JP5782690B2 - 抗np−h289抗体の作製方法 - Google Patents
抗np−h289抗体の作製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP5782690B2 JP5782690B2 JP2010189043A JP2010189043A JP5782690B2 JP 5782690 B2 JP5782690 B2 JP 5782690B2 JP 2010189043 A JP2010189043 A JP 2010189043A JP 2010189043 A JP2010189043 A JP 2010189043A JP 5782690 B2 JP5782690 B2 JP 5782690B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- influenza
- amino acid
- virus
- pandemic
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Description
免疫原として、Pandemic(H1N1)2009インフルエンザウイルスであるA/Narita/1/2009(H1N1)の組換え全長NPを常法により作製した。具体的には、該ウイルス株のゲノムRNAからRT-PCRによりNPをコードするcDNAを合成し、精製後、公知の発現ベクターに組み込んで大腸菌に導入し、発現したrNPをカラムにて回収・精製して得た。これをマウスに免疫し、常法のハイブリドーマ法により、免疫原に対する抗体を産生するハイブリドーマを作製した。スクリーニングは、常法により作製した下記表1に示す4種の組換え全長NPを抗原として用いたサンドイッチELISAにより実施した。
抗マウスIgG抗体をPBSで1μg/mlに調製した溶液を96穴アッセイプレートに50μl/wellずつ加え、37℃で1時間コーティングさせた。PBSTで洗浄後、抗NP抗体溶液を50μl/wellずつ加え、37℃で1時間反応させた。PBSTで洗浄後、rNPを50μl/wellずつ加え、37℃で1時間反応させ、PBSTで洗浄後、アルカリホスファターゼ標識FVA2-11を50μl/wellずつ加え、37℃で1時間反応させた。PBSTで洗浄後、p-NPP基質系で発色を行い、マイクロプレートリーダーにてA405nmの吸光度を測定した。なお、FVA2-11は、市販のインフルエンザ検出キットにも使用されている公知の抗A型NP抗体であり、A型を共通して認識可能な抗体である(文献:Gui-Rong BAI et.al.:Improvement of a Rapid Diagnosis Kit to Detect Either Influenza A or B Virus Infection. J.Vet.Med.Sci.68(1);1-6,2006、及びWO/2005/007697)。
(1) A/Narita/1/2009(H1N1)の組換えNP断片を用いた解析
新型インフルエンザウイルスA/Narita/1/2009(H1N1)の組換えNPの断片(図2)を作製し、ウエスタンブロッティングによりNT-L119の反応性を調べた。その結果、NT-L119はこれらのNP断片には反応を示さなかった。NT-L119はlinear epitopeではなくNPの立体構造(conformational epitope)を認識しているものと考えられる。
下記表2に示す通り、A/Narita/1/2009(H1N1): pdmH1、A/Kitakyushu/159/93(H3N2): H3、及びA/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1): H5のキメラNPを作製し、下記の手順でELISA反応阻害アッセイを行なった。
pdmH1 NPの点変異体として、第100番アミノ酸をバリンからアルギニンに置換したもの(V100R)、第190番アミノ酸をアラニンからバリンに置換したもの(A190V)、及び第289番アミノ酸をヒスチジンからチロシンに置換したもの(H289Y)を作製し、これらを競合抗原として用いて上記と同様にELISA反応阻害アッセイを行なった。
NCBI Influenza Virus Resourceには、現在までに同定されたインフルエンザウイルスの配列情報が登録されている。このデータベースを用いて、2005年〜2008年及び2009年7月〜12月の期間にヒトから分離されたA型インフルエンザウイルスのNPの第289番アミノ酸を調べた。その結果、表4に示す通り、Pandemic(H1N1)2009以外のインフルエンザウイルスではほぼ全ての株でチロシンであり、289番のヒスチジンはPandemic(H1N1)2009に特徴的なアミノ酸であった。H289であるNPを認識するNT-L119は、Pandemic(H1N1)2009を特異的に検出する抗体として有用である。
(1) イムノクロマト器具の作製
A型インフルエンザウイルスを共通して検出可能な抗A型インフルエンザウイルスNP抗体と、Pandemic(H1N1)2009のNPを特異的に検出する抗体を用いて、A型インフルエンザウイルスと新型インフルエンザウイルスを同時に検出するイムノクロマト器具を作製した。
A/Narita/1/2009 (H1N1): pdmH1、A/New Caledonia/20/99(H1N1): H1、A/Kitakyushu/159/93(H3N2): H3、及びA/duck/Hokkaido/Vac-1/04(H5N1): H5の組換えNP試料を用いて、上記で作製したイムノクロマト器具の検出感度を確認した。rNP試料は、下記表5に示す通り5000〜1.25 ng/mlの濃度で用いた。イムノクロマト器具の検体添加ゾーン8に試料30μLを添加した後、変形部材に設けた押し込み部12を下方に加圧して変形させて、変形部材に付設された突起部13によって展開液パッド3を展開液槽11に挿入して展開液を展開液パッド3に供給して測定を開始した。測定開始15分後、展開確認部10の発色によって展開液の展開を確認した後、検出ゾーン6a(FVA2-11)及び6b(NT-L119)の発色を目視で測定した。結果は表5に示す通りであり、NT-L119は5000 ng/mlの高濃度であってもpdmH1以外のNPには反応せず、また、pdmH1のNPは1.25 ng/mlの低濃度でも検出でき、このイムノクロマト器具の感度と特異性が十分に高いことが確認された。
各種インフルエンザウイルス株を用いてイムノクロマト器具の反応性を確認した。ウイルス株を孵化鶏卵培養して得た漿尿液を試料とし、試料希釈液として界面活性剤を含むトリス緩衝液(pH8.0)を使用した。結果は表6に示す通りであり、NPの第289番アミノ酸がヒスチジンであるブタ及びブタ由来ヒトインフルエンザウイルスに対しては、FVA2-11点着ゾーンとNT-L119点着ゾーンの両者が発色したが、NPの第289番アミノ酸がチロシンであるヒトインフルエンザウイルスに対しては、NT-L119点着ゾーンの発色が見られなかった。
PCR検査でPandemic(H1N1)2009陽性が確認されたヒト臨床検体(希釈鼻腔吸引液)20例を用いてイムノクロマト器具の反応性を確認した。結果を表7に示す。PCR検査ではウイルスゲノムを検出するため、抗原タンパク質を検出する抗体検査と比較して感染のより初期の段階でもウイルスを検出できる。PCR検査で陽性であった検体のうち2例において、FVA2-11点着ゾーンとNT-L119点着ゾーンのいずれも発色が認められなかった。これは、該2例においてNPが抗体で検出できる量まで蓄積していなかったためと考えられる。NT-L119は、イムノクロマト器具に適用した場合でも、インフルエンザ検査キットで既に実用化されているFVA2-11と同等の感度を発揮できることが確認された。
Claims (2)
- 配列番号2で表されるアミノ酸配列における第289番アミノ酸に対応するアミノ酸がヒスチジンであるA型インフルエンザウイルスの核タンパク質を免疫原として用いて動物(ヒトを除く)を免疫する工程、
前記免疫された動物から採取した抗体産生細胞を用いてハイブリドーマを調製する工程、
前記ハイブリドーマから、前記第289番アミノ酸に対応するアミノ酸がヒスチジンであるA型インフルエンザウイルス核タンパク質と結合し、前記第289番アミノ酸に対応するアミノ酸がチロシンであるA型インフルエンザウイルス核タンパク質とは結合しない抗体を産生するハイブリドーマを選択する工程、
選択されたハイブリドーマが産生する抗体を回収する工程
を含む、前記第289番アミノ酸に対応するアミノ酸がヒスチジンであるA型インフルエンザウイルス核タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製方法。 - ブタ由来ヒトA型インフルエンザウイルスPandemic (H1N1) 2009の核タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製方法である、請求項1記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010189043A JP5782690B2 (ja) | 2010-08-26 | 2010-08-26 | 抗np−h289抗体の作製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2010189043A JP5782690B2 (ja) | 2010-08-26 | 2010-08-26 | 抗np−h289抗体の作製方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2012046443A JP2012046443A (ja) | 2012-03-08 |
JP5782690B2 true JP5782690B2 (ja) | 2015-09-24 |
Family
ID=45901751
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010189043A Active JP5782690B2 (ja) | 2010-08-26 | 2010-08-26 | 抗np−h289抗体の作製方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP5782690B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018058812A (ja) * | 2016-06-01 | 2018-04-12 | パナソニックIpマネジメント株式会社 | インフルエンザウィルス核内蛋白質に結合する抗体、複合体、それを用いた検出装置及び検出方法 |
CN114456262A (zh) * | 2022-01-13 | 2022-05-10 | 浙江大学医学院附属第一医院 | 抗h1n1流感病毒核蛋白单克隆抗体zju-np-a1及其在检测中的应用 |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5463107B2 (ja) * | 2009-09-14 | 2014-04-09 | 独立行政法人国立国際医療研究センター | 新型インフルエンザを特異的に鑑別するモノクローナル抗体とそれを利用した免疫検出試薬 |
JP2013060367A (ja) * | 2010-01-15 | 2013-04-04 | Osaka Univ | 抗インフルエンザ抗体及びインフルエンザ検出用デバイス |
JPWO2011093217A1 (ja) * | 2010-01-29 | 2013-06-06 | 富士レビオ株式会社 | 抗Pandemic(H1N1)2009抗体及びそれを用いた免疫測定方法 |
-
2010
- 2010-08-26 JP JP2010189043A patent/JP5782690B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2012046443A (ja) | 2012-03-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5586064B2 (ja) | 抗h5亜型a型インフルエンザウイルスヘマグルチニンモノクローナル抗体 | |
US20230220052A1 (en) | Iga antibody specifically recognizing rbd protein and testing kit | |
WO2005007697A1 (ja) | 抗インフルエンザa型ウイルスモノクローナル抗体及び該抗体を用いる免疫測定器具 | |
WO2023036152A1 (zh) | 一种SARS-Cov-2检测方法和试剂盒 | |
JP2024012473A (ja) | Rsウイルスを検出するための検出用試薬又はキット及びrsウイルスを検出する方法 | |
US20130052669A1 (en) | Compositions and methods for reliably detecting and/or measuring the amount of a modified target protein in a sample | |
JP5630153B2 (ja) | A型インフルエンザウイルス核タンパク質の第100番アミノ酸がアルギニンであるか否かを判定する方法 | |
WO2011093217A1 (ja) | 抗Pandemic (H1N1) 2009抗体及びそれを用いた免疫測定方法 | |
JP5782690B2 (ja) | 抗np−h289抗体の作製方法 | |
CN114058593A (zh) | SARS-CoV-2的N抗原的单克隆抗体、检测方法及其用途 | |
KR101329344B1 (ko) | 돼지인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 검출용 항체 및 이의 용도 | |
CN117683121B (zh) | 抗水痘-带状疱疹病毒抗体及其应用 | |
JP7157061B2 (ja) | ジカウイルスを検出する方法及びキット | |
EP4059958A1 (en) | Anti?rs virus n protein?recognizing antibody, immunoassay method and immunoassay instrument using anti?rs virus n protein?recognizing antibody | |
CN116023481A (zh) | 犬冠状病毒单克隆抗体及其应用和产品 | |
KR101329342B1 (ko) | 돼지인플루엔자 바이러스 뉴라미니다아제 검출용 항체 및 이의 용도 | |
US20100028855A1 (en) | Detection of influenza virus type b | |
JP2023181275A (ja) | マイコプラズマ・ニューモニエの免疫測定方法及び免疫測定器具 | |
CN115561456A (zh) | 体外定量b肝病毒大表面蛋白的套组以及用于处理肝病的生物指标组及单株抗体组 | |
CN115850459A (zh) | 靶向新型冠状病毒n蛋白的抗体及其应用 | |
CN116041527A (zh) | 一种特异性结合e2-e2抗体复合物的抗体及其应用 | |
CN114891110A (zh) | 特异性结合人IgG4的蛋白及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20130614 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20130614 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20141104 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20141201 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20150623 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20150706 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5782690 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |