JP5463107B2

JP5463107B2 - 新型インフルエンザを特異的に鑑別するモノクローナル抗体とそれを利用した免疫検出試薬

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Publication number: JP5463107B2
Application number: JP2009212354A
Authority: JP
Inventors: 徹秋山; 照雄切替; 暢子斉藤; 博丈北嶋; 謙次楢原
Original assignee: Mizuho Medy Co Ltd; National Center for Global Health and Medicine
Current assignee: Mizuho Medy Co Ltd; National Center for Global Health and Medicine
Priority date: 2009-09-14
Filing date: 2009-09-14
Publication date: 2014-04-09
Anticipated expiration: 2029-09-14
Also published as: JP2011057653A

Description

本発明は、Ａ型インフルエンザの核蛋白(ＮＰ)に反応性を有するモノクローナル抗体に関するものである。更に詳しくは新型インフルエンザに特異的な反応性を有する新規なモノクローナル抗体に関する。

インフルエンザウイルスは、ヒトを含む多くの動物に感染し、インフルエンザを引き起こす病原体である。インフルエンザウイルスがヒトに感染すると、数日の潜伏期を経て、発熱、頭痛、関節を含む全身各部の痛み、脱力感、咳、のどの痛み等の症状を引き起こす。また、気管支炎、肺炎、中耳炎などを併発することも多く、さらに脳症、筋肉炎、心筋炎などを引き起し重篤な状態に陥る場合もある。特に、体力に乏しい、高齢者、乳幼児等では、命にかかわることもある。

インフルエンザウイルスとしては、Ａ型とＢ型の２つのタイプが知られており、このうち、Ａ型インフルエンザウイルスは、赤血球凝集素(ヘマグルチニン:ＨＡ;Ｈ１~Ｈ１６)、ノイラミターゼＮＡ(Ｎ１~Ｎ９)由来の亜型(ｓｕｂｔｙｐｅ)が多数存在し、多くの変異株が発生し、全世界的な大流行を引き起こすことがある。

Ａ型インフルエンザウイルスは、ヒトだけでなく、鳥、ブタ、馬、ミンク、クジラ等の動物にも感染する。通常、ヒトは、他の動物が感染するインフルエンザウイルスに感染することはほとんどなく、一般に、ヒトは、Ａ香港型(Ｈ３Ｎ２)、Ａソ連型(Ｈ１Ｎ１)などに感染するとされる。

しかしながら、ウイルスの変異により、これまでヒトに感染しなかったウイルスが動物からヒトへ感染したり、さらには、ヒトからヒトへ感染したりするようになる場合がある。

具体的には、東南アジア方面において鳥由来の強毒型のＡ型インフルエンザウイルス(Ｈ５Ｎ１)が、ヒトに感染した例が報告され、多数の死亡例が出るなど大きな問題になっている。強毒型でない季節性Ａ型インフルエンザウイルスに対しては、医薬及び治療法も改善されているが、ヒトが強毒型のＡ型インフルエンザウイルスに感染すると重篤化して対処が難しくなり死亡率が極めて高くなる。

更に、２００９年４月メキシコにおいて豚から人に感染したと考えられる新型Ｈ１Ｎ１が報告され、その後世界的な感染拡大を引き起こしている。２００９年６月には世界保健機構(ＷＨＯ)は世界的流行病(パンデミック)であることを宣言し、警戒水準を最も高いフェーズ６まで引き上げた。日本政府も検疫体制の強化を行い、「新型インフルエンザ対策本部」を設置するなどして対策を講じたが、２００９年５月には国内最初の感染者が見つかり、その後感染は拡大の一途をたどり国内外で重大な社会問題になっている。この新型インフルエンザは「豚インフルエンザＨ１Ｎ１」、「ｓｗｉｎｅｆｌｕ」、「新型インフルエンザ(Ａ/Ｈ１Ｎ１)」、「パンデミックインフルエンザＡ(Ｈ１Ｎ１)ｐｄｍ」などと呼ばれている。

これらの新型インフルエンザの検査法としては、従来より遺伝子増幅法(ＰＣＲ法)が用いられてきたが、これによると、複雑な作業が必要で、検査だけでも６時間乃至二日程度の時間が必要になる。新型インフルエンザの蔓延を防ぐためにも迅速な検査が強く要望されている。

Ａ型/Ｂ型インフルエンザウイルスを検査できる迅速検査としてはイムノクロマト法を利用した簡易検査試薬が広く用いられている。これは、患者の鼻腔や咽頭を綿棒でぬぐって抽出液内でウイルス由来の蛋白を抽出して、これを抗原として反応性を有する抗インフルエンザ抗体固相化メンブレン及び抗インフルエンザ抗体標識粒子によるサンドイッチ免疫反応を行わせ、免疫複合体の生成による可視的発色により検出するものである。

本発明は、Ａ型インフルエンザの核蛋白(ＮＰ)のアミノ酸配列においてＮ末端側４-１８番目がＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＧＧＥであるペプチドに特異的な反応性を有し、ＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＥ及びＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＤであるペプチドには反応性を有しないモノクローナル抗体に関するものである。また、このモノクローナル抗体を利用することで新型インフルエンザを鑑別できる免疫検出試薬を開示するものである。更に既に一般的に普及しているイムノクロマト法を利用して迅速な簡易検査薬として供給できるものである。

Ａ型インフルエンザは変異を起こしやすく、時としてこれまでヒトに感染しなかったウイルスが動物からヒトへ感染したり、さらには、ヒトからヒトへ感染したりするようになる場合がある。このようにして新たにヒトに感染し、流行が拡大するものを新型インフルエンザと呼んでいる。新型インフルエンザの場合、過去の罹患歴がないため免疫的な抵抗性をもたず、時として爆発的な流行となり大きな社会問題を引き起こす。更にその臨床においては従来のインフルエンザと比較して患者の重篤度や致死率なども異なってくるため隔離対応の必要性や、治療法なども異なる可能性がある。そのため、新型インフルエンザを迅速に且つ特異的に鑑別することは大変重要である。

２００７年１月から２００９年９月１１日迄の間にＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのＩｎｆｌｕｅｎｚａＶｉｒｕｓＲｅｓｏｕｒｃｅにデータベースとして報告されたＡ型インフルエンザ１１８２例について核蛋白のアミノ酸配列を調べてみた。(１１８２例のうち２例は１６番目のアミノ酸が解読不明であったため分析対象から除外した。)Ｎ末端側１６-１８番目がＧＧＥ(グリシン-グリシン-グルタミン酸)の配列をもつものが５５２例あり、その中の１４例が新型Ｈ５Ｎ１であり、５３７例が２００９年報告のＨ１Ｎ１であった。なお、２００９年Ｈ１Ｎ１についてはその殆どが新型Ｈ１Ｎ１であると考えられ、そう考えると９９.８%(１１８１例/１１８２例)を新型インフルエンザとして鑑別できることになる。例外は２００７年に報告されたＨ３Ｎ２型Ａ/Ｏｎｔａｒｉｏ/１２５２/２００７株のわずか１例(０.２%)のみであった。Ｎ末端側１６-１８番目がＤＧＥ(アスパラギン酸-グリシン-グルタミン酸)であるものは３７６例あり、これらはすべてＨ１Ｎ１型であった。更に詳しく見てみると２００７年報告が３１６例、２００８年報告が５７例、２００９年報告はわずかに３例のみであり、新型Ｈ１Ｎ１の発生が２００９年であることからその殆どが季節性Ｈ１Ｎ１であることが示唆された。２００７年、２００８年の報告例のみを季節性Ｈ１Ｎ１と考えても３７３例となり、全体の９９.２%(３７３例/３７６例)を占めることとなる。Ｎ末端側１６-１８番目がＤＧＤ(アスパラギン酸-グリシン-アスパラギン酸)であるものは２５１例あり、その全てが季節性Ｈ３Ｎ２型(１００%)であった。なお、１例のみＳＧＥの配列の報告が２００９年にあり、これはＨ１Ｎ１と報告されているが詳細は不明である。

このことより、かなり高い確率をもって、Ｎ末端側１６-１８番目の配列がＧＧＥの配列は新型インフルエンザ(新型Ｈ５Ｎ１または新型Ｈ１Ｎ１)、ＤＧＥであるものは季節性Ｈ１Ｎ１型、ＤＧＤであるものは季節性Ｈ３Ｎ２であると鑑別出来ることが示唆された。
特開２００７−２６１９８８

本発明は、新型インフルエンザを迅速に鑑別できるモノクローナル抗体及びそれを用いた免疫検査試薬を提供することを目的とする。

本発明に係るモノクローナル抗体は、Ａ型インフルエンザの核蛋白(ＮＰ)のアミノ酸配列においてＮ末端側４-１８番目がＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＧＧＥであるペプチドに特異的な反応性を有し、ＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＥ及びＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＤであるペプチドには反応性を有しない新規のモノクローナル抗体に関するものである。

更に、本発明の免疫検査試薬は、テストストリップと、テストストリップの上流部に配置される滴下部と、テストストリップの下流部に配置される吸水ろ紙と、滴下部より吸水ろ紙に至る流れ方向下流側に配置され第１の抗体を標識したものを流動可能に保持する塗布部と、塗布部と吸水ろ紙との間に配置され第２の抗体が固相される検査部を有する検査領域とを備え、Ａ型インフルエンザの核蛋白(ＮＰ)のアミノ酸配列においてＮ末端側４-１８番目がＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＧＧＥであるペプチドに特異的な反応性を有し、ＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＥ及びＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＤには反応性を有しない新規のモノクローナル抗体を第１の抗体または第２の抗体として使用して新型インフルエンザウイルスを季節性インフルエンザと鑑別するものである。

好ましい第１の形態では、第１の抗体及び第２の抗体の両方が本発明のモノクローナル抗体であるか、一方が本発明のモノクロであり、他方がＡ型インフルエンザ全般に反応性を有する一般的な抗インフルエンザ核蛋白モノクローナル抗体であり、この組み合わせによりＡ型インフルエンザの核蛋白(ＮＰ)のアミノ酸配列においてＮ末端側１６-１８番目がＧＧＥであるインフルエンザ株の検出が可能な免疫検出試薬である。これによって殆どの新型Ｈ１Ｎ１および新型Ｈ５Ｎ１が検出される。

好ましい第２の形態では、第１の抗体及び第２の抗体の内の一方が本発明のモノクローナル抗体であり、他方は強毒型インフルエンザに反応性が非常に弱い特殊な抗インフルエンザ核蛋白モノクローナル抗体であり、この組み合わせによりＡ型インフルエンザの核蛋白(ＮＰ)のアミノ酸配列においてＮ末端側１６-１８番目がＧＧＥであり、且つ新型Ｈ５Ｎ１ではない新型Ｈ１Ｎ１が検出される。

本発明の免疫検査試薬は、プラスチック製のハウジングに保持され、ハウジングは滴下部に対応して開口する検体滴下部と、検査領域に対応する判定窓とを備えることが更に望ましい。

本発明によれば、新型インフルエンザ(新型Ｈ５Ｎ１または新型Ｈ１Ｎ１)に特異的な反応性を有する新規なモノクローナル抗体が得られる。

また、本発明のモノクローナル抗体を用いた免疫検出試薬により新型インフルエンザ(新型Ｈ５Ｎ１または新型Ｈ１Ｎ１)のみを検出できるため、季節性インフルエンザとの鑑別が可能となる。

更に、本発明の免疫検出試薬によれば、イムノクロマト法により簡易にかつ短時間で、新型インフルエンザを明確に鑑別判定でき、このことによって陽性の患者を即座に隔離し新型インフルエンザの蔓延を防止できるし、患者を感染早期に集中的に治療できるため、予後を改善することができる。

(開発の経緯)
まず、本発明者らが本願発明の完成に達するまでの経緯を述べる。

一般的にＡ型インフルエンザウイルスの感染の有無を検査するにあたっては、種々の亜型のウイルスを検出できるようにするため変異が出来るだけ少ない抗原蛋白を標的とすべきと考えられる。具体的には、表面抗原である赤血球凝集素ＨＡやノイラミニターゼＮＡそのものには多数の亜型が存在するので、これらはスクリーニング時の標的としては適しない。一方、核蛋白(ＮＰ)は変異が少ないので標的として適していると考えられ、一般的に市販されているインフルエンザ検出試薬はこの蛋白を検出することで感度良く全ての亜型のインフルエンザ株を検出できるように作られている。

一方、Ａ型インフルエンザウイルスは、表面抗原である赤血球凝集素(ヘマグルチニン:ＨＡ;Ｈ１~Ｈ１６)、ノイラミターゼ(ＮＡ;Ｎ１~Ｎ９)由来の亜型(ｓｕｂｔｙｐｅ)が多数存在し、多くの変異株が発生しており、これらの亜型を鑑別することも疫学的に重要である。しかしながら、亜型の鑑別のために赤血球凝集素(ＨＡ)やノイラミターゼ(ＮＡ)に対する抗体を使用することも試みられてきたが感度が十分ではないという問題があった。

核タンパク(ＮＰ)は、表面抗原である赤血球凝集素(ＨＡ)やノイラミターゼ(ＮＡ)に比べると明らかに変異部位は少ないが、詳しく分析すると幾つかの領域で表面抗原に由来する亜型の分類に連動して系統的な変異が起こっている可能性が示唆された。そこで本発明者らは、新型インフルエンザの鑑別を目的として核蛋白(ＮＰ)の特定の配列を認識する新規のモノクローナル抗体の作製及び選定を行うこととした。

(モノクローナル抗体の作製)
免疫原には新型Ｈ５Ｎ１(Ａ/ＶｉｅｔＮａｍ/ＶＬ０２０/０５)由来組換え核蛋白質(ｒ‐ＮＰ/Ａ)を使用した。免疫法は、文献;生化学[６９: １２８-１３１ (１９９７).佐渡義一,香川恵:ラットリンパ節を用いる,効率的で,しかも,抗原量,労力,時間を節約できるモノクローナル抗体作製法]の方法に従い実施した。

１００μｇの免疫原を含む溶液に等量のフロインド完全アジュバント(ＤＩＦＣＯ社製)を加え完全に混合した後、ＷＫＹラットのフットパッドに投与した。その２週間後に同量の抗原をフロインド不完全アジュバントと混合し、ラット尾根部に投与し、さらに２週間後に同様の追加免疫を実施した。最終免疫後、３~４日でＰＥＧを用いてラット腸骨リンパ節細胞とミエローマ細胞(ＳＰ２/０)とを融合した。培養液にはＨＡＴ選択培地を使用し、約１週間後に培養上清を採取しスクリーニングに供した。

１次スクリーニングには、ｒ‐ＮＰ/Ａ、新型Ｈ１Ｎ１(Ａ/Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ/０４/２００９)由来組換え核蛋白質(ｒ‐ＮＰ(Ｓｗ))、季節性Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス(Ａ/ＮｅｗＹｏｒｋ/５５/２００４)培養物および季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス(Ａ/ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ/２０/９９)培養物を抗原とし、固相に抗ｒ‐ＮＰ/Ａウサギポリクローナル抗体を使用したサンドイッチＥｎｚｙｍｅＬｉｎｋｅｄＩｍｍｕｎｏｓｏｂｅｎｔＡｓｓａｙ(ＥＬＩＳＡ)法を使用した。すなわち、抗ｒ‐ＮＰ/Ａウサギポリクローナル抗体(５μｇ/ｍｌ、５０ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ９.０中)を９６穴マイクロプレート(ＣＯＳＴＡＲ社)の各ウエルに５０μｌずつ加え、室温で１時間インキュベートし固相化した。次に、０.０５%のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ(ＰＢＳ‐Ｔ)で各ウエルを洗浄後、Ｓｕｐｅｒｂｌｏｃｋ(ＰＩＥＲＣＥ社)２００μｌを加えて５分間ブロッキングを行った。ブロッキング液を除いた後、５０倍に希釈した上記抗原を５０μｌ加え室温で１時間反応させた。ＰＢＳ‐Ｔで洗浄後、ハイブリドーマ培養上清を加え、１時間反応させた。さらにＰＢＳ‐Ｔで洗浄後、ＰＢＳ‐Ｔで５０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ抗体(ＧＥ社)を５０μｌ添加し、室温で３０分インキュベートした。反応後ＰＢＳ‐Ｔで十分に洗浄し、ＴＭＢＰｅｒｏｘｉｄａｓｅＥＩＡＳｕｂｓｔｒａｔｅｋｉｔ(ＢＩＯ‐ＲＡＤ)を１００μｌ添加し、室温で１０分間反応後、反応停止液を各ウエルに１００μｌずつ加え主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍで発色レベルを測定した。

なお、反応性の確認のために使用した各インフルエンザのＮＰ抗原については配列を以下に記載する。

新型H5N1（A/VietNam/VL020/05）のNP 全アミノ酸の配列(1-498)
MASQGTKRSYEQMETGGERQNATEIRASVGRMVSGIGRFYIQMCTELKLSDYEGRLIQNSITIERMVLSAFDERRNRYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRRDGKWVRELILYDKEEIRRIWRQANNGEDATAGLTHLMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVMELIRMIKRGINDRNFWRGENGRRTRIAYERMCNILKGKFQTAAQRAMMDQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGLAVASGYDFEREGYSLVGIDPFRLLQNSQVFSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVSSFIRGTRVVPRGQLSTRGVQIASNENMEAMDSNTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISVQPTFSVQRNLPFERATIMAAFTGNTEGRTSDMRTEIIRMMESARPEDVSFQGRGVFELSDEKATNPIVPSFDMNNEGSYFFGDNAEEYDN
新型Ｈ1Ｎ1 （Ａ/Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ/04/2009）のNP 全アミノ酸の配列(1-498)
MASQGTKRSYEQMETGGERQDATEIRASVGRMIGGIGRFYIQMCTELKLSDYDGRLIQNSITIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVDGKWMRELILYDKEEIRRVWRQANNGEDATAGLTHIMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTIAMELIRMIKRGINDRNFWRGENGRRTRVAYERMCNILKGKFQTAAQRAMMDQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGLAVASGHDFEREGYSLVGIDPFKLLQNSQVVSLMRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRVSSFIRGKKVIPRGKLSTRGVQIASNENVETMDSNTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQKASAGQISVQPTFSVQRNLPFERATVMAAFSGNNEGRTSDMRTEVIRMMESAKPEDLSFQGRGVFELSDEKATNPIVPSFDMSNEGSYFFGDNAEEYDS
H3N2（A/New York/55/2004）のNP 全アミノ酸の配列(1-498)
MASQGTKRSYEQMETDGDRQNATEIRASVGKMIDGIGRFYIQMCTELKLSDHEGRLIQNSLTIEKMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYRRVDGKWMRELVLYDKEEIRRIWRQANNGEDATAGLTHIMIWHSNLNDATYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGIGTMVMELIRMVKRGINDRNFWRGENGRKTRSAYERMCNILKGKFQTAAQRAMVDQVRESRNPGNAEIEDLIFLARSALILRGSVAHKSCLPACAYGPAVSSGYNFEKEGYSLVGIDPFKLLQNSQIYSLIRPNENPAHKSQLVWMACHSAAFEDLRLLSFIRGTKVSPRGKLSTRGVQIASNENMDNMGSSTLELRSGYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQTSVQPTFSVQRNLPFEKSIIMAAFTGNTEGRTSDMRAEIIRMMEGAKPEEVSFRGRGVFELSDEKATNPIVPSFDMSNEGSYFFGDNAEEYDN
H1N1 A(New Caledonia/20/99) のNP 全アミノ酸の配列(1-498)
MASQGTKRSYEQMETDGERQNATEIRASVGRMIGGIGRFYIQMCTELKLNDYEGRLIQNSLTIERMVLSAFDERRNKYLEEHPSAGKDPKKTGGPIYKRVDGKWVRELVLYDKEEIRRIWRQANNGDDATAGLTHIMIWHSNLNDTTYQRTRALVRTGMDPRMCSLMQGSTLPRRSGAAGAAVKGVGTMVLELIRMIKRGINDRNFWRGENGRKTRIAYERMCNILKGKFQTAAQKAMMDQVRESRNPGNAEIEDLTFLARSALILRGSVAHKSCLPACVYGPAVASGYDFEKEGYSLVGVDPFKLLQTSQVYSLIRPNENPAHKSQLVWMACNSAAFEDLRVSSFIRGTRVLPRGKLSTRGVQIASNENMDAIVSSTLELRSRYWAIRTRSGGNTNQQRASAGQISTQPTFSVQRNLPFDKTTIMAAFTGNTEGRTSDMRAEIIKMMESARPEEVSFQGRGVFELSDERATNPIVPSFDMSNEGSYFFGDNAEEYDN
ＥＬＩＳＡでの分析の結果、季節性Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス(Ａ/ＮｅｗＹｏｒｋ/５５/２００４)培養物および季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス(Ａ/ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ/２０/９９)培養物には反応性を示さず、新型Ｈ５Ｎ１(Ａ/ＶｉｅｔＮａｍ/ＶＬ０２０/０５)由来組換え核蛋白質(ｒ‐ＮＰ/Ａ)、及び新型Ｈ１Ｎ１(Ａ/Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ/０４/２００９)由来組換え核蛋白質(ｒ‐ＮＰ(Ｓｗ))にのみ強い反応性を示すクローン６Ｇ６,７Ｆ６を得た。

(モノクローナル抗体の反応部位の確認)
これらのモノクローナル抗体について認識する反応部位を分析するため、ｒ‐ＮＰ/Ａについて全長(ｆｕｌｌ)、ｆｒ１,ｆｒ２,ｆｒ３,ｆｒ１‐１,ｆｒ１‐２の各配列を有する合成ペプチドを固相とするＥＬＩＳＡを行った。各フラグメントの配列は図１に示した。各ｒ‐ＮＰ/Ａ断片は１μｇ/ｍｌで固相化を行い、モノクローナル抗体は４ｎ段階希釈として１~１６３８４倍で希釈した各測定試料を用いて、上述と同様のＥＬＩＳＡ法にて測定を実施した。６Ｇ６の反応性は、次表の通りである。

７Ｆ６の反応性は、次表の通りである。

この結果、本発明のモノクローナル抗体はｆｒ２,ｆｒ３には反応せず、ｆｒ１、更にはｆｒ１-１に反応することが分かった。認識する反応部位を絞り込むため、更にｆｒ１‐１‐１(配列１-５６番),ｆｒ１‐１‐２(配列３７-９２番)の各配列を有する合成ペプチドを作製して、これを固相とするＥＬＩＳＡを行った。各フラグメントの配列は図４に示した。ここでｒ‐ＮＰ/Ａ断片は１μｇ/ｍｌで固相化を行い抗体添加濃度は１０μｇ/ｍｌとして上述と同様のＥＬＩＳＡ法で測定を行った。なお、対照として抗ｒ‐ＮＰ/Ａウサギポリクローナル抗体も同時に測定を行い、本発明のモノクローナル抗体の各ペプチドの活性を抗ｒ‐ＮＰ/Ａウサギポリクローナル抗体活性に対する相対比率で表した(表３、表４参照)。

６Ｇ６の反応性は、次表の通りである。

７Ｆ６の反応性は、次表の通りである。

以上の結果より、本発明のモノクローナル抗体はｒ‐ＮＰ/Ａの配列のうち、ｆｒ１‐１‐１に反応性を有し、従ってモノクローナル抗体の認識する反応部位はアミノ酸配列１-５６の中に存在することが分かった。Ａ/ＶｉｅｔＮａｍ/ＶＬ０２０/０５由来組換え核蛋白質(ｒ‐ＮＰ/Ａ)、新型Ｈ１Ｎ１(Ａ/Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ/０４/２００９)由来組換え核蛋白質(ｒ‐ＮＰ(Ｓｗ))、季節性Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス(Ａ/ＮｅｗＹｏｒｋ/５５/２００４)培養物および季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス(Ａ/ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ/２０/９９)の配列を比較してｒ‐ＮＰ/Ａ、ｒ‐ＮＰ(Ｓｗ)に共通に含まれて、季節性Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス(Ａ/ＮｅｗＹｏｒｋ/５５/２００４)、Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス(Ａ/ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ/２０/９９)のいずれにも含まれていない配列として１６-１８のアミノ酸を見出した。

以上の知見より、Ａ型インフルエンザの核蛋白(ＮＰ)のアミノ酸配列においてＮ末端側４-１８番目に相当する部分について、新型インフルエンザに存在するペプチド１(ＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＧＧＥ)、季節性インフルエンザＨ１Ｎ１に存在するペプチド２(ＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＥ)および季節性インフルエンザＨ３Ｎ２に存在するペプチド３(ＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＤ)の３種のペプチドを合成し、本発明におけるモノクローナル抗体６Ｇ６、７Ｆ６の反応部位を調べた。これらのペプチドを固相化する場合には予め終濃度１ｍＭとなるようにスベリン酸ジスクシンイミジル(ＰＩＥＲＣＥ社)を添加した９６穴に、ペプチドをそれぞれ１０μｇ/ｍｌとなるように添加して固相化を行い、ＥＬＩＳＡ法による測定を行った。陰性コントロールとして正常ラット血清を同時に測定し、この値に対するカットオフインデックスとして求めた。その結果は、次表の通りである。

この結果、本発明におけるモノクローナル抗体(ハイブリドーマ６Ｇ６および７Ｆ６)は、いずれも１６番目のアミノ酸がグリシン型であるペプチド１(ＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＧＧＥ)と反応し、アスパラギン酸型のペプチド２(ＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＥ)およびペプチド３(ＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＤ)とは反応しないことが確認された。

過去のインフルエンザ流行株について本モノクローナル抗体の認識部位である１６-１８番目のアミノ酸を詳細に調べたところ、ペプチド１にある配列ＧＧＥを有する株は新型Ｈ１Ｎ１および新型Ｈ５Ｎ１が殆どであり、ペプチド２にある配列ＤＧＥを有する株は季節性Ｈ１Ｎ１であった。更にペプチド３にある配列ＤＧＤを有する株は季節性Ｈ３Ｎ２であった。したがってこの認識部位を利用することによってＡ型インフルエンザの鑑別が可能であることが強く示唆され、本発明のモノクローナル抗体は特に新型インフルエンザを季節性のインフルエンザと区別して認識できる有用性があると考えられた。

そこで本発明者らは、本発明のモノクローナル抗体(ハイブリドーマ６Ｇ６および７Ｆ６)を用いてイムノクロマト法の作製法に準じて各種検査試薬の試作品を作製し、その反応性を評価した。本発明の検査試薬は通常のイムノクロマト試薬の構造、形態で達成可能であり、その典型的な形態について図５を用いて説明する。

本発明の検査試薬はハウジング１内にセットされ、試料を滴下する検体滴下部２及び判定窓部３を持っている。ハウジング１内にセットされているテストストリップは、テストストリップの上流部に配置される滴下部４と、ストリップの下流部に配置される吸水ろ紙５と、滴下部４より吸水ろ紙５に至る流れ方向下流側に配置され、第１の抗体を着色粒子で標識した酵素標識粒子を流動可能に保持する標識粒子塗布部６と、標識粒子塗布部６と吸水ろ紙５との間に配置されニトロセルロースメンブレン７上に、第２の抗体が固相される検査部８および検査対照部９を有する。検査対照部９は目的の検出物質の有無に関わらず発色サインが出現するように作製される。滴下部４はハウジング１の検体滴下部２に合致する位置に設置される。また検査部８及び検査対照部９は、共にハウジングの判定窓部３を通して外部から観察できるようになっている。

テストストリップは一般的に知られるイムノクロマト法の作製方法に準じた。すなわち抗体固相化メンブレンはニトロセルロースメンブレン７上に、ＰＢＳ緩衝液に溶解した第２の抗体をライン状に塗布して乾燥させて作製し検査部８とした。抗体標識粒子については金コロイド溶液と第一の抗体を混合して結合させ、適当な緩衝液に分散溶解させてガラス繊維ろ紙に塗布して乾燥させて標識粒子塗布部６とした。これらを支持体１０の上にそれぞれが重なり合うように、滴下部４と、給水ろ紙５と共に貼りあわせ、約６ｍｍの短冊状に切断した。切断されたテストストリップは試料滴下部２、および判定窓部３を有するプラスチック製のハウジング１内に封入した。

(実施の形態１)
好ましい実施の形態１として、本発明のモノクローナル抗体(６Ｇ６,７Ｆ６)、及び一般的に知られる全ての亜型に反応性を有する抗インフルエンザＮＰ抗体である米国Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製、カタログナンバー:Ｎｏ.１０-Ｉ５０、クローンナンバー:Ｍ２１１０１６９のモノクローナル抗体を使用し、イムノクロマト法の作製法に準じて検査試薬を試作して評価した。

これらのモノクローナル抗体を用いてそれぞれ抗体固相化メンブレン、および抗体金コロイド標識物を作製し、反応性を調べた。反応性の確認には、新型Ｈ５Ｎ１(Ａ/ＶｉｅｔＮａｍ/ＶＬ０２０/０５)由来組換え核蛋白質ｒ‐ＮＰ/Ａ、新型Ｈ１Ｎ１(Ａ/Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ/０４/２００９)由来組換え核蛋白質(ｒ‐ＮＰ(Ｓｗ))、季節性Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス(Ａ/ＮｅｗＹｏｒｋ/５５/２００４)培養物および季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス(Ａ/ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ/２０/９９)培養物を用いた。

(表６)に示すとおり、本発明のモノクローナル抗体同士の組み合わせ、および本発明のモノクローナル抗体と一般的な抗ＮＰモノクローナル抗体の組み合わせでは、新型Ｈ１Ｎ１および新型Ｈ５Ｎ１と特異的に反応し、季節性インフルエンザＨ１Ｎ１,およびＨ３Ｎ２とは反応性しなかった。また既に市販されているインフルエンザ検出試薬である製品クイックチェイサーＦｌｕ(商標) Ａ/Ｂの測定においては新型Ｈ１Ｎ１、新型Ｈ５Ｎ１、季節性インフルエンザＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２の全てに強く反応した。本試作品は新型Ｈ１Ｎ１、新型Ｈ５Ｎ１のみと特異的に反応性を有し、他の季節性インフルエンザとは反応しないことから、これらを鑑別できることが確認された。

なお、ここで用いるモノクローナル抗体に組み合わせについてはデータが示すように固相化メンブレン側、金コロイド側を入れ替えることも可能であり、また一般的な反応性を示すモノクローナル抗体についてもクローンナンバー:Ｍ２１１０１６９に特に限定されるものではない。

(実施例３)
好ましい実施の形態２として、本発明のモノクローナル抗体(６Ｇ６,７Ｆ６)、及び強毒型インフルエンザに非常に弱い反応性しか示さない抗インフルエンザＮＰ抗体である米国Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ社製、カタログナンバー:Ｎｏ.１０-Ｉ５０、クローンナンバー:Ｍ３２２２１１のモノクローナル抗体を組み合わせて試作品を作製し、新型Ｈ１Ｎ１(Ａ/Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ/０４/２００９)由来組換え核蛋白質(ｒ‐ＮＰ(Ｓｗ))、新型Ｈ５Ｎ１(Ａ/ＶｉｅｔＮａｍ/ＶＬ０２０/０５)由来組換え核蛋白質(ｒ‐ＮＰ/Ａ)、季節性Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス(Ａ/ＮｅｗＹｏｒｋ/５５/２００４)培養物および季節性Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス(Ａ/ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ/２０/９９)培養物を測定試料として用いて評価した。なお、ｒ‐ＮＰ(Ｓｗ)については検体抽出液にて１００倍、５００倍~６４０００倍の希釈物を、その他の抗原については１０倍希釈物を測定に用いた。

この結果、(表７)に示すように固相化メンブレン側または標識抗体側のいずれか一方に本発明のモノクローナル抗体を、他方に強毒型インフルエンザに非常に弱い反応性しか示さない抗インフルエンザＮＰ抗体を組み合わせて用いることで、季節性Ｈ１Ｎ１、季節性Ｈ３Ｎ２及び新型Ｈ５Ｎ１とは反応しないが、新型Ｈ１Ｎ１とのみ反応することが確認された。一方、既に市販されているインフルエンザ検出試薬である製品クイックチェイサーＦｌｕ(商標) Ａ/Ｂの測定においては新型Ｈ１Ｎ１、新型Ｈ５Ｎ１、季節性インフルエンザＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２の全てに強く反応した。本試作品は新型Ｈ１Ｎ１のみと特異的に反応性を有し、他の季節性インフルエンザや更には新型Ｈ５Ｎ１とは反応しないことから、これらを鑑別できることが確認された。また新型Ｈ１Ｎ１の希釈検体の反応性においては既製の製品とほぼ同等の反応性を示し実用的な感度を有すると考えられる。

新型Ｈ１Ｎ１陽性実検体による評価を行った。ＰＣＲにて新型Ｈ１Ｎ１が確定した患者検体５例(鼻腔拭い検体を界面活性剤入り緩衝液にて抽出した溶液)を用いて試験を行ったところ、(表８)に示すように、いずれの検体も陽性反応を示した。一方、既に市販されているインフルエンザ検出試薬である製品クイックチェイサーＦｌｕ(商標) Ａ/Ｂも同様に反応していることが確認された。。

さらに２００８/２００９年シーズンに得られた季節性Ａ型インフルエンザ患者の検体２０例およびＢ型陽性が確定した患者検体９例(いずれも鼻腔拭い検体を界面活性剤入り緩衝液にて抽出した溶液)を用いて特異性試験を行った。(表９)に示すように全て陰性を示した。一方、既に市販されているインフルエンザ検出試薬である製品クイックチェイサーＦｌｕ(商標) Ａ/ＢにてＡ型,Ｂ型インフルエンザの陰性が確認された実検体２０例(いずれも鼻腔拭い検体を界面活性剤入り緩衝液にて抽出した溶液)においても陰性が確認され、特異性についても問題ないと考えられた。

本発明の各フラグメントの配列図本発明の吸光度と抗体希釈倍率との関係を示すグラフ本発明の吸光度と抗体希釈倍率との関係を示すグラフ本発明の各フラグメントの配列図本発明の一実施の形態に検出装置の外観図

１ハウジング
２検体滴下部
３判定窓部
４滴下部
５吸水ろ紙
７ニトロセルロースメンブレン
８検査部
９検査対象部
１０支持体

Claims

Ａ型インフルエンザの核蛋白(ＮＰ)のアミノ酸配列においてＮ末端側４-１８番目がＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＧＧＥであるペプチドを含むインフルエンザ核蛋白抗原に特異的な反応性を有するモノクローナル抗体であって、ＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＥ及びＱＧＴＫＲＳＹＥＱＭＥＴＤＧＤであるペプチドを含むインフルエンザ核蛋白抗原には反応性を有しないことを特徴とするモノクローナル抗体。
Ａ型インフルエンザ抗原を検出する試薬において、反応成分として請求項１に記載のモノクローナル抗体を含むことを特徴とする免疫検出試薬。
第一の反応成分と、前記第一の反応成分とは異なる第二の反応成分とを含む免疫検出試薬であって、前記第一の反応成分は請求項１に記載のモノクローナル抗体であり、前記第二の反応成分は強毒型インフルエンザに難反応性のモノクローナル抗体であり、前記第一、第二の反応成分を組み合わせてなる免疫検出試薬。
検出方法がイムノクロマト法である請求項２または請求項３に記載の免疫検出試薬。