (en) 2007-08-17 2009-04-09 Wyeth Heterologous prime-boost immunization regimen
WO2009088401A2 (en) 2007-09-24 2009-07-16 Government Of The Usa, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services Immunostimulatory combinations of tlr ligands and methods of use
FR2921387B1 (fr) 2007-09-26 2012-04-20 Sanofi Pasteur Procede de production du virus de la grippe
GB0810305D0 (en) 2008-06-05 2008-07-09 Novartis Ag Influenza vaccination
PT2610345E (pt) 2007-11-27 2016-01-11 Medicago Inc Partículas semelhantes ao vírus (vlps) da gripe recombinantes produzidas em plantas transgénicas que expressam hemaglutinina
KR20100115346A (ko) 2007-12-06 2010-10-27 다나-파버 캔서 인스티튜트 인크. 인플루엔자 바이러스에 대한 항체 및 그의 이용 방법
WO2009092038A1 (en) 2008-01-16 2009-07-23 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Influenza dna vaccination and methods of use thereof
ITTO20080204A1 (it) 2008-03-17 2009-09-18 Pomona Biotechnologies Llc Anticorpi monoclonali atti a reagire con una pluralita di sottotipi del virus influenzale a
CA2719201A1 (en) 2008-03-28 2009-10-01 Sea Lane Biotechnologies, Llc. Neutralizing molecules to viral antigens
GB0905570D0 (en) 2009-03-31 2009-05-13 Novartis Ag Combined vaccines
EP2310409A2 (en) 2008-06-17 2011-04-20 Apogenix GmbH Multimeric tnf receptors
CN102203252B (zh) 2008-06-25 2016-08-03 法国国家健康和医学研究所 基于鞭毛蛋白的新型免疫佐剂化合物及其用途
ES2545607T3 (es) * 2008-07-08 2015-09-14 Medicago Inc. Antígenos de la gripe recombinantes solubles
WO2010036948A2 (en) 2008-09-26 2010-04-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Dna prime/inactivated vaccine boost immunization to influenza virus
WO2010117786A1 (en) 2009-03-30 2010-10-14 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Influenza virus vaccines and uses thereof
NZ596032A (en) 2009-05-11 2013-09-27 Crucell Holland Bv Human binding molecules capable of neutralizing influenza virus h3n2 and uses thereof
AU2010254136B2 (en) 2009-05-26 2016-09-29 Mount Sinai School Of Medicine Monoclonal antibodies against influenza virus generated by cyclical administration and uses thereof
DK2445928T3 (en) * 2009-06-24 2018-05-28 Medicago Inc CHEMICAL INFLUENZA VIRUS-LIKE PARTICLES INCLUDING HEMAGGLUTIN
US8828406B2 (en) 2009-07-30 2014-09-09 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza viruses and uses thereof
JP5463107B2 (ja) 2009-09-14 2014-04-09 独立行政法人国立国際医療研究センター 新型インフルエンザを特異的に鑑別するモノクローナル抗体とそれを利用した免疫検出試薬
US20120219584A1 (en) 2009-10-05 2012-08-30 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health Protection against pandemic and seasonal strains of influenza
JP2013060367A (ja) * 2010-01-15 2013-04-04 Osaka Univ 抗インフルエンザ抗体及びインフルエンザ検出用デバイス
US8298820B2 (en) 2010-01-26 2012-10-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom
EP2536425B1 (en) 2010-02-18 2019-06-19 Icahn School of Medicine at Mount Sinai Vaccines for use in the prophylaxis and treatment of influenza virus disease
CN102791734B (zh) 2010-03-08 2014-10-15 赛特瑞恩股份有限公司 源自人b细胞且具有抗甲型流感病毒的中和活性的人单克隆抗体
AU2011235220B2 (en) 2010-03-30 2016-03-10 Mount Sinai School Of Medicine Influenza virus vaccines and uses thereof
EP3450454A1 (en) 2010-07-22 2019-03-06 John W. Schrader Cross-protective protection against influenza viral infection
US10131695B2 (en) 2011-09-20 2018-11-20 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
CA2857087C (en) 2011-11-28 2021-05-25 Crucell Holland B.V. Influenza virus vaccines and uses thereof
WO2014090865A1 (en) 2012-12-11 2014-06-19 Vib Vzw Anti-influenza antibody
JP2016508133A (ja) 2012-12-18 2016-03-17 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ インフルエンザウイルスワクチン及びその使用
AU2014204826A1 (en) 2013-01-10 2015-07-09 Seqirus UK Limited Influenza virus immunogenic compositions and uses thereof
AU2014229255B2 (en) 2013-03-13 2018-12-13 Novartis Ag Influenza B virus reassortment
WO2014159960A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Antibodies against influenza virus hemagglutinin and uses thereof
AU2014236508A1 (en) 2013-03-14 2015-09-17 Contrafect Corporation Composition and methods based on neutralizing antibodies delivered intranasally for enhanced therapeutic efficacy
CA2898235A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Influenza nucleic acid molecules and vaccines made therefrom
PL235555B1 (pl) 2014-06-24 2020-09-07 Inst Biotechnologii I Antybiotykow Wyizolowany i oczyszczony polipeptyd hemaglutyniny (HA ) wirusa grypy H5N1, kompozycja zawierająca polipeptyd i jej zastosowanie, przeciwciało wiążące się specyficznie z polipeptydem oraz sposób otrzymywania tego polipeptydu
JP2018504412A (ja) 2015-01-23 2018-02-15 アイカーン スクール オブ メディシン アット マウント サイナイ インフルエンザウイルスワクチン接種レジメン
WO2016205347A1 (en) 2015-06-16 2016-12-22 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus vaccines and uses thereof
EP3463447A4 (en) 2016-06-03 2020-05-27 Icahn School of Medicine at Mount Sinai INFLUENZA VIRUSES
CA3023143A1 (en) 2016-06-15 2017-12-21 Icahn School Of Medicine At Mount Sinai Influenza virus hemagglutinin proteins and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
EP4241785A2 (en) 2023-09-13
KR20140068205A (ko) 2014-06-05
ES2953393T3 (es) 2023-11-10
EP4241785A3 (en) 2023-09-27
WO2013043729A1 (en) 2013-03-28
CA2849434A1 (en) 2013-03-28
US20150132330A1 (en) 2015-05-14
EP2758075B1 (en) 2023-05-03
AU2018202388A1 (en) 2018-04-26
JP2014530003A (ja) 2014-11-17
IN2014CN02114A (pt) 2015-05-29
CN104185476A (zh) 2014-12-03
US20190106461A1 (en) 2019-04-11
AU2012312529B2 (en) 2018-01-04
MX2014003308A (es) 2015-03-09
SG11201400743VA (en) 2014-04-28
JP2022091775A (ja) 2022-06-21
JP6498439B2 (ja) 2019-04-17
EP2758075A1 (en) 2014-07-30
IL231547A0 (en) 2014-04-30
EP2758075A4 (en) 2015-05-20
HK1200102A1 (en) 2015-07-31
AR090392A1 (es) 2014-11-12
CN108164602A (zh) 2018-06-15
US10131695B2 (en) 2018-11-20
IL262123A (en) 2018-11-29
JP2018110585A (ja) 2018-07-19
JP2020096604A (ja) 2020-06-25
AU2012312529A1 (en) 2014-03-27
CN116162175A (zh) 2023-05-26
IL231547B (en) 2018-10-31
EA201490659A1 (ru) 2014-11-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20190106461A1 (en) Influenza virus vaccines and uses thereof
US10179806B2 (en) Influenza virus vaccines and uses thereof
US9849172B2 (en) Influenza virus vaccines and uses thereof
US10736956B2 (en) Influenza virus vaccination regimens
US20190125859A1 (en) Influenza virus vaccination regimens
EP2934581A1 (en) Influenza virus vaccines and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
B15I Others concerning applications: loss of priority

Free format text: PERDA DAS PRIORIDADES US 61/536,924; US 61/565,899; US 61/607,526; US 61/648,525; US 61/670,108; US 61/684,481, CONFORME AS DISPOSICOES PREVISTAS NA LEI 9.279 DE 14/05/1996 (LPI) ART. 16 7O E NO ART. 29 DA RESOLUCAO INPI-PR 77/2013, POR NAO ATENDEREM AO DISPOSTO NO ART. 2 DA RESOLUCAO INPI-PR 179/2017, POIS NAO FOI APRESENTADA CESSAO DAS REFERIDAS PRIORIDADES, QUE POSSUEM DEPOSITANTE DIFERENTE DO DEPOSITANTE DA FASE NACIONAL.

B06F Objections, documents and/or translations needed after an examination request according [chapter 6.6 patent gazette]
B07D Technical examination (opinion) related to article 229 of industrial property law [chapter 7.4 patent gazette]

Free format text: DE ACORDO COM O ARTIGO 229-C DA LEI NO 10196/2001, QUE MODIFICOU A LEI NO 9279/96, A CONCESSAO DA PATENTE ESTA CONDICIONADA A ANUENCIA PREVIA DA ANVISA. CONSIDERANDO A APROVACAO DOS TERMOS DO PARECER NO 337/PGF/EA/2010, BEM COMO A PORTARIA INTERMINISTERIAL NO 1065 DE 24/05/2012, ENCAMINHA-SE O PRESENTE PEDIDO PARA AS PROVIDENCIAS CABIVEIS.

B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B07G Grant request does not fulfill article 229-c lpi (prior consent of anvisa) [chapter 7.7 patent gazette]

Free format text: NOTIFICACAO DE DEVOLUCAO DO PEDIDO EM FUNCAO DA REVOGACAO DO ART. 229-C DA LEI NO 9.279, DE 1996, POR FORCA DA LEI NO 14.195, DE 2021

B06U Preliminary requirement: requests with searches performed by other patent offices: procedure suspended [chapter 6.21 patent gazette]
B350 Update of information on the portal [chapter 15.35 patent gazette]
B06A Patent application procedure suspended [chapter 6.1 patent gazette]
B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]
B09B Patent application refused [chapter 9.2 patent gazette]

Free format text: MANTIDO O INDEFERIMENTO UMA VEZ QUE NAO FOI APRESENTADO RECURSO DENTRO DO PRAZO LEGAL.MANTIDO O INDEFERIMENTO UMA VEZ QUE NAO FOI APRESENTADO RECURSO DENTRO DO PRAZO LEGAL.